TW202406557A - 治療杜興氏肌肉失養症之方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了使用經修飾之反股寡核苷酸治療杜興氏肌肉失養症或延遲其發作之方法。

Description

治療杜興氏肌肉失養症之方法
本文提供治療杜興氏肌肉失養症(DMD)或延遲其發作之方法。在一個實施例中，該等方法包括向患有DMD之個體投與經修飾之寡核苷酸。
反股寡核苷酸(AON)正處於許多疾病及疾患之臨床(前)開發階段，包括癌症、炎症性疾患、心血管疾病以及神經退化及神經肌肉病症。其作用機制針對細胞核或細胞質中之各種靶標(例如經RNA酶H介導之靶RNA降解)、細胞核中之剪接調節(外顯子包含或跳躍)或藉由細胞質中核醣體次單位結合之空間位阻進行之轉譯抑制。最初描述了剪接調節或剪接轉換AON用於校正人類β-珠蛋白前驅mRNA中之異常剪接(Dominski及Kole PNAS, 1993, 90(18):8673-8677)，且目前正在研究多種遺傳病症。
AON在神經肌肉病症杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)及貝克氏肌肉失養症(Becker muscular dytrophy，BMD)之治療中得到廣泛研究。杜興氏肌肉失養症(DMD)及貝克氏肌肉失養症(BMD)係最常見形式的兒童期肌肉失養症。DMD係一種嚴重、致命的神經肌肉病症，導致在12歲前依賴輪椅支撐，且患者通常在三十歲前死於呼吸或心力衰竭。它係由一或多個外顯子之閱讀框移位缺失(約67%)或重複(約7%)引起，或由2.24 Mb肌肉萎縮蛋白基因中之點突變(約25%)引起，導致功能性肌肉萎縮蛋白缺失。BMD亦係由肌肉萎縮蛋白基因突變引起，但此等突變維持開放閱讀框，產生半功能性肌肉萎縮蛋白，並導致表型通常更溫和且壽命更長。
迄今為止，已批准四種AON用於治療DMD：依特普森(eteplirsen)、戈洛迪森(golodirsen)、卡西默森(casimersen)及維托拉森(viltolarsen)。然而，此等藥物之功效有限，且各藥物僅經批准用於治療一小部分DMD患者。
因此，持續需要治療DMD之方法。
本文提供了治療DMD或延遲其發作之方法，其藉由向患有DMD之個體投與經修飾之寡核苷酸來進行。在一個實施例中，經修飾之寡核苷酸係反股寡核苷酸(AON)。
相關申請案
本申請案主張2022年5月5日提交之美國臨時專利申請案第63/364260號及2022年12月16日提交之美國臨時專利申請案第63/387,733號之優先權益。各上文引用之申請案之揭示內容均以引用方式整體併入本文。 序列表
本申請案含有作為名為「035105WO.xml」之XML文件一起提交之序列表，該序列表創建於2023年4月26日，大小為11,646位元組，以引用方式整體併入本文。 I. 定義
為了便於理解本文闡述之揭示內容，下文定義了多個術語。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與熟悉此項技藝者通常理解相同的含義。所有專利、申請案、已公佈申請案及其他出版物以引用方式整體併入。若本文之術語有複數個定義，除非另有說明，否則以本章節中之定義為準。
除非上下文另有明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數引用。
如本文所用，「個體(subject)」係動物，例如哺乳動物，包括人類，例如患者。
如本文所用，生物活性係指化合物之活體內活性或在活體內投與化合物、組合物或其他混合物後產生之生理反應。因此，生物活性包括此類化合物、組合物及混合物之治療效果及藥物動力學行為。可以在設計用於測試此類活性之活體外系統中觀測生物活性。
如本文所用，治療係指疾病或病症之一或多種症狀得到改善或以其他方式有益地改變之任何方式。治療亦包括本文之組合物之任何醫藥用途，例如用於治療DMD之用途。
如本文所用，藉由投與特定化合物或醫藥組合物改善特定病症之症狀係指可歸因於化合物或醫藥組合物之投與或與其相關之任何減輕，無論係永久或暫時的、持久或短暫的。
如本文所用，除非另有說明，否則術語「管理(manage、managing及management)」包括預防特定疾病或病症在已經患有該疾病或病症之個體中複發及/或延長患有該疾病或病症之個體保持緩解之時間。該等術語包括調節疾病或病症之閾值、發展及/或持續時間，或改變個體對疾病或病症之反應方式。 II. 用於本文所提供之方法中之AON
在一個實施例中，用於本文所提供之方法中之AON與人類肌肉萎縮蛋白前驅mRNA之外顯子51之一部分反向互補。在另一個實施例中，用於本文所提供之方法中之AON具有序列5'-gguaaguucuguccaagc-3' (SEQ ID NO: 1)且含有修飾。在另一個實施例中，用於本文所提供之方法中之AON具有序列5'- gguaa guuc*uguc*c*aag c*-3' (SEQ ID NO: 2)，其中c*係5-甲基胞嘧啶且 g及 c*係LNA核苷酸。如本文所用，LNA核苷酸具有以下結構： 其中B係核鹼基，且L係與另一個核苷酸之磷酸酯或硫代磷酸酯鍵。
在另一個實施例中，用於本文所提供之方法中之AON具有序列TEG-5'- gguaa guuc*uguc*c*aag c*-3'，其中c*係5-甲基胞嘧啶， g及 c*係LNA核苷酸，且TEG係三乙二醇基團。在另一個實施例中，用於本文所提供之方法中之AON具有序列TEG-5'- gguaa guuc*uguc*c*aag c*-3'，其中c*係5-甲基胞嘧啶， g及 c*係LNA核苷酸，TEG係經由磷酸基團連接到5'末端之三乙二醇基團，核苷間鍵係硫代磷酸酯鍵，且非LNA核苷酸係2'-OMe核苷酸(在本文中稱為「AON1」)。參見WO 2022/069511 A1及US 2022/0098586 A1。 III. 治療DMD之方法
本文提供了治療DMD或延遲其發作之方法，其藉由向患有DMD之個體投與經修飾之寡核苷酸來進行。在一個實施例中，經修飾之寡核苷酸係反股寡核苷酸(AON)。在另一個實施例中，AON係本文所揭示之AON。在另一個實施例中，AON係AON1。在另一個實施例中，提供了一種治療DMD之方法，其藉由向患有DMD之個體投與AON1來進行。在另一個實施例中，提供了一種延遲DMD發作之方法，其藉由向患有DMD之個體投與AON1來進行。
在某些實施例中，AON係以0.4 mg/kg、0.6 mg/kg、0.8 mg/kg、1.5 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg、9 mg/kg、12 mg/kg或18 mg/kg之劑量投與。在另一個實施例中，AON係經QW投與。在另一個實施例中，AON係經QWx15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35W投與。在另一個實施例中，AON係經QWx24W或QWx25W投與。在另一個實施例中，AON係經QWx25W投與。在另一個實施例中，AON係經QWx24W投與。
在某些實施例中，AON1係以0.4 mg/kg、0.6 mg/kg、0.8 mg/kg、1.5 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg、9 mg/kg、12 mg/kg或18 mg/kg之劑量投與。在另一個實施例中，AON1係經QW投與。在另一個實施例中，AON1係經QWx15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35W投與。在另一個實施例中，AON1係經QWx24W或QWx25W投與。在另一個實施例中，AON1係經QWx25W投與。在另一個實施例中，AON1係經QWx24W投與。
在另一個實施例中，AON1係經6 mg/kg QWx25W投與。在另一個實施例中，AON1係經18 mg/kg QWx25W投與。
在另一個實施例中，提供了一種治療DMD之方法，其藉由以6 mg/kg QWx24W投與AON1來進行。在另一個實施例中，提供了一種治療DMD之方法，其藉由以18 mg/kg QWx24W投與AON1來進行。在另一個實施例中，提供了一種延遲DMD發作之方法，其藉由以6 mg/kg QWx24W投與AON1來進行。在另一個實施例中，提供了一種延遲DMD發作之方法，其藉由以18 mg/kg QWx24W投與AON1來進行。
在某些實施例中，與治療DMD或延遲其發作之現有方法相比，本文所提供之方法產生優異結果。在一個實施例中，本文所提供之方法誘導相關疾病修飾生物標誌物朝向標準化之變化。在另一個實施例中，本文所提供之方法誘導疾病相關臨床及解剖肌肉病理學朝向標準化之變化。在另一個實施例中，如在運動功能評估儀/步態得分中量測，本文所提供之方法部分或幾乎完全挽救DMD表型。在另一個實施例中，本文所提供之方法增加了肌肉萎縮蛋白產生。在另一個實施例中，本文所提供之方法增加了人類肌肉萎縮蛋白前驅mRNA外顯子51跳躍。在另一個實施例中，該等方法減輕了DMD之一或多種症狀。
使用本文所提供之AON減輕個體之DMD之一或多種症狀可以藉由任何以下檢定來評估：失去行走之時間之延長、肌肉強度之改善、舉重能力之改善、自地板上站起所花時間之改善、九米步行時間之改善、爬四級樓梯所花時間之改善、腿部功能等級之改善、肺功能之改善、心臟功能之改善、生活質量之改善。此等檢定各自均係熟悉此項技藝者已知的。對於此等檢定中之各者，一旦發現檢定中量測之參數之可偵測性改善或延長，通常意指使用本文所提供之AON已減輕了個體之DMD之一或多種症狀。在一個實施例中，可偵測性改善或延長係統計學上顯著之改善或延長，如Hodgetts等人 Neuromuscular Disorders 2006; 16: 591-602中所述。或者，可以藉由量測肌肉纖維功能、完整性及/或存活之改善來評估DMD之一或多種症狀之減輕。在另一個實施例中，DMD患者之一或多種症狀得到緩解且/或來自DMD患者之一或多種肌肉細胞之一或多種特徵得到改善。此類症狀或特徵可以在細胞、組織水準下或對患者自身進行評估。
可以藉由對來自患者之肌原細胞或肌肉細胞進行以下任何檢定來評估來自患者之肌肉細胞之一或多個特徵的緩解：肌肉細胞對鈣之攝取減少、膠原蛋白合成降低、形態發生改變、脂質生物合成發生改變、氧化壓力降低及/或肌肉纖維功能、完整性及/或存活得到改善。此等參數通常使用免疫螢光及/或肌肉活檢物橫截面之組織化學分析來評估。
可以使用至少一種以下檢定來評估肌肉纖維功能、完整性及/或存活之改善：血液中肌酸激酶之可偵測性降低、肌肉活檢物橫截面中疑似營養不良之肌肉纖維壞死之可偵測性降低及/或在肌肉活檢物橫截面中疑似營養不良之肌肉纖維直徑之可偵測性均勻性增加。此等檢定各自均係熟悉此項技藝者已知的。
如Hodgetts等人(2006)所述，可以在血液中偵測到肌酸激酶。肌酸激酶之可偵測性降低可意指與同一位DMD患者在治療前之肌酸激酶濃度相比降低5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。
通常在肌肉活檢物中使用活檢物橫截面評估肌肉纖維壞死之可偵測性降低，諸如Hodgetts等人(2006)中所述。壞死之可偵測性降低可以係使用活檢物橫截面來鑑定壞死之面積降低5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。藉由與同一DMD患者在治療前評估之壞死相比較來量測降低。
通常在肌肉活檢橫截面中評估肌肉纖維直徑均勻性之可偵測性增加，如Hodgetts等人( 同上)所述。藉由與同一DMD患者在治療前之肌肉纖維直徑之均勻性進行比較來量測增加。
在一個實施例中，本文所提供之AON為該個體提供功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白，且能夠至少部分地降低該個體中異常肌肉萎縮蛋白之產生。
在一個實施例中，為個體提供功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白意指功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白之產生增加。增加功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白mRNA或功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白之產生意指與功能性或半功能性mRNA或功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白之初始量相比，可偵測性增加了5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、140%、160%、180%、200%或更多或至少此等量，如可藉由RT-數字微滴PCR (mRNA) (Verheul等人, PLoS ONE 2016, 11(9):e0162467)或免疫螢光法(Beekman等人, PLoS ONE 2014; 9(9): e107494)、西方墨點法或毛細管西方免疫檢定法(Beekman等人, PLoS ONE 2018; 13(4): e0195850)分析(蛋白質)偵測的。在另一個實施例中，該初始量係在細胞、器官、組織及/或個體中開始使用本發明之化合物誘導肌肉萎縮蛋白前驅mRNA之外顯子跳躍時功能性或半功能性mRNA或功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白之量。
降低異常肌肉萎縮蛋白mRNA或異常肌肉萎縮蛋白之產生意指仍可藉由RT數字微滴PCR (mRNA)或免疫螢光、西方墨點法或毛細管西方免疫檢定(Wes)分析(蛋白質)偵測到異常肌肉萎縮蛋白mRNA或異常肌肉萎縮蛋白之初始量的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更少。在一個實施例中，該初始量係在細胞、器官、組織及/或個體中開始使用本發明之AON誘導肌肉萎縮蛋白前驅mRNA之外顯子跳躍時異常肌肉萎縮蛋白mRNA或異常肌肉萎縮蛋白之量。異常肌肉萎縮蛋白mRNA或蛋白質在本文中亦稱為功能較弱(與野生型功能性肌肉萎縮蛋白相比)或非功能性肌肉萎縮蛋白mRNA或蛋白質。非功能性肌肉萎縮蛋白係不能結合肌動蛋白及/或DGC蛋白複合物成員之肌肉萎縮蛋白。非功能性肌肉萎縮蛋白或肌肉萎縮蛋白mRNA通常不具有或不編碼具有該蛋白質之完整C末端之肌肉萎縮蛋白。功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白mRNA或蛋白質之偵測可以如同偵測異常肌肉萎縮蛋白mRNA或蛋白一樣進行。
一旦為DMD患者提供了功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白，至少部分DMD病因被消除。因此，預期DMD之症狀至少部分得到緩解，或者症狀惡化之速度會降低，從而導致下降速度減慢。跳躍頻率增強亦增加了DMD個體肌肉細胞中產生之功能性或半功能性肌肉萎縮蛋白之水準。 IV. 用於該等方法中之醫藥組合物
本文所提供之醫藥組合物含有治療有效量之一或多種本文所提供之AON及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
AON可以經調配成合適的醫藥製劑，例如溶液、懸浮液、粉末、用於眼科或非經腸投與之無菌溶液或懸浮液以及透皮貼劑製劑。通常，使用此項技術中熟知之技術及程序將本文所描述之AON調配成醫藥組合物(參見例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 第七版1999)。
在組合物中，將有效濃度之一或多種化合物或醫藥學上可接受之鹽與合適的藥用載劑或媒劑混合。在某些實施例中，組合物中AON之濃度有效用於在投與後遞送治療、預防或改善本文所揭示之疾病或病症之一或多種症狀及/或進展的量。
通常，組合物經調配用於單劑量投與。為了調配組合物，將重量分數之化合物以有效濃度溶解、懸浮、分散或以其他方式混合於所選媒劑中，使得所治療之疾患得到緩解或改善。適用於投與本文所提供之AON之藥用載劑或媒劑包括熟悉此項技藝者已知適用於特定投與方式之任何此類載劑。
此外，AON可以作為唯一醫藥活性成分經調配於組合物中或可以與其他活性成分組合。脂質體懸浮液，包括組織靶向脂質體，亦可適合作為醫藥學上可接受之載劑。此等可以根據熟悉此項技藝者已知之方法製備。例如，可以如此項技術中已知地製備脂質體調配物。簡言之，脂質體諸如多層囊泡(MLV)可以藉由在燒瓶內部乾燥卵磷脂醯膽鹼及腦磷脂醯絲胺酸(7:3莫耳比)來形成。添加本文所提供之化合物於不含二價陽離子之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之溶液，並搖動燒瓶直至脂質膜分散。將所產生之囊泡洗滌以去除未經封裝之化合物，藉由離心沉澱，且然後重懸於PBS中。
將活性化合物包括在醫藥學上可接受之載劑中，其量足以在對所治療之個體無不良副作用之情況下發揮治療有用之作用。治療有效濃度可以藉由在本文所描述之活體外及活體內系統中測試AON來憑經驗確定，且然後由其推斷用於人類之劑量。在一些實施例中，AON以達成藥物之治療有效濃度之方法投與。在一些實施例中，伴隨診斷(參見例如Olsen D及Jorgensen J T, Front. Oncol., 2014年5月16日, 4:105, doi: 10.3389/fonC.2014.00105)用於確定活性化合物在特定個體或個體群體中之治療濃度及安全特徵。
醫藥組合物中AON之濃度將取決於活性化合物之吸收、組織分佈、失活及排泄速率、化合物之理化特性、給藥方案及投與量以及熟悉此項技藝者已知之其他因素。例如，遞送之量足以改善本文所揭示之疾病或病症之一或多種症狀。
在某些實施例中，治療有效劑量應產生約0.1 ng/mL至約50-100 μg/mL之活性成分的血清濃度。在一個實施例中，醫藥組合物提供每天每公斤體重約0.001 mg至約2000 mg化合物之劑量。製備醫藥劑量單位形式，以提供每個劑量單位形式約1 mg至約1000 mg，且在某些實施例中，提供約10至約500 mg之必需活性成分或必需成分之組合。
AON可以一次投與，或可以分成許多較小劑量以一定時間間隔投與。應當理解，精確劑量及治療持續時間係正在治療之疾病之函數且可以使用已知測試方案或藉由自 活體內或 活體外測試資料外推來憑經驗確定。應注意，濃度及劑量值亦可能隨著要緩解之疾患之嚴重性而變化。應進一步理解，對於任何特定個體，具體劑量方案應根據個體需要及投與組合物或監督組合物投與之人員之專業判斷而隨時間調整，且本文中列出之濃度範圍僅係示範性的，並不旨在限制要求保護之組合物之範圍或實踐。
因此，將有效濃度或量之一或多種本文所描述之AON或其醫藥學上可接受之鹽與用於全身、外部或局部投與之合適的藥用載劑或媒劑混合以形成醫藥組合物。AON以有效用於改善一或多種症狀或用於治療、延緩進展或預防之量包括在內。組合物中活性化合物之濃度將取決於活性化合物之吸收、組織分佈、失活、排泄速率、給藥方案、投與量、特定調配物以及熟悉此項技藝者已知之其他因素。
組合物旨在藉由合適的途徑投與，包括但不限於非經腸、皮下、靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、真皮、經皮或經頰。
用於非經腸、皮內或皮下應用之溶液或懸浮液可包括任何以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、二甲基乙醯胺或其他合成溶劑；抗微生物劑，諸如苯甲醇及對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸及亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝液，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽及磷酸鹽；以及用於調節張力之劑，諸如氯化鈉或右旋糖。非經腸製劑可以封裝在由玻璃、塑料或其他合適材料製成之安瓿、筆、一次性注射器或單劑量或多劑量小瓶中。
在AON表現出溶解度不足之情況下，可以使用用於溶解AON之方法。此類方法係熟悉此項技藝者已知的，且包括但不限於使用共溶劑諸如二甲基亞碸(DMSO)、使用表面活性劑諸如TWEEN®或溶解在碳酸氫鈉水溶液中。
在混合或添加AON時，所得混合物可以係溶液、懸浮液、乳液或類似者。所得混合物之形式取決於許多因素，包括預期投與方式及AON於所選載劑或媒劑中之溶解度。有效濃度足以改善所治療之疾病、病症或疾患之症狀且可以憑經驗確定。
醫藥組合物以單位劑型提供用於向人類及動物投與，該等劑型諸如粉劑、顆粒、無菌非經腸溶液或懸浮液及含有合適量之AON或其醫藥學上可接受之鹽的油水乳液。醫藥治療活性AON及其鹽類以單位劑型或多個劑型調配及投與。如本文所用，單位劑量形式係指適用於人類及動物對象並如此項技術中已知地單獨包裝之物理離散單位。各單位劑量含有足以產生所需治療效果之預定量之治療活性化合物，以及所需藥用載劑、媒劑或稀釋劑。單位劑量形式之實例包括安瓿及注射器以及經單獨包裝之錠劑或膠囊。單位劑量形式可以分多個部分或多次投與。多劑量形式係包裝在單個容器中之複數個相同單位劑型，以分開的單位劑量形式投與。多個劑量形式之實例包括小瓶、錠劑或膠囊瓶或品脫或加侖瓶。因此，多劑量形式係在包裝中未分開之多個單位劑量。
亦可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有本文所提供之化合物的固體疏水性聚合物之半透性基質，該基質係呈成形製品，例如薄膜或微膠囊之形式。持續釋放基質之實例包括離子電滲療法貼劑、聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯、L-麩胺酸及L-麩胺酸乙酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT™ (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸能夠釋放分子超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質之時間更短。當經封裝化合物長時間保留於體內時，它們可能會因暴露於37℃水分而變性或聚集，從而導致生物活性喪失並可能發生結構變化。可以根據所涉及之作用機制設計合理策略以實現穩定。例如，若發現聚集機制係透過硫-二硫化物交換形成分子間S--S鍵，則可以藉由修飾巰基殘基、自酸性溶液中凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組成來達成穩定。
可以製備含有0.005%至100%範圍內之活性成分且餘量由無毒載劑組成之劑型或組合物。此類組合物包括溶液、懸浮液、粉末及持續釋放調配物，例如但不限於植入物及微囊化遞送系統，以及可生物降解的生物相容性聚合物，例如膠原蛋白、乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸等。用於製備此等組合物之方法係熟悉此項技藝者已知的。所預期之組合物可含有約0.001% 100%之活性成分，在某些實施例中，約0.185%或約75-95%。
活性AON或醫藥學上可接受之鹽可以與保護化合物免於自體內快速消除之載劑，例如延時釋放調配物或包衣一起製備。
組合物可包括獲得所需特性組合之其他活性AON。本文所提供之AON或其醫藥學上可接受之鹽亦可以有利地與此項技術中已知對治療一或多種上文提及之疾病或醫學疾患(諸如與氧化壓力相關之疾病)具有價值之另一種藥劑一起投與以用於治療或預防目的。應當理解，此類組合療法構成了本文所提供之組合物及治療方法之另一態樣。 A. 注射劑、溶液及乳液
在本文中亦涵蓋非經腸投與，其通常以皮下、肌內或靜脈內註射為特徵。注射劑可以常規形式，以液體溶液或懸浮液、適用於在註射前成為液體溶液或懸浮液之固體形式或以乳劑形式製備。在一些實施例中，懸浮液係微粒或奈米粒子之懸浮液。在一些實施例中，乳液係微粒或奈米粒子之乳液。合適的賦形劑例如係水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，若需要，欲投與之醫藥組合物亦可以含有少量無毒輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解增強劑及其他此類劑，例如乙酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及環糊精。植入緩慢釋放或持續釋放系統，使得維持恆定劑量水準亦涵蓋在本文中。簡言之，本文所提供之AON分散在固體內部基質中，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑聚氯乙烯、增塑尼龍、增塑聚對苯二甲酸乙二醇酯、天然橡膠、聚異戊二烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、矽橡膠、聚二甲基矽氧烷、矽樹脂碳酸酯共聚物、經不溶於體液中之外部聚合物膜包圍之親水性聚合物(諸如丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯之水凝膠、膠原蛋白、交聯聚乙烯醇及交聯部分水解之聚乙酸乙烯酯)，該外部聚合物膜例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、矽橡膠、聚二甲基矽氧烷、氯丁橡膠、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯與乙酸乙烯酯之共聚物、偏二氯乙烯、乙烯及丙烯、離聚物聚對苯二甲酸乙二醇酯、丁基橡膠、環氧氯丙烷橡膠、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物及乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。AON在釋放速率控制步驟中擴散透過外部聚合物膜。此類非經腸組合物中所含活性AON之百分比高度取決於其具體性質以及該化合物之活性及個體之需要。
組合物之非經腸投與包括靜脈內、皮下及肌內投與。用於非經腸投與之製劑包括準備註射之無菌溶液、準備在使用前與溶劑組合之無菌乾燥可溶性產品(例如凍乾粉劑，包括皮下注射錠劑)、準備註射之無菌懸浮液、準備在使用前與媒劑組合之無菌乾燥不溶性產品及無菌乳液。溶液可以係水性或非水性的。
若靜脈內投與，合適的載劑包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及含有增稠劑及增溶劑(例如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及其混合物)之溶液。
用於非經腸製劑中之醫藥學上可接受之載劑包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮劑及分散劑、乳化劑、多價螯合劑或螯合劑及其他醫藥學上可接受之物質。
水性媒劑之實例包括氯化鈉注射液、林格注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸林格注射液。非水性非經腸媒劑包括植物來源之不揮發油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。必須將抑細菌或抑真菌濃度之抗微生物劑添加到包裝在多劑量容器中之非經腸製劑中，此等製劑包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、氯化苄烷銨及氯化苯索寧。等滲劑包括氯化鈉及右旋糖。緩衝液包括磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因。懸浮劑及分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯吡咯烷酮。乳化劑包括聚山梨酯80 (TWEEN®80)。金屬離子之多價螯合劑或螯合劑包括EDTA。藥用載劑亦包括用於水混溶性媒劑之乙醇、聚乙二醇及丙二醇，及用於調節pH之氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。
調節醫藥活性AON之濃度，以使得注射提供產生所需藥理學效應之有效量。確切劑量取決於個體或動物之年齡、體重及狀況，如此項技術中已知的。
單位劑量之非經腸製劑包裝在安瓿、小瓶或帶針之注射器中。如此項技術中已知及實踐的，所有用於非經腸投與之製劑必須係無菌的。
說明性地，靜脈內或動脈內輸注含有活性AON之無菌水溶液係一種有效投與方式。另一個實施例係含有根據需要注射以產生所需藥理學效應之活性AON的無菌水性或油性溶液或懸浮液。
注射劑經設計用於局部及全身投與。通常，治療有效劑量經調配以含有到治療組織中之濃度為至少約0.1%w/w至約90%w/w或更高，例如超過1%w/w的活性AON。活性AON可以一次投與，或可以分成許多較小劑量以一定時間間隔投與。應當理解，精確劑量及治療持續時間係正在治療之組織之函數且可以使用已知測試方案或藉由自活體內或活體外測試資料外推來憑經驗確定。應注意，濃度及劑量值亦可能隨著接受治療之個體之年齡而變化。應進一步理解，對於任何特定個體，具體劑量方案應根據個體需要及投與調配物或監督調配物投與之人員之專業判斷而隨時間調整，且本文中列出之濃度範圍僅係示範性的，並不旨在限制要求保護之調配物之範圍或實踐。
AON可以微粉化或其他合適形式懸浮，或者可以經衍生化以產生更易溶解的活性產物或產生前驅藥。所得混合物之形式取決於許多因素，包括預期投與方式及化合物於所選載劑或媒劑中之溶解度。有效濃度足以改善疾患之症狀且可以憑經驗確定。 B. 凍乾粉劑
本文亦提供了凍乾粉劑，其可以經重構用於以溶液、乳液及其他混合物形式投與。它們亦可以經重構並調配成固體或凝膠。
藉由將本文所提供之AON或其醫藥學上可接受之鹽溶解在合適的溶劑中來製備無菌凍乾粉劑。溶劑可含有改善穩定性之賦形劑或粉劑或由該粉劑製備之重構溶液之其他藥理成分。可以使用之賦形劑包括但不限於右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合適的劑。溶劑亦可以包含緩衝液，例如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或熟悉此項技藝者已知之其他此類緩衝液，在一個實施例中，pH為約中性。隨後對溶液進行無菌過濾，然後在熟悉此項技藝者已知之標準條件下凍乾，提供所需調配物。通常，將所得溶液分裝到小瓶中用於凍乾。各小瓶將含有單劑量(包括但不限於10-1000 mg或100-500 mg)或多劑量之化合物。凍乾粉劑可在適當條件，例如約4℃至室溫下儲存。
用注射用水重構該凍乾粉劑提供了用於非經腸投與之調配物。對於重構，每mL無菌水或其他合適載劑添加約1-50 mg、約5-35 mg或約9-30 mg之凍乾粉劑。精確量取決於所選化合物。此量可以憑經驗確定。 C. 局部投與
如對於局部及全身投與所述地製備局部混合物。所得混合物可以係溶液、懸浮液、乳液或類似者，並經調配成乳膏、凝膠、軟膏、乳液、溶液、酏劑、洗劑、懸浮液、酊劑、糊劑、泡沫劑、氣霧劑、灌注劑、噴霧劑、栓劑、繃帶、皮膚貼劑或適合局部投與之任何其他調配物。
化合物可以經調配用於局部(local或topical)應用，諸如以凝膠、乳膏及洗劑形式局部應用於皮膚及黏膜，例如眼睛，及用於應用於眼睛或用於腦池內或脊柱內應用。考慮局部投與以用於透皮遞送且亦用於向眼睛或黏膜投與，或用於吸入療法。亦可以投與單獨活性化合物之鼻溶液或其與其他醫藥學上可接受之賦形劑之組合。
此等溶液，特別係旨在用於眼科用途之彼等溶液，可以經調配成含有適當鹽之0.01%-10%等滲溶液，pH約5-7。 D. 持續釋放組合物
本文所提供之AON可以藉由控制釋放方式或熟悉此項技藝者熟知之遞送裝置投與。實例包括但不限於以下專利中所述之彼等實例：美國專利第3,845,770號；第3,916,899號；第3,536,809號；第3,598,123號；及美國專利第4,008,719號、第5,674,533號、第5,059,595號、第5,591,767號、第5,120,548號、第5,073,543號、第5,639,476號、第5,354,556號、第5,639,480號、第5,733,566號、第5,739,108號、第5,891,474號、第5,922,356號、第5,972,891號、第5,980,945號、第5,993,855號、第6,045,830號、第6,087,324號、第6,113,943號、第6,197,350號、第6,248,363號、第6,264,970號、第6,267,981號、第6,376,461號、第6,419,961號、第6,589,548號、第6,613,358號、第6,699,500號及第6,740,634號，該等專利各自以引用方式併入本文。可以使用此類劑型，以使用例如羥丙基甲基纖維素、其他聚合物基質、凝膠、滲透膜、滲透系統、多層包衣、微粒、脂質體、微球或其組合提供一或多種活性成分之緩慢釋放或控制釋放，以提供不同比例之所需釋放曲線。可以容易地選擇熟悉此項技藝者已知之合適的控制釋放調配物，包括本文所描述之彼等調配物，以用於本文所提供之活性成分。
所有控制釋放醫藥產品均具有改善藥物治療，使其優於非受控制釋放對應物之共同目標。在一個實施例中，經最佳設計之控制釋放製劑在醫學治療中之用途之特徵在於使用最少藥物物質在最短時間內治癒或控制疾患。在某些實施例中，控制釋放調配物之優點包括延長藥物活性、降低劑量頻率及增加個體依從性。此外，控制釋放調配物可用於影響起效時間或其他特性，例如藥物之血液水準，且因此可影響副作用(例如不良)之發生。
大多數控制釋放調配物經設計以最初釋放一定量之藥物(活性成分)以迅速產生所需治療效果，然後逐漸並持續釋放其他量之藥物以在延長時間段內維持該水準之治療或預防作用。為了在體內維持該恆定藥物水準，藥物自劑型中釋放之速度必須能夠替代自體內代謝及排泄之藥物量。AON之控制釋放可以藉由各種條件來刺激，該等條件包括但不限於pH、溫度、酶、水或其他生理條件或化合物。
在某些實施例中，AON可以使用靜脈內輸注、植入式滲透泵、透皮貼劑、脂質體或其他投與方式來投與。在一個實施例中，可以使用泵(參見Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)；Buchwald等人, Surgery 88:507 (1980)；Saudek等人, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)。在另一個實施例中，可以使用聚合物材料。在又一個實施例中，控制釋放系統可以放置在治療目標附近，亦即因此僅需要一部分全身劑量(參見例如Goodson, Medical Applications of Controlled Release, 第2卷, 第115-138頁(1984)。
在Langer (Science 249:1527-1533 (1990)之評論中討論了其他控制釋放系統。AON可以分散在固體內部基質中，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑聚氯乙烯、增塑尼龍、增塑聚對苯二甲酸乙二醇酯、天然橡膠、聚異戊二烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、矽橡膠、聚二甲基矽氧烷、矽樹脂碳酸酯共聚物、經不溶於體液中之外部聚合物膜包圍之親水性聚合物(諸如丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯之水凝膠、膠原蛋白、交聯聚乙烯醇及交聯部分水解之聚乙酸乙烯酯)，該外部聚合物膜例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、矽橡膠、聚二甲基矽氧烷、氯丁橡膠、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯與乙酸乙烯酯之共聚物、偏二氯乙烯、乙烯及丙烯、離聚物聚對苯二甲酸乙二醇酯、丁基橡膠、環氧氯丙烷橡膠、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物及乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。AON然後在釋放速率控制步驟中擴散透過外部聚合物膜。此類非經腸組合物中所含活性成分之百分比高度取決於其具體性質以及個體之需要。 E. 靶向調配物
本文所提供之AON或其醫藥學上可接受之鹽亦可以經調配以靶向欲治療個體之特定組織、受體或身體之其他區域，包括基於脂質體、再密封紅血球及抗體之遞送系統。許多此類靶向方法係熟悉此項技藝者熟知的。本文考慮了所有此類靶向方法用於本發明組合物。對於靶向方法之非限制性實例，參見例如美國專利第6,316,652號、第6,274,552號、第6,271,359號、第6,253,872號、第6,139,865號、第6,131,570號、第6,120,751號、第6,071,495號、第6,060,082號、第6,048,736號、第6,039,975號、第6,004,534號、第5,985,307號、第5,972,366號、第5,900,252號、第5,840,674號、第5,759,542號及第5,709,874號。
在一個實施例中，基於抗體之遞送系統係抗體-藥物結合物(「ADC」)，例如，如Hamilton G S, Biologicals, 2015年9月, 43(5):318-32；Kim E G及Kim K M, Biomol. Ther. (Seoul), 2015年11月, 23(6):493-509；及Peters C and Brown S, Biosci. Rep., 2015年6月12日, 35(4) pii: e00225中所描述，該等文獻各自以引用方式併入本文。
在一個實施例中，脂質體懸浮液，包括靶向組織之脂質體，例如靶向腫瘤之脂質體，亦可適合作為醫藥學上可接受之載劑。此等懸浮液可以根據熟悉此項技藝者已知之方法製備。例如，脂質體調配物可以如美國專利第4,522,811號中所述製備。簡言之，脂質體例如多層囊泡(MLV)可以藉由在燒瓶內部乾燥卵磷脂醯膽鹼及腦磷脂醯絲胺酸(7:3莫耳比)來形成。添加本文所提供之AON於不含二價陽離子之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之溶液，並搖動燒瓶直至脂質膜分散。將所產生之囊泡洗滌以去除未經封裝之化合物，藉由離心沉澱，且然後重懸於PBS中。 F. 製品
AON或醫藥學上可接受之鹽可經包裝成含有以下之製品：包裝材料；本文所提供之AON或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療、預防或改善本文所揭示之疾病或病症之一或多種症狀或進展；及標籤，該標籤表明該化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於治療、預防或改善本文所揭示之疾病或病症之一或多種症狀或進展。
本文所提供之製品含有包裝材料。用於包裝醫藥產品之包裝材料係熟悉此項技藝者熟知的。參見例如美國專利第5,323,907號、第5,052,558號及第5,033,252號。醫藥包裝材料之實例包括但不限於泡鼓包裝、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、筆、瓶及任何適用於所選調配物及預期投與方式及治療之包裝材料。考慮了本文所提供之各種AON及組合物之調配物。
在某些實施例中，本文亦提供了套組，當由開業醫師使用時，該套組可以簡化適當量之AON向個體之投與。在某些實施例中，本文所提供之套組包括容器及本文所提供之AON或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑化物或前驅藥之劑型。
在某些實施例中，套組包括容器，該容器在包含一或多種本文所描述之其他治療劑之容器中，包含本文所提供之AON或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑化物或前驅藥之劑型。
本文所提供之套組可進一步包括用於投與AON之裝置。此類裝置之實例包括但不限於注射器、無針注射器滴袋、貼劑及吸入器。
本文所提供之套組可進一步包括可用於投與一或多種活性成分之醫藥學上可接受之媒劑。例如，若活性成分以必須重構用於非經腸投與之固體形式提供，則套組可包含合適媒劑之密封容器，活性成分可溶解於該媒劑中以形成無顆粒無菌溶液，該溶液適用於非經腸投與。醫藥學上可接受之媒劑之實例包括但不限於：水性媒劑，包括但不限於注射用水USP、氯化鈉注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖及氯化鈉注射液以及乳酸化林格氏注射液；水混溶性媒劑，包括但不限於乙醇、聚乙二醇及聚丙二醇；及非水性媒劑，包括但不限於玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉荳蔻酸異丙酯及苯甲酸芐酯。 VII. 與第二活性劑之組合療法
本文亦提供了使用本文所揭示之AON與可用於治療DMD或延遲其發作之其他治療劑之組合療法的方法。在另一個實施例中，本文亦提供了使用AON1與可用於治療DMD或延遲其發作之其他治療劑之組合療法的方法。在此等方法中，本文所揭示之AON，例如AON1，如本文別處所述經投與，例如QWx24W投與。
如本文所用，術語「組合」包括使用多於一種療法(例如，一或多種預防劑及/或治療劑)。然而，術語「組合」之使用不限制向患有疾病或病症之個體投與療法(例如，預防劑及/或治療劑)之次序。第一療法(例如，預防劑或治療劑，諸如本文所提供之AON)可以在向個體投與第二療法(例如，預防劑或治療劑)之前(例如，之前5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週之前)、同時或之後(例如，之後5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週)投與。本文亦考慮了三聯療法。
本文所揭示之AON及一或多種第二活性劑向個體之投與可以藉由相同或不同投與途徑同時或依次發生。用於特定活性劑之特定投與途徑之適用性將取決於活性劑本身(例如，該活性劑是否可以口服投與而不在進入血流之前分解)及正在治療之疾病或病症。
本文所揭示之AON之投與途徑獨立於第二療法之投與途徑。在另一個實施例中，本文所揭示之AON係經靜脈內投與。因此，根據此等實施例，本文所揭示之AON係經靜脈內投與，且第二療法可以係經口服、非經腸、腹膜內、靜脈內、動脈內、透皮、舌下、肌內、直腸、經頰、鼻內、脂質體、經由吸入投與，陰道、眼內、經由經導管或支架局部遞送、皮下、脂肪內、關節內、鞘內或以緩慢釋放劑型投與。在一個實施例中，本文所揭示之AON及第二療法藉由相同投與方式投與，例如藉由IV投與。在另一個實施例中，本文所揭示之AON藉由一種投與方式投與，例如藉由IV投與，而第二劑藉由另一種投與方式投與，例如口服投與。
在一個實施例中，第二活性劑係以約1至約1000 mg、約5至約500 mg、約10至約350 mg或約50至約200 mg之劑量經靜脈內或皮下投與且每日一次或兩次投與。第二活性劑之具體量將取決於所用具體劑、正在治療或管理之疾病類型、疾病之嚴重性及階段，以及本文所提供之AON或其衍生物之量，以及任何向個體同時投與之視情況選擇之額外活性劑。
在本文所提供之方法及組合物中，一或多種第二活性成分或劑可以與本文所提供之AON或其衍生物一起使用。第二活性劑可以係大分子(例如蛋白質)或小分子(例如合成無機、有機金屬或有機分子)。
大分子活性劑之實例包括但不限於造血生長因子、細胞介素、AON以及單株及多株抗體。典型大分子活性劑係生物分子，例如天然存在的蛋白質或合成或重組蛋白質。在本文中用作第二活性劑之AON之具體實例包括依特普森、卡西默森、戈洛迪森、維托拉森及SRP-5051 (Sarepta Therapeutics)。
小分子之實例包括皮質類固醇，例如地夫可特(deflazacort)。
可與本文所揭示之AON組合之其他療法包括基因療法(例如，SRP-9001、GALGT2或GNT 0004 (Sarepta Therapeutics))、基因編輯(例如，CRISPR/CAS9 (Sarepta Therapeutics))及細胞療法(例如，CAP-1002 (Capricor Therapeutics/Nippon Shinyaku Co. Ltd.))。 VIII. 實例
以下實例意在說明本文所提供之某些實施例，且不限制本揭露之範疇。 實例1 在 del52hDMD/ mdx 小鼠中投與 AON1 達 25 週
將hDMD del52/mdx (+/+)及C57BL/6J野生型(WT)小鼠(第1天約7週齡)分為四組，且如下所示給藥：
組 應力 小鼠編號 (M/F/混合) 劑量條 IV劑量方案 劑量水準(mg/kg) 劑量體積(mL/kg) 終止N (最後劑量後)
4週 12週
1 WT 18 媒劑 QWx25W 0 8 6 12
2 del52/mdx 18 媒劑 QWx25W 0 8 6 12
3 del52/mdx 18 AON1 QWx25W 6 8 6 12
4 del52/mdx 18 AON1 QWx25W 18 8 6 12
6 mg/kg/劑量之劑量等於0.92 µmol/kg/劑量(AON1之MW係6517 g/mol)。18 mg/kg/劑量之劑量等於2.76 µmol/kg/劑量。因此，以超過25W給予之AON1總量在6 mg/kg劑量水準下係150 mg/kg (23.00 μmol/kg)且在18 mg/kg劑量水準下係450 mg/kg (69.00 μmol/kg)。
給藥後，分析血漿濃度、組織分佈、濃度、外顯子跳躍、總體步態得分及細胞保護。結果展示於圖1-6中。
簡言之， 圖 1展示隨時間變化之AON1血漿濃度。 圖 2展示在心臟、股四頭肌、肝臟、膈肌、腓腸肌及腎臟組織中之AON1濃度。 圖 3展示AON1在治療25週後在肌肉組織(股四頭肌、腓腸肌、心臟及膈肌)中達成持續性劑量依賴性外顯子51跳躍。
圖 4展示心臟及股四頭肌中之肌肉萎縮蛋白wt%，並展示AON1之總體步態得分(平均值±SEM；N=16-18 (基線，第29週)或10-12 (第37週))。統計學顯著性：與C57BL/6J媒劑相比，#p＜0.05，####p＜0.0001；與Del52/mdx媒劑相比，*p＜0.05，***p＜0.0005，****p＜0.0001)。AON1藉由治療25週改善並維持肌肉萎縮蛋白及步態得分。精細運動及運動學步態測試參考：NA Datson等人 (2020), NUCLEIC ACID THERAPEUTICS. DOI: 10.1089/nat.2019.0824。
圖 5展示AON1治療減弱hDMD del52(+/+)模型相關性肌肉病理學且在給藥25週後維持藥理學效應達12週。經媒劑治療小鼠之腓腸肌展示出輕度萎縮、極少壞死、極少炎症(非核細胞浸潤)及極少纖維化。相比之下，經AON1治療小鼠之腓腸肌展示出極少萎縮，而無其他影響。
圖 6展示AON治療減弱hDMD del52(+/+)模型相關性心臟病理學並維持藥理學效應達12週。經媒劑治療小鼠之心肌展示出極少萎縮、極少壞死、極少炎症(單核細胞浸潤)及極少纖維化。相比之下，經AON1治療小鼠之心肌展示出極少炎症(單核細胞浸潤)及極少纖維化，而無其他影響。 實例 2 AON1 之合成
寡核苷酸AON1係藉由固相有機合成來合成。在合成過程期間未分離或表徵中間物。合成序列完成後，將寡核苷酸自固體支持物上切割，去保護且藉由超濾及製備型陰離子交換(AEX)層析進行純化。在將HPLC流份匯集後，將寡核苷酸AON1溶液濃縮並藉由第二超濾步驟脫鹽。隨後凍乾及均化提供了產物AON1，作為固體材料，在運輸前儲存於-20±5℃下。
在環境溫度下進行之合成循環示意性地展示如下(使用第一循環用於說明目的)。AON1之寡核苷酸鏈係在固體支持物上合成。序列完成後，將寡核苷酸自樹脂上切割，純化並將所得溶液凍乾以產生最終藥物物質AON1。 階段 1 ：固相合成
藉由固相有機合成使用平台合成製造AON1之寡核苷酸部分。合成係自動化的，並在配備封閉管柱反應器之合成器上使用偶聯回收技術進行，且不涉及分離中間物。將具有通用連接子之固體支持物裝入流通管柱反應器中並啟動合成。各合成循環由四個化學步驟組成，此等步驟依次進行，然後洗滌，直到形成全長寡核苷酸。 步驟1去保護
在稱為去封閉或去保護之第一步驟中，用甲苯中之二氯乙酸處理固體支持物，以自固體支持物上之UnyLinker™去除保護基團二甲氧基三苯甲基(DMT)。在步驟1之所有後續循環中，去封閉涉及自各依次引入之亞磷醯胺或鎖定亞醯胺之5'-OH去除DMT保護基團，以生成5'-DMT-off寡核苷酸。 步驟2活化及偶合
第二步驟，指定為「活化及偶合」，係鏈延伸步驟，將下一個核苷酸添加到序列中，自3'端增長到5'端。在合適的活化劑溶液，例如乙腈中之芐基硫代四唑存在下，將UnyLinker™ (第1個循環)或5'-DMT-off寡核苷酸鏈[n](所有後續循環)之未經保護之醇基用相應亞磷醯胺於乙腈或二氯甲烷/乙腈中之溶液處理，以將經延伸之DMT構建到寡核苷酸鏈[n+1]上。最後的鏈延伸步驟使用DMT-TEG-亞磷醯胺在AON1之5'端添加TEG基團，而無需硫化。 步驟3氧化/硫化
根據所需主鏈化學，相應硫代磷酸酯或磷酸二酯在該步驟中藉由硫化或氧化引入。使寡核苷酸鏈[n+1]上之DMT經歷硫化劑(例如吡啶/乙腈中之5-N-(二甲基胺基)亞甲基]胺基-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(DDTT))或氧化劑(例如吡啶/水中之碘)。僅最後一個循環涉及AON1製造期間之氧化步驟，所有其他循環均涉及硫化反應。 步驟4加帽
第四步驟，指定為「加帽」，透過向固體支持物上之寡核苷酸添加帽A (乙腈/2,6-二甲基咪唑/N-甲基咪唑)及帽B (乙腈中之三級丁基苯氧基乙醯乙酸酐)之混合物完成合成循環，以便防止任何未經反應之5'-OH寡核苷酸鏈[n]在後續偶合循環中進一步與亞磷醯胺反應。這導致形成截斷序列。在所有18個亞醯胺之合成循環完成後，鹼基及主鏈保護之寡核苷酸仍然結合在固相支持物上。 第 2 階段：主鏈去保護
將固相支持物上之寡核苷酸用乙腈中之二乙胺處理，從而導致硫代磷酸酯/磷酸酯主鏈上之β-氰乙基保護基團被去除。進行反應，隨後使用乙腈進行洗滌步驟。 第 3 階段：鹼基去保護及自樹脂上切割
在環境溫度下將管柱與氨水/乙醇一起孵育，隨後用氨水/乙醇洗滌。將經合併之溶液在升高的溫度下孵育。在該兩步程序中，將粗製寡核苷酸自固體支持物上切割，並去除核鹼基保護基團。將所得溶液過濾並淬滅，其中濾液含有粗製寡核苷酸，將其溶解於去保護溶液中。 第 4 階段：藉由超濾對寡核苷酸進行脫鹽
藉由超濾使用超濾膜濃縮粗製AON1溶液。用注射用水對所得濃縮物進行滲濾。過濾所得AON1水溶液。 第 5 階段：藉由陰離子交換層析純化粗製寡核苷酸
將反應混合物稀釋於磷酸鈉水溶液/乙腈緩衝液中，並藉由陰離子交換(AEX)層析使用Source™ 30Q純化。
生成模擬池並藉由HPLC-UV/MS進行分析。根據分析結果，選擇流份進行匯集並進一步進行下游處理。將所選流份合併以提供具有適當純度(＞85%)及產率之產物池。藉由HPLC-UV/MS再次分析該最終產物池。 第 6 階段：藉由超濾對寡核苷酸進行脫鹽
藉由超濾使用超濾膜濃縮粗製經匯集之AON1溶液。用注射用水對所得濃縮物進行滲濾。過濾所得AON1水溶液。 第 7 階段：呈凍乾固體形式之寡核苷酸
透過0.2 µm膜過濾來自第6階段之濃縮溶液並最後凍乾，以產生最終藥物物質。凍乾後，將材料在潔淨室環境中至少平衡24小時，以獲得最終產物中穩定之水含量。獲得呈白色至灰白色至黃色粉末之經平衡之藥物物質(mp：約265℃ (DSC分解)；藉由離子對反相HPLC-UV/MS得到純度92-93%)。 實例 3 用於製造 50 mg/mL AON1 之方法 緩衝溶液之配混及視情況選擇之生物負載減少過濾
將需要量之十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉及氯化鈉稱取到達約80%總量的注射用水(WFI)中，並在C級環境下在層流空氣流(LAF)下攪拌。在賦形劑溶解後，添加WFI至最終量。
若緩衝溶液之配混及藥物產品溶液之配混並不在同一天發生，則透過LAF下之C級0.45/0.2 µm膜過濾器單元過濾緩衝溶液以減少生物負載。 溶液之平衡、配混及生物負載減少過濾
將經凍乾之AON1 (實例2)在LAF下之C級環境中在室溫下平衡12–24小時。平衡後，將經凍乾之AON1稱重並藉由攪拌溶解在大約50%緩衝溶液中以避免凝集。藉由添加計算量之緩衝溶液來達到50 mg/mL溶液之最終AON1濃度。藉由避免起泡，將溶液以200至1000 rpm混合20-30分鐘。透過無菌0.45/0.2 µm膜過濾器單元對配混溶液進行生物負載減少過濾。在LAF下之C級環境中進行配混及生物負載減少過濾。 在線無菌過濾及無菌灌裝
透過兩個連續在線過濾器單元使用0.45/0.2 µm過濾器對AON1溶液進行無菌過濾，並無菌填充到隨時可用之無菌小瓶中。將小瓶加蓋並密封。將經填充之單元儲存於溫度受控之冷藏室中。
將AON1組合物在單劑量小瓶中以3 mL等滲無菌、不含防腐劑之溶液形式提供，用於靜脈內輸注，濃度為50 mg/mL，pH為7.0。容器密封系統係1型玻璃小瓶，其帶有經含氟聚合物塗覆之溴化丁基橡膠塞及帶翻蓋之鋁密封圈。下文提供了5.25 L AON1溶液之組成： 5.25 L AON1 溶液之組成
組分 量 濃度 (g/L)
AON1 262.5 g 50
十二水合磷酸氫二鈉 27.0 g 5.135
二水合磷酸二氫鈉 4.6 g 0.883
氯化鈉 24.5 g 4.676
注射用水 qs qs至目標體積
qs=足量 實例 4 在雄性及雌性 del52hDMD/ mdx 小鼠中投與 AON1 PS 達 13 週，並在給藥後 2 或 4 週進行評估
將在英國查爾斯河(Charles River, UK)飼養且由瑞士BioLytix進行基因分型之總計120隻純合hDMD del52/mdx+/+雄性及雌性小鼠用於該研究。本研究中之所有hDMD del52/mdx小鼠均源自重新衍生之群體。此外，將年齡匹配之C57BL/6J (n=20)小鼠(德國查爾斯河(Charles River, Germany))用作野生型(WT)對照。在為本研究設置不同組時，將小鼠以一種方式按性別隨機分組，使得整窩小鼠不會最終出現在一個測試組中，且考慮到基線體重，因此在開始第一次治療時無組差異。
在各治療日對小鼠稱重並相應地調整劑量。整個IV注射過程每隻小鼠需要5-8分鐘，實際注射時間為10-60秒。
所有化合物均以確保等莫耳給藥之濃度調配，並以8mL/kg注射體積投與。在各治療日對小鼠稱重並相應地調整劑量。例如，體重為30 g之小鼠接受240 µL IV注射。
向小鼠給予AON1 PS達13週。在最後一次IV注射後14天或28天之終點，藉由用戊巴比妥鈉(60 mg/kg Mebunat, Orion Pharma, Finland)深度麻醉來對小鼠實施安樂死。對小鼠進行心臟穿刺並收穫心臟組織。藉由將組織浸入液氮中之異戊烷中來立即快速冷凍組織，將其置於乾冰上預冷之冷凍管中並儲存在-80℃下。藉由合格方法分析經冷凍樣品之外顯子跳躍%及肌肉萎縮蛋白水準。結果展示在 圖 7及 8中。 實例 5 在雄性及雌性 del52hDMD/ mdx 小鼠中投與 AON1 達 13 週，並在給藥後 4 或 8 週進行評估
所有小鼠每週一次(QW)在尾靜脈中接受IV注射，研究持續時間最長為13週，自7週齡開始使用媒劑或AON1。整個IV注射過程每隻小鼠需要5-8分鐘，實際注射時間為60秒。將化合物調配成特定濃度，並以8 mL/kg之注射體積投與。在各治療日對小鼠稱重並相應地調整劑量。例如，體重為30 g之小鼠接受240 μL IV注射。
在生命結束時，第85天最後一次IV注射後4或8週(分別為第113天及第141天)，藉由心臟穿刺收集血液後，向小鼠經心臟灌注PBS，以便自組織中去除血液。收集以下組織並快速冷凍：
骨骼肌：腓腸肌(R)、股四頭肌(L+R)；將兩側收集到一個小瓶中，如此股四頭肌組織即具有一個樣品。
心臟之一半(解剖後心房及心室均存在於每一半中)、整個隔膜、肝臟(佔總肝臟之2 x 1/3)、腎臟(R)。
藉由將組織浸入液氮中之異戊烷中來立即快速冷凍所有組織，將其置於乾冰上預冷之冷凍管中並儲存在-80℃下，直至切片。
在所有組之腓腸肌、股四頭肌、心臟及膈肌組織中進行外顯子跳躍分析。使用合格逆轉錄酶數字液滴聚合酶鏈反應(RT-ddPCR)分析方法進行分析工作。由以下公式計算hDMD外顯子51跳躍百分比：
(人類跳過外顯子51拷貝/20 µL反應物)/(人類跳過外顯子51拷貝/20 µL反應物+人類非跳過外顯子51拷貝/20 µL反應物)*100
跳躍及非跳躍轉錄本之定量下限(LLOQ)係基於閾值方法。結果展示在 圖 9中。心臟及股四頭肌中之肌肉萎縮蛋白水準展示在 圖 10中。整體步態得分展示在 圖 11中。 實例 6
研究了AON1 PS及AON2對人類及石蟹獼猴血清中補體活化之影響。
用於測試品投與之給藥媒劑係含0.7% NaCl之磷酸鹽緩衝液水溶液(pH 6.9-7.1)，其經製備並用作基線對照。稱取適量測試品(AON1 PS或AON2)並使用攪拌/渦旋混合以10X劑量濃度溶解到視覺上透明之溶液中。未對所量測之重量應用校正因子。將調配物在使用前後冷藏保存(4℃)。使用前，將所有測試品調配物在工作台上升溫至室溫達至少30分鐘。測試品在製備後在4℃下儲存一週時被認為係穩定的。在研究資料中記錄實際重量及稀釋度。本研究未進行劑量分析；丟棄殘留調配物。 測試系統
測試系統1：來自n=3名正常男性人類誌願者(＞18歲)之個體血清。
測試系統2. 來自n=3隻正常雄性石蟹獼猴(＞3歲)之個體血清。 投與途徑
這係一項活體外研究，且測試品在活體外暴露於測試系統。測試品以一份比九份(1:9，v/v)之比率添加到測試系統中。該比率保持了測試系統之適當濃度，因此存在足夠濃度的補體對照蛋白。 劑量方案
將混合物在37℃±2℃下孵育30±2分鐘，並儲存在-80℃下，直至分析物測試。 目標及研究方案
本研究之目的係評估兩種反股寡核苷酸(AON1 PS及AON2)在正常雄性人類及石蟹獼猴血清中孵育後之補體分裂產物活化概況。 實驗設計
藉由將270 μL測試系統與30 μL經製備之10X測試品在1.5 mL聚丙烯微量離心卡口蓋管中混合來執行測試。一旦製備所有混合物，即將它們轉移到37℃±2℃水浴中並孵育30±2分鐘。孵育混合物後，將所有樣品等分並冷凍在-80℃或以下。 補體活化之生物分析
藉由ELISA測定之Bb分裂產物：在藉由活化補體替代途徑切割B因子時產生Bb。在活體外暴露於測試品期間產生之Bb水準可以充當替代途徑活化水準之量度。使用雙孔運行Bb ELISA，報告其平均值。最初在兩個稀釋度下評估Bb之水準，以驗證該檢定未經更高活化樣品飽和。
藉由ELISA測定之C3a分裂產物：在補體中心點切割C3時產生C3a。因此，C3a切割可在活化三種補體途徑中之任一者後產生。C3a之水準亦很重要，因為它係一種過敏毒素。在活體外暴露於測試品期間產生之C3a水準可以充當足夠強以達到該中心點之補體活化水準之量度，以及充當該活化之直接促炎結果之可能性的指示。使用雙孔運行C3a ELISA，報告其平均值。最初在兩個稀釋度下評估C3a之水準，以驗證該檢定未經更高活化樣品飽和。
結果展示在 圖 12及 13中。 實例 7 幼鼠 26 週毒性及生物分析研究
在恢復期為13週之26週幼年毒性及毒代動力學(TK)研究中，自PND 21至PND 203每4天一次藉由推注IV注射0 (媒劑對照緩衝液)、6、12或18 mg/kg AON1來向雄性CD-1小鼠(20-22/組(主要毒性研究)；6 (媒劑；用無菌鹽水稀釋之媒劑對照緩衝液)；25-31/組(TK)；21-27/組(恢復))給藥。在PND 21及203給藥前(僅PND 203)、給藥後0.5、1、3、8及24小時自AON1治療組收集血液用於生物分析。評估了以下參數：體重、食物消耗、發育標誌(龜頭包皮分離)、神經行為評估(≈PND 187及281時之運動活動；≈PND 190及284時之聽覺驚嚇(auditory startle)；≈PND 193及287時之莫里斯水迷宮(Morris water maze))、眼科檢查、臨床病理學(臨床化學、血液學及凝血)、大體屍檢、器官重量及組織病理學。
基於不存在不良發現，未觀測到毒性不良反應之水準(NOAEL)係18 mg/kg/劑量。在PND 21時，該劑量水準分別對應於5280 nmol/L及11,700 h*nmol/L之最大觀測濃度(C max)及給藥後0至24小時之濃度-時間曲線下面積(AUC 0-24)值。在PND 203時，該劑量水準分別對應於5860 nmol/L及14,600 h*nmol/L之C max及AUC 0-24值。 實例 8 NHP 39 週毒性及生物分析研究
藉由IV輸注(60分鐘)向雄性石蟹獼猴(3/組(主要毒性研究)；2/組，0、6、12及18 mg/kg QW (13週恢復))給藥0 (媒劑：0.9% NaCl注射液，USP)、6、12或18 mg/kg QW AON1，達39週。在不同研究日/時間點收集血液，用於生物分析/TK及補體活化分析。評估了以下參數：死亡率、臨床體徵、體重、食物消耗、血漿及組織(腓腸肌、心臟、股二頭肌、肝臟及腎臟)中之AON1水準、組織(腓腸肌、心臟、股二頭肌、肝臟及腎臟)中之外顯子跳躍百分比、臨床病理學(臨床化學、血液學、尿液分析、尿液化學及尿液生物標誌物)、補體活化指標(Bb、C3a及sC5b-9)、眼科、ECG、器官重量及組織病理學。
在第274天之計劃終末安樂死及計劃外安樂死時，所有AON1治療組之組織中AON1平均濃度都係可量化的。平均濃度通常隨著劑量自6 mg/kg/劑量增加到12 mg/kg/劑量而增加。在給藥階段第274天，AON1自6至12 mg/kg/劑量之平均濃度之排序順序係肝臟、腎臟、心臟、腓腸肌及股二頭肌。
藉由RT-ddPCR量測組織中之外顯子跳躍。該方法量化了未跳躍DMD(肌肉萎縮蛋白)轉錄本之數量及外顯子51跳躍之DMD轉錄本之數量；並計算了外顯子跳躍百分比(%跳躍)。外顯子51跳躍百分比自4.5%至40.8%變化，且高劑量組(12及18 mg/kg/QW)高於低劑量組(6 mg/kg/QW)。亦參見圖 14。
應注意無AON1相關性體重變化；眼科檢查發現；獸醫觀測；ECG波形異常或心律不整；或對PR間期、QRS持續時間、QT或校正QT (QTc)間期或心率之作用。對於投與高達18 mg/kg/劑量之動物，未觀測到AON1相關性臨床病理學(血液學及凝血)效應。對於投與高達18 mg/kg/劑量之雄性，在早期終末處死或計劃終末處死時未註意到AON1相關性宏觀觀測結果或器官重量影響。
分別在給藥階段之第194天或第211天，在AON1相關的垂死狀態下處死一名雄性，各雄性動物分別投與12或18 mg/kg/劑量。兩隻動物之臨床及獸醫觀測結果相似，包括活動減少、外觀消瘦以及下軀乾及/或四肢之凹陷或皮下水腫。臨床病理學發現表明炎症、氮血症、低白蛋白血症及尿蛋白升高(在量測尿蛋白之一隻動物中)。垂死之原因歸因於腎小球腎損傷及多系統血管炎症。在計劃外處死動物中AON1相關性臨床病理學效應支持炎症反應、體液缺乏、可能的胃腸道損失、興奮/生理反應及/或適度減小之血小板計數，這缺乏明確機制。計劃外處死動物之顯微鏡檢查發現包括腎小管變性/再生、血管變性、肥大及血管壁及/或血管周圍組織之炎症，這可能導致受累組織(心臟)中之間質水腫、血栓形成(肺)及/或局部退行性變化。水腫亦可能與由於腎小球變化而引起之血清蛋白顯著降低有關。此等發現及其後遺症與經補體介導之病因一致，在AON治療背景下猴容易出現該情況(Frazier Toxicol Pathol. 2015年1月;43(1):78-89)。NHP中對AON敏感性增加之原因與石蟹獼猴中H因子組分之遺傳學有關，應理解該組分會增加H因子與AON之結合。調節補體活化所需之遊離因子H量的減少消除了替代途徑之關鍵調節因子。
在所有劑量組(包括對照組)中均觀測到涉及補體替代途徑及終末途徑之低水準及瞬時補體活化。在大多數動物中，補體活化之增加通常在給藥後72小時下降到接近給藥前水準，在研究過程中有活化水準增加之趨勢。與給藥前水準相比，在第113天及第204天，兩隻早期終末處死動物之Bb水準分別增加了＞200%。雖然該兩隻動物之補體活化特徵與觀測到之參與腎臟損傷的補體一致，但其他動物亦表現出經量測之補體片段增加。動物之間的差異可能係由於動物一旦開始時即控制補體活化之能力存在個體差異，因為存在許多補體調節因子。透過AON與H因子蛋白之間的非特異性相互作用活化補體之機制被認為具有非常有限的臨床相關性，因為人類補體活化發生在高得多的AON血漿濃度下(Henry Int. Immunopharmacol. 2002;2:1657–66；Henry Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications, 第2版 CRC Press: Carlsbad, CA; 2008:327–63；Shen J Pharmacol Exp Ther. 2014年12月;351(3):709-17)。
在投與≥6 mg/kg/劑量之計劃處死動物中觀測到AON1相關性臨床病理學效應。在投與18 mg/kg/劑量之動物中，在給藥階段第176天(ALT除外)、第204天、第211天、第216天及第218天，丙胺酸轉胺酶(ALT)及鹼性磷酸酶(ALP)活性輕度增加，表明存在肝功能障礙。支持炎症反應之效應包括在投與18 mg/kg/劑量之動物中在給藥階段第176天、第204天、第211天、第216天及第218天白蛋白濃度輕度降低及球蛋白濃度增加(導致白蛋白：球蛋白比率降低)及在投與18 mg/kg/劑量之動物中在給藥階段第211天、第216天及第218天觸珠蛋白濃度輕度增加。此外，白蛋白經腎臟喪失，這得到在投與18 mg/kg/劑量之動物中在給藥階段第211天、第216天及第218天尿蛋白：尿肌酸酐比率輕度增加及尿蛋白發生率增加的支持。在投與≥ 6 mg/kg/劑量之動物中在給藥階段第211天、第216天、第218天、第225天、第239天、第253天、第260天、第267天及第274天微量白蛋白：肌酐比率輕度至中度增加亦支持經腎臟進行之白蛋白丟失。在投與18 mg/kg/劑量之動物中，在給藥階段第211天、第216天及第218天凝集素：肌酸酐比率輕度增加支持了腎損傷。額外效應係在投與≥6 mg/kg/劑量之動物中在第176天、第204天、第211天、第216天、第218天、第225天、第239天、第253天、第260天、第267天及第274天血小板計數之非劑量依賴性輕度降低，這缺乏明確機制。在18 mg/kg QW組之2隻動物中觀測到血小板計數隨時間降低，從而導致中度/顯著血小板減少症，儘管與任何解剖病理學發現無關。在計劃處死動物中未觀測到AON1相關性凝血作用。
在給藥階段第218天投與18 mg/kg/劑量之兩隻早期終末處死動物及計劃終末處死動物之顯微鏡檢查發現顯示，一隻動物之腎小管上皮細胞變性極小且另一隻動物之肝臟混合細胞炎症極小，這與肝酶值增加相關。該等發現分別歸因於AON1在腎小管上皮細胞或Kupffer細胞內之積累。其他AON1相關性發現在垂死動物及早期處死動物中很常見，包括心臟瓣膜中輕度或中度單核細胞浸潤及若干組織中單核細胞浸潤發生率增加之趨勢。此等發現可能反映了與給藥相關之全身炎症及/或補體活化之存在，且除了瓣膜變化外，均被認為係猴中常見之偶然發現的惡化。在所有動物中，與AON1積累相關之觀測結果包括腎小管上皮細胞及Kupffer細胞中之嗜鹼性顆粒(通常以劑量相關性方式)以及在多種組織內但在淋巴結內最顯著的以改變的、泡沫狀及/或輕微嗜鹼性細胞質為特徵巨噬細胞之存在。積累似乎與投與≥12 mg/kg/劑量之動物周圍組織之損傷無關，且巨噬細胞改變似乎與任何劑量下之損傷無關。在恢復安樂死時，顯微鏡檢查發現趨向於可逆性，如藉由在投與≥6 mg/kg/劑量之動物中腎臟中之嗜鹼性顆粒極少、肝臟庫弗細胞(Kupffer cell)中之色素極少及下頜骨及/或腸系膜淋巴結中之空泡化/色素化巨噬細胞浸潤極少至中度所證明。此外，在每隻投與12或18 mg/kg/劑量之一隻動物之胃腸道及投與18 mg/kg/劑量之一隻動物之膀胱(在該猴研究中未發現移行細胞變性/空泡形成)及睾丸中注意到空泡化/色素化巨噬細胞浸潤極少。
在投與AON1之男性健康及幸福之總體效應方面，基於臨床病理狀況及解剖病理學發現之嚴重性，未觀測到不良反應之水準(NOAEL)被認為係6 mg/kg/劑量，這對應於在給藥階段第260天17,000 nmol/L之平均最大觀測濃度(C max)及36,500 h*nmol/L之濃度-時間曲線下面積(AUC 0-25)。 實例 9 首例人類劑量選擇
選擇臨床試驗之建議劑量及持續時間(實例10)，以確保安全性以及對參加該試驗之各兒科參與者之直接益處的前景。
首例人類臨床研究(實例10)包括連續評估多達6個AON1劑量水準：IV投與之0.6 mg/kg、1.5 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg、9 mg/kg及12 mg/kg。
使用來自雄性石蟹獼猴之GLP 13週重複劑量毒性研究的AON1之NOAEL確定臨床研究(實例10)之起始劑量(18 mg/kg/週)(實例13)。基於體表面積縮放法，18 mg/kg QW之猴NOAEL之人類等效劑量(HED)為5.8 mg/kg QW。因此，所選0.6 mg/kg起始劑量提供了基於猴之10倍安全裕量，猴被認為係危險識別之更相關物種，因為猴對補體活化及後續炎症反應更敏感，這被認為係反股寡核苷酸之類效應之一(後者係猴之非臨床毒性之主要來源) (Shen J Pharmacol Exp Ther. 2014年12月;351(3):709-17)。人類們普遍認為，使用猴將使識別任何在數量及質量上與人類預期不良反應相似之不良反應之可能性最大化(Farman Toxicol Pathol. 2003;31:119-122)。
鑒於與每週一次給藥間隔相比，由於AON1之血漿半衰期較短而導致預期積累低，群組1A (第1部分)每2週增加一次劑量水準被認為適於使個體參與者在亞治療劑量水準下之暴露持續時間最小化。2倍至2.5倍之劑量增量允許個體參與者透過非臨床資料表明可能安全之劑量安全而有效地增加。在39週研究中觀測到之毒理學發現與長期給藥有關，且預期不會與臨床試驗中之初始單次遞增劑量有關(實例10)。
對於相同mg/kg劑量，先前已證明在NHP及DMD患者之間硫代磷酸酯寡核苷酸之血漿暴露係相似的(Bosgra Nucleic Acid Ther. 2019;29(6):305-322)；因此，使用體表面積縮放為臨床試驗之單次遞增劑量部分之起始劑量選擇提供了比體重縮放更保守的方法。對於臨床試驗之重複劑量階段，應用自NHP到人類之直接基於體重(mg/kg)之外推法，並提出了6、9及12 mg/kg QW之連續評估。
對於重複劑量階段選擇6 mg/kg QW之起始劑量以使得各兒科參與者均具有直接益處的前景，因為這係藥理學活性劑量，預期在該劑量下肌肉萎縮蛋白之表現＞穩態正常值之10%。DMC將在第4週審查劑量群組之安全性資料，並對劑量遞增提出建議。
藉由慢性毒理學研究證明並告知12 mg/kg/週之最大劑量，其已經選擇以使BMN 351治療之潛在療效最大化，並具有可管理的安全性特徵：  • 總之，慢性毒理學研究(39週猴研究(實例8)、26週小鼠研究(實例11)及幼鼠研究(實例7))中之主要毒性訊息與全部臨床可監測之硫代磷酸酯寡核苷酸的熟知類別的效應一致。 • 在39週猴研究中觀測到劑量限制性毒性，其中NOAEL經確定為6 mg/kg/週。在39週猴研究中鑑定之高於NOAEL之劑量(6 mg/kg/週)被認為係合適的，因為≥12 mg/kg QW之劑量限制毒性似乎與補體介導之效應一致，而NHP已知與其他臨床前物種及人類相比對其具有放大的敏感性(Barbour Nephrol Dial Transplant. 2013年7月;28(7):1685-93；Shen J Pharmacol Exp Ther. 2014年12月;351(3):709-17)。因此，經補體介導之作用應被視為危險識別，而非提供臨床安全邊際。在39週猴研究中在18 mg/kg QW組之2隻動物中觀測到血小板計數隨時間降低，從而導致中度/顯著血小板減少症，儘管與任何解剖病理學發現無關。在診所內可監測血小板減少。
基於非臨床研究，肝臟、腎臟、血液系統(血小板減少症)、凝血系統及血管系統(炎症變化)被識別為人類毒性之靶器官。
將透過頻繁臨床及實驗室監測進行風險監測及緩解活動，包括使用器官特異性毒性生物標誌物、明確概述之DLT標準及研究停止標準。在資料監測委員會(Data Monitoring Committee，DMC)建議是否遞增劑量、遞減劑量、開設新群組或擴大群組之前，將對安全性資料進行評估。 實例 10 評估 AON1 在患有杜興氏肌肉失養症之患者中之安全性、耐受性、藥物動力學及藥效動力學的 1/2 期劑量遞增研究
本研究將研究藉由靜脈內(IV)輸注6次遞增劑量之AON1之安全性及耐受性。鑒於杜興氏肌肉失養症(DMD)之進行性，這係一項開放標籤研究且所有參與者均將接受AON1。選擇建議劑量及試驗持續時間以確保安全性以及對參加試驗之各兒科參與者之直接益處的前景。所用藥物產品如實例3所述。
在猴中進行之關鍵性13週GLP毒性研究中，未觀測到不良反應之水準(NOAEL)經確定為18 mg/kg QW；因此，基於體表面積縮放方法，人類等效劑量(HED)為5.8 mg/kg QW。因此，所選起始劑量0.6 mg/kg提供了基於猴之10倍安全裕量，這被認為與危險識別更相關，因為猴對補體活化及後續炎症反應更敏感，這係反股寡核苷酸之類效應之一(Shen L, Frazer-Abel A, Reynolds PR等人 Mechanistic understanding for the greater sensitivity of monkeys to antisense oligonucleotide-mediated complement activation compared with humans. J Pharmacol Exp Ther. 2014年12月;351(3):709-17)。低(2倍至2.5倍)劑量滴定將進一步增加早期偵測任何潛在劑量依賴性安全性訊息之可能性，從而允許早期干預。
向參與者以6個劑量水準(0.6 mg/kg、1.5 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg、12 mg/kg及18 mg/kg)中之各者給藥將以基於此類分子之先前安全性經驗的間隔錯開。在建議是否遞增劑量、遞減劑量、開設新群組或擴大群組之前，資料監測委員會(DMC)將對可用安全性資料進行評估。該設計包括小心監測參與者之安全性，包括在劑量遞增前已知的反股寡核苷酸(AON)類效應之急性安全性事件，及在必要時實施個體及研究停止規則。
正在進行該研究以經由肌肉萎縮蛋白表現結合安全性、耐受性及藥物動力學(PK)來證明概念驗證，以評估劑量反應並為進一步臨床開發提供關於劑量選擇之見解。研究表明，肌肉中肌肉萎縮蛋白之含量越高，疾病表型越不嚴重(de Feraudy等人Ann Neurol. 2021;89(2):280–292)；因此，肌肉萎縮蛋白表現增加係本研究的有意義的結果。
將評估血漿PK及肌肉分佈，以研究劑量、血漿及肌肉暴露、外顯子跳躍及肌肉萎縮蛋白表現之間的關係。
在所有參與者完成6 mg/kg、9 mg/kg及12 mg/kg劑量水準之12週(群組1A，第2部分)或24週(群組1B、2及3)治療後，將讀取肌肉中之AON1分佈、外顯子跳躍及肌肉萎縮蛋白水準，以確定用於未來臨床開發之最佳耐受劑量。
此完成後，參與者可以參加計劃持續時間為至少1年之長期擴展(LTE)研究。擴展階段之基本原理係評估AON1在較長時間段內對患有DMD之參與者之安全性、耐受性、PK及藥效動力學(PD)效應，以及縱向評估參與者之功能變化，並潛在地與經匹配之外部對照組比較。鑒於疾病之自然史，相關擴展研究係本研究設計之必要部分。
目標 端點
初級
• 評估AON1在患有DMD之參與者中在不同劑量水準下之安全性及耐受性 • 不良事件/SAE/AESI之發生率 • 身體檢查 • 安全性實驗室測試參數 • ECG參數 • 心臟超音波圖
次級
• 評估AON1之血漿及尿液藥物動力學及肌肉分佈 • AON1血漿PK ○ AUC 0-t、AUC 0-inf○ C max、C 谷○ T max、CL、V ss、t 1/2• AON1尿PK ○ Ae 0-24h、CL R• 第13週(群組1A)或第25週(群組1B、2及3)肌肉中之AON1濃度
探索性
• 評估AON1對患有DMD之參與者肌肉中之外顯子51跳躍及肌肉萎縮蛋白表現的影響 • 肌肉活檢物中之肌肉萎縮蛋白表現(相對於第13週(群組1A)或第25週(群組1B、2及3)時之基線的變化) • 外顯子跳躍效率(來自肌肉活檢物之肌肉萎縮蛋白傳訊者核糖核酸(mRNA)之RT-ddPCR)(相對於第13週(群組1A)或第25週(群組1B、2及3)時之基線的變化)
• 評估對AON1之免疫反應 • 抗AON1抗體 • 抗肌肉萎縮蛋白抗體
• 評估AON1對身體機能之影響 • NSAA (相對於第25週時之基線的變化) • 6MWT (相對於第25週時之基線的變化)
• 評估接受AON1之參與者之自殺風險 • 兒童行為檢查表(CBCL)
6MWT，6分鐘步行測試；AE，不良事件；AESI，特別關注之不良事件；AUC 0-t，自時間0到最後一個時間點之濃度-時間曲線下面積；AUC 0-inf，自時間0到無窮大之濃度-時間曲線下之面積；CBCL，兒童行為檢查表；CL，清除率；C max，最大濃度；C 谷，谷血漿濃度；DMD，杜興氏肌肉失養症；ECG，心電圖；mRNA，傳訊者核糖核酸；NSAA，北極星門診評估(NorthStar Ambulatory Assessment)；PK，藥物動力學；RT-ddPCR，逆轉錄酶-液滴數字聚合酶鏈反應；SAE，嚴重不良事件；t 1/2，半衰期；T max，達到最大濃度之時間；V ss，穩態分佈容積
本研究係評估6個遞增劑量之IV AON1在易於發生外顯子51跳躍之患有DMD之參與者中的安全性、耐受性、藥物動力學及藥效動力學的劑量遞增研究。這係一項1/2期開放標籤研究；未計劃隨機化。資料將與個體參與者之基線資料進行比較。為了符合研究資格，潛在參與者必須滿足方案中描述之所有資格要求，包括以下所選關鍵納入標準： • 係男性且篩選時年齡為4至10歲 • 如由中央遺傳顧問審查的由易於發生外顯子51跳躍的DMD基因中記錄之肌肉萎縮蛋白突變引起之杜興氏肌肉失養症的臨床診斷 • 篩選時能走動，經定義為能夠在無輔助設備情況下獨立行走，並在8秒或更短時間內完成10米計時步行/跑步測試 • 目前不依賴日間呼吸機，且預期次年不需要日間機械或無創通氣 • 目前正在接受口服皮質類固醇治療，在基線前至少12週保持穩定劑量，且在整個研究過程中必須保持一致的劑量/劑量方案，除了適應體重變化而進行之修改 • 基於預先指定之實驗室值的正常腎功能
所選關鍵排除標準包括以下： • 對於7歲或以上兒童，用力呼氣量(FEV 1)＜預測值之60% • 當前肝臟或腎臟疾病或其病史 • 基於篩選前3個月內或篩選訪視時進行之心臟超音波心動圖(ECHO)，左心室射血分數(LVEF)＜55% • 使用Fridericia方法校正之平均QT間期(QTcF)≥450毫秒，篩查心電圖(ECG)一式三份進行 • 篩選時血小板計數＜150 x 10 9/L • 在基線(第1天)前12週內使用任何外顯子51跳躍療法進行治療，或在任何時間使用任何基因療法治療DMD
符合條件之參與者將經分配到3個群組中之1個中：群組1 (n=6)、群組2 (n=3)或群組3 (n=6)。群組1參與者進一步分為群組1A (n=3)及群組1B (n=3)。在群組1A (第1部分)中，參與者將接受單次遞增劑量之AON1，該等劑量為0.6 mg/kg、1.5 mg/kg、3 mg/kg及6 mg/kg，隨後在各劑量水準上進行1週之給藥假期，此時在遞增至下一個更高濃度前或在6 mg/kg劑量之情況下遞增到長期劑量前評估安全性資料。在群組1A (第2部分)中，參與者每週接受6 mg/kg劑量之AON1，基於非臨床資料，預期該劑量在穩態下導致大約10%肌肉萎縮蛋白表現。群組1B參與者將接受6 mg/kg QW，群組2參與者(n=6)將接受9 mg/kg QW，且群組3參與者(n=6)將接受12 mg/kg QW。詳細劑量遞增程序如下所述。
DMC將監控安全性並提出劑量遞增建議。劑量限制毒性(DLT)標準適用於0.6 mg/kg、1.5 mg/kg、3 mg/kg及6 mg/kg單次劑量後1週之評估時間段(僅限群組1A (第1部分))。對於群組1A (第2部分)、1B、2及3，DLT標準適用於群組中最終參與者之第4週評估。研究停止標準適用於整個研究之所有參與者。根據是否達到最大耐受劑量(MTD)，最多可招募18名參與者。
對於群組1A (第1部分)參與者(n=3)，以0.6 mg/kg起始劑量投與AON1，參與者給藥之間的間隔為至少9天。群組1A (第1部分)參與者將不會在第2週訪視時接受給藥。DMC將在第2週審查各參與者之安全性資料，並提出建議，在不存在DLT之情況下將參與者遞增到1.5 mg/kg (或若存在DLT，則將群組擴大到6名參與者)。群組1A (第1部分)參與者將在第3週接受1.5 mg/kg AON1，之後DMC將在第4週審查各參與者之安全性資料，並建議在不存在DLT之情況下將參與者遞增到3 mg/kg(或者若存在DLT，則將群組擴大到6名參與者)。群組1A (第1部分)參與者將不會在第4週訪視時接受給藥。群組1A (第1部分)參與者將在第5週接受3 mg/kg AON1，之後DMC將在第6週審查各參與者之安全性資料，並建議在不存在DLT之情況下將參與者遞增到6 mg/kg(或者若存在DLT，則將群組擴大到6名參與者)。群組1A (第1部分)參與者將不會在第6週訪視時接受給藥。群組1A (第1部分)參與者將在第7週接受6 mg/kg AON1 (單個劑量)，之後DMC將在第8週審查各參與者之安全性資料，並建議在不存在DLT之情況下每週給藥6 mg/kg來開始第2部分(或者若存在DLT，則在第1部分中將群組擴大到6名參與者)。群組1A (第1部分)參與者將不會在第8週訪視時接受給藥。
若DLT發生在群組1A參與者中，則將在發生DLT之劑量水準下再招募3名參與者，並然後根據上述群組1A (第1部分)概述之劑量遞增規則單獨遞增劑量。
第8週後之訪視將係群組1A參與者之第2部分之開始，指定為6 mg/kg QW劑量水準之基線(第1週)訪視。向群組1A (第2部分)參與者給藥6 mg/kg QW，間隔至少9天。在所有3名群組1A參與者在第2部分中接受3個6 mg/kg QW劑量且第三名參與者完成第4週評估後，DMC將審查可用安全性資料，且若不存在DLT，則建議開放群組1B以6 mg/kg QW給藥。
向群組1B參與者給藥6 mg/kg QW，間隔至少9天。在所有3名群組1B參與者在第2部分中接受3個6 mg/kg QW劑量且最後一名參與者完成第4週評估後，DMC將審查所有6名群組1參與者之可用安全性資料，且若不存在超過1 DLT，則建議開放群組2以9 mg/kg QW給藥。
對於群組2參與者(n=6)，AON1將以9 mg/kg QW給藥，參與者之間的間隔為至少9天。在所有6名群組2參與者接受3個劑量且最後一名參與者完成第4週評估後，DMC將審查可用安全性資料，且若不存在超過1 DLT，則建議開放群組3以12 mg/kg QW給藥。
對於所有群組3參與者(n=6)，將以12 mg/kg QW投與AON1，參與者之間的間隔為至少9天。
若在給定群組中有2名或更多參與者經歷DLT，則將超過MTD，且不會進行進一步劑量遞增。在資料審查後，DMC可能會建議擴大先前群組、選擇較低中間劑量或停止研究。
主要安全性評估終點列出於以上「目標及終點」表中。該研究之次要目標包括評估AON1之血漿及尿液PK及肌肉分佈。所有參與者均將在篩選及第13週(群組1A)或第25週(群組1B、2及3)時進行肌肉活檢。在群組3之所有6名參與者(12 mg/kg QW)完成第25週之評估後，將評估所有資料以確定計劃長期擴展(LTE)研究之劑量，該研究將開放給所有完成本研究且計劃持續時間為至少1年之參與者。LTE研究之詳情將在單獨方案中指定。一旦確定劑量且LTE研究開放登記，本研究之參與者將過渡到LTE研究，或者在他們最後一個劑量之AON1後4週進行研究完成訪視。在LTE研究開放前，本研究將繼續進行給藥及評估。
在最後一名參與者在第25週接受劑量後，DMC將審查所有參與者資料。基於結果及DMC建議，申辦方將確定LTE研究之劑量。若參與者已透過申辦方確定之LTE劑量完成所有計劃訪視，則認為參與者已完成研究。在獲得衛生當局之許可或批准後且在參與者之站點收到IRB/EC對LTE之批准後，參與者可以開始在LTE中給藥。研究完成發生在參與者登記LTE之前最後一次訪視的日期。在LTE研究期間，參與者將接受12 mg/kg或本研究期間確定之最高耐受劑量之AON1。 實例11 雄性 CD-1 小鼠 AON1 26 週毒性研究之評估
經由緩慢推注IV注射向雄性CD-1小鼠(0及18 mg/kg劑量組中10或15隻/組(主要毒性研究)及多達5隻/組之主要毒性動物在13週恢復期後實施安樂死；4 (媒劑對照)及19/組(毒代動力學(TK)))給藥0 (媒劑：0.9%NaCl注射液，USP)、6、12或18 mg/kg AON1，每週兩次，總持續時間為26週。在第1天及第176天在給藥後0 (給藥後2分鐘內)、0.33、1、3、8及24小時收集血液用於生物分析。評估以下參數：死亡率、臨床體徵、體重、食物消耗、眼科檢查、臨床病理學(亦即臨床化學、血液學及凝血)、大體屍檢、器官重量及組織病理學。 生物分析及組織分佈
血漿暴露(基於C max及AUC 0-24)以通常與劑量成比例之方式隨著劑量增加而增加。在多個劑量之AON1後，在雄性小鼠中未觀測到累積。
在所有治療組中在第178天，雄性小鼠組織中AON1之平均濃度係可量測的。平均濃度通常隨著劑量自6 mg/kg/劑量增加到18 mg/kg/劑量而增加。不同劑量水準之AON1平均濃度之排序順序為：肝臟、腎臟、心臟、腓腸肌及股二頭肌。
由於病理學發現之輕度嚴重性及對每週兩次投與高達18 mg/kg/劑量之動物之健康或幸福無影響，未觀測到不良反應之水準(NOAEL)係每週兩次18 mg/kg/劑量，這對應於分別給藥階段第176天37,700 nmol/L及14,700 h*nmol/L之平均最大觀測濃度(C max)及濃度-時間曲線下面積(AUC 0-24)值。 實例12 細胞色素 P450 抑制及誘導
在與0.1至100 μM AON1孵育之人類肝微粒體中評估了AON1抑制CYP酶之潛力。藉由每種同工酶之陽性對照(亦即參考化合物)證實檢定之有效性。直接抑制CYP1A2之IC 50值係7.85 µM，而直接抑制CYP2C8及CYP2C19之IC 50值係＞100 µM。考慮微粒體蛋白結合後，直接抑制CYP1A2、CYP2C8及CYP2C19之未結合IC 50值分別係0.09、＞1.27及＞1.08 µM，其低於在18 mg/kg最大劑量下預測之人類血漿C max18 µM。嘗試了AON1之血漿蛋白結合，但由於與過濾裝置之非特異性結合水準高，因此無法評估。不存在對CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4/5(受質=睾酮或咪達唑侖)之直接抑制。基於文獻，CYP酶之基於硫代磷酸酯之寡核苷酸抑制依賴於測試系統；在人類肝微粒體中觀測到基於硫代磷酸酯之寡核苷酸對CYP酶之抑制，而非在經冷凍保存之人類肝細胞中觀測到(Kazmi Drug Metab Dispos. 2018年8月;46(8):1066-1074. 可獲自：https://dmd.aspetjournals.org/content/dmd/46/8/1066.full.pdf)。經冷凍保存之人類肝細胞提供了更具臨床相關性之抑制譜，可用於藥物相互作用之活體外到活體內外推，以對CYP酶進行基於硫代磷酸酯之寡核苷酸之抑制。鑒於AON1亦係一種基於硫代磷酸酯之寡核苷酸，微粒體可能不代表活體內條件。
為此，使用經冷凍保存之人類肝細胞進行了進一步研究，且證明AON1不係CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6或CYP3A4/5之直接或時間依賴性抑制劑，所有評估CYP之IC 50值＞100 μM。
在與100 μM AON1孵育之肝細胞中評估誘導CYP酶之潛力。藉由每種同工酶之陽性對照(亦即參考化合物)證實檢定之有效性。CYP誘導之活體外檢定表明CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4在轉錄水準下不受AON1誘導。 實例13 治療 13 週之雄性石蟹獼猴中之 AON1 之評估
藉由IV輸注(60分鐘)向雄性石蟹獼猴(3/組(主要毒性研究)；2/組，0、12及18 mg/kg QW (4週恢復))給藥0 (媒劑：0.9% NaCl注射液，USP)、6、12或18 mg/kg QW AON1，達13週。在給藥前第1天及第85天以及給藥後0.5、1、2、3、6、8及24小時收集血液用於生物分析，並在給藥前、給藥後1、3、6及24小時收集血液用於補體活化分析。亦在第78天收集了給藥前樣品。評估了以下參數：死亡率、臨床體徵、體重、食物消耗、血漿及組織(腓腸肌、心臟、股二頭肌、肝臟及腎臟)中之AON1水準、組織(腓腸肌、心臟、股二頭肌、肝臟及腎臟)中之外顯子跳躍百分比、臨床病理學(臨床化學、血液學、尿液分析、尿液化學及尿液生物標誌物)、補體活化指標(Bb、C3a及sC5b-9)、眼科、ECG、器官重量及組織病理學。
藉由RT-ddPCR量測組織中之外顯子跳躍。該方法量化了未跳躍DMD(肌肉萎縮蛋白)轉錄本之數量及外顯子51跳躍之DMD轉錄本之數量；並計算了外顯子跳躍百分比(%跳躍)。外顯子51跳躍百分比自1.7%到14.4%變化，且通常隨劑量增加。
本揭露之範疇不受限於實例中所揭示之實施例，實例僅意欲作為個別態樣之單一說明，且任何等效物均係在本揭露之範疇內。除本文所示及所述之彼等修改外，各種修改根據前述描述而為熟習此項技術者顯而易知的。此類修改旨在落入所附發明申請專利範圍之範圍內。
本文引用了各種參考文獻，諸如專利、專利申請案及出版物，其揭示內容皆以引用之方式整體併入本文。
圖 1展示隨時間變化之AON1血漿濃度。 圖 2展示在心臟、股四頭肌、肝臟、膈肌、腓腸肌及腎臟組織中之AON1濃度。 圖 3展示AON1在治療25週後在肌肉組織(股四頭肌、腓腸肌、心臟及膈肌)中達成持續性劑量依賴性外顯子51跳躍。 圖 4展示心臟及股四頭肌中之肌肉萎縮蛋白wt%，並展示用AON1治療之小鼠之總體步態得分。 圖 5展示AON1治療減弱hDMD del52(+/+)模型相關性肌肉病理學且在給藥25週後維持藥理學效應達12週。 圖 6展示AON1治療減弱hDMD del52(+/+)模型相關性心臟病理學並維持藥理學效應達12週。 圖7展示在QW、Q2W或Q4W給藥後第14天(實心圓)或第28天(空心圓)用具有經硫代磷酸基團連接到寡核苷酸之TEG之AON1 (AON1 PS，9.4、18.7或37.5 mg/kg)治療的hDMDΔ52/mdx小鼠之心臟及股四頭肌中之肌肉萎縮蛋白表現。 圖 8展示在QW、Q2W或Q4W給藥後14天(實心圓)或28天(空心圓)用AON1 PS (9.4、18.7或37.5 mg/kg)治療之hDMDΔ52/mdx小鼠之心臟中的外顯子51跳躍%。 圖 9展示在給藥後4週及8週用18.7 mg/kg AON1 (13週QW)治療之hDMDΔ52/mdx小鼠之股四頭肌、腓腸肌、心臟及隔膜中的外顯子51跳躍%。 圖 10展示在QWx13W給藥後4或8週用AON1 (18.7 mg/kg)治療之hDMDΔ52/mdx小鼠之心臟及股四頭肌中的肌肉萎縮蛋白表現。 圖 11展示用AON1治療之小鼠之總體步態得分。 圖 12展示AON1 PS及AON2 (無5'-TEG基團之AON1)對人類及猴血清中之補體參數Bb之影響。 圖 13展示AON1 PS及AON2對人類及猴血清中之補體參數C3a之影響。 圖 14展示用AON1治療39週之NHP在二頭肌、腓腸肌及心臟組織中之外顯子跳躍(實例8)。
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Claims (14)

  1. 一種治療患有DMD之個體或延遲個體中之DMD發作的方法，其包含向該個體投與0.4 mg/kg、0.6 mg/kg、0.8 mg/kg、1.5 mg/kg、3 mg、6 mg/kg、9 mg/kg、12 mg/kg或18 mg/kg之劑量的AON1，其中該AON1係經QW投與。
  2. 如請求項1之方法，其中該AON1係經QWx15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35W投與。
  3. 如請求項1或請求項2之方法，其中該AON1係經QWx24W或QWx25W投與。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該AON1係經QWx25W投與。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該AON1係經QWx24W投與。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該AON1係以3 mg/kg之劑量投與。
  7. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該AON1係以6 mg/kg之劑量投與。
  8. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該AON1係以9 mg/kg之劑量投與。
  9. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該AON1係以12 mg/kg之劑量投與。
  10. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該AON1係以18 mg/kg之劑量投與。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其係治療個體之DMD的方法。
  12. 如請求項1至10中任一項之方法，其係延遲個體中之DMD發作的方法。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與第二活性劑。
  14. 如請求項13之方法，其中該第二活性劑係依特普森(eteplirsen)、卡西默森(casimersen)、戈洛迪森(golodirsen)、維托拉森(viltolarsen)、SRP-5051 (Sarepta Therapeutics)、皮質類固醇諸如地夫可特(deflazacort)、基因療法(例如SRP-9001、GALGT2或GNT 0004 (Sarepta Therapeutics))、基因編輯(例如CRISPR/CAS9 (Sarepta Therapeutics))或細胞療法(例如CAP-1002 (Capricor Therapeutics/Nippon Shinyaku Co. Ltd.))。
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