TW206235B

TW206235B -

Info

Publication number: TW206235B
Application number: TW080109191A
Authority: TW
Inventors: Sushil G Devare; Joan Tyner
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1990-11-07
Filing date: 1991-11-22
Publication date: 1993-05-21
Also published as: DE69131046D1; WO1992008738A1; ES2132115T3; CA2095735A1; EP0556320A4; JP2002012600A; GR3030212T3; EP0556320A1; KR930702507A; DK0556320T3; CA2095735C; JP3242402B2; EP0556320B1; JP2002000267A; JP3292727B2; ATE178096T1; DE69131046T2; JPH06502076A; AU9077791A; JP3292728B2

Description

206235 Λ 6 Β 6 五、發明説明（1 ) 發明背景本發明大體上是有關可轉一地結合至C型肝炎病毒（ HCV)之抗醱，更特別地是有關一糸列新穎的融合瘤細胞株，其可分泌對HCV蛋白質C-10〇, 33C及 CORE (核心）之單株抗脹，以及使用這些單株抗饈之方法。自古代人們已知由於黄疸所造成的肝炎疾病。病毒性肝炎目前已知包括一組具有不同的病毒組織蛋白質結構及複製模式之病毒作用物，其經由不同的慼染途徑，造成具有不同程度肝傷害之肝炎。急性病毒性肝炎臨床上由已確知之病人症狀診斷，包括黃疸、肝屬痛及肝轉胺酶水平之提高，如天冬醯胺轉胺酶及丙胺酸轉胺酶。目前應血清學分析以進一步分辨A型及B型肝炎。非 A非B型肝炎（NANBH) —語首先用於1 975年，其中描述非由A型肝炎病毒或B型肝炎病毒所造成的輸血後肝炎。Fe i n s t one e t a 1 ·，New Engl· J· Med· 292 :4 5 4 - 4 5 7 (1 9 7 5)。NANBH之診斷主要是在以A型及B型肝炎存在之血清學分析為基礎上利用排除而得。NANBH應對約90%的輸血後肝炎負責。

Hoi 1inger et a 1· · in N.R· Rose et a 1· · eds· · Manu-a 1 of Clinical Immunology» American Society for M~ icrobiology， Washington， D.C.，5 5 8 — 5 7 2 ( 1 9 8 6)〇目前利用與已知肝炎病毒之一之基因體相似性，企圖本紙尺度通用中a困家棕準（CNS)甲4規格（210x297公垃） (請先閱讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 裝· 線- 經濟部屮央標準乃以工消费合作社卬(*.'14 3 - 206235 Λ 6 - 13 6 _ 五、發明説明（2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 來鑑定NANBH病毒已失敗，推知NANBH是有不同的基因體組織及結構。 Fowler et a 1 . , J. Med♦ Virol· 12 :205 — 213 (1983)，及 Weiner et al. • j- Med. Virol. 21 ： 239-247 (1 9 8 7) 。NANBH專一性抗體偵測分析法發展，受阻於與病毒相蘭抗原之鑑定困難。Wards et al.,美國專利第4, 8 7 0, 0 7 6 ； Wards et al., Proc. Natl. Acad. Sc i . 83 ' 6608—6612 (1986) ; Ohori et al. ,j. Med. Virol.12:161 - 178 (1983)；

Bradly et al.，Proc. Natl· Acad· Sc i » 84 : 6277—628 1 (1 987).; Akatsuka et al.， J. Med. Virol. 20:43 — 56 (1 9 8 6) 〇於 1 988 年 5 月，Chiron Corporation 與 Cente-r for Disease Control共同研究造成假想NANB作用物，C型肝炎病毒（HCV)之鑑定。M. Houghton等人將得自黑猩猩經感染血漿之NANB作用物選殖並表現於大腸桿菌。Cuo 等人，Science 244： 359-361 (1 9 8 9) ; Choo et al·，Science 2 4 4 : 3 6 2 經濟部屮央檔準·^:^工消费合作社卬驭 —364 (1989)。鑑定出HCV中之CDNA序列，其编碼的抗原可與臨床上診斷為NANBH的大部份病人，其所有之抗體免疫地反應。依據可應用之資料及 HCV之分子結構，病毒之遣傳構造包括單股直線型 RNA (正股）分子量約9. 5kb,並具有一個連續的轉譯開放讀譯架構。J . A · Cu t hbe r t，Amer.J. Med · Sc i · 本紙張尺度逍用中B困家標準（CNS)甲4規格（210x297公垃） -4 - 206235 五、發明説明（3 ) 299:346 — 355 (1990)。其係一種小的有包膜病赛，類似黃病毒（FUviviruses)。研究者企圖藉感染個體肝細胞中之超結構變化來鑑定NAN B作用物。 H. Gupta, Liver 8： 111-115 (1988)； D.W. Bradly J. Virol . Methods 10 ： 307-319 (1985)。肝細胞中相似的超結構變化，以及PCR 擴大的HCV RNA序列，己於NANBH病人以及被感染性HCV血漿感染（實驗性）之黑猩猩中測及。T. Snimizu e t a 1· · Proc. Natl. Acad. Sc i· 8 T : 6441-6444(1990)。重要的血清學證據已發現，將_HCV涉及為輸血後 N A N B Η 之病因物。H. Alter et al . , N. Eng. J. M-ed_. 321 ： 1494-1500 (1989) ； Estab- en et a 1· . The Lancet Aug-5 : 294 — 296 ( 1 9 8 9) ; C. Van Der Poe 1 et a 1· . The Lancet Aug.5 ： 2 9 7 - 2 9 8 (1 9 8 9) ;G. Sbol 1 i ,

Med. Virol. 30 ： 230-232 (1 9 9 0) ;M. 經濟部屮央標準：工消贽合作杜.4,51 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Makris et al., The Lancet 335:1117— 1119 (1990)。雖然HCV抗體之偵測可消除供血糸統中70—80%經NANBH感染之血液，抗體顯然地可於疾病之慢性階段中被容易地測及，而自急性 NANBH階段則只有6 0%檢品是HCV抗體陽性。H. Alter et al·. New Eng· J· Med.3 2 1 : 1 994— 1 5 0 0 ( 1 9 8 9 )。曝出H C V及抗體偵測間間隔之本紙張尺度逍用中因H家標準(CNS)甲4規格（210x297公:J2) -5 - 206235 Λ 6 136 經濟部屮央榀準>!·;π工消赀合作社卬¾ 五、發明説明（4 ) 延長，以及對各種結構及非結構蛋白質免疫反應之槪括缺乏適當的資訊，使得潛伏期病人的感染階段及NANBH 感染中之抗體陰性期發生問題。因此，有必要發展一套分析糸統以鑑定急性感染及可能存在之病毒血症。需要工具以分辨急性和持鑲性感染，且限定NANBH感染之預後過程以發展預防策略。發明要點本發明提列一列具高度專一性及新穎的單株抗體，其可用來偵測C型肝炎病毒蛋白質。單株抗臁可特異地結合至C — 100，33C或核心蛋白_質，且不會顯著地分別結合至33C及核心，C 一 100及核心及C 一 100及 33C。産生這些單株抗髏之融合瘤如下：H8 1 C 1 7 (ATCC貯置號HB10588,産生單株抗體 H81C17), H35C54 (ATCC貯置號HB 10592,産生單株抗體H35C54)， H28C10 (ATCC貯置號HB10587,産生單株抗體H28C10) ， H4C20 (ATCC貯置號 HB10593,産生單株抗體H4C20)， H11C130 (ATCC 貯置號 HB10589，産生單株抗體H11C130) ， H1C46 (ATCC貯置號HB10594,産生單株抗體H1C46) ， 13— 395 — 157 (ATCC貯置號10608,産生單株抗體13-975—157),14—153-234 ( 本紙55：尺度边用中國困家標準（CNS) T4規格（210x297公及) (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁} 裝. 訂- 線. -6 - 206235 Λ 6 Β6 ，央準χ;π工消赀合作杜.41¾ 五、發明説明（5 ) ATCC貯置號1 0604,産生單株抗體14 一 153 -234) , 14— 1350 - 210 (ATCC 貯置號 ?1810602,産生單株抗體14一1350 — 210 ),6 — 295 — 534(ATCC 貯置號 HB1 0607 ,分泌單株抗體6—296—534)及6—914— 518 (ATCC貯置號HB10600,分泌單株抗塍 6 — 9 1 4 一 5 1 8)。這些單株抗髏之專一性可有益地分別研究，以及於NANBH診斷及評估之預後乃診斷應用。於較佳之分析模式中，可含有HCV抗原之受試樣品與結合多株或單株抗一 H C V抗體_或其Η段之固相接觸，以形成混合物。此混合物在足以形在抗體/抗原複合物之時間及條件下培育。如此形成之複合物再與指示試劑接觸，其中包括與HCV抗原具專一性之單株或多株抗體或其 Μ段，並粘接産訊化合物以形成一個第二混合物。此第二混合物在足以形成抗體/抗原/抗體複合物之時間及條件下反應。H CV抗原之存在如所産生可偵測訊號之測及而決定。受試樣品中HCV存在量，及捕獲在固相上之 HCV抗原量，與所産生之訊號量成比例。此外，將含有單株或多株抗體或其片段，而與HCV 具專一性以及産訊化合物之指示試劑加至塗覆在固相上之多株或單株抗-HCV抗髏或其Η段，加上受試樣品後形成混合物。混合物在足以形成抗體/抗原/抗體複合物之時間及條件下培育。受試樣品中HCV存在及含量，以及 (請先閲請背面之注意事項再填'寫本頁) 裝. 訂- 線. 本紙尺度边用中國國家棕準(CNS)甲4規格(210x297公垃） -7 經濟部屮央標準劝^工消痄合作社卬|*'|4 20623b Λ6_；__ 五、發明説明（6 ) 捕獲在固相上之HCV抗原量，可由可偵测訊號之偵測而決定。受試樣品中HCV之存在量與産生之訊號董成bb例〇於另一分析模式上，可應用本發明一個或一個以上組合之單株抗體為競爭探針，以偵測HCV抗原之抗醱。例如，HCV核心抗原，不論單獨或呈組合型式均可塗覆在固相上。疑似含有HCV核心抗原之抗鼸的受試樣品再與指示試剤培育，指示試劑包括産訊化合物及本發明之單株抗體，經充份時間及條件下共置，可形成受試樣品與指示試劑與固相，或指示試劑對固相之抗髏/抗原後合物。單株抗體對固相結合之減少可定量地_偵測。訊號與證實為陰性NANBH受試樣品所産生之訊號比較下有可測知之減少顯示，受試樣品中存在有抗一HCV核心抗釅。又在另一分析楔式中，受試樣品與其中粘附有C型肝炎病毒蛋白質之固相，以及包括與C型肝炎病毒具持異性之單株抗體或其片段，並拈附有産訊化合物之指示試劑接觸，以形成一種混合物。混合物於足以形成抗體/抗原複合物之時間及條件下共置。受試樣品中抗C型肝炎病毒之存在可由可偵測之産訊化合物測及而決定，訊號並與來自已知陰性樣品所産生之可偵測訊號比較。受試樣品之訊號與已知陰性樣品訊號比較，其中訊號可偵測之減少可顯示存在有抗一HCV抗體。也可進行溶液中無抗原等進行抗一HCV抗體偵測之競爭性分析法。組織樣品中C型肝炎病毒存在之偵測，可將組織樣品 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 線. 本紙5fc尺度逍用中Η Η家標準（CNS)甲4規格（210x29·/公垃) -8 - Λ 6 136 206235 五、發明説明（7 ) 與指示試劑接觸，以形成混合物；指示試劑包括産訊化合物粘附至選自下列之單株抗體，包括：抗HCV C 1 00抗體，或其片段，.單株抗一 HCV 33C抗鼸或其片段，及抗一 HCV核心抗髏或其片段。此混合物在足以形成抗體/抗原複合物之時間及條件下共置。组錐樣品中C型肝炎病毒之存在，可由産訊之測及而決定。也提出供本發明單株抗體使用之套組。附麗簡要説明圖1A是重組髖蛋白質於HCV基因饈上之位置，其可充作免疫原以産生本發明之融合_瘤，以及亞片段，用於定出本發明單株抗體之表位輿圖。圖1B為HCV基因醱輿圖，代表非結構（NS)基因及結構基因，核心（C)及包膜（E)。圖2A為西方墨點分析之相H,説明單株抗齷 Η 1 1 C 1 30之特異結合及表位輿圖)其中第1列是 PHCV29 (aa 1192-1457),第2列是 3 3 C a * C K S (aa 1 192-1331)，第 3 列是33cb*CKS (aa 1330—1457)，第 4 列是 33C (λρί) (aa 1 192-1457 )及第5列C K S ; 圖2B是西方墨點分析之柑Η,說明單株抗 Η 1 C46之特異結合及表位輿圖其中第1列是 PHCV29 (aa 1192 — 1457),第 2 列是本紙张尺度逍用中® S家樣準(CNS)甲4規格（210x297公垃) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 綠· 經濟部屮央拉準乃Π工消评合作社卬54 20623b 經濟部屮央標準沿：：：：工消处合作社.5-31 Λ 6 Β 6 五、發明説明（8 ) 3 3 C a · C K S ( a a 1 192-1331)，第 3 列是 33cb，CKS ( a a 1 3 3 0 - 1 4 5 7), 第4列是 33C (ApL) ( a a 1 192-1457 )且第5列C K S ; 圖2C是西方墨點分析之相片，説明單株抗龌 H81C17之特異結其中第1列是PHCV34 ( a a 1 — 150)，第 2 列是 HCV C O R E ( λ p L )且第3列是CKS; 圔2D是西方墨點分析之相片，說明單株抗體 H35C54之特異結其中第1列是PHCV34 ( a a 1 _ 1 5 0 ),第4 列是 HCV C Ο R E ( λ p L )且第3列是CKS; 圔2E是西方墨點分析之相片，說明單株抗饈 H28C1 10之特異結合及表輿圖> 其中第1列是C — 1 0 0 B · C K S ( a a 1 6 7 6 - 1 7 9 0)，第2 列是C-10〇C*CKS ( a a 1789-1863 ),第3列是C— 100D.CKS (aa 1861 — 1931),第4列是C-100 (XpL, aa 1676 — 1790),且第 5 列是CKS; 圖2F是西方墨點分析之相K,說明單株抗體 H4C20之特異結合及表位輿其中第1列是C-1 0 0 Β ♦ C K S ( a a 1676-1790)，第2 列是C—100C.CKS (aa 1789-1863 ),第 3 列是C-10 0D.CKS (aa 18 6 1- 本紙張尺度边用中SB家捣準（CNS)甲4規格（210x297公及) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- -10 - 20G235 ΛΒ66 五、發明説明（9 ) 1931)，第4 列是 C— 100 (ApL, a a 1676 — 1790),且第 5列是CKS。圖3是以單株抗髏H28C1 10之重叠的六元肽（ a a 1694-1735)進行之PEPSCAN分析概括，用以説明由單株抗glH2 8C 1 1 0所確認之HCV基因體之表位特異性及胺基酸序列。圖4說明於應用單株抗體H81C17的本發明抗原捕獨分析中，抗一HCV兔子及人類多株捕獲抗體於偵測 HCV核心蛋白質之效力。圖5為由抗原捕獲EIA所測試之陰性血淸及血漿族群之分佈，其中頻率對作圖圖6至17為西方墨點相片，顯示本發明單株抗體之反應性，其中第1至3列包括拮抗HCV 33C蛋白質單株抗髏 (第 1 列 6 — 296 — 534,第 2列 6 — 914一 518,及第3列 6-1070—110); 、第4至6列包括拮抗H C V核心之單株抗體（第4列 13 — 975 -157，第 6 列 14 一 153 — 234 ，及第6列 14-1350—210); 第7及8列含拮抗假想的HCV ENV區之單株抗髏（第7列 16 — 407 — 209及第8列 16 — 8 0 3 - 1 7 4)；第9一10列含拮抗HCV C-100之單株抗體 (第 9 列 25 — 1518— 105，第 10 列 28 — 本紙it尺度边用中a Η家揉準(CNS)甲4規格（210X297公及） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線. -11 - Λ 6 Β6 206235 五、發明説明（1C) 7 3 5 - 3 5 5)；第1 1列含拮抗CKS之單株抗體（第1 1列之29 - 1 2 1 - 2 3 6)；第1 2列含正常的老鼠血清對照組；及第1 3列含抗體稀釋劑之負對照組。圖6為這些單株抗體對C K S —核心進行之電吸漬；圖7為這些單株抗體對λ P L —核心進行之電吸漬；圓8為這些單株抗體對λ P L_ 3 3C —核心進行之電吸漬；圖9為這些單株抗饉對C K S — 3 3 C進行之電吸漬圖10為這些單株抗體對CKS—33C—BCD進行之電吸漬；圖11為這些單株抗體對CKS-BCD進行之電吸漬； \ 圖1 2為這些單株抗體對CKS-B進行之電吸漬；圖13為這些單株抗體對CKS—E進行之電吸漬；圖1 4為這些單株抗體對CK S進行之電吸漬；圖15為這些單株抗髏對SOD-100進行之電吸漬；圖16為這些單株抗髏對CKS — A'BCD進行之電吸漬；及圖17為這些單株抗體對CKS— A "BCD進行之電吸漬。本紙5良尺度边用中國國家標準(CNS)甲4規格（210x297公及) (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 裝· 線< 經濟部屮央標準XJH工消作合作杜卬11 -12 - 206235 五、發明説明（11) 發明$詳細説明本發明提出對HCV蛋白質C—100, 33C及核心（CORE)之新穎的單株抗體，使用單株抗體之方法 ,及含這些單株抗體之套組。本發明之單株抗體，可應用於各種分析糸統中以決定是否有任何HCV蛋白質C_100, 33C或核心（ CORE),或其組合之存在。也可使用所提出單株抗醑之片段。例如，第一分析楔式中，已塗覆在固相上之多株單株抗一HCV—100抗一33C或抗一CORE抗龌或其Η段，或其組合，與其中可能含有任一或所有H C V 蛋白質或其組合之受試樣品接觸，以形成混合物。此混合物於定以形成抗髏/抗原複合物之時間及條件下共置。之後指示試劑與抗體/抗原複合物接觸，以形成第二混合物。此指示試劑包括單株或多株抗體，或其Η段，其中特異地結合HCV C—100蛋白質、HCV 33C蛋白質或CORE蛋白質，或這些抗髏之組合，其中並粘附有産訊化合物。第二混合物再以足以形成抗體/抗原/抗體複合物之時間及條件下共置。受試樣品中HCV蛋白質之存在及捕獲於固相（若有的話），則可由産訊化合物産生之可偵測訊號來決定。存在於受試樣品中之HCV蛋白質量，與産生之訊號成比率。此外，多株或單株抗一HCV C—100,抗一 HCV 33C或抗一HCV CORE抗體或其Η段，本紙》：尺/1邮中8 81家料獅）甲很格(21(^挪公及) ----- -13 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線. 經濟部屮央標準而：^工消^合作社卬^ 20623S λ6 _____Β6___ 五、發明説明（1¾ 或這些抗體之組合（其結合至固相），受試樣品及指示試剤（含有單株或多株抗體或其片段，其特異地結合至 HCV C-100, HCV C33,或 HCV VORE蛋白質，或這些抗體之組合，且其中粘附産訊化合物）以上接觸可形成混合物。此混合物在足以形成抗饈 /抗原/抗髏複合物之時間及條件下共置。受試搛品中 HCV蛋白質之存在（若有的話），並捕獲在固相上，可由産訊化合物産生之可偵測訊號而決定。受試樣品中 H C V蛋白質之存在量與産生之訊號成比例。於另一不同的分析型式中，可應用本發明一或一個以上單株抗體之組合為競爭性探針，_以偵測HCV蛋白質C —100, 33C或CORE之抗體。例如，HCV蛋白質不論是單獨地或組合型式，可塗覆在固相上。再將疑似含有C型肝炎病毒之抗體之受試樣品與含有産訊化合物之指示試劑，及本發明之單株抗髏共置，在充份的時間及條件下形成受試樣品與指示試劑至固相，或指示試劑至固相之抗體/抗原複合物。單株抗體對固相結合之減少可予以定量地偵測。訊號與經證實為陰性NANBH受試樣品所産生之訊號比較，其中可偵測之減少顯示受試樣品中有抗一HCV抗體之存在。又在另一偵測方法中，可應用本發明每一單株抗體，以偵測經固定組繊切Η中之HCV抗原，以及以免疫組織化學分析之經固定細胞。此外，這些單株抗髖可結合至類似CNBr* —活化之 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝* 訂. 線. 木紙尺度逍用中國國家樣準(CNS)甲4規格（210x25)7公犮) -14 - IL06235 Λ 6 Β6 經濟部屮央標準沿：=:工消仲合作杜印51 五、發明説明（1¾ Sepharose之基質上，且用於特異HCV蛋白質（來自細胞培養），或生物組織如血液及肝之親和力純化。本發明的單株抗體可用於産生供治療用途，或其他類似應用之嵌合型抗體。單株抗讎或其片段可値別提供，以偵測HCV C— 10 0, H C V 33C或HCV CORE 蛋白質。此處提供之單株抗餹（及其片段）之組合，也可一起充作抗一 HCV蛋白質抗髏混合物或a摻合物〃之組份，各自有不同的結合特異性。因此，此摻合物也可包括本發明之單株抗體，直接相對於HCV基因體之不同的抗原決定基，並加上相對於假想的HCV EN_V區域之單株抗鳢。可用於分析模式中之多株抗體或其片段，應特異地結合至HCV C—100蛋白質、HCV 33C蛋白質或HCV CORE蛋白質。所使用之多株抗體較好是源自哺乳動物；也可使用人類、山羊、兔子或羊抗一 HCV 多株抗體。更好，是兔子多株抗一HCV抗體。用於分析中之多株抗體可單獨使用，或呈多株抗體之摻合物使用。因為用於分析模式中之摻合物含有具不同HCV特異性之單株抗體或多株抗體，其應可用於HCV感染症之診斷、評估及預後，以及用於研究HCV蛋白質分化及特異性。可以此處所述之本發明方法所測試之樣品，包括人類及動物之髖液，如全血、血清、血漿、腦脊《液、尿液、生物性流體如細胞培養上清液，固定之組織檢品及固定的細胞檢品。固體支持物係技藝中已知的，且包括反應淺盤本紙56•尺度逍用中a國家樣準(CNS)甲4規格(210x297公及） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· .盯，線. -15 - Λ 6 »3 6 206235 五、發明説明（1屮孔洞之壁，試管，聚苯乙烯珠粒，磁粒，硝化纖長條，膜，撤粒子如乳膠粒子，及其他。指示試劑包括産訊化合物（標誌），其可産生可為外在方法测及之訊號，並共軛至（粘附）HCV之待異結合成員。”特異結合成員〃在此表示特異结合對之一成員。即，二値不同的分子其中分子之一經由化學或物理方法特異地結合至第二分子。除了可為HCV特異結合對之抗髖成員，本指示試剤也可為任何特異結合對之成員，包括半亢原一抗半抗原条統，如生物素或抗生物素，抗生物素蛋白或生物素，碩水化合物或外源凝集素，互補的核苷酸序列，效應細胞或受體分子，酵素輔_因子及酵素，酵素抑制劑或酵素，及其他。免疫反應性特異結合成員可為抗體，抗原，或抗體/抗原複合物，其可結合至HCV如於三明治式分析，或至捕獲試劑如於競爭性分析，或至輔助的特異結合成員，如於間接分析中。所欲包括的各種産訊化合物（標誌）包括色原，催化劑如酵素，發光化合物如螢光素及若丹明（rhodamine)、化學發光化合物、放射活性元素，及直接可視之標誌。酵素之實例包括：鹼性磷酸酶，薛葉過氣化酶，点一半乳糖苷酶等。特殊標誌之選擇並不駸苛，但是本身或聯合一種以上附加物質可以産生訊號。企望分析中應用之試劑可呈套組型式提供，具有一種以上的容器如小瓶或瓶子，而每一容器可含値別的試劑，如單株抗體，或單株抗體之摻和物。本紙張尺度边用中B S家櫺準(CNS)甲4規格（210x297公及） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. -線· 經濟部屮央榀準而“工消作合作杜.3-¾ 16 ~ Λ 6 13 6 ^06235 五、發明説明（1马以下實例說明本發明於C型肝炎病毒血淸診斷上之優點及利用性，係描述這些單株抗塍用於發展、鑑定特性、定表位輿圖及臨床利用上之方法。單株抗體用於發展之方法依循技蕤中之已知步驟，且詳述於KohleΓandMlste-in, Nature 256:494) 1975),且總嫌於 J. G.R. Hurrel， ed.， Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications· CRC Press > Inc·» Boco Ra t on，FL ( 1 9 8 2 )。另一依據 Koh 1 er and Μ 1 s t e-i n 方法之單株抗膜〇SgL.T.Mimmsetal..Virol-〇gy 176:604-619 (1990);其在此列為參考。這些實例用於說明而非限制-本發明之精義及範圍。實例1一8說明細胞株81C17, H35C54， H28C110, H4C20，H11C130 及 Η 1 C46之産製及用法。實例9 一 1 3說明細胞株1 3 -975-257, 14-153-234 及 14-1350—21◦之産製及用法。實例14一17説明細胞株6-296 — 534，16 — 914-518及β- ίΟ? ◦— 110之産製及用法。實例1 老鼠免疮捺種由HCV序列编碼之大腸桿菌衍生重組體抗原，命名為 PHCV23 (HCV C - 1 0 0 , a a 16 7? -1931) , PHCV29 (HCV 3 3 C , a a k紙張尺度通用中a a家樣準（CNS)甲4規格（210x297公;li) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝< 綠. 經濟部十央榀準·-工消灼合作社卬51 -17 Λ 6 Β6 206235

五、發明説明（1Q (請先閱讀背面之注意事喷再填寫本頁) 1192-1457)及 PHCV34 (HCV-CORE, a a 1 一 150)充作免疫原分別用於産製與HCV C—100, 33C及CORE具特異性之鼠類單株抗髏。這些重組體蛋白質關於合成，選殖及表現之詳細資訊掲示於美國專利案第07/572, 822號，其享有共同擁有權，且列為本案參考。這些蛋白質經精g 者已知之蛋白質純化方法純化，可加上適當的佐劑用於免疫接種。圖1A示出重組髏HCV蛋白質之位置及其在基因體上之亞片段。以dHCV23免疮接種 . 經濟部屮央21準沿Π工消奸合作杜卬5i 第1天，BALB/c老鼠以腹膜内（i p)接受 1 5撤克經純化PHCV23/200撖升Freund | s完金佐劑之注射。第二次免疫接種於14天後，以15微克 PHCV23 /不完全Freund ’ s佐劑進行。第2 1天採血，並以酵素鍵結之免疫分析（E IA)及西方墨點分析評估對PHCV之免疫反應。令老鼠休息至少8週後才進行融合。以dHCV29免疮接種第1天，BALB/c老鼠以i. p.接受15撤克經純化的PHCV 2 9 / 1 0 0撤升Freund's完全佐劑之注射。於14天及28天後以15微克PHCV23/ 不完全Freund’s佐劑中進行接下來的免疫接種。第2 1 各紙張尺度通用中BS家標準(CNS)甲4規格(210x297公及） -18 Λ 6 Β 6 206235 五、發明説明（17) 天採血，並如上述評估對PHCV23之免疫反應。 P4r>HCV34免疮培箱以類似P HCV2 9免疫接種之程序免疫BABL/ C 老鼠，使用 R I Β I 佐劑条統（RIBI Immunochem. Research， Hamilfon. Montana)。於第 1 天，它鼠接受 1 5 撤克之經純化PHCV34,其中依廠商指示於缓衝乳液中製備各15撤克的海藻糖徽菌酸鹽（TDM)及草分枝桿菌（M. phlei)。接下來於第14、28及42天時進行免疫接種。於第21及49採血，並如下文所述地評估免疫反應。 - 酵袤一嫌結之狰疫分析（E IA) 對免疫抗原之免疫反應以徹滴定EIA及西方墨點分析評估。微滴定盤孔洞塗覆以1〇〇微升經純化抗原/ 0. 1M碩酸氳鹽缓衝溶液，PH9. 5。經以璘酸鹽緩衝食鹽水（PBS)(其中含0· 0 1%硫酸十二酯鈉（ SDS)及 0· 0 5% Tween-2〇® (可購自 Biorad

Laboratories，Richmond，CA))洗條後，自由態的位置再塗覆以1%BSA/硪酸氫鹽缓衝溶液，pH9. 5。於最後一次洗滌後，盤貯於4t：下。來自天然或經免疫老鼠之血清連缠稀釋於100撤升之稀釋缓衝液中，其中含 20mM磷酸鈉，pH7. 4,0.15M NaCl、 20%正常山羊血清、10%脛牛血清15mM 本紙56：尺度逍用中a a家標準(CNS)甲4規格(2)0X297公及) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 經濟部屮央榀準·^ΓΠ工消价合作社卬5i _ 19 _ 206235 Λ 6 Β 6 五、發明説明（1均 EDTA, 10mM EGTA, 50mM Tris, 0.2% Tween — 20®,以《氮化鈉為保藏剤（pH 6. 8)。經稀釋之血清與抗原反應於37t：下3小時。培養盤洗滌，加入1〇〇撤升經適當稀釋之山羊抗一老鼠 IgG (重（H)及輕（L)鏈）、璋葉過氣化酶（ HR P 0)—共扼之抗體（Jackson Inmunochemicals， West Grove, PA)。盤在37t：下培育2小時。經最後一次洗滌後，加入1〇〇微升的鄰位一苯二胺：2HC1 ( OPD)顔色試劑。反應於室溫下進行10—30分，再加1毫升，NH2S〇4停止之。記錄於492/600毫微米波長下之吸光度，發現其與結_合至値別抗原之特異抗體量成比例。而方墨點分析約300微克的經純化rHVC蛋白質，在95Ϊ：以 SDS及2—镟基乙醇處理，再於12%聚丙烯醛胺一 SDS 凝朦上電泳（Laemmli et al.，Nature 227 : 680—685 (1970))。蛋白質由凝膠轉移至硝化纖維上歴1夜，係以l〇〇mamp電泳，或1— 2小時，l.〇amp,於含有25mM Tris(參羥甲基胺基甲烷），192mM甘胺酸，及2. 0%甲醇， PH8. 3之檫準轉移緩衝液中進行（Towbin et al · · Proc. Nat 1 . Acad · Sc i. 73 :4350-4354〔 1 979〕）。蛋白質轉移及以5%乾失奶/PBS阻斷本紙5k尺度通用中國a家標準(CNS)甲4規格(210X297公澄) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 線. -20 - 206235 Λ 6 06 經濟部屮央標準.-?：：：:工消仲合作杜卬31 五、發明説明（1¾ 硝化纗維後，硝化纖維切成長條（各自含約5微克的重組蛋白質），再用來決定抗一 HCV抗體於受試血清中之存在（或其他樣品）。反應混合物包括硝化纖維長條，與適當量的受試樣品共置於2· 0毫升之缓衝液中（20mM Tris.lmM E D T A , Ο . 2 Μ Ν a C 1 , Ο . 3 96 Triton X— 1 〇〇 ®及2毫克/¾升牛血淸白蛋白（BSA) , pH7. 5, 5%大腸桿菌溶囍産物及 3%CKS溶薗産物）4Ό下一夜。長條以經缓衝去污劑洗滌（10mM磷酸鹽缓衝食鹽水（PBS) ρΗ7. 5 ，含 0. 1%SDS 及 0· 5% TritonX-100®), 之後加入共扼至HRPO之抗老鼠.1 gG抗體。長條在室溫下共置1〜2小時，之後以經缓衝去污劑洗滌。最後，結合至蛋白質之抗體加入新鮮製備之HRP顔色試劑使具像化（Biorad Lab. Richmond, CA) ( 1 2 0 毫克溶於 4 ◦毫升冰冷之甲醇，再稀釋至200毫升Tr i s緩衝食鹽水，pH7. 8,含120橄升30%過氣化氫）。此分析證明相對於個別蛋白質之抗體的存在，此中老鼠已被免疫。奮例2 細胞經證明特異的抗一HCV抗體以合理的效價存在於經免疫老鼠之血清中，於抗原融合前之追加免疫前至少8週令老鼠休息。之後將約40微克各別經純化之重組體 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝· 訂線· 本紙張尺度通用中a Η家猱準(CNS)甲4規格(210x297公茇） -21 - 206235 經濟部中央榀準工消费合作社卬3i Λ 6 136__ 五、發明説明（20) HCV蛋白質，由尾靜脈注射進行融合前之抗原追加。3 天後殺死老鼠，將其含抗一HCV抗體一産製細胞之脾臓分裂成單一細胞。這些單一細胞懸液以0. 83% N H 4C 1 處理以除去红血球，懸液再以10:1比率 CSP2/0 :脾臓細胞）與SP2/0細胞混合。經固定的細胞離心，以無血清的培養基洗一次，再次離心。以聚乙二醇（PEG)來成免疫供者脾細胞與骨《瘤細胞株 SP2/0 (HPRT 陰性）之融合體。KohleΓandMi-1 s t e i n . Nature 256:494 (1975) » 總覽見 J.G.R. Hur re 1 . ed . . Monoclonal H vb r i doma ? Techn i q-ues and Applications. CRC Pres.s > Inc·，Boco Raton ,FL(1 982)。簡言之，脾與SP2/0細胞之融合係將團塊與40%PEG (ATTC,MW 1300-1 600)共曝於無血清之Iscoe's經修飾Dulbecco’s Medium (IMDM)中歴2分鐘。PEG及細胞懸液加 20毫升無血清IMDM,以5分鐘D間缓慢稀釋，之後以離心收集細胞。上清液傾析，並更換以30毫升含20 %胚牛血清(F B S ) (Hyclone Labora tore i s . Logan . Utah)及HAT (次黃嘌昤，胺基碟昤及胸《)之IMD I培養基，以選出融合瘤。也加來自非免疫BALB/c 老鼠之脾細胞充作供給層。細胞以〇.1毫升/孔洞塗佈於3個9 6孔洞之組織培養盤。3天後對每一孔洞加入額外的0. 1毫升HAT培養基。之後以一週之間隔，將一半的培養基更換以含2096FBS之IMDM，其中含 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線- 本紙5k尺度逍用中國S家橒準(CNS)甲4規格(210x297公垃) -22 - ___06_206235 Λ 6 經濟部十央標準·-?以工消设合作社卬¾ 五、發明説明（21) HT (次黃嘌昤及胸苷），且令融合瘤生長7—14天。頃發現，融合體含有製作HCV抗饉與SP 2/0細胞融合之脾細胞。簡言之，由fusogen促進之脾細胞與 SP2/0細胞膜之融合，其可形成含有二種細胞核之異核體。最後，不相似的核融合産生可同時有弱分裂之單一核。一旦融合之細胞分裂，融合體藉喪失各自核中之染色體而穩定。經融合的細胞以毎孔洞1 0 5〜1 〇6個細胞塗佈在多重之96孔洞盤中。由SP2/0:脾細胞融合産生之融合細；胞，可於UAT培養基中培養而選擇性增殖。所有未使用之SP2/◦或SP2/0:SP2/0融合細胞以胺甲碟昤避免其生長，且-未融合之脾細胞或脾：脾融合細胞死於培養基中。只有SP2/0:脾細胞融合體可於HAT選擇培養基中生長。實例3 蜇抶抗髏>篩菝及蓰91 於10〜14天，自融合瘤細胞生長之孔同中取出培養液，再如下筛選單特異抗體之存在。毎一値融合瘤培養流體於塗覆有免疫原之培養盤，以及塗覆有CKS蛋白質之培養盤上（用於HCV蛋白質之融合配對）以實例1所述之EIA方法測試。融合瘤培養液與免疫原；即HCV 蛋白質特異地反應，而非CKS融合配對，並選出以用西方墨點分析進一步證實。E I A陽性之融合瘤培養液，測試其對個別HCV蛋白質以及CKS之反應性，採用如實本紙尺度逍用中a a家標準(CNS)甲4規格(210x297公垃) (請先閱讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 裝· 訂- 線. -23 - 經濟部屮央櫺準，-5::3:工消贽合作杜卬¾ 206235 Λ 6 ____Β6__ 五、發明説明（22) 例1所述之西方墨點分析。以ΕIΑ及西方墨點法均鑑定出可與HCV蛋白質特異反應之融合瘤，而非與CKS蛋白質，且以有限稀釋方法選出以進一步選殖，利用J.W. Goding, Monoclonal Antibodies〗 Principles and Practices» Academic Pres s · New York ( 1 9 8 3 )所列之準則。經選殖樣品之培養物上清液再以Ε I A測試，採用如實例1所述之免疫原及CKS蛋白質，以證實對HCV 蛋白質序列之單特異反應性。選出對重點所在之蛋白質有最強反應性之純条，以擴大並進一步分析。實例4 以膀水方法据大抗髂産銮為了獲得較大量的單株抗體，10〜20百萬欲求融合瘤細胞株之經選殖細胞，接種至先前已用0. 5毫升 Pristane(2，6, 10, 14-四甲基十五硪烷）i.p. 處理之BALB/c老鼠，採用J.G.R. Hurrell,等人， Monoclonal Hybridoma Ant i bod i es· Techniques and A-pplicat ion. CRC Press , Boca Raton » FL(1 9 8 2) 〇所示之方法。Pristane之處理可加強老鼠骨發瘤融合體在老鼠腹膜中之生長，且所形成之腹水液富含由融合細胞分泌之單株抗體。於適當腹水液（約7天）形成後，殺死老鼠，自腹膜中抽出腹水液，以離心使澄明化再貯於一 2 0 T：下。來自腹水液之單株抗體以蛋白質-A Sepharose 純化（依據J.G.R· Hurrel等人，上文）。此處所述的所本紙張尺度近用中因B家樣準(CNS)甲4規格（210x297公;¢) (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 裝· 訂- 線. -24 - 經濟部屮央標準·工消设合作社卬5i 206235 Λ 6 _；__13 6__ 五、發明説明（22ξ) 有鑑定步驟，可以培養物上清液、腹水液、或蛋白質一A 純化之I g G進行。實例5

蜇抶抗鵲之鑑宙 E I A 以實例1所述之酵素一鍵結的免疫分析來決定每一單株抗體之待異性。簡言之，將經澄明化之腹水或以蛋白質 —A純化之I gG在微滴定盤中於連缠稀釋液中反應，盤中塗覆有a)免疫原（即PHCV23,或PHCV39 或PHCV34) , b) CKS蛋-白質（用於三種免疫原選殖及配對之融合配對），c)在噬菌體ApL啓動基因控制下可於大腸捍菌中表現之値別蛋白質（即C 一 1 0 0 ,33C或CORE)(即HCV蛋白質表現等CKS融合配對）。毎一單株抗體對個別蛋白質之特異性，由單株抗體對免疫原之特異活性，以及表現於大腸桿菌，ApL 中之HCV蛋白質而非CKS蛋白質，可予以證實。表1 說明本發明單株抗體對HCV之C—100, 33C及 CORE蛋白質之値別數據。两方墨點分析

西方墨點分析之一般策略述於實例1。除了稀釋缓衝液中不包括CKS溶胞産物。簡言之，約300撤克的 a)免疫原（即 PHCV23、PHCV29 或 pHCV 本紙55：尺度逍用中a Η家標準(CNS)甲4規格（210x297公及) (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝- •1Τ, 線· -25 - Λ 6 Β 6 206235 五、發明説明（2屮 34)，或b) CKS蛋白質（用於免疫原之融合配對）或C)在λρί啓動基因控制下於大腸桿菌中表現之値別蛋白質，均電泳並轉移至硝化纖維。於硝化继維上自由態位置阻斷後，切成2毫米之長條。每一單株抗體均對所有三種抗原進行反應性測試（即，免疫原，CKS及表現於大腸桿菌λρί上之値別的HCV蛋白質）。毎一單株抗體之特異性如ΕIΑ分析中所述地予以證實。個別數據示於圖2A — 2F。參見圖2A — 2F,示出本發明每一單株抗體對其特異蛋白質之單一特異結合。同型 · 毎一單株抗體之同型，使用同型定型套組（Amersham ，Arlington Heights, IL)並依循其中之指不。簡言之，每一單株抗體及適當控制組之組織培養上清液，以塗覆有特異同型抗體（由上述之套組所提供）之長條於1 : 5稀釋下反應。確實依循操作指示進行分析。本發明毎一單株抗髏之同型示於表I。组宙瘩人額rfn清競莓為了確定每一單株抗體是否確認於人塍中具免疫原性之同型，如下進行競爭分析。每一單株抗體於分析中進行，此中單株抗體與對C—100, 33C及CORE抗體具血清陽性之人類血清競爭對個別抗原之結合。簡言之，將來自經NANBH感染個體之人類血清，及對HCV之本紙5良尺度边用中a B家樣準(CNS)甲4規格(210x297公及） (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝玎線

經濟部屮央標準·χ,ίπ工消奸合作社卬U -26 - Λ 6 H6 20623^ 五、發明説明（2习 C一100, 33C及CORE蛋白質抗體具強烈血清陽性之人類血清包括於反應混合物中，且每一單株抗髁之最終濃度為1 〇%。如實例1所述地進行微滴定E I A。將單株抗賭對値別蛋白質之結合，於免疫人類血清下有50 %以上抑制作用者視為具競爭性（數據示於表1)。實例6 宙裹位奧圖將相對於HCV蛋白質C—100, 33C, CORE之單株抗體，定在蛋白質之特殊位置上，利用（ a)每一單株抗體與個別Η (：乂蛋_白質之亞片段之西方墨點反應性，及（b)被選出用於個別蛋白質序列之許多合成肽之反應性，利用撤滴定E IA。此了這二種方法，C 一 100之單株抗體也以PEPSCAN分析法定位，為了進一步界定為這些抗體確認之表位。關於定位的其他待異詳細情況，將針對個別單株抗體詳述。單株抗體對重組體HCV蛋白質各種亞Η段之反性性簡言之，相當於HCV基因體aa 1676-1931的許多個別的寡核苷酸，呈分開的EcoRI-BamHI亞Η段連接及選殖至CKS融合載髖 PJ0200。這三個亞片段如圖1所述地命名為CKS -B ( a a 1676-1790) , CKS-C (aa 1789-1863)及 CKS-D (aa 18 6 1- 本紙張尺度通用中8 H家樣準(CNS)甲4規格（210X297公及） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 線· 經濟部屮央標準：：工消介合作社卬货 -27 - 紉濟部屮央標準Μ工消合作社l;I,!il 206235 Λ 6 _；_Β_6__ 五、發明説明（2句 1 93 1)。所選出之本發明單株抗體之西方墨點分析示於圖2-2F。CKS -融合蛋白質選殖及表現之詳細方法，述於美國專利案第07/572/822號，其享有共有權且列為本案之參考。這些純条之溶胞産物，充作西方墨點分析中之抗原.以為抗一C—100單株抗體之初步表位輿圖決定之用。類似地，來自HCV 22C區的二個亞片段，命名為33C A - C K S ( a a 119 2 -1331)及 33CB - CKS ( a a 1330 -1457)也如圖1所述地選殖及表現於大腸桿菌中。這些溶胞産物充作抗原，用於抗一33C單株抗體表位定位之用。 - 每一單株抗體，及適當的控制蛋白質亞Η段組（全長的蛋白質以及CKS融合配對）之西方墨點分析，如賁例 1般進行，除了稀釋缓衝液中不包括CKS溶胞産物。以這些重組亞片段進行表位定位之詳情，說明於圖2Α—2 F。單株抗體H28C1 10顯示對C-100B， PHCV2 3及C_100 (ApL構體）之反應性，但不與C-100C, C—100D或CKS蛋白質反應，此顯示H28C110特異地確認或結合HCV基因體 a a 1676— 1790間之表位。類似地，單株抗髏 H4C200可確認（特異地結合）aa 1861 — 1931間之表位，依據這些數據，單株抗體 HI1C130可確認aa 1192—1331間之表位，且單株抗體確認aa 1330-1457間之表位 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 裝· •一叮. 緣- 本紙張尺度逍用中a a家it準(CNS)甲4規格(210x297公Jii -28 - Λ 6 B6 206235 五、發明説明（27) 〇会成肽類之反應性自HCV蛋白質C—100， 33C及CORE不同區域中選出許多胺基酸序列。用於這些單株抗體表位定位之肽，列於下表2中。 ^_2_ 以合成肽谁行：> 表位亩位 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 紹濟部屮央標準：工消"合作社卬災 H C V基闵鵲區域受試之單抶抗體肽 a a 肽與値別之反應性 CORE H81C17 SP 1-75 無 H35C54 SP 35-75 Jrrr Μ 33C H1C46 SP 1192-1240 SP 1223-1240 無 H11C130 SP 1357-1407 SP 1418-1457 4nr Μ C-100 H28C110 PEPSCAN 分析 SP 1694-1750 (aa 1694-1735)及 SP 1694-1750 SP 1684-1735; SP 1684-1735 aa 1702-1709 SP 1696-1708 (PEPSCAN) SP 1866-1930 H4C20 SP 1899-1930 SP 1899-1930 本紙尺度边用中SH家樣準(CNS)<P4規格（210x297公及） -29 - Λ 6 Β6 206235 五、發明説明（2均此中每一値肽組合於樹脂載體上，利用逐步固相合成法，始於羧基末端殘基。所應用之步驟類似E. Gross及 T· He inehofer » eds·，Barary and Me r r i f i e1d » The P_ ep t ides 2 · 1 2 8 4 , Academic Press. New York» n-ew York(l 9 8 0)所述 ynthesizer Model 430A之反應容器進行。肽自樹脂上解離後，肽以二乙醚洗滌，並用4 0 %酷酸溶液萃取。水溶液經冷凍乾燥後所得之粗製肽，充作表位定位實驗中之抗原標的。簡言之，受試的每一肽，以1 ◦撖克/毫升於碩酸氫鹽緩衝溶液，PH9. 5之濃度塗覆在微滴定孔洞上。El A進行方式如實例1。_將反應性較負控制組強 4倍之單株抗體視為陽性。此外，HCV C-10◦之單株抗體也以 PEPSCAN分析定位。合成肽於聚丙烯針上合成，依循操作指不（Cambridge Pesearch Bioscience，Valley Stream, New York)以廠商指示進行 HCV C - 1 0 〇單株抗體之EIA,其中使用包括aa 1684— 1750 (HCV基因體）67個重《的六員肽。代表性數據示於圖4。單株抗體H28C 1 1 0可持異地與肽序列 Tyr— Arg— G 1 u — Phe—Asp — Glu — Met-Glu (HCV基因體 1702-1709aa )反應。單株抗髏H4C20於PEPSCAN中不示出反應性，但確實可與較大的肽1899— 1930aa於 EIA中反應。此可歸於H4C20需較大的肽以確認線本紙張尺度逍用中Η國家標準(CHS)甲4規格（210x297公;¢) {請先閱請背面之注意事項再構寫本頁) 訂- 線. 30 — % Λ 6 Β6 五、發明説明（2马型表位之事實。奮例7 ΤΓ τ Α以偵測生物樣品中之H C V蛋白暫為簡化目的，詳細方法只以HCV之CORE蛋白質來説明。製備兔子多株抗體t r 〇 HCV蛋白質33C 及C—100之方法，和下文HCV CORE蛋白質所述的目同。靱備相對於H C V C：0 RE蛋白誓之兔平多株抗體年輕的兔子（3-4月大且重_ 2 — 3公斤）得自…-zelton Labs，Denver，ΡΑ·。以 1 0 0 — 1 5 0 微克高度純化的HCV CORE蛋白質（λρί啓動基因下表現於大腸捍菌中）/FreuncTs完金佐劑，肌内注射於4個不同部位。接下來，以二週間隔，相似方式但於Freund^ 不完全佐劑中進行二次免疫接種。兔子之兔疫反應依實例 1所述地以EIA及西方墨點分析檢知。當達到對蛋白質可接受之免疫反應時對兔子採血。來自免疫兔子血清之 I g G以Protein-A Sepharose親和力層析純化，此係精蕕知熟知之方法。珠粒塗薄於目前最佳的模式中，如上製備之兔子IgG,塗覆在充作固髏載體之聚苯乙烯珠粒上，以捕獲受試樣品中之各紙乐尺度边用中a Η家埝準(CNS)甲4規格(210X297公犮） (請先閱7*?背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線< 經濟部屮央標準x;:tx工消赀合作社.2-¾ -31 - 五、發明説明（30) CORE抗原。聚苯乙烯珠粒以蒸餾水洗滌，並於401C 下與5—10微克/毫升經純化之HCV CORE兔子 IgG/於缓衝溶液中（0.1M T r i s , 0 . 5 Μ NaCl, 〇. 0022% Triton X-100 ®.pH8. 5 )共置。珠粒以P B S洗一次，再浸於0 . 1 % Triton X-100 ®/PBS約40*C 1小時。於PBS洗二次後，珠粒再覆以3%牛血清白蛋白（BDA)/PBS,約 40¾下約1小時。最後，珠粒再覆以5%M糖溶液/ PBS並於氫氣下乾燥。由對C—100， 33C及 CORE HCV抗髏具血清陽性之個體血清中純化出之抗一 HCV人類多株抗體I g G 也以相似方式塗覆。

E I A 許多與HCV C—100、 HCV 33C或 HCV C0RE具特異性之單株抗體，經篩選可充作探針f P r ,以於E I A中偵測受試樣品中之HCV蛋白質。簡言之，每一單株抗體與個別抗原共置，並有塗覆有抗一HCV兔子多株抗體IgG聚苯乙烯珠粒之存在。 EIA之詳細策略與下相似。數據說明單株抗體之反應性 ,其顯示充作探針用於抗原偵測分析之最佳反應性，示於表3中。本紙乐尺度通用中國S家捣準(CNS)甲4規格(210X297公及） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝< 線. -32 - Λ 6 _ Β6 五、發明説明（31) 表 3 單株抗體抗原 A 下之吸光度，於抗體濃度下負對照組， 0亮榭克/毫升正對照組， 100豪榭克/臺畀 H81C17 HCV CORE 0.246 >6.62 H11C130 HCV 33C 0.194 0.832 H28C110 HCV C-100 0.623 2.53 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 經濟部中央標準工消贽合作社.5-51 於El A步驟中，將200微升疑似含有HCV CORE蛋白質之檢品與50撤升單株抗體H8 1 C 1 7 (終濃度為5 — 1 ◦微克/毫升，-稀釋於含2〇mM T r i s , 0 . 1 m M NaCl.lmM EDTA, 3. 0%BSA, 0. 3 % Tweerr — 2 0 ® 及 1 0 % fbs, pH7. 5之缓衝液中），及塗覆有HCV兔子 I gG之珠粒（依上文所述地製備）共置於反應盤中。經環境溫度下共置一夜後，珠粒以蒸餾水洗滌，並加入 200徹升經適當稀釋之薛菜過氧化酶標記之山羊抗一；老鼠 I g G (H + L) ( Jackson Immunoresearch，West Grove, PA)。經檫記探針之共置於約4 0 t：下進行約2小時。洗滌珠粒，並轉移至其中含3 0 0徹升鄰苯二胺：2 H C 1 (OPD)為顔色試劑之反應試管中。反應於環境溫度及暗處進行約30分鐘，之後加1毫升1Ν H2S〇4而停止。於492/6 Ό0毫撒米下記錄吸光度。先前已經過篩選，且經證實為NANBH感染陰性之陰裝. 訂_ 線- 本紙56·尺度逍用中as家標準（CNS)甲4規格（210x297公垃） -33 - Λ 6 13 6 五、發明説明（3¾

性控制組也包括於驗中。陽性控制組含有重組體HCV CORE蛋白質（pHCV34)於缓衝液溶液中，上述。在毎一組實驗中均包括陽性及陰性控制組三份。為了決定抗原捕獲分析對於樣品中HCV CORE 蛋白質決定之效力，將範圍由1 0 Q毫撤克蛋白質/毫升至100微撤為蛋白質/毫升之各種濃度的重組餹HCV CORE蛋白質（在ApL啓動基因下表現於大腸桿薗），稀釋於上述之缓衝液中。將每一個經糸列成員，依此中所述之方法進行E I A步驟。為了比較目的，毎一成員以 (a)抗一 HCV兔子多株抗體於固相，及（b)抗一 HCV人類多株抗髏於固相進行測_試。如圖4及表4所説明的，本發明之抗原捕獲分析，可於2 0 0微升受試樣品中偵測少至200撤微之HCV CORE蛋白質。以兔子或人類捕獲抗體於偵測蚕敏度上雖無顯著差異，抗一 HCV兔子抗體顯示整體上較佳之操作，並被選出充作抗原捕獲中較佳的多株抗體。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經鴻部中央榣準一工消"合作社l;fJ!il 本紙尺度边用中國囷家捣毕(CNS)甲4規格（210X297公及) -34 - 五、發明説明（3¾

抗原濃度 pL CORE# 豪榭亩於E I A 4 9 2 兔子珠粒 —-IV « α ga Α中之反應性 A 4 9 2 人龉换紡 100 6.39 4.45 50 4.06 2.19 25 2.19 1.25 12.5 1.02 0.887 6.25 0.339 0.382 3.125 0.230 0.121 1.56 0.084 0.043 0.78 0.050 0.032 0.39 0.038 0.014 0.2 0.028 0.015 0.1 0.020 0.014 0 0.014 0.014 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 線. 經濟部屮央標準劝Π工消仰合作社卬災 '以於λ P L啓動基因糸统下可在大腸桿菌中表現之重組體HCV CORE為抗原。濃度以A280數值上之每毫升若干毫微克蛋白質為基礎。分析糸統有200微升/ 孔洞以供試驗，故每孔洞中確實的抗原量為此處所給數值之 1 / 5。本紙张尺度边用中國a家櫺準(CNS)甲4規格（210x297公垃) -35 - 7 5 Μ,— SO沾奶 Λ6 ___ _13 6 五、發明説明（3今實例8 陰性血清及rfn聒樣品之測試 60份NANBH陰性的血清及60份血漿，以實例 7之E I A步驟測試。這些分析之結果示於圖5。由數據可看出，大部份的陰性血漿及血清落與陰性對照組相近之狹窄的◦. D.(光密度）範圍中。◦ . D . 0.175之血漿樣品被視為重覆反應性。抗原存在之證實，由於樣品體積不夠，無法在此樣品上進行。實例9 細株 1 3 -975 — 157, 14-153-234 及14一1350-210夕産製及用法 A.重組體HCV抗原及劳疫原之産製以自動肽合成儀製作，在HCV基因體假想的 CORE區域中之相當的合成肽。利用技藝中已知之方法構築以下的肽：

CORE 3 5-75 3 5-61 這些肽述於共有的美國專利案07/6 10, 180 中，檫題為C型肝炎分析，其享有共同所有權，且列為# 案參考。本紙張尺度逍用中BB家標準(CNS)甲4規格(210x297公垃） (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 裝 π 線 -36 - Λ 6 Β6 五、發明說明（3习重組體抗原，與大腸桿菌中之CMP—XDO合成酶製成融合HCV (依據技藉中已知之方法），或與λρί 啓動基因条統成為非融合蛋白質。以下蛋白質被選殖及純化：

ApL CORE (1-150) CKS - CORE (1-50) CKS-33C (1 191-1457)

ApL-33C- CORE (1 191-1457 及 1- 1 5 0之融合） CKS-BCD (156-1930) CKS-E (1931-218 9.) (NS4/NS5 反應） CKS-B (1676-1790) 見圖1 B關於HCV基因體之輿圖，及HCV區域之大約位置。重組體蛋白質C—100 (1569— 1 930),以與超氧物歧化酶（S0D)融合蛋白質型式得自Chiron。所有的重組體蛋白質以S 0 D — P A G E 知純度均大於9 〇%。 B .老蘭.：> 免疫接種 BALB / C 老鼠（Charles River Laboratories’

Charles River, NY) 6 — 8 週大，以 5 0 徹克 λ P L — C0RE/1 0 ◦微升 FreancTs 完全佐劑（Difco，De - 本紙张尺度逍用中SS家標準（CNS)甲4規格（2l〇X297公及：） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 線· -37 - 2〇6·挪 Λ 6 13 6 經濟部屮央捣芈χ;=::工消·(?合作社卬& 五、發明説明（3句 tro it，MI)中皮下及腹膜内先行免疫接種。於第15天， 5 ◦微克的免疫原稀釋至1〇〇微升磷酸鹽缓衝溶液（ PBS) , pH7. 2,並靜脈内注射至尾靜脈（J. Go-ding， Monoclonal Antibodies: Principles and Pract-ice [New York; Academic Press，1 9 8 6〕）〇血清效價未予以評估。 C .融合於第18天，殺死老鼠，且脾細胞以1:1比率與 SP 2/0骨睡瘤細胞株融合，依據已知之傳統方法（ G. Kohler and C- Milstein, Nature(l 9 7 5) 2 5 6 :495— 497 ; J. Goding,上文）。細胞融合園塊分散於/毫升50%聚乙二醇（PEG) (ATCC MW 1 4 5 0)，並方$ Iscove’s Modified Dulbecco's Medium (I M D M ) ( Gibco，Grand Island，NY)中離心。細胞再懸浮於HAT (次黃嘌昤一胺甲碟昤一胸©)—選擇性IMDM中，並加有10%胚牛血清（FBS)( [1丫〇1〇116 1^1)00纹1〇1*丨63，1^〇8玨11，1]11)，以每9 6孔洞组織培養盤塗佈3X 1 05値細胞。包括在HAT培養基中之生長促進劑有〇. 5%STM (RIBI Imm unochem♦ Re s e-a r。h , I n c ·，H a m i 1 t ο η , Μ T)及 1 % 〇 r i g e η H y b r i d o m a Cloning Factor (Igen，Rockville，MD)。培養孔洞中之生長培養基於融合後第5及7天，更換添加有HT (次黃嘌昤一胸苷）及10%FBS之IMDM。 (請先閲請背面之注意事項再堪寫本頁) 裝. 訂線. 本紙56·尺度边用中S國家樣準(CNS)T4規格(210x297公垃) -38 - “6 η 062於經濟部屮央榣準x;u工消设合作社卬¾ 五、發明説明（37) D .酵袤免疮分析（EIA) 融合後1◦天，利用相對於免疫抗原之EIA篩選培養物上清液，以偵測分泌HCV特異抗體及非特異蛋白質之融合體以減少任何偽陽性（Langone & Van Vunakis， eds.» Methods in Enzyme 1oqy» 9 2 : 168—174, Academic Press〔 1 9 8 3〕）。聚苯乙稀9 6孔洞微滴定盤，以毎孔洞50撤升之1撖克/毫升HCV抗原溶液 /PBS在室溫下塗覆一夜。任何剩下的聚苯乙烯孔洞上之結合位置，均以3 %牛血清白蛋白（B S A ) ( Inter- gen，Purchase，NY) / P B S中，_室溫下3 0分鐘阻斷之。培養盤以蒸餾水洗三次。50微升之融合瘤組織培養上清液，於室溫下於孔洞中共置1小時，孔洞再以蒸餾水洗三次。結合至抗原之抗體，以山羊抗一老鼠IgG+M— 择菜過氧化酶（HR P0) ( K i r k ega a r d-Pe r r y Labora- tories〔KPL〕，Gaithersburg，MD)偵測，其以 1 : 1000稀釋於阻斷溶液中，再於室溫下培育30分。盤以蒸餾水洗滌，且鄰苯二胺受質（〇PD; Abbott Laboratories， Abbott Park， IL) 充作色原般加入。於 4 9 2 毫擻米波長下謓取吸光度。當光密度（0D)為負控制組之 3倍時，將融合培養物視為可能的HCV抗體陽性，並與不相關抗原塗覆盤之抗體結合比較，以觀察HCV抗原盤之顯著差異，即在後者有>◦· 2 〇D之差異及 <0.2 0 D 訊號。 (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 線. 本紙5fc尺度边用中a國家榣準（CNS)甲4規格（210 X 29+·’公及） -39 - % A 6 B6 經濟部中央標準XJn工消奸合作杜.s-奴五、發明説明（3¾ E ·西方墨點以西方墨點分析證實融合抗體之特異性（Towbin & Gordon, J. Immunol. Methods.T 2:313—340 C 1984〕）。HCV重組體蛋白質及不相關蛋白質，以硫酸十二酯鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS - PAGE )電泳，並再轉移至硝化纖維上，依據廠商之操作指示（ Schleicher & Schuell, Keene. NH； Bio-Rad. Richmond ，CA)。硝化纖維長條以1¾牛血紅素（SUma Chemical Co" St. Louis，Mo)及 0. 5% Tween- 2 0 ( Fisher Scientific, Pittsburg，DA)於 P.BS 中，於室溫下阻斷 3 ◦分，長條再與融合組織培養上清液共置。之後以 PBS洗滌，再加山羊抗一老鼠IsG + M — HRPO ( KPL)歴30分。結合至HCV抗原之抗體，以充作色原受質之4 一氣一1 一某酚（Sigma)具象化。選殖融合培養物，且若示出HCV抗體待異性則置於冰凍貯存中。 f .純条之發展以有限稀釋選殖H CV特異融合體（Goding. Monoclonal Antibodies： Principles and Practices. 2nd e~ d. Academic Press, New York，〔 1 9 8 6〕）。變化包括培養物log 1 ◦稀釋糸列塗佈，並選擇每96孔洞組織培養盤中呈現<2 0%生長之培養盤以為陽性純条之擴大。經1 0天後，以E I A及西方墨點分析，測試培養物 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂線. 本紙55：尺度边用中國a家標準（CfiS) Μ規格（2丨0 X 297公!i) -40 - 經濟部屮央#準A U工消仰合作杜卬¾ ㈣5 Λβ Β6 五、發明説明（3¾ 上清液。選出之純糸擴大以進一步評估，並於加有10% FBS 及 10%DMS〇 (Sigma)之 80%IMDM 中冷凍貯存。 G .星株抗鵲固型以5 8八純糸定型糸統11重組（<^1〇11〇七乂？1118 3丫3七610 狙 kit) (Southern Biotechnology Associates . Inc·. Birmingham, AL)略為變化來決定單株抗髏之同型。 E I A 9 6孔洞之微滴定盤，以1 0 0撤升/孔洞之1 :1000稀釋之山羊抗一老鼠IgG+M(H+L)( KPL)於室溫下塗覆一夜。培養_盤以3 % B S A/ PBS阻斷30分，再水洗。培養物樣品加至孔洞中，培育1天，再水洗。加入套組中之山羊抗-老鼠亞型特異共軛物，培育30分鐘。經水洗後，顔色以0PD受質鑑定。結合至老鼠免疫球蛋白之山羊抗一老鼠同型特異共軛物，且在492毫微米下呈現>0.1 0D值，則表明傜亞型。 Η.蛋抶抗體之産製被選擇以進一步評估之純糸，於組織培養之Τ燒瓶中擴大之，並取1 〇6個細胞注入於加Pr is tan前之 B A L B/ C老鼠腹腔中（Chari e s River Biot echn i ca-1 Se r v i e s，I nc ·，W i 1 m i ng t on，M A )(見 H u r r e 1 1 ,上文 )。生成之腹水液於注射7 — 1 0天後回收，離心，再貯本紙5k尺度边用中a國家標準（CNS)下4規格（210x2974.12} * 41 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 線. Λ 6 13 6 五、發明説明（於一2 0 1C下。I g G抗髏於Protein A上親和力純化（ Phermac i a-LKB Biotechniques » Piscataway· NJ)利用自動式OROS純化条統100型（見Goding,上文，基本原則）。IgG抗體於S-300管柱上（Phermac ia-LKB)以分子大小純化。以下之鑑定資料均以經純化之單株抗體來進行。 I .等雷隹距（I E F ) 為確保冷凍品一致性之細胞株品質管制，包括於 I EF凝膠裝置上（B i 〇 — Rad)偵測抗髏之p I點，此裝置僳依據電荷分離蛋白質。-簡言之，雙一丙烯醛胺 -核糖黃素溶液缜料至丙烯醛胺凝膠，曝於螢光燈下1小時，再貯於4t：下一夜。1微克單株抗體樣品及檬準品覆於凝膠上，並電泳1 一 2小時。經一糸列固定及洗條，凝膠以銀染色（B i 〇 - Rad)。單株抗體之P I值以經由凝膠之移動距離估計，且與已知P1值之標準品移動距離直接比較。有差異性的指紋成帶型式反映出抗體個別産生組之間p I撒妙異質性（Hanilton，R.G. Reinier，c. Β·, Rodkey, L-S- ( 1 9 8 7 ) Quality Control of mu- r i ne monoclonal antibodies using isoelectric focu-sing affinity i mmunoblot analysis. Hgbr i doma 6 ： 205-217)° 本紙尺度边用中S S家標準(CNS)肀4珙格（21〇X297公！) -42 - (請先閱讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 裝· 訂_ 線. 纽濟部屮央蚱準而u Η消货合作社.5-¾ 五、發明説明（41) J. 單株抗體之EIA及西方墨點恃里袢此處所示之所有的單株抗塍，於可應用之各類重組體 HCV抗原之進行篩選，如美國專利第07/572, 8 22中所示的，標題為利用重組體蛋白質之C型肝炎分析 (HEPATITIS C ASSAY UTILIZING RECOMBINANT PROTEINS )，其享有共同所有權，並列為本案之參考。多重抗原篩選技術證實HCV待異性，並排除單株抗體之HCV非待異CKS, XpL或連接子一臂之反應性。 K. EIA表位韹番作用的研究為檢査特異性及抗原結合之差-異性，利用標記有生物素及未標記之單株抗體進行表位分組實驗（Lansone & V-an Vunak i s. Methods in Enzymology. 9 2 : 2 4 2 — 2 5 3 , Academic Press〔1 983〕）。簡言之，抗髏標記以 NHS — LC_ 生物素（Pierce Chemical Co.， Rockford, IL),依據操作指示。微滴定盤如前所述地塗覆以免疫原。首先，l〇g2之未標記抗體稀釋液，預共置於孔洞中歴15分鐘，之後加固定量之經生物素化之抗體 (於經生物素化抗體之直接EIA中之稀釋液單獨時可得最大吸收值之50%),並培育20分鐘。培養盤以水洗三次。加經稀釋之鏈抗生物素一幵只卩0(27111以，3〇1^-h San Francisco，CA)至孔洞，並培育3 0分。培養盤再次洗滌，且如前述地展開0PD之顔色。於492毫微米下讀取吸光度。相同或相關表位之抗體，其訊號受阻斷或 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝· .可線· 本紙張尺度边用中困a家標準(CNS)咧規格（210x297公及) -43 - 經濟部屮央標準工消讣合作社卬災五、發明説明（42) 抑制達50%以上。以不同特異性之抗賸則不見抑制作用。對於在HCV核心區域内産製之抗體，互相進行此研究 L. RIA交万鏟豸作用塗覆以適當抗原之珠粒或盤，與100微升之未標記單株抗體共培育，後者以1〜20微克/毫升之單株抗體濃度稀釋於再鈣化之陰性人類血漿中（NHP,抗一 HCV,抗一 HIV及HBsAg陰性）。100微升之經放射標記之抗體，以1〜4微居里/毫升稀釋於 HTLV I套組之檢品稀釋液中胃（含去污劑，動物血清，缓衝液），將之與珠粒置45t：下2小時或20 — 25 1C下18 — 20小時。珠粒洗滌，並計算放射活性。 Μ.以合成肽淮行之ΕIΑ反應件塗覆有3毫克/毫升之珠粒與1〇〇毫升，濃度在 ◦. 02—1毫克/毫升之單株抗體共培育1小時。珠粒洗滌，並加入山羊抗一老鼠I gG + M_HRPO ( KPL)歴3 ◦分。珠粒再次洗滌，並以OPD為色原，在4 9 2毫微米下讀出OD值。 N . H C V杭原分析塗覆有一種抗H C V單株抗體或其摻合物之珠粒，與 200撤升檢品共置於40 — 45t：下2小時或20 — 本紙张尺度通用中囷國家標準（CNS)甲4規格（210x297^,12) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -44 - 五、發明説明（4β 25Ό下18—20小時。珠粒以蒸餾水洗滌，再與 2 0 0微升經放射標記之抗一 HCV單株抗體（一種以上 )共置於45¾下2小時。珠粒洗滌，並於r計數器上計數。〇.匿株抗體之鑑定拮抗HCV CORE區之單株抗體（1— 75), 依相互競爭研究分成二類獨特之基國。各組均與CKS-C 0 R E (1 — 150)及 IPL—核心，IPL — 33 C 一核心及相當於（1一 75)之合成胚反應，與（35 一 75)有一些反應，（35 - 6-1)則無。第2組的單株抗體14-153-234,明白地與肽（1 一 75) 及（35 — 75)反應，但與（35 - 61)則否。單株抗體14—1350—210與其他不同，可與3種 HCV核心合成肽均強烈地反應。這些數據示於表5及6 。參考6—17,綜合於下表5之反應性示於4、 5及6 列。1至3列含拮抗HCV 33C蛋白質之單株抗髏（ 1列為6-296-534， 2列為6—914—518 ,3列為6—1070—110) ;4—6列含拮抗

HCV CORE之單株抗體（4列為13 — 975 — 157，5 列為 14— 153 — 234，6列為14一 1350-210) ;7及8列含拮抗假想的HCV ENV區域之單株抗體（7列為1 6 - 407 — 209及 8列為16—803—174) ;9—11列含拮抗本紙度边用中S a家榀準（CNS)甲4規格（210 X 297公及） (請先閲請背面之注意事項再蜞寫本頁) 裝. 線. -45 - % 五、發明説明（1 HCV C— 100之單株抗體（9列為25 —1518 — 105, 10 列為 9，28-735 — 355，11 列含CKS對照用單株抗體29—121—236) ；12 列含正常老鼠血清之控制組；13列含負控制組。表 5 於而方墨點上之反應性 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 細胞株

λΡΐ- cks- CKS- λΡΙ^ 033^- CKS- C33- CKS- CKS- CKS-核心核心核心c33 BCD BCD B E

SOD CKS- CKS-CKS 100 A.BCD A'BCD 13- 975-1 57 + 14- 153-234 + 14.1350-210 + 组別细胞株〇1同型 CKS- 核心 XPL- XPL- 33c-核心核心 HCV-core Synthetic Peotide 裝玎線 CKS- CKS- 33c- _ ——_ 33c BCD 1-75 35-75 35-61 +/- 經濟部屮央拉準x;n工消费合作社卬!;1 1 13-975-157 IgM k 2 14-153-234 6 lgG2a k + 3 14-1350-210 IgM k 實例1 ο 抗一CORE免疫分析依上文、、R I A相互競爭作用〃所述進行之單步驟競爭性抗一CORE分析之數據，示於表7中。於這些實驗中，抗一 HCV陽性人類檢品與第2組（14— 153) 本紙浪凡度通用中國國家栉準（CNS)甲4規格（210x297公及) -46 - Λ 6 Π 6 五、發明説明（4$ 或第3組單株抗體（14— 1350)進行對ApL — CORE經塗覆珠粒（1微克/毫升）之競爭結合決定。測試1 0値抗—HCV反應性檢品及2個抗一 HCV陰性檢品。將結合訊號大於50%抑制之檢品，視為對抗一 c〇RE抗體具有反應性。10個陽性撿品中有7個與第 2组（14— 153)競爭，且 100% (10/10) 與第3組（14—1350)競爭。這些數據建議，經感染個體對不同的HCV CORE表位有不同的抗體反應 (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 線< 經濟部屮央標準沿U工消贽合作社.l-p^i 本紙5it尺度边用中a固家榀準(CNS)甲4規格（210x297公垃） -47 - 五、發明説明（表 7競爭性單步驟抗一 C ◦ R Ε分析 Λ 6 Β 6 標記物：14-153-234 _標記物：14-1350~210 檢品 CPM AVG S/N %抑制率结果 CPM AVG S/N % 抑制率结果 48272 48542 36866 34521 47010 35655 50345 31041 Elevated ALT 27 4845 5130 0.11 89.4 + 440 405 0.01 98.8 + 5414 370 238-NC 40035 41964 0.86 13.6 - 28481 28294 0.82 18.0 43892 28106 135 620 558 0.01 98.9 + 1 14 1 17 0.00 99.7 + 496 1 19 163 14540 15471 0.32 68.1 + 100 102 0.00 S9.6 + 16402 1 04 173 5344 5531 0.11 88.6 + 114 1 26 0.00 99.6 + 5717 137 220 1049 101 2 0.02 97.6 + ί24 1 30 0.00 99.6 + 974 136 252 231 212 0.00 99.6 + 138 135 0.00 99.6 192 132 > R13203 56075 55778 1.15 -14.9 - 3029 3479 0.10 89.9 + 55480 3929 SAC190 472 417 0.01 99.1 + 1 02 1 94 0.01 99.4 362 284 7088396 41692 41963 0.86 13.6 - 1 02 1 22 0.00 99.6 42233 1 42 EP10968 ；39418 40470 0.83 16.6 - 94 95 0.00 99.7 41522 95 14-153 5580 5491 0.1 1 88.7 +· 16216 14178 0.41 59.9 5402 12140 283-NC 45170 44219 0.91 8.9 - 24748 23908 0.69 30.7 • 43268 23067 (請先閲背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 線. 經濟部屮央標準劝U工消赀合作社.!-pf/i 本紙尺度ii用中SS家櫺準(CNS)甲4¾格(210X297公及） 48 咖_ Λβ ---Β_6_ 五、發明説明（4? 實例1 1 抗一HCV CORE二步驟阻斷分析依據此處所述之競爭性單步驟分析法，為偵測抗一 HCV CORE之、、RIA相互競爭作用〃進行二步親阻斷分析，利用表8所示，經標記之第3阻單株抗體（ 14-1350—210)。測試16個對抗一C100 具重覆反應性之檢品（利用Ortho 1.0 sen 套組，可購自 Ortho Diagnostics，Raritan，New Jersey)。6 個以抗一C10◦證實分析示出為偽陽性，且1〇個證實為陽性。6個偽陽性中無一者在分析中有2 0%以上之抑制作用，而於此抗一CORE分析中觀-察之真抗一C 1 00陽性則為48 — 99%抑制作用。 (請先閲請背面之注意事項再填窝本頁) 裝· .^- 缘- 經濟部中央標準：工消价合作社卬本紙张又度通用中a 0家標準(CNS)甲4規格(210x297公垃) -49 - 20623b Λ 6 Ο 6 五、發明説明（4与表 8 二步驟阻斷抗一HCV—CORE分析珠粒：1.〇撤克XpL-OCRE;標記物：14-1350/HTLV I稀釋液檢品 CPM AVG S/N %抑制率結果 NC 23376 25969 26257 28275 經濟部屮央橾準·心U工消"合作社卬災

Sacramento Negative 1.0 Gen · 183 31956 1.23 -23.1 — 184 26525 1.02 -2.1 - 185 24714 0.95 4.8 - 192 20664 - 0.80 20.4 - 193 20934 0.81 19-4 - 194 23321 0.90 10.2 - Sacramento Positive 1.0 Gen · 188 13569 0.52 47.7 十 189 2243 0.09 91.4 + 191 2361 0.09 90.9 + 195 284 0.01 98.9 + 196 170 0.01 99.3 + 197 487 0.02 98.1 十 206 3639 0.14 86.0 十 207 2713 0 - 10 89.6 + 208 145 0.01 99.4 + 214 10398 0.40 60.0 + (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙5k尺度边用中因Η家砬準(CNS)甲4規格(210x297公没) -50 - Λ 6 η 6 206235 五、發明説明（4¾ 實例1 2 Η Π V CORE Ακ 分析來自一型CORE Ag分析之結果示於表9中。此分析依上述a HCV抗原分析"中所述之步驟2驟分析，如下般進行：與檢品（2 0 0微升）的第一次共置是室溫下18小時，之後與經放射標記之第2組單株抗體14 一 153在45¾下共置2小時。由於以第3組單株抗體 1 4 一 1 3 5 0塗覆之珠粒不與塗覆第2組者競爭，故也可能進行單步驟三明治式分析。對S/N值大於3之檢品，視為對CORE Ag具反應性。分析中對重組體λ pL —-CORE之蚕敏度為約 100毫微克/毫升。13値來自病人之檢品中有2個具高的ALT,且抗一C一100反應性視為對CORE抗原具反應性。 (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 線經濟部屮央#準x;u工消fr合作社卬¾ 本紙尺度边用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公及) -51 - ^062^° 五、發明説明（50)

檢品 hC

XPbCORE

高的ALT Λ 6 Β 6 表 9 Η C V核心A g分析 (14-1350 珠粒 /14-153 標記物〉經濟部屮央 ],lh 準入 i\ 消合 A· 杜 110 μς/ηηΙ 11 μg/m\ 1.1 μς/ητιΙ 110 ng/ml 11 ng/ml 10 27 54 77 1 35 1 63 1 73 220 238 252 283 28 290 CPM 114 137 1 33 1 846 1798 1488 1405 1 220 1271 51 4 430 1 82 1 67 206 21 7 1 60 1 87 710 546 41083267457574458427 56612343775820955968 4 4 1 2 3 3 0〇 3 2 2 1 HI 2 2 112 1 ii ^ 平均 1 28 S/N 结果 1822 14.23 + 1447 1 1 .30 + 1246 9.73 + 472 3.69 + 1 75 1 .36 - 212 1.65 - 1 74 1.36 - 628 4.91 458 3.57 + 1 89 1 .48 - 328 2.56 - 342 2.67 - 275 2.14 * 1 71 1.34 - 216 1.68 - 1 75 1.36 -- 226 1 .77 - 1 75 1.36 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝. 訂_ 線- 各紙尺度通用中國Η家*ί準（CNS)甲4規格(2丨0X297公垃) -52 - Λ 6 Β 6 206235 五、發明説明（5¾ 實例1 3 (請先閱誚背面之注意事項再埙寫本頁) 瞧m罝抶抗鵲捞和物之hcv抗餺試驗也進行相似之CORE抗原模式，其中使用抗一 CORE單株抗體之摻和物，於固相上及於標記物中（ 14-1350-210, 14 - 153-234,及 14一726)。於25個抗一C—100重覆反應檢品中，1個檢品（SAC 161)在反應活性上有顯箸地提高。準備Interstate Blood Bank得之陰性抗一HCV 族群頻率組織圖（未示出）。設定於S/N = 2. 0之截去值，可自陰性族群平均值中得出5個標準偏差。無一陰性檢品之S /N 7 1.6。 - 實例1 4 細朐株 16 — 296-534, 6 -914 — 518 及 6 -1070-110之産製及用法_ A .重組體H C V杭原及免疮原之産製重組體抗原與CMP — XD 0成酶於大腸桿菌中製成融合合蛋白質，依據精蓊者，已知之方法，或與λρί啓動基因条統呈未融合蛋白質。選殖及纯化以下蛋白質： ApL CORE (1-150) CKS-CORE (1-150) CKS-33C (1 191-1457) ApL-33C-C0RE (1 191-1457 及 1- 1 5 0之融合）本紙56·尺度边用中®困家標準(CNS) T 4規格(210 X 29Ϊ公垃) -53 - Λ 6 Β6 ^06235 五、發明説明（59 CKS-BCD (1 5 6 - 1 9 3 0) (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) CKS-E (1931-2189) (NS4/NS5 反應） CKS-B (1676-17 90) 見圖1B關於HCV基因體之輿圖及HCV區域之大約位置。重組體蛋白質C—100 (1569—1930 )是與超氧物技化酶（SOD)之融合蛋白質型式得自C-hiron。所有的重組體蛋白質以SOD — PAGE知純度均大於9 0 %。 B .老鼠：> 免痔培種 -經濟部屮央榀準AM工消"公作杜.κ,κ BALB / C 老鼠（Charles River Laboratories， Charles River，NY), 6 — 8 週大，以 10 — 10 0 撤克 HCV CKS — 33C/100 微升 Freand’s 完全佐劑（Difco，Detroit, MI)中皮下及腹膜内地先予以免疫。於第14天，以免疫原稀釋於不完金Freund ’ s佐劑（ Difco)中給予第二次相似之追加。第25天，10 — 100微克免疫原稀釋至10 ◦徹升磷酸鹽缓衝食鹽水（ PBS) , pH7. 2,並靜脈内注射入尾靜脈中（J· Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Pra_ ctice [New York; Academic Press，1 9 8 6 ])〇未評估血清效價。本紙5k又度边用中a a家捣準（CNS)甲4規格（210 X297公垃） -54 - Λ 6 13 6 206235 五、發明説明（53 C .融合於第28天，老鼠殺死，脾細胞以1:1比率與 SP2/0骨鏈瘤細胞株，依已知之傳統方法（G. Kohler and C. Milstein, Nature(l 9 7 5) 2 5 6 : 495-497 Godins，上文）融合。細胞融合園塊分散於1毫升50%聚乙二醇（PEG) (ATCC MW 1 4 5 0),並於 Iscove's 經修飾之 Dulbecco's 培養基（IMDM) (Gibco, Grand Island, NY)中離心。細胞再懸浮於HAT (次黃嘌昤一胺甲碟昤一胸苷）一選擇性IMDM (加有10%胚牛血清（FBS)中（ Hyclone Laboratories，Logan，UT),並以每値 9 6 孔洞組織培養盤3 X 1 05個細胞塗佈。生長促進包括於 HAT 培養基的有：0. 5%STM (RIBI Inmunochem. Research， Inc., Hamilton. MT)及 1 % Origen Hybri-doma Cloning Factor ( I gen . Rockville. MD) 〇培養孑 L 洞中之生長培養基，於融合後第5及7天時更換以添加有 HT (次黃嘌呤一胸苷）及10%FBS之IMDM。 D .酵袤狰疫分析（E I A) 於融合後10天，以相對於免疫抗原之EIA筛選培養物上清液，以偵測分泌HCV特異抗體及非特異蛋白質之融合體，以減少任何偽陽性（Langone & Van Vunakis， eds.. Methods in Enzymeloqy，9 2 ·· 1 6 8 — 1 7 4， Academic Press〔 1 9 8 3〕）。聚苯乙嫌9 6孔洞微滴本紙m尺度边用中國困家標準（CNS)甲4税格（210x297公及） (請先閱讀背面之注意事項再場寫本頁) 裝- 訂- -55 - 206235 Λ 6 Π 6 五、發明説明（54 定盤，以每孔洞50微升之1微克/毫升HCV抗原溶液 /PBS,在室溫下塗覆一夜。任何剩下的聚苯乙烯孔洞上之結合位置，均以3 %牛血清白蛋白（B S A ) (Int-61：料11»?111：〇11&56，訂）/?3 3中，室溫下阻斷3 0分鐘。培養盤以蒸餾水洗三次。50微升之融合瘤組織培餐上清液，於室溫下於孔洞中共置1小時，孔洞再以蒸餾水洗三次。結合至抗原之抗體，以山羊抗一老鼠I 8： G+M — 摄菜過氣化酶（HR PO) ( K i rkegaard-Per ry Labora-tories〔KPL], Gaithersbcrg, MD)偵測，其以 1 : 1000稀釋於阻斷溶液中，再於室溫下培育30分。盤以蒸餾水洗滌，且鄰苯二胺受質（-0PD; Abbott Laboratories， Abbott Park， IL) 充作色原般加入。於 4 9 2 毫徹米波長下謓取吸光度。當光密度（0D)為負控制組之 3倍時，將融合培養物視為可能的HCV抗體陽性，並與不相關抗原塗覆盤之抗體結合比較，以觀察HCV抗原盤之顯著差異，即在後者有>◦. 2 0D之差異及 <0.2 ◦ D 訊號。 E .西方墨點以西方墨點分析證實融合抗體之特異性（Towbin & Gordon , J. Immunol. Methods, 7 2 ： 313 — 340 〔 1984〕）。HCV重組體蛋白質及不相關蛋白質，以硫酸十二酯鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS — PAGE )電泳，並再轉移至硝化纖維上，依據廠商之搡作指示（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙56：尺度通用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公及) -56 - Λ 6 B6 206235 五、發明説明（5含

Schleicher & Schueli，Keene , NH ； Bio-Rad，Richmond ，CA)。.硝化纖維長條以牛血红素（Sigma Chemical Co.，St. Louis., Mo)及 0. 5% Tween-2 0 (Fisher

Scientific，Pittsburg，DA)於 PBS 中，於室溫下阻斷 3 ◦分，長條再與融合組織培養上清液共置。之後以 PBS洗滌，再加山羊抗一老鼠I gG+M — HRP0 ( KPL)歷30分。結合至HCV抗原之抗體，以充作色原受質之4 一氣一 1 一棻酚（Sigma)具象化。選殖融合培養物，且若示出HCV抗體特異性則予以冰凍貯存。 F .純条：> 發届 . 以有限稀釋選殖HCV特異融合體（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. 2nd e-d. Academic Press» New York，〔 1 9 8 6〕）。變化包括培養物稀釋糸列塗佈，並選擇每96孔洞组織培養盤中呈現< 2 0%生長之培養盤以為陽性純糸之擴大之用。經1◦天後，以EIA及西方墨點分析，測試培養物上清液。選出之純糸擴大以進一步評估，並於加有1 〇 %FBS 及 10%DMSO (Sigma)之 80%IMDM 中冷凍貯存。 G .塱抶抗鵲固型以 SBA Clonotyping SystemM 套組（Southern Bi-otechnology Associates， Inc·. Birmingham， AL)略為本紙尺度边用中a Η家標準(CNS)甲4規格（210 X 297公.!£) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 線- -57 - 20623b Λ 6 _____Π6__ 五、發明説明（5乓變化來決定單株抗體之同型。 EIA 96孔洞之微滴定盤，以100撤升/孔洞之1 : 1 000稀釋之山羊抗一老鼠IgG+M(H+L) (KPL)於室溫下塗覆一夜。培養盤以39^BSA/PBS阻斷30分再水洗。培養物樣品加至孔洞中，培育1天，再水洗。加入套組中之山羊抗一老鼠亞型特異共軛物，培育3 0分鐘。經水洗後，顔色以0DS受質鑑定。結合至老鼠免疫球蛋白之山羊抗一老鼠同型特異共軛物，且在492毫撤米下呈現 >0.1 0D值者表明僳亞型。 Η .望抶抗體之産製 - 被選擇以進一步評估之純糸，於組織培養之Τ燒瓶中擴大，並取1〇δ値細胞注入加Pristan前之B A L Β / C 老鼠之腹腔中（Charles River Biotechnical Servies ,Inc·，Wilmington，MA)(見 Hurrell，上文）。生成之腹水液於注射7—1◦天後回收，離心，再貯於一20 t：下。I g G抗體於Protein A上親和力純化（？1^1：111&-cia-LKB Biotechniques，Piscataway，NJ)利用自動式 ◦ R 0 S純化条統1 0 〇型（見Goding，上文，基本原則 )。IgG 抗體於 S-300 管柱上（Pharmacia-LKB ) 以分子大小純化。以下之鑑定資料均以經純化之單株抗體來進行。 I .等雷焦距（I E F ) _ 本紙5良尺度边用中a困家標準（CNS)甲4規格（210 X297公没） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 線· -58 - Λ 6 η 6 206235 五、發明説明（5》為確保冷凍品一致性之細胞株品質管制，包括有 IEF凝膠裝置上（Bio — Rad)偵測抗體之pI點，此裝置像依據電荷來分離蛋白質。簡言之，雙一丙烯酵胺-核糖黃素溶液填料至丙烯醛胺凝膠，曝於螢光燈下1 小時，再於41C下一夜。1徹克單株抗醱樣品及標準品覆於凝膠上，並電泳1 一 2小時。經一糸列固定及洗滌，凝膠以銀染色（Bi o — Rad)。單株抗體之p I值以經由凝膠之移動距離估計，且與已知PI值之標準品移動距離直接比較。有差異性的指紋成帶型式反映出抗體値別産生組之間P I微妙異質性（Hamilton，R.G. Peimer，C. B·，Rodkey，L . S · ( 1 9 8 7) Q u_a lity Control of murine monoclonal antibodies using isoelectric f ocu-sing affinity i mmunob lot analysis· Hgbr i doma 6 : 2 0 5 - 2 1 7 ) 0 J ♦翬株抗體之E I A及而方墨點持異件此處所示之所有的單株抗體，於可應用之各類重組體 HCV抗原上進行篩選，如美國專利第07/572, 8 2 2中所示的，標題為利用重組體蛋白質之C型肝炎分析，其享有共同所有權，並列為本案之參考。多重抗原篩選技術證實HCV特異性，並排除單株抗體之HCV非特異 CKS, ApL或連接子一臂之反應性。 K . E I A寿位競爭作用的研究本紙尺度边用中®國家標準（CNS)甲4規格（210x297公垃） (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線. -59 - 經濟部屮央捣準而Π工消疗合作fi.Lp;ii 200235 Λ 6 ____Η6_ 五、發明説明（58) 為檢査特異性及抗原結合之差異性，利用標記有生物素及未標記之單株抗體進行表位分組實驗（Langone & V- an Vunakis, Methods in Enzymology.9 2 : 242 — 2 5 3，AcadomicPress〔 1 9 8 3〕）。簡言之，抗藤擦記以 NHS-LC -生物素（Pierce Chomical Co·, Rockford，IL),依據操作指示。微滴定盤如前所述地塗覆以免疫原。首先，未標記抗體之l〇g2稀釋液，預共置於孔洞中歴15分鐘，之後加固定量之經生物素化之抗體 (於經生物素化抗體之直接EIA中之稀釋液單獨時可得最大吸收值之50%),並培育20分鐘。培養盤水洗三次。加經稀釋之鏈抗生物素一 HR-PO (Zymed, South San Francisco，CA)至孔洞，並培育30分。培養盤再次洗滌，且如前述地展開0PD之顔色。於492毫微米下讀取吸光度。相同或相關表位之抗體，其訊號受阻斷或抑制達50%以上。以不同特異性之抗體則不見抑制作用。對於在HCV核心區域内産製之抗體，互相進行此研究。 L . R I A交互競爭作用塗覆以適當抗原之珠粒或盤，與100徹升之未標記單株抗體共培育，後者以1〜20微克/毫升之單株抗體濃度稀釋於再鈣化之陰性人類血漿中（NHP,抗一 HCV,抗一 HIV及HBsAg陰性）。100微升之經放射標記之抗體，以1〜4微居里/毫升稀釋於 HTLV I套組之檢品稀釋液中（含去污劑，動物血清 (請先閲請背面之注意事項再塡寫本頁) 裝. *^τ' 線. 本紙张尺度逍用中S a家棕準(CNS)T4規格(210x297公及) -60 - 206235 Λ 6 ^_η 6 _ 五、發明説明（5¾ ，缓衝液），將之與珠粒置451下2小時或20 — 25 t：下1 8 — 20小時。珠粒洗滌，並計算放射活性。 M . H C V抗原分析塗覆有一種抗H C V單株抗體或其摻合物之珠粒，與 2〇0微升檢品共置於40 — 451：：下2小時或20 — 251C下18 — 20小時。珠粒以蒸餾水洗滌，再與 2 0 0微升經放射標記之抗一 HCV單株抗體（一種以上 )共置於45¾下2小時。珠粒洗滌，並於γ計數器上計數。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) N.單抶抗鵲夕鑣宙拮抗HCV 33C區域（1191-1457)的二組單株抗體競爭作用見於表1 0。此組可與HCV CKS-33C, CKS-33C-CORE，及 ApL -33C-CORE 融訂線經濟部中央標準·/1-JM工消费合作社卬!/i 综合於下表10之反應 H C V 33C蛋白質 534, 2列為6-9 1 0 7 0 - 1 1 0)；

合蛋白質反應。參考圖6—17, 性示於1及2列。1至3列含拮抗之單株抗體（1列為6 — 296 — 14 一 5 1 8及3列為6 — 4 — 6列含拮抗HCV 之單株抗體（4列為13 — 975 — 157，5 一 153 — 234,及 6 列為 14 一 1350- CORE 列為1 4 2 10) ;7及8列含拮抗假想的HCV ENV區之單株抗體（ 7列為 1 6 — 407 — 209,及 8 列為 16 — 8〇3_ 各紙张尺度通用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公及) -61 - Λ 6 η 6 206235 五、發明説明（6〇 17 4) ;9— 11列含拮抗HCV C- 100之單株抗體（9 列為 25 —1518 — 105, 10 列為 28- 7 3 5 - 3 5 5) ; 11列含CKS控鄗用單株抗體29 - 1 2 1 - 2 3 6) ; 12列含正常老鼠血清控制組；及 1 3列含負控制組。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝· 線· 表 1 0 抗一 Η C V -3 .s Γ：罝抶拚餺 Ε I Α及西方墨點反應性 λΡΙ·- CKS- 組別 ί細胞珠 „丨同型 CKS- 核心 XPL- 核心 33c- CKS- 33c- CKS- CKS- Rr,n Rrn □ n\^<^ 1 6-296-534 6.0 lgG1 k - - -+ 十 + - 〇 6-314-518 lgG2b k - - + + · + - . 經濟部屮央桴準工消圯合作社卬公實例1 5 抗一HCV — .Ί 3C：競番作用分析利用CKS-33C塗覆之珠粒（0. 1微克/毫升 )及經放射標記之1組（6 — 296 — 534)及2組（ 6 — 9 14 — 5 18)單株抗體偵測，來發展單步驟競爭分析。7份抗一 C 100偽陽性血清樣品及10份抗一 C 1 0 0真陽性血清樣品（得自Interstate Blood Ronk) ,利用本發明二種抗一 33C單株抗體測試（表2)。偽陽性檢品對任一單株抗體之抑制作用不超過2 5%。單株抗體6 — 296 — 534之結合幾乎為抗—C 一 1 0 ◦陽本紙尺度边用中國國家櫺準(CNS)甲4規格（210X297公垃） —62 一 206235 Λ 6 Β 6 五、發明説明（6$ 性檢品所完金抑制184 — 100%)。有趣的是，這些檢品均無法與2組單株抗體有效地競爭對3 3 C之結合 (0 — 24%抑制作用）。表1 1融合體之繼代純糸發展說明，以Ε I Α及 RIA競爭結合研究之可比較的反應性。 (請先閲讀背面之注意事項再構寫本頁) 經濟部屮央標準：工消奸合作让卬11 本紙張尺度边用中國國家標準4規格（210x297公及) -63 - 206235 66 Λπ 五、發明説明（6刁表 11 競爭性抗一HCV 33C分析德記物：6-296於HTLV I稀釋液檢品 CPM A\G N3 72473 70641 67993 71456 $3cr3m8门to n6gativ6 specimens S/N %抑制率結果 145 55325 0.78 21.7 - 1 46 65197 0.92 7.7 - 1 48 53705 0.76 24.0 - 149 57741 0.82 1 8.3 - 151 89301 1 .26 -26.4 - 1 52 8871 1 1.26 -25.6 - 154 67721 Sacramento positive specimens 0.96 4.1 * 147 5366 0,08 92.4 + 150 3351 0.05 95.3 + 153 240 0.00 99.7 + 156 1 28 0.00 99.8 + 159 3045 0.04 95.7 + 1 60 47 0.00 99.9 + 161 1 1 276 0.16 84.0 + 1 63 42 0.00 99.9 + 1 65 1076 0.02 98.5 + 1 67 66 0.00 99.9 + (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝· *31_ 線. 濟 -;!|i 屮央 It f

Ίϊ- 合li- I：P 本紙5fc尺度通用中a a家標準（CNS)甲4規格（210x297公及） -64 - 206235 Λ 6 Β 6 五、發明説明（63 標記物：6-914於HTLV I稀釋液 IN3 al4444555a(^45 5556666 S1111111S 檢 11 1111111 t0 nt Θ E a cr5 6 8 9 2 4 7 0 3 6 9 0 3 5 CPM AV3 32156 3401 34431 35444 negative specimens 3861 3 36134 35130 30137 36794 30860 34493 positive specimens CPM A\G 29573 3421 9 8 1 2 3 2 0 4 7 5 3 3 3 2 2 2 6 3 4 9 9 5 0 6 3 8 6 7 6 0 8 6 9 5 4 3 ο N s/ %抑制率 ^ 639811 10 0 8 0 9 0 i« J— ii Λυ J— ow i— 5 •2342 4 3 · · · · 3 . 16 3 18 · 1 ---1 - 9 . S/N %抑制率 0.87 13.0 1.01 -0.6 0.82 17.7 0.94 6.3 0.96 4.0 0.91 8.9 1 .02 -1.6 0.81 - 19.2 0.76 23.9 果结 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 線. 經濟部十央標準乃Π工消费合作iL.M," 本紙張尺度边用中國S家標準（CNS)甲4規格（210x297公及） _ 65 一 Λ 6 η 6 206235 五、發明説明（64 實例1 6 HCV_3 3C：杭原分析二步驟3 3C抗原R I A分析之結果示於表1 2。將 S/N值大於4.◦之分析檢品視為具反應性。此分析可偵測分別是CKS — 33C及I PL — 33C-C〇RE 於300毫微克/毫升及2· 0微克/毫時。7値檢品中的2値來自高的ALT及抗一C_10◦病人，對33C 抗原具有反應性。 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝- -^1_ 線- 經濟部屮央準人:1 工消 i'i· 合 M- 卬本紙张尺度边用中國S家標準(CNS)甲4規格(210x29了公.!i) -66 - 206235 Λ 6 η 6 五、發明説明（6与表 12H C V - 3 3 C Ag 分析 (B-91 4-51 8 珠粒 /6-296-534.6-1 070-1 1 0 標記物 > 檢品 bC CKS-33c 36 μς/σιΙ " 3.6 μς/ηιΙ Μ 360 ng/ml Ν 36 ng/ml " 3.6 ng/ml IPL-33C-CORE 248 μς/αιΙ Η 24.8 μς/ΓπΙ Ν 2.48 g/mi Μ 248 mg/ml Μ 24.8 ng/ml 高的ALT 2 7 w 238

Μ Ρ C 7820420103 115 5 11 7 7 2 9 0 28231601 32348510 9 2 3 7 3 16 8556310867 8 9 6 4 2 4 443355331144332 9 9 57023575 58152711 17 3

經濟屮央 l,t Λ 个I: 芈 U 工合 fi-丨:P 1 73 252 283 28 290 1 ο 75791553 30783307 6835331132 9 7 7 1 平均 S/N 结果 312 18125 58.09 + 5133 16.45 + 1340 4.29 + 412 1.32 - 321 1.03 - 5873 18.82 + 3545 1 1 .36 + 1369 4.39 + 471 1.51 - 331 1.06 - 1999 6.41 + 516 1.65 - 748 2.40 - 421 1 .35 - 383 1.23 - 1331 4.26 + 289 0.93 • (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· .11- 本紙5k尺度边用中H S家標準(CNS)甲4規格（210 X 297公垃) -67 - 206235 Λ 6 Η 6 經濟部+央榀準工消设合作-fi'-p% 五、發明説明（6§ 實例1 7 單抶抗鵲充作摻会物進行與實例1 6分析略變化之研究。此於步驟中，將三種抗一33C單株抗體（6—914一518, 6-296 — 534,及 6 — 1070—1 10)塗覆在珠粒上，並充作標記中之摻合物。無一抗一 C— 100重覆活性，或I BB陰性族群與所有檢品均具反應性，S/N值少於1 . 7。因此，本發明的新穎單株抗體可用於各種方式，這些單株抗體可用於經擴大産物之免疫沈澱作用，並偵測塗覆有抗一 HCV單株抗體之HCV核-酸微粒子或載體（固相 )，用來捕獲與HCV R N A有關之病毒或病毒蛋白質，其後可繼以R N A偵測方法。此方式型式之例子教示於美國專利案第07/568, 663,標題為、'擴大及偵測標的核酸序列之方法〃，其享有共同所有權且列為本案之參考。這些單株抗體地可用於HCV抗原於細胞中之定位，利用直接粘附之HCV單株抗體（螢光、膠態金，等），或使用二次粘附之抗一老鼠抗體。可追踪疾病之組織病理學。再者，血清、組織、細胞、培養基、或體液中天然或重組HCV抗原之偵測，可利用本發明個別單株抗體於三明治構型，或單株抗體摻合物於固相上，及於偵測糸統中〇也可進行利用拮抗非重叠表位之單株抗體之單步驟抗 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. ,ιτ. 線- 本紙?fc尺度逍用中國a家標準(CNS)甲4規格（210x297公及） -68 - 20623b fta6 經濟部屮央標準工消奸合作社卬!,,,4 五、發明説明（6? 原分析法。某些單株抗髏可確認不為感染個體確認之抗原性表位，因此可確認游離態或為人類抗體结合之血清Ag 。再者，檢品以去污劑或埋原劑或二者處理，可將〜隱性〃或阻礙之抗原或抗原決定子曝出。例如，CORE抗原可呈現為病毒包膜覆蓋之蛋白質殼型式。以去污劑除去包膜應可曝出CORE抗原。單株抗體也可提供較高效價多株抗體為實際之優點，即分析中有更高的敏感性，或使培育時間更短。再者，可發展抗髏免疫分析，一或二步驟競爭分析，其中抗一HCV與經標記之抗一HCV單株抗體競爭對有限抗原位置數目之結合。可發展更-敏感的競爭分析，其中人類抗一HCV結合至溶液中之HCV Ag,以阻斷或抑制HCV Ag三明治分析中HCV Ag之結合。利用單株抗體的競爭性分析，可更精確地定出人類抗體表位之輿圖，且可用於決定病毒中和抗體表位。某些單株抗體可有病毒中和活性。最後，單株抗體應可有於天然病毒及重組體HCV抗原及蛋白質之免疫親和力純化。産生本發明單株抗體之融合瘤，可鑑知為産生單株抗體H81C17之融分瘤H81C17,産生單株抗體 H35C54之融合瘤H35C54，産生單株抗體 H28C11〇之融合瘤H28C110,産生單株抗體 H4C20之融合瘤H4C20,産生單株抗體 HI1C130之融合瘤HI1C130,及産生單株抗體Η 1 C46之融合瘤Η 1 C46。融合瘤 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 、1Γ 線· 各紙张尺度边用中Η國家標準（CNS)甲4規格（210x297公及） 69 - 206235 Λ 6 Β 6 經濟部十央毕x;w工消赀合作社.卬¾ 五、發明説明（69 H28C110， H81C1?及H11C130貯置在美國標準菌種收集所，1 2 3 Ο 1 Parklawn Drive, R-ockville, Margland 20852， 1990 年 1〇月 30日，並有以下编號：H28C1 10為ATCC No. HB10587;H81C17 為 ATCC No. HB10588 及 H11C130 為 ATCC No. HB10589。融合瘤H35C54、 H4C20及Η 1 C46貯置在美國標準薗種收集所， 1 2 3 0 1 Park 1 awn Drive. Rockville，Margland 20852， 1990年10月31日，並有以下编號： H35C54 為 ATCC N〇..HB10592 ； H4C20 為 ATCC N〇.HB10593 及 H1C46 為 ATCC No. HB10594〇同時，産生本發明單株抗體之融合瘤細胞株，鑑知為融合瘤細胞株1 3 — 9 7 5 — 1 5 7 (産製單株抗髏13 —975— 157),融合瘤細胞株14 一 153 — 234 (産製單株抗體14 —153 — 234)及融合瘤細胞株14—1350 — 210 (産製單株抗體14一 1 350 — 2 1 0)。這些融合瘤細胞株貯置於美國標準菌種收集所，1 2 3 0 1 Pa r k 1 awn Dr i ve，Rockv i 1 i e， Margland 20852 於 1990 年 1 1 月 16 日，且有下列编號：融合瘤細胞株1 3 — 975 — 1 57為 ATCC No. HB10608,融合瘤細胞株14一 153-234，為 ATCC No. HB10604, 本紙張尺度边用中S國家榣準(CNS)甲4規格(2] 0 X 297公没) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝· 訂線. -70 - 206235 Λ 6 Η 6 五、發明說明（6$ 及融合瘤細胞株14一135◦—210為ATCC No. HB1〇602〇再者，分泌本發明單株抗體之融合瘤細胞株，鑑知為融合瘤細胞株6 - 296 — 534 (分泌單株抗體6 — 296—534)及融合瘤細胞株6-914一518 ( 分泌融合瘤細胞株6 — 9 1 4 — 5 1 8)。這些融合瘤細胞貯置在美國標準菌種收集所，1 2 3 0 1 Parklawn Drive. Rockville. Margland 2 0 8 5 2 , 1 9 9 0年 11月16日，依據以下编號：融合瘤細胞株6 — 296 一534, ATCC No. ΗΒ10607,及融合瘤細胞株 6 — 914 — 518, A T-C C No. Η B 1 0 6 0 0 〇此處提供之獨特單株抗體用法之其他變化包括：偵測免疫複合物中之HCV抗原，或藤而不具及/或隠性抗原，及/或與病毒核酸相關，以利用PCR, LCR,或直接雜交法來偵測核酸。本發明其他變化及處理修飾，如此中所示的對於精藝者應是顯而易見的。因此，本發依據所附之申請專利範圍予以限制。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -訂線，濟部屮央準 y-j ϋ 工消 ή·，〇. 卬本紙5k尺度边用中國S家標準(CNS)甲4規格(210x297公垃) -71 - 2002¾¾ Λ 6 Β6 五、發明説明（7()

ΜΛΒ ID 表 1 HCV蛋白質單株抗

ro?s&j0Ktt jemieG2mif EIAK價 asm合 λΛ ocsa 合蛋白質榍嫌蛋白質構《* _g谢攻/斜豪舰/JHL 同型栽争作用W/免表位待異性HCV 淸基因«fcaa H81C17 PHCV34 +++ +++ 16 (HCV-C0RE) H35CS4 PHCV34 +++ ++ 31

3.9 lgGl.K

7,8 lsGl.K 1-150 1-150 H28C110 PHCV23 +++ (HCV C-100) H4C20 PHCV23 +++ (HCV C-100) H11C130 PHCV29 ++十 (HCV 33C) H1C46 pHCV29 +++ (HCV 33C) 0.5 0.4 lgGl.K + 1702-1709 +++ 125 30 IgGl.K ++ 899-1930 ........................ .....F : 4 (請先閲讀背面之注意亊項再填寫本頁) 0.5 0.5 IsGl.K 十十十

0.5 63 leGl.K 1192-1339 1339-1457 經濟部屮央標準Aw工消费合作让卬^ 1. 數據反映毎一單株抗體之反應性，其中個別的免疫原以（a) CKS融合蛋白質，及（b)在λ PL·啓動基因下，無任何大勝桿菌中之融合蛋白質〇 +++表示強的反應性；+表示弱的反應性。 2. 數據反映每一戰嫩體之反應性.其免疫原如1中所述〇 E I A校價定義為單株抗體I s G蛋白質按毫撤以餅計之酿，《^4 9 2奄齡T«陰峨8^4倍:aiiBtSo 3. +++表示強的競争作用（>8 0%) ;+表示弱的競爭作用（約5 0%)。 4. 表位待異粒賊，«dSS例5及6臟幡多實驗為織本紙55：尺度边用中a國家標準（CNS)甲4規格（210x297公垃） -72 -

Claims

六、中鲭專則範圍 A7 B7 C7 D7 附件一 A:第80109191號;i利申請案

[^告中文申請專利範圍修正本民國82年3月修正經汫部屮央櫺準局貞工消费合作社印33. i，一種特異地結合至HCV蛋白質C—100且不會特異地結合至HCV蛋白質33C及CORE的單株抗體，其像由選自ATCC寄存编號HB10593及 10587組成之類群的融合瘤所分泌。 2，一種特異地結合至HCV蛋白質33C且不會特異地結合至HCV蛋白質C一10◦及CORE的單株抗體，其像由選自ATCC寄存編號HB10594、 HB10589、 HB10607及HB10600所組成之類群的融合瘤所分泌。 3. —種特異地結合至HCV蛋白質CORE且不會持異地結合至HCV蛋白質C一1◦0及33C的單株抗體，其像由選自ATCC寄存编號HB10592、 HB10588、HB10608、HB10604 及 Η B 1 0 6 0 2所組成之類群的融合瘤所分泌。 4. 一種於可能含有C型肝炎病毒之受試樣品中，測定C型肝炎病毒HCV C-100蛋白質，或HCV 33C蛋白質或HCV CORE蛋白質存在的方法，此方法包括： a.令受試樣品與抗一 HCV單株或多株抗體接觸，以形成混合物，該抗體可特異地結合至HCV C— (請先閱讀背fc之注意事項再填其本页} k. •綠· 本紙張尺度通用中因0家標準（CNS)甲4規格(210x297公釐） _ 1 _ A7 B7 C7 D7 206235 六、申請專利範团 (請先閱讀背面之注意事項再填窩本頁) 100蛋白質，或HCV 33C蛋白質或HCV CORE蛋白質，並被粘附在發生抗體特異地結合至 HCV蛋白質的固相之上，其中該單株抗體係由選自下列之融合瘤所分泌之單株抗體，包括：ATCC No. HB10593、HB10587、HB10 594、 HB10589、HB10592、HB10588、 HB10607、HB10600、HB10608、 HB10604 及 HB10602 ; b .在足以形成抗體/抗原複合物之條件下培育該混合物一段時間；經濟部屮央標準局貝工消费合作社印製 c .令該複合物與含有産生可偵測訊號之産訊化合物的指示試劑接觸，以形成一個第二混合物，該産訊化合物被粘附至HCV C — 10 ◦蛋白質，或HCV 3 3 C 蛋白質或HCV CORE蛋白質的抗一HCV單株或多株抗體，其中該單株抗體像由選自下列之融合瘤所分泌之單株抗體，包括：ATCC No. HB10593、 HB10587、HB10594、HB10589、 HB10592、HB10588、HB10607、 HB10600、HB10608、HB10604 及 HB10602,且該産訊化合物僳選自由發光化合物，化學發光化合物，酵素及放射活性元素所組成的類群； d .在足以形成抗體/抗原/抗體複合物之條件下培育該第二混合物一段時間； e .偵測産生之訊號以決定受試樣品中C型肝炎病毒 -2 - 本紙張尺度璁用中國B家橾準(CNS) «Ρ4規格(2丨0x297公*) r- A7 20623ο B7 C7

六、申請專利範00 之存在，其中HCV C—100蛋白質，或HCV 33C蛋白質，或HCV C〇RE蛋白質於受試樣品中之含量與該産生之訊號成比例。 5. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中（&)及 (c )步驟可同時進行。 6. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中粘附至固相之抗—HCV抗體是多株抗體。 7. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中該抗一 η CV抗體粘附至固相者為單株抗體。 8. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中指示試劑包括粘附至多株抗體之産訊化合物。 9. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中指示試劑包括粘附至單株抗體之産訊化合物。 10. —種決定受試樣品中可能存在之HCV抗體之存在及含量之競爭性分析法，此方法包括：經濟部屮央櫺準局员工消费合作社印製 (請先聞讀背而之注意事項再填寫本頁) a.將疑似含有HCV抗體之受試樣品與塗覆有 H C V 33C、C— 100 或HCV CORE 蛋白質之固相及指示試劑，在足以形成受試樣品與固相及/或指示試劑及固相之抗體/抗原複合物條件下接觸一段時間，該\指示試劑包括産訊化物及可特異地結合至該蛋白質的單株抗體，其中該單株抗體偽由選自下列之融合瘤所分泌之單株抗體，包括：ATCC No. HB10593. HB10587、HB10594、HB10589、 HB10592、HB10588、 HB10607、參紙張尺度適用中Ββ家«準（CNS)<P4規格（210x297公*) -3 - A7 B7 C7 D7 206235 六、申請專利範園 (請先閃讀背面之注意事Jfi再填"本頁) HB10600、HB10608、HB10604 及 HB1 0602,且該産訊化合物選自下列包括發光化合物，化學發光化合物，酵素及放射活性元素之類群； b.決定受試樣品中HCV抗體之存在，像偵測指示試劑與固相之結合與由陰性受試樣品産生之訊號比較下有減少，以顯示受試樣品中HCV抗體之存在。 1 1 . 一種用於偵測受試樣品中H C V存在之分析套組，包括：一種容器含有可特異結合至HCV C— 100蛋白質，HCV 33C蛋白質或HCV CORE蛋白質之單株抗體，其中該單株抗體傺由選自下列之融合瘤所分泌的，包括：ATCC No. HB10593、HB10587、HB10594、 HB10589、HB10 592、HB10588、 HB106 0 7、 HB10600、 HB10 608、 HB10604及HB10602,或其組合。 1 2 . —種單株抗體，選自下列包括：ATCC No. HB10 593、HB10587、經濟部屮央櫺準局員工消贽合作社印製 •線· HB1 〇 594、 HB1 0 589、 HB10592、 HB10 588、HB10607、HB10600、 HB10 608、 HB10 604 及 HB10602。本紙張尺度適用中B國家標準(CNS)甲4規格(210x297公嫠)