TW211066B - - Google Patents

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明説明（I) 本發明傜同在申請中的美國專利申請栗號559, 152號 (1990年7月23日申請）的部份接續案，然後是共同申諳美國 申請案號367,772號（1989年7月17日申請）的分割案（根據 PCT申請案PCT/0589/00016,1989年1月3日申諳於美國接收 局，根據1988年7月25日申請的日本專利申請案號185319 / 88,以及目前己放棄的申請日為1987年12月31日的美國申諳 菜號1 4 0 , 1 9 7號）。 技術領域 ik 先 閲 背 而 之 注 意 卞 項 % 本 經濟部屮央標準而A工消赀合作社印製 由光子的基 雜經發分到定 氣的學該測安 二 良化止偵不 一 改的防器去 2 種基基儀除 ，一 定定被而 1 於安安可子 光關不不者分 發偽去類或該 學明除此光入 化發可 。見加 的本素物可素 良 ，酵 合出酵 改說含化發的 種的、的烷是當 1 殊解 丁就適 於特裂環也種 。 關更以雜 ，一 光 偽 ，予氧光將發 明物可.·! 發到而 發合式 I 而直解 本化方 2 解 ，分 烷素 ，分線會 丁酵 1 因光才 經分裂bb學 I 苯一 的烷以對化，} 去 計丁 予的個 2 基除 千環法烈 一 < 氣基 以雜方強有 I 基代 數氣學呈須 3 醯取 從二化況必從磷基 可 I 用情 ， ，I 羥 ,2 使的言如”的 環 ，與烷而例 3 上 循 1 象丁子 。ί 基 素光，現環分基 I 笨 酵發種雜烷定 4 的 種學此氧丁安 I 烷 一 化。二環不基丁 由的基 I 雜補氣環 經解定 2 氧互甲雜 子裂不 ，二除 I 氣 分以的 1 個去 4 二 素予補光一子 i 1 酵式互發每分} 2 種方其學對劑烷 ， 1,素.去化中試網 1 酵除的其解金 I 由子解，裂螺基 K紙ί艮尺度边用中a困家標毕（CHS) TM規格（2KIX297公;a：) S1. ：. 20,000 五、發明説明（70 經濟部屮央#準局：23;工消许合作社印製 m 分 子 的 氳 離 子 必 須 用 一 分 子 的 氫 氧 化 鈉 > 而 每 秒 去除 1 0 0 0 到 5 0 0 0 個 分 子 的 3 — ( 2 9 一 螺 旋 金 鏑烷 ) — 4 — 甲 氣 基 — 4 — ( 3 ” 磷 m 基 氣 基 ) 苯 基 一 1 ,2 — 二 氣 雜 環 丁 院 二 鈉 鹽 的 磷 m 基 氣 基 只 需 要 —* 値 分 子 的鹼 性 m 酸 酶 ( ，， A P ” ) 9 請 參 見 j a b 1 〇 η S k i 所箸 99 D N A P Γ 〇 b e f 〇 Γ I η f e C t i 〇 u S D i S e a S e ” ( B 〇 C a R a t 〇 π » F 1 a , ·· C R C P Γ e S S 9 1 9 8 9 ) » 2 2 頁 〇 可 用 酵 素 方 式 予 以 裂 解 的 發 光 1 2 — 二 氧 雜 環丁 烷 化 合 物 一 般 會 包 含 安 定 基 (s t a bili z i ng gr 0 U IPS), 例如被 結 合 到 二 氧 雜 環 丁 院 環 上 的 第 3 個 碩 原 子 上 的 一 種 金銷 烷 基 叉 基 螺 旋 t 此 舉 有 助 於 防 止 二 氧 雜 環 丁 院 化 合 物 在結 合 之 .» 1,. 刖 > 也 就 是 可 經 由 酵 素 式 予 以 裂 解 的 不 安 定 基 被接 到 殘 餘 分 子 上 的 結 合 在 蓄 的 被 裂 解 之 前 1 在 室 恤 ( 2 5 t： ) 之 下 進 行 實 質 上 的 分 解 〇 使 用 螺 金 銷 烧 基 來 發 揮 安定 性 的 觀· 念 是 由 W i e Γ y η 8 a 等 人 帶 進 1 9 2 — 二 氣雜 璟 丁 院 化 學 界 的 ( T e t Γ a h e d Γ 〇 η L Θ t t e Γ S t 1 6 9 ( 1 9 7 2 ) 和 Μ C C a P r a 等 人 J . C h e m 9 S 〇 C « 1 C h e m • C 〇 m m ) • » 9 4 4 ( 1 9 7 7 ) 0 這 安 定 基 使 得 此 類 二 氧 雜 環 丁 烷 在 使用 之 前 可 儲 存 m 當 長 的 時 間 i 例 如 在 約 4 到 約 3 0 X： 的 溫度 可 儲 存 約 1 2 値 月 到 約 1 2 年 的 時 間 • 而 不 會 發 生 實 質上 的 分解作用。 (請先閲請背而之注意'r-哨#填艿本-¾ 裝- 訂· 線· 本紙?IL尺度边用中a Η家楳準（CNS)甲4規格（210X297公釐） S1. 2. 20,090 Λ () Η 6 gj1〇Cv_ 五、發明説明（>) 本發明進一步關於其二氣雜環丁烷分子在技菡認定免 疫鑑定，化學鑑定和核酸探針鑑定，以及其作為直接化學 /物理探針以研究各種巨分子，合成聚合物.蛋白質.核 酸，觸媒抗體以及其類似物的分子結構或微結構，以期能 即將被分析其化學或生物物質的存在，數量或結構的分析 物能夠被確認和定量。 背景技藝 近年來化學發光1 , 2 —二氧雜環丁烷的重要性與曰 俱增，持別是隨著經由酵素方式予以裂解化學發光1, 2 一二氧雜環丁院的來臨，更顯示其重要性，如1 986年 7月24日所申請的美國專利申請案第889, 823號 (Bronstein) (823 申請案）；1987 年 請 yL U) ifi 背 而 之 注 意 事 項 补 m % 木 經濟部+央標準工消费合作杜印製 號日等的 2 一的在),化 51d 請 7 2 同少es用 33r 申 6 ，不很U1知 ο 月 a 日 ， 1 種烷ec已 ,2 w o d 的各丁01為 ο 1 d 3 Γ 解 ，環 m 因 4 年 E 月 a 裂止雜 r 乃 1 7 ( 6 W 以為氣te此 第 8 號年 d 予前二or, 案 9700E 式目 I ” 子 ^19 8( 方到 2(r分 申 .，1 9 號 素 ， ，子導 利} ,12 酵是 1 分報 專人 ο 及 7 由的光導為 國等 4 以 6 經比發報作 美 nl} , 與對學為被 的 i 第案 3 ，烈化作未 諳 e 案請 1 是強的被從 申+^諳 申 2 的呈 解上上 日 S 申7第，起烷裂術定 1η國 9 案。提丁 以技鑑 3 〇 美 1請} 度環予析物 月 的 ί.申案再雜可分生 2BIS} 國請 氧知何在 1ί 申人美申 二 已任而 本紙張尺度边用中S困家棕準（〇奶）肀<1規格（210x297公龙） S1. 2. 20,000 經濟部屮央標準局貝工消许合作杜印製 "·'、發明説明（奉） 學方法予以裂解的化合物大部 於水以及可溶於有機溶劑的被 二氣雜環丁烷，如此一來可能 經由添加可使其共軛到一生物 基而使其改良，使得此類共軛 丁烷被作為化學活性化學發光 就另一方面而言，典型酵 氣雜環丁烷如在適當酵素存在 附帶金銅烷基的酵素裂解1 , 一 （4 一甲氣基螺〔1, 2- —三環〔3. 3.3. 1 3 * 7 酸鹽以友其鹽，例如二鈉鹽， 甲氧基苯氣基磷醛基化二氧雜 3 - (4 —甲氣基螺〔1, 2 ，一三環〔3. 3· 1. 1 3 , 氣基一3” - yS-D -吡喃糖 GD-使其特別適合作為許多 物鑑定中所使用的分析技術報 曾經有人發現到AMP P 發光加強劑，例如聚合銨，辚 基二甲基銨氛化物）〕（”B 合物（參見美國專利申請案第 88年6月1日申諳，Voy ____ — 一 & - 份不溶於水，除了某些略溶 乙醛氣基所取代的1, 2 — 無法用於生物鑑定上，除非 品種如一抗體上的基或取代 化學裂解1，2 —二氣雜環 的標記。 素裂解化學發光1, 2 —二 下以及光照射之下會分解的 2 -二氧雜環丁烷，例如3 二氣雜環丁烷一 3, 2’ 〕十基〕_4 一基）苯基磷 被證實為以下的金銷烷基叉 環丁烷（AMPPD)以及 —二氧雜環丁院一 3 — 2 7 ]十基〕一 4 -基）苯基 型半乳糖以及其鹽（AMP 塑態的於水性溶媒特別是生 導分子。 D在水性溶液中以及在化學 或sa鹽如聚〔乙烯苄基（苄 DMQ”）以及其它雜極聚 2 0 3, 263 號，於 19 t a等人），展現了比到達 (請先閲讀背而之注意，項典艰寫木一 本紙張尺度边用中曲Η家標毕（CNS)甲<1規格（210x297公;») S1. 20,000 _ Η 6_ <10」1'^發明説明（<) η- 先 閲 ifi 背 而 之 注 意 項 % 恆常光照射特性的最適期問還長的特性（” t 1 / 2 ” ，定義 為在恒常穩定的發光狀態到達一半最大化學發光強度所需 要的時間，此發光半衰期隨著二氧雜環丁烷氧陰離子在各 種不同環境的穩定性而改變）。 就統計學上而言，到達穩定發光動力狀態大約需要7 値t 1/2期間。在BDMQ存在之下，AMPPD在水性 溶液的濃度大於2xl〇-5M, pH為9. 5時的tl/2 為7. 5分鐘；而在BDMQ存在之下，濃度為 4xlO_3M時，tl/2大約為30 — 60分鐘，而雷在 水性溶掖的濃度為2x 1 0 _s Μ時，AMPPD的t 1/2 為2 . 5分鐘。 在使用經由酵素方式予以裂解的化學發光1 , 2 —二 經濟部中央標準局KX工消费合作社印製 氧雜環丁烷作為報導分子的快速生物鑑定中，希望能夠儘 快到達穩定狀態的發光動力，以期能夠在鑑定中偵測到所 謂的”终點”。當化學發光強度可在到逹穩定狀態動力之 前就偵溯到，但是若希望能夠在到達穩定發光動力狀態之 前就得到資料，則必須擁有複雜且精密的熱力控制發光計 儀器才能辦的到。

再者，AMPPD在水性緩衝溶液中，以及在有無化 學發光加強劑（如BDMQ)的存在之下，會表現出高於 所希望得到還高的熱以及其它非酵素方式活性化發光，或 者稱之為”雜音”，此雜音可被歸諸於金鏑酮 (adamantanone)在激態下的發光，以及衍生自A Μ P P D 卜紙诋尺度逍用中國困家標毕（CNS)TM規格（210x297公:«：) S1. 2. 20,000 五、發明説明（k) Λ (5 1$ 6 經濟部屮央標準而β工消奸合作杜印製 分子芳条 制偵測水 到的A Μ 出2値次 使用 陰離子、 基酚鹽二 離子也可 式，例如 層，微脂 聚合物表 強劑如Β’ 訊號，可 號並因為 範圍。 ...我們 在例 1 .酵素 [AMPPD] 部份的甲基 平，並因此 P P D雜音 方。 驗性磷酸酶 去磷醯基化 氧雜環丁烷 以水解方式 作為一種微 m -氣苯酸鹽陰離子。此種雜音會限 阻止最終靈敏度的實現，因為所偵測 水平大約比檩準發光計中暗電流還大 對A Μ 的A Μ 或者” 少量形 膠粒， 粒胞，反相微膠粒 面，以及在一種疏 DMQ所製造者一 産生強烈且發光的 AMP PD的酵素 P P D P P D AMP 成，以 撤脂粒 ,微乳 水性環 般，而 加強水 水解而 進行酵素裂解 -金銅烷基叉 一 D ”。此種 一種有機化分 ，板相，薄層 膠，微膠，乳 境如同由一化 産生一 平，藉 實質上 種背景 此造成 降低動 也會産生 甲氣基甲 酚鹽化陰 子組合方 ,脂體雙 膠，膜或 學發光加 化學發光 高背景訊 力訊號的 提出下列的假設性機構來符合以上所述的觀察 如B D M Q加強聚合物的存在之下： 路徑（ΑΡ存在之下）： ΑΡ [ΑΜΡβοΐ slow 1/ CL at 477nm ih 先 閲 背 而 之 >主 意 項 % 木 (tj 7.5 min. 2·熱路徑（無AP存在之下）： ___-IQ- 一 t紙张尺度边用中典囷家樣準（CNS)T4規格（210x297公及） S1. 2. 20,000 1 經濟部屮央榀準局=^工消赀合作社印31 五、發明説明（7)

AMPPD +AMPHD

ΑΗΡ©0 +AMPHD ——> CA*]f slow (t J * 7.5 min.) -> CI*, at 415rtm CL^ at 477ns; 1 ) ” C L "代表化學發光。 2)在水性緩衝溶液中的AMP P D包含一少量的去磷醛 基化、羥基化的1, 2_二氣雜環丁烷（”AMPHD” ，該去磷醯 基化的二氣雜環丁烷可以AMpf D的陰離子的形式存在 ，如果溶液的pH足夠高（高於約9. 5 Θ 3 ) ” C L i ”和’’ C L 2 ”代表背景化學發光。 4 ) ” A' M代表處於激態的金鋼酮。 卽使沒有加強聚合物，AMP P D也能夠在水溶液中 形成聚集體（aggregate)。 3 .酵素路徑 4 ..熱和水解路徑： AP & iAMPPD]· -[AHP^D], faster (t = 2.5 min,) CL at 477ni rh 先 閲 ifi 背 而 之 注 意 ·*具 寫 本 裝 玎 線 ；AMPPD]|

Ther^^j and Hvdrolvtiic Pathway;

AMP® D +AHPHD CL, at 477na △

[入 *】B -11 CLj at 415nzn 本紙張尺度边用中®困家4?华(CNS)甲4規格（210><297公放） S1. 2. 20,000 Λ ί; Ιί 6 " 五、發明説明（分） 先 閲 ifi 背 而 之 注 意 事 項 * % 本 在以上的機構當中，n>>m, η和m為加強聚合物 存在與否以及AMP P D濃度的函數。 呈聚集形態（η或m>l)的單一金網_的激態可能 表現出比未呈聚集形態的金銷酮的激態還高的訊號産量發 射，此處再度強調如果”安定化”會發射更多的光，如同 有一種如BDMQ的化學發光加強劑存在之下。此種情況 或許是因為前者有較低的單一狀態，較低的糸統間穿越量 或者比後者有較慢的条统間穿越，或者是因為到目前為止 尚無法知悉的原因。一般而言，因為發光計在設計上是偵 測所有發射的光子，而不管其能量或者波長，所以4 1 5 nm和4 7 7 nm的波長的發光均被視為背景雜音發射。 相似情況之下，當照片或X射線底片被用來記錄化學發光 時，無法很容易的對不同的波長作出任何區別，因此，偵 測靈敏感度就受到背景雜音的限制。 最後，所觀察到的AMPPD聚集在以上所述的情況 之下.可能肇始於AMP P D的兩親性特性，或者其酚鹽的 陰離子以及類似的分子： 經濟部屮央#準而貝工消赀合作社印製 〇—-1—0

本紙張尺度边用中a困家標準(CNS)規格(210父297公龙） S1. 2. 20,000 五、發明説明（ 因此，本發明的目的是減少進行鑑定所需要的時間， 恃別是進行生物鑑定所需要的時間，其中使用酵素方式予 以裂解的化學發光1, 2—二氧雜環丁烷被用作報導分子 請 it 閲 讀 背 而 之 注 意 事 項 % 經濟部屮央榀準扃κχ工消#合作社印3i 本發 發光1 , 子，特別 時間。 本發 化學發光 工作的基 本發 改良.酵素 本發 學發光1 以上 和使用方 利範圍是 發明掲示 本發 明的另一目的是提供新穎且改良 2 —二氧雜璟丁烷，其在鑑定過 是在生物鑑定中，可減少完成鑑 明的另一進步目的是提供新穎且 1, 2—二氣雜環丁烷作為以酵 質，以提供改進的偵測水平。 明的再進一步目的是提供新穎中 裂解1, 2_二氣雜環丁烷。 明的S—再進一步目的是提供製 ,2 —二氣雜環丁烷和其中間體 的目的以及其它的目的以及本發 面，對該習知此技人士而言以下 顯而易知的。 的酵素裂解化學 程乃使用報導分 定工作所需要的 改良的酵素裂解 素為基底的鑑定 間體以供合成該 備這些酵素裂化 的方法。 明的特性，範圍 的敘逑和申請專 明提供一種新穎種類的安定、經由酵素方式可予 本紙張尺度边用中a Η家樣準(CNS)T4規格(210x297公龙） S1. 20,000

五、發明説明（/^ 以裂解.2 - 呈溶液 表面如 光學方 在 使得在 AMP 雖 或理論 基的存 止二氣 而預防 或一些 的化學發 二氣雜環 的生物流 耐隆膜上 式釋出可 水性溶媒 擔任報導 P D時擁 然我們不 所限制， 在之下， 雜環丁烷 該分子形 其它聚合 水性環境（包括 因此.而防止進一 效應而造成該現 光3 - （取 丁烷化合物 體樣品，或 )與酵素或 偵測到的能 中，這些改 分子的鑑定 有更高的靈 希望被任何 但是很可能 或者在金銷 分子進行有 成穩定化的 型態存在均 水本身）之 步形成聚合 象，證據是 代的金 ，其能 者在固 改良特 量。 良的金 作業中 敏度。 官試解 的是在 烷基叉 效率的 有機化 如此。 下使氫 髏。而 較短的 網烷一 2 ’ 基叉） 夠在水性溶媒中，如在 體表面上（例如一種膜 異結合配對酵素反應以 綱烷基叉二氧雜環丁烷 可進行更快，且比使用 釋此種無法預料的機構 此處所掲示型態的取代 部份的存在之下，會防 堆積（packing),因此進 組合，不管是以微膠粒 某些該取代基可能在其 結合到其它物質之上， 且可能因為電子或雙極 0 11 / 2和較低的背景雜音 請 先 閲 讀 背 而 之 注 項 孙 寫 木 裝 玎 線 經濟部屮央榀準局KX工消费合作社印製 圖示簡述 圖1— 5顯示每一値AMPPD和其溴一，B —羥基一， A—羥基一和氯金鋼烷一2’ 一基叉類似物各別的TSH ,RLV ν· TSH,得自以下實施例XI I的敘述。 圖6—10比較得自AMMPD和其A-羥基—，B—羥 ____-14- 本紙张尺度边用中a®家標準(CNS)T4規怙（210x297公;«：) S1. 2. 20,000 發明説明（"） 基，氯一和漠金銷院一 實施例X ί ί 示核酸鑑定中 Λ ί» II 6 經濟部屮央榀準局β工消费合作社印製 得自以下 圖1 1顯 D D的氯 作為報導 圖1 2顯 D的氣代 為報導分 圖1 3為 性磷酸酶 (苄基甲 分鐘時Α‘ 參見以下 圆1 4為 圖1 5為 鹼性..磷酸 -營光 ( 加上翡翠 圖1 6為 代金網 分子的 示核酸 金鏑烷 子的比 5分鐘 被氮代 基銨氯 Μ Ρ Ρ 的實施 圖1 3 在5分 SS被氛 ”翡翠 劑量曲 圖1 5 烷-2 比較， 鑑定中 —2， 較，參 時的劑 金辋烷 化物） D本身 例X I 相同物 鐘時的 代金網 ”）稀 線的比 相同物 2 ’ 一基叉類似物的總發光量，乃 I的敘述。 改良的發光強度，其乃使用AMP ’—基叉類似物與AMP PD本身 參見以下的實施例X I V。 的發光動力學，其乃使用AMPP 一基叉類似物與AMP P D本身作 見以下的實施例X V I。 量反應曲線，其為AMPPD的鹾 一 2’ 一基叉類似物與聚〔乙烯基 )(”BDMQ”）稀釋，與在5 加上的劑量曲線的比較， X 〇 質在2 0分鐘時的劑量反應曲線。 劑量反應曲線，其為AMPPD的 烷一2’ 一基叉類似物與BDMQ 釋，與在5分鐘時AMPPD本身 較，參見以下的實施例XIX。 質時在2 0分鐘時的劑量反應曲線 先 閲 背 而 之 注 意 事 項 孙 % 本 圖1 7為T PA序列影像，.得自以下實施例XX所述使用 (1) AMPPD和（2) AMPPD的氣代金銷烷—2 ’一基叉類似物。 _'___-15-___ _ t紙張尺度边用中a國家樣準(CNS)TM規格(2丨0乂297公放） S1. 2. 20,000 Λ Γ> η 6 %um- 五、發明説明（/；^· 圖1 8顯示得自實施例XX I V所述的訊號\其乃使（1 )AMPPD和（2)本發明的取代類似物。 圖19繪出化學發光訊號，乃得自實施例XXVI I的（ 1) AMPPD 和（2) C1-AMPPD。 圖20顯示得自實施例XXV I X以偵測PBR322質 體DNA,其乃使用（1) AMPPD和（2) C 1 -A Μ P P D 〇

圖2 1表示偵測到PBR322的曝光，其乃根據實施例 XXXI,以時間對（1) AMPPD, (2) Cl— A 1? 先 閲 in 背 而 之 注 意 卞 項 再 % 本 Ml 經濟部中央標準而员工消费合作社印製

I 作 xrbb和 X X Μ XD和B,D和XA xp I 和vp _~- X _ X p ID X p Vo 和 r 例 Mxp X Μ X D I B 施 A X p X A XPI 和 〇 實 I XM例一 XPID 圖據 1 .例 A 施 r 例Mvp 作根 c 施 I 實B施 Axp D#} 實 L 自， 實 1XM p,2 據 c 得 D 據 lx. A p 號 i 根， 乃 p 根 c 例 I M 訊和 ，D ,p ，，施 1 A 光 D 況 p 。較 M 。 像 D 實 c I 發 p 情 p 白比 AO 影 p 據 ， r 學p光 M 蛋的 13 較p根 D B 化 M 曝 A 鐵間 15 比M了p 丨示 A 示類運之 cs 表 A 映 p 3表} 表人的號 ，0 代較反 Μ {形 1 ο 測 D 訊 Dh6fcb8A 和圖 { 3 偵 P 表 ΡΡ2·,2 較 D為對 和 VP 代 pi 和X和tb P2 間 3ΙΜ·4ΜΓη5Ι7 , pc\3 時 02XA2AU2X2X Μ圖以圖圖 X I 圖較 L_X_I 本紙尺度边用中a S家標準（CHS) T4規格（210x297公龙） 81. 2. 20,000 五、 V，6 P P D 〇 圖2 9反映了實施例4 0的人類蓮鐵蛋白的化學發光偵測 ，比較 AMPPD, Cl — AMPPD 和 Br-AMPP D〇 進行本發明的最佳模式 本發明的新穎化學發光3_ (取代金銷烷~ 2* —基 叉）1, 2 —二氣雜環丁烷可用以下通式代表：

先 m iti 背 而 之 注 意 Ψ 項 % 木IE 0—0 經："部屮央榀準^只工消^合作社印51 式I中，X和X1艟別代表一値在金銷烷一 2’ —基 叉取代基上5 ’和7 ’位置的取代基，可為一氫，羥基（ 當氳鍵结到水上時為微拉電子基），一鹵素取代基，亦即 氟或氛（拉電子基）或者溴或碘（可極化，内消旋基）， 一未經取代直鐽或支鏈的較低數目烷基，較佳是甲基，一 取代直鍵或支鏈較低數目的烷基單一取代或具備兩個或多 値取代基（可為相同或不同），例如一羥基烷基如羥基甲 基，一鹵素烷基如三氟甲基，以及其類似者，一烷氣基， 特別是C: _7烷氧基（甲氧基，乙氧基，丙氧基等等） -=_LI 本紙張尺度边用中因Η家標毕（CNS)甲4規格（210x297公龙） S1. 2. 20,000 Λ 6 Π6 aiwefi- 五、發明説明（\4〇 ，一未經取代的芳基，較佳為一苯基；一經取代芳基，更 佳是一芳基環含有6値被單一取代的碩原子或者具備兩個 或多個取代基（可為相同或不同），例如一鹵素取代基， 如Ρ —溴苯基或Ρ —氦苯基，一烷氣基取代基，例如Ρ — 甲氧基苯基（一電子貢獻基），一羥基丙氣基取代基，例 如羥基乙氧基或羥基丙氧基，一氣基或一醯胺基，例如甲 醯胺基或乙醯胺基，一羧基或取代羧基和其類似者，其前 提是X和X1其中至少一値不是氫。 金銅烷基叉基被不是氫的上述取代基單一取代時，當 此化合物被合成時，便可得到其同倒和異侧同分異構物的 混合物。例如，在某些單碘取代金網烷基叉二氣雜環丁烷 情況之下，一種同分異構物在分解時會表現出比其它異構 物更強的發光度。在其它倩況之下，例如，對單羥基取代 金鋼烷基叉二氣雜環丁烷而言，該兩種同分異構物在化學 發光性質如其強度上的表現大致相等或幾乎相等。以上的 雨種情況之下，該異構物可在使用之前被分離，例如使用 經濟部屮央標準局只工消许合作社印S1 2 月構 述出當 第 9 異 上現， 案年 · 値表的 請 8 析 兩會生 申 8 分 步不發 利 9 層 一而能 專 1 色 進代可 國 ，用 被取是 美人使 基所物 用等可 代基構 使 S 者 取代異 乃 d 或 叉取置 其 r , 基的位 ,a 術 烷外， 子W技 鋼以然 分 d 的 金 } 當 導 E 示 。的氫 ， 報丨揭離烷為物 的號所分 丁不構 中 6 } 用環-異 定 ο 請不雜 X 側 鑑 ο 申而氣和異 物，日物二_ X \ 生 4 4 合 < 側 在 4 1 混 氫同 本紙法尺度边用中a «家標準（CNS) Τ4規怙（210x297公：ίέ) S】· β A C 4 2ί 6 » 五、發明説明（\备 請 先 閲 背 而 之 注 意 事 項 再 m % 本 兩種不同取代基存在時，例如5’ 一羥基一7，_氣一和 5* —氯一7’ 一翔基一取代金銷院基叉二氣雜環丁院。 只1和只1符號可代表上述Br〇nstein, B ronstein 等人，Edward, Edward 等 人，Vo yt a等人申請案所掲示的任何在二氣雜環丁院 第4値碩原子上的取代基，只要當R t和R 2代表傾別取 代基時· Rz為芳香条，雜芳香条，或一不飽和取代基與 一芳香糸環共軛，以及至少R:和1^2其中之一·，或者 Ri和1^2皆為一酵素方式裂解的不安定基取代基螢光發 色圆，當該酵素可去除不安定取代基而被一酵素去除時會 産生一發光物質。 經濟部屮央標準局β工消ίν·合作社印製 因此，例如符號R i可代表氳，k者當R 2代表經由 一螺鍵結結合到二氧雜環丁烷的一取代基時Ri代表一鍵 ,或者代表不會干涉光的産生以及會滿足二氧雜環丁烷環 磺原子的價數的有機取代基，而産生四價二氧雜環丁烷環 碩原..子，例如烷基，芳基，烷芳基，雜烷基，雜芳基，環 烷基或環雜烷基，如一種直鏈或支鏈烷基，其具備1到7 個碩原子，一直鐽或支鐽羥塞烷基，其具備1到7痼磺原 子，一個一OR基，其中R為一 Ci — 2無支鏈有有支鐽 、未取代或取代的、飽和或不飽和烷基，環烷基，環烯基 ，芳基，芳烷基或芳烯基，以上任何基可被融接到R2使 得發射部份包括一内酯環或N, 0或S的含雜原子基，或 一直接鍵結到二氧雜琛丁烷環第4磺原子酵素裂解基，或 ____ -19- 本紙張尺度边用中K困家標毕（CNS)T4規怙（210x297公龙） S1. 20,000 Ιϊ 6 五、發明説明 到其它 直接産 者鍵結 素裂解 鍵，所謂富含 後者例 環丁烷 的是一 痼碩原 符 丁烷環 丁烷， 團螢光 份吸收 能量而 解基所 如為一 環之上 甲氣基 子時。 號R 2 磺原子 較佳情 發色圍 能量而 返回基 取代而 所述Ri基的其中之一， 生或接缅諝整p Η而産生 電子如一氧陰離子，硫陰 肟或一醛胺陰離子如磺醯 。較佳的情況是，R 1為 其包含一可被一酵 富含電子部份的一 離子或氮陰離子（ 胺）鍵結到二氣雜 —烷氣基，更特殊 ，當R2披單一鍵結到二氣雜環丁烷的第4 代表不會干涉光的産生以 的價數的有機取代基，而 況下，R2將代表任何多 基，其會使得相當的二氣 形成一激態，並進而發射 態，其被包含一可被一酵 直接産生或接續調整ρ Η 及會滿足二氣雜環 産生四價二氧雜環 數的轾光形成螢光 雜環丁烷的分解部 光學上可偵測到的 素裂解鍵的酵素裂 而産生富含電子部 , 成 子组 it 0 陰 R 氮與 或起 子 一 離或 陰 { 硫表 ， 代 子獨 離 〇 單 陰上可 氧之號 一 環符 如烷 2 子丁 R 電環如 含雜例 富氧 ， 謂二此 所到因 ，合 份鍵

Tk 閲 讀 背 而 之 注 意 事 項 孙 填 木 線 經濟部中央櫺準局κχ工消#合作杜印製 旋 螺 基 代 取 的 子 原 磺 個 4 第 上 環 烷 ： 丁如 環例 雜 * 氣基 二围 到色 合發 鍵光 一 螢 S 基 胺 基 甲二 - 5 ; 如 物例 生 -衍物 基生 苯衍 和S 基和 苯i 磺 基 甲 I 9 基 苯 二 I ο 1i 9 如 例 物 生 衍 ;蒽 4-奈和 基憲 羥 I 和 酸 本紙張尺度逍用中a S家標孕（CNS) ΤΜ規格（2丨0X29/公龙） S1. 2. 20,000 6 » jtoot- 五、發明説明（^) 請 先 間 ύ 背 而 之 事 項 m % 本 1, 9 -i羧基醛，I基4 和9 -苯基蒽； 一若丹明（rhodamine)和若丹明衍生物，例如rhodol, 四甲基若丹明•四乙基若丹明，二苯基二甲基若丹明，二 苯基二乙基若丹明和二i基若明； 螢光素和螢光素衍生物，例如5 -碘乙醯胺基螢光素 .6 —碘乙醯胺基螢光素和螢光素—5—馬來醯亞胺； 一番亞素（counarin)和香亞素衍生物，例如7 _二烷 基胺基一 4 一甲基香亞素，4 —溴甲基一 7_甲氣基香亞 素和4一溴甲基一7—羥基香亞素； —赤蘚紅（e r y t h r q s i η)和赤蘚紅衍生物，例如羥基赤 蘚红，赤蘚红一 5 -碘乙醯胺和赤蘚紅一 5 _馬來醯亞胺 —(啶（a c r i d i n e )和Α啶衍生物，例如羥基Α啶和9 基Μ啶； —芘（prene)和芘衍生物•例如Ν - (1-芘）碘乙醯 羥基芘和1 —芘甲基碘乙酸酯； _1, 2—二苯乙烯和1, 2—二苯乙烯衍生物.例 經濟部屮央標準局β工消合作社印製 -甲 胺.. 如6 乙烯 ,6’ 一二溴1, 2 —二苯乙烯和羥基1, 2 —二苯 一硝基苯並噁二唑和硝基苯並噁二唑衍生物，例如， 羥基硝基苯並噁二唑，4一氣一7-硝基苯並一2—噁一 1, 3 —二唑，2 - (7-硝基苯並—2 —噁-1, 3 - 二唑一4 一基）甲基胺乙醛和6 — (7’ 一硝基苯基—2 _ - - _ '21- 本紙張尺度边用中a困家標毕(CNS) T4規格(210x297公没） 81. 2. 20,000 五、 Λ (j Π 6 發明説明（1¾ 噁 «•奎木； 1, 3_二唑一 4 一基）胺基乙酸； 。奎啉和喹3林衍生物，例如6 一羥基•奎啉和6 -胺基 β啶和β啶衍生物，例—甲基以啶和1^_苯基 鹽酸甜菜龄（acid〇acridine)和鹽酸甜菜驗衍生物， 一甲基發酸甜菜驗和羥基_ 9_甲基鹽酸甜菜驗； 一。卡唑（carbazole)和咔唑衍生物，例如^^ —甲基^卡 唑和羥基一 Μ —甲基。卡唑；—螢光花青（cyanine),例如〇 ( —種雷射光染料 ),羥基花青，1, 6 -二苯基-.lt 3, 5 —三十六烯 ,1_ (4一二甲基胺基苯基）〜6_苯基三十六烯和相 當的1 , 3 —丁二烯； 例如9 ...............................η· ! ά (請先W讀背而之注意事項再填寫本 花青； -N - 經濟部中央梂準局貝工消费合作社印製 經由 碩花青和磺花青衍生物，例如苯基磺花青和羥基碩 姐銳發，例如，4 (4 一二烷基二胺基苯乙烯基） 甲基吡錠碘酸鹽和羥基一取代％録發； —氧 IS (oxonol);和 一間吩和羥基間盼。 Ra符號與Ri符號一起代表一融接螢光發色團基， 螺旋鍵結鍵合到二氣雜環丁烷環的第4個碳原子上 ，其通式為： -22 本紙5ίί尺度逍用中a Η家標毕(CNS)Ή規格(210x2974：«：) S1. 2. 20,000

經濟部中央標準局A工消t合作社印51 基，具備1到7値碩原子，例如甲氣基，羥基乙基或羥基 丙基；一芳基，具備1或2個環，例如，苯基，奈基或恩 基；雜芳基，具備1或2個環，例如吡咯基-吡唑基；一 環烷基，琛上具備3到7値硕原子，如環己基；雜環梡基 ，環上具備3到6値碩原子，例如二噁烷；一芳烷基，具 備1或2値環，例如苄基；或一烷芳基，具備1或2値環 ，例，如甲苯基；每値R 3分別可為氫；一拉電子基，例如 過氟烷基，具備1到7 β碩原子，例如，三氟甲基；一鹵 素；C〇2 Η , - 2 C Ο 2 Η, - S Ο 3 Η, Ζ S Ο 3 Η ,-Ν Ο ζ , Ζ Ν Ο ζ , - CbN,或- Ζ! C^N,其 中Z為1到7値碩原子的支鐘或直_烷基，例如甲基；一 具備1或2痼環的芳基，例如苯基；一貢獻電子基，例如 一支鐽或直鐽的Ci _7烷氧基，例如，甲氧基或乙氧基 :一芳烷氧基，具備1或2個環，例如苯氧基；一支鏈或 -23- 本紙張尺度边用中因國家標準（CNS)T4規格（210X297公釐} S1. 2. 20,000 Λ Π 6 ftilflfiS- 五、發明説明（70) 直鏈C i _C7羥基烷基，例如羥基甲基或羥基乙基；一 羥基芳基，具備1或2艢環，如羥基苯基；一傾支鐽或直 鐽Ci _C7烷基酯基，如醋酸酯，一芳基酯基，具備1 或2個環，如苯並噁唑，苯並噬哩，苯並眯唑或苯並三唑 。再者，2或更多傾R3基可形成融接環或環本身可被取 代或不被取代。 R2符號，單獨或與Ri —起，可近似的代表一特殊 類別的融接含環螢光團部份，該螢光團部份含一不安定取 代基，取代基含一鍵，當被去除時，使得富含電子的融接 .聚環部份轉而造成二氧雜環丁烷化合物的分解而發光。此 類的成員為那些不安定環取代基連接到融接多琛環者，關 係於此瓌連接到二氧雜環丁烷環的點（單鍵接合或者，當 R !代表一鍵時，為一螺鍵結），使得隔離那些連接點的 環s P2總數為一奇數，其中包括連接點的s P2環碩原 ih 閲 讀 背 而 之 注 意 事 項 再 窍 L本 人 等 S d Γ 中 當 物 合 化 環 a 的 W環 d 多 E 接 見融 參在 子

此 成 。形 > 來 案用 請被 申可 2 基 7 殘 6 其 5 /IX 經濟部屮央標準局ΕΧ工消费合作社印製 化 条 : 光袠 蜜如 環例 烴 ， 糸者 香子 芳原 環碩 多環 的個 接 ο 融 3 的約 ί - Hy 上 9 為含 者包 份是 團恃 光 ， 螢物 種合

本紙張尺度边用中a困家標準(CHS) TM規格（210x297公*) S1. 2. 20,000 A α Λ 遑 2Τ 經濟部屮央標準局β工消赀合作杜印3i 五、發明説明（τ|) 取代基鍵結顯示一値1, 6-取代型態如二鈉6_ ( 4 一甲氣基螺〔1, 2 -二氣雜環丁烷—3, 2’ 一 （5 ’一羥基）三環〔3. 3. 1. 137〕十基〕一 4_基 )一1一秦烯磷酸鹽，戊搭烯，甘菊環，庚搭烯， as-indacene,s-indacene，，二苯搜，二綦嵌苯，醋萘，菲 (phenanthrene),恩（anthracene), acephenanthrylene, 醋亞惫基（aceanthrylene),三苯搜，££(pyrene),屈 (chrysene),四申（naphthacene),以及其類似物，並包括 其被一或多個非不安定取代物如上述由R3 , R 4 , R 5 所代表的取代基的衍生物。 此類”奇數型態的取代”的螢光圃部份的融接多環的 環部份（由R2單獨代表，或者—起為非芳香糸的 殘基，亦即少於全芳香条的融接多環条烴螢光化合物，其 具備一含一鍵的不安定環取代基，當該鍵被裂解時，使得 該敝.接且少於全芳香糸多環富含電子部份轉而使得二氣雜 環化合物可分解而發光，未經取代或者被一或多個上述非 不安定取代基所取代，且含有從1 0到約3 0値環碩原子 ,例如芴，3, 4 —二氫一 3, 3 —二甲基紊，二苯並環 庚烯，9， 010 —二氫菲，茚，茚並〔1, 2-a〕郎 ,p h e n a 1 e n e ,氟恩烯，和其類似物。 再者，由R2單獨代表或與Ri —起代表的螢光圃融 接多環糸環部份可為融接多環条雜芳香条或少於全芳香糸 ——___________ -25- ____________ 先 Μ] ifl 背 而 之 注 意 事 項 孙 % 本 裝 η 線 本紙張尺度逍用中a Η家標準（CNS)甲4規格（210x297公;ft) S1. 2. 20,000 Λ () Π 6 五、發明説明（yTf 融接環雜環糸螢光圑形成基，例如二苯並硫吩，二苯並。夫 喃，2， 2 -二甲基一2 — H —色嫌，xanthene,呢症， 達〇林，異璧淋，菲啶，碳苯乙烯基，吩噁屬.盼噻溱，吩 I ,嘌昤，ΙΛ澡，柰啶，N -醯基*引，色滿•異色滿， N -醯基^嗱湛基，異〇引辗基，和其類似物，未被取代 或者被一或多個上述非不安定取代基所取代，其包含9到 約30個環原子，全部為碩原子。 至少Ri和112其中之一為被取代者的較佳酵素可除 去基為一磷酸酯基，特別是一由下式所代表的磷酸酯基： 請 閲 in 背 而 之 注 意 事 項 # % 木 U*q· i· Μ (III) 經濟部中央櫺準局员工消件合作社印製 銨 N 乙二酸 丁的上 ,•或以磷環基荣 鉀子基。性雜酯骨 或離甲錠鹼氧酸合 納陽如吡如二磅聚 如銨例如素使類 一 ，季 ，份酵而此到 屬条基部用轉。接 金香烷一使會光連 鹼芳為的可，發被 如或可統基基而而 例基 7 糸酯代结基 ，烷 R 環酸取鍵銨 子芳値糸磷子氣季 離 ，一 環類離一種 陽基每雜此陰氣 一 一 烷中或=氣出其 表 7 其基意造釋由 代 C ，苄 _ 製其經 + 1 4 如到以使可 Μ 1+基受解化子 中 C} 烷別裂定離 其者 7 芳持以安陽 或R，鹽予去銨 ,{基鈉酶烷季 。 本紙張尺度边用中8 8家楳準(〇阳）〒4規格(210><2!)7公«:) S1. ：. 20,000 五、發明説明（7¾ CH- rv

yt 閲 ifi 背 而 之 注 意 事 項 再 m % 本 當η大於1時，或者為聚季鞍鹽的一部份時，亦即為 一 ionene聚合物。 另一較佳的酵素可去除基為召一 D _半乳糖苷基，其 可被/3 - D -半乳糖苷釀裂解而生成二氣雜環丁烷酚鹽的 共轭酸，’其在受到壓力之下會發光。 可使用酵素而予以裂解的取代基亦包括酵素一可裂解 烷醯氧基，例如一醋酸酯基，或者一酵素可裂解氣羧酸鹽 基化基，1 一磷—2, 3 —二醯基甘油酯基，1—硫代— D—葡糖甘基，腺苷三磷酸酯類似物，腺苷二磷酸酯類似 物基，膝苷單磷酸酯基，腺苷類似物基，α-D -半乳糖 苷基，/3 — D—半乳糖苷基，ct-D —葡糖苷基，/3 — D 一葡糖苷基，/3 — D —苷露糖基，/3 — D —。夫喃果糖苷基 ,/3 — D_^苷酸基，p_甲苯磺醯基一 L 一精氨酸酯基 或p_甲苯磺醯基一L 一精氨酸醛胺基。 當R2為苯基時，Ri可為—0 (CH2) nCH3 ， 當N = 0-19時，較佳為n = 〇 — 5。在某些化合物中 _____-27- 裝 線 經濟部屮央榀準局员工消^合作社印製 本紙張尺度边用中a a家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙） S1. 2. 20,000 五、發明説明οψ 先 閲 in 背 而 之 注 意 事 項 % 本 ，重要待性可被傳到分子上，或者經由控制或額外取代於 苯環上。安定性，溶解度，聚集度，結合力和分解動力學 可進一步經由下式的化合物予以控制：

X； 其中Z為上述經由酵素可予以裂解的基，氣為鄰位， 間位，對位，Q為氫，芳基，取代的芳基，芳基烷基，雜 芳基，5庚原子多達20膣的雜芳基，一烯丙基，羥基（ 較低磺數）烷基，一較低碩數的烷基OS i R3 (其中 R3為碩數較低的烷基，芳基，烷氧基Ci _6 , 12個 經濟部中央榀準局β工消费合作社印製 或更少磺原子的烷氧芳基，羥基（較低碩數）烷基，胺基 (較低碩數）烷基，一OR4或一SR4 (其中R4為烯 基，.取代的（較低磺數）烯基，多達2 0傾磺原子的（較 佳碩數）烷基），一 S02 R5 (其中R5為甲基，苯基 或N H C 6 Η 5 )，取代或不被取代的（較低硕數的烷基 ，硝基，氣基，鹵素，羥基，羧基，三甲基甲矽烷基或璘 醛氧基。 經取代的金銷烷一 2 —基叉部份螺鍵結到二氣雜環丁 烷環的第3値碩原子上（示於以上的式I)可被其它相似 的具備2或多個融接環的經取代融接聚環烷叉基所代替， -2 8 * S1. 20,000 本虼5良尺度逍用中BB家楳华(CNS)甲4規格(210x297公Λ) 每値環有3到1 2痼磺原子，例如雙環〔3 . 3 . 壬基一 9 — 1 〇 . 4 e .0 . '0 2 似物。 P C T 8年1月2 申請案為基 烷在第3傾 第4個碳原 。該公開申 在較佳 一溶解化取 丁烷的T基 基包括磷酸 ipxrcro- 五、發明説明（4 基叉，己環一 〔5. 5. 1.0. 26 0. 3 0 9 1 3 〕三癸烷—5_基叉，戊琛〔5. 4 6 0. 3 ! 〇s s 〕十一基_4 一基叉以及類 申請案第W088/00695 8日公開）以Brons.te i 礎，掲示經由酵素裂解的1, 2 碩原子位置被” T — V ”取代基 子位置被” X ”和” Y — Z ”的 請案在第3頁第6到1 2行亦掲 的實施例中，一或多値T, X或 代基，例如羧酸，磺酸，或季胺 為一聚環烷基，較佳為金銷烷基 酯；該酵素具備磷酸酶活性。 號（於1 9 8 η 的’ 8 2 3 一二氣雜環丁 所取代，且在 取代基所取代 示著： Υ進一步包括 發；二氧雜環 ;酵素可裂解 ih 先 閲 讀 背 而 之 注 意 事 項 # % 本 經濟部屮央#準局貝工消合作社印製 基 Z 。 一 基 X 或素如 的 的 ，酵供 合 烷Y代提 聚 丁 ，取被 可 環 X 以基。 到 雜由烷的結 結 •.氧經丁結鍵：鍵 著二 質環鍵利箸被 示到物雜所便示可 掲結性氧質以掲基 行鍵和二物基行 T 6 披親到性代 1 或 1 可異结和取 2Y 到 Z 持鍵親胺到 ， 3 基該被異亞 IX 2 解。可特醯 1 的 第裂基 > ,來第烷 頁素代基下馬頁丁 2 酵YX 之或 3環 2 ，取為況基 2 雜 第如以佳情胺第氧 在例，較種 ，在二 上ί此酸 之基在羧 本紙張尺度边用中Β 8家樣準(CNS)甲4規格(210x297公釐） S1. 2. 20,000 - ^五、發明説明（>b 閲 讀 背 而 之 事 項 本 ,例如一乙烯基，其可被聚合而形成一均聚合物或共聚合 物。 二氣雜環丁烷的X, γ或τ基可被鍵結到例如膜，薄 膜，珠或聚合物以供免疫或核酸鑑定的使用。該基被提供 如羧酸.胺基或馬來醯亞胺取代基以便利鍵结。 二氣雜環丁烷的X, Y或T基可包含加強二氣雜環丁 烷酵素劣解的動力取代基，例如富含電子的部份（如甲氧 基）。 二氣雜環丁烷的Y和T基以及X基可包含溶解化取代 基。 此處所掲示和申請的由3 — （取代金鏑烷_2’ 一基 叉）1, 2 —二氣雜環化合物所解決的問題並不見於已公 開的該PCT前案中，發明人未曾發現這些化合物曾掲示 於此前案或者其它任何參考資料。 這些3 — （取代金銷烷一 2，一基叉）一’1, 2氣雜 經濟部屮央標準局ΚΧ工消奸合作社印¾ 環丁_.炫的金部合成可利用上述Br 〇 s t e i η和E dw a rd申諳案以及Edward的美國專利申謓案（27 9， 176,” 176號申請案）所掲示的方法予以合成 。因此，來自以上式I範圍的1, 2_二氧雜環丁烷 其 中X代表一羥基，X1代表氫，Ri代表一甲氣基且112 代表磷醯氣基鹽取代苯基，較佳為一間位一磷醛氣基鹽取 代苯基，可依照’ 176申請案所掲示的方法包括示於以 下的圖示的反應程序予以合成。 — _____ . . -30- 本紙5艮尺度逍用中a國家標华(CNS) T4規格（210x297公;tt) S1. 2. 20,000 A a ««o»6-- 五、發明説明（>7)

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間 中 酯 酸 磷 到 得 時 應 反 酸 斯 易 路 和 P 經濟部中央櫺準而β工消许合作社印製 Η

R R • 原戊 基硕特 烷個 ， 的 41) 低 loy 較約it 數到es 硝 2(01 1 含酚 表一菜 代表 ， 8 代基 R3 醯 ,R 丙 中 〇 , 當基基 序丁醯 程或乙 應基如 反乙例 述 ，, 上基基 在甲醯 如 的 例子 逍 度 尺 ft 紙 :本 i(CN> 毕 標 家 32 * 公 97 20 0 6 ο 4?4 五、發明説明（7f) 醛（Pivaloyl), Q代表一鹵素，例如氮或溴，或〇r8 , Μ分別代表為質子，金靥陽離子如鈉離子或鉀離子，或一 銨，取代銨.季銨或（Η+)吡錠陽離子。如Edwar d在’ 197申請案所述，可用硫醇鹽的裂解來取代上述 步驟5反應序列0R9的鹼裂解，其中R9可為一碩數較 低的烷基，烯基或芳烷基如甲基，烯丙基或苄基。鹼或硫 醇鹽裂解的産物可（取代R9 )有氫或一鹼金屬陽離子如 鋰，納或鉀。 上述中間體由下式所代表： ih 先 閲 讀 背 而 之 注 意 事 項 % 本

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經濟部屮央櫺準而貝工消f合作杜印製 其中X和X1兩者只有一個不為氳，是已知的化合物 ，或者可從已知的起始材料和技g認可的方法彳I快的合成 出來.。例如，在單一取代的金銷烷一 2 —酮（X和χ ! 其中之一為氫）： —5—羥基金辋烷一 2 —酮製備如Gel UR s y nthes i s, 3 74 (1972)所述； 一5—溴金網烷一2—酮和5—氣金鏑烷一酮乃 製備如Ge 1 uk等人所箸Tetrahedron 2 4 5 3 6 9 (1968)中所述。 _-an-_ 本紙张尺度边用中a Η家標準(CNS)T4規格（2丨0x297公*) S1. 2. 20,000 ft.066- 五、發明説明QC) 其 中 X 或 X 1 為 氟 9 未 取 代 ( 硕 數 較 低 ) 院 基 * 例 如 Th t 一 丁 基 > 取 代 ( 碩 數 較 低 ) 院 基 1 例 如 三 氟 甲 基 I 未 取 先 閲 代 的 ifi 芳 基 • 例 如 苯 基 或 取 代 的 芳 基 » 例 如 P 一 氯 苯 基 1 P 背 \ί7; — 甲氣基苯基或 P 一 硝基苯基 » 參見 1 e N 〇 b e 1 等 之 注 意 人 所 著 J • A m C h e m - S 〇 C • » 1 0 8 1 5 9 事 項 8 1 ( 9 8 6 ) 和 W a 1 b 〇 r S k y 等 人 所 著 J A m m % • C h e m • S 〇 C • ， 1 0 9 » 6 7 1 9 ( 1 9 8 7 ) 本 Η ( X 或 X 1 為羥基甲基） Ο 簡單的單元程序允許很多上述的X或X 1 取代基或者 此 技 其 它 已 知 者 的 取 代 基 轉 換 成 5 — X — 或 5 — X I — 金 銅 院 — 2 — 酮 • 其 中 X 或 X 1 可為三烷基甲矽烷氣基 « 碘 或 氡 基 〇 這 Jit 部 份 在 上 述 反 應 第 4 階段中的溫和條件之下 呈 現 穩 定 狀 態 Q 例 如 » 當 5 — 羥 基 金 銅 烷 — 2 — 酮 與 5 7 % 氳 rv*t m 酸 共 回 流 7 小 時 後 1 得 到 5 — 碘 金 鋼 焼 — 2 — 酮 ( 熔 點 為 7 3 到 7 6 V ) 〇 5 — 羧 基 金 銷 烷 — 2 — 酮 的 製 備 $ 如 L, a η t V 〇 e V » J • 0 b S h C h • K h i m • 1 1 2 1 2 3 6 1 ( 1 9 7 6 ) 或 者 L e N 0 b 1 e 等人 • 9 J • 0 Γ g • C h e m • 1 4 8 I 1 1 0 1 ( 1 9 8 3 ) 所 述 > 在 將 甲 基 酯 皂 化 之 後 9 利 用 T a b u S h ί 等 人 J • 0 Γ g * C h e m • • 3 8 9 3 4 4 7 ( 1 9 7 3 ) 的三道步驟程序而可被轉化成5 一 氱 金 銅 院 — 2 — m » 經 由 一 種酮醛肢中間塍可用以得到 1 — 氡金銅烷 — 2 一 酮 裝 ΤΓ 線

經濟部中央標準局貝工消许合作社印M 異構物。5_三甲基甲矽烷金鋼烷一 2_酮（熔點34_ -34- 本紙尺度边用中a B家《準(CNS) T4規tft(210x297公;¢) S1. ?. 20,000 五、發明説明 酮備 - 製 2 來 I 鹼 烷的 網量 金等 基一 S! 用 - 使 5 4 的驟 態步 型中 護序 保程 被應 為反 作述 可上 , 在 許 P 允 8 只 3 , 〇 X , 化的態 烷它狀 矽其定 甲 ，穩 去是止 以的靜 予解於 術 了處 技所要 準士需 標人不 用般中 利 一 ·當 著的程 接技過 可此應 ，知反 醚習舾 醇被整 烯可在 的信基 應相丨 對 X 相 和 0 子 化原 轉溴 應或 反子 的原 符氣 相一 件為 條丨 構 X 结和 它 X 其當 與 ， 被是 可的 中現 驟發 步被 何經 任已 在 ， 是如 但例 (請先閲讀背而之注意节項洱项寫本 在和 ,溫 匿 =J βΒ ντ- 間進 中 下 醇況 烯情 的量 5 過 和耳 4 莫 驟氨 步態 中液 序或 程醇 應二 反内 •C~\ty ab 上omf(b 備室 製彈 ,溫 時高 經濟部屮央櫺準而貝工消费合作杜印51 的溶劑分解作用。與二醇（如乙二醇或丙二醇）的反應速 率只有在提高溫度（105到120TM以及在質子受者 如碩酸銪的存在時才會稍快一些。一般而言，此種反應很 慢，但是是很乾淨，且可避免使用水銀或重金靥來促進羥 基烷基醚的形成。3 —(甲氣基一5 — (2 —羥基乙氣基 )三環〔3. 3. 1. 1. 3 7] +基—2 -基叉甲基） 酚可.被三甲基乙醛氨化物和三乙胺酯化而得到相對應的二 酯，二酯然後被甲醇中的磺酸鉀選擇性的裂解，而得到酚 單酯。該磷醯化步驟同時合併了 /9 —位置去除和使用在甲 醇中的甲氧化鈉對障礙酯進行皂化作用，最後得到羥基乙 氧基烯醇醚磷酸鹽。 在通以壓力情況下，相對應的5_溴化合物與液態氨 (在二噁烷中）反應會産生3 — （甲氧基一 5 -胺基三環 〔3. 3.1. 1. 3 7〕十基_2 一基叉甲基）酚，使 *35- 本紙張尺度边用中a國家標準(CNS)T4規格（2】0><297公龙） S1. 2. 20,000 ft- 1066

Λ (i Π G 五、發明説明 經濟部屮央標準局Κ3：工消"合作社印製 用 的 方 法 乃 敘 逑 於 Η U m m e 1 e η 的 論 文 ( U η 1 V e Γ S i t y 〇 f G Γ 〇 η i η g e η » T h e N e t h e Γ 1 a η d S t P 6 0 ( 1 9 8 5 ) ) 〇 使 用 兩 田 量 的 氯 化 乙 m 或 醋 酸 甲 酸 酐 和 4 — 二 甲 基 胺 基 at 啶 作 m 1 依 照 G a W r 〇 η S k i 等 人 的 著 作 ( J • A m • C h e m • S 〇 C • > 1 〇 9 > 6 7 6 2 ( 1 9 8 7 ) 所 述 程 序 對 上 述 得 到 的 胺 基 烯 醇 m 酚 進 行 快 速 的 醯 基 化 而 酯 化 ( 5 — 羥 基 金 銅 烷 基 叉 ) 乙 醇 » 终 而 得 到 甲 醛 胺 基 或 乙 醛 胺 基 酚 % 酯 I 然 後 照 著 上 述 方 法 進 行 選 擇 性 的 皂 化 作 用 * 以 及 下 述 方 法 進 行 m 醯 基 化 和 光 氧 化 作 用 〇 Μ e i j e Γ 在 其 論 文 中 ( U η ί V e Γ S i t y 〇 f G， Γ 〇 η i η g e η • Τ h e N e t h e Γ 1 a η d S ( 1 9 8 2 ) t Ν U m a η 等 人 在 其 著 述 ( J • 0 Γ g * C h e m • 9 4 3 » 2 2 3 2 ( 1 9 7 8 ) > 以 及 F a U 1 k η e Γ 等 人 的 ( J • C h e m • S 〇 c * » C h.. e m • C ο m m • 3 9 0 6 ( 1 9 7 1 ) 提 供 以 4 — 甲 撐 金 綱 院 — 2 — 酮 ( X 和 X 1 在 以 上 式 I 的 4 ， 位 置 為 氣 • 甲 撐 ) 作 為 上 述 反 應 程 序 第 4 道 步 驟 以 及 後 缠 反 應 的 起 始 材 料 • 與 一 合 適 的 磷 酸 鹽 安 定 化 陰 磺 離 子 〇 單 一 氧 對 烯 醇 醚 以 取 代 外 甲 撐 官 能 基 的 反 應 性 差 異 • 確 保 了 二 鈉 3 — ( 4 — 甲 氣 基 螺 — C 1 t 2 — 二 氣 雜 環 丁 烷 一 3 ， 2 — ( 4 一 甲 撐 ) 三 環 C 3 • 3 • 1 • 1 3 , 7 3 十 院 3 一 4 — 基 一 ) 苯 基 磷 酸 m 會 是 一 種 光 氣 化 産 物 〇 -36- (請先閱讀背而之注意事項|#填寫本！^ 裝- 訂- 線 本紙張尺度边用中a a家標準（CNS) T4規格(210x297公¢) SI. 2. 20,000 2 2 發明説明 m Λ η Ο.

tlvW 五、·? 鹽二酯可被單一氣氣化到1, 2—二氣雜環丁烷對應物， 接著在室溫下與甲氧化鈉（甲醇中）反應，然後在水性工 作環境中進行預備反相高壓液相色層分析，得到同側和異 側異構物混合物的純1, 2-二氣雜琛丁烷磷酸鹽單酯鹽 。也可使用形成1, 2_二氣雜環丁烷的化學方法，包括 使用三乙基甲矽烷氫三氧化物，磷酸鹽臭氧化物或三芳基 胺自由基陽離子一在參氣存在下調解電子氣化作用。 起始材料的化學式為： 1? 先 閲 而 之 注 意 項 % 本

ο 3 dv A k 此述 X 以上 ， 料，X 材如一 始例雙 起 0 -些的 6 這知 ， 由已5 者是的 或也代 , 體 取 氫間式 為中、方 不的稱 但成對 . 合 用 同所使 相法 4 1 方驟 X 的步 和定序 X 認程 中所應' 其技反 經濟部中央栉準局A工消$:：合作社印製 環 烷 丁 環 雜 氣稱 t 二對 e 員的 t 四基 S 於代 ί 關取略 相 1 策 在 X 成 生和合 産 X 基 會含醯 銅包乙 1 置單 2 位昆 1 的 〇 烷側烷 鏑反丁 金和環 I 側雜 ! 同氣 2 二 t 人 等 _ e 9 t 1 s 0 ; 二酮 _ I 7 2 , I 3 烷 I 鋼 基金 壬基 3 羥 1 二 . I 3 7 • P 3 5 t 備 環製 雙基 由醛 經乙 可烯 彡乙 人 < 等7 Γ ο e 8 t 1 t f

L e 7 7 9 . Tm . e . h 人 C 等 . 1 η 1 Π i A m a s H g 見 i 參 边 ;度 尺 張 紙 一本 很 :τ \t/ (CNS 毕 標 家 公 237 S1. 2. 20,000 M1066 Ιϊ 6 五 發明説明 如 中得到 的避免 甲醇中 的揮發 ,可使 胺以及 副産物 步 應以産 氣或溴 溶劑的 .0〕 或更高 的鹼很 果在加入酵素可去除基如磷 選擇性的可裂解特戊醯氣芳 分離羥基芳基烯醇醚。可經 )氣直接分開特戊醯酯，並 份，得到乾燥固匾的芳基氣 用此預成型，在乾燥極性非 無路易斯酸情況下，進行上 可在步驟7或8的工作相中 驟7的2—氡乙基磷酸鹽二 生步驟8的磷酸單酯。在步 的衍生物較佳舆一揮發性胺 B U，，( 1 , )於一醇溶劑 的壓力以及環境溫度下使用 容易在反應最終的真空下揮 酸酯基之 基烯醇醚 由一當量 且在反應 化鈉。在 質子溶劑 述反應步 予以去除 酯産物進 驟8當中 前的任何反應 ，則可更方便 的甲氧化鈉（ 最後除去所有 此種情況之下 如二甲基甲醛 驟6 ,無機鹽 0 行/3 —去除反 ,X或X 1為 先 IVJ in 背 而 之 注 意 事 項 填 % 本 -§ 有機胺如” D 十一基一 7烯 如氨，或者與一可溶於 8 -重氮雙環〔5. 4 如甲醇中。在大氣壓力 氨較為有利，因為過量 發。 經濟部中央標準局只工消费合作社印製

Z 如 ο 例合 ，基 酸 * 1 ，聚e苯 磷 用 ί 劑如 C 四 基 作氣溶器ηι 乙 化一共應 eo氰 氣單有iglci 2 I 的著含光 C , 2 鹽藉可由 S5. 物 酸乃也經yl 。産 憐其 ，可 1 , > 粗 酸 ，成氣 〇 o P 的 醇行完 1 p 1 P 7 _ 缔進中單 < ,τ 驟37 的式仿 。1 5 ί 步 · 9 方氯醇 a 者盼應 驟學如甲 S 或樸反 步化烴如 C , I 述 程光化 ，e 藍 Η 上 過 用齒醇 Β 撐 3 自 應可如的 甲 2 得 反-劑數 e ,,, 述的溶硝 者 上 示化低 Ο C1 或 "顯 鹵較Rη 2 所在如物 I I 本紙张尺度边用中a Η家樣準(CNS)f 4規格(2丨0X297公*) S1. 2. 20,000 2^066 五、發明説明 經濟部屮央楳準局员工消"合作社印製 etrahedron, 27 5, 7 —二羥基金鏑烷一 2 — 金铜烷_2 —酮或其5, 7 — ，方法是採用47%水性氫溴 水性氫碘酸，在Ge 1 uk等 件下完成。5, 7 -二院基金 —二甲基一金銷烷一 2 —酮， Am. Chem. Soc., 9 )的方法予以合成。在依照 加改良之後，將3 — （甲氣基 3.3. 13 7〕十基一 2 一 二醇或Γ, 4 — 丁二酵在碩酸 可得到相對應的對稱雙羥基烷 環丁烷。 當有人想要利用以不同於 合作效應時，特別是當利用此 環丁烷作為異構混合物，不對 烷一 2 —酮可被用於上述反應 7—三氟金鋼烷一2__的製 ki i等人掲示於Zh. 0 b 7,2339 (1981)的 銅院—2 —酮和5 —甲基一 7 t e t t e r等人掲示於1 〇 -3 9 請 先 閲 讀 背 而 之 注 意 項 % 木 9 4 3 1 7 ( 1 9 7 1 ) 〇 酮 可 被 轉 化 成 5 » 7 — 二 溴 二 氛 和 5 f 7 — 二 碘 類 似 物 酸 • 亞 硫 鹽 氱 化 物 或 者 5 7 人 於 1 〇 C • C i t 所 述 條 綱 院 一 2 — 9 例 如 5 » 7 可 利 用 K i Γ a 等 人 於 J • 1 1 1 1 8 2 5 6 ( 1 9 8 上 述 單 取 代 衍 生 物 的 路 徑 稍 — 5 • 7 — 二 溴 三 環 C 3 • 基 叉 二 甲 基 ) 酚 與 二 醇 如 乙 鉀 存 在 之 下 進 行 溶 劑 分 解 * 氧 基 取 代 的 1 ， 2 — 二 氧 雜 X 1 不 是 氳 的 X 基 不 是 氫 的 m 酵 素 裂 解 1 • 2 — 二 氣 雜 稱 5 7 ( X 參 X 1 ) 金 銷 程 序 的 步 驟 4 中 0 5 — 溴 — 備 可 依 S 〇 r 〇 C h i η S S h C h • K h ί m • » 1 方 法 〇 5 — 氛 一 7 — 羥 基 金 — 羥 基 金 銷 — 2 — _ 已 被 S C C i t » 而 5 溴 — 7 本紙張尺度逍用中Η困家標準（CNS) T4規格（210x297公龙） S1. 2. 20,000 ft A A 4- • J 2 經濟部屮央樣準局貝工消货合作社印製 五、發明説W (々Μ · 一羥基金銷烷一 2-酮可自7 —甲撐雙環〔3. 3. 1〕 壬基一3, 9—二酮一9一乙烯乙醛基合成，乃依照St e t t e Γ掲示將該化合物.溶解於無水乙醇，並在〇它下 用溴化氫氣體取代氛化氳氣髏飽和溶液而得到相對應的氯 衍生物。 合成上述式I中尺t不是較低烷氣基且r2不是磷醒 氣基鹽取代苯基的化合物的合成方法和中間體被發現於上 述 Bronstein 等人，Edwards 和 Edwa rd等人（’672)申請案。 如同上述.本發明亦關於使用其化學發光酵素方式予 以裂解取代的1, 2 -二氧雜環丁烷於被此技所認定的鑑 定中，其中包括供偵測樣品中的酵素，此類鑑定所用的工 具，以及完成此類用途所需要的装置等。 例如，當使用本發明來偵測一種樣品中的酵素時，使 該樣品與一種含有可被欲偵測酵素裂解基的二氧雜環丁烷 接觸..，該酵素裂解了二氣雜環丁烷的酵素裂解基以形成帶 負電荷的取代基（例如氧陰離子）鍵結到二氧雜環丁烷上 。該帶負電的取代基轉而破壞二氣雜環丁烷的穩定性，造 成二氧雜環丁烷分解而形成會發光能量的螢光發色圃。偵 測到這種發色團就視為有該種酵素的存在。藉著測量發光 的強度，便可決定酵素在樣品中的濃度。 尚有許多其它利用目測裝置來決定樣品中特殊物質的 存在與否以及其濃度。上逑二氣雜環丁烷可被用於許多種 ________________ ____________ -40·__ 先 閲 ifi 背 而 之 注 意 事 項 % 本 裝 線 本紙張尺度逍用中a困家標準(CNS) 規格(210x297公釐） S1. 20,000 經濟部屮央標準局β工消费合作社印製 Λ Π 6 五、發明説明Pi p 鑑定作業中。這些鑑定作業的實例包括偵測抗體或抗原如 5 —或>3 — hCG的免疫鑑定；酵素鑑定；偵測如鉀或納 離子的化學鑑定；以及偵測如病毒（如HTLV III 或巨细胞病毒或細菌（如大腸菌）和某些細胞官能基（如 受體結合位置）。 當被偵測物質為一種抗體，抗原或核酸時，具備裂解 二氧雜環丁烷酵素可裂解基的酵素較佳被鍵結到一對待偵 測物質（亦即持定的鍵结到待偵測物質的物質）具備特定 的親和力，也就是一種抗原，抗體或核酸探針。傳統的方 法如碩化二醒亞胺偶和，被用來將酵素鍵結到特定親和性 的物質；鍵結較佳為透過醛胺的結合。 一般’而言，鑑定作業乃依以下方式進行。一種被懷疑 含有待偵測物質的樣品與一種含有鍵結到一種物質的酵素 缓衝溶液接觸，該物質對待偵測物質具備持殊的親和力， 最終的溶液被培養並允許待偵測物質鍵結到待殊親和力酵 素化合物的待殊親和部份，然後將過量待殊親和力酵素冲 洗掉，並加入一種含有可被特定親和酵素化合物的酵素部 份裂解基的二氣雜環丁烷。酵素裂解了酵素可裂解基，造 成二氧雜環丁烷分解成兩個羰基化合物（如一種酯，酮或 醛）。被酵素可裂解基鍵結的發色圃被激發而發光。發光 情況被偵測到（使用如一種電池，或相機發光計中的感光 底M,或者一種光電池或光電子倍增管），作為樣品中存 在有待偵測物質的證據。發光強度經測量之後，可藉以決 ______________________ -4 1- (請先閱讀背而之注意事項一^碼筠本一!-· 裝· 線* 本紙張尺度边用中a «家標準(CHS) T4規格(210x297公；«：) S1. 2. 20,000 2U066 Λ β Β 6 五、發明説明G約 經濟部中央榀準局=5工消费合作社印製 定待測物質的濃度。 特殊鑑定作業的實例如下。 A .鑑定人類I s G 一値有箸96井的撖滴定盤被塗佈羊抗人類IgG ( F (ab) 2特殊碎片），對并加入含有人類IgG的血 清樣品，在室溫之下對井培養1小時。 依照培養周期，從井中去除血清樣品，然後用含有 Ο. 15M氛化鈉，0. 0 1M磷酸鹽和0. 1%胎牛血 清蛋白素（PH7. 4)水性缓衝溶液沖洗井4次。 鍵結到抗人類IsG的鹺性磷酸酶被加入毎個井中， 對井培養1小時，然後用上述緩衝溶液沖洗4次，再加入 本發明=氧雜環丁烷含磷酸酯的緩衝溶液。二氣雜環丁烷 的酵素裂解所造成的最終發光在發光計或者用相機光發光 計中的底片被偵測到。 B .鑑定h C G ..兔子抗一ct — hCG被吸附到一耐陵網薄膜上。用1 毫升含0. 15M氱化鉑，0. 01M磷酸鹽和0. 1% 胎牛血清蛋白素（PH7. 4)的沖洗薄膜之後，將含h C G如孕婦尿液謅該薄膜吸收。 標記驗性磷酸酶的抗一P—hCG被加入薄膜，該薄 膜再度被2毫升上述缓衝溶液沖洗，然後將薄膜置於發光 計的小池或放入一像機發光計，並與一含磷酸鹽的本發明 二氧雜環丁烷接觸。肇始於二氣雜環丁烷的酵素劣解所造 -4 ?- ____________

Th先閲背 而 之 注 意 事項 填 %本 Μ 裝 訂 線 本紙5JL尺度逍用中國困家榣毕(CNS) ΤΜ規怙（2ΚΙΧ297公;«:) S1. 2. 20,000 五、發明説明 請 先 m ih 背 而 之 市 項 % 本 成的發光然後被偵測出來。 c.鑑定血清鹾性磷酸醻 2. 7毫升含Ο. 8M的2—甲基一2_胺基丙酵的 水性鍰衝溶液被置人1 2x75mm的Pyr ex試管， 加入含鹼性磷酸酶的〇. 1毫升血清樣品，然後將溶液均 衡到3 0X：,加入0. 2毫升本發明含磷酸鹽的二氣雜環 丁烷，迅速將試管置於一發光計以記錄最終發光，發光水 平將.與鹼性磷酸酶活性的速率呈正比。 D .核酸雜交鑑定 經：冰部.屮央標準而貝工消你合作社印製 一種被懷疑含有巨细胞病毒的腦脊鷂流饈（CSF) 的樣品被收集並置放於一薄膜之上，如一種耐隆或硝基纖 維素薄膜，然後用尿素或胍異硫氣酸鹽的化學處理以打破 細胞壁並分解所有的細胞成份（除了病毒DNA成份）， 如此製得的病毒DNA的成份束被分離並使與硝基纖維素 濾紙接觸。將一種對病毒DNA具備持殊效應且被鹼性磷 酸酶..標記的DNA探針被置於過濾紙上；該探針與互補的 病骞DNA成份束逹成雜交作用，雜交完成之後，用含有 〇 . 2M 氯化鈉和 0. ImmTris-HCL (pH 為 8 . 1 0 )的水性缓衝溶液沖洗該濾紙，以去除過剩的探 針分子。本發明一種含磷酸鹽的二氣雜環丁烷被加入，經 由酵素裂解二氣雜環丁烷所發出最終的光被發光計或被照 像底Η偵測到。 Ε.鑑定半乳糖苷酶 ________ . . _ - " d Ί - 本紙張尺度边用中Η 8家標毕（CNS) T 4規怙（210X297公龙） S1. 2. 20,000 211066 Λ () Π 6 經濟部屮央楞準局Μ工消赀合作社印魟 五、發明説明（4^ 在上述鑑定作業以及以下所要敘述的實施例當中，可 分別加入含α —或/9 一可裂解的半乳糖苷醑或者含〇t_D 一或/3 - D —半乳；:者脊（galactopyranoside)基，因為酵鬵 裂解糖發光園部份所産生的光會被發光計或照片底Η偵测 到。 F .電泳 電泳可依無在電場中的膠支持物上分子大小和結構來 分離蛋白質和核酸的錯合混合物。此種技術也可被應到蛋 白分解之後分離核酸碎Η,或者可應用於利用限制内核酶 技術（如同在DNA序列中一般）施行剪離作業之後分離 核酸碎片的工作。在對膠内的品種進行電泳分離作業之後 ，或者在；if分離的品種從膠上轉移到一薄膜之上，結合到 一配位基上的酵素來偵測有鍵結現象。例如，用一錮以共 價方式連接到G性磷酸藺的抗體來偵測衫：碎片。另外一値 在DNA序列鹼性磷酸酶的例子，卵白素結合到生物素基 化核.苷酸基之上。之後，本發明一個AMP PD類似物被 加入騾或薄膜濾紙上。經過短暫的培養之後，因為二氣雜 環丁烷的酵素活性化作用形成發光品種而發光，發光被X 射線或立即式光照片底片或者被發光計偵測到。多頻道分 析進一步改進以前的方法，其乃藉著同時探測一種以上的 碎片。 G .固態鑑定 在固態鑑定中，希望能夠用非持殊蛋白質如胎牛血清 (請先閱讀背而之注意事項再蜞寫木一^ 裝· 本紙張尺度逍用中a Η家楳準（CNS)TM規格（2丨0x297公*) S1. 2. 20,000 2ii〇66 Λ Π Ιϊ 6 經濟部中央標準而β工消赀合作社印製 五、發明説明 (4-/) 蛋白素（BSA)或明膠預先處理非特殊結合位置以阻斷 非持殊結合在母體上。己經發現到部份業BSA商品製備 物含有少量會表現出磷酸酶活性•該活性會導致來自AM PPD所不希望見到的背景發光。然而，也有人發現到某 些水溶性合成巨分子物質在使用二氣雜環丁烷作固態鑑定 時是效率頗佳的非特殊结合阻斷劑。這些物質中較佳者為 水溶性聚合季銨S,如BDMQ,聚（氣化乙烯苄基三甲 基銨）（TMQ),以及聚（氛化乙烯苄基三丁基銨）（ TBQ)。其它此類物質被掲示於前述Voyta等人的 ’ 2 6 3申諳案和以下的表I I I。 Η ,鑑定核苷酸酶 一種鑑定酵素ATP a s e的作業分為兩道步驟。其 第一道步驟中，酵素在其最佳的PH (典型為PH7. 4 )與一包括經由末端磷酸酯鍵結的共價結合到一發色圃取 代的1, 2—二氣雜環丁烷的ATP以製造磷酵基一發色 團一取代的1, 2二氣雜環丁烷。第二道步驟中，籍著加 入酸使pH降低到6以下，較佳降低到PH2-4將第一 道步驟的産物分解，用發光計或色層薄膜偵測最終的光。 另一傾類似的兩道步驟方法中，ADP a s e的鑑定作業 是使用本發明發色團取代1, 2 —二氧雜環丁烷的ADP 衍生物作為基質，而5’ 一核苷酸酶的鑑定作業使用本發 明發色團取代的1, 2-二氣雜環丁烷的一種腺苷酸衍生 物作為基質。第二道步驟可經由加入酵素鹺性磷酸酶以分 _-4 5-__ ih 先 閲 讀 背 而 之 it 意 項 再 % 裝 訂 線 f紙尺度边用中a因家楳毕（CNS) T4規格（210X297公址） S1. 2. 20,000 Λ fi Π 6 211066 五、發明説明（4^ 先 閲 ih 背 而 之 >主 意 事 項 % 本 解磷醯基一發色圃—取代的1, 2 -二氣雜環丁烷。 I .核酸序列 在使用本發明的發光1, 2 -二氣雜環丁烷施以II泳 分離作業之後，可偵測到製備於序列 P r 〇 t 〇 c ο 1的D N A 和R N A碎片。

藉由二去氣鏈終結方法[Sanger,F等人 Proc.Nat.Acad.Sci.(USA),74:5463(1977)]可進行 D N A 序列。簡單的說，對四痼序列反應之中的毎一艢反應而言 ，單束型板DNA與二去氣核苷酸，生物素基化 (biotinylated)原始質束 DN A 〇 在 之後，Klenovi 酵 素和三磷酸去氣腺苷與每一種四個序列反應混合物一起培 養，然後加入三磷酸去氣腺苷/再繼續培養。 接著，利用聚丙烯醛胺膠電泳（PAGE)分離反應 混合物之中的D N A碎片。該碎片被轉移到一薄膜之上， 較佳於耐隆上薄膜上，將該碎Η暴露於紫外線下而使碎Η 在薄.膜之上交鍵，較佳於短波長的紫外線下。 經濟部中央標準^β工消伢合作社印製 在使用一種聚合物，如肝磷脂，酪蛋白或血清蛋白素 ，阻斷非特殊鍵結位置之後，薄膜上的DNA碎片與以共 價方式連接到本發明特殊的1, 二氣雜環丁烷基質的 酵素可裂解基具備特殊特性的酵素的卵白素或鏈徽卵白素 。當卵白素或鐽徽卵白素親和的結合到生物素時，生物素 基化DNA碎片即將被標記一種酵素。例如，當化學發光 基質為二鈉3_ (4 —甲氣基螺[1, 2 —二氣雜環丁烷 -A R - S1. 2. 20,000 本尺度逍用中织Η家楳芈(CMS) T4規格（210x297公龙） 211066 五、發明説明（4^) 一 3, 2，一 （5，—氯）三琛[3. 3. 1. 13,7〕 癸烷〕一 4 一基）苯基磷酸鹽二氣雜環丁烷鹽（C 1 _a MPPD) ·卵白素或鍵級卵白素即將被共軛到一種磷酸 酶上。相似的情況之下，當化學發光基質為二鈉3- （4 一甲氧基螺〔1，2 —二氧雜環丁烷一3 — 2，— （5， 一氯）三環〔3. 3. 1. 1. 3,7〕癸烷〕一 4 一基） 苯基/S — D —吡喃半乳糖（C1-AMPGD)，卵白素 或鐽徽卵白素與半乳糖苷醻。 將DNA碎片一錯合物一生物素一卵白素（或者鏈徽 卵白素）一酵素與適當的1, 2—二氣雜環丁烷在鹼性 pH如約高於pH8. 5時接觸以産生發光，DNA碎片 在對光線敏娀的底片如X射線或立即顯像底Η下或者在光 電發計儀器之中現形。 以上所敘述的偵測方法也可被應到整體基因D Ν Α序 列報告（Church . e t al. [Church, G . M . , et a 1., Pro?. Hat. Acad. Sci. (USA),81:1991(1984)]。將經過化 學裂解和電泳分離的DNA[Haxan, A.M. et a 1. , P r o c . Nat . Acad. Sci· (USA), 74:560(1997)]轉移到一薄膜上 之後，較佳於耐隆上，並且將階梯（1 a d d e r)藉由紫外線交 鍵到薄膜上，特殊的D N A序列可經由先後加入以下的成 份而偵測出*來：生物素基化寡核苷酸為雜交探針；卵白素 或鍵徽卵白素共價結合到對本發明酵素可裂解化學發光1 ,2 —二氣雜環丁烷具備特殊作用的酵素上；和適當的1

jlLL 本紙張尺度边用中a Η家«毕（CNS) T 4規格(210x297公；¢) 閲 背 而 之 注 意 事 項 m % 木 4 裝 線 經濟部中央楳準^A工消#合作社印製 S1. 20,000 η 6 五、發明説明（4f ,2 —二氣雜環丁烷。序列階梯的影像（由PAGE所生 成）可，依上述而製備得。 序列再度探測序列階梯可藉由以下方式完成：首先藉 著使薄膜與一種加熱的淸潔劑（例如在約8 Of到約9 ου 從約0. 5到約5%十二烷基硫酸鈉（SDS)在水中所 形成的溶液，然後再從約7 0 t冷卻到約5 0 t )溶液從 薄膜剝離雜交的探針和化學發光物質，將目前毫無掩飾的 DNA碎片與另一種生物素基化寡核苷酸探針雜交以産生 一種如上所述的影像化學。 類似的偵测方法可被應用到利用R N A序列方法所製 舞 備出來的RNA碎H。 為了使得習知此技人士能夠完全的了解本發明，乃提 出以下的實施例。這些賁施例僅為示範目的，不應該被視 為對本發明的限制。所有部份（parts)和百分比均為重量/ 體積，除了 TLC溶劑混合物之體積/體積表示之外，或 者有恃別磬明者除外

Tk 先 間 背 而 之 注 意 事 項 m % 本 經濟部中央榀準局κχ工消费合作社印製 R ( Μ 無 Ν 的： Η 況此 1 情因 1-'·.一 的 體有置 間所位 中在環 醚而叉 醇”基 烯子 I 的質 ， 供条 2 提香 I 所芳烷 例表銷 施代金 實 } 表 的，代 份 ί 均 部甩份 某使部 料 } 資 ， 本紙5fc尺度边用中® Η家楳毕（CNS)<P4規怙（210x29/公址） S1. 2. 20,000 811066 經濟部屮央榀準局β工消费合作社印製 五、發明説明

X

k

OM OM 實施例I 200‘克（1. 64莫耳）的3 -羥基苄基酵和270 毫升（1. 93莫耳）的三乙基胺披注入一含1升氣化甲 撐（於冰浴中）燒瓶中，用機槭方式攪拌最終的棕色溶液 ，在15分鐘之内從另外一値含2 12毫升（1. 72莫 耳）的三甲基乙醯基氯化物的漏斗以細流方式加入該溶液 中，最終的泥漿另外再被攪拌15分鐘，除去冰浴，反應 再進行2小時，TLC (K5F;25%丙酮一己烷）顯 示起始物質已經消失，而且出成較高含量的Rf。反應混 合物被轉移到分離式漏斗，並混合250毫升的1M氫氛 酸，用水（2x400毫升）萃取有機相，乾燥溶液通過 矽曙塞，以旋轉方式予以蒸發，然後在真空之下（1. 0 mmHs)得到348克的撖棕色油狀的3 —特戊醛氧苄 醛，該産物被保持氬氣中。 實施例I I 4 0 0克的p —甲苯磺酸溶於2 5毫升的甲醇中所形 成的溶液在一邊攪拌下加入實施例I的3 -特戊醯氣一苄 然後逐滴加人三甲基原甲酸鹽（224毫升；2. 05 莫耳），攪拌1小時，溶液所釋出少量熱置可予以忽略。

Tk 先 閲 ili 背 而 之 注 意 項 再 m % 本 装 線 本紙足度遑用中8 Η家棵毕(CNS) T4規格(21DX297公龙） S1. 2. 20,000 Λ 6 Η 6 211066 五 、發明説明

Tk 先 閲 讀 背 而 之 注 意 亊 項 % 本 加入0. 5克的磺酸氫鈉，將燒瓶置於旋轉蒸發器（浴溫 4 0*C)中以除去所有的揮發物。最終的油在氮氣之下通 過一短矽膠管柱以得到橙一棕色油，繼而在真空之下 (1. OmmHg)攪拌，得到426克的粗3 —戊特醛 氣苄醛二甲基乙醛。红外線分析顯示没有醛羧基的吸收 (1 6 9 5 cm-1 ) 〇

實啤例I I I 實施例I I的粗3 —特戊醯氣苄醛二甲基乙醯在3升 燒瓶的氬氣大氣中被溶於1升的氯化甲撐（剛蒸蹓P2 〇5 所得），然後，347毫升（2. 03奠耳）的三乙基亞 瞵酸靆被一次加入，該燒瓶被接上一値隔板入口接頭，並 且在通入微置氬氣之下被置於冰丙酮浴中冷卻。用注射茼 分成數次加入三氟化硼醚酸鹽（249毫升；2. 03莫 耳），並伴之劇烈的攪拌。最終的反應混合物在一 551C 之下被搜拌2小時，然後儲存在一 2 01C的冷凍室過夜。

經濟部屮央榣準局员工消货合作杜印M .然後，將燒瓶回溫到室溫，將其内容物攢拌4小時， 小心將橙棕色的溶液倒入1 7 0克碩酸氫鈉在8 0 0毫升 水中所形成劇烈攪拌泥漿，攪拌速度以不産生劇烈發泡為 原則。經過剌烈攪拌雙相混合物達1小時之後，在一分離 式漏斗中分離兩層，用氛化甲撐（2x250毫升）萃取 水相，混合的有機相萃取物經過硫酸鈉的乾燥，濃縮，並 於真空之下蒸發，産生535克的清澈，淡黃色的油狀二 乙基1一甲氣基一1一 （3—特戊醯氣苯基）甲烷磷酸鹽 S1. 20,000 本紙張尺度边用中H a家標準(CNS)T4規岱(2]0X297公龙） 211066 Μ 五、發明説明C40

Th 先 閲 背 而 之 /i- 意 事 項 再 % 本 (〇 . 25mmHg 的沸點 158 — 16 1¾),實施例 I到I I I的總程序産量為9 1 %。 ^NMR (400MHz ；CDCl3) ： δ • 1. 21 和 1. 25 (6Η,兩値 t, 7Hz, 〇CH2 C H 3 ) :3.37 ( 3 H , s,ArCH〇CH3); 3 . 80 ( 3 H , s , A r 0 C H 3 ) ； 3 9 〇 - 4. 10 (4H, m, OCHz CHs ) ; 4.46 (1 H , d , 15. 6 H z , A r C Η P 〇 ) ； g 3 5

(1 H , m ) ； 7 . 〇〇 ( 2 H , m ) > 7 . 2 6 ( 1 H ，m ) 〇 I R (neat) :2974, 1 5 9 g f 1582, 148 0、1 2 2 5 ( P = 0 ) , 1 0 9 8, 1050, ，1020, 965cm'1 〇

實施例I V ..二異丙基醯胺（1 1· 6毫升，82. 8毫莫耳）在 經濟部中央櫺準局β工消#合作社印製 7 5毫升四氫》夫喃所形成的溶液在氬氣大氣下於乾燥冰 浴中被冷.卻到一7 8 °C ,正-丁基鋰於己烷（a 1 f r i ch 75. 〇毫莫耳）所形成的30¾升的2. 5M溶 液被用注射筒加入上逑溶液，然後攪拌最終的鋰二異丙基 醯胺溶液20分鐘，13. 47克（37. 6莫耳）二乙 基1—甲氣基一1— (3 —特戊醛氣苯基）甲烷磷酸鹽於 2 5毫升的四氫咳喃所形成的溶液在5分鐘之内從一個 _ -51- 本紙張尺度边用中8 8家標毕（〇阳）肀4規格（2]0><2!3/公龙） S1. 2. 20,000 A () Π 6 另外的漏斗 溫之下被搜 子。 4 . 9 酮在2 5毫 的呈撤雲霧 4 0分鐘内 9〇分鐘， 稀釋，用醋 機取萃取液 並濃縮，得 的混合物橙 1 Η N M R δ . 7 . 3 I d * vJ —= (2, H , m 211066 五、發明説明@ 中被逐滴加入該溶液中。最終的紅色溶液在低 拌3 0分鐘，以確保完金反應成磷酸鹽陰碩離 9克（30. 1毫莫耳）的羥基佥銷烷一 2 — 升四氫夫喃所形成的溶液被逐滴的加入，最終 狀的混合物在- 7 8 °C被攛拌，5分鐘，然後在 慢慢回溫到室溫。該溶液目前呈橙色，被回流 冷卻，用2 0 0毫升的飽和碩酸氫鈉溶液予以 酸乙酯（3x75毫升）予以萃取。混合的有 披用飽氮化鈉溶液沖洗，很快的在硫酸鈉乾燥 到12. 49克的酚条烯醇醚和其特戊醛酸酯 色膠體。 ^ (特戊醯酸酯，400MHz, CDC 13 : 請 先 閲 iH 背 而 之 注 意 事 項 再 填 % 本 3 (1 H , m , Η - 5 f ), 7 . 12 (1 Η 7 . 7 Hz, A r Η ) . 6 . 9 5 -7 .0 2 ,A r H ) . 3. 43 ( 1 Η , b .Η 經濟部中央櫺準而β工消#合作杜印製 e Μο S Η 3 /1· 8 2 3 9 7 2 Γ b Η 1Χ Η 7 S Γ b Η 1Α /IV 3 2 2 \—/ 3 I Η 9 5 7 8 m Η ix

3 Η C * (ο C 9 ο 5 C 3 S ) • 3 Η 1 9 C (.Η 4 C 3 ( • R 2 4 4 3 Η 2 2 4 4 7 1 1 t , 8 8 7 4 5 8 1 2 , · 2 4 ο 2 6 9 1 2 , ο II C 酯 5 6 6 1 2 5 IX 1* 4 7 2 IX 6 本紙?艮尺度遑用中B ffl家榣準（CNS) T4規格（210X297公*) S1. ；. 20,000 Λ f fi G 6Λ: 五、發明説明（4φ 經濟部屮央榣準而w工消"合作社印製 » 1 1 1 8 > 9 1 8 C m 1 0 此 混 合 物 被 吸 收 於 1 0 0 升 的 甲 醇 中 » 並 在 1 0 • 克 的 無 水 m 酸 鉀 的 存 在 之 下 回 流 3 • 5 小 時 • 然 後 將 甲 醇 脱 除 • 而 殘 留 物 在 水 和 醋 酸 乙 酯 之 間 分 層 1 有 機 層 被 飽 和 氯 化 鈉 溶 液 沖 洗 1 再 於 旋 轉 蒸 發 器 中 蒸 發 • 得 到 一 殘 留 物 殘 留 物 被 氯 仿 — 石 油 醚 再 結 晶 9 得 到 6 • 5 克 的 灰 白 色 固 體 3 — ( 甲 氣 基 — 5 — 羥 基 一 二 環 [ 3 • 3 * 1 • 1 3 7 ] 十 基 — 2 — 基 叉 甲 基 ) 酚 ( 熔 點 1 7 1 — 1 7 2 t： > 從 母 液 另 外 得 到 0 • 8 克 産 物 » 使 酚 % 烯 醇 m 總 産 量 為 7 9 % ( 以 5 — 羥 基 金 銷 院 一 2 一 酮 為 基 礎 ) 〇 X Η N Μ R ( 4 0 0 Μ Η Ζ 1 C D C 1 3 ) δ ( 1 I d d > J = 8 • 4 > 7 • 7 Η Ζ > Η — 5 > ) > 6 • 7 一 6 • 8 8 ( 3 Η 1 m » A Γ Η ) 1 6 • 3 6 ( 1 Η > b Γ • S > A Γ 0 Η ) 1 3 * 4 1 ( 1 Η t b Γ • S » Η — 1 ) t 3 • 2 8 ( 3 Η » s 1 0 Μ e ) 9 2 • 7 9 ( 1.. Η % b r • S t Η — 3 ) % 2 • 2 2 ( 1 Η > b Γ > S ， Η — 7 ) ί 1 • 5 6 — 1 • 9 8 ( 1 1 Η I m ) 0 I R ( C D C 1 3 ) ： 3 5 8 6 t 3 3 2 0 ( 0 Η ) t 3 〇 0 0 > 2 9 2 0 > 2 8 4 4 » 1 6 6 5 t 1 5 9 0 t 1 5 7 8 f 1 4 4 5 » 1 2 9 6 » 1 0 9 2 » 8 8 5 c m — X 0 Η R Μ s 理 論 值 ( C 1 8 Η 2 Ζ 0 3 ( Μ + ) 2 8 6 1 5 7 3 > 實 際 值 2 8 6 1 5 6 9 〇 (請先閲誚背而之注意事項再艰寫本-^. 裝· 訂_ 線· 5 3- 本从張尺度逍用中a國家樣準（CNS)T4規格（210x297公:Sr) S1. 2, 20,000 泰 ▲ ▲ 6 » 五、發明说明（0)

Ml 背 而 之 it 意 事 項 再 寫 本

實施例V 5 . 04克（17. 6毫莫耳）的3 — （甲氣基一5 一羥基三環〔3. 3. 1. 13 7〕十基_2一基叉金 銷烷基）酚於35毫升的四氫#喃所形成的溶掖在氬氣大 氣之下與3. 4毫升（24. 6毫莫耳）的三乙胺混合之 後，在冰浴中被冷卻到〇t。2 —氣一 2 —氣一 1，3, 2 —二氧磷酸烷（1. 95毫升，21. 1毫契耳）被逐 滴的加入並加以搜拌，5分鐘之後移走冰浴，在室溫之下 繼續攪拌45分鐘，用30毫升的無水二乙醇稀釋反應混 合物，然後在氬氣之下過濾以除去濕氣，三乙胺氫氛化物 然後被2 0毫升的二乙醇沖洗，濃縮的濾液在旋轉蒸發器 中蒸發而得到粘性淡橙色油狀磷酸三酯。 將上述三酯在氬氣之下溶於3 0毫升的分子篩乾燥二 甲基甲醯基之後，與1. 02克（20. 8毫莫耳）的乾 經濟部屮央櫺準局β工消费合作社印製 燥氣化鈉在室溫之下反應，添加時一次加入並加以攪拌。 在真空（1 . 〇毫米汞柱）和加熱到5 0 C之下除去溶劑 。當最終橙棕色殘留物溶於水中並在PLRP聚苯乙烯管 柱（聚合物實驗室）之上進行反相分析色層分析〔0. 碩酸氫鈉（水）一乙腈梯度〕，顯示反應已完全形成中間 體氡乙基磷酸二酯鈉鹽。 殘留物然後被35毫升的甲酵吸收，室溫之下一邊攪 拌下再被甲氣化納於甲醇中所形成的4. 85毫升的 4. 3 7 Μ (21. 1毫莫耳）吸收30分鐘，反相分析 __________ - R 4 - ____- _一 S1. 20,000 本紙張尺度逍用中曲明家標华(CNS)ΤΜ規怙(210x297公龙） Λ 6 Η 6 211066 五、發明説明（<ί) Η P L C顯示磷酸單酯的/5位置消除反應已完成。除去溶 劑，殘留物被1 〇%/丙酮碾製而得到膠狀固體。再度用 3%水/丙酮予以碾製以得到質硬灰白色固體.接箸被過 濾，真空（1. 〇毫米汞柱）下乾燥，得到8. 35克的 粗製二鈉3 — （甲氣基一 5 —羥基三環〔3. 3. 1. 1 十基一 2 -基叉金銷烷基）苯基磷酸鹽（被無機鹽汙染） Ο 使用水一乙腈梯度（於聚合物實驗室的PLRP聚苯 乙烯管柱）以及對適量部份進行冷凍乾燥法的反相製備 HPLC之後，得到5. 2克（72%)的白色顆粒固體 的純化合物，其軟化點為120f,在1 63 — 1 68¾ 的熔點熔成淡棕色膠體。 it Ml 讀 背 而 之 注 意 項 再 % 本 經濟部屮央標準局只工消费合作社印製 6 1 , ί , , Η · • VJ, VI/6H\J. 1Η 7 Η 8 3 1 ( ο 5 Γ (-61 Λ_· - A 6 2 Η ο ( Ο Η ·· 3 在 ) » ζ * 3 S 2 7 存 ο ζ Η ) * · » . 式·· ζΗ> ， ， )/ Γ NJ/ 1 形 ο D 4 3 5 Η b 3 _ 物 2 , . . I Γ , 12合Η Ζ78ΗΑΗΗ4 水 2 Η, II » » 1 > . 二* M3J s 2(sl 以0-ο . , . Η 7 . , 鹽 6 08d Γ41 Γ) 酸 ο 4 = , b . . b 7 碟 2 ( J Η * 7 3 « _ 示 a R.1HII Η H 顯 Ν Ν d ( 1 J ) 1 , 析 1 Μ d 5 ( · e ( S 分 2 Η * o 3 d M 1 素 H I H 9-06 Γ 〇 元 17. H > · b ) ( 6 1 s 2 * m c 8 本紙张尺度边用中a Η家樣毕(CNS) T4規格(210x297公«：) S1. 2. 20,000 211066 Λ (ί Π6 經濟部中央標準扃员工消贤合作社印Μ 五、發明説明（0 理 論 值 C 1 4 8 • 4 4 » Η » 5 * 6 5 Ρ 6 • 9 4 Τη 先 實 驗 值 C » 4 8 • 3 7 參 Η $ 5 * 9 0 • Ρ 6 • 8 7 閲 讀 實 施 例 V I 背 而 之 0 * 8 克 的 二 納 3 — ( 甲 氣 基 一 5 — 羥 基 三 環 C 3 • 注 意 3 1 1 ^ , 7 ) 十 基 一 2 一 基 叉 金 鋼 院 基 ) 苯 基 磷 酸 鹽 項 於 9 6 毫 升 的 2 5 % 無 水 甲 醇 / 氣 仿 ( 含 5 . 3 5 X 1 0 - 5 Μ % 本 亞 甲 藍 感 應 染 料 ) 所 形 成 的 溶 液 被 分 入 三 根 玻 χήί m 管 中 i 每 根 玻 璃 管 在 冰 浴 中 被 冷 卻 到 5 X： 將 氯 氣 通 入 溶 液 予 以 氣 化 0 5 分 鐘 之 後 % —» 邊 繼 缜 通 入 氣 氣 —* 邊 用 2 5 0 瓦 髙 壓 鈉 蒸 氣 燈 的 冷 光 予 以 照 射 9 而 同 時 保 持 溫 度 在 5 TC 〇 將 5 m ί 1 厚 度 的 杜 邦 製 K a P t 0 η 聚 醯 亞 胺 薄 膜 置 於 鈉 & 氣 燈 和 管 子 之 間 » 過 濾 不 相 要 的 紫 外 線 1 2 0 分 鐘 之 後 f 被 昭 射 的 溶 液 轉 為 粉 紅 色 〇 反 相 分 析 Η Ρ L C [ 0 • 1 % m 酸 Μ 鈉 ( 水 ) — 乙 腈 悌 度 ) 於 Ρ L R Ρ 聚 苯 乙 烯 管 柱 ( 聚 合 物 實 ffA· 駿 室 ) 上 並 無 顯 示 産 物 峯 ： 為 早 期 沖 提 的 寬 峯 ( 停. 滞 時 間 為 3 • 9 7 分 鐘 ) 與 較 後 期 的 另 — 沖 提 尖 峯 ( 停 滞 時 間 為 5 • 7 7 分 鐘 ) 〇 早 期 沖 洗 産 物 ( A ) 與 後 期 冲 ) 洗 産 物 ( B ) 的 比 率 為 1 • 3 1 ( 每 —— 根 管 子 的 溶 液 〇 溶 液 被 混 合 » 在 真 空 ( 2 5 • 0 毫 米 汞 柱 ) 與 冰 浴 之 下 除 去 溶 液 t 殘 留 物 溶 於 7 0 毫 升 的 水 中 » 以 0 • 4 5 撖 米 耐 隆 薄 膜 過 濾 之 » 反 相 製 備 Η Ρ L C ( 水 — 乙 腈 梯 度 ) 拫 容 易 的 得 到 兩 種 産 物 〇 —R R - 本紙5fc尺度边用中a ffl家標準（CNS)肀4規格（210><297公龙） SI. 20,000 οΛίυοο η 6 五、發明説明（β) 混合適當的製備HPLC部份，接箸以HPLC分析 ,顯示均勻狀態。冷凍乾燥之後得到0 . 3 2克的一種産

物（A)和0. 26克的另一種産物（B)，經由1 HNMR 分析為異構物（同側和反側）的1, 2 —二氣雜環，亦即 同側的二鈉3 — (4 —甲氣基螺一 〔1, 2_二氣雜環丁 烷—3, 2’ — （5，—羥基）三環〔3. 3. 1. 13,7〕 十一基〕一4_基）苯基磷酸鹽：

請 7t 間 讀 背 而 之 注 意 項 孙 m % 本 K

CCH

3

本紙張疋度边用中aa家楳毕(CNS)甲4規tM210x297公I) S1. 2. 20,000 6 06 1 1 2 6 6 ΛΠ 五、發明説明 每 値 異 構 物 都 化 學 發 光 t 在 Ρ Η 1 0 於 水 性 缓 衝 溶 媒 與 鹼 性 m 酸 鹽 中 會 産 生 化 學 發 光 » 且 具 備 獨 特 的 光 對 時 間 以 及 雜 音 特 性 0 1 Η Ν Μ R ( A 異 構 物 f 4 〇 0 Μ Η ζ % D 2 0 ) ·· δ 6 • 9 8 — 7 • 6 ( 4 Η 9 m » A Γ Η ) » 3 • 1 1 ( 3 Η 1 S t 0 Μ e ) t 2 • 9 7 ( 1 Η * b Γ • S » Η — 1 )· > 2 • 3 4 ( 1 Η > b Γ * S ί Η — 3 ) » 1 • 7 9 ( 1 Η ， b Γ • S » Η — 7 ) * 1 • 3 — 1 • 6 8 ( 8 Η t m ) » 1 • 0 1 ( 1 Η » d I J 1 3 • 5 Η ζ ) 9 0 • 8 ( 1 Η > d > J = 1 3 Η ζ ) ο 1 Η Ν Μ R '( B 異 構 物 » 4 〇 0 Μ Η Ζ t D 2 0 ) ： (請先閲讀背而之注意亊項洱项寫本^. 裝· 訂 經濟部屮央標準局β工消费合作社印製 δ 6 . 94-7. 62 ( 4 Η , m , A r Η ) , 3. 09 (3 H , s , Ο M e ) , 2. 91 ( 1 H , b r . s, H - 1 ) , 2. 27 ( 1 H , b r . s , H - 3 ), 1 . ... 8 4 ( 1 H , b r . s , H - 7 ) , 1. 21- 1. 7 5 ( 8 H , m ) , 1. 02 ( 1 H , d , J = 1 2 .8 H z ) , 0. 87 ( .1 H , d , J = 1 2 . 8 H z )0 元素分析顯示異構物B以二水合物形式存在。 Cts Hz 丄 Na2 〇8 Ρ·2Η2 ◦(異構物 B)： 理論值 C, 45. 2, Η, 5. 27, Ρ, 6. 47。 賁際值 C45. 53, Η, 5. 35, Ρ, 6. 11。 "· R ft ~· _ ______ 線· 本紙?fc尺度边用中as家榀準(CNS)T 4規格(210x297公龙） S1. 2. 20,000 21106® A ii It 6 五、發明説明（α 經濟部屮央楳準局貝工消费合作杜印製 以1 Η N M R的資料不可 為同側異構物，而何者為反側 賁施例V I I 大致上依照以實施例I V 38. 2毫莫耳）的二異丙基 形成的溶液在氬氣大氣之下於 丁基鋰於己烷（35. 0毫莫 2. 5Μ溶液被搜拌20分鐘 30. 3毫莫耳）的二乙基1 醯氣苯基）甲烷磷酸鹽於3 0 液在10分鐘内被逐滴的加入 下被攪伴1小時，然後在7分 毫莫耳）的5—溴金銅烷一2 所形成的溶液混合，並同時攪 之後移除冰浴，反應混合物在 0 溶液然後再被回流1小時 烷予以稀釋，倒入一含有飽和 1 0%於己烷中的醋酸乙酯（ 混合物有機萃取物被1 5%氯 上快速乾燥，濃缩，得到1 1 在短矽膠管柱上進行阻塞過濾 烷）沖提，得到1 1 . 〇克的 能特別分出兩個異構物何者 異構物。 的步驟，將5. 35毫升（ 胺於3 5毫升的四氳〇夫喃所 冰浴中冷卻到一 7 8 正 耳）所形成的14毫升的 之後，加入1 0 . 8 6克（ 一甲氣基一1— (3 —持戊 毫升的四氫*夫喃所形成的溶 ，最終的橙色溶液在室溫之 鐘内與5. 21克（22. 75 一酮於2 0毫升的四氳#喃 拌。攪拌再持續10分鐘， 1小時内被慢慢回溫到室溫 ，冷卻，用1 ◦ ◦毫升的己 硪酸氫鈉的分離式漏斗，用 3x50毫升）予以萃取， 化鈉水溶液沖洗，於硫酸鈉 .62克的淡橙色粘性油。 ，以1 0%醋酸乙酯.（正己 撤黃綠色膠體。 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本 裝. 線. 本紙張尺度遑用中曲國家標準(CNS) 規格(2〗0乂29丨公4) S1. 2. 20,000

66 ΛΠ 五、發明説明（0 經濟部屮央榀準而貝工消仲合作社印製 Η N Μ R ( 待 戊 ϋ m » 4 0 0 Μ Η Z $ C D C 1 3 先 ) 1 δ 7 3 4 ( 1 Η t > J = 7 8 Η Z ， Η — 5 間 in 9 ) 7 . 1 ( 1 Η > d > J = 7 . 7 Η Z 1 A Γ Η ) $ 背 而 之 6 • 9 5 ·_ 7 • 0 2 ( 2 Η $ m ， A Γ Η ) * S • 3 9 ( 注 意 1 Η t b Γ S ) Η 一 1 ) > 3 2 8 ( 3 Η * S t 0 Μ e ) 节 項 9 2 * 7 4 ( 1 Η » b Γ s * Η 一 3 ) ) 2 . 3 2 % • 1 本 2 5 1 ( 6 Η > m Η 4 > Η —* 6 9 Η 一 9 ) t 〆 2 • 1 7 ( 1 Η > b Γ • S > Η — 7 ) t 1 • 6 7 — 1 • 9 2 ( 4 Η ， m > Η — 8 ) Η — 1 0 ) > 1 • 3 4 ( 9 Η > S * C 〇 C ( C Η 3 ) 3 ) ο I R ( η e a t ) 2 9 2 4 I 2 8 5 0 t 1 7 4 5 ( Xt= QE3 c = 〇 ) } 1 6 5 4 > 1 6 0 2 t 1 5 7 8 « 1 4 7 8， 1 2 7 4 » 1 1 1 0 * 1 0 1 8 > 8 0 8 t 7 5 8 c m - 1 0 該 膠 zm m 被 3 0 毫 升 的 甲 自享 吸 收 1 並 與 2 • 4 克 的 無 水 m 酸 鉀 回 流 2 小 時 f 除 去 甲 醇 t 妖 /»*» 後 將 殘 留 物 在 水 和 3 〇 % 醋酸乙酯 ( 己 院 中 ) 分 層 ， 有 機 相 被 氮 化 納 飽 和 水 溶 液 沖 洗 9 在 硫 酸 納 上 乾 燥 $ 濃 &B » 得 到 9 • 3 2 克 的 色 m 2Μ m t 此 膠 m 在 矽 m 上 進 行 f s a s h 色 層 分 析 f 得 到 7 • 0 6 克 無 法 被 结 晶 的 ( 8 8 % 産 量 t 以 5 — m 金 網 烷 — 2 — 01 為 主 ) 的 淡 ZM1 臾 色 膠 m 0 妖 而 9 I R 和 N Μ R m 示 所 得 到 的 化 合 物 3 — ( 甲 氧 基 — 5 — 溴 三 環 C 3 • 3 • 1 • 1 3 7 ] 十 基 — 2 — 基 叉 甲 基 ) m 的 純 度 高 到 足 可 促 成 磷 醯 基 化反應。 -60- 本紙張尺度边用中a®家榀準（CNS)TMaifi(2〗0x297公及） S1. 2. 20,000 λΛ Λ Γ) 211066_Π6_ 五、發明説明（1) 從3 — （甲氧基一5 -溴三琛〔3. 3. 1. 13,7 〕十基一2 -基叉甲基）苯基醋酸鹽所得到的純酚条化合 物樣品，其製法如下：不純的酚条化合物（5 . 5 7克， 15. 95毫莫耳）在氬氣大氣下被溶於30毫升的分子 篩一乾燥吡啶中，加人5 0毫克的4 —二甲基肢基吡啶作 為觸媒，接著，用注射筒加入1. 8毫升（19. 15毫 莫耳）的醋酸酐，反應混合物在室溫與攪拌之下進行3小 時。 反應混合物然後被轉移到一含有2 5 0毫升的磺酸氫 鈉飽和水溶液的分離式漏斗，用1 0 %醋酸乙酯（於己烷 中）（2 X i ◦ 0毫升）予以萃取，用水將混合萃取液沖 洗多次，’然後在硫酸納上乾燥，乾燥的溶液被置於旋轉蒸 發器中蒸發，殘留物在含有數滴醋酸乙酯的正己烷中再結 晶，如此得到的灰白色固體再度被結晶，得到5 . 2 1克 (83. 5 %産量）的醋駿鹽，熔點1 0 8 — 1 1 0 C。 HRMS 分析結果：C2H23Br〇3 ( Μ + ) 閲 ifi 背 而 之 注 意 項 孙 m % 本 裝 η 線 經濟部屮央榀準局口工消赀合作社印製 . . R ο ο Μ 9 9 Ν 3 3 Η 值值 1 論驗 理實 3 3 8 ο Ζ Η Μ 1 〇 3 ο 8 4 Ό ( J d d Η ζην 5 3 7 δ Η : Ζ )Η 3 7 1 · C 7 D , C 8 5

Η Γ A

Η Γ A ζ Η 1 7 7 II J d Ια Η r—I /_\ 3 τ—Η 7 ζ Η 1Χ 8 = J d Ια Η IX /ίν 3 ο 7 2 1 Η ζ Η 1χ d Η 1 /IV 9 9 6 本紙張尺度遑用中8國家標毕（CNS) Τ4規格（2丨0x297公龙） S1. 2. 20,000 211066 A (> Π 6 經：淨部中央櫺準局β工消#合作社印製 五 、發明说明（<令 3 3 9 ( 1 Η b Γ S Η — 1 ) 3 2 7 ( 3 Η 先 ) S 0 Μ e ) 2 7 5 ( 1 Η b Γ S Η 3 ) 閲 讀 2 4 0 —* 2 5 1 ( 6 Η Μ Η — 4 Η 一 6 Η 背 而 之 一 9 ) 2 2 9 ( 3 Η s 0 A c ) 2 1 8 注 意 ( 1 Η b Γ S Η 一 7 ) t 1 6 9 — 1 9 2 項 再 ( 4 Η » m * Η — 8 Η — 1 0 ) 0 寫 本 I R ( C Η C 1 3 ) 3 5 8 4 » 3 3 2 0 〇 Η ) Η 2 9 2 5 t 2 8 5 0 I 1 6 6 5 » 1 5 8 8 t 1 5 7 8 > 1 4 4 5 t 1 4 3 5 » 1 〇 9 2 1 1 0 8 〇 1 1 0 1 5 > 8 8 0 > 8 〇 8 C m - 1 ο 實 施 例 V I I I 再 依 照 以 上 實 施 例 I V 的 步 驟 t 將 2 - 9 7 毫 升 ( 2 1 • 3 毫 莫 耳 ) 的 二 異 丙 基 胺 於 2 1 毫升的四氳》夫喃 所 形 成 的 溶 m 在 氬 氣 之 下 被 置 於 冰 浴 中 冷 到 — 7 8 QC t 與 8 . 5 毫 升 的 2 ♦ 5 Μ 正 丁 基 鋰 於 己 ( 2 1 • 3 毫 荑 耳 ). 中 所 形 成 的 溶 液 混 合 t 逐 滴 加 入 且 同 時 m 拌 » 2 0 分 鐘 0 二 乙 基 1 — 甲 氧 基 一 1 一 ( 3 一 特 戊 m 氣 苯 基 ) 甲 院 m 酸 ( •7 . 2 6 克 2 〇 • 3 毫 莫 耳 ) 於 2 0 毫 升 的. 四 氫< =*夫 喃 所 形 成 的 溶 液 在 1 0 分 鐘 之 内 用 注 射 筒 逐 滴 加 入 > 溶 m 繼 m 在 低 溫 下 m 拌 1 小 時 〇 2 - 7 9 克 ( 1 5 * 2毫莫耳） 的 5 — 氯金銷烷 一 2 一 S3 於 1 5 毫 升 的 四 氳. 夫 喃 所 形 成 的 溶 液 在 5 分 鐘 之 内 加 入 以 上 溶 液 • 在 低 溫 之 下 m 拌 1 〇 分 鐘 之 後 t 除 去 冰 浴 > • 62 裝 玎 線 ^紙張尺度边用中國困家標準(CNS)甲4規格（210x297公龙) ：.20,000 經濟部屮央櫺準而员工消&合作社印製 將混合物回溫到室溫。 用5 ◦毫升正己烷稀釋 飽和水溶液的分離式漏 取之，乾燥有機部份， 下泵之，得到一殘留物 色油狀的5 . 1 5克的 環〔3 . 3 . 1 . 1 3 甲基醋酸鹽（結構由I 0 . 8 6 5克的後期沖 該後期部份被再度與待 化反應（參見以上實施 額外◦ . ’ 3 5克的持戊 鋼院—2— _為主）。 1 Η N M R (特戊 )：δ 7.36(1 7 13 1 Η , d 混合物被回流1 . 5小時，冷郤， ，倒入含有1 5 0毫升的磺酸氫鈉 斗。用5%醋酸乙酯一正己烷萃 濃縮之，真空（1. 0毫米汞柱） ，在矽_上進行色層分析，得到無 較高Rf3 -(甲氧基一5 —氯三 7 〕十基一 2 —基叉甲基）苯基三 R和NMR鑑定出來），以及 提物質，主要成份為相對應的酚。 戊韹和三乙胺（氯化甲撐）進行醯 例I )，接著進行色層分析，得到 II酯（9、％總産量，以5 —氛金 醯酯，400MHz, CDC 13 H, t, J = 7. 8Hz, H-5 ,J = 7 . 7 H z , A r H ) A3 ,1 - Η 2 ， . S Η Η C , m 3 · » » ( 2 , ，r 4 m C 3 Η } b 一 ，09 2 1 Η Η c 2 ( - Η 4 , : 4 Η 1 w ( S ) 〇 ( 9 t . S 8 Η Η a 7 . 7 1 9 e I Γ 2 ( - ( π 8 b 2 3 6 ( 9 ) 3 6 3 R . Η e - * * I 6 *"- Μ 2 -—II ，( 〇 _ . S 2 ) ο 3 f ,91 c ,Η } I 一 } , ) 3 3 Η Η 3 5 Η ·ί i ' ) 3 5 4

3 TX

ο 5 7 1X 先 閲 ή 背 而 之 注 意 事 項 再 % 本 本紙5艮尺度边用中a因家樣準（CNS)甲4規格(210x297公龙） S1. 2. 20,000 α a A 4 G 6 An 五、發明説明（y) 經濟部+央榀準而β工消赀合作社印51 ( 酯 C = 〇 ) » 1 6 6 4 f 1 6 0 2 > 1 5 7 8 > 1 4 7 t 1 2 7 4 » 1 1 1 2 > 1 0 2 2 » 8 2 7 7 5 8 c m 混 合 的 持 戊 m 酯 部 份 ( 5 • 5 克 * 1 4 • 1 毫 莫 耳 ) 被 吸 收 於 4 0 毫 升 的 甲 II 中 I 與 5 • 3 7 克 的 -fm· Μ 水 碳 酸 鉀 回 流 4 0 分 鐘 1 除 去 甲 醇 之 後 殘 留 物 被 水 和 3 〇 % 醋 m 乙 酯 — 己 烷 分 層 » 有 機 部 份 濃 縮 t 阻 塞 » 得 到 4 * 0 7 克 ( 8 8 % 産 量 > 以 5 — 氯 金 鋼 烷 — 2 — 酮 為 主 ) 的 鬆 脆 白 色 泡 沫 3 — ( 甲 氧 基 — 5 — 氯 三 環 C 3 • 3 • 1 * 1 3 7 十 基 — 2 — 基 叉 甲 基 ) 酚 i 與 空 氣 接 m 之 後 會 變 得 有 點 粘 稠 0 Η R Μ S 分 析 結 果 C 1 8 Η 2 1 C 1 0 2 ( Μ + ) 理 論 值 3 0 4 • 1 2 2 7 實 驗 值 3 0 4 • 1 2 3 0 0 1 Η Μ N R ( 4 0 0 Μ Η Z » C D C 1 3 ) - δ 7 • 2 3 ( 1 Η » d d » J = 7 • 7 » 7 • 6 Η Z > Η — 5 9 ) » 6 • 8 5 ( 1 Η t d i J = 7 • 6 Η Ζ > A Γ Η ) f 6 • 7 7 一 6 • 8 3 ( 2 Η * m A Γ Η ) t 3 • 4 4 ( 1 Η > b Γ • S » Η — 1 ) > 3 * 1 ( 3 Η » S » 〇 Μ e ) * 2 * 8 ( 1 Η » b Γ • S > Η — 3 ) > 2 * 1 — 2 * 3 1 ( 7 Η t m t Η — 4 t Η — 6 Η — 7 $ Η — 9 ) » 1 • 6 5 — 1 • 8 9 ( 4 Η f m t Η — 8 t Η 一 1 0 ) C I R ( C Η C 1 3 ) l 3 5 9 〇 > 3 3 3 0 ( 0 Η ) 請 先 間 讀 背 而 之 t- 項 % 木 本紙5艮尺度边用中8困家樣毕（CN5)T4規格（210x297公没） £1.2. 20,000 2.11QS6- 五、發明説明φ/) > 2 9 3 0 t 2 8 5 5 f 1 6 5 5 1 1 5 9 0 > 1 5 8 0 1 1 4 4 〇 1 1 2 9 5 1 1 〇 9 4 9 1 0 8 0 t 1 〇 2 2 1 8 8 0 1 8 2 6 C m - 1 0 實 施 例 I X 3 — ( 甲 氧 基 — 5 — 溴 三 環 C 3 • 3 • 1 • 1 3 , 7 ] 十 基 — 2 — 基 叉 甲 基 ) m ( 1 • 4 9 克 * 4 • 2 6 毫 莫 耳 ) 披 溶 於 8 • 5 毫 升 的 無 水 乙 二 醇 然 後 一 起 與 0 • 2 8 克 的 碩 酸 鉀 密 封 於 玻 璃 試 管 中 t 試 管 在 1 0 0 的 油 浴 中 被 加 埶 μ、、 7 小 時 試 管 内 的 内 含 物 在 真 空 下 ( 1 • 0 毫 米 汞 柱 ) 以 及 加 熱 下 濃 縮 t 殘 留 物 被 分 層 於 飽 和 氛 化 鈉 飽 和 溶 液 和 醋 酸 乙 Si 0 有 機 部 份 被 脱 除 t 在 短 矽 膠 管 柱 上 進 行 色 層 分 析 , 得 到 1 • 3 1 克 ( 9 2 % ή 量 I 以 酚 起 始 物 質 為 主 ) 的 灰 白 色 泡 沫 的 3 — ( 甲 氧 基 — 5 一 ( 2 — 羥 基 ) 乙 氧 基 — 環 C 3 3 1 1 3 7 ] 十 基 一 2 一 基 叉 甲 基 ) 酚。 經濟部中央榀準局β工消作合作社印製 ) 2 c r ， · 3 Η 2 b 5 ) 8 c Η , ， : I Η o c ) Η ) Η Γ 5 * ο 1 1 3 , A m - c IN > ) J 2 H 1 c H 2 Η Η H 8 D 6 Η Γ 2 6 s . c 6 A ( . 2 7 * 7 4 r > z = 7 m 6 = b ) H J II J » e M , J H 3 , Η M o t 2 ,tlo 0 d ( ) ( ， 4 Η ο Η H 4 s ( 1 H 8 o 2 4 , R ( 1 Γ ( H M9(6A133 N 1 3 I 5 » ( H 8 3s ) 8 1 7 7 3 H 2 CO · ow f z · oo 6 1 ) H 3 本紙5良尺度边用中SH家榣毕（CNS)T4規格（210χ297ϋ) S1. 20,000 Λ 6 Π 6 2110^6 經濟部屮央梂準局Μ工消#合作社印製 先 閲 ifi 背 意 事 再 %

五、發明説明 .S,H-,1 . 5 5

I R ( ,2 9 2 9 ,14 4 0 實施例X 3 —( 十基_ 2 _ 以以上實施 中）被用來 碾製，然後 1 . 2克的 磷韹基化烯 備相對應的 3 -( 十基.—2 -1 0 0毫升 5 . 3 5 X 液被分入三 在此情況之 酸氫鈉的水 之後，將同 〔0 . 1 % Μ 3 ) 9 2 • 2 — 1 • 9 〇 ( C Η C 1 3 ) t 2 8 4 2 1 * 1 〇 9 2 9 甲 氣 基 — 5 ―― 基 叉 甲 基 ) 酚 例 V 所 述 的 方 進 行 β — 去 除 在 真 空 下 ( 1 .灰 白 色 固 體 0 醇 産 物 的 純 度 1 > 2 — 二 氣 甲 氧 基 — 5 — 基 叉 甲 共 基 ) 的 無 水 1 0 % 1 〇 - 3 Μ 亞 根 玻 璃 管 > 如 下 > 被 泵 的 殘 中 溶 Λ77 m 0 進 行 側 和 異 側 的 異 碩 酸 氫 納 ( 水 4 ( 1 H , b 1 Ο Η , m ) ：3 5 8 0, 1 6 6 4, 1 1 0 7 8, 8 氯二Ϊ果L 3 · (1 . 2 3 克 法被磷醯基作 作用。得到的 .0毫米永柱 反相分析Η P 高，足可供直 雜環丁烷。 氛三環〔3 . 苯磷酸鹽（0 甲醇/氮仿， 甲基藍作為感 以上實施例V 留物在7 〇毫 反相製備Η Ρ 構物收集在一 )一乙腈梯度 _-66- r . s , Η - 〇 3 3 2 0 ( 〇 5 8 6, 1 5 8 5cm"* 1 3 . 1 . 1 ,4 . 0毫莫 用，除了氨（ 粗製胺鈉鹽被 )被泵，得到 L C顯示所得 接光氧化作用 3 . 1 . 1 3， .6 5克）被 其中&含有 應染料。最终 I所述被光照 升含2 5 8毫 L C時，排除 起。分析Η P 〕顯示有兩個 耳） 甲醇 丙酮 到的 以製 溶於 的溶 射。 克碩 雜質 L C 産物 本紙张尺度边用中a Η家榣準（CNS)肀4規格（210x2听公龙） S1. ：. 20.000 211066 五、發明説明 A (i It 6 經濟部中央榀準局β工消仲合作社印製 峯 ( 停 m 時 間 為 8 • 0 1 分 鐘 和 8 • 3 2 分 鐘 ) t 早 期 沖 提 異 構 物 與 後 期 面 積 百 分 比 ( 2 7 0 η m ) 為 0 * 4 ： 1 先 閲 1奇 > I Η N Μ R 證 實 冷 凍 乾 燥 的 白 色 固 體 為 同 側 和 異 側 二 鈉 «*»1 背 而 之 3 — ( 4 — 甲 氧 基 螺 — C 1 9 2 一 二 氧 雜 環 丁 烷 一 3 — 2 注 意 > —™ ( 5 9 一 氯 ) 三 環 C 3 • 3 • 1 1 3 , 7 〕 十 基 ] — 項 4 一 基 ) 苯 基 磷 酸 鹽 異 構 物 的 混 物 0 % 元 素 分 析 顯 示 産 物 以 一 種 二 水 合 物 的 形 式 存 在 〇 本 C 1 8 Η 2 C 1 N a Z 0 • P Η 2 0 分 析 ： 理 論 值 = C » 4 3 • 5 2 * Η > 4 • 8 7 > C 1 » 7 • 1 4 實 驗 值 C » 4 3 • 2 3 * Η $ 4 • 9 9 » C 1 * 7 • 6 5 1 Η Ν Μ R ( 4 0 0 Μ Η Z » D 2 0 » 兩 値 異 構 物） • δ 6 • 9 7 — 7 • 6 8 ( 4 Η $ m t A Γ Η ) > 3 • 0 8 和 3 • 0 9 ( 3 Η > 2 S > 0 Μ e ) 1 2 • 9 5 ( 1 Η t b Γ • S « Η — 1 ) 9 0 * 7 6 — 2 * 3 5 ( 1 2 Η t m ) 0 實 旅 例 X I 3 — ( 甲 氧 基 — 5 — 溴 三 環 r 3 4 3 • 1 * 1 3 , 7 3 十 基 — 2 — 基 叉 甲 基 ) m 被 磷 基 化 > 妖 後 如 以 上 實 施 例 X 所 述 的 5 — 氯 類 似 物 被 光 氧 化 作 用 〇 在 0 • 3 % ( W / V ) 硪 酸 酸 氫 鈉 水 溶 液 處 理 9 得 到 過 濾 的 粗 製 1 > 2 — . 氣 雜 環 磷 酸 馥 的 水 溶 WL 9 妖 後 進 行 反 相 製 備 Η P L C ( 水 — 乙 腈 梯 度 ) 以 製 備 同 側 和 異 側 異 構 物 % 收 集 在 一 起 供 冷 凍 乾 燥 0 經 過 冷 凍 乾 燥 的 産 物 為 —* 白 色 膨 鬆 固 體 » 在 分 析 -67-___ t a H SCiT^iCNS) Ψ4miS(210x297i^ ς, 2. 20,000 10 1 2 δ 6 β 6 An 五、發明说明 經濟部屮央榀準局工消费合作杜印$1 Η P L C 之 後 9 得 到 兩 痼 峯 % 其 停 滯 時 間 分 別 為 8 • 5 2 分 鐘 和 8 • 9 4 分 鐘 0 早 期 冲 洗 異 構 物 和 後 期 沖 洗 異 構 物 的 面 積 百 分 比 ( 2 7 0 η m ) 為 〇 • 5 ： 1 0 1 Η N Μ R 證 賁 該 産 物 為 同 側 和 異 側 二 鈉 3 — ( 4 一 甲 氧 基 螺 — [ 1 f 2 — 二 氯 雜 環 丁 烷 — 3 — 2 * 一 ( 5 9 — 溴 ) 三 環 C 3 . 3 . 1 • 1 3 , 7 十 基 ] — 4 一 基 ) 苯 基 磷 酸 m 〇 1 Η Ν Μ R ( 4 0 0 Μ Η Ζ • D Z 0 兩 個 異 構 物 ) ： δ 6 * 9 9 — 7 • 5 2 ( 4 ， Μ » R ) > 3 • 0 7 和 3 . 〇 9 ( 3 Η « 2 S 9 0 Μ e ) > 2 • 9 1 ( 1 Η 9 b Γ • S » Η — 1 ) » 0 • 8 2 — 2 • 3 2 ( 1 2 Η 9 m ) 實 0 施 例 X. I I 按 照 製 造 商 以 及 工 具 之 説 明 指 示 使 用 Η y b r i t e C h Τ a η d e m 一 Ε Τ S Η 工 具 ( Η y b Γ i t e c h 公 司 ) t 在 —* % 列 T S Η 標 準 下 進 行 Τ S Η 免 疫 鑑 定 » 唯 —· 例 外 是 在 兀 成 抗 — Τ S Η — m 性 磷 酸 酶 共 軛 物 培 養 和 清 洗 步 驟 時 » 塑 膠 珠 另 外 用 0 • 1 Μ 二 乙 醇 胺 1 m Μ 氯 化 m 9 0 • 0 2 % 壘 氮 化 鈉 缓 衝 液 ( P Η 1 0 * 0 ) 清 洗 9 妖 後 很 快 的 儲 存 於 2 0 0 升 的 相 同 缓 衝 液 中 〇 在 含 有 珠 子 的 管 内 加 入 3 0 0 A 1 的 0 • 6 7 m Μ 缓 衝 液 而 啓 發 抗 — T S Η — 鹼 性 磷 酸 酶 共 軛 物 鍵 結 到 珠 子 表 面 的 化 學 發 光 訊 號 t 該 缓 衝 液 包 含 二 鈉 3 — ( 2 9 — 螺 金 m 烷 ) — 4 — 甲 氣 基 — 4 — ( 3 ” — 磷 醯 基 氣 基 ) 苯 基 一

(請先閲讀背而之注意事項孙碣寫木A 裝. 訂 線- 本紙張尺度边用中a Η家標準(CNS)T 4規格(210x297公龙） S1. 2. 20,000 211UPO 15 6 五、發明説明

,2 —二氣雜環丁烷（” AMPPD 4 一甲氣基螺_ 〔 5，- 基）苯 )，相

羥基）三環〔 基磷酸鹽（A異構物（ 對應的二銷B ,2 —二氣雜環丁烷- 3.3.1.137〕 A - Ο Η ，二鈉 3 —( 3 , 2，-( 十基〕—4 — A Μ P P D ”

異構物（” B — OH — AMPPD )以及二鈉3 — （4 —甲氧基螺 (5 ’ 一氣 丁烷— 7〕十 ”）, 疊氮化 19, 度，在 L B 錄（只 每 3 — 2 }— ( 基〕一 4 一基）苯基磷 乙醇胺. 於 0 · 1 Μ 二 m ( ρ Η 1 0 2 5, 31, 室溫之下以5 9 5 2型發光 0 ) 4 0,5 秒鐘為間 計（德國 記錄訊號比雜音的訊號 )三環〔3 · 酸鹽（” C 1 1 m Μ氣化ij| 加入基質後的 0和6 0分鐘 隔，使用0 e B e r t h ο 2 -·二氧雜環3 . 1 . 1 3. -AMPPD ,0 . 0 2 % 第 7 , 13， 記錄光照射強 r t h ο 1 d 1 d儀器）記 間 背 而 之 节 項 再 % 本

— ®AMPPD,BR-AMPPD,B — OH- -AMPPD 經3部+央榀準局A工消赀合作社印製 AMPPD, A-OH-AMPPD 和 CL 的T S H , R L U對T S H分別顯示於圖1 和5。 & AMPPD和其金銷烷—2’ 一基叉基被羟基（A和 2,3,4 B異構物），氣和溴 雜環丁烷之間的總發 進行總去磷醯基化實 製備1 , 2 —二 1 , 2 -二氣 每一傾化合物 基單一取代的相對應的 射光量的比較，是在對 驗而進行的。 氧雜環丁烷（4. 0mm)於0.05M _-69-_ 本紙張尺度边用中a國家糅毕(CNS)T4規格(210X297公;ft) S1. 2. 20,000 211066 Λ (ί Η 6 五、發明説明（^岣 經濟部屮央標準局β工消费合作社印製 碩酸鈉/磺酸氫納（含1 m M氯化鎂）水溶液，然後在 3〇它之下達成平衡，加入1 ◦徹升的7. 6 4 X 1 Ο Μ 的鹼性磷酸酶（牛腸生物酵素）水溶液，使用Turne r型號2 Ο E發光計儀器記錄最終溶液的發光倩況。 五種被質疑的每一種化合物的發光衰退速率（以每分 鐘相對光單位（R L U )表示），見於下表。 表I 衰退速率（R L U ) . 1,2-二氧雜環丁烷 I II III AMPPD 0.1 0.3 0.8 OH-金銅烷-2 ’ - 基叉（A異搆物） 1.3 - - 0H-金鋼烷-2 ’ - 基叉（b異構物） 1.5 - - 氯-金銅烷-2 ’ - 基叉.. 1.2 5.5 - 溴-金鋼烷-2 ’ - 基叉 1.2 0.8 - 40 閲 in 背 而 之 意 事 項 % 本 總衮退時間（分） 6 0 9 10 15 總化學發光量被分別描述於圖6 , 7 , 8 , 9和1 0 實施例X I V 一條中性BIODYNE Α耐隆薄膜（Ρ 公 裝 π 線 7 0- 本紙尺度边用中®國家標準（CNS)肀4規格（210X297公龙） S1. 20,000 ΟΛίυον Π 6 五、發明説明（^¾ 司）被以下濃度的生物素基化P B r 3 2 2 8 5 - m e r寡核苷酸探針（合成遣傳公司）在其兩側塗上兩次斑點 配'對斑點编號 DNA濃度（picQgrams) 1 100.000 2 50.000 3 4 5 6 7 8 25.000 12.500 6.250 3.125 1.563 0.781 請 先 閱 in 背 而 之 注 意 項 # % 本 〆 經濟部屮央榀準局β工消费合作社印製 9 ' 0.39110 空白1 1/單束，未標記DNA, lng。 接著，薄膜在0. 2%酪蛋白/ 0. 1 % T w e e η 2 0.清潔劑於水性磷酸鹽缓衝鹽溶液（P B S )中處理一 小時以進行保護作用，然後加入1 / 5 0 0 ◦稀釋 — 鹼性磷酸醯共軛物（S i gma公司）於0. 2%酪蛋白 (P B S )的稀釋液，培養薄膜30分鐘，用0. 2%酪 蛋白/ 0. l%Tween20清潔劑於PBS中清洗兩 次，每次5分鐘，在0. 3%Tween20清潔劑於P B S中清洗4次，毎次5分鐘，於含1 in Μ氯化鎂（p Η 1〇.0 )的水性0 . 1 Μ二乙醇胺清洗2次，每次5分 _-7 1-_ 本紙張尺度边用中as家樣準(CN5)T4規格(210X297公龙） S1. 2. 20,000 Π 6 五、發明説明七均 鐘 薄膜被從中切成兩塊，每一塊都各有一組斑點，其中 經濟部中央標準局A工消伢合作社印製 一塊在水性A 含1 m Μ氮化 ,另外一塊在 (〇.2 5m 發光計中並暴 片。使用氣化 D比較起來） )和管柱1 ( 實施例X V ρ β r 3 程序中，使用 為 2 0 0 - 2 此混合物 〇 D Υ Ν Ε 配對斑點编號 1 2 3 4 5 6 MPPD 水溶液（0. 25mM 於 Ο. 1M 鎂的二乙醇胺，PH10. 0)培養5分鐘 相對應的氛金銷一 2’ 一基叉化合物 Μ於相同缓衝液中），然後將兩塊置於像機 露於Ρ 1 aro〖d型612拍立得黑白底 合物得到改良的化學發光強度（與AMP P ,可從圖1 1的管柱2 (C 1 — AMPPD AMPPD)看出來。 22質體（4700b ρ)被置於nick轉譯 Trans-light工具（Tropix公司）以産生長度 0 0 0 b p s的生物素基化的單束聚核。 被點成以下濃度的5條平行管柱於乾燥Β I A薄膜上。 D Ν A 濃度（picograms) 20.000 10.000 5 . 0.0 0 2.500 1.250 0.625 間 ifx 背 而 之 注 意 項 再 % 寫 木 本紙5艮尺度边用中a Η家楳準（CHS) Τ4規格（210x297公Λ) SI. 2. 20,000 ism Α (ί Π 6 五、發明説明 (W|i A Ο m 用 ( 液 W 在 5 1 鐘 7 6 9 10 薄 固定 .2 酸鹽 ,然 S i ，培 e e 0 . 分鐘 0 . 0.313 0.156 0.078 0.039 膜被紫外線照射（UVP碾物燈）3分鐘，將DN 於薄膜表面上，然後用空氣乾燥。接着，薄膜在 %酪蛋白/ 0. l%Tween20清潔劑於水性 缓衝鹽溶液（P B S )中處理一小時以進行阻斷作 後加入1/50Q0稀釋 一鹼性磷酸酶共轭物 gma公司）於〇. 2%酪蛋白（PBS)的稀釋 養薄膜30分鐘，用0.2%酪蛋白/〇.1%丁 ri 2 0清潔劑於P B S中清洗3次，每次5分鐘， 3%Tween20清潔劑於PBS中清洗，毎次 ，於含ImM氯化鎂和0. 02%叠氮化納（pH 〇)的水性Ο.1M二乙醇胺清洗2次，每次5分 1? 先 閲ik 背 而 之 ;主 意 事 項 % 本 經濟部中央標準局β工消t合作杜印5i 2 接著，從薄膜饀別切下5塊1 — 5排狀斑點（塊狀1 5),如同斑點6-10 (槐狀6 — 10)的5排管柱 般。塊狀1—5被基質缓衝液冲洗30分鐘，塊狀6 — 0在0. 1%BDMQ於基質缓衝液中被保護30分鐘 兩组塊狀接著在基質緩衝液披培養5分鐘，然後在1, -二氣雜環丁烷水溶液（0. 25mM)中培養5分鐘 如以下所示： 7 3 本紙張尺度边用中a 8家楳準(CNS)肀4規格(210X297公龙） S1. 20,000 6 6 10 1 6 6 ΛΠ 五、發明説明Cp) 塊 狀 编 號 1 > 2 — 二 氣 雜 環 丁 烷 1 A Μ P P D 2 羥 基 — 金 鋼 院 — 2 9 — 基 叉 ( A 異 構 物 ) 3 羥 基 — 金 銷 院 — ， — 基 叉 ( 異 構 物 ) 4 氯 一 金 m 烷 — 2 9 一 基 叉 5 溴 — 金 m 院 一 2 9 — 基 叉 6 A Μ Ρ Ρ D 7 m 基 一 金 m 院 — *p 9 — 基 叉 ( A 異 構 物 ) 8 羥 基 一 金 銷 院 — 2 9 — 基 叉 ( B 異 構 物 ) 9 氯 — 金 m 烷 — 2 S 一 基 叉 1 〇 溴 — 金 m 烷 — 2 ， 一 基 叉 所 # 塊 狀 被 置 於 像 機 發 光 計 中 並 暴 露 於 Ρ 1 a Γ 〇 i d 型 6 1 2 拍 立 得 黑 白 底 片 0 使 用 3 — ( 取 代 金 銷 院 — 2 9 — 基 叉 ) 1 2 — 二 氧 雜 環 丁 院 得 到 改 良 的 化 學 發 光 強 度 ( 與 A Μ Ρ Ρ D 比 較 起 來 ) > 示 於 表 I I 0 ik 先 間 讀 背 而 之 注 意 事 項 再 寫 本 裝 1Γ 線 經濟部中央標準局A工消你合作社印$1 本紙張尺度边用中®困家標準（CNS) 規格（210x297公没） S1. 20,000 6R η 4 五、發明説明（'//) 為-i -af¥-^5 Π5τ?-Βαριυιδτβ tVHGI ssb OXQfi 丨 ou_d u-

OeOOOQOOnm ocovno的

^o〇»^r«Mf^inoo ^ M 〇〇〇〇〇 奶（non 朽 οο〇ΐτ>ιΛΝ<Νΐη，《細 叻ΟΟΜηββηηη rttntAi^^oo^oo οζαα ozca .σΗαα ozca oxca ou OS OUouou (請先閱讀背而之注意苹項洱艰窍木 ^x^fs® π -•Javloefel ijsoef- rso·^ 3 (JlaAoef Y·- spfl· uepf f Λ· sl>-· u··0-· §pf 1Λ· SP-Λ· U*P-A— Spj-Λ— 經濟部屮央榣準局β工消赀合作社印奴 0 激 -z—-uaMBPV—J® -M丨：IcvlIelMr丨-3 -t—-UBAepv丨HO ,t 丨：lueB"pv—=o adaHV -M—-cflevpv 丨ue -7^s002i^a -t—-CIrvl^llvrllo -忾丨：lue·霉llvlllo «η γ» « 9v ο 。ffl农5朱铿兹农U班银X醚雜碱n^s-。騮农s 漱轡鹚^ο^^^ΧΙί^^ΗΎηϊΊ 裝* 訂_ 線. 本紙張尺度逍用中囲Β家標準（CNS)甲4規格（210父297公龙） S1. 2. 20,000 aii〇66五、發明説明（7» 實施例X V I —塊狀中性BIODYNE A耐隆薄膜被12. 5 picogram (兆分之一克）的生物素基化的PBR 322 35聚合物寡核苷酸探針（Bi ogen公司）著上斑 點（沿箸兩《),乾燥之後，被U V P礦物燈光公司的紫 外線照射5分鐘，將D N A固定在薄膜的表面。接箸，該 薄膜被5xSSC (0. 0 15M檸檬酸鈉/0. 15M 氯化納）濕潤，浸漬於0. 2%酪蛋白.0. l%Twe e η 2 0清潔劑（於P B S中）1小時，被浸漬薄膜被 一鹼性磷酸酶共軛物（’’Avidx”共軛物）（稀釋 ' 於1 一 Γ 0000於0. 2%酪蛋白）培養30分鐘。 薄膜被水性0. 2%酪蛋白/◦. l%Tween 2 0清潔劑清洗兩次（每次5分鐘），然後用水性0 . 1 % T w e e π 20清潔劑（PBS中）清洗兩次（每次 5分鐘），最後在pH為10的含111)1^氯化_的水性 Λ G Β6 請 先 閲 背 而 之 注 意 事 項 朴 寫 本 裝 玎 線 經濟部屮央榀準局β工消伢合作社印製 鐘 點鐘烷化袋 分 斑分鋇氛si 5 邊 5 金 Μ 塑 次 一養氯 Ε, 每 有培應 1 中 ( 帶以對含袋 次' 都予相 ίΕ 兩 塊液其胺塑 洗 每養及醇於 清 ，培以乙封 ) 塊的 D 二 密 液 兩 ◦ ρ Μ ,-衝 等 1 ρ 1 液 7 緩 相為Μ. 溶· 定 成 Η Α ο 的 鑑 切 P 的於上 ( 被列 Μ 物狀 胺 膜下m合塊 醇 薄於 5 化去 乙 的塊 2 叉除 二 洗兩 .基後 Μ 清將 ο I 然 .1 被別性， ， . 。 分水 2} ο ) 〇 : I 镁 本紙張尺度边用中國B家標準（CNS)肀4規格（2]0X297公龙） S1. 2. 20,000 211066 Λ Π 6 經濟部中央榀準而貝工消费合作杜印製 .五、發明説明（β) / 被粘貼於T u r n e r 20Ε型發光計的窗戶上。每塊均 在化學發光照射之下進行2 0分鐘，光照射動力學數字列 於圖1 2。 實施例X V I I 由相對應羥基金銅烷_2’ 一基叉（A和B異構物） 以及氯金鏑烷- 2，-基叉化合物之化學發烷照射的加強 作用（與AMPPD發射情況比較起來）都以以下方式予 以證賁，所有化合物都在下列加強聚合物存在之下進行的 0 4組實驗中，每組各有3根試管，毎根試管含有4 5 0 微升分別與P Η為1 0 . 〇 (基質緩衝液◦的〇 . 1 Μ 二乙醇胺（含1 m Μ氯化鎂，0 . 0 2 % h氮化鈉和0 . 1%加強聚合物）的4種1, 2-.二氧雜環丁烷的0. 4 mM水性溶液，使用Berthold LB 9 5 2 T 發光計測量其背景訊號。 接箸，50撤升pH為10. 0的水溶液（2. 83 xlO — 1 2 M)的鹼性磷酸酶於〇. 1M二乙醇胺（含 ImM氯化鎂，0. 02%疊氮化鈉）（最後酵素濃度為 2 . 8 3x10 1 3 M)被加入每根試管，分別於5和 i 2 0分鐘時以發光計測量其化學發光訊號，其化學發光訊 號的強度：在加強聚合物存在之下得自每一根4種1， 2 一一氣雜環丁院背景比率的結果顯τπ於以下的表I I I。 使所用的加強聚合物以及代表聚合物的符號記載於表 _-77- 本紙張尺度边用中B S家標毕(CNS) T4規格（210x297公龙） 閲 "i* 背 而 之 注 意 事 % 木 裝 玎 線 S1. 2. 20,000 五、 發明説明（70

加強聚合物 B D M Q 聚（乙烯苄基三甲基氯化銨 苯乙烯/ TMQ共聚合物 二丙_丙烯醯胺/ TMQ共聚合物 聚（乙烯苄基十二基二甲基氛化銨）/ T E Q共聚合物 聚（乙烯苄基三乙基氯化銨） 聚（乙烯苄基三丁基氣化銨） 聚（乙烯苄基一 N-甲基氮化锨錠） 聚〔乙烯苄基（2_苯基胺基）乙基一 二甲基氯化銨〕 · * 苄叉媒染劑 聚（乙烯苄基二甲基乙基一氛化銨） 聚〔乙烯苄基二甲基（2 —羥基）乙基 氯化銨 經濟部屮央榀準而A工消#合作社印级

I I I 〇 號 藍寶石 T M Q S / T M Q D A A / T M Q D M Q / T E Q T E Q T B Q Μ P B B A E D M B Z D Μ E B D Μ E (OH) B EMERALD TBQ/FLUO (請先閱讀背而之注意事項洱碭寫木( 藍寶石和螢光素 T B Q和螢光素 S1. 2. 20,000 本紙張尺度边用中a Η家標準（CNS) T4規格（210x297公龙） 78- α 6 β Λπ - 五、發明説明C74

AMPPD

POLYMER IIME( SIGNAL! S/N SIGNAL I S/N SIGNAL! S/N SIGNAL, S/N

NONE SAPPHIRE

TMQ S/TMQU 4

S/TMQ(ls2) DAA TMQ

Q E T MQ D

TEQ TBQ

B p M 0 5 0 0 5 0 2 2 0 5 0 2 0 5 0 2 0 5 0 0 5 0 2 2 0 5 0 2 0 5 20 0 5 20 0 5 0 2 172.6 1.0 3706.0 21.5 5944.8 34.4 241.4 1·0 38457.8 159.3 85359.8 353.6 159.9 10525-822558.3 0 8 1 1 3 1 6 4 116.3 1.0 5931,5 35.7 15866.3 95.4 169,8 3437.0 9994,7 0 2 9 10 8 2 5 180.0 1.0 8354.4 46.4 14957.3 83.1 245,2 1.0 32820.5 133,9 78977.4 322,1 217.8 1.0 25095.8 115.3 50020.0 229.7 493.9 1.0 94A29.4 191,2 214319.4 433-9 87.0 1.0 2863.6 32,9 3160.8 36.3 86.1 U〇 21051.3 244*5 25330.3 292.3 77.9 1.0 8853.4 1U.6 11658.3 149.6 81.2 L.O 9294.6 Π4.5 1201.7 148.1 90.6 1.0 10193.8 112.5 11365,1 158.6 90.5 5583.1 6309.4 0 7 7 lx 1M 6 6 90.8 1.0 17235.6 189.7 20702.2 227.9 126.3 33L4.8 3767.9 138.8 10908.4 14625.4 125.7 6258.9 8857.8 134.0 4775.3 7120.3 160.3 3305.1 5722.3 136.0 5486.8 6670.3 145.5 9213.8 8288.0 0 3 8 0 6 3 16 9 135 2 2 7 o l.Q 49.8 70.5 0 6 1 0 6 7 0 3 0 15 3 I o 5 —-09 3 5 2 3 4 4 o 301 L 3 7 6 5 85.3 4083.6 4460.9 0 9 3 17 2 4 5 296-0 1.0 51584.5· 3Ί.6 70161.6 505-4 0 0 4 1 5 6 6 2 1 2 3 0 5 o 1 o 5 4 4 9 6 9 3 » 60.0 5631.2 9957.466.8 3121.4 6696.9 0 9 0 0 7 2 13 5 16 0 o L 9 15 9 2 5 ，-< ♦ 6 7 2 2 8 4 8 2 0 3 2 o 3 2 8 0 ··· 7 2 8 7 15 *76 9 7 3 5 1.0 514.6 747.2 經濟部中央櫺準局KX工消费合作社印製

BAEDM BZ DMEB DME(OH)B EMERALD TBQ-FLUOR 050 050 050 050 050 050 2 2 2 2 2 2 211.8 1.0 19971.8 94.3 41701.8 196.9 217.3 1.0 9275.3 107.6 26529,1 306.5 149.4 1.0 2738.0 18.3 4611.5 30.9 178.6 1.0 9401.5 52.6 20434.9 114.4 6 3 9 • · · 12 0 6 6 4 14 5 3 8 1.0 21.4 52.9 2902.1 1.0 317571.6 109.4 818775.8 282.1 4961.2 1.0 57271.6 113.9 1445675.6 291.4 348.8 1J 15779.8 45.24 1908.9 54.7 101.8 l.C 37244.5 366.C 44569.8 438.0 93.6 l.C 13165-3 140.7 16159.2 172.7* 95.6 l.C 5887.3 61.fi 7433.5 77.a 79.9 1.0 2156.9 27.C 2536.7 31.7 79.9 l.C 6160.6 77.1 7835.2 98.1 .85.2 l.C 3931.9 46.1 5300.5 66.2 本紙張尺度遑用中a ®家標準（CNS)1? 4規格（210x297公;¢) 142.6 1.0 67.1 i.O 8806.2 6L.8 26551.0 397.0 11563.4 8L-1 34467.2 513-5 158.9 i.O 118.8 1.0 15508.5 97.6148394.6 1249-6 20830.8 131.1209466.8 1763.9 140.3 1.0 86.0 1.0 10021.3 71.5) 22170.5 257. 10939.0 78.01 29133.9 306.51 432 4 4 2 6 69 118 969 413 603 146 252 115 1 2 6 140 4 5 2 2 4 6 19 6 ··· 2 0 0 3 4 9 16 9 2 3 · · ....................^.....π* · · ά (請先閱访背.而之注意苹項#项寫本^

OA^S 084 154 13 2 15 8 2 3 1 2 3 A L.O 20·0 30.2 9 9 4 8 6 5 8 8 8 o 1 9 7 1.0 102.2 193.3 3434.0 1 ^00510.8 583.2 662054.4 964,0 5882.7 L-〇 987572.0 839. 1505971.2 1280. SI. 20,000 -79- 6 6 ο 4» 2ί ΛΠ 經濟部中央榀準局β工消伢合作社印製 五、發明説明（0?) 實施例X v I I I 取代金網烷- 2，-基叉化合物所得到的背景訊號和 11/2參數（與AMP PD比較）在下列兩種不同缓衝液中 乃以以下方式予以測定。 製備pH為10. 0的1, 2 —二氣雜琛丁烷於一種 缓衝溶液所形成的4 X 1 0 4 Μ的水溶液，該缓衝溶液 為0. 05Μ碩酸鈉/碩酸氳納（含ImM氮化鎂），如 1 , 2 —二氧雜環丁烷於一種缓衝溶液所形成的P Η為 10. 0的4x1 〇-4 Μ溶液，該缓衝溶液由含ImM 氮化鎂和0 . 0 2 %疊氮化鈉的0 . 1 Μ二乙醇胺所組成 。將每稂試管1毫升的該種溶液置於Turner20E 發光計中，測量背景訊號。 接著，按照以下的步認測量每個樣品的U/2值。將 1 0 0微升的二氧雜環丁烷樣品加入9 0 0微升上述每一 種緩衝溶胶，然後用吸管置於一根試管中（最後的二氧雜 環丁烷濃度為4x 1 0 5 Μ),在30t下維持均衡， 然後加入1 0微升的1 一 1 0 0 0稀釋的牛腸鹼性磷酸醏 (於相同的缓衝溶液中，酵素濃度為7 · 6x1ο-1 ).在30分鐘内使用Turner 20E型發光計記 錄最終的化學發光強度。最终的結果列於以下的表I V。 表I V 1 . 〇 . 0 5 Μ的碩酸鉑/碩酸氫鈉，1 m Μ氮化鎂， 一--一 - —- _________________ -80- ________ (請先閲讀背而之注意卞項#碭寫本「 裝· 訂 線- 本紙5良尺度边用中a Η家榣準(CNS)甲4規格(210x297公没） S1. 2. 20,000

Λ (i Π C 2ii〇66 五、發明説明

ρ Η 為 9 . 5 二氧雜環丁烷 0 . 4 ffl M ( T L U )背景 陰離子半袞期（分） AMPPD 1.96 2.42 Α-0Η-AMPPD 1.20 1.33' Β-0Η-AMPPD 1.72 1.49 C1-AMPPD 0.93 1.08 BR-AMPPD 1.35 0.99 2.0. 1 Μ 二 乙醇胺，1 m M氛 化鎂，0 . 0 2 %叠氮 化鈉，Ρ Η 1 0 .0 二氣雜環丁烷 0 . 4 π Μ (T L U)背景 陰離子半衰期（分） AMPPD 2.09 2.26 A-OH-AM'PPD 0.95 1.05 B-OH-AMPPD 1.32 1.31 - C 1 - AMPP D 0.77 0.86 BR-AMPPD 1.13 0.56 實施例X I X 請 先 間 讀 背 而 之 注 意 Ψ 項 %

經 濟 部 + 央 U 準 局 员 工 消 ΊΪ， 合 作 社 印 製 鹼性磷酸酶（牛腸；生物酵素）被稀釋O-10000QC)成 一種濃度為2 . 5 4 X 1 0 - 1 2 μ的原料溶液。製備一 糸列雙份的試管，其中含有45 0微升的pH為10. ◦ 的0 . 1 Μ二乙醇胺水溶液（含有1 m Μ氮化鎂和〇 . 〇 2 % S氮化鈉），加上0 · 1 %以下特定的加強聚合物和 4. 4x1. 0-4 μ 的一種 1, 2 —二氣雜環丁烷：Αμ P P D或相對應的氯金鋇烷-2 ’ -基叉化合物。 本紙張尺度边用中Η Η家楳毕(CNS) Ή規怙（210x297公龙） 81 · - 20,000

Sti〇66 經濟部屮央標準局CX工消赀合作社印製 加 入 5 0 撤 升 的 鹼 性 m 酸 酶 原 料 溶 液 » 使 檄 品 含 有 以 下 的 酵 綮 濃 度 2 5 4 X 1 〇 -1*2 Μ 8 4 9 X 1 〇 -1 3 Μ 2 8 3 X 1 0 -1 3 Μ 9 4 5 X 1 0 -1 4 Μ 3 1 5 X 1 0 -1 4 Μ 1 0 5 X 1 0 -1 4 Μ 3 4 9 X 1 0 -1 4 Μ 1 .1 6 X 1 0 4 Μ 3 8 8 X 1 0 -1 5 Μ 1 ' 2 9 X 1 〇 叫 6 Μ 4 3 1 X 1 0 -1 7 Μ 每 ™* 根 試 管 内 的 1 I 2 — 二 氣 雜 環 丁 烷 的 最 终 孃 度 為 4 X 1 0' 4 Μ 1 最 終 加 強 聚 物 的 濃 度 為 0 • 0 9 % 0 加 入 1 % 2 一 二 氣 雜 環 丁 之 後 的 5 和 2 0 分 鐘 記 錄 > 分 別 記 錄 五 値 兩 位 整 數 0 圔 1 3 m 示 錶 性 磷 酸 m 被 氮 金 鋼 院 一 2 3 — 基 叉 » 1 > 2 — 二 氧 雜 環 丁 院 與 加 強 劑 I 和 I I 稀 釋 於 加 入 _. 氧 雜 環 丁 院 5 分 鐘 之 後 的 劑 量 反 應 曲 線 I 與 A Μ Ρ Ρ D 和 相 同 加 強 劑 的 劑 量 反 應 曲 線 9 以 R L V 對 C A Ρ ] 和 訊 號 / 雜 音 ( S N 對 C A P ) 表 示 〇 圖 1 4 顯 示 鹼 性 磷 酸 酶 稀 釋 液 > 偵 測 氯 金 銷 烷 一 2 > 一 基 叉 1 > 2 — 二 氣 雜 環 丁 烷 加 本紙張尺度边用中团國家標毕（CNS)甲4規格(210x297公,Jt) S1. 2. 20.000 -82- β 6 An 211066 五、發明説明（Ί》 ih 先 閲 背 而 之 i 事 項 % 本 上BDMQ —螢光素（”翡翠 I”）和聚（乙烯苄基三 丁基氮化銨）（” T B Q ”）一登光素（龍翠I I )，在 加入基質之後的5和2 0分鐘之後加以偵測，與A Μ Ρ Ρ D加上相同加強劑比較。

實施例X X pBR質體（生物基因公司）含有一種TPA序列插 入物，被MSP1限制酵素分解，Maxam等人 (PNAS，74, 560 (1977))所述進行化學裂解，以産生G, A G, AC, TC 和 C,並.依 Rub i n(Nucleic Acids Research, 8. 4613 (1980))産生T。每根反應試管的七分 之一被載入〇. 4mm的TBE梯度序列膠（長60公分 ),4小時電泳之後，D N A被電傳送b I Ο D Y N E A耐隆薄膜（〇. 45微米），並用紫外線處理，使DNA 固定在薄膜表面上。 接箸，該薄膜被乾燥，在4 5 f下於pH為7. 2的 水性緩衝液（含有1%BSA, Ο. 5M磷酸鈉和7% 經濟部中央櫺準局只工消f合作社印製 S D S )預雜交3 0分鐘，然後在4 5 t於1 0徹升的 NNB直接鹼性磷酸薛共轭探針（分子生物条統公司）於 4 0毫升上述B SA缓衝液中。薄膜然後於45 °c下在水 性5XSSC/1% (每次5分鐘）被清洗兩次，再於 45°C水性1XSSC/1%SDS (每次5分鐘）清洗 兩次，於含125mM氛化鈉，5〇mMTr〗s和1%

Tr丨tori X 一 1C)〇清潔劑的pH為8. ◦的水性 - ....... ——————.....-- " A A — 本紙张尺度边用中a a家標準(CNS) 規格（2丨0x297公龙） 产 S1. 20,000 A () 1Ϊ 6 五、發明説明（ 請 先 閲 ifi 背 而 之 注 意 項 寫 本 溶液中清洗一次，在室溫之下於1 X S C S (每次1分鐘 )清洗一次，最後於室溫下在Ρ Η為1 0 . 0的含0 . 1 Μ二乙醇肢，ImM氯化鎂和0. 02%疊氮化鲂的水溶 液中清洗兩次。 薄膜然後被A Μ P P D水溶液（〇 · 2 5 m Μ )潤濕 ,被包在Saran包裝内，暴露在Kodak X A R 底片4 0分鐘，加入A Μ P P D之後的1小時又暴露5分 鐘，序列影像顯示於圖1 7 ( 1 )。 使用相對應的氯金銅烷一 2 — ’ 一基叉1, 2 —二氧 雜環化合物重覆全部的程序，得到的序列影像顯示於圖1 7 (2)。

實施例X： X I 每一傾如表4所示的二氧雜環丁烷熱背景的測試方法 如下：在3010之下，利用Turner20E型的發光 計（Sunnyvale)於〇. 4mM二氣雜環丁烷於〇. 1 Μ二乙 醇睽.，1 m Μ氯化鎂的ρ Η為1 0 . 0的水溶液中測試， 經濟部中央榀準而β工消赀合作社印製 在沒有酵素存在之下每値樣品的平均發光強度（Turner L i g h t U n i t s於0 · 4 m Μ背景）列於表1。 列於表1的二氣雜環丁烷陰離子半衰期的測試法如下 :3〇1〇 於 Turner Model 20E發光計中，1 毫升的 〇.〇4mM 二氣雜環丁烷（於相同的缓衝液中）溶液在加入〇 . 7 6 4兆分 之一莫耳的鹸性磷酸酶之後被完全去P醯基化。從化學發 光發射的第一次方衰退計算二氣雜環丁烷陰離子的半衰期 -84"_ 本紙张尺度边用中Κ Η家樣毕（CNS)甲4規格（210x297公；it) S1. 20,000 βft c4, 五、發明説明（5f) 經濟部中央指準局A工消价合作社印5i 表4 各種 二 氧 雜 環 丁 院 磷 酸· 鹽半 衰 期 和 熱 背 景 的比較 二氣 雜 環 丁 院 0 . 4 m j背景（TLU) 陰 離 子半衰 期 (分） AMPPD 1 . 83 2 .10 CH3 0- AMPPD 0 . 7 1 1 .5 2 HO-AMPPD 0 . 83 1 .19 C 1-AMPPD 0 . 83 0 • 96 Br-AMPPD 0 · 78 1 .01 I -AMPP D 0 . 46 0 .93 T L U代表T u r n e r L 1 gh t Unit S *陰 離 子 的 生 成 是 添 加 0 . 7 6 4兆分之- -冥耳的鹼性磷酸藺到 4 0 η 〇 n a mo 1 e (十億分之- -)的 A Η P P D 和 R -A Μ P P D 於 0 . 1M DEA , 1 m Μ氯化鎂（P Η 10 .0 )〇 實施 例 X X I I 偵 測 鹼 性 磷 酸 酯 與 不同 化 學 發 光 1 » 2 —二 氣 雜環基 質的 裝 置 如 下 ： 雙 份 条 列稀 釋 液 ( 1 — 3 )鹼性 m 酸酶在 室溫 之 下 與 P Η 為 1 〇 .0 的 0 ♦ 4 m Μ 二氧雜 環 丁烷於 0 . 1 m Μ 二 乙 醇 胺 > 1 m Μ 氮 化 鎂 ( 含 1 m g / m 1的 聚合 加 強 劑 1 或 2 的 醚 ), 於 Be rt ho Id L Β 9 5 2 Τ發光計之中 。接 著 ， 與 一 基 質 培 養 5或 2 0 分 鐘 > 以 5値整 體 相對光 線單 位 ( R L U ) 方 式 測量 化 學 發 光 » 製 成圔1 0 的結果 。使 化 學 發 光 訊 號 為 沒 有酵 素 情 況 之 下 訊 號兩倍 的 _性磷 _ 85 一 請 先 閱 ifi 背 而 之 注 兔· 項 # 寫 本 本紙張尺度遑用中困困家楳毕（CHS) T4規格(210x297公,St) 51. 2. 20,000 βcc A 4 4J 2

JXVW V 五、發明説明（0 酸釀瀑度，乃以外插方式製成圖1 8。兩倍背景時的鹸性 磷酸酶濃度披視為表5的偵測限制。 表5 鹼性磷酸酶與不同化學發光1，2 ~二氧雜環基質/加強 劑糸統的偵測限制

二氣雜環丁烷 AMPPD HO-AMPPD C 1-AMPPD Br-AMPPD 加強劑1 5分 2 0分 加強劑2 5分 2 0分 .8 (請先閱讀背而之注意卞項#碣寫本π 經濟部屮央標準局A工消伢合作杜印si 偵測限制以_ f e m t 〇 m q 1 e / 1表示。

實旋例X X I I I 雙份的鹼性磷酸酶条列稀釋液（1 - 3 )在室 與 pH 為 10. 0 的 0. 4mM 的 AMPPD 或 C MP... PD於二乙醇胺，ImM氯化含lmg/ 任一聚合加強劑1或2 ,在B e r t h ο 1 d L B 9 5 2 T發光計 培養.,.培養5分鐘後，化學發光強度被記錄成5秒 光線單位（RLU)，對雙份加以平均，並對鹸性 濃度作圖，示於圔1 8上半部。較底部的圖顯示化 訊號與背景（無酵素）的化學發光訊號的比率，作 濃度的函數。 -86 溫之下 1 - A m 1的 中一起 S相對 碟酸酿 學發光 為酵素 本紙張尺度边用中國國家標毕（CNS)甲4規格（210x297公;¢) S1. 20,000

Ci Λ A 2ί 五、發明説明衫不

賁施例X X I V 在多種加強劑存在下，以2 . 8 3 X 1 CT1 3 μ鹼性 磷酸酶和不同的R_取代金綱烷1, 2—二氧雜環丁烷磷 酸酶得到化學訊號比的雜音水平。所有的測量均在室溫之 下於B e r t h ο 1 d L B 9 5 2 T發光計中進行。首先測量毎一種樣品 (三份）的背景化學發光水平，每一値樣品組成為0.2徹莫耳 pH為10.0的二氣雜環丁烷於0.45毫升的0.1M二乙醇肢，ΙπΜ 氣化鎂，其中含或不含iBg/al的加強劑。將試管置入發光計 ，測暈其發光強度。接箸，試管被取出發光計，將鹼性磷酸酶 (5 0徹升含1 . 4 1 4 X 1 (P 6莫耳）加入每根試管，加入基質之後 的5和2 0分鐘之後，測量發光強度。毎根試管的最後濃度為 0 . 4 π Μ。‘表6.讓示在鹼性磷蝨藺存在下於5和2 0分鐘時化學發 光訊號與背景訊號（無酵素情況之下所得）的比率。 表6 各種不同R -取代A Μ P P D化合物化學發光訊號對雜音水平比較 先 間 讀 背 而 之 注 意 項 堝 % 木 經濟部+央榣準局ΚΧ工消1ί·合作社印製 二氣雜 環丁烷 加強劑 時間 R = H R = 0H R = C I R = B r (分） 無 5 2 I 55 82 77 2 0 3 4 73 98 92 藍賫石I 5 159 229 577 383 20 364 305 82 7 566 翡翠I 5 109 3 0 7 583 149 _2JL 本紙張尺度边用中國a家樣準（CHS)T4規怙（210x297公;it) S1. 20,000 211〇66 五、發明説明^5 經浒部屮央榣準而员工消赀合作杜印製 20 282 386 964 9 15 藍 寶 石 2 5 1 9 2 466 13 19 688 2 0 4 34 643 2 2 2 1 1 0 1 9 翡 翠 2 5 113 24 7 839 315 2 0 2 9 1 299 1280 50 3 所 有 使 用的 加，強 劑為PH10 ,1 m g / m 1 於 0 . 1 Μ DEA ,鹼性磷 酸 酶 濃 度 為 2.83 ! X 1 0*1 3 M，在 B erthold LB952T發光計中進 行 測 量 0 賁 施 例 X X V 表 7 顯 示使 用表 5實施例 X X I V所述程 序供 偵 測 驗 性 磷 酸 酶 與 R - 取代 二氣雜環 丁烷的 偵_限制 ,除 了 其 中 使 用 —. 種 儀 器來 測畺 化學發光 強度讀 數。此實 施例 所 用 的 發 光 計 為 L a bSy s item L urn i ο η 〇 s k a η π i c r 〇 t iter pi ate re ad e r 〇 表7 鹼 性 磷 酸 酶 偵測 限制 與化學發 光（2χ背景） 培養 5分鐘 藍寶石I 藍寶石I I AMPPD 3 .8x10** 5 Μ 2 .5 X 1 Ο'1 £ Μ Cl -AMPPD 1 .4 X 1 Ο*1 5 Η 8 .0 X 1 Ο'1 ^ Μ Br -AMPPD 2 .7x10'* 5 Μ 4 .0 X 1 0·1 6 Μ HO -AMPPD 3 .1 X 1 〇-1 5 Μ 1 • 4 X 1 0·1 5 Μ 培養2 Q分鐘後 * 8 8 - 先 閲 in 背 而 之 注 意 事 項 # 本 裝 π 線 本吟張尺度边用中®國家楳準（CNS)T4規怙（210x297公;¢) S1. 2. 20,000 M賨石I 1.4X10·1 s 5 . 0 x 1 0-1 5 4 . 0 x 1 O'1 s 1 . 1 x 1 O-1 5

AHPPD C 1 -AMPP D Br-AMPPD HO-AMPPD 五、發明説明（4 藍賓石I I 1 ‘ 1 X 1 0.1 5 4 . 3 X 1 O'1 e 3 . 9 x 1 0*1 « 3 . 1 X 1 Ο*1 ® 1) 缓衝液：〇 . 1M二乙醇胺，lmM氯化鎂，0 . 02¾銎氮化納 ，PHIO . 0〇 2) 訊號記錄器於 Labsystems Luminoskan Microtiter plate reader.

實施例X X V I 表8顯示表4於2 ◦分鐘培養後資料，於W i 1 j microti ter plate luminoneter測量。 表8 鹼性磷酸酶偵測限制與化學發光（2 x背景）

培養 2(3 分鐘，LABSYSTEMS .. 藍耷石I 藍寶石I I AMPPD 1 . 4 X 10-1 2 Μ 1 . 1 X 1 0-1 2 Μ i? 先 閲 in 背 而 之 注 意 事 項 再 堝 % 經濟部屮央標準^A工消"合作社印製

C1-AMPPD

Br-AMPPD

HO-AMPPD 5 . 0 x 1 O'1 6 Μ 4 . 3 X 1 Ο-1 4 . 0 χ 1 Ο'1 6 .1 χ 1 Ο-1 5 培養23分鐘後，WILJ 藍寶石I AHPPD 1.9X10-1 5 Μ _-89- 3.9Χ10-1 6 Μ 3 . 1 X 1 Ο'1 6 Μ 藍寶石II 1 . 3 X 1 Ο-1 s Μ 尺度边用中a國家《準（CNS)T4規格（210χ29_/公，ϋ) SI. 2. 20,000 2 A () I? 6

C 卜 A Μ P P D 7 . 0 5 x 1 0-1 6 M 2 · 1 X 1 O·1 6 M

Br-AMPPD 2.1x10'' 6 M 7.4x10·1 6 M

HO-AMPPD 1 . 5 x 1 O'1 5 Μ 1.4X10·1 5 M

實施例X X V I I

經濟部屮央榀準XJCX工消费合作社印M AMPPD和Cl-AMPPD在耐隆薄膜上功能的比較如下 :12.5picograms的生物素基化的- pBR322-(35聚合體）於1微 升中被著點於乾燥耐隆薄膜上，然後用紫外線予以照射，使 交鏈到薄膜上，接著用1XSSC緩衝液予以藤潤，與0 . 2：ϊ酪蛋白 ,0. UTween 2 0 (磷酸鹽缓衝液鹽水（P B S)中）一起於室溫培 養1小時，用〇 · 3 % T w e e η 2 0 ( P B S中）清洗4次，於基質緩衝液 (0 . lMm二乙醇胺，lmM氯化镁，PH10 . 0)清洗2次，在0. 25mM二 氧雜琛丁烷（基質緩衝液中）培養5分鐘。以此種方式，兩種 薄膜分別在A Μ P P D和C ：l - A Μ P P D培養之後而生成，然後將薄膜 密封在塑膠袋中，連接到1 2 X 7 5 π π玻璃試管外側，再插入配備 刨裝光倍增器偵測器的 T u r n e r 2 0 Ε型的發光計，使其熱平 衡到.3 Q°C ,然後對化學發光強度監控2 Q到4 0小時，如圖1 9所 示，AMPPD和U-AHPPD的化學發光訊號被製成為對時間的函 數。

實施例X X V I I I 得自在PVDF和NYLON薄膜上的最大化學發光強度的半衰 期計算自所收集到資料，如實施例XXVII所逑的NYL0H薄膜。 對PVDF薄膜而言，修正protocol包括用第二基質缓衝液清洗 ，接著在室溫下將薄膜在Tropix NitroBlock試劑中培養5分 本紙張尺度边用中a困家4ί孕(CHS) T 4規格(210父297公放> S1. 2. 20,000 Λ () 1\ 6 請 先 閲 ύ 背 而 之 注 意 事 項 % 本 鐘，接箸用基質缓衝液清洗，再加入二氧雜環丁烷基質。最 大化學發光訊號的半衰期乃以對數（最大化學發光訊號扣除 每値時點的訊號）對時間作圖如表9所示。 表9 偵測生物素基化DNA化學發光 --半衰期對最大化學發光--

薄膜 AMPPD C1-AMPPD P V D F * 45.51 分 14.20分 NYLON 99.83分 47.48分

在添加基質之前，P V D F薄膜先被N i t r q B L 0 C K處理。 12.5pivogram維辛素基化的PBR322-35聚合體被Avidix-AP 以及ΡΗΓ0 . 0的0 . 24mM二氧雜環丁烷（0 . 1M DEA中）偵測。 實施例X XI X 使用PVDF和NYLON上的AMPPD和C1-AMPPD,以生物素基化的 PBR322 DNA探針偵測PBR322質體DNA,步驟如後 ：pBR322 經濟部屮央楳準扃β工消费合作社印製 DNA被煮沸而變性，一条列樣品披1 XSCC缓衝液（每孔的最终 DNA質塊顯示於圖20)稀釋，被置於 IaiBobilonPPVDF薄膜和 Afflersham Hybond N nylon薄膜上，其乃使用 Schleicher 和 Schuell slot bo 11儀器。用紫外線使DNA交鐽到

Biodyne A和Hybond薄膜上.Imaiobilon P薄膜首先被阻 斷，然後用紫外線處理，薄膜接著被1XSCC缓衝液濕潤，在65 = 於雜交缓衝液（1M 氯化鈉，0.2¾:肝素，0.5¾聚乙烯吡咯烷酮 ,U 十二基硫酸钔，lmΜ乙烯二胺四醋酸，5¾¾聚糖硫酸發 _________ -91- _____ S1. 20,000 本紙5艮尺度边用中a Η家楳準(CNS) Τ4規格(210x297公;it) ®ii〇66 五、發明説明（¾¾ (請先閲請背而之注意事項存项艿本^ ,50mH Tris-HCl,pH7.5)中預行雜交，於 之下與 12ng/ml PBR322探針（使用nick translation程序進行生物素基作 用）於相同缓衝液中進行雜交，在s 5 C於相同缓衝液（扣 除葡聚糖硫酸鹽，EDTA和tepahn)清洗一次，75X：下於 1XSCC/12SDS 清洗二次逵 10分鐘，75t 於 〇, IX SSC/USDS清 洗二次達1 5分鐘，室溫下於u S C C清洗二次達5分鐘，於2怎酪 蛋白 ，〇.ii%Tween 20(ysoy PBS中）中被保護1小時，於 0.23：酪蛋白（PBS中）清洗一次達5分鐘，在鏈徽卵白素標s己 齡性磷酸酶被以 1-15QQC稀釋於0.2¾酪蛋白/PBS培養30分 鐘，然後用0 . 2 酪蛋白，T e e η 2 0 ( P B S中）清洗6次，於基質缓 衝液 （0 . 1 Κ二乙醇胺，1 π Η氯化鎂，Ρ Η 1 0. 0 )清洗二次，然後 在基質缓衝液中的 0.25mM AMPPD和 C卜AMPPD(兩種分雞 的薄膜）培養5分鐘。在添加基質之前，PVDF薄膜於N i t ro B 1 〇 c k 中培養5分鐘，並用基質缓衝液清洗二次。薄膜然後被包在 塑膠中，然後在添加基質之後暴露於P 〇 1 a r q i d 6 1 2型底片 ，如.圖 2 0所示。

實施例X X X 經濟部屮央楳準而β工消费合作社印製 甩生物素基化的P B R 3 2 2 D N A探針以P V D F , n y 1 〇 h和硝基繊 維素上 AMPPD, U-AP«MD,和 ΒΓ-AHPPD偵測 PBR 3 2 2 質體 DNA乃 使用類似於實施例X X I X所述的P r Q t 〇 c ο 1加以進行的，唯一不 同之處是目標DN A固定在PVDF和硝基繊雒素的方式是在80 t 將薄膜焙烤2小時。而在添加二氯雜環丁烷之前，PVDF和硝 基鐵維素薄膜被硝基阻斷劑處理。不同二氧雜環丁烷磷酸 本紙張尺度逍用中8 8家櫺準(CNS) T 4規格(210x297公;Jt) SI. 2. 20,000 1066 (S7) 五、發明説明 酶被共轭於不同薄膜支持物的鹼性磷酸酶D N A探針所催化而 分解所産生的化學發光訊號Polaroid 6 21型影像，顯示於圖 210

實施例X X X I AMPPD和C1-AMPPD在硝基继維素薄膜與驗性磷酸酯有關 的光照射動力學乃依照以下方式予以比較：先前被3 ’末端標 記著生物素-U - d U T A ( 1微升含1 2 . 5 p g )的p B R 3 2 2 - ( 3 5聚合體 )被點記在乾燥的硝基纖雒素薄膜上，該薄膜然後被1XSSC缓 衝液濕潤，用0.2%諮蛋白，0.1：STween 20於磷酸鹽缓衝鹽水 (PBS)在室溫下培養1小時，在基質缓衝液（0.1 Μ二乙醇胺 ,ΙπιΜ氯化鎂，ρΗΙΟ.Ο)清洗二次，用NitroBlock試劑培養5分 鐘，在基質緩衝液清洗二次，然後兩Η試片痼別繼缠於 0 . 2 5 m M A Μ P P D和C 1 - A H P P D (於基質緩衝液中）培養5分鐘。接 箸將薄膜密封於塑膠袋中，連接到1 2 X 7 5 m m試管的外側，然後 插入配備著一側光倍增管偵測器且被熱平衝到3 0 t的 T u r卩e r 2 0 - E型發光計。在2 0 - 4 0小時内監控化學發光強度， 經濟部中央標準局只工消费合作社印31 如圖22所示，AHPPD和C1-AMPPD的化學發光強度訊號對時間 作圏。 實施例X X X 11 使用以下的程序評估在薄膜之上的蛋白質，IgG,用共軛 羊-抗鼠抗體的鹼磷酸酶，AMPPD和C1-AHPPD加以偵測，其半 衰期對最大化學發光訊號強度。1徹升的纯化鼠IgG於20%甲 醇電泳轉移緩衝液所形成的1微克/毫升溶液被點於乾燥硝 _H__________ 本紙張尺度边用中曲明家«準(CNS)T4規格（210x297公货） 81. 2, 20,〇〇〇 β a, η 1 t 2 五、發.明説明 lOTWli 基·缝袤和il潤P O F薄膜上。薄膜逛缥披〇 · 1〗τ w e e η 2〇/?BS洗藤，於保護缓衝 '夜（〇 · 2¾酪蛋白，〇 . U Tween-20於 P S S )保護1小時，共鈪到羊抗鼠抗證的鹼性磔酸酶於保護缓 衝莜的1-IQ000倍稀釋液中培養，在保護缓衝液中清洗二次 逢5分鐘，在G.l：STtfeen-20/PBS清洗5分蓮達5分蓮，在基霣缓 缓衝液（0 . 1 Μ二乙酵按，1 a Μ Μ化镁，ρ Η 1 0 · 0 )甲清洗二次達5 分箍，分成兩値實施例並分別於（].25πΜ的AMPPD和C1-AMPPD 培養5分鐘。將薄歲密封於塑騵袋中，連接到Ι2χί5ππ試管的 外側，然後插人配備著一倒光倍增啻偵測器且菝熱平®到 3 0 t 的 Turner 20-Egg 光計 3 !濟邶中央準Λ貝工消伢合作杜印11 (諳先閲靖背而之注意事項再填¾本頁)

S 施例 XXXI I I 西方吸墨分析乃在偵測在耐隆薄膜上會産生化學g光 的人類蓮鐵蛋白，纯化人類蓮鐵蛋白的0-5, 1,2, 4, 3, IS, 32, -9 4" _ _____ Λ () Η 6 211066 五、發明説明（if!) (請先閲讀背而之注意卞項#填寫本β 64,128和256ng的一条列稀釋液被SDS聚丙烯醯胺膠電泳和 電泳方式傳送到Pall Biodyne A耐隆薄膜上。薄膜接著被 磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)清洗，被PBS中的〇 . 3¾酪蛋白保護30分 鐘，在老鼠抗-人類蓮鐵蛋白於〇.33iTween-20/PBS的稀釋 1000倍稀釋液中培養，用0.3%Tween-20/PBS清洗4次達5分鐘 ,用標記羊抗鼠抗體的鹼性磷酸酶於〇. 3 U wee n-2 Ο/PBS的被 稀釋10000倍的稀釋液中培養，在0.3XTween-20/PBS清洗4次 ,在基質緩衝液（0 . 1 Μ二乙醇胺，1 a Μ氛化鎂，ρ Η 1 0 . 0)中清洗 二次，在 〇.25：UM AMPPD,C1-AMPPD和 Br-AMPPD於基質缓衝液 中培養5分鐘，然後暴露到Ρ 〇 1 a r 〇 i d 6 1 2型立可拍黑白底片 達 5分鐘，結果列於3 0。

實施例χ·χχιV 經濟部屮央標準局Α工消伢合作社印製 依照實施例13所述的程序進行人類蓮鐵蛋白在 Inmobi lun-P PVDF薄膜進行偵測化學發光，除了作以下的改 變：在添加二氧雜環之前，4値Ρ V D F薄膜之中的2値在 Not.](：oBlQck培養5分鐘，然後在基質缓衝液清洗二次，AMPPD 和C 1 - A Μ P P D在有無N i t r q B1 d c k情況下暴露5分鐘，結果列於 圖230

實施例X X X V 化學發光偵測鼠間白血球溶菌素-4基因，其乃使用鹼性 磷酸酶標記寡核苷酸探針與AMPPD,Cl-AMPPD,Br-AMPPD和 LumiPhus 530。含該基因或者鼠間白血球溶菌累- 4(MIL)基 因被連續稀釋於1XSSC並箸點於乾瑪BiQdyne A薄膜，重量分 _____- q q - _ f紙張尺度遑用中a Η家標準(CNS) T4規格（210x297公A) SI. 2. 20,000 21106^ Α (ί Η 6 五 、發明説明（*|为 經濟部屮央榀準局κχ工消t合作杜印製 別為 1 2 . 8 , 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.0 2 5, 0 . 0 1 2 5 , 0 · 0 0 6 3 和 0.0 0 3 1 5 n g 的 D Ν Α。D Ν Α 被紫外線 固定在薄膜上，並接箸被1XSSC濃潤，50 t：時預雜交於雜交缓 衝液（7% SDS, U骼蛋白，0.25H Naz P〇4 , pH 7.2 與瞵 酸 ）3 0分鐘，在5 0 °C用5 η Μ標記着募核苷酸探針的鹼性磷酸 藺雜交2小時，依下列方式清洗：室溫下於2 X S S C , U S D S清洗 二次，在5 0 °C於1 X S S C , U S D S清洗二次達1 5分鐘，於室溫下 在1 X S S C , 1 % T r i t ο η X - 1 0 0清洗二次達5分鐘，在1 X s c c清洗 二次逹5分鐘，在基質缓衝肢（〇. 1Μ二乙醇胺，InM 氯化鎂 ,Ρ Η 1 0 )清洗二次。薄膜値別樣品分別於G - 2 5 m M AMPPD , C1-AMPPD , Br-AMPPD和 LuniPhos 530培養 5 分鐘，包於塑膠 袋中，培養一時之後，暴露於κ 〇 d a k ' X A R - 5 X射線底片1小時 。實驗結果列於圖24。 實施例X X X V I 用Cl-AMPPD和AMPPD所得的化學發光訊號強度的比較見 表％序列反應乃使用帶有含BioRad BST聚合酶的5’-生物 素化泛用首層M13mpl8 DNA。兩組反應在7.67 Μ尿素離子-梯度聚丙烯韹胺膠被分開，然後以被動式的毛細管傳送，被 傳送到耐11薄膜。以紫外線照射5分鐘，使D Ν Α因為交鏈而固 定在薄膜上，薄膜然後在室溫下於保護缓衝液（0.2¾酪蛋白 ,0 . Π Tween-20於PBS中）與標記鏈徽卵白素鹼性磷酸酶 於0 . 2 X酪蛋白，P B S中被稀釋5 0 0 0倍的稀釋液培養3 0分鐘 ，在0 . 3 % T vf e e η - 2 0於P E S中清洗二次，在基質缓衝液（〇 · 1 Μ _- Q R -____ i 先 m ifi 背 而 之 i主 意 卞 項 % 木 f·紙張尺度边用中8B家楳毕(CNS)T4規格(210X297公龙） S1. 2. 20,000 A fi Π 6 211066 五、發明説明 ? 閲 背 而 之 /ϊ 意 項 再 寫 本 二乙醇胺，1 π Μ氮化鎂，Ρ Η 1 Q )清洗一分鐘，將薄膜分成兩塊， 於0.25mH二氧雜環丁烷培養5分鐘（分別對AMPPD和 U - A H P P D),將薄膜包於塑P袋中，培養1小時之後，暴露於 KodakXAR-5X射综底片7分鐘。實驗結果列於圖25。

實施例X X X V I I 使用CSPD和C1-AMPPD比較DNA帶解析度是在應用序列反 應情況下進行的，而其轉移和化學發光偵測是在如實施例 X X X V I使用A H P P D和C 1 - A Μ P P D的相同情況下進行的。顯示於 圖2 6為加入基質之後曝光1分鐘和2 4小時的情況。

實施例X X X V I I I 使用位於硝基缒維素薄膜上的A Μ P P D , C卜A Μ PP D和 B r - A Μ P P ’D偵測帶有生物素基化p B R 3 2 2 D Ν Α探針的p B R 3 2 2質 鱧DNA。PBR322質體DNA被一連串的稀釋，並分別將512， 256, 128, 64, 32, IS, 8, 4, 2, lpg的 DNA置於 3塊乾燥 經濟部屮央櫺準局貝工消许合作社印製 的硝基纖維素薄膜上，該薄膜接箸在 8 Q t焙烤2小時，並用 紫外線處理5分鐘，用1 X S C C濕潤，在雜交缓衝液（1 Μ氯化納， 0.2U干素，〇.53ί聚乙烯吡烷酬，40¾十二基亞硫酸鲂，lmH乙 烯二胺四醋醆，52®聚糖，50nM Tris-HCl, PH7.5)預雜交 60分鐘，與被nick轉譯生物素基化的15ng/nl PBR322探針雜 交，65 t在雜交缓衝液（扣除肝素，葡聚糖和EDTA)清洗5分鐘 ，在751於1XSCC/USDS清洗二次5分鐘，在75t：用1XSCC / USDS清洗二次15分鐘，在室溫下用1XSCC清洗一次5分鐘。 該薄膜然後在室溫下進行化學發光偵測，其乃用0 . 2 %諮蛋白 S1. 2. 20,000 本紙》尺度边用中SB家«準(CNS)IM規格（210><297公龙） 211〇68 五、發明説明 (請先閲請背而之注意肀項再填寫本一{ 於P E S中清洗二次，，用組斷缓衝液（0 . 2 0 %裔蛋白，0 · 1无 Tween 2 0於P BS中）予以阻斷1小時，用〇 · 2 U酪蛋白於P BS中 清洗5分鐘，然後用0. 2 X 3§蛋白（P B S)清洗5分鐘，用標記鐽徽 卵白素的鹼性磷酸酶於0.2¾詻蛋白稀釋15000倍的稀釋液中 培養3 0分鐘，在H i t r ο B U c k溶液清洗二次達5分鐘，然後用 0 . 3 ίϋ T w e e η - 2 0 / P B S凊洗4次，每次5分鐘，然後在基質緩衝液 (0 . 1 Η 二乙醇胺，1 in Μ氯化i.i , Ρ Η 1 0)中清洗二次（每次5分鐘 ),將帶子個別三種嬝度為〇.25mM二氧雜環丁烷的二氧雜環 丁烷磷酸鹽(AMPPD, C1-AMPPD 和 Br-AMPPD)中培養。 Ρ ο 1 a r 〇 i d 6 1 2底片曝光時間在各種培養時間的倩況顯示於圔 27〇 實施例X X X I X · 用鐽徽卵白素鹼性磷該藺共轭物和化學發光二氣雜環 丁烷磷酸鹽.AMPPD.C1-AMPPD和Br~AMPPD(於中性耐隆薄膜 上）來偵測帶有生物素基化P B R 3 2 2 D N A探針，其乃採用實施 例χμνί II所述的程序，除了省略5分鐘的Nit roB lock培養。 結果如圔23所示。 經洧部屮央楳準而κχ工消1-Ϊ-合作社印製

實施例X L 偵測人類蓮鐵基因化學發光乃在Imiiiobilon-P PVDF薄 膜上進行的，膠電泳，轉移，阻斷和偵測步驟均依照實施例 XXIV進行，除了所有的PVDF薄膜都在NitroBlock試劑中培養 5分鐘。圖29顯示AMPPD,C1-AMPPD和Br-AMPPD在人類蓮鐵基 因在P V D F薄膜上的差別。 - - "98" 本紙張尺度边用中a困家樣準(CNS)T4規格(210X297公龙） g] 2. 20,000 «211066 Λ fi Π 6 五、 發明説明（0 實施例X L I 每一種列於表11的二氯雜環丁烷的熱背景在一種〇.4mM 二氧雜環丁烷於0 . 1Μ二乙醇胺，1 η Μ氛化鎂（ρ Η 1 0 . 0)的溶液 中，於301C在Turner20型發光計測量，在沒有酵素存在之下 ,每一種樣品的平均化學發光強度在0.4 下被標示為”非 待殊背景”，並以相對發光單位（R L U),見表11。 二氣雜環丁烷陰離子的半衮期亦列於表1,測量如下：1 毫升的0 . 0 4 二氣雜環丁烷（於同上缓衝液中）溶詨在3 0 t： 被加入0.764pic〇BQle驗性磷酸酶於Turner 20型發光計中 完全披去磷顏基作用。二氣雜環丁烷陰離子的半衮期乃從 化學發光照射的第一次衮退來計算。 ' 表11 二氧雜環丁烷半衮期和非持殊背景照射（31.51C) 二氧雜環 對平頂曲综半衮期 (分）於低鹼性磷酸酶* 先 m ή 背 而 之 注 意 項 塡 寫 本 裝 玎 線 經濟部屮央榀準局A工消费合作社印製 非持殊背景 0 . 4mM RLU AMPPD λ. 1.97 1 • 95 FSPD 0.74 0 • 45 CSPD 0.71 0 • 96 BrSPD 0,70 0 .93 I SPD-A 0.64 0 .47 ISPD-B 0.70 0 • 93 ho^amppd-a 0.93 0 • 92 ho-amppd-b 1.03 1 .35 G张尺度逍用中曲®家採準(⑽τ4規格(210x2n) S1. 2. 20,000 211066 Λ (i η 6 五、發明説明（Μ

ch3 o-amppd-a ch3 o-amppd-b i-PrO-AMPPD-A i-PrO-AMPPD-B .86 • 93 .63 .8 3 .9 8 .74 .91 n-BuO-AMPPD 0.71 ::(試管含有2.83%10131^鹼性磷酸酶於0.1»二乙醇胺，111^氯 化鎂，0.022昼氮化鈉（pHlQ . 0)。 本發明有關以上的討論主要針對其較佳具體實施例和 實例，對習知此技人士而言，針對本發明觀念所作的1 〇種改 變和改良可很容易的被達成而不脱離以下申請專利範圍所 規範的本發明精神及範瓖。 (請先閲讀背而之注意事項洱项寫本♦ 裝· 訂· 線- 經濟部屮央標準局貝工消费合作杜印製 本紙張尺度逍用中B困家搮準卬《)肀4規格（210X297公龙） S1. 2. 20,000

Claims (1)

1. 補充 Α7 Β7 C7 D7 六、申請專利範面 1.一種可由酵素予以裂解化學發光1, 2—二氯雜環丁 垸化合物，其於分解時會發光，在室溫下以及其由酵素予 以裂解的不安定取代基鍵结被蓄意裂解之前呈大致穩定狀 態，由下式代表：

   中 其 X X 和和 X X 基 R 為 C 和 基 羥 #; 鹵氫 , 為 氫値 2 表 一 R 代有 ， 別 R 基 分中氧 1 I 甲 為

   氧 垸 4 C ---------------'--------装------訂----線 (請先《讀背面之注意事項再壜寫本頁) «濟部t*樣攀扃WK工消费合作社印製 X 且 基 羥 為 X 中 其 物 0 合 苷化 耱之 乳項 半 1 或第 鹽圍 酸範 磷利 一 專 為請 γ Φ , 如 。 中 .氳 其 2 為 «濟部中*標翠马员工消费含作让印*1我 2ΐ1〇6δ β7 C7 _D7_ 六、 申請專利範圍 3. 如申請專利範圍第1項之化合物，其χ為氮且χι為 氫。 4. 如申誚專利範圍第1項之化合物，其中X為溴且X1 為氫。 5. 如申請專利範圔第1, 2或3項之化合物，其中R2 為間磷酸鹽取代苯氧基。 6. 如申請專利範圍第5項之化合物，其中磷酸鹽取代基 為二鈉鹽。 7. 如申請專利範圍第1, 2或3項之化合物，其中R2 為間；3 _ D —半乳塘苷一取代苯氧基。 8.3- (4 -甲氯基螺〔1, 2 -二氯雜頊丁烷一3, 2’ - (5 —羥基）三環〔3. 3. 1 . I3 7〕十基〕 一 4 一基）苯基碟酸二納鹽J 9. 3 - (4_甲氧基螺：1, 2 —二氯雜環丁垸一3, 2’ 一 （5_ 氣）三環〔3. 3. 1 . 1 3 7]十基〕— 4 一基）苯基磷酸二納鹽： 10. 3 — （4 一甲氣基蟋：1, 2 -二氧雜環丁垸-3 ,Z ' — ； 5 - ；三澴、2. C . ： . ： : 丁基： 一 4 一基）苯基碟酸二納鹽： 11. 同側：3 - : 4 -甲氧基揉：1 , 2 —二氧雜環丁 垸一 3， 2’ - (5 -羥基）三環〔3. 3. 1. 1 3 7 十基：_4 一基；笨基龚酸二訥鹽： 1 2 . [5] Μ ：： - ^ % % m ： 1 , 2 — 二氣雜環丁 (請先《讀背面之注意事項再場寫本頁) Λ —裝· 訂. -線· 2li〇^6 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 烷一 3, 2’ 一 （5 —氮）三環〔3. 3 . 1 . 12 7 1 十基〕一 4 一基）苯基磷酸二鈉鹽。 13.同側 3 — （4 一甲氧基螺〔1, 2 —二氧雜環丁 烷一 3, 2’ - (5 -溴）三環〔3. 3 . 1 . 1 3 7 3 十基〕一4一基）苯基磷酸二鈉鹽。 1 4 . 反側3 — （4 一甲氣基螺〔1, 2 —二氣雜環丁 烷一3, 2’ 一 （5 —羥基）三環〔3. 3. 1. 1 3 7 〕十基]一 4 一基）苯基磷酸二鈉鹽。 15. 反側 3 - (4 —甲氣基螺〔1, 2 —二氣雜瓖丁 垸一 3, 2’ 一 （5 — 氛）三環〔3. 3 . 1 . 13 7〕 十基]一 4 -基）苯基碟酸二鈉鹽。 16. 反制 3 — （4 一甲氧基螺〔1, 2 —二氧雜環丁 烷-3, 2’ 一 (5 -漠）三琿〔3. 3 . 1 . 13 7〕 十基〕一 4 一基）苯基磷酸二納鹽。 17. —種下式化合物的烯醚醇：

   (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) .-r -—裝. 訂. 線. 211066 A7 B7 _D7 六、申請專利範園 X和X 1 q別代表氫，鹵柔，羥基和C 基，X和X1不同時為氫； Y代表甲氣基，Y 1為

   或半乳糖苷 C + .院 S ϋ濟部t央揉翠.局員工消費合作社印製 18. 如申請專利範圍第17項之化合物，其中X為羥基 且X 1為S。 19. 如申諳專利範園第17項之化合物，其中X為氛且 X 1為氫。 20. 如申請專利範園第17項之化合物，其中X為溴且 X 1為氫。 21. 3 -(甲氯基一5 —羥基三環〔3. 3 . 1. 1 3 7 〕十基一2 —基叉甲基）苯基踌酸二納。 2 2 . 3 — ί 甲氯基一5 — 氡三環〔3. 3. 1 . 13 7 :十基一2—基叉甲基）苯基碟酸二納： 2 3 . 3 — t 甲氧基一5— LE 三環、3. 3 . i . 1 - 7 〕十基_2 —基叉甲基）笨基磷酸二訥。 2 4 . —種鑑定方法，其中藉由光學可偵測反醮偵潮具備 持#鐽结配對者，其改良之處包括一種經由薄素可予以裂 解化學發光1 , 2—二m雜環丁垸化合物在分'解時會産生 光能量的酵素反睡，在室溫下以及其由酵素予以裂解的不 ---------------^--------裝------.玎---If -線 (請先Μ讀背面之注項再壜寫本霣) A7 aii〇6b B7 C7 D7 六、申請專利範園 安定取代基鍵結被番意裂解之前呈大致穩定狀態，由下式 代表：

   其中： X和X 1分別代表氫，鹵素，羥基和C i _ C +垸氧 基，X和X 1不同時為氫；f R t為甲氧基，R 2為

   (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) •装. 訂. 線. 嫌濟部中兴標季局κ工消费合作社印# 其中，Y為一龚菏鹽或半乳塘荅；在水溶性加強物霣存在 之下進行，其奎生的待殊光能量高於無加強物霣的情況； 其中該加強物霣包活一正霄荷聚合季銨鹽和螢光素，其能 夠與隨著薄袤1化分解該1 , 2 -二氣雜琿丁垸化合物而 .室生該1 . ：_ -二氣1澴=:完七合物的負電荷産物而形成 211〇66 A7 B7 C7 D7 熳濟部中央櫺攀局具工消t合作杜印s 二 、申請專十 丨範園 三 级 錯 A 〇 物 > 藉 此 在 該 負 電 菏 産 物 與 *fc W 光 素 之 間 發 生 能 置 轉 移 而 使 得 螢 光 素 發 光 2 5 • 如 Φ 請 專 利 範 圍 第 4 項 之 鑑 定 方 法 > 其 中 X 為 羥 基 且 X 1 為 氫 〇 2 6 * 如 串 請 專 利 Λ^· m 圍 弟 〇 4 項 之 鑑 定 方 Λ+ t 其 中 X 為 氛 且 X 1 為 氳 〇 〇 Ύ * 如 Φ 請 專 利 範 圍 第 2 4 項 之 鑑 定 方 法 i 其 中 X 為 溴 且 X 1 為 氣 〇 2 3 如 Φ 請 專 利 範 圍 第 2 5 i 〇 6 或 2 7 項 之 鑑 定 方 法 » 其 中 R 為 間 碟 酸 鹽 — 取 代 苯 氧 基 0 9 如 Φ 請 專 利 範 圍 第 2 8 項 之 鑑 定 方 法 $ 其 中 m 酸 鹽 取 代 基 為 二 m 鹽 〇 3 〇 * 如 Φ 請 專 利 μ» m 圍 第 2 5 2 6 或 2 "Γ 項 之 鑑 定 方 法 ， 其 中 ΤΛ 2 為 間 β — D 一 半 乳 塘 苷 取 代 苯 氣 基 〇 1 如 Φ 請 專 利 Jf^p· m 圍 第 2 4 項 之 鑑 定 方 法 > 其 中 1 » 一 二 氣 雜 環 丁 院 化 合 物 為 3 一 / 4 — 甲 氣 基 螺 r 1 1 2 — 二 氧 雜 環 丁 λ完 - 〇 » 〇 - V Γ' ' - 涇 基 二 環 < 〇 • • ^1 1 1 3 7 十 基 — 4 — 基 ) 苯 基 碟 酸 二 m 鹽 〇 3 2 如 申 請 專 利 範 圍 第 2 4 項 之 鑑 定 方 法 » 其 中 1 > *p — 二 S 雜 環 丁 烷 化 合 物 為 3 — ( 4 一 甲 氣 基 螺 r 1 ， 2 — 二 氧 雜 琿 丁 院 — 3 » > 一 5 9 — m —· 環 r 3 3 1 1 3 7 ] 十 基 — 4 • 基 ) 苯 基 碟 酸 \ 鈉 鹽 〇 ---------------^--------装------.玎—Λ '0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 嫌濟部中央標準爲员工消费含作杜印S 21Λ066 A7 B7 C7 _ D7 六、申請專利範園 33. 如申諸專利範圍第27項之鑑定方法，其中1, 2 -二氣雜環丁垸化合物為3 — （ 4 一甲氣基螺〔1, 2 - 二氧雜環丁烷一 3, 2’ - (5’ -溴）三環〔3. 3 .1. I3 7]十基]-4-基）苯基磷酸二鈉锂。 34. 如申誚專利範圍第24項之鑑定方法，其中持殊鍵 結配對包括一抗原和一抗證。 35. 如申請專利範圍第24項之鑑定方法，其中特殊鍵 結配對包括一核酸和一能夠鍵結到所有或一部份核酸的探 針。 36. 如申諸專利範圍第24項之鑑定方法，其中恃殊鍵 結配對包括一酵素和含有可彼該酵素裂解的基的1, 2 - 二氣雜環化合物。 37. 如申請專利範圍第36項之鑑定方法，其中可被酵 素裂解的基包括一吡喃半乳搪，該酵素包括一半乳耱苷菌 〇 38. 如申諝專利範圍第35項之鑑定方法，其中核酸為 D N A , R N A或其碎Η : 3 9.如申諸專利範圍第3 5項之逋定方法，其中深到·為 一與核酸酸互補的揉記募核苷酸。 4 0.如申請專利範圃第39項之鑑定方法，其中寡 酸被生物素基化。 41 :如申請專利範圍第39項之鑑定方法，其中DNA ,RNA或其碎Η乃製術自序列程序。 {請先Μ讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝. 訂. .線. A7 B7 C7 D7 211066 ί、2申利範圔第4 1項之鑑定方法，其更包括 以下步驟： (a)使DNA, RNA或其碎片與標記互浦募核苷酸探針 接》以形成一雜交配對， (iJ)將雜交配對與能夠強固的鍵結到寡核苷酸標記的分子 上，該寡核苷酸與能夠裂解一可被酵素裂解的1, 2_二 氣雜琿丁烷的酵素共價共轭，以釋出光能， (c) 添加類似1，2-二氣雜環丁 €基質，和 (d) 偵測産生的光。 4 3.如申諸專利範園第4 2項之鑑定方法，其中募核守 IS瀠記為一生物袤或生1¾¾¾生饬。 44. 如申誚專利範圍第42項之鑑定方法，其中能夠與 募核苷酸搮記有強烈交互作用的分子是卵白素或鐽截卵白 45. 如申謓專利範圔第42項之鑑定方法，其中酵素為 一酸或一鹼踌酸酶，Rt為甲氧基且為一間碟酸鹽取 代苯氧基3 4 3 ·如申請專利範圍第2項之逋定弯4，其=該語5 為半乳搪苷酶，R i為甲氧荃，^ -為一間_ D -半乳 --------装------訂----.(I線 (請先閲讀背面之注$項*填寫本1} «濟#中*櫺準局員工消費合作社印《 苷 糖 7 4 法 方 定 鑑 之 項 2 4 第 園 ，範 基利 氣專 苯諒 代申 取如 被 能 光 中 其 定 0 U S Γ C.J 4 第画 範 利 ο 專 0 謫 偵申 片如 底 光8威4 液 能 :t 卞 H 211068 A7 B7 C7 D7 申、ί 、電 六光 園 範 核環 寡雜 該氣 中二 其 -, 2 法 -方 1 定該 鑑解 之分 項夠 9 能 3 一 第記 。 圍標素 範式酵 利方的 專價能 請共光 申以射 如針發 . 探以 9 酸烷 4 苷丁 核學 寡化 在疫 中免 其以,m 法抗 方該 定 ， 鑑原 之抗 項結 9 鍵 3 價 第共 園| 範括 利包 專記 請標 申的 如針 . 探 ο 酸 5 苷 原能 抗光 該射 對發 針以 為物 0 合 抗化 該環 中雜 其氧 ,二 物| 軛 2 共 . 素 1 酵該 體解 抗分 一 夠 到能 结素 鍵酵 式該 方 . 或 9 4 , 第藹 圍酸 範磷 利驗 專 一 請或 申酸 如 I . 為 1 素 5 酵 R 中磷 其間 , 一 法為 方 2 定 R 鑑且 之基 項 a ο 甲 5 為 {請先閲讀背面之注f項再填寫本頁) 第 圍 範藤 〇 利苷 基專糖 氧II乳 苯 申半 代如為 取 素 鹽 2 酵 酸 5 該 R 中 其一 , 3, 法間 方一 定為 鑑 】 之 R 項 ， ο 基 5 氧 或甲 9 為 D 鑑行 之進 Is± ο 膜 5 薄 或陲 9 耐 4 1 '\M-9 是 3 酸 , 核 5 該 〇 3 到 基第结 氰圍键 苯範針 代利探 取專該 I 諳中 苷申其 耱如 ， 乳 .法 半 3 方 - 5 定 嫌濟部中央攉攀居Λ工消f合作汰印# 6 碎進 4 其上 ,或膜 5 A 薄 4N 隆 » R fm 4 , 一 4A 在 ,N 是 C.JD 交 4 中 雜 , 其的 2 .間 4 法之 窠方 針 圍定 0 範滏酸 利 之 苷 專項核 請 3 0 申 4 記 如或摞 7 被 4 4 與 5 ， Η 勺 δ 行 笔 1 ®· 利 專 請 & 如 材 母 饅 固 在 法 - :®' 211068 A7 B7 C7 D7 :r ΐ進$行f該母材上的非持殊鍵结乃預先以聚合季鉸 溶 水 該 中 其 法 方 定 鑑 之 項 4 〇 2 〇 斷第素 阻圍白 以範蛋 nu **·5 而專血 材請為 母申質 該如拽 BE 巨 理 .強 處 6 加 鹽 5 性 強 加 該 中 其 法 方 定 鑑 之 項 4 2 第 圍 。 範鹽 利銨 專季 請合 申 聚 如 一 • 為 7 質 5 物 合 ί } 聚基銨 該苄化 中烯氛 其乙基 ,C Τ 法聚三 方 ，基 定 } 苄 鑑銨 ί、 之化烯 項氣乙 7 基 C 5 甲聚 第三或 圍基、j 範苄 ί 利烯銨 專乙化 請 ί 氛 申聚基 如為甲 .鹽 二 8 銨基 5 季苄 季 合 Φ 聚 如為 • 鹽 3 较 5 季 第 圍 範 ''U 禾 聚 為 鹽 铵 合聚 百*1, 該 ) 中较 其化 , 氛 法基 方甲 定三 鑑基 之苄 項烯 4 乙 C'J ( 錢 化 氯 基 甲 二 基 ： ί卞 } 基玆 苄ft 烯 累 乙 基 :丁 三 基 苄 烯 乙 vt 聚 或 被解 可分 1 -括物 包 合 其化 , 垸 具 丁 工環 的雜 質氧 物二 1 -第 2 中 -品 1 樣光 一 發 測學 偵化 種的 一 解 • 裂 ο 素 6 酵 的 基 代 取 定 ： 安表 不弋 解式 裂 下 素 由 酵 ， 被 定 可 薄 其 上 及 致 以 十、 下 I到 溫 「--_ 室¾ 在 裂 .:1 光蓄 發 袭 會 结 時a {請先閲讀背面之注意事項再填寫本買) X 丨装. 訂. Jk-線. 嫌濟部t央標翠局員工消費含作让印«

   R.a ο 六、申請專利範圍 中 其 A7 B7 C7 D7 C 和 基 羥 素 鹵 > ·’ 為 氫簠 2 表為 R 代時 ， 別同基 分不氧 1 1 甲 X X 為 和和 i X X R 基 氧 垸 4 C (請先《讀背面之注意事項再瑱寫本頁)

   氯酸 甲磷 為 * 1 或 R 酸 中為 其素 -酵 具該 Η , ο 之基 苷項氧 糖 ο 苯 乳 6 代 半第取 或圍鹽 鹽範酸 酸利磷 磷專間一II一 為申為 Υ如 2 , . R 中 1 , 其 6 基 0 R 中 其 具Η 之 項 ο 6 第 園 範 利 專 請 电 如 2 6 'η 間 ο 1 釀 為苷 2 糖 S 乳 , 半 基為 荃la 苯 ί-ρ-人 取 ~ ¥ 0 IL 半 装- 訂. 丨線. 熳濟部中央標筚局R工消费合作社印轚 其 具Η 之 項 2 6 或 。 1 量 6 能 , 光 ο 0 6 偵 第供 圍置 範裝 利像 專影 請製 申複 如括 • 包 3 更 6 中 為 像 影 製 謨 中 其 具Η 之 項 3 6 第 圍 範 利 專 請 φ 〇 如片 . 底 4 相 6 照 211066 Α7 Β7 C7 D7六、申請專利範園 6 5 · —種偵測一樣品中核酸或其碎片的工具，其包括一 可披酵素裂解的化學發光1, 2 —二《雜環丁烷化合物， 分解時會發光，在室溫下以及其可被酵袤裂解不安定取代 基的鍵結被蓄意裂解之前大致上穩定，由下式代表： 〇—9 其中： X和X 1分別代表氪，鹵袤，羥基和C ^ 一 C ,烷氣 基，X和X 1不同時為氫； R i為甲氧基，R 2為 (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

   -装. 訂. -線. *濟部中央*準局8工消t合作钍印製

   和 和 荅¾ 糖该 乳寡 半 的 或 記 鹽漂 酸柔 0 0 一 被 為式 Y方 ， 價 中 共 其以 核 該 洪 薄 隆 \Λ 0 211066 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 酸-寡核酸探針進行雜交作用。 66. 如申諳專利範圍第65項之工具，其中Ri為甲氣 基，Rz為間磷酸鹽-取代苯氧基，該酵袤為酸或鹼性碟 酸酶。 67. 如申請專利範圔第65項之工具，其中Ri為甲氣 基，R 2為間/3 — D —半乳糖苷一取代苯氯基，該酵素為 半乳糖苷醏。 68. 如申請專利範圍第65, 66, 67項之工具，其 中更包括影像複裂装置供偵測該光能量， 6 9.如申請專利範圍第3 3項之工具，其中該影像復製 装置為照相底片：） 7 G . —種偵測一樣品中核酸或其碎S的工具，其包活一 可被酵素裂解的化學發光1, 2 -二氣雜環丁烷化合物， 分解時會發光，在室溫下以及其可被譁柔裂解不安定取代 基的鍵结波蓄意裂解之前大致上穩定，由下式代表： ^--------^------11---_{—線 <請先閲讀背面之注意事项再墣寫本頁) 嫌濟部t夹揉幂局員r一消费>咋达印#

   211066 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 中 其 X 和 X X 和 X 基 R 為 C 和 基 羥 素 鹵 ，; 為 氫氳 2 表為 R 代時 ， 別同基 分不氯 1 1 甲 氣 烷 4 C

   生 !<J Μ 物 ， 生 1 或該 If 将 物可 主到 和記结 ;11鍵 苷式價 搪方共 乳瀆被 半共素 或M白 鹽披卵 酸針徽 礎深鏈 1 蝨或 為核素 Y 募白 , 浦 0 中互； 其 一 物 2 二 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝. '上針 素深 酵酸 的核 置寡 能該 光到 射交 發雜 其片 使碎 而其 解或 分酸 物核 合該 化供 垸 ， 丁薄 環薄 雜隆 氧耐 7 基 氧踌 甲性 為鹼 i 或 R m 中為 其素 , 酵 具该 工 -之基 項氧 ο 笨 7 代 第取 圔 -範鹽 利酸 專磷 請間 申為 如 μ . R 訂. '線. 醑 酸 *濟部中央揉準局R工消费合作社印製 氧 為 甲 素 為酵 該 R , 中基 其氯 ,苯 里'!t Η 取 之 - 項苷 3 糖 「’ 乳 盖 半 1Iig D 利 | 專 点 請間 0 申為酶 如 2 苷 R 糖 0 _ ，乳 7 基半 請 * 如 3 ―Jf 像 影 活 包 更 中 其 具Η 之 項 2 7 、， 或量 1 能 7 光 , 該 ο 測 7 偵 第供 圍置 範装 利 製 專理 製 理 像 影 該 中 其 具Η 之 項 - 4 3 I - 7 第 圍 範 利 專 請 申 如 4 7 211066 A7 B7 C7 D7 申 、置 5 六装 7 括 包 其 具Η 的 片 碎 其 或 酸 核 中 品 樣ο 一 圍片 測磨偵 利相種 , 代 物取 合 定 ： 化安表 垸不代 丁解式 環裂下 雜素由 氯酵 ， 二被定 _ 可穩 2 其上 , 及致 1 以大 光下前 發溫之 學室解 化在裂 的 ，意 解光蓄 裂發被 素會結 酵時鍵 被解的 可分基

   R (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本I) -装. 訂. 中 其 C 和 基 羥 素 0 ，; 為 氫氬… 表 為 'R 代時 ， 別同基 分不氧 - 1 甲 X X 為 和和 1 X X R 基 氧 垸 + C -線. β濟部中*檫準屬W工消费合作社印S

   苷 糖 乳 半 或 鹽 酸1 為 Υ 中 其 211066 六、申請專利範園 一互補寡核酸探針被以 的抗體被共價鍵結到可 分解而使其發射光能量 酸或其碎Η雜交到該寡 76. 如申請專利範圍 基，R 2為間磷酸鹽一 酸醑。 77. 如申請專利範圍 基，R 2為間/3 — D -半乳糖苷酶。 78. 如申諸專利範圍 中更包括影潷漤製装置 79. 如申請專利範圍 素裂解的化學發光1， 會發光，在室溫下以及 结波蓄意訪-:¾ 經濟部中央镲準局Λ工消t合作社印焚 Α7 Β7 C7 _D7_ 共價方式標記抗原；一針對該抗原 將該1, 2 -二氣雜琿丁烷化合物 的酵素上；和一耐隆薄薄1供該核 核酸探針3 第7 5項之工具，其中R i為甲氣 取代苯氧基，該酵素為酸或鹼性磷 第75項之工具，其中Ri為甲氣 半乳塘苷一取代苯氣基，該酵素為 第75, 76或77項之工具，其 供湞測該光能置。 第78項之工具，其中該影像複製 装置為照相底爿： 80. —種偵潮一樣品中蛋白霣的工具，其包括一可被酵 2 _二氧雜環丁垸化合锪，分解時 其可波酵袤裂解不安定取代基的鍵 二；1 Ξ ^式丨戈表： Ri ---------------^--------裝------#----f -線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

   \b' 211066 A7 B7 C7 C7 D7 六、申請專利範圔 中 其 X Q it X X 和 X 基 R 為 C 和 基 羥 素 鹵 ,; 為 氫氫 Μ 表為R 代時 ， 別同基 分不氣 1 1 甲 氧 烷 .+ C (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

   々寸 和 可 nu ; 5 苷结 糖11 乳 1 半共 或披 鹽證 酸 抗 龚的 一 原 為抗 Y 該 . 對 中針 其 1 2 '裝. 訂- 上 素 酵 的 置 能 光 射 發 其 使结 而璉 解證 分抗 合 白 化蛋 烷供 丁薄 環薄 雜隆 氧 Μ 曙 耐 為 膜 '薄 中 其 Μ Η -之摸 項,1 ο 8 笔 / 圍 範或 利 摸 專;# If¾ 申遂 如 通 . 基 1 0 8 , .線. 熳濟部中央«準局員工漓费>作社印»|狄 氧碟 甲性 為 * I 或 R 酸 中 為 其素 - 酵 具該 Η . 之基 項氧 •- 苯 r〇it 1取a _ 範罾 利 Μ 專龚 0 間 丰 為 如 2 . c·^0 2 ，酶 3 基酸 R , 中 基 其氧 ’ 苯 具 弋 工 取 之 -項 }才 oS 8 乳 第 生 園 -範 「一 利 -專 J II笥 电 為 如 n • R 3 . 3 筌 氧 甲 為 為 0 酵 該 A7 B7 C7 D7 21:1066 六、申請專利範圍 半乳糖苷醑。 84. 如申請專利範圔第80, 8 1, 82或83項之工 具，其中更包括影像複製装置供偵測該光能量。 85. 如申請專利範圍第84項之工具，其中該影像後製 装置為照相底Η。 8 6. —種偵測一樣品中蛋白質的工具，其包括一可被酵 素裂解的化學發光1, 2 -二氣雜環丁烷化合物，分解時 會發光，在室溫下以及其可被酵素裂解不安定取代基的鍵 结被蓄意裂解之前大致上穩定，由下式代表： {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) X

   R 1 Η 2 .装. 訂. .線. 經濟部中央標準局具工消費合作让印S 其中： X和X 1分別代表Μ，鹵素，羥基和C i 基，X和X1不同時為氫； R i為甲氧基，R 2為 C + 院氣 1 3 - A7 六、申請專利範園 α

   乳糖苷；和 γ B7 C7 D7 设濟部t夹櫺準局Λ工消费合作社印$ 其中，Υ為一磷酸留或半 針對該蛋白質的第一抗謾 ，該第一抗體共價键结到 合物分解的酵素上。 87.如申諸專利範圍第 基，R 2為間磷酸鹽一取 酸酶 3 3 .如申諸專利範圔第 基，R 2為間- D —半 半乳糖苷酶。 8 _9 .如申請專利範圍第 或8 6項之工具，其中更 所增加待殊光能量高於無 9 0 .如申諳專利範園第 3 抱 S -¾ 血 Γη 2 Ξ S ： 3 1 .如申請專利範圍第 為一聚合季銨鹽3 9 2.如申請專利範圍第3 0項之工具，其中該聚合季续 鹽為聚合季銨鹽為聚（乙浠苄基三甲基氛化玆），聚：乙 烯苄基（苄基二甲基m化錢）;或聚：乙t希；苄基三丁基 ;和針對該第一抗體的第二抗鼸 可将該1, 2 -二氧雜環丁浣化 86項之工具，其中Ri為甲氧 代苯氧基，該酵袤為酸或鹼性碟 33項之工具，其中Ri為甲氧 乳糖苷-取代苯氧基，該酵衆為 6 0 , 6 5 . 7 0 , 7 5 , 3 0 包活一水溶性加強物霣，該物質 該物質参與的清況5 8 9項之工具，其中該水溶性加 3 9項之工具，其中該加強物質 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ----------{--------装-------玎---^ 4---- 2il〇66 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 氯化銨）}。 93. 如申請專利範圍第89項之工具，其中該加強物質 包括一正電荷聚合季铵鹽和螢光素，其能夠與隨著酵素催 化分解該1, 2_二氣雜環丁烷化合物而産生該1 /2 — 二氣雜環丁烷化合樹的負電荷産物形成三级錯合扨，藉此 在該負電菏産物與螢光素之間發生能量轉移而使得螢光素 發光。 94. 如申請專利範圔第93項之工具，其中該聚合季銨 鹽為聚合季銨鹽為聚（乙烯苄基三申基氛化銨），聚〔乙 烯苄基（苄基二甲基氰化銨）〕或聚〔乙烯C苄基三丁基 氨化玆；}。 9 5 . 一種偵測漾品中酵柔的方法，其笆括以下步驟： (a) 提供一可被酵柔裂解的化學發光1 , 2 -二氧雜環丁 垸化合物，分解時會發光，在室溫下以及其可被酵素裂解 不安定取代基的鍵结被蓄意裂解之前大致上穩定，由下式 代表Μ (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) -裝. 訂. 線. 嫌濟部中央襟筚局3工消费含泎认印$

   X1 Α7 Β7 C7 D7 六、申請專利範® C4*±· SB 4- /5c Si {請先閲讀背面之注意事項再填宵本頁) 其中： X和X 1分別代表氫，鹵素，羥基和C 1 基，Χ和X1不同時為氣； Ri為甲氯基，Rz為

   .装· 其中，Y為一碟酸鹽或半乳糖苷：和 訂. (b)將該1 , 2-二氣雜琿丁垸化合物與該含該酵袤的樣 品接觸；該酵素從該1, 2 —二氣雜環丁烷化合掬裂解該 經由酵素方式可予以裂解不安取代基以形成一鍵结到該1 ,2 -二氯雜璟丁垸化合物的負電苘取代基，該負電菏取 代基使該1 , 2 —二氯雜環丁垸化合物分解以形成一芭括 該螢光苯發色團基的發光物質；和 湞测該發光物質以示該瑟素存在。 9 S.如申請專利範圍第95項之工具，其中Ri為甲氯 基，Rz為間磷酸鹽一取代苯氯基，該酵袤為酸或鹼性碟 酸釀。 _3 7 .如申請專利範圍第9 5項之工具，其中R i為甲氧. 基，R c為間々一 D _半乳塘苷一取代苯氣基，該酵素為 Α7 Β7 C7 D7 211°66 六、申請專利範園 半乳糖苷酶。 98·如申誚專利範圔第55項之鑑定方法，其中該鑑定 包括用BDMQ和T BQ預處理一硝基纖維素薄膜。 9 9.如申請專利範圍第5 5項之鑑定方法，其中該鑑定 包括用BDMQ和TBQ預處理一PVDF薄膜。 (請先Μ讀背面之注$項再塡寫本頁) _裝· 訂· -線. 經濟部中央標準局員工消费合作社印裂 22 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）