TW202400624A - 具有肌肉損失抑制和肌肉質量提高活性的肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申請涉及具有肌肉損失抑制和肌肉質量提高活性的肽及其用途，其提供一種由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽，以及包括所述肽作為有效成分的用於預防或治療肌肉疾病的藥物組合物和包括所述肽作為有效成分的用於預防或改善肌肉疾病的食品組合物。

Description

具有肌肉損失抑制和肌肉質量提高活性的肽及其用途
本申請涉及具有肌肉損失抑制和肌肉質量提高活性的肽及其用途。本申請主張2022年6月10日申請之韓國專利申請第10-2022-0071033號的優先權，且所述專利申請的公開內容透過引用併入本文。
近年來，隨著全球高齡人口的速增加的趨勢，根據聯合國(United Nations)的一份報告，預計到2050年，60歲及以上的人口將超過20億。骨骼肌是最大的器官，其佔體重的50%，肌肉減少和肌力弱化是因老化而發生的主要身體變化之一。因此，在30歲後，表現出骨骼肌在我們的身體中每年會減少1%左右的趨勢，並在65歲以後急劇減少。這樣的肌肉的急劇減少會對生活質量產生很大影響，例如降低體能並增加跌倒和骨折的風險等，並且考慮到這些擔憂，世界衛生組織(WHO)於2017年將肌少症(sarcopenia)認証為官方疾病。
與肌肉疾病相關的脊神經、運動神經或骨骼肌纖維的退化引起的肌少症是具有代表性的難治性疾病之一，其發病原因至今尚未查明。根據目前的研究，由於誘導骨骼肌收縮的運動神經退化，骨骼肌收縮不進行或骨骼肌中參與肌肉收縮的蛋白質表達減少或所述蛋白質被修飾，使得正常的骨骼肌收縮不進行，從長遠來看，眾所周知，所述運動神經或骨骼肌會變型為纖維性組織。這種肌少症的根本發病原因尚未查明，由於尚未開發出可預防或恢復運動神經或骨骼肌退化的方法，至今正在積極開展研究以開發減緩所述肌少症進展的方法。目前已知運動、蛋白質和熱量的補充對肌少症有幫助，但在肌少症患者中佔大多數的老年人中，其幫助不是很大，因此迫切需要一種肌少症治療劑。
另一方面，肌肉大小或肌肉量受誘導肌肉內發生的合成代謝或分解代謝的細胞內信號轉導過程調節。具體來說，當誘導肌肉蛋白質合成的信號轉導反應比肌肉蛋白質分解佔優勢時，肌肉蛋白質合成增加，這表現為肌肉大小增加(hypertrophy)或肌纖維數增加(hyperplasia)。此外，肌肉細胞的分化和肌肉形成受各種肌肉調節因數(muscle regulatory factors)的調節。MyoD啟動肌肉特異性基因的表達，並誘導肌肉衛星細胞(muscle satellite cells)分化為肌母細胞(myoblast)，透過MyoD的活性誘導肌細胞生成素(myogenin)表達是肌母細胞融合(fusion)中最重要的因素，其參與肌管(myotube)的形成。透過這個過程形成的肌纖維形成束，最終形成肌肉。
在此技術背景下，正在進行各種研究以抑制由外部或內源性因素引起的肌肉損失並促進肌肉蛋白質合成(韓國註冊專利第10-2064387號)，但仍不完善。
[技術問題]
一方面提供由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽。
另一方面提供一種用於抑制肌肉損失和提高肌肉質量的組合物，其包括由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽作為有效成分。
本申請的其他目的和優點將從以下結合所附權利要求和附圖的詳細描述中變得更加明顯。對於本說明書中未記載的內容，本申請技術領域或相近技術領域中的技術人員能夠充分認識和推斷，因此省略其說明。 [技術方案]
本申請中所公開的每一個描述和實施例可以適用於每一個其他的描述和實施例。換言之，本申請中所公開的各種元素的所有組合都落入本申請的範圍內。此外，本申請的範圍不應解釋為受以下具體描述的限制。
一方面提供由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽。
在本說明書中使用的術語“肽”可以指透過肽鍵將胺基酸殘基彼此結合而形成的線形分子。所述肽可以根據本領域已知的化學合成方法特別是固相合成技術或液相合成技術(美國註冊專利第5,516,891號)而製造。作為為了開發具有生物學有效活性的肽的不懈努力的結果，查明了由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽。在此，所述生物學有效活性可以表現選自諸如以下特性中的任何一個或多個︰(a)作為肌母細胞的分化初期標誌物的肌生成素(Myogenin︰MyoG)和肌生成因數5(Myogenic factor 5︰Myf5)的表達提高；(b)作為肌母細胞分化的後期標誌物或肌纖維組成蛋白的肌球蛋白重鍊(Myosin heavy chain︰MyHC)和α-輔肌動蛋白(α-actinin)的表達提高；以及(c)作為炎症性蛋白質的α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin︰α-SMA)和白細胞介素6(interleukin-6︰IL-6)的表達減少。因此，所述肽可用於預防、改善或治療肌肉疾病的用途。
為了獲得化學穩定性、增強的藥理特性(半衰期、吸收性、藥效、效能等)、改變的特異性(例如，廣泛的生物活性譜)或降低的抗原性，保護基可以連接到肽的N-或C-末端。在一具體實施例中，所述肽的N-末端可以與選自由下項組成的組中的任何一個保護基結合︰乙醯基(acetyl group)、芴基甲氧基羰基fluoreonylmethoxycarbonyl group)、甲醯基(formyl group)、棕櫚醯基(palmitoyl group)、肉荳蔻基(myristyl group)、硬脂基(stearyl group)、丁氧羰基(butoxycarbonyl group)、烯丙氧基羰基(allyloxycarbonyl group)、和聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)，和/或所述肽的C-末端可以與選自由下項組成的組中的任何一個保護基結合︰氨基(amino group，NH 2)、叔烷基(tertiary alkyl group)、和疊氮化物(azide，NHNH 2)。另外，可選地，所述肽可以另外包括靶向序列、標籤(tag)、標記的殘基、為用於增加半衰期或肽的穩定性的特定目的而製造的胺基酸序列。
所述肽是人工合成的(Artificially synthesized)或非天然發生或經操作(Non-naturally occurring or engineered)的，所述“非天然發生或經操作的”是指透過施加人工修飾而生成的狀態，而不是其存在於自然狀態中的狀態。在此，所述人工修飾可包括透過模擬復數個的基酸結構人工合成胺基酸序列，或如上所述，進行操作以獲得化學穩定性、增強的藥理特性、改變的特異性或降低的抗原性。
在本說明書中使用的術語“穩定性”可以指儲存穩定性(例如，常溫儲存穩定性)以及保護所述肽免受體內蛋白水解酶攻擊的體內穩定性。
另一方面提供一種用於預防或治療肌肉疾病的藥物組合物，其包括由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽作為有效成分。
在所述肽的描述中提到的術語或元素中，與已經提到的相同的術語或元素如上所述。
在本說明書中使用的術語“預防”是指透過施用所述組合物抑製或延遲疾病發病的任何行為。
在本說明書中使用的術語“治療”是指向患有疾病或有疾病發病風險的個體提供包括改善所述個體的狀況(例如，一種或多種症狀)、延緩疾病進展、減緩症狀進展等的效果的任何形式的治療。因此，所述“治療”和“預防”並不意味著治癒或完全消除症狀。
在本說明書中使用的術語“肌肉疾病”是與肌母細胞增殖或分化減少相關的肌肉疾病、疾患或狀況，並且可以統指由例如肌肉功能降低、肌肉消耗或肌肉退化引起的肌肉疾病。所述肌肉疾病可以是例如，肌少症(Sarcopenia)、張力亢進(Atony)、肌營養不良(Muscular dystrophy)、肌肉萎縮(Muscular atrophy)、肌肉退化、肌強直、肌萎縮性硬化症、肌無力症和惡病質(Cachexia)，但不限於此。
在一具體實施例中，根據一實施例的藥物組合物可以透過促進肌母細胞的增殖和分化來提高肌肉質量或肌肉強度或改善肌肉功能。
儘管現有的功能性肽具有有效的生物學活性，但由於肽本身的大小，示出不能有效流入靶組織或細胞或半衰期短而在短時間內在體內消失的缺點。相反，根據一實施例的藥物組合物包括由約10個或更少的胺基酸組成的肽作為有效成分，因此，有效成分細胞滲透率等非常優異，例如對於局部施用的情況，可以獲得有效治療肌肉疾病的效果。
根據一實施例，本申請的肽可以顯著地增加肌母細胞的分化初期標誌物(例如，MyoG和Myf5)和分化後期標誌物或肌纖維組成蛋白(例如，肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain)、α-輔肌動蛋白)的表達，從而促進分化成肌肉細胞或肌肉纖維。此外，本申請的肽不僅可以在外因性因素引起肌肉損傷時提高肌肉質量恢復/再生，還可以減少受損肌肉組織中免疫細胞的浸潤和膠原蛋白組織的積累，從而緩和肌肉疾病的症狀並抑制疾病進展，因此，所述肽可用作用於治療肌肉疾病的藥物組合物的有效成分。
所述藥物組合物可以包括所述肽的藥物有效量(pharmaceutically effective amount)；和/或藥學上可接受的載體，但不限於此。
在本說明書中使用的術語“藥學有效量”可意指足以達成所述藥物組合物對骨病的治療效能的量。
所述肽與藥學上可接受的載體之間的重量比可以例如為500：1至1：500，例如，所述重量比可以為450：1至1：450、400：1至1：400、350：1至1：350、300：1至1：300、250：1至1：250、200：1至1：200、150：1至1：150、100：1至1：100、80：1至1：80、60：1至1：60、40：1至1：40、20：1至1：20、10：1至1：10、8：1至1：8、6：1至1：6、4：1至1：4、或2：1至1：2，但不限於此。
所述藥學上可接受的載體是製劑製造時常用的一種，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油等，但不限於此。合適的藥學上可接受的載體和製劑在雷明登藥物科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)(第19版，1995)中詳細描述。
除了上述成分之外，所述藥物組合物還可以包括潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等，但不限於此。
所述藥物組合物可以口服或非腸道施用，在非腸道施用的情況下，可以是經肌肉注射、靜脈內注射、皮下注射、腹腔注射、局部施用、經皮施用等來施用，但不限於此。
所述藥物組合物的施用量可以是每天0.0001至1000 ug(微克)、0.001至1000 ug、0.01至1000 ug、0.1至1000 ug或1.0至1000 ug，但不限於此，根據製劑化方法、施用方法、患者的年齡、體重、性別、病理狀況、飲食、施用時間、施用途徑、排泄速度和反應敏感性等因素，可以採用各種方式施用。
所述藥物組合物根據本領域技術人員可以容易地實施的方法使用藥學上可接受的載體和/或賦形劑來製劑化，從以可以以單位用量形式製造或放入多用量容器中來製造。
所述劑型可以為在油性或水性介質中的溶液、懸浮液或乳液形式，或可以是軟膏、乳膏、凝膠、經皮吸收劑、巴布劑、貼劑、糊劑、提取物劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形式，且可以另外包括分散劑和/或穩定化劑。
所述肽可以例如含有在納米體或納米體顆粒中以進一步改善細胞滲透問題或穩定性問題。例如，所述納米體可以透過使用卵磷脂作為原料以微流化儀製造，例如，可以包含在卵磷脂顆粒中。只要是已知的方法，所述納米體的製造方法可以使用任何方法。所述納米體顆粒的大小可以是10至200 nm，例如，可以是10至180 nm、10至160 nm、10至140 nm、10至120 nm、10至100 nm、10至80 nm、10至60 nm、10至40 nm、10至20 nm、50至200 nm、50至180 nm、50至160 nm、50至140 nm、50至120 nm、50至100 nm、50至80 nm、或50至60 nm。
所述藥物組合物還可以包括有益於預防或治療肌肉疾病的成分，所述成分可以是例如選自維生素C、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素H、維生素PP、維生素原B5、維生素A、維生素D、維生素E、維生素K1或胡蘿蔔素或其混合物中的任何一種成分，但不限於此。
另一方面提供一種用於預防或改善肌肉疾病的食品組合物，其包括由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽作為有效成分。
所述肽和藥物組合物的描述中提到的術語或元素中，與已經提到的相同的術語或元素如上所述。
在本說明書中使用的術語“改善”可以指至少減少與狀況的緩和或治療相關的參數例如症狀的程度的所有行為。
在一具體實施例中，根據一實施例的食品組合物可以透過促進肌母細胞的增殖和分化來提高肌肉質量或肌肉強度或改善肌肉功能。
所述食品組合物可以直接添加所述來使用，也可以與其他食品或食品成分一起使用，並可以根據常規方法適當使用。除有效成分外，所述食品組合物可以包括食品學上可接受的食品輔助添加劑，且有效成分的混合量可以根據使用目的(預防、保健或治療性處理)而適當確定。
所述食品組合物還可以包括有益於預防或改善肌肉疾病的成分，所述成分可以是例如選自維生素C、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素H、維生素PP、維生素原B5、維生素A、維生素D、維生素E、維生素K1或胡蘿蔔素或其混合物中的任何一種成分，但不限於此。
在本說明書中使用的術語“食品輔助添加劑”是指可以輔助添加到食品中的構成元素，並是為製造各劑型的保健功能食品而添加的，且可以由本領域技術人員適當地選擇來使用。食品輔助添加劑的例子包括各種營養劑、維生素、礦物質(電解質)、合成香味劑和天然香味劑等的香味劑、著色劑和填充劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體增稠劑、pH調節劑、穩定化劑、防腐劑、甘油、酒精、碳酸飲料中使用的碳酸化劑等，但所述食品輔助添加劑的種類不限於上述例子。
所述食品組合物可以包括保健功能食品。在本說明書中使用的術語“保健功能食品”是指透過使用對人體具有有益功能性的原料或成分來製造並加工成片劑、膠囊、粉末、顆粒、液相和丸等形式的食品。這裡，“功能性”是指對人體的結構和功能獲得對保健用途有用的效果如調節營養素或生理作用等。所述保健功能食品可以透過現有技術領域中常用的方法來製造，在所述製造時，可以透過添加現有技術領域中常用的原料和成分來製造。此外，只要所述保健功能食品的劑型被認為是保健功能食品即可，並不受限制地製造。所述食品組合物可以製造成各種形式的劑型，與一般藥物不同，其以食品為原料，並沒有長期服用藥物時可能出現的副作用，且攜帶性極佳，因此，根據一實施例的保健功能食品可以作為輔助劑攝取以提高肌肉疾病的治療效果。
此外，可以使用/應用根據一實施例的組合物的保健食品的種類不受限制。根據本領域技術人員的選擇，可以透過將保健功能食品中可含有的合適的其他輔助成分與已知的添加劑混合來製造包括所述肽作為有效成分的食品組合物。可以添加的食品的例子包括肉類、香腸、麵包、巧克力、糖果類、零食類、餅乾類、比薩餅、拉麵、其他麵類、口香糖類、包括霜淇淋類的乳製品、各種湯、飲料、茶、飲劑、酒精飲料和維生素複合劑等，此外，還可以添加在汁、茶、果凍、果汁中來製造。
另一方面提供一種預防或治療肌肉疾病的方法，其包括向個體施用包含由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽作為有效成分的組合物。
所述肽、藥物組合物和食品組合物等的描述中提到的術語或元素中，與已經提到的相同的術語或元素如上所述。
在本說明書中使用的術語“施用”或“應用”可互換使用，並且可以表示透過任何合適的方法向個體或患者提供預定的物質。另外，所述術語還可以指使根據一實施例的組合物至少部分局部化到所需區域，或透過施用途徑將根據一實施例的組合物配置在個體內。
在本說明書中使用的術語“個體”是指需要改善皮膚狀況的對象，更具體地，是指哺乳動物如人類或非人類的靈長類動物、小鼠(mouse)、狗、貓、馬和牛等。
所述組合物可以是例如包括由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽作為有效成分的藥物組合物或食品組合物。
所述組合物中含有的作為有效成分的肽的含量可以根據食品/藥物的形式、期望的用途等而沒有限制地適當選擇，例如，其可以以組合物總重量的0.01至15重量％的量添加。此外，例如，保健飲料組合物可以以100 ml為基準添加0.02至10 g，優選為0.3至10 g的比率，但不限於此。 [有益效果]
根據一方面的肽，透過增強參與肌母細胞分化的因數的表達，從而可以促進向肌細胞或肌纖維的分化。
根據一方面的肽，在外因性因素引起的肌肉損傷的情況下，不僅可以提高肌肉質量的恢復/再生，還可以減少受損肌肉組織中免疫細胞的浸潤和膠原蛋白組織的積累，從而緩和肌肉疾病的症狀，並抑制疾病的進展。
因此，根據一方面的肽可用作用於預防、改善或治療肌肉疾病的組合物的有效成分。
在下文中，將透過實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例是為了舉例說明本發明，本發明的範圍不限於這些實施例。
實施例1. 肽的合成、
使用自動肽合成儀(Milligen 9050，Millipore，美國)合成具有下[表1]中所記載的SEQ ID NO：1的胺基酸序列的肽，並使用C18反相高效液相色譜(HPLC)(Waters Associates，美國)純化且分離這些合成的肽。作為色譜柱，使用ACQUITY UPLC BEH300 C18(2.1 ㎜ × 100 ㎜，1.7 ㎛，Waters Co，美國)。
[表1]
SEQ ID NO 序列(N-末端 → C-末端)
1 EAEYEHL
實施例 2. 確認在初期分化步驟中肌母細胞的分化促進效果
在本實施例中，通過評估作為小鼠肌母細胞的C2C12細胞的初期分化標誌蛋白質的表達變化，以確認在初期分化步驟中根據一實施例的肽對從肌母細胞分化肌母細胞/肌纖維的影響。
2-1. 通過蛋白質表達分析的評估
在將C2C12細胞在包括1%P/S和2%BCS的DMEM培養基中培養後，待細胞融合度(cell confluency)達到約70%至80%時，將其接種(seeding)在6孔培養板中。然後，當6孔培養板中細胞的細胞融合度達到100%時，將培養基替換為分化培養基(1％P/S，2％馬血清(Horse serum))，同時向其中添加5、50或100 μg/ml的SEQ ID NO：1的肽。此後，每兩天更換和添加與分化培養基相同量的SEQ ID NO：1的肽。自首次更換培養基後3天，通過向培養物中加入溶解緩衝液溶解培養物後，在4℃和12,000 rpm下離心30分鐘以獲得蛋白質，並使用BCA試劑盒對其進行定量。將包括所述蛋白質的樣品作為對象實施SDS-PAGE來分離各蛋白質，然後電轉移(electrotransfer)至膜(membrane)。用5%脫脂牛奶(skim milk)處理並封閉(blocking)附著有所述蛋白質的膜，然後在4°C下使一抗反應過夜。以PBS-T洗滌後，在常溫下使二抗反應1小時，並再用PBS-T洗滌，然後通過Gel Doc(Bio-Rad，Hercules，CA，美國)和Western檢測試劑(Elpis Biotech，大田，韓國)對其進行檢測。作為一抗，使用Anti-MyoG (santa cruz， 美國)、Anti-Myf5 (Abcam， 英國)、和Anti-GAPDH(santa cruz，美國)，對於對照組，使用未處理組(Non)，作為比較組，使用僅處理分化培養基的組(CM)。
結果，如圖1和圖2所示，確認了通過用SEQ ID NO：1的肽處理，作為肌母細胞的分化初期標誌物的肌細胞生成素(MyoG)和Myf5的表達增加。
2-2. 通過免疫螢光法的評估
在將C2C12細胞在包括1%P/S和2%BCS的DMEM培養基中培養後，待細胞融合度達到約70%至80%時，將其接種在6孔培養板中。然後，當6孔培養板中細胞的細胞融合度達到100%時，將培養基替換為分化培養基(1％P/S，2％馬血清)，同時向其中添加100 μg/ml的SEQ ID NO：1的肽。此後，每兩天更換和添加與分化培養基和100 ug/ml的SEQ ID NO：1的肽 。自首次更換培養基後3天，將所培養的細胞用4%多聚甲醛 (PFA)在室溫下固定10分鐘，並在0.1%Triton X-100中實施透化過程(permeabilization)5分鐘。然後，在所固定的細胞中添加PBS、10%FBS和0.1%Triton X-100以在室溫下封閉(blocking)1小時後，處理一抗(MyoG，santa cruz，美國)，並在室溫下培養其1小時。然後，洗滌所述細胞並再次與二抗(山羊抗小鼠(goat anti-mouse)IgG-TR，Santa Cruz，美國)一起在室溫下培養30分鐘。此後，將細胞核用DAPI(Santa Cruz，美國)染色並以LEICA螢光顯微鏡(TCS SP8，LEICA，德國)對其進行觀察。
結果，如圖3和圖4所示，確認了通過用SEQ ID NO：1的肽處理，不僅作為肌母細胞的初期分化標誌物的肌細胞生成素(MyoG)的表達增加，而且肌母細胞核區的表達也增加。
總結上述試驗結果，發現根據一實施例的肽有助於促進從肌母細胞到肌細胞的初期分化。
實施例 3. 確認在後期分化步驟中肌母細胞的分化促進效果
在本實施例中，通過評估作為小鼠肌母細胞的C2C12細胞的初期分化標誌蛋白質的表達變化，以確認在後期分化步驟中根據一實施例的肽對從肌母細胞分化肌母細胞/肌纖維的影響。
3-1. 通過蛋白質表達分析的評估
除了溶解緩衝液的添加時間(自首次更換培養基後7天)之外，以與所述實施例2-1相同的方法進行，從而確認了作為肌母細胞的後期分化標誌物的肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain: MyHC)蛋白質的表達水準。作為一抗，使用Anti-MyHC (santa cruz，美國)以及Anti-GAPDH (santa cruz，美國)，作為對照組，使用未處理組(Non)，並作為比較組，使用僅處理分化培養基的組(CM)。
結果，如圖5和圖6所示，確認了通過用SEQ ID NO：1的肽處理，作為肌母細胞的分化後期標誌物的肌球蛋白重鏈(MyHC)的表達增加。
3-2. 通過免疫螢光法的評估
除了固定化時間(自首次更換培養基後7天)，以與所述實施例3-1相同的方法進行，從而確認了作為肌母細胞的後期分化標誌物的肌球蛋白重鏈(MyHC)蛋白質的表達水準。使用抗α-輔肌動蛋白(Anti-α-actinin)(santa cruz，美國)作為一抗，使用山羊抗小鼠IgG-TR(Santa cruz，美國)作為二抗，並使用僅處理分化培養基(CM)的組作為比較組。
結果，如圖7和圖8所示，確認了通過用SEQ ID NO：1的肽處理，作為肌母細胞的分化後期標誌物的α-輔肌動蛋白的表達增加。
總結上述試驗結果，發現根據一實施例的肽有助於促進從肌母細胞到肌細胞的後期分化。
實施例 4. 使用動物模型確認肌肉損失抑制效果
在本實施例中，以由BaCl 2誘導肌肉受損的動物模型作為對象，評估肌肉質量的變化、免疫細胞在肌肉組織中的浸潤面積和膠原蛋白的積累水準，以及肌纖維組成蛋白和炎症性蛋白的表達水準，以確認根據一實施例的肽對抑制肌肉損失的影響。
4-1. 肌肉質量評估
將1.2 %(w/v) 50 μl的BaCl 2水溶液注射8週齡雄性C57BL/6小鼠的脛骨前肌(Tibialis anterior︰TA)肌肉中以在1天內誘導小鼠肌肉損傷。然後，以0.1 mg/μl的濃度將20 mg的SEQ ID NO：1的肽以1天的間隔口服施用於所述誘導了肌肉損傷的小鼠總共6次。對於陽性對照組，以0.01 ug/μl的濃度肌內注射0.5 ug的IGF-I。自誘導肌肉損傷起第7天，犧牲小鼠，並以肉眼觀察TA肌肉的變化，且測量其重量。使用未處理組(Non)作為對照組，使用僅由BaCl 2誘導肌肉損傷的組(N.C)作為陰性對照組，並使用對由BaCl 2誘導肌肉損傷的組處理IGF-I的組(P.C)作為陽性對照組。
結果，如圖9和圖10所示，確認了通過SSEQ ID NO：1的肽處理，由BaCl 2誘導肌肉損傷的小鼠的TA肌肉的肌肉質量增加，由此得知其可以促進受損肌肉的再生。
4-2. 通過肌肉組織染色的評估
從所述實施例4-1的誘導肌肉損傷的小鼠獲得的肌肉組織在室溫下用PBS洗滌，然後用4％多聚甲醛(PFA)固定。然後，用PBS洗滌固定化後的肌肉組織3次，並用梯度乙醇系列(gradient ethanol series)(從70%到100%)將其脫水(dehydration)。將所述肌肉組織樣品切片化成4 μm的大小。包括所述切片化的標本的組織載玻片通過梯度乙醇系列脫蠟(dewaxing)和水合(hydration)，並在蘇木精(hematoxlin)溶液中染色1分鐘，在伊紅(Eosin)溶液中染色10秒。染色完結後，組織切片依次浸入90%和100%乙醇(ethyl alcohol)中，最後在二甲苯(xylene)中浸泡兩次5分鐘後，在組織載玻片上進行封片(mounting)(H&E染色)。
另外，如上所述對包括所述切片化的標本的組織載玻片進行脫蠟和水化後，在天狼猩紅溶液(Picro Sirius Red Solution )中染色60分鐘，然後在1%醋酸溶液(acetic acid solution)浸泡兩次2分鐘，並用D.W對其進行洗滌。然後，將組織玻片浸泡在乙醇(ethyl alcohol)中，最後在二甲苯中浸泡兩次5分鐘，然後在組織載玻片上進行封片(天狼猩紅染色)。
結果，如圖11和圖12所示，確認了透過SEQ ID NO：1的肽處理，由BaCl 2誘導肌肉損傷的組織中的免疫細胞浸潤面積減少。另外，如圖13和圖14所示，確認了透過SEQ ID NO：1的肽處理，由BaCl 2誘導肌肉損傷的組織中膠原蛋白的積累減少。
4-3. 通過肌肉組織中的蛋白質表達分析的評估
使用均化器(homogenizer)破碎從所述實施例4-1中誘導肌肉損傷的小鼠獲得的肌肉組織，並向其中添加溶解緩衝液來溶解破碎物後，在4°C和12,000 rpm下離心30分鐘獲得蛋白質，並使用BCA試劑盒對其進行定量。將包括所述蛋白質的樣品作為對象實施SDS-PAGE來分離各蛋白質，然後電轉移至膜。用5%脫脂牛奶處理並封閉附著有所述蛋白質的膜，然後在4°C下使一抗反應過夜。以PBS-T洗滌後，在常溫下使二抗反應1小時，並再用PBS-T洗滌，然後通過Gel Doc(Bio-Rad，Hercules，CA，美國)和Western檢測試劑(Elpis Biotech，大田，韓國)對其進行檢測。使用抗-MyHC(santa cruz，美國)、抗α-肌動蛋白(santa cruz，美國)、抗α-SMA(Abcam，英國)、抗-IL-6(santa cruz，美國)、和抗α微管蛋白(Anti-α-tubulin)(santa cruz，美國)作為一抗。
結果，如圖15和圖16所示，確認了透過SEQ ID NO：1的肽處理，由BaCl 2誘導肌肉損傷的組織中作為肌纖維組成蛋白MyHC和α-輔肌動蛋白的表達增加。另外，如圖17和圖18所示，確認了透過SEQ ID NO：1的肽處理，由BaCl 2誘導肌肉損傷的組織中作為炎症性蛋白質的α-SMA和IL-6的表達減少。
總結上述試驗結果，可以得知，根據一實施例的肽不僅使受損肌肉再生或恢復，而且有助於抑制肌肉損傷的進展，例如引起肌肉損傷的炎症反應。
劑型例 1. 肽納米體的製造
通過充分攪拌將50 mg的所述實施例1的肽溶解在500 ml的蒸餾水中。將結合體溶液與5 g的卵磷脂、0.3 ml的油酸鈉(sodium oleate)、50 ml的乙醇和一些油相混合後，用蒸餾水調整量使總量為1 L後，以微流化器利用高壓進行乳化，從而製造大小為約100 nm的肽納米體。
劑型例 2 . 藥物製劑
2-1. 散劑的製造
將以下成分混合並填充在密封袋中以製造散劑。
本發明的肽20 mg
乳糖100 mg
滑石粉10 mg
2-2. 片劑的製造
將以下成分混合然後根據常規的片劑製造方法壓片來製造片劑。
本發明的肽10 mg
玉米澱粉100 mg
乳糖100 mg
硬脂酸鎂2 mg
2-3. 膠囊劑的製造
根據常規的膠囊劑製造方法，將以下成分混合並填充到明膠膠囊中以製造膠囊劑。
本發明的肽10 mg
結晶性纖維素3 mg
乳糖14.8 mg
硬脂酸鎂0.2 mg
2-4. 注射劑的製造
根據常規注射劑的製造方法，每1安瓶(2ml)製造成以下成分含量。
本發明的肽10 mg
甘露醇180 mg
注射用滅菌蒸餾水2974 mg
Na 2HPO 4·2H2O 26 mg
2-5. 液劑的製造
根據常規的液劑製造方法，將各成分入純淨水中並溶解，並將以下成分混合後，加入純淨水調節整體至100 ml，然後將其填充至棕色瓶中並滅菌以製造液劑。
本發明的肽10 mg
異構糖10 g
甘露醇5 g
純淨水適量
本發明的上述描述僅用於說明目的，本發明所屬領域的技術人員將能夠理解，在不改變本發明的技術思想或必要特徵的情況下，可以容易地將其修改為其他具體形式。因此，上述實施例應被理解為在所有方面都是說明性的而不是限制性的。
(無)
圖1為透過西方墨點法確認在將由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽添加至C2C12細胞後作為肌母細胞的初期分化標誌物的肌細胞生成素(Myogenin)和Myf5的表達增加的結果。
圖2為在將由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽添加至C2C12細胞後定量評估肌母細胞的初期分化標誌物的表達變化的圖，其中，圖2的(a)是確認肌細胞生成素的表達水準的結果，且圖2的(b)是確認Myf5的表達水準的結果。
圖3為透過免疫螢光法確認在將由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽添加至C2C12細胞後作為肌母細胞的初期標誌物的肌細胞生成素(Myo G)的表達模式的結果。
圖4為在將由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽添加至C2C12細胞後定量評估肌細胞生成素(Myo G)的表達水準的結果。
圖5為透過西方墨點法確認在將由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽添加至C2C12細胞後作為肌母細胞的後期分化標誌物的MyHC的表達增加的結果。
圖6為在將由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽添加至C2C12細胞後定量評估肌母細胞的後期分化標誌物的表達變化的結果，且為確認MyHC表達水準的結果。
圖7為透過免疫螢光法確認在將由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽添加至C2C12細胞後作為肌母細胞的後期標誌物的α-輔肌動蛋白(α-actinin)的表達模式的結果。
圖8為在將由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽添加至C2C12細胞後定量評估α-輔肌動蛋白的表達水準的結果。
圖9是以肉眼確認在由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的脛骨前肌(Tibialis anterior︰TA)肌肉的變化的結果。
圖10是定量評估在由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的TA肌肉的肌肉質量變化的圖，其中，圖10的(a)是確認TA肌肉的重量(g)的結果，且圖10的(b)是確認TA肌肉(％)的結果。
圖11為透過H&E染色確認在源自由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型的肌肉組織中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的免疫細胞浸潤面積變化的結果。
圖12為定量評估在源自由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型的肌肉組織中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的免疫細胞浸潤面積變化的結果。
圖13為透過天狼星紅(Sirius red)染色確認在源自由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型的肌肉組織中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的膠原蛋白積累水準變化的結果。
圖14定量評估在源自由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型的肌肉組織中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的膠原蛋白積累水準變化的結果。
圖15為透過西方墨點法確認在源自由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型的肌肉組織中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的作為肌纖維成分蛋白質的MyHC和α-輔肌動蛋白的表達增加的結果。
圖16為定量評估在源自由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型的肌肉組織中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的作為肌纖維成分蛋白質的MyHC和α-輔肌動蛋白的表達水準的結果。
圖17為透過西方墨點法確認在源自由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型的肌肉組織中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的作為炎症性蛋白質的α-SMA和IL-6的表達減少的結果。
圖18為定量評估在源自由BaCl 2誘導肌肉損傷的動物模型的肌肉組織中根據由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的肽的處理的作為炎症性蛋白質的α-SMA和IL-6的表達水準的結果。
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Claims (10)

  1. 一種肽，其由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。
  2. 如請求項1所述之肽，其中，所述肽的N-末端與選自由下項組成的組中的任何一個保護基結合︰乙醯基、芴基甲氧基羰基、甲醯基、棕櫚醯基、肉荳蔻基、硬脂基、丁氧羰基、烯丙氧基羰基、和聚乙二醇。
  3. 如請求項1所述之肽，其中，所述肽的C-末端與選自由下項組成的組中的任何一個保護基結合︰氨基(NH 2)、叔烷基、和疊氮化物(NHNH 2)。
  4. 如請求項1所述之肽，其中，所述肽表現選自以下性質中的任何一種或多種︰ (a)肌生成素和肌生成因數5的表達提高； (b)肌球蛋白重鍊和α-輔肌動蛋白的表達提高；以及 (c)α-平滑肌肌動蛋白和白細胞介素6的表達減少。
  5. 一種用於預防或治療肌肉疾病的藥物組合物，其包括如請求項1至4中任一項所述之肽作為有效成分。
  6. 如請求項5所述之藥物組合物，其中，所述肌肉疾病是由肌肉功能下降、肌肉消耗或肌肉退化引起的肌肉疾病。
  7. 如請求項6所述之藥物組合物，其中，所述肌肉疾病是肌少症、張力亢進、肌營養不良症、肌肉萎縮、肌肉退化、肌強直、肌萎縮性硬化症、肌無力症和惡病質中的任何一種。
  8. 一種用於預防或改善肌肉疾病的食品組合物，其包括如請求項1至4中任一項所述之肽作為有效成分。
  9. 如請求項8所述之食品組合物，其中，所述肌肉疾病是由肌肉功能下降、肌肉消耗或肌肉退化引起的肌肉疾病。
  10. 如請求項8所述之食品組合物，其中，所述食品組合物還包括選自維生素C、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素H、維生素PP、維生素原B5、維生素A、維生素D、維生素E、維生素K1或胡蘿蔔素或其混合物中的任何一種成份。
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