TW202346347A - Wnt受體特異性化合物及其相關方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供與一或多種Wnt受體特異性結合之化合物及其相關方法。在一些態樣中，提供用Wnt傳訊路徑之調節劑治療眼部病症之組合物及方法。特別地，該等眼部病症為視網膜病變。本發明亦提供給藥方法及醫藥組合物。

Description

WNT受體特異性化合物及其相關方法
本發明係關於與一或多種Wnt受體特異性結合之化合物及其相關方法。特定言之，本發明提供用於治療各種眼部病症之Wnt訊號調節劑。特別地，提供針對眼睛之血管疾病，包括視網膜病變之治療。
椎骨視網膜為眼後的一層薄神經組織。其負責偵測視覺刺激且為視覺資訊處理之第一站。對於其適當功能而言，視網膜血管為不可缺少的營養物及氧氣來源。視網膜為代謝上高活性的。由於消耗大量氧氣之光感受器，一公克視網膜顯示相比於身體中任何其他器官最高的耗氧率。為了有效地遞送營養物及氧氣，視網膜血管作為由一側上之三個平面血管神經叢及另一側上之脈絡膜毛細血管組成的定型架構位於視網膜中。內部血管形成最初開始於視網膜之玻璃體表面上，產生初級血管神經叢。在血管神經叢之表面徑向擴增之後，血管豎直穿透至視網膜中在內網層(inner plexiform layer；IPL)及外網層(outer plexiform layer；OPL)形成兩個額外視網膜內毛細管神經叢。由於血管與視網膜之間的功能及結構關係，異常血管發育及/或血管損傷與可能導致各種類型之視網膜病變及視網膜變性的視網膜之異常或受損功能直接相關。
涉及Wnt傳訊，其作為用於視網膜中之血管發育之重要路徑。來自人類及嚙齒動物研究之愈來愈多之基因證據進一步支持Wnt傳訊在視網膜血管中之重要性(Wang等人, 2018, Prog Retin Eye Res.2018年12月1日. pii: S1350-9462(18)30046-6)。編碼涉及Wnt傳訊之各種受體(Fzd4、Lrp5、Tspan12)及配體(norrin)之人類基因中之突變引起多種遺傳性玻璃體視網膜病變。亦已觀測到此等基因(Fzd4、Lrp5、Tspan12、norrin)之鼠類異種同源物中之特定基因突變引起人類視網膜病變中可見之異常血管的特徵表型。此發現已促進研究人員獲得對視網膜病變疾病進展之較佳理解，以及開啟經由Wnt訊號調節進行視網膜病變治療之可能性。
視網膜病變為對眼睛視網膜之任何損傷，其可能引起視力障礙。視網膜病變涵蓋視網膜血管疾病及由異常血流引起之視網膜損傷。老年性黃斑變性視為視網膜病變，但通常論述為單獨實體。視網膜病變，包括糖尿病性視網膜病變，可分成早期及晚期。在早期，亦稱為非增殖性視網膜病變，視網膜小血管可存在輕微惡化，且多個血管部分可能腫脹且洩漏流體至周圍視網膜組織中。晚期視網膜病變涉及顯著新血管生成以及視網膜區域中之微動脈瘤及出血(參見例如Grading Diabetic Retinopathy from Stereoscopic Color Fundus Photographs-An Extension of the Modified Airlie House Classification. (1991) Ophthalmology, 98(5), 786-806)。視網膜病變可為全身性或代謝疾病之眼部表現，如糖尿病及高血壓所見。糖尿病為視網膜病變之常見原因，且糖尿病性視網膜病變為工作年齡的人失明之主要原因，且已由世界衛生組織(World Health Organization)指定為優先眼病。
家族性滲出性玻璃體視網膜病變(Familial Exudative Vitreoretinopathy；FEVR)為特徵在於眼內血管之不良形成之遺傳性眼病。超過50%之FEVR患者顯示在編碼Fzd4、Lrp5、Tspan12或norrin之基因中之一者中的突變。Wnt訊號配體Norrin經由由Fzd4/Lrp5/Tspan12構成之受體複合物將訊號傳輸至內皮細胞以用於眼睛中視網膜血管形成之正常發育。然而，在FEVR患者中，norrin、Fzd4、Lrp5或/及Tspan12基因中之一或多者中之突變引起視網膜中之不成熟血管發育。所得無血管區域形成產生視網膜缺血區域，其導致對視網膜之一級損傷。此缺血病狀誘導產生血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)及血管生成素2 (Ang2)，導致新血管生成及血管簇形成。新產生之異常血管可能容易破裂，導致視網膜由於滲出及出血之二級損傷。糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy；DR)之疾病進展類似於FEVR及其他遺傳性血管畸形或功能不全疾病之疾病進展。高糖血症誘導視網膜血管損傷，導致血管堵塞、缺血、新血管生成及出血，最終導致視網膜病變。
儘管基因資料已表明Wnt傳訊在眼睛中建立適當血管結構方面之重要性，但發育後Wnt傳訊之活化是否將引起血管結構改善係未知的。某些報導甚至已表明，拮抗而非促效Wnt傳訊將在視網膜病變治療方面有益。因此，對視網膜病變、疾病進展及其中涉及之Wnt訊號之更多理解將由於此可能會引起新治療而為有益的。特別地，對於視網膜病變之有效治療而言，需要調節疾病之特定階段期間之Wnt促效劑及拮抗劑傳訊。本發明解決此等需求且提供用於調節視網膜病變及疾病進展之不同階段期間之Wnt傳訊促效作用及拮抗作用的方法。
在一個態樣中，本發明提供多特異性抗體或抗體片段。
根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可至少包含：(A)第一抗原結合區，其與捲曲類受體4 (Fzd4)特異性結合且包含第一重鏈可變域(VH1)及第一輕鏈可變域(VL1)；(B)第二抗原結合區，其與低密度脂蛋白受體相關蛋白5及/或6 (LRP5及/或LRP6)特異性結合且至少包含第二重鏈可變域(VH2)。
在一些實施例中，該VH1包含：(i)具有如下胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDRH1)：(i-1)與SEQ ID NO: 121之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之CDRH1胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat定義；(i-2)包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列或由其組成，其中X 1為任何胺基酸，視情況S、A、Q或N；或(i-3)包含SEQ ID NO: 121、122、123或124之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之CDRH1胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat定義；(ii)具有如下胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDRH2)：(ii-1)與SEQ ID NO: 141之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之CDRH2胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat定義；(ii-2)包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列或由其組成，其中X 1為任何胺基酸，視情況E、A、S或D；或(ii-3)包含SEQ ID NO: 141、或142、143或144中之任一者的胺基酸序列或由其組成；或包含SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之CDRH2胺基酸序列或由其組成，視情況由Kabat定義；及(iii)具有如下胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDRH3)：(iii-1)與SEQ ID NO: 161之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之CDRH3胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況由Kabat定義；(iii-2)包含SEQ ID NO: 160之胺基酸序列或由其組成，其中X 1為任何胺基酸，視情況D或不為S、E、A、R、T、L、H、Y、Q或K的任何胺基酸；(iii-3)包含SEQ ID NO: 161之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之CDRH3胺基酸序列或由其組成，視情況由Kabat定義。
在一些實施例中，該VL1包含：(iv)具有如下胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDRL1)：(iv-1)與SEQ ID NO: 221之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之CDRL1胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況由Kabat定義；或(iv-2)包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之CDRL1胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat定義；(v)具有包含以下或由以下組成之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (CDRL2)：(v-1) SEQ ID NO: 241之胺基酸序列；或(v-2) SEQ ID NO: 281中所含之CDRL2胺基酸序列，視情況根據Kabat定義；及(vi)具有包含以下或由以下組成之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (CDRL3)：(vi-1) SEQ ID NO: 261之胺基酸序列；或(vi-2) SEQ ID NO: 281中所含之CDRL3胺基酸序列，視情況根據Kabat定義。
在一些實施例中，該VH2包含：(i)具有包含以下或由以下組成之胺基酸序列的CDRH1：(i-1) SEQ ID NO: 321之胺基酸序列；或(i-2) SEQ ID NO: 381、386及393-396中之任一者中所含之CDRH1胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat定義；(ii)具有如下胺基酸序列的CDRH2：(ii-1)與SEQ ID NO: 341之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之CDRH3胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或Kabat定義；(ii-2)包含SEQ ID NO: 341之胺基酸序列或由其組成；或(ii-3)包含SEQ ID NO: 381、386及393-396中之任一者中所含之CDRH2胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat定義；及(iii)具有如下胺基酸序列的CDRH3：(iii-1)與SEQ ID NO: 361之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之CDRH3胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或MGT或Kabat定義；(iii-2)包含SEQ ID NO: 360之胺基酸序列或由其組成，其中X 1、X 2及X 3分別為任何胺基酸，其限制條件為(a) X 1及X 2分別為D及E，(b) X 1及X 3分別為D及D，及/或(c) X 2及X 3分別為E及D，視情況其中X 1、X 2及X 3分別為D、E及D，分別為D、D及D，分別為D、E及E，分別為D、E及S，分別為D、E及A，或分別為D、E及T；或(iii-3)包含SEQ ID NO: 361、362、363、364、365及366中之任一者之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381、382、388、393、394、395及396中之任一者中所含之CDRH3胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat定義。
在一些情況下，多特異性抗體或抗體片段可包含上文描述之VH1、上文描述之VL1及上文描述之VH2。
在一些情況下，VH2為奈米抗體、包含其或包含於其中。
在一些情況下，多特異性抗體或抗體片段為雙特異性抗體或抗體片段。
在某些實施例中，VH1包含具有如下之胺基酸序列之CDRH1、CDRH2及CDRH3：(i)分別SEQ ID NO: 121、141及161，(ii)分別SEQ ID NO: 122、142及161，(iii)分別SEQ ID NO: 121、142及161，(iv)分別SEQ ID NO: 123、142及161，(v)分別SEQ ID NO: 124、142及161，(vi)分別SEQ ID NO: 122、141及161，(vii)分別SEQ ID NO: 122、143及161，(viii)分別SEQ ID NO: 122、144及161，(ix)分別SEQ ID NO: 121、143及161，(x)分別SEQ ID NO: 121、144及161，(xi)分別SEQ ID NO: 123、141及161，(xii)分別SEQ ID NO: 123、143及161，(xiii)分別SEQ ID NO: 123、144及161，(xiv)分別SEQ ID NO: 124、141及161，(xv)分別SEQ ID NO: 124、143及161，或(xvi)分別SEQ ID NO: 124、144及161。
在某些實施例中，VL1包含分別具有SEQ ID NO: 221、241及261之胺基酸序列之CDRL1、CDRL2及CDRL3。
在某些實施例中，VH2包含具有如下之胺基酸序列之CDRH1、CDRH2及CDRH3：(i)分別SEQ ID NO: 321、341及361，(ii)分別SEQ ID NO: 321、341及362，(iii)分別SEQ ID NO: 321、341及363，(iv)分別SEQ ID NO: 321、341及364，(v)分別SEQ ID NO: 321、341及365，或(vi)分別SEQ ID NO: 321、341及366。
在一些情況下，多特異性抗體或抗體片段可包含上文描述之VH1、上文描述之VL1及上文描述之VH2。
在某些實施例中，該VH1包含：(i)包含SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之胺基酸序列之VH1的CDRH1、CDRH2及CDRH3，視情況根據Kabat；或(ii)包含以下之胺基酸序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3：(ii-1)分別SEQ ID NO: 121、141及161，(ii-2)分別SEQ ID NO: 122、142及161，(ii-3)分別SEQ ID NO: 121、142及161，(ii-4)分別SEQ ID NO: 123、142及161，(ii-5)分別SEQ ID NO: 124、142及161，(ii-6)分別SEQ ID NO: 122、141及161，(ii-7)分別SEQ ID NO: 122、143及161，或(ii-8)分別SEQ ID NO: 122、144及161。
在某些實施例中，該VL1包含：(i)包含SEQ ID NO: 281中所含之胺基酸序列之VL1的CDRL1、CDRL2及CDRL3，視情況根據Kabat；(ii)分別包含SEQ ID NO: 221、241及261之胺基酸序列的CDRL1、CDRL2及CDRL3。
在某些實施例中，該VH2包含：(i)包含SEQ ID NO: 381、386、393、394、395及396中之任一者中所含之胺基酸序列之VH2的CDRH1、CDRH2及CDRH3，視情況根據IMGT或Kabat；或(ii)包含以下之胺基酸序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3：(ii-1)分別SEQ ID NO: 321、341及361，(ii-2)分別SEQ ID NO: 321、341及362，(ii-3)分別SEQ ID NO: 321、341及363，(ii-4)分別SEQ ID NO: 321、341及364，(ii-5)分別SEQ ID NO: 321、341及365，(ii-6)分別SEQ ID NO: 321、341及366。
在一些情況下，多特異性抗體或抗體片段可包含上文描述之VH1、上文描述之VL1及上文描述之VH2。
在特定實施例中，(A)該VH1包含：(i)包含SEQ ID NO: 181中所含之胺基酸序列之VH1的CDRH1、CDRH2及CDRH3，視情況根據Kabat；或(ii)分別包含SEQ ID NO: 121、141及161之胺基酸序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3；及該VL1包含：(i)包含SEQ ID NO: 281中所含之胺基酸序列之VL1的CDRL1、CDRL2及CDRL3，視情況根據Kabat，或(ii)分別包含SEQ ID NO: 221、241及261之胺基酸序列的CDRL1、CDRL2及CDRL3；及(B)該VH2包含：(i)包含SEQ ID NO: 381、393、394、395或396中之任一者中所含之胺基酸序列之VH2的CDRH1、CDRH2及CDRH3，視情況根據IMGT或Kabat；或(ii)包含以下之胺基酸序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3：分別SEQ ID NO: 321、341及361，分別SEQ ID NO: 321、341及363，分別SEQ ID NO: 321、341及364，SEQ ID NO: 321、341及365，或分別SEQ ID NO: 321、341及366。
在某些實施例中，該VH1包含：(i)具有如下胺基酸序列之重鏈構架區1 (FRH1)：(i-1)與SEQ ID NO: 111之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之FRH1胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；(i-2)包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列或由其組成，其中X 1為任何胺基酸，視情況Q或K；(i-3)包含SEQ ID NO: 111或112之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之FRH1胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(i-4)由人類生殖系IGHV3-23*04編碼之FRH1組成或衍生於其；(ii)具有如下胺基酸序列之重鏈構架區2 (FRH2)：(ii-1)與SEQ ID NO: 131之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之FRH2胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；(ii-2)包含SEQ ID NO: 130或131之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之FRH2胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(ii-3)由人類生殖系IGHV3-23*04編碼之FRH2組成或衍生於其；(iii)具有如下胺基酸序列之重鏈構架區3 (FRH3)：(iii-1)與SEQ ID NO: 151之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之FRH3胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；(iii-2)包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列或由其組成，其中X 1為任何胺基酸，視情況N或D；X 2為任何胺基酸，視情況R或K；及X 3為任何胺基酸，視情況A或T；(iii-3)包含SEQ ID NO: 151或152之胺基酸序列或由其組成，包含SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之FRH3胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(iii-4)由人類生殖系IGHV3-23*04編碼之FRH3組成或衍生於其；及/或(iv)具有如下胺基酸序列之重鏈構架區4 (FRH4)：(iv-1)與SEQ ID NO: 171之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之FRH4胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；(iv-2)包含SEQ ID NO: 170或171之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之FRH4胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(iv-3)由人類生殖系IGHJ4*01編碼之FRH4組成或衍生於其。
在某些實施例中，該VL1包含：(v)具有如下胺基酸序列之輕鏈構架區1 (FRL1)：(v-1)與SEQ ID NO: 211之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之FRL1胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；或(v-2)包含SEQ ID NO: 211之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之FRL1胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；(vi)具有如下胺基酸序列之輕鏈構架區2 (FRL2)：(vi-1)與SEQ ID NO: 231之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之FRL2胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；或(vi-2)包含SEQ ID NO: 231之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之FRL2胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；(vii)具有如下胺基酸序列之輕鏈構架區3 (FRL3)：(vii-1)與SEQ ID NO: 251之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之FRL3胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；或(vii-2)包含SEQ ID NO: 251之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之FRL3胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(viii)具有如下胺基酸序列之輕鏈構架區4 (FRL4)：(viii-1)與SEQ ID NO: 271之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之FRL4胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；或(viii-2)包含SEQ ID NO: 271之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之FRL4胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat。
在某些實施例中，該VH2包含：(i)具有如下胺基酸序列之FRH1：(i-1)與SEQ ID NO: 311之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之FRH1胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或Kabat；(i-2)包含SEQ ID NO: 310之胺基酸序列或由其組成，其中X 1為任何胺基酸，視情況E或D；X 2為任何胺基酸，視情況A或T；及X 3為任何胺基酸，視情況S，視情況其中FRH1不由SEQ ID NO: 310之胺基酸序列組成，其中X 1、X 2及X 3分別為E、A及A；(i-3)包含SEQ ID NO: 311或312之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381、382-386及393-396中之任一者中所含之FRH1胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(i-4)由人類生殖系IGHV3-66*01編碼之FRH1組成或衍生於其；(ii)具有如下胺基酸序列之FRH2：(ii-1)與SEQ ID NO: 331之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之FRH2胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或Kabat；(ii-2)包含SEQ ID NO: 330之胺基酸序列或由其組成，其中X 1為任何胺基酸，視情況Y；X 2為任何胺基酸，視情況Q；X 3為任何胺基酸，視情況R；X 4為任何胺基酸，視情況L；X 5為任何胺基酸，視情況I；及X 6為任何胺基酸，視情況A，視情況其中FRH2不由SEQ ID NO: 330之胺基酸序列組成，其中X 1、X 2、X 3、X 4、X 5及X 6分別為V、G、L、W、V及S；(ii-3)包含SEQ ID NO: 331、332或333之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381、382-386及393-396中之任一者中所含之FRH2胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii-4)由人類生殖系IGHV3-66*01編碼之FRH2組成或衍生於其；(iii)具有如下胺基酸序列之FRH3：(iii-1)與SEQ ID NO: 351之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之FRH3胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或Kabat；(iii-2)包含SEQ ID NO: 350之胺基酸序列或由其組成，其中X 1為任何胺基酸，視情況D或G；X 2為任何胺基酸，視情況L；X 3為任何胺基酸，視情況M；X 4為任何胺基酸，視情況T；X 5為任何胺基酸，視情況D或E；X 6為任何胺基酸，視情況N或S；X 7為任何胺基酸，視情況S或A；X 8為任何胺基酸，視情況M；X 9為任何胺基酸，視情況R或K；及X 10為任何胺基酸，視情況A或P，視情況其中FRH3不由SEQ ID NO: 350之胺基酸序列組成，其中X 1、X 2、X 3、X 4、X 5、X 6、X 7、X 8、X 9及X 10分別為D、V、I、R、D、N、S、L、R及A；(iii-3)包含SEQ ID NO: 351或352之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381、382-386及393-396中之任一者中所含之FRH3胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(iii-4)由人類生殖系IGHV3-66*01編碼之FRH3組成或衍生於其；及/或(iv)具有如下胺基酸序列之FRH4：(iv-1)與SEQ ID NO: 371之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之FRH4胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或Kabat；(iv-2)包含SEQ ID NO: 370之胺基酸序列或由其組成，其中X 1為任何胺基酸，視情況R或W；及X 2為任何胺基酸，視情況Q或L；(iv-3)包含SEQ ID NO: 351或352之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381、382-386及393-396中之任一者中所含之FRH4胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(iv-4)由人類生殖系IGHV3-66*01編碼之FRH4組成或衍生於其。
在一些情況下，多特異性抗體或抗體片段可包含上文描述之VH1、上文描述之VL1及上文描述之VH2。
在某些實施例中，VH1包含如下胺基酸序列：(i)與SEQ ID NO: 181-188中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性；及/或(ii)包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列或由其組成，其中：X 1為任何胺基酸，視情況Q或K；X 2為任何胺基酸，視情況S、A、Q或N；X 3為任何胺基酸，視情況E、A、S或D；X 4為任何胺基酸，視情況N或D；X 5為任何胺基酸，視情況R或K；X 6為任何胺基酸，視情況E或T；及X 7為任何胺基酸，視情況D或不為S、E、A、R、T、L、H、Y、Q或K之任何胺基酸。
在某些實施例中，VL1包含與SEQ ID NO: 281之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。
在某些實施例中，VH2包含如下胺基酸序列：(i)與SEQ ID NO: 381、386及393-396中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性；及/或(ii)包含SEQ ID NO: 380之胺基酸序列或由其組成，其中：X 1為任何胺基酸，視情況E或D；X 2為任何胺基酸，諸如A或T；及X 3為任何胺基酸，諸如S；X 4為Q；X 5為任何胺基酸，諸如Y；X 6為任何胺基酸，諸如Q或G；X 7為任何胺基酸，諸如R；X 8為任何胺基酸，諸如L或W；X 9為任何胺基酸，諸如I；及X 10為任何胺基酸，諸如A；X 11為M；X 12為M；X 13為任何胺基酸，諸如D或G；X 14為任何胺基酸，諸如L；X 15為任何胺基酸，諸如M；X 16為任何胺基酸，諸如T；X 17為任何胺基酸，諸如D或E；X 18為任何胺基酸，諸如N或S；X 19為任何胺基酸，諸如S或A；X 20為任何胺基酸，諸如M；X 21為任何胺基酸，諸如R或K；及X 22為任何胺基酸，諸如A或P；X 23、X 24及X 25分別為任何胺基酸，只要(a) X 23及X 24分別為D及E，(b) X 23及X 25分別為D及D，及/或(c) X 24及X 25分別為E及D即可，視情況其中X 23、X 24及X 25分別為D、E及D，分別為D、D及D，分別為D、E及E，分別為D、E及S，分別為D、E及A，或分別為D、E及T；X 26為任何胺基酸，諸如R或W；及X 27為任何胺基酸，諸如Q或L。
在一些情況下，多特異性抗體或抗體片段可包含上文描述之VH1、上文描述之VL1及上文描述之VH2。
在一些特定實施例中，(A) VH1包含含有SEQ ID NO: 181-188中之任一者之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；及/或VL1包含含有SEQ ID NO: 281之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；及/或(B)VH2包含含有SEQ ID NO: 381、386及393-396中之任一者之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
在特定實施例中，(A)該VH1包含：(i)包含SEQ ID NO: 181中所含之胺基酸序列之VH1的CDRH1、CDRH2及CDRH3，視情況根據Kabat；或(ii)分別包含SEQ ID NO: 121、141及161之胺基酸序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3，及該VL1包含：(i)包含SEQ ID NO: 281中所含之胺基酸序列之VL1的CDRL1、CDRL2及CDRL3，視情況根據Kabat，或(ii)分別包含SEQ ID NO: 221、241及261之胺基酸序列的CDRL1、CDRL2及CDRL3；及(B)該VH2包含：(i)包含SEQ ID NO: 381中所含之胺基酸序列之VH2的CDRH1、CDRH2及CDRH3，視情況根據IMGT或Kabat；或(ii)分別包含SEQ ID NO: 321、341及361之胺基酸序列的CDRH1、CDRH2及CDRH3。
在某些實施例中，該VH1包含：(i)具有如下胺基酸序列之FRH1：(i-1)與SEQ ID NO: 111之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之FRH1胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；(i-2)包含SEQ ID NO: 111之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181中所含之FRH1胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(i-3)由人類生殖系IGHV3-23*04編碼之FRH1組成或衍生於其；(ii)具有如下胺基酸序列之FRH2：(ii-1)與SEQ ID NO: 131之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之FRH2胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；(ii-2)包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181中所含之FRH2胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(ii-3)由人類生殖系IGHV3-23*04編碼之FRH2組成或衍生於其；(iii)具有如下胺基酸序列之FRH3：(iii-1)與SEQ ID NO: 151之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之FRH3胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；(iii-2)包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181中所含之FRH3胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(iii-3)由人類生殖系IGHV3-23*04編碼之FRH3組成或衍生於其；及/或(iv)具有如下胺基酸序列之FRH4：(iv-1)與SEQ ID NO: 171之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之FRH4胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；(iv-2)包含SEQ ID NO: 171之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181中所含之FRH4胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(iv-3)由人類生殖系IGHJ4*01編碼之FRH4組成或衍生於其。
在某些實施例中，該VL1包含：(v)具有如下胺基酸序列之FRL1：(v-1)與SEQ ID NO: 211之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之FRL1胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；或(v-2)包含SEQ ID NO: 211之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之FRL1胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；(vi)具有如下胺基酸序列之FRL2：(vi-1)與SEQ ID NO: 231之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之FRL2胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；或(vi-2)包含SEQ ID NO: 231之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之FRL2胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；(vii)具有如下胺基酸序列之FRL3：(vii-1)與SEQ ID NO: 251之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之FRL3胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；或(vii-2)包含SEQ ID NO: 251之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之FRL3胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat；及/或(viii)具有如下胺基酸序列之FRL4：(viii-1)與SEQ ID NO: 271之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之FRL4胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據Kabat；或(viii-2)包含SEQ ID NO: 271之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之FRL4胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat。
在某些實施例中，該VH2包含：(i)具有如下胺基酸序列之FRH1：(i-1)與SEQ ID NO: 311之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之FRH1胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或Kabat；(i-2)包含SEQ ID NO: 311之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381中所含之FRH1胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(i-3)由人類生殖系IGHV3-66*01編碼之FRH1組成或衍生於其；(ii)具有如下胺基酸序列之FRH2：(ii-1)與SEQ ID NO: 331之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之FRH2胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或Kabat；(ii-2)包含SEQ ID NO: 331之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381中所含之FRH2胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii-3)由人類生殖系IGHV3-66*01編碼之FRH2組成，或衍生於其；(iii)具有如下胺基酸序列之FRH3：(iii-1)與SEQ ID NO: 351之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之FRH3胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或Kabat；(iii-2)包含SEQ ID NO: 351之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381中所含之FRH3胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(iii-3)由人類生殖系IGHV3-66*01編碼之FRH3組成或衍生於其；及/或(iv)具有如下胺基酸序列之FRH4：(iv-1)與SEQ ID NO: 371之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之FRH4胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況根據IMGT或Kabat；(iv-2)包含SEQ ID NO: 351之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381中所含之FRH4胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(iv-3)由人類生殖系IGHV3-66*01編碼之FRH4組成或衍生於其。
在一些情況下，多特異性抗體或抗體片段可包含上文描述之VH1、上文描述之VL1及上文描述之VH2。
在一些特定實施例中，(A) VH1包含與SEQ ID NO: 181之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列；及/或VL1包含與SEQ ID NO: 281之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列；及/或(B) VH2包含與SEQ ID NO: 381之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。
在一些特定實施例中，(A) VH1包含含有SEQ ID NO: 181之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；及/或VL1包含含有SEQ ID NO: 281之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；及/或(B) VH2包含含有SEQ ID NO: 381之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
在特定實施例中，(A) VH1包含由SEQ ID NO: 181之胺基酸序列組成的胺基酸序列；及VL1包含由SEQ ID NO: 281之胺基酸序列組成的胺基酸序列；及(B) VH2包含由SEQ ID NO: 381之胺基酸序列組成的胺基酸序列。
在一些特定實施例中，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：(A)第一抗原結合區，其與Fzd4特異性結合且包含VH1及VL1；及(B)第二抗原結合區，其與LRP5及/或LRP6特異性結合且至少包含VH2， 其中：(i) VH1之CDRH1、CDRH2及CDRH3與具有SEQ ID NO: 181之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)的彼等者一致；(ii) VL1之CDRL1、CDRL2及CDRL3與具有SEQ ID NO: 281之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)的彼等者一致；及(iii)VH2之CDRH1、CDRH2及CDRH3與具有SEQ ID NO: 381之胺基酸序列之VH的彼等者一致。在特定實施例中：(i) VH1包含SEQ ID NO: 181之胺基酸序列或由其組成；(ii) VL1包含SEQ ID NO: 281之胺基酸序列或由其組成；及(iii) VH2包含SEQ ID NO: 381之胺基酸序列或由其組成。
在一些實施例中，(A)第一抗原結合區為抗原結合片段(Fab)、Fab'片段、F(ab') 2、單鏈Fab (scFab)、可變片段(Fv)、單鏈Fv (scFv)、雙功能抗體或三功能抗體，包含其或包含於其；及/或(B)第二抗原結合區：(i)為奈米抗體或Fd片段，包含其或包含於其；或(ii)進一步包含第二輕鏈可變域(VL2)，且為Fab、Fab'片段、F(ab') 2、scFab、Fv、scFv、雙功能抗體或三功能抗體，包含其或包含於其。
在一些實施例中，多特異性抗體或抗體片段包含以下中之一或多者：(a)免疫球蛋白重鏈恆定域1 (CH1)或其變體；(b)免疫球蛋白鉸鏈或其變體；(c)免疫球蛋白重鏈恆定域2 (CH2)或其變體；(d)免疫球蛋白重鏈恆定域3 (CH3)或其變體；及/或(e)免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)或其變體。
在某些實施例中，CH1或其變體：(a-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(a-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 21或22之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。
在某些實施例中，鉸鏈或其變體：(b-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(b-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。
在某些實施例中，CH2或其變體(c-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(c-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 41-46中之任一者之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。
在某些實施例中，CH3或其變體：(d-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(d-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 51-54、61-64及66-69中之任一者之胺基酸序列或由其組成(視情況不包括C端K)，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。
在某些實施例中，CL或其變體：(e-1)屬於κ輕鏈恆定域(CLκ)，視情況為人類CLκ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性；及/或(e-2)屬於λ輕鏈恆定域(CLλ)，視情況為人類CLλ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性。
在一些特定實施例中，多特異性抗體或抗體片段分別包含SEQ ID NO: 42及51，分別包含SEQ ID NO: 43及51，分別包含SEQ ID NO: 45及61，分別包含SEQ ID NO: 45及66，分別包含SEQ ID NO: 46及61或分別包含SEQ ID NO: 46及66之CH2及CH3序列。
在一些實施例中，多特異性抗體或抗體片段包含片段可結晶(Fc)區。
在某些實施例中，Fc區屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類或其變體。
在某些實施例中，IgG1或其變體之Fc區可包含以下胺基酸取代中之一或多者：N297A、N297Q、D265A、L234A、L235A、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、缺失G236、P238A、A327Q、A327G、P329A、P329G、K322A、L234F、L235E、P331S、T394D、A330L、P331S、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、S239D、I332E、S298A、E333A、K334A、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、K326D、A330M、K334E、G236A、K326W、S239D、E333S、S267E、H268F、S324T、E345R、E430G、S440Y M428L、N434S、H310A、L328F、M252Y、I253A、S254T、T256E、H435Q、H435A及/或其任何組合，根據EU編號。
在某些實施例中，IgG2或其變體之Fc區可包含以下胺基酸取代中之一或多者：P238S、V234A、G237A、H268A、H268Q、H268E、V309L、N297A、N297Q、A330S、P331S、C232S、C233S、M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合，根據EU編號。
在某些實施例中，IgG3或其變體之Fc區可包含胺基酸取代E235Y，根據EU編號。
在某些實施例中，IgG4或其變體之Fc區可包含以下胺基酸取代中之一或多者：E233P、F234V、L235A、G237A、E318A、S228P、L236E、S241P、L248E、T394D、M252Y、S254T、T256E、N297A、N297Q及/或其任何組合，根據EU編號。
在某些實施例中，Fc區可包含一或多個降低Fc效應功能之胺基酸取代。
在一些特定實施例中，該一或多個胺基酸取代位於選自由以下組成之群之位置處：位置234、235、236、237、265、297及329，根據EU編號。
在一些特定實施例中，該一或多個胺基酸取代至少包含以下胺基酸取代，根據EU編號：(ii-1) L234A、L235A及P329G；(ii-2) L234A及L235A；(ii-3) I253A、H310A及H435Q；(ii-4) I253A、H310A及H435A；(ii-5) D265A及P329A；(ii-6) M252Y、S254T及T256E；及/或(ii-7) M428L及N434S。視情況，此類取代可相對於人類IgG1 Fc區及/或相對於SEQ ID NO: 71-74中之任一者(視情況不包括C端K)。
在一些特定實施例中，Fc區可包含含有以下中之任一者或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 71-74、81-84、86-89、91-94、96-99、471-474、476-479、481-484及486-489 (視情況不包括C端K)。
在一些實施例中，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含如 圖 24 至圖 35中之任一者中所描繪的結構，視情況 圖 24中描繪的結構中之任一者。
在一些實施例中，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：(a)包含該VH1的第一多肽；及(b)包含該VH2及該VL1的第二多肽，其中第一及第二多肽視情況經由一或多個二硫鍵彼此相互作用，從而允許該VH1及VL1形成該第一抗原結合區。
在某些實施例中，(a)第一多肽以N端至C端之次序包含以下：(a-1)該VH1及(a-2) CH1或其變體，視情況其中CH1或其變體：(i)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類IgG1或IgG4；及/或(ii)包含含有SEQ ID NO: 21或22或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；(a-3)免疫球蛋白鉸鏈或其變體，視情況其中鉸鏈或其變體：(i)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類IgG1或IgG4；及/或(ii)包含含有SEQ ID NO: 31或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；(a-4) CH2或其變體，視情況其中CH2或其變體：(i)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類IgG1或IgG4；及/或(ii)包含含有SEQ ID NO: 41-46中之任一者或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；及(a-5) CH3或其變體，視情況其中CH3或其變體：(i)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類IgG1或IgG4；及/或(ii)包含含有SEQ ID NO: 51-54、61-64及66-69中之任一者(視情況不包括C端K)或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
在某些實施例中，(b)第二多肽以N端至C端之次序包含以下：(b-1)該VH2；(b-2)視情況連接子，其視情況為肽連接子，進一步視情況為可撓性連接子，視情況其中連接子：(i)包含一或多個胺基酸，視情況一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二個胺基酸；(ii)由小胺基酸組成，該等小胺基酸由G、S及/或A組成；(iii)包含含有選自由以下組成之群之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、G、GG、GGG、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GSS、SGS及SSG；及/或(iv)包含含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之多個重複序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、G、GG、GGG、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GSS、SGS及SSG；(b-3)該VL1；及(b-4) CL或其變體，視情況其中CL或其變體：(i)屬於CLκ，視情況為人類CLκ，且視情況包含含有以下或由以下組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 11或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列；或(ii)屬於CLλ，視情況為人類CLλ，且視情況包含含有以下或由以下組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 12或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列。
在一些情況下，多特異性抗體或抗體片段可包含上文所描述之第一多肽及上文所描述之第二多肽兩者。
在一些特定實施例中，多特異性抗體或抗體片段包含：視情況經由一或多個二硫鍵彼此形成二聚體之該等第一多肽中的兩者；及該等第二多肽中的兩者，其中該等第二多肽中之一者視情況經由二硫鍵與該等第一多肽中之一者相互作用，且該等第二多肽中之另一者視情況經由二硫鍵與該等第一多肽中之另一者相互作用。
在某些實施例中，多特異性抗體或抗體片段包含Fc區，其中Fc區：(I)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類或其變體；(II)至少包含以下胺基酸取代，根據EU編號：(ii-1) L234A、L235A及P329G；(ii-2) L234A及L235A；(ii-3) I253A、H310A及H435Q；(ii-4) I253A、H310A及H435A；(ii-5) D265A及P329A；(ii-6) M252Y、S254T及T256E；及/或(ii-7) M428L及N434S，視情況相對於人類IgG1 Fc區及/或相對於SEQ ID NO: 71-74中之任一者(視情況不包括C端K)；及/或(III)包含含有以下或由以下組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 71-74、81-84、86-89、91-94、96-99、471-474、476-479、481-484及486-489中之任一者(視情況不包括C端K)之胺基酸序列，或包含與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。
在一些特定實施例中，(a)第一多肽：(i)包含與SEQ ID NO: 2、7、8、9、450、451、452及453中之任一者(視情況不具有C端K)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列；(ii)包含含有SEQ ID NO: 402、407、408、409、460、461、462及463中之任一者(視情況不具有C端K)之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列，其中：X 1為任何胺基酸，視情況Q或K；X 2為任何胺基酸，視情況S、A、Q或N；X 3為任何胺基酸，視情況E、A、S或D；X 4為任何胺基酸，視情況N或D；X 5為任何胺基酸，視情況R或K；X 6為任何胺基酸，視情況E或T；及X 7為任何胺基酸，視情況D或不為S、E、A、R、T、L、H、Y、Q或K之任何胺基酸；及/或(iii)包含含有SEQ ID NO: 2、7、8、9、450、451、452及453中之任一者(視情況不具有C端K)之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
在一些特定實施例中，(b)第二多肽(i)包含與SEQ ID NO: 1具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列；及/或(ii)包含含有SEQ ID NO: 401之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列，其中：X 1為任何胺基酸，視情況E或D；X 2為任何胺基酸，諸如A或T；及X 3為任何胺基酸，諸如S；X 4為Q；X 5為任何胺基酸，諸如Y；X 6為任何胺基酸，諸如Q或G；X 7為任何胺基酸，諸如R；X 8為任何胺基酸，諸如L或W；X 9為任何胺基酸，諸如I；及X 10為任何胺基酸，諸如A；X 11為M；X 12為M；X 13為任何胺基酸，諸如D或G；X 14為任何胺基酸，諸如L；X 15為任何胺基酸，諸如M；X 16為任何胺基酸，諸如T；X 17為任何胺基酸，諸如D或E；X 18為任何胺基酸，諸如N或S；X 19為任何胺基酸，諸如S或A；X 20為任何胺基酸，諸如M；X 21為任何胺基酸，諸如R或K；及X 22為任何胺基酸，諸如A或P；X 23、X 24及X 25分別為任何胺基酸，只要(a) X 23及X 24分別為D及E，(b) X 23及X 25分別為D及D，及/或(c) X 24及X 25分別為E及D即可，視情況其中X 23、X 24及X 25分別為D、E及D，分別為D、D及D，分別為D、E及E，分別為D、E及S，分別為D、E及A，或分別為D、E及T；X 26為任何胺基酸，諸如R或W；及X 27為任何胺基酸，諸如Q或L；及/或(iii)包含含有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
在特定實施例中，(a)第一多肽包含含有SEQ ID NO: 2、7、450及451 (視情況不具有C端K)之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；及(b)第二多肽包含含有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
在其他特定實施例中，多特異性抗體或抗體片段包含：經由一或多個二硫鍵彼此形成二聚體之該等第一多肽中的兩者；及該等第二多肽中的兩者，其中該等第二多肽中之一者經由二硫鍵與該等第一多肽中之一者相互作用，且該等第二多肽中之另一者經由二硫鍵與該等第一多肽中之另一者相互作用。
在其他實施例中，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：(A)兩個或更多個Fzd4結合區，其中該等Fzd4結合區中之至少一者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及/或(B)兩個或更多個LRP5及/或LRP6結合區，其中該等LRP5及/或LRP6結合區中之至少一者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
在一些情況下，該多特異性抗體或抗體片段中所包含之該一或多個Fzd4結合區之數目與該一或多個LRP5及/或LRP6結合區之數目的比率可選自由以下組成之群：2:1、1:2、2:2、3:1、1:3、3:2、2:3、3:3、4:1、1:4、4:2、2:4、4:3、3:4及4:4。
在一些情況下，該多特異性抗體或抗體片段中所包含之該一或多個Fzd4結合區之數目及該一或多個LRP5及/或LRP6結合區之數目可：分別為2及1；分別為1及2；分別為2及2；分別為3及1；分別為1及3；分別為3及2；分別為2及3；分別為3及3；分別為4及1；分別為1及4；分別為4及2；分別為2及4；分別為4及3；分別為3及4；或分別為4及4。
在某些情況下，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：兩個相同Fzd4結合區，其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及一個LRP5及/或LRP6結合區，其為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
在某些情況下，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：兩個Fzd4結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中或(ii)其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及一個LRP5及/或LRP6結合區，其為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
在某些情況下，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：一個Fzd4結合區，其為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個相同LRP5及/或LRP6結合區，其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
在某些情況下，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：一個Fzd4結合區，其為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個LRP5及/或LRP6結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中或(ii)其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
在某些情況下，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：兩個相同Fzd4結合區，其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個相同LRP5及/或LRP6結合區，其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
在某些情況下，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：兩個Fzd4結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中或(ii)其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個相同LRP5及/或LRP6結合區，其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
在某些情況下，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：兩個相同Fzd4結合區，其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個LRP5及/或LRP6結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中或(ii)其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
在某些情況下，根據本發明之多特異性抗體或抗體片段可包含：兩個Fzd4結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中或(ii)其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個LRP5及/或LRP6結合區，其彼此不同(i)其中之至少一者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中或(ii)其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
在另一態樣中，本發明提供核酸，視情況其中根據本發明之核酸或核酸組合可編碼本文所描述之多特異性抗體及抗體片段中之任一者。
在一些實施例中，核酸可為DNA、cDNA、RNA、mRNA、經修飾之mRNA或DNA/RNA雜交體。
在一些實施例中，核酸或核酸組合可包含：(a)第一核酸，其編碼本文所描述之第一多肽中之任一者；及(b)第二核酸，其編碼本文所描述之第二多肽中之任一者。
在另一態樣中，本發明提供包含此等核酸之載體。
在一些實施例中，根據本發明之載體或載體組合可包含本文所描述之核酸中之任一者或核酸組合中之任一者。
在一些實施例中，載體包含一或多個與核酸以可操作方式連接之啟動子。
在一些實施例中，載體為表現載體。
在一些實施例中，載體包含質體、病毒載體(視情況腺相關病毒、腺病毒、慢病毒或逆轉錄病毒)、基於脂質之載體、自我複製RNA載體、病毒樣粒子、基於聚合物之載體及/或奈米粒子，視情況基於脂質之奈米粒子。
在一些實施例中，載體組合可包含：(a)第一載體，其包含編碼第一多肽之第一核酸；及(b)第二載體，其包含編碼第二多肽之第二核酸。
在另一態樣中，本發明提供包含此類核酸或載體之宿主細胞及細胞群體。
根據本發明之宿主細胞可包含：(A)本文所描述之多特異性抗體及抗體片段中之任一者；(B)本文所描述之核酸中之任一者或核酸組合中之任一者；及/或(C)本文所描述之載體中之任一者或載體組合中之任一者。
在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠。
在一些實施例中，宿主細胞為非哺乳動物，視情況為植物、細菌、真菌、酵母、原生動物或昆蟲。
在某些實施例中，宿主細胞為：(i)人類胚胎腎(human embryonal kidney；HEK)細胞，視情況為HEK293細胞或其變體，進一步視情況為Expi293F™細胞；(ii)中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary；CHO)細胞；(iii)免疫細胞；或(iv)融合瘤。
在一些實施例中，根據本發明之細胞群體可包含本文所描述之任一宿主細胞中之兩者或更多者。
在另一態樣中，本發明提供含有前述中之任一者之醫藥組合物。根據本發明之醫藥組合物可包含：(A)本文中所描述之多特異性抗體及抗體片段中之任一者；(B)本文中所描述之核酸中之任一者或核酸組合中之任一者；(C)本文中所描述之載體中之任一者或載體組合中之任一者；及/或(D)本文中所描述之宿主細胞或細胞群體中之任一者；及(II)醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
在另一態樣中，本發明提供活體內方法，諸如治療個體之方法；治療或預防個體之疾病、病症或病狀之方法；及誘導、促進、刺激、增強及/或支持個體之目標細胞中之Wnt傳訊之方法。
在一些態樣中，根據本發明之治療需要此類治療之個體之方法可包含向個體投與有效量之：(A)本文所描述之多特異性抗體或抗體片段中之任一者；(B)本文所描述之核酸或核酸組合中之任一者；(C)本文所描述之載體或載體組合中之任一者；(D)本文所描述之宿主細胞或細胞群體中之任一者；及/或(E)本文所描述之醫藥組合物中之任一者。
在一些實施例中，個體患有疾病、病症或病狀或具有罹患疾病、病症或病狀之風險，例如因為遺傳或潛在疾病或共病。
在一些實施例中，本發明提供治療或預防需要此類治療之個體之疾病、病症或病狀之方法，其可包含投與有效量之：(A)本文所描述之多特異性抗體或抗體片段中之任一者；(B)本文所描述之核酸或核酸組合中之任一者；(C)本文所描述之載體或載體組合中之任一者；(D)本文所描述之宿主細胞或細胞群體中之任一者；及/或(E)本文所描述之醫藥組合物中之任一者。
在一些態樣中，根據本發明之誘導、促進、刺激、增強及/或支持個體之目標細胞中之Wnt傳訊之方法可包含向個體投與有效量之：(A)本文所描述之多特異性抗體或抗體片段中之任一者；(B)本文所描述之核酸或核酸組合中之任一者；(C)本文所描述之載體或載體組合中之任一者；(D)本文所描述之宿主細胞或細胞群體中之任一者；及/或(E)本文所描述之醫藥組合物中之任一者。
在一些實施例中，Wnt傳訊為Wnt/β-連環蛋白傳訊或包含其。
在一些實施例中，該方法促進、刺激、增強及/或支持募集多種受體複合物，該等受體複合物各自包含(i) Fzd4及(ii) LRP5或LRP6。
在本文所揭示之活體內方法中之任一者中，個體通常為哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠。
在本文所揭示之活體內方法中之任一者中，個體可包含非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物。
在本文所揭示之活體內方法中之任一者中，在一些情況下，個體患有疾病、病症或病狀或具有罹患疾病、病症或病狀之風險，例如因為遺傳或另一潛在疾病或共病。
在本文所揭示之活體內方法中之任一者中，該方法可進一步包含向個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑。
在本文揭示之活體內方法中之任一者中，疾病、病症或病狀可包含視網膜病變，視情況為視網膜血管疾病(視情況由血管發育之抑制或過量血管生成引起)及/或視情況選自由以下組成之群：滲出性玻璃體視網膜病變、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、早產兒視網膜病變、諾里氏病(Norrie disease)、糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy；DR)、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性黃斑缺血、老年性黃斑變性(AMD) (包括濕性AMD及乾性AMD)、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity；ROP)、骨質疏鬆假膠質瘤症候群(OPPG)、視網膜靜脈阻塞及科阿氏病(Coats disease)。
在本文所揭示之活體內方法中之任一者中，疾病、病症或病狀可包含血管病症，視情況血管畸形或血管功能不全，進一步視情況與缺血誘發之新血管生成相關。
在本文所揭示之活體內方法中之任一者中，疾病、病症或病狀可包含骨骼疾病或骨骼損傷，視情況選自由以下組成之群：骨質疏鬆(包括骨質疏鬆假膠質瘤(OPPG)症候群及幼年型原發性骨質疏鬆)、骨礦物質密度變化及癌症相關骨質溶解。
在本文揭示之活體內方法中之任一者中，疾病、病症或病狀可包含肌肉萎縮疾病，視情況選自由以下組成之群：肌肉減少症、惡病質及肌肉失養症。
在本文揭示之活體內方法中之任一者中，疾病、病症或病狀可包含神經或神經退化性疾病，視情況選自由以下組成之群：中風、創傷性腦損傷、癲癇症、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、巴金森氏症(Parkinson's disease)、杭丁頓氏症(Huntington's disease)、肌萎縮性脊髓側索硬化症、弗里德賴希共濟失調(Friedreich ataxia)、路易體疾病(Lewy body disease)、脊髓性肌肉萎縮症、運動神經元疾病、多發性硬化、巴登氏病(Batten disease)及庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)。
在本文所揭示之活體內方法中之任一者中，活性劑之投與可為向個體的一或多隻眼睛，視情況玻璃體內或經由眼部滴劑。
在本文揭示之活體內方法中之任一者中，活性劑之投與可局部進行，視情況向眼睛、耳、鼻(視情況鼻內)、皮膚(視情況透皮或經上表皮)、黏膜、皮膚或陰道，或藉由吸入。
在本文揭示之活體內方法中之任一者中，活性劑之投與可非經腸投與進行，視情況藉由注射(視情況靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、鞘內、動脈內、關節內、骨內或腹膜內投與)或藉由吸入。
在本文所揭示之活體內方法中之任一者中，活性劑之投與可經腸進行，視情況經口、舌下、經頰或經直腸。
在本文揭示之活體內方法中之任一者中，活性劑之投與可包含以如下向個體的一或多隻眼睛投與本文所描述之多特異性抗體或抗體片段中之任一者：每隻眼約0.1-100000 ng、每隻眼約1-100000 ng、每隻眼約1-10000 ng、每隻眼約10-10000 ng、每隻眼約1-100 ng、每隻眼約200-300 ng、每隻眼約300-400 ng、每隻眼約400-500 ng、每隻眼約500-600 ng、每隻眼約600-700 ng、每隻眼約700-800 ng、每隻眼約800-900 ng、每隻眼約900-1000 ng、每隻眼約1000-2000 ng、每隻眼約2000-3000 ng、每隻眼約3000-4000 ng、每隻眼約4000-5000 ng、每隻眼約5000-6000 ng、每隻眼約6000-7000 ng、每隻眼約7000-8000 ng、每隻眼約8000-9000 ng、每隻眼約9000-10000 ng、每隻眼約10000-20000 ng、每隻眼約20000-30000 ng、每隻眼約30000-40000 ng、每隻眼約40000-50000 ng、每隻眼約50000-60000 ng、每隻眼約60000-70000 ng、每隻眼約70000-80000 ng、每隻眼約80000-90000 ng或每隻眼約90000-100000 ng。
在另一態樣中，本發明提供誘導、促進、刺激、增強及/或調節目標細胞中之Wnt傳訊之方法。
在一些態樣中，誘導、促進、刺激、增強及/或支持目標細胞中之Wnt傳訊之此類方法可包含使目標細胞與有效量之以下各者接觸：(A)本文所描述之多特異性抗體或抗體片段中之任一者；(B)本文所描述之核酸或核酸組合中之任一者；(C)本文所描述之載體或載體組合中之任一者；(D)本文所描述之宿主細胞或細胞群體中之任一者；及/或(E)本文所描述之醫藥組合物中之任一者。
在一些實施例中，接觸在活體外進行。
在一些實施例中，接觸在離體進行。
在一些實施例中，接觸在活體內進行。
在一些實施例中，該方法包含(i)製備用於植入之細胞及/或組織，(ii)分化幹細胞，及/或(iii)製備類器官。
在一些實施例中，該方法引發或促進骨形成、血管形成及/或神經形成及/或分化。
在另一態樣中，本發明提供製造本文所描述之多特異性抗體及抗體片段中之任一者之方法。
在一些態樣中，製造本文所描述之多特異性抗體及抗體片段中之任一者之方法可包含：(a)在允許該多特異性抗體或抗體片段表現之條件下培養包含編碼多特異性抗體或抗體片段之核酸或核酸組合中之任一者的細胞；及(b)自來自(a)之細胞培養物收穫及純化所得多特異性抗體或抗體片段。
在另一態樣中，本發明提供製造本文所描述之宿主細胞中之任一者或細胞群體中之任一者之方法。
在一些態樣中，製造本文所描述之宿主細胞或此類細胞群體中之任一者之方法可包含將本文所描述之核酸或核酸組合中之任一者及/或本文所描述之載體或載體組合引入一或多個細胞中。
在一些實施例中，引入在活體外進行。
在一些實施例中，引入在離體進行。
在一些實施例中，引入在活體內進行。
本文所描述之多特異性抗體或抗體片段中之任一者、本文所描述之核酸或核酸組合中之任一者、本文所描述之載體或載體組合中之任一者、本文所描述之宿主細胞或細胞群體中之任一者及/或本文所描述之醫藥組合物可用於醫療。
本文所描述之多特異性抗體或抗體片段中之任一者、本文所描述之核酸或核酸組合中之任一者、本文所描述之載體或載體組合中之任一者、本文所描述之宿主細胞或細胞群體中之任一者及/或本文所描述之醫藥組合物可用於治療疾病、病症或病狀，例如涉及Wnt傳訊之疾病、病症或病狀。
在一些實施例中，疾病、病症或病狀包含本文所描述之任一疾病中之一或多者。
本發明進一步涵蓋一種以下各者之用途：本文所描述之多特異性抗體或抗體片段中之任一者、本文所描述之核酸或核酸組合中之任一者、本文所描述之載體或載體組合中之任一者、本文所描述之宿主細胞或細胞群體中之任一者及/或本文所描述之醫藥組合物，其用於製造用於治療疾病、病症或病狀的藥劑。
在一些實施例中，疾病、病症或病狀包含本文所描述之任一疾病中之一或多者。
本發明部分地基於Wnt傳訊促效劑及拮抗劑調節視網膜病變適應症中之異常血管形成之用途。
在一些實施例中，本發明提供治療罹患視網膜病變之個體之方法，其包含向個體投與經工程改造之Wnt傳訊促效劑。在其他實施例中，經工程改造之Wnt促效劑包含與一或多種Fzd受體結合的結合組合物以及與一或多種LRP受體結合的結合組合物。
在一個態樣中，本發明提供一種經工程改造之Wnt傳訊促效劑，其中Wnt傳訊促效劑包含：兩條輕鏈，各自包含與SEQ ID NO: 1具有至少95%一致性之多肽序列；及兩條重鏈，各自包含與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之多肽序列，其中兩條重鏈彼此結合，且兩條輕鏈中之各者與Wnt傳訊促效劑之不同重鏈結合。在某些實施例中，兩條輕鏈中之各者包含含有以下胺基酸殘基修飾中之一或多者之VHH域：N29Q及/或經DED取代之hVHH3-H4 DDD (胺基酸101-103)。在某些實施例中，兩條重鏈中之各者包含以下胺基酸殘基中之一或多者：CDR1 S31、CDR2 E62及/或CDR3 D108。
在另一態樣中，本發明提供一種核酸，其包含編碼本文揭示之經工程改造之Wnt傳訊促效劑(例如hp4SD1-03或其片段或變體)之一或多個輕鏈及/或一或多個重鏈的序列。在某些實施例中，核酸為mRNA，例如經修飾之mRNA。
在一相關態樣中，本發明提供一種載體，其包含本文揭示之核酸，例如包含編碼hp4SD1-03或其片段或變體之一或多個輕鏈及/或一或多個重鏈之序列的核酸。在特定實施例中，載體為表現載體，其包含與核酸以可操作方式連接之啟動子，諸如病毒載體。
在一相關實施例中，本發明提供一種宿主細胞，其包含本文揭示之載體或核酸，例如包含編碼hp4SD1-03或其片段或變體之一或多個輕鏈及/或一或多個重鏈之序列的載體或核酸。在某些實施例中，宿主細胞為重組細胞。在某些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑；以及： a)本文所揭示之經工程改造之Wnt傳訊促效劑； b)本文揭示之核酸；及/或 c)本文所揭示之載體。
在某些實施例中，醫藥組合物包含hp4SD1-03或其片段或變體，或核酸編碼hp4SD1-03或其片段或變體之一或多個輕鏈及/或一或多個重鏈，或載體包含含有編碼hp4SD1-03或其片段或變體之一或多個輕鏈及/或一或多個重鏈之序列的核酸。
在另一態樣中，本發明提供一種治療個體之視網膜病變之方法，其包含向個體投與： a)本文所揭示之經工程改造之Wnt傳訊促效劑； b)本文揭示之核酸； c)本文揭示之載體，及/或 d)本文揭示之醫藥組合物。
在某些實施例中，經工程改造之Wnt傳訊促效劑為hp4SD1-03或其片段或變體，或醫藥組合物包含hp4SD1-03或其片段或變體，或核酸編碼hp4SD1-03或其片段或變體之一或多個輕鏈及/或一或多個重鏈，或載體包含含有編碼hp4SD1-03或其片段或變體之一或多個輕鏈及/或一或多個重鏈之序列的核酸。
在所揭示之治療方法之某些實施例中，所治療之視網膜病變為視網膜血管疾病。在某些實施例中，視網膜血管疾病係由血管發育之抑制引起。在某些實施例中，視網膜病變係由過量血管生成引起。在某些實施例中，視網膜病變為早期視網膜病變或晚期視網膜病變。在一些實施例中，視網膜血管疾病選自由以下組成之群：家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、滲出性玻璃體視網膜病變、諾里氏病、糖尿病性視網膜病變(DR)、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性黃斑缺血、老年性黃斑變性(AMD) (包括濕性AMD及乾性AMD)、早產兒視網膜病變(ROP)、骨質疏鬆假膠質瘤症候群(OPPG)、視網膜靜脈阻塞及科阿氏病。經工程改造之Wnt傳訊促效劑可經由各種投與途徑投與，包括但不限於全身性或局部，諸如靜脈內、皮下、經口、局部、經鼻、玻璃體內、脈絡膜上或視網膜下。在某些實施例中，經工程改造之Wnt傳訊促效劑係向個體的一或多隻眼睛投與，例如玻璃體內。
相關申請案之交互參考
本申請案主張以下各者之優先權：2021年12月31日申請之美國臨時申請案第62/295,805號；2022年1月11日申請之美國臨時申請案第63/298,570號；及2022年8月17日申請之美國臨時申請案第63/398,754號。該等申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
除非上下文另外明確規定，否則如本文(包括隨附申請專利範圍)所用，諸如「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」之字語的單數形式包括其對應複數個提及物。
本文中引用之所有參考文獻以引用之方式併入，其引用程度如同特定且個別地將各個別公開案、專利申請案或專利以引用的方式併入一般。不應將本文之任何內容解釋為承認本發明無權先於憑藉先前發明之此類揭示內容。 I.   定義。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般熟習技術者所理解相同之含義。
應瞭解，在本說明書中所使用之術語僅出於描述特定型式或實施例之目的，且並不意欲限制將僅由所附申請專利範圍限制的本發明之範疇。
如本文所用，當參考特定敍述數值使用時，術語「約」意謂值可與敍述值相差不超過10%。舉例而言，如本文所用，表述「約100」包括90及110以及其間的所有值(例如91、92、93、99、99.1、99.2、99.3、99.4、100、100.8、100.9、101、106、107、108、109等)。
分子之「活性」可描述或係指分子對配體或對受體之結合，係指催化活性，誘導、促進、增強及/或支持一或多個目標分子(例如抗原)多聚化(例如二聚化、三聚化、四聚化等)的能力，誘導、促進、增強及/或支持表現一或多個目標分子(例如抗原)之細胞中之訊號轉導的能力，改變(例如刺激或抑制)基因表現的能力，抗原活性，對其他分子之活性的調節(諸如對一或多個目標分子(例如抗原)具有特異性之配體之活性)及其類似者。分子之「活性」亦可指調節或維持細胞間相互作用，例如黏附之活性，或維持細胞結構，例如細胞膜或細胞骨架之活性；或治療效果。「活性」亦可意謂比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白質]或[免疫活性]/[mg蛋白質]或其類似者。
如本文所用，術語「投與」或「引入」係指將根據本發明之化合物或組合物遞送至細胞；至個體之細胞、組織及/或器官；或至個體。此類投與或引入可在活體內、活體外或離體進行。
如本文所用，術語「抗體」意謂一種經分離或重組結合劑，其包含特異性結合抗原性抗原決定基所必需的可變區序列。因此，抗體為展現所需生物活性(例如結合特定目標抗原)之抗體或其片段之任何形式。因此，其就最廣義使用且尤其涵蓋單株抗體(包括全長或完整單株抗體)、多株抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、奈米抗體、雙功能抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，包括但不限於scFv、Fab及F(ab') 2，只要其展現所需生物活性即可。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，例如完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fab'-SH及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(例如Zapata等人, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995))；單鏈抗體分子(例如scFv)；半抗體；奈米抗體或僅VH，或僅VL；及由抗體片段形成之多特異性抗體。當提及IgG、IgE或IgD時，亦可分別稱為「半IgG」、「半IgE」或「半IgD」的術語「半分子」或「半抗體」係指參考抗體之一個重鏈及一個輕鏈之集合。木瓜酶消化抗體產生兩個相同抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自具有單一抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映容易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生F(ab') 2片段，其具有兩個抗原組合位點且仍能夠與抗原交聯。
術語「完整抗體」、「全長抗體」及「完全抗體」或其類似者在本文中可互換使用且係指結構實質上類似於原生抗體之抗體。在一些情況下，抗體包含藉由二硫鍵互連之重鏈(H)及輕鏈(L)。存在五個主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等抗體中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。舉例而言，完整IgG (或IgD或IgE)抗體包含兩個免疫球蛋白重鏈及兩個免疫球蛋白輕鏈。因此，在一些情況下，根據本發明之抗體可包含藉由二硫鍵互連之兩對重鏈及輕鏈或其抗原結合片段。一些完整抗體包含各自包含藉由二硫鍵互連之兩對重鏈及輕鏈的多個單元。舉例而言，完整IgA包含兩個單元，且完整IgM包含五個單元。因此，在其他情況下，根據本發明之抗體可實際上包含各自包含藉由二硫鍵互連之兩對重鏈及輕鏈的多個(例如，兩個、三個、四個、五個等)單元或其抗原結合片段。
在完整抗體中，各重鏈由以下構成：重鏈可變域(VH)；及重鏈恆定區(CH)，其通常由CH1、CH2及CH3域構成。各輕鏈由以下構成：輕鏈可變域(VL)；及輕鏈恆定域(CL)。通常(具有一些例外，諸如奈米抗體、駱駝化重鏈抗體、IgNAR及其類似者)，一個VH及一個VL可形成抗原結合區。VH及VL區可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(complementarity determining region；CDR)，穿插有稱為構架區(framework region；FR)之更保留區。各VH及VL多肽由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈中之CDR分別稱為「CDRH1」、「CDRH2」及「CDRH3」，且輕鏈中之CDR稱為「CDRL1」、「CDRL2」及「CDRL3」。重鏈中之FR分別稱為「FRH1」、「FRH2」、「FRH3」及「FRH4」，且輕鏈中之FR稱為「FRL1」、「FRL2」、「FRL3」及「FRL4」。在本發明之某些實施例中，抗體(或其抗原結合片段)之FR可與人類生殖系編碼之序列(例如由VH1-03生殖系編碼之重鏈FR序列；及/或由VK4-01生殖系編碼之輕鏈FR序列)相同，或可經天然或人工修飾。胺基酸共同序列可以基於兩個或更多個CDR之並列分析來確定。
片語「重鏈」或「HC」在其最廣泛的意義上使用，且涵蓋包含至少一個免疫球蛋白重鏈域或部分(亦即，VH、CH1、鉸鏈、CH2及CH3中之至少一者)之多肽。類似地，片語「輕鏈」或「LC」在其最廣泛的意義上使用，且涵蓋包含至少一個免疫球蛋白輕鏈域(亦即，VL及CL中之至少一者)的多肽。
抗體可變域及/或恆定域中胺基酸殘基之編號可藉由任何適當編號方案、方法及定義進行。舉例而言，CDR序列可基於Kabat編號或IMGT編號，或者Chothia編號、Martin編號(亦稱為AbM編號)、Gelfand編號、Honneger's編號(亦稱為AHo's編號)或針對可變區之化學計算組(Chemical Computing Group；CCG)編號來確定，或可結構上確定(參見例如IgBlast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)；Dondelinger等人, Front Immunol.2018 Oct 16;9:2278；http://www.bioinf.org.uk/abs/info.html#cdrid；http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/anarci/)。對於恆定域而言，可例如使用EU編號、IMGT編號或Kabat編號。除非另外指示，否則對於恆定域及區域使用EU編號。
根據IMGT (免疫球蛋白或抗體、T細胞受體、MH、免疫球蛋白超家族IgSF及MhSF之國際免疫遺傳學資訊系統(the international ImMunoGeneTics information system for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MH, immunoglobulin superfamily IgSF and MhSF))、CH1域、鉸鏈區、CH2域及CH3域分別對應於胺基酸位置118-215、216-230、231-340及341-446 (EU編號)。術語「CH1域」、「鉸鏈」、「CH2域」及「CH3」在本文中在廣義上使用以涵蓋任何天然存在的、對應重鏈恆定域及/或區同種異型及其變體，其可包含更少或更多胺基酸(例如CH1域可包含鉸鏈區之一部分)及/或胺基酸修飾。
人類IgG1之例示性CH1域可包含SEQ ID NO: 21或22之胺基酸序列；人類IgG1之例示性鉸鏈可包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列；及人類IgG1之CH2域可包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列。人類IgG1之例示性CH3域可包含SEQ ID NO: 51、52、53或54之胺基酸序列，且此類CH3序列可移除C端K。此類例示性序列之任何變體可結合本文所描述之CDR及/或可變域序列使用。
「Fc區」為含有恆定區之至少一部分(包括原生序列Fc區及變異Fc區)之免疫球蛋白重鏈的C端區。人類IgG重鏈Fc區可自Asp221延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外規定，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md, 1991中所描述。
片語抗體之「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之生物活性，其在抗體同型間變化。例示性效應功能包括：補體(例如C1q)結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下調細胞表面受體(例如B細胞受體)；及B細胞活化。
存在兩個主要輕鏈同型kappa (κ)及lambda (λ)，且對應輕鏈恆定域分別稱為κCL域(CLκ)及λCL域(CLλ)。
根據IMGT，CLκ域為胺基酸位置108-214 (EU編號)。人類IgG之例示性CLκ域可包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。根據IMGT，CLλ域為胺基酸位置107-215 (EU編號)。人類IgG之例示性CLλ域可包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
術語「CLκ」及「CLλ」在本文中在廣義上使用以涵蓋任何天然存在的、對應輕鏈恆定域及/或區同種異型及其變體，其可包含更少或更多胺基酸及/或胺基酸修飾。
人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之恆定域之各種標準序列(對應於不同同種異型)在本領域中為已知的，且可發現於例如Vidarsson等人, Front Immunol.2014年10月20日;5:520及美國專利第9150663號中，其揭示內容在此以全文引用之方式併入本文中。同樣，此等參考序列意欲為例示性的，因為申請人意欲人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4序列包括任何天然存在之人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4同種異型。
「抗原結合區」係指對抗原具有特異性之抗體或抗原結合片段之一部分。在一些情況下，抗原結合區可包含VH及VL。在一些情況下，抗原結合區可包含VH且無VL，例如在奈米抗體之情況下。
術語「抗原」係指能夠與選擇性結合劑(諸如抗體)結合且另外能夠用於動物中以產生能夠與彼抗原之抗原決定基結合之抗體的分子或分子之一部分。在某些實施例中，結合劑(例如，Wnt替代物分子或其結合區，或Wnt拮抗劑)在其優先識別其在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之目標抗原時稱為特異性結合抗原。
片語「不同抗原」可指不同及/或相異的蛋白質、多肽或分子；以及不同及/或相異的抗原決定基，該等抗原決定基可含於一個蛋白質、一個多肽或一個分子內。「抗原結合片段」或「抗原結合抗體片段」係指完整抗體之一部分或衍生自結合完整抗體所結合之抗原的一或多種完整抗體之部分之組合。如本文所用，術語「抗原結合片段」可指含有免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈、或與所關注之抗原結合之VHH/sdAb (單域抗體)或Nanobody® (Nab)的至少一個CDR的多肽片段，尤其係指一或多種Fzd受體，或指LRP5及/或LRP6。就此而言，本文所描述之抗體的抗原結合片段可包含來自結合一或多種Fzd受體或LRP5及/或LRP6之抗體的VH及VL之1個、2個、3個、4個、5個或所有6個CDR。抗體之抗原結合片段包括特異性結合抗原以形成複合物之任何天然存在、酶促可獲得、合成或經基因工程改造的多肽或醣蛋白。
如本文所用，術語「生物活性」及「生物學活性」係指歸因於細胞中之特定生物元件的活性。舉例而言，Wnt促效劑或其片段或變異體之「生物活性」係指模擬或增強Wnt訊號之能力。作為另一實例，多肽或其功能片段或變體之生物活性係指該多肽或其功能片段或變體發揮其例如結合、酶活性等天然功能的能力。作為第三實例，基因調控元件，例如啟動子、強化子、Kozak序列及其類似者之生物活性係指該調控元件或其功能片段或變體分別調控，亦即促進、增強其以可操作方式連接之基因之表現或活化該基因之轉譯的能力。
如本文所用，術語「雙功能抗體」係指包含對一個抗原位點具有特異性之第一臂及對不同抗原位點具有特異性之第二臂的抗體，亦即，雙功能抗體具有雙特異性。
關於多特異性抗體(例如雙特異性、三特異性、四特異性等等)，此類抗體包含至少兩個不同的識別且與至少兩個不同抗原或抗原決定基特異性結合之抗原結合區。不同抗原決定基可在或可不在相同抗原內。「雙特異性抗體」為一種類型之多特異性抗體，且包含兩個不同的識別且與兩個不同抗原或兩個抗原決定基特異性結合之抗原結合區。雙特異性抗體可靶向例如相同或不同細胞上之兩種不同表面受體。「雙特異性抗體」在本文中用於涵蓋藉由四聯瘤(quadroma)技術(參見Milstein等人, Nature, 305(5934): 537-540 (1983))、藉由兩種不同單株抗體之化學結合(參見Staerz等人, Nature, 314(6012): 628-631 (1985))或藉由杵-臼(knob-into-hole)或類似方法產生之全長抗體，其在Fc區中引入突變(參見Holliger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993))，產生多種不同免疫球蛋白物種，其中僅一種為功能性雙特異性抗體。雙特異性抗體在其兩個結合臂(一對HC/LC)中之一者上結合一個抗原(或抗原決定基)，且在其第二臂(不同的HC/LC對)上結合不同抗原(或抗原決定基)。藉由此定義，雙特異性抗體具有兩個不同抗原結合臂(在特異性及CDR序列兩者中)。
「包含」意謂，所敍述之要素係例如組合物、方法、套組等中所需的，但亦可包括其他要素以形成在申請專利範圍之範疇內的例如該組合物、方法、套組等。舉例而言，「包含」以可操作方式連接至啟動子的編碼治療多肽之基因的表現卡匣為除該基因及啟動子外，亦可包括其他元件，例如聚腺苷酸化序列、強化子元件、其他基因、連接子域等的表現卡匣。
「保留胺基酸取代」為胺基酸殘基經側鏈(R基)之化學特性(例如電荷或疏水性)類似之另一胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保留胺基酸取代將不會實質上改變蛋白質之功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列彼此間差異為保留取代的情況下，可上調相似性百分比或相似度以校正取代之保留性質。作出此調節之手段為熟習此項技術者熟知的。(參見例如Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307- 331)。具有帶類似化學特性之側鏈的胺基酸群組之實例包括：1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7)含硫之側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。在一些實施例中，保留胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。或者，在一些實施例中，保留置換包含在Gonnet等人(1992) Science256: 1443 45中所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值之任何變化。在一些實施例中，「中等保留」置換包含在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之任何變化。
「基本上由……組成」意謂將所描述的例如組合物、方法、套組等之範疇限制於不會實質上影響例如該組合物、方法、套組等之基本及新穎特徵的指定材料或步驟。舉例而言，「基本上由」以可操作方式連接至啟動子及聚腺苷酸化序列的編碼治療多肽之基因「組成」的表現卡匣可包括額外序列，例如連接子序列，只要其不會實質上影響該基因之轉錄或轉譯即可。作為另一實例，「基本上由」所敍述之序列「組成」的變體或突變體多肽片段基於衍生其之全長原生多肽而在序列之邊界處具有所敍述之序列±約10個胺基酸殘基的胺基酸序列，例如比所敍述之邊界胺基酸殘基少10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個殘基，或比所敍述之邊界胺基酸殘基多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基。
「由……組成」意謂自組合物、方法或套組排除申請專利範圍中未說明之任何元件、步驟或成分。舉例而言，「由」所敍述之序列「組成」的多肽或多肽域僅含所敍述之序列。
「控制元件」或「控制序列」為參與促成包括聚核苷酸之複製、倍增、轉錄、剪接、轉譯或降解的聚核苷酸之功能調控之分子的相互作用之核苷酸序列。該調控可影響該過程之頻率、速度或特異性，且可為增強性或抑制性的性質。此項技術中已知之控制元件包括例如轉錄調控序列，諸如啟動子及強化子。啟動子為在某些條件下能夠結合RNA聚合酶且開啟通常位於啟動子下游(沿3'方向)之編碼區之轉錄的DNA區域。
本文揭示之抗體或組合物(例如醫藥組合物)之「有效量」為至少為達成所需治療或預防結果，例如特定病症(例如視網膜病變)之可量測改善或預防，較佳具有最少或沒有毒性或有害作用時所需要的最少量。有效量可尤其根據患者之疾病病況、年齡、性別及體重，及抗體(或其抗原結合片段)在個體中誘發所需反應之能力以及在一些情況下共同投與一或多種額外治療劑而變化。
「表現載體」為如本文所論述或如此項技術中已知之載體，例如質體、小環、病毒載體、脂質體及其類似者，其包含編碼所關注基因產物之區域，且用於實現基因產物在預定目標細胞中之表現。表現載體亦包含以可操作方式連接至編碼區以促進基因產物在目標中之表現的控制元件，例如啟動子、強化子、UTR、miRNA靶向序列等。控制元件與一或多個以可操作方式連接以進行表現之基因的組合有時稱為「表現卡匣」，其中許多組合為此項技術中已知且可以獲得，或可由此項技術中可得到的組分容易地構築。
如本文所用，術語「FR組」係指四個側接胺基酸序列，其構架重鏈或輕鏈V區之CDR組之CDR。一些FR殘基可接觸已結合的抗原；然而，FR主要負責摺疊V區成為抗原結合位點，尤其與CDR直接相鄰之FR殘基。在FR內，某些胺基酸殘基及某些結構特徵極高度保留。就此而言，所有V區序列含有約90個胺基酸殘基之內部二硫環。當V區摺疊成為結合位點時，CDR呈現為形成抗原結合表面之突出環模體。一般認為存在FR保留結構區，其影響CDR環形成某些「典型」結構之摺疊形狀，與精確CDR胺基酸序列無關。此外，已知某些FR殘基參與非共價的域間接觸，該等接觸使抗體重鏈及輕鏈之相互作用穩定。
捲曲家族為捲曲類受體之家族，其為通常與輔受體(諸如LRP5、LRP6或ROR1/2)一起在無翅基因/整合(Wnt)及其他傳訊路徑中充當受體之G蛋白偶聯受體。捲曲家族成員包括捲曲類受體1-10 (Fzd1、Fzd2、Fzd3、Fzd4、Fzd5、Fzd6、Fzd7、Fzd8、Fzd9及Fzd10)。
捲曲類受體4 (Fzd4)為捲曲家族之成員，Fzd4家族亦可稱為CD344、EVR1、FEVR捲曲4、捲曲家族受體4、捲曲同源物4、Fz4、Fz-4、Fzd4S、FzE4、MGC34390或Wnt受體捲曲-4。在人類中，Fzd4由染色體11上之 Fzd4基因編碼，具有基因位置11q14.2 (NCBI，基因ID：8322)。在一些實施例中，人類Fzd4可具有如GenBank: AAR23924.1或SEQ ID NO: 4提供之胺基酸序列，或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基。
若干疾病及/或表型係由 Fzd4基因中之一或多種改變或 Fzd4基因表現改變引起。根據OMIM®資料庫(https://www.omim.org/)， Fzd4基因之遺傳病包括：滲出性玻璃體視網膜病變1 (表型MIM編號133780，體染色體顯性)；及早產兒視網膜病變(表型MIM編號133780，體染色體顯性)。根據MedlinePlus (NIH，https://medlineplus.gov/genetics/gene/)，涉及 Fzd4基因中之遺傳變化之疾病包括家族性滲出性玻璃體視網膜病變。
術語「宿主細胞」係指引入外源性核酸序列之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括原代轉型細胞及自其衍生之後代(不考慮繼代次數)。
術語「個體(individual)」、「宿主」、「個體(subject)」及「患者」在本文中可互換地使用，且係指哺乳動物，包括但不限於人類及非人類靈長類動物，包括猿猴及人類；哺乳動物運動型動物(例如馬)；哺乳動物農畜(例如綿羊、山羊等)；哺乳動物寵物(狗、貓等)；及嚙齒動物(例如小鼠、大鼠等)。
低密度脂蛋白受體(Low density lipoprotein receptor；LDLR)涉及多種細胞功能，包括血液中膽固醇之主要運載體低密度脂蛋白(low-density lipoprotein；LDL)之胞吞作用。LDLR家族成員包括LDL受體；低密度脂蛋白受體相關蛋白1、1b、2、3、4、5、6及8 (LRP1、LRP1b、LRP2、LRP3、LRP4、LRP5、LRP6及LRP8)；LR11；及極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein；VLDL)受體(Ren等人, Front Cell Dev Biol.2021年5月6日;9:670960.)。
在LDLR中，LRP5及LRP6在其結構及功能方面為獨特的。舉例而言，LRP5及LRP6兩者亦可藉由與另一受體(諸如另一Wnt受體(例如Fzd受體))形成受體複合物，而分別用作Wnt及其他配體之輔受體，且介導傳訊。
LRP5亦可稱為BMND1、EVR1、EVR4、HBM、LR3、低密度脂蛋白受體相關蛋白7 (LRP7)、OPPG、OPS、OPTA1或VBCH2。在人類中，LRP5由染色體11上之 LRP5基因編碼，具有基因位置11q13.2 (NCBI，基因ID：4041)。在一些實施例中，人類LRP5可具有如NCBI參考序列：NP_002326.2或SEQ ID NO: 5提供之胺基酸序列，或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基。
若干疾病及/或表型係藉由 LRP5基因中之一或多個改變或其表現改變引起、介導及/或加重。顯示 LRP5中之功能喪失型突變引起骨質疏鬆假膠質瘤(OPPG)，一種導致骨折之與過早的全身性骨質疏鬆相關之罕見症候群；家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)亦與 LRP5中之突變相關；LRP5上調與鈣化主動脈瓣疾病(例如在高膽固醇血症存在下，主動脈瓣及血管中之骨基質蛋白質表現取決於LRP5，且在退行性人類二尖瓣膜及鈣化主動脈瓣樣本中觀測到LRP5組織染色及全組織蛋白含量增加)相關；在患有骨關節炎(OA)之人類患者之髖及膝組織中已發現LRP5基因表現上調；及藉由選擇式剪接產生之經截短LRP5與甲狀旁腺腫瘤及乳癌相關(Joiner等人, Trends Endocrinol Metab. 2013年1月;24(1):31-9.)。在大腸直腸癌(CRC)中，組織LRP5表現上調且與CRC之臨床階段相關，且顯示LRP5促進癌症幹樣特徵(Nie等人, J Cell Mol Med. 2022年2月;26(4):1095-1112.)。儘管骨肉瘤細胞中之LRP5表現亦與疾病進展相關(Hoang等人, Int J Cancer. 2004年3月;109(1):106-11.)，但顯示骨細胞中LRP5之過度表現增強骨骼中骨細胞之抗乳癌作用(Liu等人, Bone Res. 2021年7月6日;9(1):32.)。
根據OMIM®資料庫(https://www.omim.org/)， LRP5基因之遺傳病包括：滲出性玻璃體視網膜病變4 (表現型MIM編號601813，體染色體顯性及體染色體隱性)；骨內骨肥厚(表現型MIM編號144750，體染色體顯性)；骨質石化病，體染色體顯性1 (表現型MIM編號607634，體染色體顯性)；骨質疏鬆假膠質瘤症候群(表現型MIM編號259770，體染色體隱性)；骨硬化(表現型MIM編號144750，體染色體顯性)；伴隨或不伴隨腎囊腫之多囊性肝病4 (表現型MIM編號617875，體染色體顯性)；van Buchem病2型(表現型MIM編號607636)；骨礦物質密度變異1 (表現型MIM編號601884，體染色體顯性)；及骨質疏鬆(表現型MIM編號166710，體染色體顯性))。根據MedlinePlus (NIH，https://medlineplus.gov/genetics/gene/)，涉及 LRP5基因中之遺傳變化之疾病包括：家族性滲出性玻璃體視網膜病變；幼年型原發性骨質疏鬆；及骨質疏鬆假膠質瘤症候群。
LRP6亦可稱為ADCAD2或STHAG7。在人類中，LRP6由染色體12上之 LRP6基因編碼，具有基因位置12p13.2 (NCBI，基因ID：4040)。在一些實施例中，人類LRP6可具有如NCBI參考序列：NP_002327.2或SEQ ID NO: 6提供之胺基酸序列，或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基。
若干疾病及/或表型係藉由 LRP6基因中之一或多個改變或其表現改變引起、介導及/或加重。舉例而言， LRP6之外顯子18中之單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism；SNP)與阿茲海默症相關；已觀測到 LRP6中之突變(R611C)與早期冠狀動脈疾病之間的因果關係；及在患有骨關節炎(OA)之人類患者之髖及膝組織中發現LRP6基因表現上調(Joiner等人, Trends Endocrinol Metab. 2013年1月;24(1):31-9.)。此外，LRP6在各種癌症中上調且據報導促進各種癌症之生長，該等癌症包括乳癌(例如三陰性乳癌(triple negative breast cancer；TNBC))、原發性慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia；CLL)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer；NSCL)、肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma；LSCC)及肝細胞癌(HCC) (Li等人, Oncogene. 2004年12月2日;23(56):9129-35.；Roslan等人, J Oncol. 2019年3月26日;2019:4536302)。已報導與其相關之多種拮抗性抗LRP6抗體活體內抑制Wnt驅動之腫瘤(Joiner等人, Trends Endocrinol Metab. 2013年1月; 24(1):31-9.)。
根據OMIM®資料庫(https://www.omim.org/)， LRP6基因之遺傳病包括：選擇性牙齒不發育7 (表現型MIM編號616724，體染色體顯性)；及體染色體顯性冠狀動脈疾病2 (表現型MIM編號610947，體染色體顯性)。
如本文所用，術語「原生」或「野生型」係指存在於野生型細胞、組織、器官或生物體中之核苷酸序列，例如基因或基因產物，例如RNA或蛋白質。如本文所用，術語「變體」係指參考聚核苷酸或多肽序列，例如原生聚核苷酸或多肽序列之突變體，亦即，與該參考聚核苷酸或多肽序列具有小於100%之序列一致性。換言之，變體包含相對於參考聚核苷酸序列，例如原生聚核苷酸或多肽序列的至少一個胺基酸差異(例如胺基酸取代、胺基酸插入、胺基酸缺失)。舉例而言，變體可為與全長原生聚核苷酸序列具有50%或更高、60%或更高、或70%或更高序列一致性，例如與全長原生聚核苷酸序列具有75%或80%或更高，諸如85%、90%或95%或更高一致性，例如98%或99%一致性之聚核苷酸。作為另一實例，變體可為與全長原生多肽序列具有70%或更高序列一致性，例如與全長原生多肽序列具有75%或80%或更高一致性，諸如85%、90%或95%或更高，例如98%或99%一致性之多肽。變體亦可包括與參考序列(例如原生序列)之片段共有70%或更高序列一致性，例如與原生序列共有75%或80%或更高，諸如85%、90%或95%或更高一致性，例如98%或99%一致性的參考序列(例如天然序列)之變體片段。
「Norrin」為具有活化Wnt/β-連環蛋白傳訊路徑之胱胺酸結模體之分泌型蛋白。在人類中，Norrin由X染色體上之 NDP基因編碼，具有基因位置Xp11.3 (NCBI，基因ID：4693)。Norrin亦可稱為諾里氏病(Norrie disease)蛋白、NDP、ND、X連鎖滲出性玻璃體視網膜病變2蛋白或EVR2。在一些實施例中，人類LRP5可具有如NCBI參考序列：NP_000257.1或SEQ ID NO: 3提供之胺基酸序列，或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似者)之等效殘基。
若干疾病及/或表型係藉由 NDP基因中之一或多個改變或其表現改變引起、介導及/或加重。根據OMIM®資料庫(https://www.omim.org/)， NDP基因之遺傳病包括：X連鎖滲出性玻璃體視網膜病變2 (表現型MIM編號305390，X連鎖顯性或X連鎖隱性)；及諾里氏病(表現型MIM編號310600，X連鎖隱性)。根據MedlinePlus (NIH，https://medlineplus.gov/genetics/gene/)，涉及 NDP基因中之遺傳變化之疾病包括：家族性滲出性玻璃體視網膜病變；諾里氏病；及視網膜營養不良。
Norrin與一或多種Wnt受體，例如Fzd4、LRP5或LRP6 (通常稱為LRP5/6)及TSPAN12結合，且誘導典型Wnt傳訊路徑，且其下游作用包括血管生成，例如經由轉錄因子Sox17之活化(Junge等人, Cell.2009年10月16日;139(2):299-311.；及Ye等人, Cell. 2009年10月16日;139(2):285-98.)。已知Fz4、Lrp5、Norrin或TSPAN12中之突變進一步會引起視網膜血管形成不足。同樣，阻斷Norrin誘導、Fzd4介導之Wnt傳訊據報導引起中樞神經系統(central nervous system；CNS)血管生成及血液-CNS障壁中之缺陷(Zhang等人, Nat Commun. 2017年7月4日;8:16050.)。
「以可操作方式連接(Operatively linked)」或「以可操作方式連接(operably linked)」係指遺傳元件之併接，其中該等元件係呈允許其以預期方式操作的關係。舉例而言，若啟動子有助於起始編碼序列之轉錄，則該啟動子係以可操作方式連接至編碼區。在啟動子與編碼區之間可存在中間殘基，只要維持此功能關係即可。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物或組合物中除活性成分外之對個體很大程度上無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。在一些實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任何抗體及至少一種額外治療劑。
如本文所用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」係指任何長度之胺基酸之聚合物。該等術語亦涵蓋經修飾之胺基酸聚合物；例如以包括二硫鍵形成、醣基化、脂質化、磷酸化或與標記組分結合。
術語「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之聚合形式，包括去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物，且可間雜有非核苷酸組分。若存在，可在聚合物組裝之前或之後賦予核苷酸結構之修飾。如本文所用，術語聚核苷酸可互換地指雙股及單股分子。除非另有說明或要求，否則本文所描述的本發明之聚核苷酸的任何實施例涵蓋雙股形式及已知或預測構成該雙股形式之兩個互補單股形式中之各者。
聚核苷酸或多肽與另一聚核苷酸或多肽具有某一百分比「序列一致性」，意謂，當比對時，在比較兩個序列時鹼基或胺基酸之彼百分比相同。當用於兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中時，術語「一致」或「一致性」係指所關注序列與參考序列中相同殘基之數目或百分比。百分比可如下計算：藉由將所關注之序列相對於參考序列最佳比對；在參考序列之全長上比較兩個序列；測定兩個序列中存在相同胺基酸殘基或核酸鹼基之位置的數目，得到匹配位置數；將匹配位置數除以在產生比對中藉由添加引入參考序列中之間隙位置之數目調整的參考序列中之位置之總數目；及將結果乘以100，得到序列一致性百分比。在比較DNA及RNA時，胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)可視為等效的。序列一致性可如下確定：藉由使用用於比對(blasting)兩個序列(bl2seq)之單獨可執行BLAST引擎程式，其可擷取自National Center for Biotechnology Information (NCBI)檔案傳輸站，或在全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/處，使用預設參數(Tatusova及Madden, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174, 247-250；其以全文引用的方式併入本文中)。
如本文所用，「啟動子」涵蓋引導RNA聚合酶之結合且由此促進RNA合成的DNA序列，亦即足以引導轉錄之最小序列。啟動子及對應蛋白質或多肽表現可為普遍存在的，意謂在廣泛範圍之細胞、組織及物種中具有強活性或具有細胞類型特異性、組織特異性或物種特異性。啟動子可為「組成性」的，意謂其具有連續的活性；或為「誘導性」的，意謂啟動子可因生物或非生物因素之存在或不存在而活化或去活化。本發明之核酸構築體或載體中亦包括可與或可不與啟動子序列鄰接之強化子序列。強化子序列影響啟動子依賴性基因表現且可位於原生基因之5'或3'區中。
「重組」當用於聚核苷酸時意謂，該聚核苷酸為選殖、限制或接合步驟或產生不同於在自然界中發現之聚核苷酸之構築體的其他程序之各種組合的產物。
術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其類似者在本文中一般用以意謂獲得所需藥理學及/或生理作用。該作用就完全或部分抑制或預防疾病或其症狀，例如降低個體中發生疾病或其症狀之可能性而言可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可為治療性的。如本文所用，「治療」涵蓋對哺乳動物之疾病的任何治療，且包括：(a)抑制該疾病，亦即遏制其發展；或(b)減輕該疾病，亦即使該疾病消退。治療劑可在疾病或損傷發作之前、期間或之後投與。對進行中之疾病之治療尤其受關注，其中治療穩定或減少患者之不期望的臨床症狀。此類治療理想地在受影響組織(例如眼睛)中完全功能喪失之前進行。主題療法理想地在疾病有症狀階段期間且在一些情況下在疾病有症狀階段之後投與。
如本文所用，片語「視網膜血管疾病」為眼睛疾病，特定言之，由異常血管形成引起之視網膜疾病。在一些態樣中，異常血管係由血管發育之抑制引起，且在其他態樣中，異常血管係由過量血管生成引起。
「載體」為包含經分離之核酸且其可用於將經分離之核酸遞送至細胞內之化合物或物質組合物。多種載體為此項技術中已知的，包括但不限於線性聚核苷酸、與離子或兩親媒性化合物相關之聚核苷酸、質體、病毒及病毒樣粒子(VLP)。因此，術語「載體」包括自主複製質體、自我複製RNA或病毒粒子。因此，術語「載體」涵蓋表現載體。該術語亦應視為包括非質體及非病毒化合物，其促進核酸轉移至細胞中，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似者。病毒載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體及其類似者。
「Wnt傳訊路徑」包含一組訊號轉導路徑，其可由Wnt配體(亦稱為Wnt)或另一配體對一或多種Wnt受體之結合誘導。Wnt配體為富含半胱胺酸且高度疏水性之分泌性醣蛋白之多樣家族，其長度通常為350-400個胺基酸。在人類中，Wnt配體包括WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11及WNT16。Wnt受體為可被Wnt配體結合之受體，且包括捲曲類受體及與酪胺酸激酶(Ryk)相關之輔受體(諸如LRP5、LRP6)，以及受體酪胺酸激酶樣孤兒受體(ROR)。
Wnt傳訊路徑調控複雜正常細胞過程，諸如細胞分化、發育、組織穩態及創傷癒合。當Wnt傳訊異常調控時，其可能與發育病症、瘤形成及其他疾病相關。主要Wnt傳訊路徑包括：典型Wnt傳訊路徑(亦稱為Wnt/β-連環蛋白傳訊路徑)；Wnt/平坦細胞極性(PCP)路徑；及Wnt/Ca2+路徑(Sharma and Pruitt. Int J Mol Sci. 2020年10月28日;21(21):8018.)。下文描述此等路徑。
「典型Wnt傳訊路徑」：在不存在Wnt配體下，細胞質β-連環蛋白一般與軸蛋白(Axin)及腺瘤性結腸息肉(adenomatosis polyposis coli；APC)形成複合物(通常稱為「破壞複合物」)，且被酪蛋白激酶1 (casein kinase 1；CK1)及糖原合酶激酶3 (GSK3)磷酸化。磷酸化β-連環蛋白被E3泛蛋白連接酶β-Trcp識別，其靶向β-連環蛋白以用於蛋白酶體降解且因此不會進入細胞核。在Wnt配體存在下，Fzd及LRP (例如LRP5或LRP6)一旦被Wnt配體結合，則形成受體複合物，其藉由CK1及GSK3變得磷酸化。此引起軸蛋白與LRP胞質尾之結合及散亂蛋白(Dishevelled；DVL)與Fzd胞質尾之結合，其干擾破壞複合物，從而允許細胞質β-連環蛋白進入細胞核。在細胞核中，β-連環蛋白引起直接及間接轉錄活化，例如藉由如共活化劑與TCF/LEF家族之轉錄因子的結合(Wiese等人, Development.2018年6月26日;145(12):dev165902.；Sharma and Pruitt. Int J Mol Sci. 2020年10月28日;21(21):8018.；Ren等人, Front Cell Dev Biol.2021年5月6日;9:670960.)。典型Wnt傳訊路徑亦可藉由非Wnt配體與一或多種Wnt受體之結合，例如藉由Norrin (NDP)與Fzd4、LRP5或LRP6 (通常稱為LRP5/6)及TSPAN12之結合起始(Junge等人, Cell.2009年10月16日;139(2):299-311.；及Ye等人, Cell. 2009年10月16日;139(2):285-98.)。
「Wnt/平坦細胞極性(planar cell polarity；PCP)路徑」：Fzd及輔受體(例如ROR1或ROR2)一旦被Wnt配體結合，則形成受體複合物且募集DVL至質膜。DVL與小GTP酶(諸如RHO及RAC)相互作用以進一步觸發ROCK及/或JNK之活化。此藉由轉錄反應活化轉錄因子(諸如JUN及ATF2)引起細胞骨架重排之活化(Sharma and Pruitt. Int J Mol Sci. 2020年10月28日;21(21):8018.)。
「Wnt/Ca2+路徑」：Fzd及輔受體(例如ROR1或ROR2)一旦被Wnt配體結合，則形成受體複合物且活化磷脂酶C (PLC)，從而引起細胞內Ca2+流入。此經由各種轉錄因子(諸如NFAT)進一步活化CDC42且觸發Ca2+依賴性細胞運動及極性(Sharma and Pruitt. Int J Mol Sci. 2020年10月28日;21(21):8018.)。
除非另外指示，否則本發明之實踐將採用在熟習此項技術者之技能範疇內的細胞生物學、分子生物學技術、微生物學、生物化學及免疫學之習知技術。此類技術在諸如以下之文獻中充分闡述：「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」,第二版(Sambrook等人, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」 (M. J. Gait編, 1984)；「Animal Cell Culture」 (R. I. Freshney編, 1987)；「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.)；「Handbook of Experimental Immunology」 (D. M. Weir及C. C. Blackwell編)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」 (J. M. Miller及M. P. Calos編, 1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」 (F. M. Ausubel等人編, 1987)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis等人編, 1994)；及「Current Protocols in Immunology」 (J. E. Coligan等人編, 1991)，其中之各者明確地以引用之方式併入本文中。
下文參考用於說明之實例應用來描述本發明之若干態樣。應理解，闡述眾多特定細節、關係以及方法以提供對本發明的充分理解。然而，一般熟習此項技術者將易於認識到，可在無一或多個特定細節的情況下或藉由其他方法來實踐本發明。本發明不受動作或事件之所說明次序限制，此係因為一些動作可按不同次序發生及/或可與其他動作或事件同時發生。此外，實施根據本發明之方法不需要所有所說明的動作或事件。
術語「包括(including)」、「包括(includes)」、「具有(having)」、「具有(has)」、「具有(with)」或其變化形式在實施方式及/或申請專利範圍中使用，此類術語意欲以類似於術語「包含」之方式為包括性的。
本文所提及之所有公開案均以引用之方式併入本文中以揭示及描述與所引用之公開案相關的方法及/或材料。應理解，在存在矛盾之情況下，本發明取代所併入公開案之任何揭示內容。
應進一步注意，申請專利範圍可撰寫為排除任何視情況存在之要素。因此，此陳述意欲與對所主張要素之敍述結合充當使用諸如「僅僅(solely)」、「僅(only)」及其類似者之排他性術語或使用「負性」限制之前提基礎。
除非另外指示，否則本文所用之所有術語均具有與熟習此項技術者所知相同之含義，且本發明之實踐將採用在熟習此項技術者之知識範圍內的微生物學及重組DNA技術之習知技術。 II.  概要。
本發明提供Wnt訊號調節劑及其用於治療例如涉及異常Wnt傳訊之疾病、病症及病狀(諸如但不限於各種眼部病症)之使用方法，包括調節Wnt訊號以治療視網膜病變之方法，包括但不限於FEVR及其他遺傳病症、DR及AMD。在特定實施例中，本發明提供Wnt/β-連環蛋白促效劑以抑制視網膜病變進展中之異常新血管生成。
Wnt (「無翅基因相關整合位點(Wingless-related integration site)」或「無翅基因及Int-1」或「無翅基因-Int」)配體及其訊號在控制包括骨骼、肝、皮膚、胃、腸、腎、中樞神經系統、乳腺、味蕾、卵巢、耳蝸及許多其他組織在內的許多必需器官及組織的發育、穩態及再生中起到關鍵作用(例如藉由Clevers, Loh, and Nusse, Science2014; 346:1248012綜述)。調節Wnt訊號傳導路徑具有治療退化性疾病及組織損傷之潛能。
調節Wnt傳訊作為一種治療手段的挑戰之一為存在多種Wnt配體及Wnt受體捲曲1-10 (Fzd1-10)，其中許多組織表現多種且重疊之Fzd。除Fzd外，典型Wnt訊號亦涉及作為輔受體之低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白5 (LRP5)或低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白6 (LRP6)，該等蛋白質在各種組織中廣泛表現。
R-脊椎蛋白(R-spondin) 1-4為擴增Wnt訊號之配體之家族。R-脊椎蛋白中之各者經由受體複合物起作用，該受體複合物在一端上含有鋅及環指3 (ZNRF3)或環指蛋白43 (RNF43)且在另一端上含有富白胺酸重複序列之G蛋白偶聯受體4-6 (LGR4-6) (例如藉由Knight及Hankenson 2014, Matrix Biology; 37: 157-161綜述)。R-脊椎蛋白亦可經由額外作用機制起作用。ZNRF3及RNF43為兩種特異性靶向Wnt受體(Fzd1-10及LRP5或LRP6)以實現降解的膜結合的E3連接酶。R-脊椎蛋白與ZNRF3/RNF43及LGR4-6之結合引起三元複合物之清除或螯合，此將E3連接酶自Wnt受體移除且使Wnt受體穩定，產生增強之Wnt訊號。各R-脊椎蛋白含有兩個弗林蛋白酶(furin)域(1及2)，其中弗林蛋白酶域1與ZNRF3/RNF43結合，且弗林蛋白酶域2與LGR4-6結合。含有弗林蛋白酶域1及2之R-脊椎蛋白的片段足以擴增Wnt傳訊。儘管R-脊椎蛋白之作用取決於Wnt訊號，但由於LGR4-6及ZNRF3/RNF43兩者在各種組織中廣泛表現，故R-脊椎蛋白之作用不具有組織特異性。
在某些實施例中，Wnt/β-連環蛋白促效劑(或Wnt傳訊促效劑)包含與一或多種Fzd結合之抗體、抗體片段及/或抗體域以及與LRP5及/或Lrp6結合之抗體域。在某些實施例中，抗體域相較於其他Fzd優先與Fzd4結合。在某些實施例中，Fzd結合域優先與一或多種Fzd結合，其中其與彼等Fzd結合之K D比其與其他Fzd結合之K D低至少10倍。在某些實施例中，Fzd結合域優先與一或多種Fzd結合，其中其與彼等Fzd結合之K D比其與其他Fzd結合之K D低至少100倍。在某些實施例中，Fzd結合域優先與一或多種Fzd結合，其中其與彼等Fzd結合之K D比其與其他Fzd結合之K D低至少1000倍。在某些實施例中，抗體域包含本文揭示之Wnt傳訊促效劑(例如hp4SD1-03)中存在之對應CDR，或包含hp4SD1-03之片段或變體，例如可變重鏈或可變輕鏈區。非限制性例示性序列可見於 附錄表 A-J中。
在某些實施例中，Wnt/β-連環蛋白促效劑包含IgG抗體樣結構，該結構包含兩個抗體輕鏈及兩個抗體重鏈且進一步包含兩個與抗體鏈中之任一者融合的VHH域(參見例如 圖 24 至圖 25)。在特定實施例中，VHH域與各抗體輕鏈之N端融合(參見例如 圖 24)。在特定實施例中，抗體重鏈及輕鏈結合一或多種Fzd，或優先與Fzd4結合，且VHH域與LRP5及/或LRP6結合。在某些實施例中，相較於LRP6，VHH域優先與LRP5結合。在某些實施例中，LRP5/6結合域優先與LRP5或LRP6結合，其中其與LRP結合之K D比其與其他LRP結合之K D至少低100倍。在某些實施例中，LRP5/6結合域優先與LRP5或LRP6結合，其中其與LRP結合之K D比其與其他LRP結合之K D至少低1000倍。
在相關實施例中，Wnt/β-連環蛋白促效劑可採用不同雙特異性結合結構，包括但不限於本文所揭示之任一者(包括但不限於 圖 24 至圖 34中所描繪之結構)。如此項技術中所熟知，抗體為能夠經由至少一個位於免疫球蛋白分子可變區上之抗原決定基結合域特與目標(諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等)特異性結合的免疫球蛋白分子。如本文所用，該術語不僅涵蓋完整多株或單株抗體，且亦涵蓋含有抗原決定基結合域之其片段(例如dAb、Fab、Fab'、F(ab') 2、單鏈Fv (scFv)、VHH或單域抗體(sdAb)、DVD-Ig、其合成變體、天然存在之變體、包含抗原決定基結合域之融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體及包含具所需特異性之抗原結合位點或片段(抗原決定基識別位點)之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾之組態。由基因融合構築之「雙功能抗體」、多價或多特異性片段(WO94/13804；P. Holliger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 6444-6448, 1993)亦為本文中所涵蓋之抗體的特定形式。本文中亦包括包含與CH3域接合之scFv之微型抗體(S. Hu等人, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996)。參見例如Ward, E. S.等人, Nature341, 544-546 (1989)；Bird等人, Science, 242, 423-426, 1988；Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P. Holliger等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 6444-6448, 1993；Y. Reiter等人, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996；S. Hu等人, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996。
蛋白水解酶木瓜酶優先裂解IgG分子，以產生若干片段，其中兩個片段(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原結合位點之共價異二聚體。酶胃蛋白酶能夠裂解IgG分子，以提供若干片段，包括包含兩個抗原結合位點之F(ab') 2片段。根據本發明之某些實施例使用之Fv片段可藉由優先蛋白裂解IgM及偶爾蛋白裂解IgG或IgA免疫球蛋白分子而產生。然而，Fv片段更通常使用此項技術中已知之重組技術得到。Fv片段包括非共價VH:VL異二聚體，其包括保留原生抗體分子之許多抗原識別及結合能力的抗原結合位點。Inbar等人(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662；Hochman等人(1976) Biochem15:2706-2710；及Ehrlich等人(1980) Biochem19:4091-4096。
在某些實施例中，考慮單鏈Fv或scFV抗體。舉例而言，κ體(Ill等人, Prot. Eng. 10: 949-57 (1997))；微型抗體(Martin等人, EMBO J13: 5305-9 (1994))；雙功能抗體(Holliger等人, PNAS90: 6444-8 (1993))；或Janusins (Traunecker等人, EMBO J10: 3655-59 (1991)及Traunecker等人, Int. J. Cancer Suppl. 7: 51-52 (1992))，可使用標準分子生物學技術，按照本申請案關於選擇具有所需特異性之抗體之教示來製備。在另其他實施例中，可製備涵蓋本發明之配體的雙特異性或嵌合抗體。舉例而言，嵌合抗體可包含來自不同抗體之CDR及構架區，而可產生經由一個結合域特異性結合至一或多種Fzd受體及經由第二結合域特異性結合至第二分子的雙特異性抗體。此等抗體可經由重組分子生物學技術產生或可以物理方式結合於一起。單鏈Fv (scFv)多肽為共價連接之VH:VL異二聚體，其自包括由肽編碼連接子連接的VH及VL編碼基因之基因融合物表現。可用於連接scFv中之VH及VL之例示性連接子可包含可撓性連接子。在一些實施例中，連接子可包含一或多個胺基酸，視情況1-50個之間的胺基酸，諸如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十個胺基酸。在一些實施例中，連接子可由小胺基酸組成，該等小胺基酸由G、S及/或A組成。在一些實施例中，連接子可包含含有選自由以下組成之群之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、G、GG、GGG、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GSS、SGS及SSG。在一些實施例中，連接子可包含含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之多個重複序列(例如兩個、三個、四個或五個重複序列)或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、G、GG、GGG、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GSS、SGS及SSG。在某些實施例中，連接子可包含SEQ ID NO: 101之三個或四個重複序列，其可視情況分別稱為(G4S) 3連接子及(G4S) 4連接子。Huston等人(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA85(16):5879-5883。已描述多種方法來辨別用於使來自抗體V區之天然聚集但經化學分離之輕多肽鏈及重多肽鏈轉化成為scFv分子的化學結構，該scFv分子將摺疊成實質上類似於抗原結合位點之結構的三維結構。參見例如Huston等人之美國專利第5,091,513號及第5,132,405號；及Ladner等人之美國專利第4,946,778號。
在某些實施例中，如本文所描述之抗體係呈雙功能抗體形式。雙功能抗體為多肽之多聚體，各多肽包含含有免疫球蛋白輕鏈之結合區的第一域及含有免疫球蛋白重鏈之結合區的第二域，該等兩個域經連接(例如藉由肽連接子)但不能彼此結合以形成抗原結合位點；抗原結合位點係藉由多聚體內之一個多肽之第一域與多聚體內之另一多肽之第二域結合而形成(WO94/13804)。
抗體之片段由VH域組成(Ward, E. S.等人, Nature341, 544-546 (1989))。
當使用雙特異性抗體時，其可包含習知雙特異性抗體，其可藉由各種已知方法製造，例如如(Holliger, P.及Winter G., Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993))中所描述，或其可化學上或自雜交融合瘤製備，或其可包含上文所提及之雙特異性抗體片段中之任一者。可僅使用可變域，在無Fc區之情況下構築雙功能抗體及scFv，從而潛在地降低抗個體基因型反應之作用。
與雙特異性完全抗體相對比，雙特異性雙功能抗體亦可部分地尤其適用，因為其容易構築且在大腸桿菌( E. coli)中表現。可使用噬菌體呈現(參見例如WO94/13804)自文庫容易地選擇具有適當結合特異性之雙功能抗體(及許多其他多肽，諸如抗體片段)。若雙功能抗體之一個臂保持恆定，例如針對抗原X具有特異性，則可製備其中另一個臂變化之文庫且選擇具有適當特異性之抗體。雙特異性完全抗體可藉由杵-臼工程改造製備(J. B. B. Ridgeway等人, Protein Eng., 9, 616-621 (1996))。
在某些實施例中，可提供呈UniBody®形式之本文所描述之抗體。UniBody®為移除鉸鏈區之IgG4抗體(參見GenMab Utrecht, The Netherlands；亦參見，例如US20090226421)。此專有抗體技術產生預期治療窗比當前之小抗體型式更長之穩定的更小抗體型式。IgG4抗體視為惰性的，且因此不與免疫系統相互作用。完全人類IgG4抗體可藉由消除抗體之鉸鏈區修飾，以獲得相對於對應完整IgG4 (GenMab，Utrecht)具有不同穩定性特性之半分子片段。將IgG4分子切半僅在UniBody®上保留一個可與同源抗原(例如疾病目標)結合之區域，且因此使UniBody®僅與目標細胞上之一個位點單價結合。
在某些實施例中，如本文所描述之抗體及其抗原結合片段包括重鏈及輕鏈CDR組，重鏈及輕鏈CDR分別插入於重鏈及輕鏈構架區(FR)組之間，重鏈及輕鏈構架區為該等CDR提供支持且界定CDR相對於彼此之空間關係。如本文所用，術語「CDR組」係指重鏈或輕鏈V區之三個高變區。自重鏈或輕鏈之N端開始，此等區域分別表示為「CDR1」、「CDR2」及「CDR3」。因此，抗原結合位點包括六個CDR，包含來自重鏈及輕鏈V區中之各者的CDR組。包含單一CDR(例如CDR1、CDR2或CDR3)之多肽在本文中稱為「分子識別單元」。多種抗原-抗體複合物之結晶學分析已表明，CDR之胺基酸殘基與結合之抗原形成廣泛接觸，其中最廣泛抗原接觸係與重鏈CDR3。因此，分子識別單元主要負責抗原結合位點之特異性。
如本文所用，術語「FR組」係指四個側接胺基酸序列，其構架重鏈或輕鏈V區之CDR組之CDR。一些FR殘基可接觸結合抗原；然而，FR主要負責摺疊V區成為抗原結合位點，尤其與CDR直接相鄰之FR殘基。在FR內，某些胺基酸殘基及某些結構特徵極高度保留。就此而言，所有V區序列含有約90個胺基酸殘基之內部二硫環。當V區摺疊成為結合位點時，CDR呈現為形成抗原結合表面之突出環模體。一般認為存在FR保留結構區，其影響CDR環形成某些「典型」結構之摺疊形狀，與精確CDR胺基酸序列無關。此外，已知某些FR殘基參與非共價域間接觸，該等接觸使抗體重鏈及輕鏈之相互作用穩定。
「單株抗體」係指均質抗體群體(構成群體之個別抗體相同且結合相同抗原決定基，除了可能變異抗體(例如含有天然存在之突變或在單株抗體製備製造期間產生)以外，此類變體一般少量存在。)，其中單株抗體由涉及抗原決定基之選擇性結合之胺基酸(天然存在及非天然存在)構成。單株抗體針對單一抗原決定基具高度特異性。術語「單株抗體」不僅涵蓋完整單株抗體及全長單株抗體，且亦涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv)、單鏈(scFv)、Nanobodies®、其變體、包含單株抗體之抗原結合片段的融合蛋白、人源化單株抗體、嵌合單株抗體及包含具有所需特異性及與結合抗原決定基之能力之抗原結合片段(抗原決定基識別位點)之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾組態，包括本文所揭示之Wnt替代物分子。並不意欲限制抗體之來源或其製備方式(例如藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現、轉殖基因動物等)。該術語包括完全免疫球蛋白以及上文在「抗體」定義下所描述之片段等。
在某些實施例中，本發明之抗體可呈Nanobody®形式。Nanobody®技術最初在發現及鑑別駱駝科( Camelidae) (例如，駱駝及駱馬)具有僅由重鏈組成且因此缺乏輕鏈之全功能抗體之後發展。此等僅重鏈抗體含有單一可變域(VHH)及兩個恆定域(CH2、CH3)。選殖及分離之單一可變域具有完整抗原結合能力且極穩定。具有其獨特結構及功能特性之此等單一可變域形成「Nanobodies®」之基礎。Nanobodies®由單一基因編碼且在幾乎所有原核及真核宿主，例如大腸桿菌(參見美國專利第6,765,087號)、黴菌(例如麴菌屬( Aspergillus)或木黴屬( Trichoderma))及酵母(例如酵母菌屬( Saccharomyces)、克魯維酵母菌屬( Kluyvermyces)、漢森酵母( Hansenula)或畢赤酵母屬( Pichia))中有效產生(參見美國專利第6,838,254號)。產生過程可擴大規模且已產生數公斤數量之Nanobodies®。Nanobodies®可調配成具有較長存放期之備用溶液。Nanoclone®方法(參見例如WO 06/079372)係基於B細胞之自動高通量選擇產生針對所需目標之Nanobodies®之專有方法。Nanobodies®為駱駝特異性之僅重鏈抗體之單一域抗原結合片段。Nanobodies®，亦稱為VHH抗體，通常具有約15 kDa之小尺寸。
所涵蓋之另一抗體片段為雙可變域免疫球蛋白(DVD-Ig)，其為將兩個單株抗體之功能及特異性組合於一個分子實體中之經工程改造的蛋白質。DVD-Ig設計為IgG樣分子，不同之處在於各輕鏈及重鏈經由短肽鍵而非IgG中之一個可變域含有兩個串聯可變域。兩個可變域之融合取向及連接子序列之選擇對於分子之功能活性及高效表現至關重要。DVD-Ig可藉由習知哺乳動物表現系統產生為用於製造及純化之單一物種。DVD-Ig具有親體抗體之特異性，活體內穩定，且展現IgG樣物理化學及藥物動力學特性。DVD-Ig及其製備方法描述於Wu, C.等人, Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007))中。DVD-Ig結構可適用於其中抗原結合區中之至少一者包含VHH域之情況(例如參見圖26 (例如右上))。
在某些實施例中，如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段經人源化。此係指嵌合分子，其一般使用重組技術製備，具有來源於來自非人類物種免疫球蛋白之抗原結合位點(亦即，CDR之全集)以及基於人類免疫球蛋白之結構及/或序列之分子的剩餘免疫球蛋白結構。在一些情況下，例如當來源於非人類物種之FR序列與對應人類FR序列匹配或緊密匹配時，人源化抗體或抗原結合抗體片段可包含融合至恆定域上之來源於非人類物種的完全可變域。在一些情況下，例如當來源於非人類物種之FR序列不同於或顯著不同於對應人類FR序列時，人源化抗體或抗原結合抗體片段可包含融合至恆定域上之移植至可變域中之適當構架區上之來源於非人類物種的CDR。在一些情況下，FR中之適當殘基經取代為對應人類殘基或與其類似的殘基(例如保留胺基酸)。在某些情況下，CDR中之一些殘基亦可經取代為對應人類殘基或與其類似的殘基(例如保留胺基酸)。抗原決定基結合位點可為野生型或藉由一或多個胺基酸取代來修飾。此消除在人類個體中作為免疫原之恆定區，但對外來可變區之免疫反應之可能性保留(LoBuglio, A. F.等人, (1989) Proc Natl Acad Sci USA86:4220-4224；Queen等人, PNAS(1988) 86:10029-10033；Riechmann等人, Nature(1988) 332:323-327)。用於人源化本文揭示之抗Fzd或LRP抗體之說明性方法包括描述於美國專利第7,462,697號中之方法及其他熟知人源化方法。
對CDR之此類其他修飾可使其重塑成儘可能接近人類形式。已知重鏈與輕鏈兩者之可變區含有三個互補決定區(CDR)，該三個互補決定區回應於所討論之抗原決定基而變化且決定結合能力，由在既定物種中相對保留且假定為CDR提供骨架之四個構架區(FR)側接。當關於特定抗原決定基製備非人類抗體時，可變區可藉由將來源於非人類抗體之CDR移植在待修飾之人類抗體中存在之FR上來「重塑」或「人源化」。已藉由以下各者報導此方法適用於各種抗體：Sato, K.等人, (1993) Cancer Res53:851-856；Riechmann, L.等人, (1988) Nature332:323-327；Verhoeyen, M.等人, (1988) Science239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等人, (1991) Protein Engineering4:773-3783；Maeda, H.等人, (1991) Human Antibodies Hybridoma2:124-134；Gorman, S. D.等人, (1991) Proc Natl Acad Sci USA88:4181-4185；Tempest, P. R.等人, (1991) Bio/Technology9:266-271；Co, M. S.等人, (1991) Proc Natl Acad Sci USA88:2869-2873；Carter, P.等人, (1992) Proc Natl Acad Sci USA89:4285-4289；及Co, M. S.等人, (1992) J Immunol148:1149-1154。在一些實施例中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，含有來自小鼠抗體之所有六個CDR的人源化小鼠抗體)。在其他實施例中，人源化抗體具有一或多個相對於原始抗體改變之CDR(一個、兩個、三個、四個、五個、六個)，亦稱為一或多個「來源於」來自原始抗體之一或多個CDR的CDR。
在某些實施例中，本發明之抗體可為嵌合抗體。就此而言，嵌合抗體由與不同抗體之異源恆定或Fc部分以可操作方式連接或以其他方式融合的抗體之抗原結合片段構成。在某些實施例中，異源Fc域具有人類來源。在其他實施例中，異源Fc域可來自出自親本抗體之不同Ig類別，包括IgA (包括子類IgA1及IgA2)、IgD、IgE、IgG (包括子類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)及IgM。在其他實施例中，異源Fc域可由來自不同Ig類別中之一或多者的CH2及CH3域構成。如上關於人源化抗體所指出，嵌合抗體之抗原結合片段可僅包含本文所描述之抗體之CDR中之一或多者(例如本文所描述之抗體之1、2、3、4、5或6個CDR)，或可包含整個可變域(VL、VH或兩者)。
在一些實施例中，根據本發明之抗體或抗體片段包含Fc區。
已知Fc區中之某些胺基酸修飾調節Ab效應功能及特性，諸如但不限於抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及半衰期(Wang X.等人, Protein Cell. 2018年1月; 9(1): 63-73；Dall'Acqua W. F.等人, J Biol Chem. 2006年8月18日;281(33):23514-24. Epub 2006年6月21日；Monnet C.等人, Front Immunol. 2015年2月4日;6:39. 數位物件識別碼(doi)：10.3389/fimmu.2015.00039. eCollection 2015)。突變可為對稱或不對稱的。在某些情況下，具有帶不對稱突變之Fc區(亦即兩個Fc區不相同)之抗體可提供更佳功能，諸如ADCC (Liu Z.等人 J Biol Chem. 2014年2月7日; 289(6): 3571-3590)。
在一些實施例中，抗體或抗體片段，諸如根據本發明之多特異性抗體或抗體片段，可包含含有一或多個相較於對應野生型Fc區降低或減少效應功能之胺基酸取代(亦稱為「Fc靜默突變或取代」)的Fc區。在某些實施例中，Fc區可在選自由以下組成之群之位置處包含一或多個胺基酸取代：位置234、235、236、237、265、297及329，根據EU編號。在某些實施例中，Fc區可包含L234A、L235A及P329G，根據EU編號(在本文中亦稱為「LALAPG」)。在某些實施例中，Fc區可包含L234A及L235A，根據EU編號(在本文中亦稱為「LALA」)。在某些實施例中，Fc區可包含D265A及P329A，根據EU編號(在本文中亦稱為「DAPA」)。在某些實施例中，Fc區可包含N297A，根據EU編號。
在一些實施例中，抗體或抗體片段，諸如根據本發明之多特異性抗體或抗體片段，可包含含有一或多個相較於對應野生型Fc區減少抗體或抗體片段之半衰期之胺基酸取代的Fc區。在某些實施例中，Fc區可包含I253A、H310A及H435Q，根據EU編號(在本文中亦稱為「IAHAHQ」或「AAQ」)。在某些實施例中，Fc區可包含I253A、H310A及H435A，根據EU編號(在本文中亦稱為「IAHAHA」或「AAA」)。
在一些實施例中，抗體或抗體片段，諸如根據本發明之多特異性抗體或抗體片段，可包含含有一或多個相較於對應野生型Fc區增加抗體或抗體片段之FcRn結合及/或增加半衰期之胺基酸取代的Fc區。在某些實施例中，Fc區可包含M252Y、S254T及T256E，根據EU編號(在本文中亦稱為「YTE」)。在某些實施例中，Fc區可包含M428L及N434S，根據EU編號(在本文中亦稱為「LS」)。
在一些實施例中，當抗體包含IgG1之Fc區或來源於IgG1之Fc區時，該Fc區可包含一或多個胺基酸取代。取代可為例如N297A、N297Q、D265A、L234A、L235A、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、G236-deleted、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、L234F、L235E、P331S、T394D、A330L、P331S、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、S239D、I332E、S298A、E333A、K334A、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、K326D、A330M、K334E、G236A、K326W、S239D、E333S、S267E、H268F、S324T、E345R、E430G、S440Y、M428L、N434S、L328F、M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合(殘基編號係根據EU編號) (Dall'Acqua W. F.等人, J Biol Chem. 2006年8月18日;281(33):23514-24. Epub 2006年6月21日；Wang X.等人, Protein Cell. 2018年1月; 9(1): 63-73)。Fc區可進一步包含一或多個額外胺基酸取代。取代可為例如但不限於A330L、L234F、L235E、P331S及/或其任何組合(殘基編號係根據EU編號)。
在一些實施例中，當抗體包含IgG2之Fc區或來源於IgG2之Fc區時，該Fc區可包含一或多個胺基酸取代。取代可為例如但不限於P238S、V234A、G237A、H268A、H268Q、H268E、V309L、N297A、N297Q、A330S、P331S、C232S、C233S、M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合(殘基編號係根據EU編號)。Fc區可進一步包含一或多個額外胺基酸取代。取代可為例如但不限於M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合(殘基編號係根據EU編號)。
在一些實施例中，當抗體包含IgG3之Fc區或來源於IgG3之Fc區時，該Fc區可包含一或多個胺基酸取代。取代可為例如但不限於E235Y (殘基編號係根據EU編號)。
在一些實施例中，當抗體包含IgG4之Fc區或來源於IgG4之Fc區時，該Fc區可包含一或多個胺基酸取代。取代可為例如但不限於E233P、F234V、L235A、G237A、E318A、S228P、L236E、S241P、L248E、T394D、M252Y、S254T、T256E、N297A、N297Q及/或其任何組合(殘基編號係根據EU編號)。取代可為例如S228P (殘基編號係根據EU編號)。
在一些實施例中，人類樣Fc區之聚醣可經工程改造以調節效應功能(例如參見Li T.等人, Proc Natl Acad Sci U S A.2017年3月28日;114(13):3485-3490. 數位物件識別碼：10.1073/pnas.1702173114. Epub 2017年3月13日)。
在一些實施例中，免疫球蛋白CDR及可變域之結構及位置可參考Kabat, E. A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 第4版. US Department of Health and Human Services. 1987及現可於網際網路(immuno.bme.nwu.edu)上獲得之其更新來確定。
在某些實施例中，拮抗劑或促效劑結合劑以約1 µM或更小、約100 nM或更小、約40 nM或更小、約20 nM或更小或約10 nM或更小之解離常數(K D)與一或多種Fzd及/或LRP5/6結合。舉例而言，在某些實施例中，與一或多種Fzds結合之本文所描述之Fzd結合域或抗體以約l00 nM或更小、約20 nM或更小或約10 nM或更小之K D與彼等Fzd結合。在某些實施例中，結合域以約1 µM或更小、約100 nM或更小、約40 nM或更小、約20 nM或更小、約10 nM或更小或約1 nM或更小之EC50與一或多種其目標抗原結合。
可藉由此項技術中已知之任何方法分析本發明之抗體或其他藥劑的特異性結合。可使用之免疫分析包括但不限於競爭性及非競爭性分析系統，其使用諸如以下之技術：生物層干涉術(BLI)分析、表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)、FACS分析、免疫螢光、免疫細胞化學、西方墨點、放射免疫分析、ELISA、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱反應、凝膠擴散沈澱反應、免疫擴散分析、膠合分析、補體固定檢定、免疫放射量檢定、螢光免疫分析及蛋白A免疫分析。此類分析為常規的且在此項技術中已熟知(參見例如Ausubel等人編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, 第1卷, John Wiley & Sons, Inc., New York，其以全文引用的方式併入本文中)。
舉例而言，可使用ELISA確定抗體與目標抗原之特異性結合。ELISA分析包含製備抗原、用抗原塗佈96孔微量滴定盤之孔、添加與可偵測化合物(諸如酶促受質(例如，辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶))結合之抗體或其他結合物至孔中，培育一段時間且偵測抗原之存在。在一些實施例中，抗體或藥劑未與可偵測化合物結合，而是將識別第一抗體或藥劑之第二經結合抗體添加至孔中。在一些實施例中，代替用抗原塗佈孔，可將抗體或藥劑塗佈至孔中，且可在將抗原添加至經塗佈孔之後添加與可偵測化合物結合之第二抗體。熟習此項技術者將瞭解經修飾以增加所偵測到之訊號的參數以及此項技術中已知之ELISA的其他變體(參見例如Ausubel等人,編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, 第1卷, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1)。
抗體或其他藥劑對目標抗原之結合親和力及抗體-抗原相互作用之解離速率可藉由競爭性結合分析確定。競爭性結合分析之一個實例為放射免疫分析，其包含將經標記抗原(例如，Fzd、LRP)或其片段或變體與所關注之抗體在增加量之未標記抗原存在下培育，隨後偵測與經標記抗原結合的抗體。抗體之親和力及結合解離速率可藉由Scatchard圖分析由資料確定。在一些實施例中，BLI分析用於確定抗體或藥劑之結合速率及解離速率。BLI動力學分析包含分析抗體與在其表面上具有固定的抗原之感測器的結合及解離。
在某些實施例中，本發明提供Wnt傳訊促效劑，包括但不限於hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ、hp4SD1-03 AAA，以及其片段及變體。在特定實施例中，Wnt傳訊促效劑具有 圖 1中圖解之結構或 圖 24中之加框結構，及/或包含 圖 9中或 圖 19A 或圖 19B中揭示之序列中之一或兩者或其任何功能片段或變體，例如其抗原結合片段，諸如VHH域、VL域、或VH域、或Fc域或此等功能域中之任一者之變體，例如與本文揭示之抗體序列之任何功能片段序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性的變體。在一些實施例中，Wnt傳訊促效劑包含與 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示，或SEQ ID NO: 1及/或2、SEQ ID NO: 1及/或7、SEQ ID NO: 1及/或450、SEQ ID NO: 1及/或451、SEQ ID NO: 1及/或452、SEQ ID NO: 1及/或453中所闡述之序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)的變異序列，或其任何功能片段，例如其抗原結合片段。在一些實施例中，Wnt傳訊促效劑包含與 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示，或SEQ ID NO: 1中所闡述之輕鏈序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)的野生型或變異序列；及與 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示，或SEQ ID NO: 2、7、450、451、452或453中所闡述之重鏈序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)的野生型或變異序列。在一些實施例中，Wnt傳訊促效劑包含兩個野生型或變異序列，其各自與 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示或SEQ ID NO: 1中所闡述之輕鏈序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)；及兩個野生型或變異序列，其各自與 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示，或SEQ ID NO: 2、7、450、451、452或453中所闡述之重鏈序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)，其中兩條重鏈彼此結合，且各輕鏈例如藉由二硫鍵與不同重鏈結合。在特定實施例中，將胺基酸殘基中之一或多者引入親本分子4SD1-03_LALAPG中，以產生hp4SD1-03，包括但不限於例如hVHH3-H4 ( 圖 2)、hVHH3-H4 N29Q ( 圖 3)、經DED取代之hVHH3-H4 ( 圖 4)、4SD1 HC CDR1 N31S及CDR2 D62E ( 圖 7)中之彼等，及/或人源化4SD1構架中之彼等，如 圖 8中所示。在某些實施例中，維持VHH3 CDR3 D108。在某些實施例中，維持VHH3 M51。在某些實施例中，本發明提供一種包含一或多個胺基酸取代之hp4SD1-03之變體(或片段之變體或其片段或鏈)，其可視情況在hVHH3-H4之位置101-104處之DDDY (SEQ ID NO: 418)模體(其對應於hp4SD1-03之位置101-104處之VHH域之DEDY (SEQ ID NO: 410)模體)內包含胺基酸取代，視情況其中位置102處的D經另一胺基酸(例如E、S、A或T)取代，或視情況其中DEDY (SEQ ID NO: 410)經修飾為DEEY (SEQ ID NO: 411)、DESY (SEQ ID NO: 412)、DEAY (SEQ ID NO: 413)、DETY (SEQ ID NO: 414)、ESEY (SEQ ID NO: 415)、ESTY (SEQ ID NO: 416)或ESSY (SEQ ID NO: 417) ( 圖 14)。hp4SD1-03之序列顯示如下。 輕鏈： 重鏈：
hp4SD1-03之VHH域具有序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASS ANIQSIET LGWYRQAPGKQRELIA NMRGGGYM KYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYC YVKLRDEDYVY RGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 381)，其中CDR加底線且以粗體顯示。
GGGGS (SEQ ID NO: 101)為VHH域與VL域之間的連接子序列。
hp4SD1-03之VL域具有序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPLT FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 281)，其中CDR加底線且以粗體顯示。
hp4SD1-03之VH域具有序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFT SYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYAESVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ATGFGTVVFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 181)，其中CDR加底線且以粗體顯示。
hp4SD1-03之Fc域具有序列：DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 81)。
進一步尤其考慮hp4SD1-03之一些Fc變體，其包含與hp4SD1-03相同的輕鏈(亦即SEQ ID NO: 1)及Fc區序列與hp4SD1-03之重鏈不同的重鏈(hp4SD1 HC含有包含LALAPG取代之Fc區，SEQ ID NO: 81)。
舉例而言，可將LALAPG取代引入另一Fc區參考序列中，得到SEQ ID NO: 82-84。
在另一實例中，「hp4SD1-03 AAQ」包含SEQ ID NO: 1的輕鏈及類似於hp4SD1-03之重鏈但包含除LALAPG取代以外包含IAHAHQ取代(本文中亦稱為AAQ取代)之Fc區(例如SEQ ID NO: 471-474之Fc區)的重鏈。此類重鏈可例如包含SEQ ID NO: 450之胺基酸序列。
在另一實例中，「hp4SD1-03 AAA」包含SEQ ID NO: 1的輕鏈及類似於hp4SD1-03之重鏈但包含除LALAPG取代以外包含IAHAHA取代(在本文中亦稱為AAA取代)之Fc區(例如SEQ ID NO: 476-479之Fc區)的重鏈。此類重鏈可例如包含SEQ ID NO: 451之胺基酸序列。
hp4SD1-03之Fc變體之其他非限制性實例包括：(I)包含SEQ ID NO: 1之輕鏈及SEQ ID NO: 7之重鏈的雙特異性抗體，其包含含有LALA取代的Fc區(此類Fc區序列可為例如SEQ ID NO: 86-89)；(II)包含SEQ ID NO: 1之輕鏈及SEQ ID NO: 8之重鏈的雙特異性抗體，其包含含有IAHAHQ取代但無LALAPG取代的Fc區(此類Fc區序列可為例如SEQ ID NO: 91-94)；(III)包含SEQ ID NO: 1之輕鏈及SEQ ID NO: 9之重鏈的雙特異性抗體，其包含含有IAHAHA取代但無LALAPG取代的Fc區(此類Fc區序列可為例如SEQ ID NO: 96-99)；(IV)包含SEQ ID NO: 1之輕鏈及SEQ ID NO: 452之重鏈的雙特異性抗體，其包含除LALA取代以外含有IAHAHQ取代的Fc區(此類Fc區序列可為例如SEQ ID NO: 481-484)；及(V)包含SEQ ID NO: 1之輕鏈及SEQ ID NO: 453之重鏈的雙特異性抗體，其包含除LALA取代以外含有IAHAHA取代的Fc區(此類Fc區序列可為例如SEQ ID NO: 486-489)。
hp4SD1-03之額外非限制性Fc變體可包括：(I)如下hp4SD1-03變體，其中Fc區經在選自以下之位置處包含一或多個胺基酸取代的Fc區置換：位置234、235、236、237、265、297及329，根據EU編號；(II)如下hp4SD1-03變體，其中Fc區經包含D265A及P329A取代(在本文中亦稱為「DAPA」)的Fc區置換，根據EU編號；(III)如下hp4SD1-03變體，其中Fc區經包含N297A取代的Fc區置換，根據EU編號；(IV)如下hp4SD1-03變體，其中Fc區經包含M252Y、S254T及T256E(在本文中亦稱為「YTE」)的Fc區置換，根據EU編號；及(V)如下hp4SD1-03變體，其中Fc區經包含M428L及N434S(在本文中亦稱為「LS」)的Fc區置換，根據EU編號。可對任何Fc區序列(包括但不限於SEQ ID NO: 71-74之Fc區參考序列)進行此類取代。
亦尤其考慮如下之hp4SD1-03變體，其中：抗Fzd4 VH及/或VL及/或抗LRP5/6 VH序列中之一或多者經 附錄表 B 、 C 及 E中所含之任一對應變體置換；抗Fzd4 VH CDR及/或VL CDR及/或抗LRP5/6 VH CDR序列中之一或多者經 附錄表 A 、 C 及 D中所含之任一對應變體或 附錄表 B 、 C 及 E中所含之抗Fzd4 VH及/或VL及/或抗LRP5/6VH序列中所含之任一對應變體置換；抗Fzd4 VH FR及/或VL FR及/或抗LRP5/6 VH FR序列中之一或多者經 附錄表 A 、 C 及 D中所含之任一對應變體或 附錄表 B 、 C 及 E中所含之抗Fzd4 VH及/或VL及/或抗LRP5/6 VH序列中所含之任一對應變體置換；連接子(抗LRP5/6 VH與抗Fzd4 VL之間的連接子)序列經 附錄表 F中所含之任一對應變體置換；CH1、鉸鏈、CH2、CH3及/或CL序列中之一或多者經 附錄表 G中所含之任一對應變體置換；Fc區序列中之一或多者經 附錄表 H中所含之任一對應變體置換；及/或重鏈(HC)及/或輕鏈(LC)序列中之一或多者經 附錄表 I-J中所含之任一對應變體置換。在其他實施例中，本發明提供一種核酸序列，其編碼本文所描述之Wnt促效劑分子或其多肽組分，例如編碼SEQ ID NO: 1之多肽及/或SEQ ID NO: 2、7、8、9、450、451、452或453之多肽，或任一多肽之變體或片段。在某些實施例中，聚核苷酸為DNA或mRNA，例如經修飾mRNA。在特定實施例中，聚核苷酸為經修飾mRNA，其進一步包含5'帽序列及/或3'加尾序列，例如聚A尾。
在其他實施例中，聚核苷酸為包含以可操作方式連接至編碼序列之啟動子的表現卡匣。在其他實施例中，聚核苷酸存在於表現載體，例如病毒載體中，該載體包含含有編碼本文所描述之Wnt促效劑多肽序列或其變體或片段之核酸序列的聚核苷酸。
本發明進一步考慮一種包含表現載體之細胞，該表現載體包含含有與編碼Wnt促效劑多肽序列或其變體或片段之核酸以可操作方式連接之啟動子的聚核苷酸。在特定實施例中，細胞包含含有聚核苷酸之表現載體，該聚核苷酸包含與編碼Wnt促效劑多肽之核酸序列以可操作方式連接之啟動子。在某些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞。可用於表現及產生哺乳動物多肽之細胞為此項技術中已知的。在特定實施例中，細胞為異源細胞、同種異體細胞或獲自待治療之個體之自體細胞。在特定實施例中，細胞為幹細胞，例如脂肪組織源性幹細胞或造血幹細胞。
本發明亦提供產生本文揭示之Wnt促效劑或其多肽序列之方法，該方法包含在適合於表現Wnt促效劑多肽之條件下培養包含一或多種編碼Wnt促效劑多肽之表現載體的細胞(例如宿主細胞)。在某些實施例中，編碼重鏈多肽之聚核苷酸存在於第一表現載體中，且編碼輕鏈多肽之聚核苷酸存在於第二表現載體中。在某些實施例中，編碼重鏈多肽之聚核苷酸及編碼輕鏈多肽之聚核苷酸存在於同一表現載體中。在某些實施例中，Wnt促效劑或其多肽序列在表現後係自宿主細胞分泌及/或純化。 III.醫藥組合物
亦揭示包含本文所描述之Wnt促效劑分子及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的醫藥組合物。
在其他實施例中，亦揭示包含聚核苷酸及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的醫藥組合物，該聚核苷酸包含編碼本文所描述之Wnt促效劑分子的核酸序列。在某些實施例中，聚核苷酸為DNA或mRNA，例如經修飾mRNA。在特定實施例中，聚核苷酸為經修飾mRNA，其進一步包含5'帽序列及/或3'加尾序列，例如聚A尾。在其他實施例中，聚核苷酸為包含以可操作方式連接至編碼序列之啟動子的表現卡匣。
在其他實施例中，亦揭示包含表現載體(例如，病毒載體)及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的醫藥組合物，該表現載體包含含有編碼本文所描述之Wnt促效劑分子之核酸序列的聚核苷酸。在某些實施例中，編碼Wnt拮抗劑分子之核酸序列及編碼Wnt促效劑之核酸序列係於同一聚核苷酸(例如表現卡匣)中。
本發明進一步考慮包含細胞及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑之醫藥組合物，該細胞包含含有聚核苷酸之表現載體，該聚核苷酸包含與編碼Wnt拮抗劑/促效劑分子之核酸以可操作方式連接的啟動子。在特定實施例中，醫藥組合物進一步包含含有聚核苷酸之表現載體的細胞，該聚核苷酸包含與編碼Wnt促效劑之核酸序列以可操作方式連接的啟動子。在特定實施例中，細胞為異源細胞或自待治療之個體獲得的自體細胞。在特定實施例中，細胞為幹細胞，例如脂肪組織源性幹細胞或造血幹細胞。
單獨或呈組合形式之主題分子可與適用於製備調配物之醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及試劑組合，其一般安全、無毒且合乎需要，且包括哺乳動物，例如人類或靈長類動物使用可接受的賦形劑。此類賦形劑可為固體、液體、半固體，或在氣溶膠組合物情況下為氣態。此類載劑、稀釋劑及賦形劑之實例包括但不限於水、鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。補充活性化合物亦可併入調配物中。用於調配物之溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌化合物，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合化合物，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；界面活性劑，諸如用於預防聚集及/或吸收至材料中之Tween 20®；及用於調節滲性之化合物，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼(諸如，鹽酸或氫氧化鈉)來調整pH。在特定實施例中，醫藥組合物為無菌的。
醫藥組合物可進一步包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投與，適合的載劑包括生理鹽水、抑菌水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一些情況下，組合物為無菌的且應為流體，以使得其可吸入注射器中或自注射器遞送至個體中。在某些實施例中，其在製造及儲存條件下穩定，且防止諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。載劑可為例如含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似者)及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由維持所需粒度(在分散液之情況下)及藉由使用界面活性劑來維持。微生物作用之預防可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑來達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑，例如，糖、多元醇(諸如，甘露醇、山梨糖醇)、氯化鈉。內部組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收含之藥劑(例如,單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
無菌溶液可藉由如下製備：將所需量之Wnt拮抗劑/促效劑抗體或其抗原結合片段(或編碼聚核苷酸或包含其之細胞)併入具有上文列舉之成分之一或其組合之適當溶劑中(視需要)，隨後過濾滅菌。一般而言，藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及來自上文所列舉成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液之任何額外所需成分的粉末。
在一個實施例中，用將保護抗體或其抗原結合片段以免自身體快速消除的載劑製備醫藥組合物，諸如控制釋放調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法為熟習此項技術者顯而易見的。材料亦可市售獲得。脂質體懸浮液亦可用作醫藥學上可接受之載劑。此等可根據熟習此項技術者已知之方法來製備。
為便於投與及劑量之均一性，將醫藥組合物調配成單位劑型可為有利的。如本文所用，單位劑型係指作為單位劑量適用於待治療個體的物理離散單位；各單位均含有經計算可產生所需治療效果的預定量之活性抗體或其抗原結合片段與所需醫藥載劑。單位劑型之規格可由以下因素規定且直接視以下因素而定：抗體或其抗原結合片段之獨特特徵及欲達成之特定治療作用，及混配此類用於治療個體之活性抗體或其抗原結合片段之技術中的固有限制。
醫藥組合物可連同投與說明書一起包括於以下中：容器、包裝或分配器，例如注射器，例如預填充注射器。
本發明之醫藥組合物涵蓋任何醫藥學上可接受之鹽、酯、或此類酯之鹽、或在向哺乳動物投與後能夠提供(直接地或間接地)生物學活性抗體或其抗原結合片段之任何其他化合物。
本發明包括本文所描述之Wnt促效劑分子的醫藥學上可接受之鹽。術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明之化合物的生理上且醫藥學上可接受之鹽：亦即，保留親本化合物之所需生物活性且不會賦予其不合需要之毒理作用的鹽。多種醫藥學上可接受之鹽為此項技術中已知的且描述於例如以下中：「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 第17版, Alfonso R. Gennaro (編), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (及其最新版)、「Encyclopedia of Pharmaceutical Technology」, 第3版, James Swarbrick (編), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007以及 J. Pharm. Sci.66:2 (1977)。此外，關於合適的鹽的綜述參見Stahl及Wermuth之「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use」(Wiley-VCH, 2002)。醫藥學上可接受之鹼加成鹽可由金屬或胺，諸如鹼金屬及鹼土金屬或有機胺形成。
用作陽離子之金屬包含鈉、鉀、鎂、鈣及類似金屬。胺包含N-N'-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、二環己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺及普魯卡因(procaine) (參見例如Berge等人, 「Pharmaceutical Salts」, J. Pharma Sci., 1977, 66, 119)。該等酸性化合物之鹼加成鹽係藉由以習知方式使游離酸形式與足夠量之所需鹼接觸產生鹽來製備。游離酸形式可藉由以習知方式使鹽形式與酸接觸且分離游離酸來再生。游離酸形式在某些物理特性(諸如在極性溶劑中之溶解度)方面在某種程度上不同於其各別鹽形式，但出於本發明之目的，在其他情況下，鹽等效於其各別游離酸。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含治療有效量之Wnt促效劑分子或其醫藥學上可接受之鹽與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑，例如鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、磷酸鹽及胺基酸、聚合物、多元醇、糖、緩衝劑、防腐劑及其他蛋白質的混合物。例示性胺基酸、聚合物及糖及其類似者為辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇單硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、聚葡萄糖、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人類血清白蛋白、檸檬酸鹽、乙酸鹽、林格氏溶液及漢克氏溶液(Hank's solutions)、半胱胺酸、精胺酸、肉鹼、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸、纈胺酸、白胺酸、聚乙烯吡咯啶酮及聚乙二醇。較佳地，此調配物在4℃下穩定保持至少六個月。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或磷酸鈉/硫酸鈉、tris緩衝液、甘胺酸緩衝液、無菌水，及一般熟習此項技術者已知之其他緩衝液，諸如Good等人(1966) Biochemistry 5:467所描述之緩衝液。緩衝液之pH可在6.5至7.75範圍內，較佳地在7至7.5範圍內且最佳在7.2至7.4範圍內。 IV.使用方法
本發明亦提供使用Wnt促效劑分子例如以調節Wnt傳訊路徑，例如以增加Wnt傳訊，以及在各種治療環境中投與Wnt促效劑分子之方法。本文提供使用Wnt促效劑分子之治療方法。在一個實施例中，向患有涉及不當或失調Wnt傳訊之疾病之個體提供Wnt促效劑分子。
在某些實施例中，Wnt促效劑分子可用於增強組織或細胞中之Wnt傳訊路徑。促效Wnt傳訊路徑可包括例如增加組織或細胞中之Wnt傳訊或增強Wnt傳訊。因此，在一些態樣中，本發明提供一種用於促效細胞中之Wnt傳訊路徑之方法，其包含使組織或細胞與有效量之本文所揭示之Wnt促效劑分子或其醫藥學上可接受之鹽接觸，其中Wnt促效劑分子為Wnt傳訊路徑促效劑。在一些實施例中，接觸在活體外、離體或活體內進行。在特定實施例中，細胞為經培養細胞，且該接觸係在活體外進行。在某些實施例中，此類方法可適用於誘導所關注之細胞及/或組織分化。因此，此類方法可能用於製備細胞及/或組織以用於移植物植入(例如神經細胞或組織，其可例如適用於治療神經或神經退化性疾病)、使幹細胞分化(例如使幹細胞分化成神經前驅細胞或神經元)及/或製備類器官(例如神經類器官)。
Wnt促效劑分子可用於治療各種疾病、病症及病狀，諸如視網膜病變。特別地，Wnt傳訊之活化為眼睛中血管發育期間視網膜血管形成所必需的。norrin、Fzd4、Lrp5或Tspan12之遺傳性缺失不僅顯著地使表面視網膜表面上之血管發育消退，且亦使血管滲透至更深層視網膜中消退。另外，由於不成熟血管形成所產生之無血管區域引起缺血誘發之新血管生成。因此，Wnt促效劑或/及拮抗劑之及時受控投與不僅將使視網膜病變疾病進展消退且亦將引起病痛改善。在特定實施例中，Wnt促效劑將在個體之視網膜病變疾病進展之早期或晚期投與。
可治療之視網膜血管疾病可包括但不限於：家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、滲出性玻璃體視網膜病變、諾里氏病、糖尿病性視網膜病變(DR)、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性黃斑缺血、老年性黃斑變性(AMD) (包括濕性及乾性AMD)、早產兒視網膜病變(ROP)、骨質疏鬆假膠質瘤症候群(OPPG)、視網膜靜脈阻塞及科阿氏病。
在特定實施例中，視網膜疾病或視網膜病變係用Wnt傳訊促效劑(包括但不限於hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ或hp4SD1-03 AAA)或包含hp4SD1-03之片段或變體或其多肽組分的Wnt傳訊促效劑治療。在特定實施例中，片段或變體為保留Fzd及/或LRP5/6結合活性及誘導Wnt傳訊路徑(在Wnt傳訊促效劑之情況下)之能力的功能片段或變體，例如在某些實施例中，相較於親本分子(其可為例如hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ或hp4SD1-03 AAA)，至少100%、至少90%、至少80%、至少70%或至少60%之Fzd及/或LRP5/6結合活性，及/或誘導Wnt傳訊路徑之能力的至少100%、至少90%、至少80%、至少70%或至少60%。
在特定實施例中，Wnt傳訊促效劑具有如 圖 1中圖解的結構型式及/或包含 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示之序列中之一者或兩者或其任何功能片段或變體，例如其抗原結合片段，諸如VHH域、VL域、或VH域、或Fc域或此等功能域中之任一者的變體，例如與本文所揭示之抗體序列之任何功能片段具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的變體。在一些實施例中，Wnt傳訊促效劑包含與 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示，或SEQ ID NO: 1及/或2、SEQ ID NO: 1及/或7、SEQ ID NO: 1及/或8、SEQ ID NO: 1及/或9、SEQ ID NO: 1及/或450、SEQ ID NO: 1及/或451、SEQ ID NO: 1及/或452及/或SEQ ID NO: 1及/或453中所闡述之序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)的變異序列，或其任何功能片段，例如其抗原結合片段。在一些實施例中，Wnt傳訊促效劑包含野生型或與 圖 9中揭示或SEQ ID NO: 1中所闡述之輕鏈序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)的變異序列；及野生型或與 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示，或SEQ ID NO: 2、7-9及450-453中之任一者中所闡述之重鏈序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)的變異序列。在一些實施例中，Wnt傳訊促效劑包含兩個野生型或變異序列，其各自與 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示或SEQ ID NO: 1中所闡述之輕鏈序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)；及兩個野生型或變異序列，其各自與 圖 9 或圖 19A 或圖 19B中揭示，或SEQ ID NO: 2、7-9及450-453中之任一者中所闡述之重鏈序列具有至少90%一致性(例如95%、98%或100%一致性)，其中兩條重鏈彼此結合，且各輕鏈例如藉由二硫鍵與不同重鏈結合。在特定實施例中，可將胺基酸修飾引入親本分子4SD1-03_LALPG中，以產生hp4SD1-03或其變體，包括例如hVHH3-H4 ( 圖 2)，hVHH3-H4 N29Q，經DED取代之hVHH3-H4 DDD ( 圖 4)，經DEEY (SEQ ID NO: 411)、DESY (SEQ ID NO: 412)、DEAY (SEQ ID NO: 413)、DETY (SEQ ID NO: 414)、ESEY (SEQ ID NO: 415)、ESTY (SEQ ID NO: 416)或ESSY (SEQ ID NO: 417)取代之hVHH3-H4 DDDY (SEQ ID NO: 418) (胺基酸101-104) ( 圖 14)，4SD1 HC CDR1 N31S，及4SD1 HC CDR2 D62E ( 圖 7)中之彼等；及/或人源化4DS1構架中之彼等，如 圖 8中所示。在某些實施例中，維持CDR3 D108。在某些實施例中，維持VHH3 M51。
在特定實施例中，本文揭示之治療方法引起以下中之一或多者：視網膜血管滲漏降低、視網膜缺血降低或視網膜新生血管病灶大小減小。在特定實施例中，本文所揭示之治療方法引起本文所揭示之疾病或病症中之任一者之一或多個症狀或病變改善。
本發明亦提供與針對FEVR及/或DR之已知治療的組合治療。舉例而言，Wnt促效劑可與視網膜病變之另一療法組合投與，包括但不限於抗VEGF藥劑或VEGF抑制劑或VEGF拮抗劑，諸如抗VEGF抗體。在一些實施例中，抗Ang2抗體亦將與Wnt促效劑組合向個體投與。低氧誘導之VEGF及Ang2表現為病理性新血管生成之重要線索，且實際上已考慮拮抗劑Ang2抗體用於視網膜病變患者治療(Gadkar等人, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015年8月;56(9):5390-400)。抗VEGF抗體或抗Ang2抗體可與本發明之分子依序或同時投與。VEGF拮抗劑可包括但不限於：貝伐單抗(bevacizumab)、蘭比珠單抗(ranibizumab)、阿柏西普(aflibercept)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)及塔尼比單抗(tanibirumab)；及Ang2拮抗劑可包括但不限於：奈伐蘇單抗(nesvacumab)、AMG780及MEDI3617。
在另一實施例中，促效劑分子亦可併入組織靶向部分，例如識別視網膜組織特異性受體或細胞表面分子之抗體或其片段。
治療劑(例如Wnt促效劑)可在疾病或損傷發作之前、期間或之後投與。對進行中之疾病之治療尤其受關注，其中治療穩定或減少患者之期望的臨床症狀。此類治療理想地在受影響組織之功能完全喪失之前進行。主題療法理想地在疾病有症狀階段期間且在一些情況下在疾病有症狀階段之後投與。在一些實施例中，主題方法產生治療益處，例如預防病症之發展、阻止病症之進展、逆轉病症之進展等。在一些實施例中，主題方法包含偵測已實現之治療益處的步驟。一般熟練技術人員應瞭解，此類治療功效量測將適用於所改善之特定疾病，且將識別用於量測治療功效之適當偵測方法。
本說明書中提及及/或申請案資料表中所列之以上美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外來專利、外來專利申請案及非專利公開案中之全部均以全文引用的方式併入本文中。
根據以上內容應瞭解，雖然已出於說明之目的在本文中描述了本發明之特定實施例，但可在不偏離本發明之精神及範疇之情況下進行各種修改。因此，除了所附申請專利範圍之外，本發明不受限制。
參考以下實例最佳理解本發明之廣泛範疇，其不意欲將本發明限制於具體實施例。 實例
描述分子生物學中之標準方法。Maniatis等人(1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Sambrook及Russell (2001) Molecular Cloning, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Wu (1993) Recombinant DNA, 第217卷, Academic Press, San Diego, Calif。標準方法亦見於Ausbel等人(2001) Current Protocols in Molecular Biology, 第1-4卷, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y中，其描述選殖於細菌細胞中及DNA誘變(第1卷)、選殖於哺乳動物細胞及酵母中(第2卷)、醣結合物及蛋白質表現(第3卷)以及生物資訊學(第4卷)。
描述用於蛋白純化之方法，包括免疫沈澱、層析、電泳、離心及結晶。Coligan等人(2000) Current Protocols in Protein Science, 第1卷, John Wiley and Sons, Inc., New York。描述化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白之製造、蛋白質之醣基化。參見例如Coligan等人(2000) Current Protocols in Protein Science, 第2卷, John Wiley and Sons, Inc., New York；Ausubel等人(2001) Current Protocols in Molecular Biology,第3卷, John Wiley and Sons, Inc., NY, N.Y., 第16.0.5-16.22.17頁；Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.;第45-89頁；Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J.,第384-391頁。描述多株及單株抗體之生產、純化及片段化。Coligan等人(2001) Current Protocols in Immunology, 第1卷, John Wiley and Sons, Inc., New York；Harlow及Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Harlow及Lane,見上文。可獲得用於表徵配體/受體相互作用之標準技術。參見例如Coligan等人(2001) Current Protocols in Immunology, 第4卷, John Wiley, Inc., New York。
可獲得流式細胞分析技術之方法，包括螢光活化細胞分選偵測系統(FACS®)。參見例如Owens等人(1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.；Givan (2001) Flow Cytometry, 第2版；Wiley-Liss, Hoboken, N.J.；Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.。可獲得用作例如診斷試劑的適用於修飾核酸，包括核酸引子及探針、多肽及抗體之螢光試劑。Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.；Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, Mo.。
描述免疫系統之組織學之標準方法。參見例如Muller-Harmelink (編) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, N.Y.；Hiatt等人(2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, Pa.；Louis等人(2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, N.Y.。
用於確定例如抗原片段、前導序列、蛋白質摺疊、功能域及醣基化位點之套裝軟體及資料庫係可獲得的。參見例如GenBank, Vector NTI®套件(Informax, Inc, Bethesda, Md.)；GCG Wisconsin套裝軟體(Accelrys, Inc., San Diego, Calif.)；DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nev.)；Menne等人(2000) Bioinformatics16: 741-742；Menne等人(2000) Bioinformatics Applications Note16:741-742；Wren等人(2002) Comput. Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne (1983) Eur. J. Biochem.133:17-21；von Heijne (1986) Nucleic Acids Res.14:4683-4690。 實例1 新穎Wnt傳訊促效劑之產生及表徵
如所描述研發及表徵呈現增強活性之人源化且最佳化Wnt傳訊促效劑。 蛋白質產生
所有重組蛋白質均藉由暫時轉染在Expi293F™細胞(Thermo Fisher Scientific)中產生。蛋白質首先使用MabSelect SuRe管柱(本文中通常稱為蛋白A)純化，接著利用使用1xHBS緩衝液(20 mM HEPES pH 7.4，150 mM NaCl)之Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare Life Sciences)尺寸排阻層析(SEC)或利用使用2XHBS緩衝液之HiLoad 16/600 Superdex 200來進一步精製。此後，蛋白質藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢查且估計純度＞ 90%。 SuperTop Flash (STF)分析(Wnt傳訊分析)
如先前所報導，Wnt傳訊活性使用含有受Wnt反應性啟動子控制之螢光素酶基因之bEND3細胞來量測(Super Top Flash報導分析，STF) (Chen等人, STAR Protoc.2020年6月3日;1(1):100043.)。簡言之，以每孔10,000個之密度，將細胞接種於96孔盤中，24小時後在3 μM IWP2存在下處理，以抑制內源性Wnt配體之產生。接著將不同濃度之重組蛋白質添加至細胞中隔夜。細胞用螢光素酶細胞培養物溶解試劑(Promega)溶解，且螢光素酶活性用螢光素酶分析系統(Promega)，使用供應商提出之程序量測。 實例 2氧誘發之視網膜病變(OIR)小鼠研究
類似於先前所描述進行氧誘發之視網膜病變(OIR)之小鼠模型(Smith等人, Oxygen-induced retinopathy in the mouse, Investigative Ophthalmology & Visual Science1994年1月, 第35卷, 101-111)，其中具有一些實驗變化。簡言之，將在產後7天(P7)之新生幼鼠暴露於具有75%吸入氧含量之高氧環境5天。因此，自P7至P12，幼鼠自中心視網膜中之新形成之毛細管之血管堵塞形成無血管(AV)視網膜。在P12將幼鼠移動至室內空氣之後，無血管中心視網膜變得低氧，且自P12至P17，在血管及無血管視網膜之接合處形成玻璃體內新生血管(NV)簇。對於處理而言，P12幼鼠接受以下測試品中之一者之玻璃體內注射：Eylea® (阿柏西普，誘餌VEGF受體)，60 μg/眼睛；4SD1-03_LALAPG，68 ng/眼睛；hp4SD1-03，13.6 ng/眼睛；或媒劑對照。為了評估測試品對於減少AV及NV區域之功效，在P17之幼鼠之整個建立的視網膜用同工凝集素B4染色且成像。對AV、NV及總視網膜區域手動進行評分，且以AV區域或NV區域相對於總視網膜區域之百分比呈現。為了評價劑量-功效關係，如上文所描述進行第二OIR研究( 圖 15A 至 圖 15C)，其中劑量為每隻眼睛13.6 ng、136 ng、1360 ng hp4SD1-03，或注射媒劑對照。為了評估測試品對於減少AV及NV區域之功效，在P17之幼鼠之整個建立的視網膜用同工凝集素B4染色且成像。對AV、NV及總視網膜區域進行手動評分且以AV或NV區域相對於總視網膜區域之百分比呈現。各處理組與媒劑對照組之間的統計顯著性使用單因素ANOVA測試，隨後Tukey多重比較檢定來測定。在OIR模型中，自40 nM至4000 nM之hp4SD1-03有效減少NV簇及AV區域。
hp4SD1-03之所有測試劑量均顯示病理性NV及視網膜AV區域顯著減少至比媒劑處理組更大程度( 圖 15B 及圖 15C)。此等結果表明，hp4SD1-03不僅在視網膜缺血條件中強力抑制病理性NV簇形成，且亦潛在地促進適當血管再生以再灌注受損視網膜。 實例 3VEGF誘導之視網膜血管滲漏兔研究
類似於先前所描述進行VEGF誘導之視網膜血管滲漏之兔模型(Arana, L.A.等人Fluorescein angiography, optical coherence tomography, and histopathologic findings in a VEGF animal model of retinal angiogenesis. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 250,1421-1428 (2012))，其中具有一些實驗變化。第0天，對兔眼睛玻璃體內給藥測試品，隨後1.0 µg重組人類VEGF165 (R&D Systems)以用於視網膜滲漏。在第0天(VEGF之前)、第3天及第5天，對兩隻眼睛進行螢光素血管造影(Fluorescein angiography；FA)。在靜脈內注射鈉螢光素(12 mg kg−1) 1-2 min之後進行早期視網膜攝影。使用RetCam3 (Natus)成像系統對動物成像。評定(遮蔽)測試品及所收集影像且如下對視網膜滲漏進行評分：視網膜滲漏評分，0：主血管呈現極筆直，以及有限的較小血管扭曲；1：主血管呈現增加之扭曲及/或血管擴大；2：主血管之間存在滲漏，微小血管之間無滲漏；3：主血管及微小血管之間存在滲漏；及4：主血管及微小血管之間存在滲漏，且微小血管不可見。 實例 4VHH3人源化
為了使駱駝抗體(VHH3)序列人源化，搜尋人類生殖系IgG重鏈(HC)之序列資料庫。發現3-66*01為最接近匹配。產生及純化四種不同突變體(H1-H4)。挑選顯示最佳生產產率之「hVHH3-H4」作為經人源化之VHH3 ( 圖 3)。 實例 5精製VHH3
為了化解VHH3 CDR區中脫醯胺作用、異構化及氧化之潛在傾向風險，如下產生及測試VHH3突變體( 圖 3 至 圖 5)。 在CDR1之N29Q突變(圖3)
產生及純化hVHH3-H4之三種不同N29突變體(N29Q、N29A、N29S)。舉例而言，N29Q VHH3顯示針對高純度表現之良好產率。將CDR1中之天冬醯胺置換為麩醯胺酸以減小脫醯胺作用之潛在傾向。 在CDR3之D102E突變(圖4)
產生及純化hVHH3-H4 CDR3中之五種不同突變體(DED、SDE、EDE、ESD、SSD)以化解VHH3中「DD」模體異構化之風險。所有突變體均顯示良好STF反應及表現。選擇可具有極小結構變化之DED突變體。將CDR3中之天冬胺酸置換為麩胺酸以減小異構化之潛在傾向。 在CDR3之D103突變(圖14)
在hp4SD1-03中，在VHH域之CDR3之胺基酸101-104內進行各種胺基酸取代，包括以下：DEEY (SEQ ID NO: 411)、DESY (SEQ ID NO: 412)、DEAY (SEQ ID NO: 413)、DETY (SEQ ID NO: 414)、ESEY (SEQ ID NO: 415)、ESTY (SEQ ID NO: 416)及ESSY (SEQ ID NO: 417)。此等突變體顯示良好表現及穩定性。所有所測試突變體均增加STF反應量值(Emax)。在一些突變體中，EC50值減小(例如ESSY (SEQ ID NO: 417))。 VHH3 CDR2中之M51及M57無變化(圖5)
產生在VHH3 CDR2中之各甲硫胺酸殘基處之三種不同突變體(M51K、M51L、M51I、M57K、M57L、M57I)作為VHH且純化以化解潛在氧化傾向之風險。所有突變體均顯示表現較大降低，且決定保留兩個甲硫胺酸殘基。藉由Mass-spec分析測試氧化，其指示無氧化(資料未顯示)。 精製4SD1 IgG LALAPG
為了化解4SD1可變域中脫醯胺作用、異構化及氧化之潛在傾向之風險，如下產生及測試HC突變體。輕鏈CDR區中無潛在傾向之胺基酸。 在 4SD1 HC_CDR1 之 N31S 突變 ( 圖 7)
產生及純化包含4SD1 LC以及4SD1 HC之三種不同N31突變體(N31Q、N31A、N31S)之一的雙特異性抗體。相較於其親本形式，所有突變體在STF分析中均顯示無活性降低。N31S及N31A突變體在STF分析中甚至顯示效能改良，且挑選N31S用於經精製之分子。 在 4SD1 HC_CDR2 之 D62E 突變 ( 圖 7)
產生及純化包含4SD1 LC以及4SD1 HC之三種不同D62突變體(D62E、D62A、D62S)之一的雙特異性抗體。相對於其親本形式，所有突變體均顯示相當或改良的STF活性(例如反應量值增加)。由於D與E之間的胺基酸相似性，挑選D62E用於經精製之分子。 在4SD1 HC_CDR3之D108無變化(圖7)
產生及純化包含4SD1 LC以及4SD1 HC之十種不同D108突變體(D108E、D108A、D108S、D108R、D108T、D108L、D108H、D108Y、D108Q、D108K)之一的雙特異性抗體。相較於其親本形式，所有突變體均顯示在STF活性方面之顯著效能損失。判斷D108應保持不變且藉由mass-spec分析評估異構化傾向。 4SD1構架人源化(圖8)
4SD1抗體序列獲自含有與人類生殖系序列錯配之一些突變之合成人類抗體文庫。基於人類IgG生殖系序列校正構架中之突變，如 圖 8中所指示。相對於親本4SD1-03_LALAPG，如 圖 9中所示併入以上序列修飾之hp4SD1-03顯示改良的STF活性，亦即EC50降低且Emax增加。 實例6 hp4SD1-03之生物活性 Wnt 傳訊活性
相比於其親本形式4SD1-03_LALAPG，最終人源化且精製之4SD1-03_LALAPG：hp4SD1-03 ( 圖 9)，在如實例1中進行之STF分析中顯示約10倍效能增加(如基於EC50降低所評估) ( 圖 10A中所示之一個例示性並列劑量反應比較)。更具體言之，來自七個獨立實驗之hp4SD1-03之平均EC50 ± SEM為0.055 ± 0.014 nM，且來自十個獨立實驗之4SD1-03_LALAPG之平均EC50 ± SEM為0.477 ± 0.069 nM。
類似地，當進行類似於STF分析但使用不含受Wnt反應性啟動子控制之外源性報導基因之bEND3細胞(亦即使用較少人工環境)之用於量測Wnt/ β-連環蛋白傳訊的另一分析時(下文描述方法細節)，相對於4SD1-03_LALAPG，在hp4SD1-03之情況下觀測到EC50降低11.5倍而不損失反應量值(Emax) ( 圖 10B)。
材料及方法
藉由定量由活性Wnt傳訊誘導且在負反饋環中起作用之基因Axin2之基因表現之量，量測小鼠腦微血管內皮細胞(bEnd.3細胞)中的Wnt/ β-連環蛋白傳訊活性(Yan, PNAS, 98(26):14973-14978, (2001)；Lustig, Mol. Cell. Biol.22(4): 1184-1193 (2002)；Jho, Mol. Cell. Biol.22(4): 1172-1183 (2002))。
以500000個細胞/孔之密度，將細胞接種於6孔盤中，且在處理前24小時在具有0.5% BSA之DMEM中饑餓。接著將4SD1-03_LALAPG或hp4SD1-03蛋白添加至細胞中24小時。進行饑餓以消除FCS之非特異性傳訊作用。重組人類Norrin (R&D Systems，批次NSO0717041，3014-NR-025)用作反應比較劑。使細胞溶解，且完全按照製造商方案，用350 µl RLT緩衝液萃取RNA (Qiagen RNeasy 96套組，目錄號74181，批次172036621)。合成cDNA，且根據製造商程序擴增Axin 2 cDNA (Applied Biosystems高容量cDNA逆轉錄套組，目錄號4368813，批次01216654；Applied Biosystems TaqMan通用PCR主混合物，目錄號4304437，批次2208187；Axin2引子：Mm00443610_m1Applied Biosystems)。
使用GraphPad Prism 9.3.1產生劑量反應曲線(DRC)；對於標準化，將重組Norrin之最大反應設定為100%。 小鼠視網膜損傷模型
如 圖 11中所示，相較於親本構築體4SD1-03_LALAPG，用經修飾之構築體hp4SD1-03處理在視網膜損傷之小鼠模型中表明，相較於4SD1-03_LALAPG，hp4SD1-03具有更佳結果。 兔視網膜血管滲漏模型
如 圖 12中所示，用經修飾之構築體hp4SD1-03處理在視網膜損傷之VEGF誘導之視網膜血管滲漏兔模型中減少血管滲漏。用2 μg hp4SD1-03/眼睛處理引起滲漏減少44%，且用0.4 μg hp4SD1-03/眼睛處理亦顯著地減少血管滲漏。 實例 7 西方墨點分析 - 4SD1-03_LALAPG
如先前所報導進行西方墨點分析，其中具有少量修改。簡言之，在收穫用於細胞溶解24小時之前，人類視網膜微血管內皮細胞(HRMEC)用10 nM 4SD1-03_LALAPG處理。使用抗ZO-1 (Abcam；ab216880)、抗CLDN5 (Abcam；ab131259)及抗β肌動蛋白(Sigma-Aldrich：A5441)一級抗體，隨後使用辣根過氧化酶(HRP)結合的抗兔或抗小鼠二級抗體用於化學發光訊號。
在具有特定內皮細胞(EC)緊密連接之血腦障壁(BBB)血管中觀測到淋巴球性強化結合因子1 (Lef1)及Mfsd2a之累積，其在Wnt/β-連環蛋白傳訊調節下(參見例如Wang Z等人(2020) Sci Adv2020;6:eaba7457；Wang Y等人(2019) Elife8；及Ben-Zvi A等人(2014) Nature509:507-511)。在HRMEC中， LEF1及 MFSD2AmRNA之表現被4SD1-03_LALAPG處理顯著上調( 圖 16A)。此外，在4SD1-03_LALAPG處理後，視網膜血管EC中EC緊密連接蛋白質CLDN5及ZO-1之表現上調( 圖 16B)。此等結果表明，靶向Fzd4及LRP5之經生物工程改造之四價抗體在血管EC中具有活性，且可經由上調障壁功能蛋白質而增加血管完整性。 西方墨點分析- hp4SD1-03
類似地，確認用10 nM hp4SD1-03處理HRMEC (材料及方法在下文詳述)誘導Wnt/β-連環蛋白傳訊，藉由作為Wnt傳訊之關鍵組分且在Wnt傳訊路徑活化後變得磷酸化之散亂蛋白區段極性蛋白3 (DVL3)之磷酸化增加所量測(Gonzalez-Sancho等人, Mol Cell Biol. 2004年6月;24(11):4757-68.)。( 圖 16C)。
材料及方法
以500000個細胞/孔之密度，將HRMEC細胞接種於6孔盤中，且在處理前24小時在具有0.5% BSA之DMEM中饑餓。添加細胞與重組Norrin、R2M3_null對照或hp4SD1-03蛋白，且培育1小時。重組人類Norrin (R&D Systems，批次NSO0717041，3014-NR-025)用作反應比較劑。細胞用300 µl具有Complete (Roche 11873580001)或Pefabloc SC (Roche 505648900)之細胞溶解緩衝液(Cell Signaling 9803S)在4℃下溶解30 min，在4℃下以14000g離心萃取物15 min，且上清液用3 µlDNA酶I (Qiagen 79254)消化。使溶解物在藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離之SDS樣品緩衝液中沸騰，轉移至硝化纖維素膜上且使用所指示抗體進行西方墨點分析(NuPage7%Tris乙酸凝膠，Invitrogen EA03585BOX，根據製造商之方案，iBlot® NC Transfer Stacks Invitrogen IB 23001，兔抗Dvl3抗體細胞傳訊3218，抗兔IgG (H+L)，HRP結合物Promega，W4011)。藉由使用Fuji LumiImager LAS 300, AIDA軟體(高級資料影像分析儀4.15.025版)量測條帶強度定量蛋白質含量。計算上帶(對應於磷酸化DVL3)及下帶(對應於未磷酸化DVL3)與之間的強度比率。 實例 8 藉由 BLI 進行之 結合動力學
觀測到相對於4SD1-03_LALAPG，hp4SD1-03對人類Fzd4之CRD之結合親和力增加，藉由生物層干涉術(bio-layer interferometry；BLI) (材料及方法在下文詳述)量測( 圖 17A 至圖 17C)。在所有測試濃度中，在hp4SD1-03之情況下之人類Fzd4 CRD的感測圖譜顯示比在4SD1-03_LALAPG之情況下更慢的解離( 圖 17C)。兩個圖( 圖 17A 至圖 17B)中之動力學分析亦清楚地顯示，減緩的k off(k dis)極其影響hp4SD1-03之降低的K D值。不希望受理論所束縛，減緩的k off及降低的K D可至少部分地解釋上文所描述之STF及Wnt/β-連環蛋白傳訊量測分析中觀測到之EC50值降低。
材料及方法
藉由BLI，使用OCTET®紅96 (PALL ForteBio, Fremont, CA)儀，在30℃下，1000 rpm，用AHC生物感測器(Sartorius)，來測定4SD1-03_LALAPG或hp4SD1-03對人類Fzd4之富半胱胺酸域(CRD)之單價結合的動力學。將4SD1-03_LALAPG或hp4SD1-03稀釋於電泳緩衝液(PBS，0.05% Tween-20®，0.5% BSA，pH 7.2)中至50 nM，且捕獲至AHC生物感測器，隨後浸漬至在電泳緩衝液中含有不同濃度(1000、333.3、111.1、37、12.4、4.12及1.37 nM)之人類Fzd4之CRD的孔中或至僅具有電泳緩衝液作為參考通道的孔中。隨後用電泳緩衝液解離相互作用。藉由OCTET®系統軟體，基於擬合於1:1結合模型，計算各結合劑之一價K D。 藉由 SPR 進行之 結合動力學
觀測到相對於4SD1-03_LALAPG，hp4SD1-03對人類Fzd4之CRD之結合親和力增加，藉由表面電漿子共振(SPR) (材料及方法在下文詳述)量測( 圖 18A 至圖 18C)。如感測圖譜( 圖 18A 至圖 18B)及動力學值( 圖 18C)中所示，hp4SD1-03顯示比4SD1-03_LALAPG更慢的解離及增加的親和力(K D值降低)。同樣，不希望受理論所束縛，減緩的k off及降低的K D可至少部分地解釋上文所描述之STF及Wnt/β-連環蛋白傳訊量測分析中觀測到之EC50值降低。
材料及方法
藉由SPR，使用Biacore®8K儀，使用HBS-EP+ (Biacore #BR-100668)作為電泳緩衝液，來測定hp4SD1-03或4SD1-03_LALAPG對人類Fzd4 CRD (TPP-48723、PPB-51327)之結合。按照製造商之建議，CM5生物感測晶片(Biacore #BR100530)用EDC/NHS之50:50溶液(胺偶合套組Biacore #BR-100633)活化。將含10 µg/ml蛋白質AG之10 mM乙酸鹽pH 4.5固定於表面上，隨後用1M乙醇胺鹽酸鹽去活化。
以10 µl/min之流速，捕獲四個濃度下(4、2、1及0.5 µg/ml於HBS-EP+中)之hp4SD1-03或4SD1-03_LALAPG持續30秒。在HBS-EP+中製備人類Fzd CRD之連續稀釋液(2.5 µM-10.29 nM)，且以30 µl/min注射90秒結合，隨後200秒解離。藉由以30 µl/min之流速注射0.85%磷酸30秒而再生表面。
自原始資料減去與感測器表面(流槽1)及空白(HBS-EP+或0 nM分析物)之分析物相互作用。接著，使用1:1結合模型擬合感測圖譜以提供動力學常數(k a及k d)及親和力(K D)值。對不同捕獲濃度之結果求平均，且在excel中計算標準差以獲得此處報導之值。由於所使用之分析物之最高濃度為2.5 µM，所以高於250 nM之K D值為表觀K D。 實例 9 設計 hp4SD1-03 之 Fc 突變體
為了致力於產生可具有較短活體內循環時間之hp4SD1-03之變體，hp4SD1-03之Fc區(其已經具有L234A、L235A及P329G (在本文中亦稱為LALAPG))經修飾以進一步具有以下胺基酸取代：I253A、H310A及H435Q (在本文中亦稱為IAHAHQ或AAQ)；或I253A、H310A及H435A (在本文中亦稱為IAHAHA或AAA)。另外包含IAHAHQ之hp4SD1-03變體命名為hp4SD1-03 AAQ，且另外包含IAHAHA之hp4SD1-03變體命名為hp4SD1-03 AAA。未對hp4SD1-03之輕鏈進行改變。hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA之重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別顯示於 圖 19A及 圖 19B中。不希望受理論所束縛，活體內循環時間(半衰期，T ½)降低可提供降低之毒性。 hp4SD1-03 AAQ 及 hp4SD1-03 AAA 之產生
hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA兩者均使用蛋白A親和樹脂成功純化( 圖 20)。
材料及方法
藉由暫時轉染在Expi293F™細胞(Thermo Fisher Scientific)中產生重組蛋白質。蛋白質藉由蛋白A親和層析捕獲且在酸性條件下溶離，接著精製且藉由Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva)尺寸排阻層析(SEC)，使用HBS緩衝液進行緩衝液交換。經純化之蛋白質藉由SDS-聚丙烯醯胺電泳檢查，基於此，估計蛋白質具有＞ 90%純度。SEC層析圖顯示於 圖 20中。 hp4SD1-03 AAQ 及 hp4SD1-03 AAA 之蛋白質穩定性
相對於hp4SD1-03，未發現hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA之第一解鏈溫度(Tm1)具有顯著變化( 圖 21)。
材料及方法
測定解鏈曲線，且使用監測內源螢光之UNcle儀(UNchained Labs)來量測解鏈溫度(Tm1及Tm2)。HBS pH 7.4中之蛋白質濃度為0.5 mg/mL，其中溫度自15℃緩慢升溫至95℃，升溫速率為0.6℃/min。在相同實驗中，藉由增加粒度之靜態光散射來測定聚集起始之溫度(Tagg)。重複分析各樣品兩次。 hp4SD1-03 AAQ 及 hp4SD1-03 AAA 之 STF 活性
如實例1中所描述，藉由STF分析量測Wnt傳訊活性。例示性結果顯示於 圖 22中。相對於hp4SD1-03，hp4SD1-03 AAQ顯示EC50略微降低，且hp4SD1-03 AAA顯示反應量值(Emax)增加。 hp4SD1-03 AAQ 及 hp4SD1-03 AAA 對 FcRn 之結合
hp4SD1-03 AAQ以及hp4SD1-03 AAA均未顯示與FcRn之任何結合 ( 參見圖 23)。
材料及方法
藉由BLI在Octet®紅96 (PALL ForteBio, Fremont, CA)儀上，在25℃下，1000 rpm，用NTA生物感測器進行該結合分析。將His標記之FcRn (Acro Biosystems)稀釋於電泳緩衝液(PBS，0.05% Tween-20，0.5% BSA，pH 7.2)中至100 nM，且捕獲至NTA生物感測器(Sartorius)，隨後浸漬至在電泳緩衝液中含有100 nM之hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA之孔中或至僅具有操作緩衝液作為參考通道之孔中。重複分析樣品兩次。 實例 10 藥物動力學 (PK)
測定hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA之各種藥物動力學參數，包括半衰期。
例如如上文所描述，適當地產生及純化hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA。在給藥之前，將模型動物(例如兔，諸如新西蘭白兔(New Zealand White rabbit)或絨鼠兔(Chinchilla rabbit)組；猴，諸如石蟹獼猴等)隨機分配至基於所需劑量(例如100 ng、1 μg、10 μg、100 μg、1 mg及10 mg等)、所需途徑(例如玻璃體內、使用滴眼劑局部、靜脈內等)、收穫之樣品類型及樣品收穫時間點設計的不同實驗組。收集血液樣品用於基線量測。
在給藥當天，將hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA復原至所需濃度(例如300 nM、3 μM、30 μM、300 μM、3 mM及30 mM等)，且經由所需途徑，以所需劑量向模型動物投與。
對於靜脈內投與後之分析而言，例如經由中耳部動脈，在不同時間點，例如給藥後5及30分鐘，以及1、2、4、8、24、32、48、72及96小時，連續收集適當量之血液(例如0.2 mL，對於小動物，諸如兔；3 mL，對於較大動物，諸如猴)。對於在玻璃體內或局部投與後之分析而言，亦將連續收集適當量之血液，且將在不同的預先選擇的末端時間點收集適當組織，諸如眼部組織(例如玻璃狀液、水狀液、玻璃狀液、視網膜組織(例如包括視盤、黃斑、周邊視網膜))。
所有血液樣品將收集於不具有抗凝血劑之血清分離管中，使其在環境溫度下凝結例如至少20分鐘，且在2-8℃下離心。將在離心之約20分鐘內收穫血清，且儲存在-60℃至-80℃下直至PK分析。將所有所收集組織稱重且儲存在-80℃下直至分析。
例如藉由使血清樣品經受ELISA來分析血清樣品中hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ或hp4SD1-03 AAA之濃度。例如藉由使組織樣品均質化且經受均質化至ELISA來分析組織樣品中hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ或hp4SD1-03 AAA之濃度。將相對於時間繪製濃度以觀察全身性及局部藥物動力學。將計算全身性及局部半衰期。為了分析PK，可使用擬合於任何適當PK模型(參見例如Gadkar等人, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015年8月;56(9):5390-400.；Le等人, J Pharmacol Exp Ther. 2015年11月;355(2):288-96.；Li等人, Exp Eye Res. 2012年4月;97(1):154-9.；及Park等人, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2016年5月1日;57(6):2612-7.)。
可組合上文描述之各種實施例以提供其他實施例。本說明書中提及及/或申請案資料表中所列之美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外來專利、外來專利申請案及非專利公開案中之全部均以全文引用的方式併入本文中。必要時，可修改實施例的態樣以採用各種專利、申請案以及公開案的概念，從而提供又其他實施例。可依據上文詳細描述，對實施例進行此等及其他改變。
一般而言，在隨附申請專利範圍中，所使用之術語不應視為將申請專利範圍限制為本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，但應視為包括所有可能的實施例以及等效於此類申請專利範圍所賦予之完整範疇。因此，申請專利範圍不受所揭示內容限制。 例示性實施例
本文在下文中描述根據本揭示案之一些例示性實施例。
實施例 P1.一種經工程改造之WNT傳訊促效劑，其中該WNT傳訊促效劑包含：a)兩條輕鏈，各自包含與SEQ ID NO: 1具有至少95%一致性之多肽序列；及2)兩條重鏈，各自包含與SEQ ID NO: 2具有至少95%一致性之多肽序列，其中該等兩條重鏈彼此結合，且該等兩條輕鏈中之各者與該WNT傳訊促效劑之不同重鏈結合。
實施例 P2. 如 實施例 P1之經工程改造之WNT傳訊促效劑，其中該等兩條輕鏈中之各者包含含有以下胺基酸殘基中之一或多者的VHH域：N29Q及/或經DED取代之VHH3-H4 (或hVHH3-H4) DDD。
實施例 P3.如 實施例 P1之經工程改造之WNT傳訊促效劑，其中該等兩條重鏈中之各者包含以下胺基酸殘基中之一或多者：CDR1 S31、CDR2 E62及/或CDR3 D108。
實施例 P4.一種核酸，其包含編碼如 實施例 P1 至 P3中任一項之經工程改造之WNT傳訊促效劑之輕鏈及/或重鏈的序列。
實施例 P5.如 實施例 P4之核酸，其中該核酸為mRNA，例如經修飾之mRNA。
實施例 P6.一種載體，其包含如 實施例 P4或 實施例 P5之核酸。
實施例 P7. 如實施例 P6之載體，其中該載體為包含與如 實施例 P4或 實施例 P5之核酸以可操作方式連接之啟動子的表現載體。
實施例 P8.一種宿主細胞，其包含如 實施例 P4或 實施例P 5之核酸或如 實施例 P6或 實施例 P7之載體。
實施例 P9.一種醫藥組合物，包含醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑，以及：a)如 實施例 P1 至 P3中任一項之經工程改造之WNT傳訊促效劑；b)如 實施例 P4 至 P5中任一項之核酸；及/或c)如 實施例 P6 至 P7中任一項之載體。
實施例 P10.一種治療個體之視網膜病變之方法，其包含向該個體投與：a)如 實施例 P1 至 P3中任一項之經工程改造之WNT傳訊促效劑；b)如 實施例 P4 至 P5中任一項之核酸；c)如 實施例 P6 至 P7中任一項之載體；及/或如 實施例 P9之醫藥組合物。
實施例 P11.如 實施例 P10之方法，其中該視網膜病變為視網膜血管疾病。
實施例 P12.如 實施例 P11之方法，其中該視網膜血管疾病係由血管發育之抑制引起。
實施例 P13.如 實施例 P10之方法，其中該視網膜病變係由過量血管生成引起。
實施例 P14.如 實施例 P10 至 P13中任一項之方法，其中該視網膜血管疾病選自由以下組成之群：家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、滲出性玻璃體視網膜病變、諾里氏病、糖尿病性視網膜病變(DR)、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性黃斑缺血、老年性黃斑變性(AMD) (包括濕性AMD及乾性AMD)、早產兒視網膜病變(ROP)、骨質疏鬆假膠質瘤症候群(OPPG)、視網膜靜脈阻塞及科阿氏病。
實施例 P15. 如實施例 P10 至 P14中任一項之方法，其中該經工程改造之WNT傳訊促效劑係向該個體的一或多隻眼睛投與。
實施例 P16.如 實施例 P15之方法，其中該經工程改造之WNT傳訊促效劑係玻璃體內投與。
實施例 A1. 一種抗Fzd4抗體或抗體片段，其包含： (A) VH，其包含：(i) CDRH1，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i-1) SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之CDRH1胺基酸序列，視情況根據Kabat；(i-2) SEQ ID NO: 121-124中之任一者之胺基酸序列；及/或(i-3) SEQ ID NO: 120之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況S、A、Q或N；(ii) CDRH2，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(ii-1) SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之CDRH2胺基酸序列，視情況根據Kabat；(ii-2) SEQ ID NO: 141-144中之任一者之胺基酸序列；及/或(ii-3) SEQ ID NO: 140之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況E、A、S或D；及(iii) CDRH3，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(iii-1) SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之CDRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；(iii-2) SEQ ID NO: 161之胺基酸序列；及/或(iii-3) SEQ ID NO: 160之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況D或不為S、E、A、R、T、L、H、Y、Q或K之任何胺基酸；及 (B) VL，其包含：(i) CDRL1，其包含含有以下或由以下組成胺基酸序列：(i-1) SEQ ID NO: 281中所含之CDRL1胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(i-2)包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列或由其組成；(ii) CDRL2，其包含含有以下或由以下組成胺基酸序列：(ii-1) SEQ ID NO: 281中所含之CDRL2胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii-2)包含SEQ ID NO: 241之胺基酸序列或由其組成；及(iii) CDRL3，其包含含有以下或由以下組成胺基酸序列：(iii-1) SEQ ID NO: 281中所含之CDRL3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(iii-2) 包含SEQ ID NO: 261之胺基酸序列或由其組成。
實施例 A2. 如實施例 A1之抗Fzd4抗體或抗體片段，其中： (A)該VH包含：(i) FRH1，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i-1) SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之FRH1胺基酸序列，視情況根據Kabat；(i-2) SEQ ID NO: 111或112之胺基酸序列；及/或(i-3) SEQ ID NO: 110之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況Q或K；(ii) FRH2，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(ii-1) SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之FRH2胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii-2) SEQ ID NO: 130或131之胺基酸序列；(iii) FRH3，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(iii-1) SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之FRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；(iii-2) SEQ ID NO: 151 或152之胺基酸序列；及/或(iii-3) SEQ ID NO: 150之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況N或D；X 2為任何胺基酸，視情況R或K；及X 3為任何胺基酸，視情況E或T；及/或(iv) FRH4，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(iv-1) SEQ ID NO: 181-188中之任一者中所含之FRH4胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(iv-2) SEQ ID NO: 170或171之胺基酸序列；及/或 (B)該VL包含：(i) FRL1，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i-1) SEQ ID NO:281 中所含之FRL1胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(i-2) SEQ ID NO: 221之胺基酸序列；(ii) FRL2，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(ii-1) SEQ ID NO: 281中所含之FRL2胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii-2) SEQ ID NO: 231之胺基酸序列；(iii) FRL3，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(iii-1) SEQ ID NO: 281中所含之FRL3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(iii-2) SEQ ID NO: 251之胺基酸序列；(iv) FRL3，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(iv-1) SEQ ID NO: 281中所含之FRL3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(iv-2) SEQ ID NO: 271之胺基酸序列。
實施例 A3. 如實施例 A1 或 A2之抗Fzd4抗體或抗體片段，其中： (A) 在該VH中： (I) (I-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 181中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 121、141及161之胺基酸序列；及(I-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 181之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (II) (II-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO: 182中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 122、142及162之胺基酸序列；及(II-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 182之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (III) (III-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 183中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 124、142及162之胺基酸序列；及(III-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 183之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (IV) (IV-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 184中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 121、142及162之胺基酸序列；及(IV-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 184之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (V) (V-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 185中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 123、142及162之胺基酸序列；及(V-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 185之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (VI) (VI-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 186中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 122、144及162之胺基酸序列；及(VI-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 186之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (VII) (VII-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 187中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 122、141及162之胺基酸序列；及(VII-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 187之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (VIII) (VIII-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 188中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 122、143及162之胺基酸序列；及(VIII-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 188之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列；及/或 (B)在該VL中：(1)該CDRL1、該CDRL2及該CDRL3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 281中分別所含之CDRL1胺基酸序列、CDRL2胺基酸序列及CDRL3胺基酸序列，視情況根據Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 221、241及261之胺基酸序列；及(2)視情況該VL包含與SEQ ID NO: 281之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列。
實施例 A4. 如實施例 A1 至 A3中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段，其中：(A)該VH包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：SEQ ID NO: 181-188中之任一者之胺基酸序列；及/或(B)該VL包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：SEQ ID NO: 281之胺基酸序列。
實施例 A5. 如實施例 A1 至 A4中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段，其中：(A)該VH包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：SEQ ID NO: 181之胺基酸序列；及(B)該VL包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：SEQ ID NO: 281之胺基酸序列。
實施例 A6. 如實施例 A1 至 A5中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段，其為以下，包含以下或包含於以下中： (i)包含該VH及該VL之IgG (視情況IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA、IgE、IgD或IgM； (ii)多特異性抗體或抗體片段(視情況包含如 圖 24 至圖 35中之任一者，進一步視情況 圖 24中所描繪之結構)，其包含含有該VH及該VL的第一抗原結合區以及對第二抗原具有特異性的第二抗原結合區，視情況其中該第二抗原為LRP5及/或LRP6；及/或 (iii)抗原結合片段(Fab)、Fab'片段、F(ab') 2、單鏈Fab (scFab)、可變片段(Fv)、單鏈Fv (scFv)、雙功能抗體或三功能抗體，其包含該VH及該VL。
實施例 A7. 如實施例 A1 至 A6中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段，其包含以下中之一或多者： (a)免疫球蛋白重鏈恆定域1 (CH1)或其變體，視情況其中該CH1或其變體：(a-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(a-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 21或22之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (b)免疫球蛋白鉸鏈或其變體，視情況其中該鉸鏈或其變體：(b-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(b-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (c)免疫球蛋白重鏈恆定域2 (CH2)或其變體，視情況其中該CH2或其變體：(c-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(c-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 41-46中之任一者之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (d)免疫球蛋白重鏈恆定域3 (CH3)或其變體，視情況其中該CH3或其變體：(d-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(d-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 51-54、61-64及66-69中之任一者之胺基酸序列(視情況不包括C端K)或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致；及/或 (e)免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)或其變體，視情況其中該CL或其變體：(e-1)屬於κ輕鏈恆定域(CLκ)，視情況為人類CLκ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性；或(e-2)屬於λ輕鏈恆定域(CLλ)，視情況為人類CLλ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況其中該抗Fzd4抗體或抗體片段分別包含SEQ ID NO: 42及51，分別包含SEQ ID NO: 43及51，分別包含SEQ ID NO: 45及61，分別包含SEQ ID NO: 45及66，分別包含SEQ ID NO: 46及61或分別包含SEQ ID NO: 46及66之CH2及CH3序列。
實施例 A8. 如實施例 A1 至 A7中任一項抗Fzd4抗體或抗體片段，其包含片段可結晶(Fc)區，視情況其中該Fc區： (I)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類，或其變體； (II)屬於：(i) IgG1或其變體，視情況其包含以下胺基酸取代中之一或多者：N297A、N297Q、D265A、L234A、L235A、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、缺失G236、P238A、A327Q、A327G、P329A、P329G、K322A、L234F、L235E、P331S、T394D、A330L、P331S、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、S239D、I332E、S298A、E333A、K334A、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、K326D、A330M、K334E、G236A、K326W、S239D、E333S、S267E、H268F、S324T、E345R、E430G、S440Y M428L、N434S、H310A、L328F、M252Y、I253A、S254T、T256E、H435Q、H435A及/或其任何組合，根據EU編號；(ii) IgG2或其變體，視情況其包含以下胺基酸取代中之一或多者：P238S、V234A、G237A、H268A、H268Q、H268E、V309L、N297A、N297Q、A330S、P331S、C232S、C233S、M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合，根據EU編號；(iii) IgG3或其變體，視情況包含胺基酸取代E235Y，根據EU編號；或(iv) IgG4或其變體，視情況包含以下胺基酸取代中之一或多者：E233P、F234V、L235A、G237A、E318A、S228P、L236E、S241P、L248E、T394D、M252Y、S254T、T256E、N297A、N297Q及/或其任何組合，根據EU編號； (III)包含一或多個降低Fc效應功能之胺基酸取代，視情況其中該一或多個胺基酸取代位於選自由以下組成之群之位置處：位置234、235、236、237、265、297及329，根據EU編號； (IV)至少包含以下胺基酸取代，根據EU編號：(ii-1) L234A、L235A及P329G；(ii-2) L234A及L235A；(ii-3) I253A、H310A及H435Q；(ii-4) I253A、H310A及H435A；(ii-5) D265A及P329A；(ii-6) M252Y、S254T及T256E；及/或(ii-7) M428L及N434S，視情況相對於人類IgG1 Fc區及/或相對於SEQ ID NO: 71-74中之任一者(視情況不包括C端K)；及/或 (V)包含如下胺基酸序列：包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 71-74、81-84、86-89、91-94、96-99、471-474、476-479、481-484及486-489中之任一者(視情況不包括C端K)之胺基酸序列，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。
實施例 A9. 一種核酸或核酸組合，其編碼如 實施例 A1 至 A8中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段，視情況其中該核酸為DNA、cDNA、RNA、mRNA、經修飾之mRNA或DNA/RNA雜交體。
實施例 A10. 如實施例 A9之核酸或核酸組合，其包含：(a)第一核酸，其編碼包含該VH之第一多肽；及(b)第二核酸，其編碼包含該VL之第二多肽。
實施例 A11.一種載體或載體組合，其包含如 實施例 A9 或 A10之核酸或核酸組合，視情況其中：(i)該載體包含一或多個與該核酸以可操作方式連接之啟動子；(ii)該載體為表現載體；及/或(iii)該載體包含質體、病毒載體(視情況為腺相關病毒、腺病毒、慢病毒或逆轉錄病毒)、基於脂質之載體、自我複製RNA載體、病毒樣粒子、基於聚合物之載體及/或奈米粒子，視情況為基於脂質之奈米粒子。
實施例 A12.如 實施例 A11之載體或載體組合，其編碼如 實施例 A1 至 A8中任一項抗Fzd4抗體或抗體片段且包含：(a)第一載體，其包含編碼包含該VH之第一多肽的第一核酸；及(b)第二載體，其包含編碼包含該VL之第二多肽的第二核酸。
實施例 A13.一種宿主細胞，其包含：(A)如 實施例 A1 至 A8中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段；(B)如 實施例 A9 或 A10之核酸或核酸組合；及/或(C)如 實施例 A11 或 A12之載體或載體組合，視情況其中該宿主細胞為：(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物，視情況為植物、細菌、真菌、酵母、原生動物或昆蟲，且視情況其中該宿主細胞為：(i)人類胚胎腎(HEK)細胞，視情況為HEK293細胞或其變體，進一步視情況為Expi293F™細胞；(ii) 中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；(iii)免疫細胞；或(iv)融合瘤。
實施例 A14.一種細胞群體，其包含兩種或更多種如 實施例 A13之宿主細胞。
實施例 A15.一種醫藥組合物，其包含：(I) (A)如 實施例 A1 至 A8中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段；(B)如 實施例 A9 或 A10之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 A11 或 A12之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 A13之宿主細胞或如 實施例 A14之細胞群體；及(II)醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
實施例 A16.一種治療需要此類治療之個體之方法，其包含向該個體投與有效量之：(A)如 實施例 A1 至 A8中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段；(B)如 實施例 A9 或 A10之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 A11 或 A12之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 A13之宿主細胞或如 實施例 A14之細胞群體；及/或(E)如 實施例 A15之醫藥組合物，視情況其中：(a)該個體為(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物；(b)該個體患有疾病、病症或病狀或具有患上疾病、病症或病狀之風險；及/或(c)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑。
實施例 A17.一種治療或預防需要此類治療之個體之疾病、病症或病狀之方法，該方法包含投與有效量之：(A)如 實施例 A1 至 A8中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段；(B) 實施例 A9 或 A10之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 A11 或 A12之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 A13之宿主細胞或如 實施例 A14之細胞群體；及/或(E)如 實施例 A15之醫藥組合物，視情況其中：(a)該個體為(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物；及/或(b)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑。
實施例 A18.一種製造如 實施例 A1 至 A8中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段之方法，其包含：(a)在允許表現該抗Fzd4抗體或抗體片段之條件下培養包含如 實施例 A9 或 A10之核酸或核酸組合的細胞，及(b)自來自(a)之細胞培養物收穫及純化該抗Fzd4抗體或抗體片段。
實施例 A19.一種製造如 實施例 A13之宿主細胞或此類細胞之群體之方法，其包含將如 實施例 A9 或 A10之核酸或核酸組合及/或如 實施例 A11 或 A12之載體或載體組合引入一或多個細胞中，視情況其中該引入在活體外、離體或活體內進行。
實施例 B1. 一種抗LRP5/6抗體或抗體片段，其包含：包含以下之VH： (i) CDRH1，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i-1) SEQ ID NO: 381-399中之任一者中所含之CDRH1胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；(i-2) SEQ ID NO: 321-323中之任一者之胺基酸序列；及/或(i-3) SEQ ID NO: 320之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況Q、N或S或不為A之任何胺基酸； (ii) CDRH2，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(ii-1) SEQ ID NO: 381-399中之任一者中所含之CDRH2胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；(ii-2) SEQ ID NO: 341之胺基酸序列；及/或(ii-3) SEQ ID NO: 340之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，及X 2為任何胺基酸，視情況其中該CDRH2不包含由SEQ ID NO: 340組成的胺基酸序列，其中X 1及X 2分別為K及M，分別為L及M，分別為I及M，分別為M及K，分別為M及L，或分別為M及I；及 (iii) CDRH3，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(iii-1) SEQ ID NO: 381-399中之任一者中所含之CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；(iii-2) SEQ ID NO: 361-369及300-303中之任一者之胺基酸序列；及/或(iii-3) SEQ ID NO: 360之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況D或E；X 2為任何胺基酸，視情況E、D或S；及X 3為任何胺基酸，視情況D、E、S、A、T或D，視情況其中該VH為奈米抗體、包含其或包含於其中。
實施例 B2. 如實施例 B1之抗LRP5/6抗體或抗體片段，其中該VH包含： (i) FRH1，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i-1) SEQ ID NO: 381-399中之任一者中所含之FRH1胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；(i-2) SEQ ID NO: 311或312之胺基酸序列；及/或(i-3) SEQ ID NO: 310之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況E或D；X 2為任何胺基酸，視情況A或T；及X 3為任何胺基酸，視情況S，視情況其中該FRH1不包含由SEQ ID NO: 310組成的胺基酸序列，其中X 1、X 2及X 3分別為E、A及A； (ii) FRH2，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(ii-1) SEQ ID NO: 381-399中之任一者中所含之FRH2胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；(ii-2) SEQ ID NO: 331-333中之任一者之胺基酸序列；及/或(ii-3) SEQ ID NO: 330之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況Y；X 2為任何胺基酸，視情況Q或G；X 3為任何胺基酸，視情況R；X 4為任何胺基酸，視情況L或W；X 5為任何胺基酸，視情況I；及X 6為任何胺基酸，視情況A，視情況其中該FRH2不包含由SEQ ID NO: 330組成的胺基酸序列，其中X 1、X 2、X 3、X 4、X 5及X 6分別為V、G、L、W、V及S； (iii) FRH3，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(iii-1) SEQ ID NO: 381-399中之任一者中所含之FRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；(iii-2) SEQ ID NO: 351或352之胺基酸序列；及/或(iii-3) SEQ ID NO: 350之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況D或G；X 2為任何胺基酸，視情況L；X 3為任何胺基酸，視情況M；X 4為任何胺基酸，視情況T；X 5為任何胺基酸，視情況D或E；X 6為任何胺基酸，視情況N或S；X 7為任何胺基酸，視情況S或A；X 8為任何胺基酸，視情況M；X 9為任何胺基酸，視情況R或K；及X 10為任何胺基酸，視情況A或P，視情況其中該FRH3不包含由SEQ ID NO: 350組成的胺基酸序列，其中X 1、X 2、X 3、X 4、X 5、X 6、X 7、X 8、X 9及X 10分別為D、V、I、R、D、N、S、L、R及E，及/或 (iv) FRH4，其包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i-1) SEQ ID NO: 381-399中之任一者中所含之FRH4胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；(i-2) SEQ ID NO: 371或372之胺基酸序列；及/或(i-3) SEQ ID NO: 370之胺基酸序列，其中X 1為任何胺基酸，視情況R或W；及X 2為任何胺基酸，視情況Q或L。
實施例 B3. 如實施例 B1 或 B2之抗LRP5/6抗體或抗體片段，其中在該VH中： (I) (I-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 381中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 321、341及361之胺基酸序列；及(I-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 381之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (II) (II-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 382-385中之任一者中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 322、341及362之胺基酸序列；及(II-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 382-385中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (III) (III-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 386中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 321、341及362之胺基酸序列；及(III-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 386之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (IV) (IV-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 387中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 323、341及362之胺基酸序列；及(IV-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 387之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (V) (V-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 388中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 322、341及361之胺基酸序列；及(V-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 388之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (VI) (VI-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 389中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 322、341及300之胺基酸序列；及(VI-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 389之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (VII) (VII-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 390中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 322、341及301之胺基酸序列；及(VII-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 390之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (VIII) (VIII-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 391中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 322、341及302之胺基酸序列；及(VIII-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 391之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (IX) (IX-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 392中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 322、341及303之胺基酸序列；及(IX-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 392之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (X) (X-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 393中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 321、341及363之胺基酸序列；及(X-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 393之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (XI) (XI-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 394中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 321、341及364之胺基酸序列；及(XI-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 394之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (XII) (XII-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 395中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 321、341及365之胺基酸序列；及(XII-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 395之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (XIII) (XIII-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 396中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 321、341及366之胺基酸序列；及(XIII-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 396之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (XIV) (XIV-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 397中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 321、341及367之胺基酸序列；及(XIV-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 397之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列； (XV) (XV-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 398中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 321、341及368之胺基酸序列；及(XV-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 398之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列；或 (XVI) (XVI-1)該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3包含含有以下或由以下組成之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 399中分別所含之CDRH1胺基酸序列、CDRH2胺基酸序列及CDRH3胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；及/或(ii) SEQ ID NO: 321、341及369之胺基酸序列；及(XVI-2)視情況該VH包含與SEQ ID NO: 399之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之胺基酸序列。
實施例 B4. 如實施例 B1 至 B3中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段，其中該VH包含含有SEQ ID NO: 381-399中之任一者之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
實施例 B5. 如實施例 B1 至 B4中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段，其中該VH包含含有SEQ ID NO: 381之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
實施例 B6. 如實施例 B1 至 B5中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段，其： (i)為奈米抗體或Fd片段、包含其或包含於其中； (ii)包含於多特異性抗體或抗體片段(視情況包含如 圖 24 至圖 35中之任一者，進一步視情況 圖 24中所描繪之結構)中，該多特異性抗體或抗體片段包含：(ii-1)對第一抗原具有特異性之第一抗原結合區，視情況其中該第一抗原為Fzd4；及包含該VH之第二抗原結合區。 (iii)進一步包含VL且為以下，包含以下或包含於以下中：包含該VH及該VL之Fab、Fab'片段、F(ab')2、scFab、Fv、scFv、雙功能抗體或三功能抗體。
實施例 B7. 如實施例 B1 至 B6中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段，其包含以下中之一或多者： (a)免疫球蛋白重鏈恆定域1 (CH1)或其變體，視情況其中該CH1或其變體：(a-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(a-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 21或22之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (b)免疫球蛋白鉸鏈或其變體，視情況其中該鉸鏈或其變體：(b-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(b-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (c)免疫球蛋白重鏈恆定域2 (CH2)或其變體，視情況其中該CH2或其變體：(c-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(c-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 41-46中之任一者之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (d)免疫球蛋白重鏈恆定域3 (CH3)或其變體，視情況其中該CH3或其變體：(d-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(d-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 51-54、61-64及66-69中之任一者之胺基酸序列(視情況不包括C端K)或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致；及/或 (e)免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)或其變體，視情況其中該CL或其變體：(e-1)屬於κ輕鏈恆定域(CLκ)，視情況為人類CLκ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性；或(e-2)屬於λ輕鏈恆定域(CLλ)，視情況為人類CLλ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況其中該抗LRP5/6抗體或抗體片段分別包含SEQ ID NO: 42及51，分別包含SEQ ID NO: 43及51，分別包含SEQ ID NO: 45及61，分別包含SEQ ID NO: 45及66，分別包含SEQ ID NO: 46及61或分別包含SEQ ID NO: 46及66之CH2及CH3序列。
實施例 B8. 如實施例 B1 至 B7中任一項抗LRP5/6抗體或抗體片段，其包含片段可結晶(Fc)區，視情況其中該Fc區： (I)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類，或其變體； (II)屬於：(i) IgG1或其變體，視情況其包含以下胺基酸取代中之一或多者：N297A、N297Q、D265A、L234A、L235A、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、缺失G236、P238A、A327Q、A327G、P329A、P329G、K322A、L234F、L235E、P331S、T394D、A330L、P331S、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、S239D、I332E、S298A、E333A、K334A、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、K326D、A330M、K334E、G236A、K326W、S239D、E333S、S267E、H268F、S324T、E345R、E430G、S440Y M428L、N434S、H310A、L328F、M252Y、I253A、S254T、T256E、H435Q、H435A及/或其任何組合，根據EU編號；(ii) IgG2或其變體，視情況其包含以下胺基酸取代中之一或多者：P238S、V234A、G237A、H268A、H268Q、H268E、V309L、N297A、N297Q、A330S、P331S、C232S、C233S、M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合，根據EU編號；(iii) IgG3或其變體，視情況包含胺基酸取代E235Y，根據EU編號；或(iv) IgG4或其變體，視情況包含以下胺基酸取代中之一或多者：E233P、F234V、L235A、G237A、E318A、S228P、L236E、S241P、L248E、T394D、M252Y、S254T、T256E、N297A、N297Q及/或其任何組合，根據EU編號； (III)包含一或多個降低Fc效應功能之胺基酸取代，視情況其中該一或多個胺基酸取代位於選自由以下組成之群之位置處：位置234、235、236、237、265、297及329，根據EU編號； (IV)至少包含以下胺基酸取代，根據EU編號：(ii-1) L234A、L235A及P329G；(ii-2) L234A及L235A；(ii-3) I253A、H310A及H435Q；(ii-4) I253A、H310A及H435A；(ii-5) D265A及P329A；(ii-6) M252Y、S254T及T256E；及/或(ii-7) M428L及N434S，視情況相對於人類IgG1 Fc區及/或相對於SEQ ID NO: 71-74中之任一者(視情況不包括C端K)；及/或 (V)包含如下胺基酸序列：包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 71-74、81-84、86-89、91-94、96-99、471-474、476-479、481-484及486-489中之任一者(視情況不包括C端K)之胺基酸序列，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。
實施例 B9. 一種核酸或核酸組合，其編碼如 實施例 B1 至 B8中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段，視情況其中該核酸為DNA、cDNA、RNA、mRNA、經修飾之mRNA或DNA/RNA雜交體。
實施例 B10. 如實施例 B9之核酸或核酸組合，其包含：(a)第一核酸，其編碼包含該VH之第一多肽；及(b)第二核酸，其編碼包含該VL之第二多肽。
實施例 B11.一種載體或載體組合，其包含如 實施例 B9 或 B10之核酸或核酸組合，視情況其中：(i)該載體包含一或多個與該核酸以可操作方式連接之啟動子；(ii)該載體為表現載體；及/或(iii)該載體包含質體、病毒載體(視情況腺相關病毒、腺病毒、慢病毒或逆轉錄病毒)、基於脂質之載體、自我複製RNA載體、病毒樣粒子、基於聚合物之載體及/或奈米粒子，視情況基於脂質之奈米粒子。
實施例 B12.如 實施例 B11之載體或載體組合，其編碼如 實施例 B1 至 B8中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段且包含：(a)第一載體，其包含編碼包含該VH之第一多肽的第一核酸；及(b)第二載體，其包含編碼包含該VL之第二多肽的第二核酸。
實施例 B13.一種宿主細胞，其包含：(A)如 實施例 B1 至 B8中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段；(B)如 實施例 B9 或 B10之核酸或核酸組合；及/或(C)如 實施例 B11 或 B12之載體或載體組合，視情況其中該宿主細胞為：(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物，視情況為植物、細菌、真菌、酵母、原生動物或昆蟲，且視情況其中該宿主細胞為：(i)人類胚胎腎(HEK)細胞，視情況為HEK293細胞或其變體，進一步視情況為Expi293F™細胞；(ii)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；(iii)免疫細胞；或(iv)融合瘤。
實施例 B14.一種細胞群體，其包含兩種或更多種如 實施例 B13之宿主細胞。
實施例 B15.一種醫藥組合物，其包含：(I) (A)如 實施例 B1 至 B8中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段；(B)如 實施例 B9 或 B10之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 B11 或 B12之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 B13之宿主細胞或如 實施例 B14之細胞群體；及(II)醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
實施例 B16.一種治療需要此類治療之個體之方法，其包含向該個體投與有效量之：(A)如 實施例 B1 至 B8中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段；(B)如 實施例 B9 或 B10之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 B11 或 B12之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 B13之宿主細胞或如 實施例 B14之細胞群體；及/或(E)如 實施例 B15之醫藥組合物，視情況其中：(a)該個體為(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物；(b)該個體患有疾病、病症或病狀或具有患上疾病、病症或病狀之風險；及/或(c)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑。
實施例 B17.一種治療或預防需要此類治療之個體之疾病、病症或病狀之方法，該方法包含投與有效量之：(A)如 實施例 B1 至 B8中任一項抗LRP5/6抗體或抗體片段；(B)如 實施例 B9 或 B10之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 B11 或 B12之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 B13之宿主細胞或如 實施例 B14之細胞群體；及/或(E)如 實施例 B15之醫藥組合物，視情況其中：(a)該個體為(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物；及/或(b)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑。
實施例 B18.一種製造如 實施例 B1 至 B8中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段之方法，其包含：(a)在允許表現該抗LRP5/6抗體或抗體片段之條件下培養包含如 實施例 B9 或 B10之核酸或核酸組合的細胞，及(b)自來自(a)之細胞培養物收穫及純化該抗LRP5/6抗體或抗體片段。
實施例 B19.一種製造如 實施例 B13之宿主細胞或此類細胞之群體之方法，其包含將如 實施例 B9 或 B10之核酸或核酸組合及/或如 實施例 B11 或 B12之載體或載體組合引入一或多個細胞中，視情況其中該引入在活體外、離體或活體內進行。
實施例 C1. 一種多特異性抗體或抗體片段，其至少包含：(A)第一抗原結合區，其與Fzd4特異性結合且包含第一重鏈可變域(VH1)及第一輕鏈可變域(VL1)；(B)第二抗原結合區，其與LRP5及/或LRP6特異性結合且至少包含第二重鏈可變域(VH2)，其中：(A)該VH1及該VL1係根據如 實施例 A1 至 A8中任一項之抗Fzd4抗體或抗體片段中之任一者的VH及VL；及/或(B)該VH2係根據如 實施例 B1 至 B8中任一項之抗LRP5/6抗體或抗體片段中之任一者的VH。
實施例 C2. 如實施例 C1之多特異性抗體或抗體片段，其中：(A)該第一抗原結合區為抗原結合片段(Fab)、Fab'片段、F(ab') 2、單鏈Fab (scFab)、可變片段(Fv)、單鏈Fv (scFv)、雙功能抗體或三功能抗體，包含其或包含於其；及/或(B)該第二抗原結合區：(i)為奈米抗體或Fd片段，包含其或包含於其；或(ii)進一步包含第二輕鏈可變域(VL2)，且為Fab、Fab'片段、F(ab') 2、scFab、Fv、scFv、雙功能抗體或三功能抗體，包含其或包含於其。
實施例 C3. 如實施例 C1 或 C2之多特異性抗體或抗體片段，其包含以下中之一或多者： (a)免疫球蛋白重鏈恆定域1 (CH1)或其變體，視情況其中該CH1或其變體：(a-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(a-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 21或22之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (b)免疫球蛋白鉸鏈或其變體，視情況其中該鉸鏈或其變體：(b-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(b-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (c)免疫球蛋白重鏈恆定域2 (CH2)或其變體，視情況其中該CH2或其變體：(c-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(c-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 41-46中之任一者之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (d)免疫球蛋白重鏈恆定域3 (CH3)或其變體，視情況其中該CH3或其變體：(d-1)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類；及/或(d-2)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 51-54、61-64及66-69中之任一者之胺基酸序列(視情況不包括C端K)或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致；及/或 (e)免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)或其變體，視情況其中該CL或其變體：(e-1)屬於κ輕鏈恆定域(CLκ)，視情況為人類CLκ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性；或(e-2)屬於λ輕鏈恆定域(CLλ)，視情況為人類CLλ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，視情況其中該多特異性抗體或抗體片段分別包含SEQ ID NO: 42及51，分別包含SEQ ID NO: 43及51，分別包含SEQ ID NO: 45及61，分別包含SEQ ID NO: 45及66，分別包含SEQ ID NO: 46及61或分別包含SEQ ID NO: 46及66之CH2及CH3序列。
實施例 C4. 如實施例 C1 至 C3中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其包含Fc區，視情況其中該Fc區： (I)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類，或其變體； (II)屬於：(i) IgG1或其變體，視情況其包含以下胺基酸取代中之一或多者：N297A、N297Q、D265A、L234A、L235A、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、缺失G236、P238A、A327Q、A327G、P329A、P329G、K322A、L234F、L235E、P331S、T394D、A330L、P331S、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、S239D、I332E、S298A、E333A、K334A、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、K326D、A330M、K334E、G236A、K326W、S239D、E333S、S267E、H268F、S324T、E345R、E430G、S440Y M428L、N434S、H310A、L328F、M252Y、I253A、S254T、T256E、H435Q、H435A及/或其任何組合，根據EU編號；(ii) IgG2或其變體，視情況其包含以下胺基酸取代中之一或多者：P238S、V234A、G237A、H268A、H268Q、H268E、V309L、N297A、N297Q、A330S、P331S、C232S、C233S、M252Y、S254T、T256E及/或其任何組合，根據EU編號；(iii) IgG3或其變體，視情況包含胺基酸取代E235Y，根據EU編號；或(iv) IgG4或其變體，視情況包含以下胺基酸取代中之一或多者：E233P、F234V、L235A、G237A、E318A、S228P、L236E、S241P、L248E、T394D、M252Y、S254T、T256E、N297A、N297Q及/或其任何組合，根據EU編號； (III)包含一或多個降低Fc效應功能之胺基酸取代，視情況其中該一或多個胺基酸取代位於選自由以下組成之群之位置處：位置234、235、236、237、265、297及329，根據EU編號； (IV)至少包含以下胺基酸取代，根據EU編號：(ii-1) L234A、L235A及P329G；(ii-2) L234A及L235A；(ii-3) I253A、H310A及H435Q；(ii-4) I253A、H310A及H435A；(ii-5) D265A及P329A；(ii-6) M252Y、S254T及T256E；及/或(ii-7) M428L及N434S，視情況相對於人類IgG1 Fc區及/或相對於SEQ ID NO: 71-74中之任一者(視情況不包括C端K)；及/或 (V)包含如下胺基酸序列：包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 71-74、81-84、86-89、91-94、96-99、471-474、476-479、481-484及486-489中之任一者(視情況不包括C端K)之胺基酸序列，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。
實施例 C5. 如實施例 C1 至 C4中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其包含如 圖 24 至圖 35中之任一者中所描繪的結構，視情況 圖 24中描繪之結構中之任一者。
實施例 C6. 如實施例 C1 至 C5中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其包含：(a)第一多肽，其包含該VH1；及(b)第二多肽，其包含該VH2及該VL1，其中該第一及該第二多肽視情況經由一或多個二硫鍵彼此相互作用，從而允許該VH1及該VL1形成該第一抗原結合區，視情況其中： (a)該第一多肽以N端至C端之次序包含以下： (a-1)該VH1；及 (a-2) CH1或其變體，視情況其中該CH1或其變體：(i)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類IgG1或IgG4；及/或(ii)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 21或22之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (a-3)免疫球蛋白鉸鏈或其變體，視情況其中該鉸鏈或其變體：(i)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類IgG1或IgG4；及/或(ii)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致； (a-4) CH2或其變體，視情況其中該CH2或其變體：(i)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類IgG1或IgG4；及/或(ii)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 41-46中之任一者之胺基酸序列或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致；及 (a-5) CH3或其變體，視情況其中該CH3或其變體：(i)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類IgG1或IgG4；及/或(ii)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 51-54、61-64及66-69中之任一者之胺基酸序列(視情況不包括C端K)或由其組成，或與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致；及/或 (b)該第二多肽以N端至C端之次序包含以下： (b-1)該VH2； (b-2)視情況連接子，其視情況為肽連接子，進一步視情況可撓性連接子，視情況其中該連接子：(i)包含一或多個胺基酸，視情況一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二個胺基酸；(ii)由小胺基酸組成，該等小胺基酸由G、S及/或A組成；(iii)包含含有選自由以下組成之群之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、G、GG、GGG、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GSS、SGS及SSG；及/或(iv)包含含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之多個重複序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、G、GG、GGG、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GSS、SGS及SSG； (b-3)該VL1；及(b-4) CL或其變體，視情況其中該CL或其變體：(i)屬於CLκ，視情況為人類CLκ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性；或(ii)屬於CLλ，視情況為人類CLλ，且視情況包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性，進一步視情況其中該多特異性抗體或抗體片段包含：視情況經由一或多個二硫鍵彼此形成二聚體之該等第一多肽中之兩者；及該等第二多肽中之兩者，其中該等第二多肽中之一者視情況經由二硫鍵與該等第一多肽中之一者相互作用，且該等第二多肽中之另一者視情況經由二硫鍵與該等第一多肽中之另一者相互作用。
實施例 C7. 如實施例 C1 至 C6中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其包含Fc區，其中該Fc區： (I)屬於IgG，視情況屬於IgG1或IgG4，進一步視情況屬於人類，或其變體； (II)至少包含以下胺基酸取代，根據EU編號：(ii-1) L234A、L235A及P329G；(ii-2) L234A及L235A；(ii-3) I253A、H310A及H435Q；及/或(ii-4) I253A、H310A及H435A，視情況相對於人類IgG1 Fc區及/或SEQ ID NO: 71-74中之任一者(視情況不包括C端K)；及/或 (III)包含如下胺基酸序列：包含SEQ ID NO: 71-74、81-84、86-89、91-94、96-99、471-474、476-479、481-484及486-489中之任一者之胺基酸序列(視情況不包括C端K)或由其組成，或包含與其至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。
實施例 C8. 如實施例 C1 至 C7中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其包含：(a)第一多肽，其包含含有SEQ ID NO: 2、7、8、9、450、451、452及453之胺基酸序列(視情況不具有C端K)或由其組成的胺基酸序列；及(b)第二多肽，其包含含有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
實施例 C9. 如實施例 C8之多特異性抗體或抗體片段，其包含：經由一或多個二硫鍵彼此形成二聚體之該等第一多肽中的兩者；及該等第二多肽中的兩者，其中該等第二多肽中之一者經由二硫鍵與該等第一多肽中之一者相互作用，且該等第二多肽中之另一者經由二硫鍵與該等第一多肽中之另一者相互作用。
實施例 C10. 一種編碼如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段之核酸或核酸組合，視情況其中該核酸為DNA、cDNA、RNA、mRNA、經修飾之mRNA或DNA/RNA雜交體。
實施例 C11. 如實施例 C10之核酸或核酸組合，其包含：(a)第一核酸，其編碼包含該VH1之第一多肽；及(b)第二核酸，其編碼包含該VH2及該VL1之第二多肽。
實施例 C12.一種載體或載體組合，其包含如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合，視情況其中：(i)該載體包含一或多個與該核酸以可操作方式連接之啟動子；(ii)該載體為表現載體；及/或(iii)該載體包含質體、病毒載體(視情況腺相關病毒、腺病毒、慢病毒或逆轉錄病毒)、基於脂質之載體、自我複製RNA載體、病毒樣粒子、基於聚合物之載體及/或奈米粒子，視情況基於脂質之奈米粒子。
實施例 C13.如 實施例 C12之載體或載體組合，其編碼如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段且包含：(a)第一載體，其包含編碼包含該VH1之第一多肽的第一核酸；及(b)第二載體，其包含編碼包含該VH2及該VL1之第二多肽的第二核酸。
實施例 C14.一種宿主細胞，其包含：(A)如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段；(B)如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合；及/或(C)如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合，視情況其中該宿主細胞為：(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物，視情況為植物、細菌、真菌、酵母、原生動物或昆蟲，且視情況其中該宿主細胞為：(i)人類胚胎腎(HEK)細胞，視情況為HEK293細胞或其變體，進一步視情況為Expi293F™細胞；(ii)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；(iii)免疫細胞；或(iv)融合瘤。
實施例 C15.一種細胞群體，其包含兩種或更多種如 實施例 B13之宿主細胞。
實施例 C16.一種醫藥組合物，其包含：(I) (A)如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段；(B)如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 C14之宿主細胞或如 實施例 C15之細胞群體；及(II)醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
實施例 C17.一種治療需要此類治療之個體之方法，其包含向該個體投與有效量之：(A)如 實施例 C1 至 C9中任一項多特異性抗體或抗體片段；(B)如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 C14之宿主細胞或如 實施例 C15之細胞群體；及/或(E)如 實施例 C16之醫藥組合物，視情況其中：(a)該個體為(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物；(b)該個體患有疾病、病症或病狀或具有患上疾病、病症或病狀之風險；及/或(c)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑。
實施例 C18.一種治療或預防需要此類治療之個體之疾病、病症或病狀之方法，該方法包含投與有效量之：(A)如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段；(B)如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 C14之宿主細胞或如 實施例 C15之細胞群體；及/或(E)如 實施例 C16之醫藥組合物，視情況其中：(a)該個體為(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物；及/或(b)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑。
實施例 C19.一種誘導、促進、刺激、增強及/或支持個體之目標細胞中之Wnt傳訊之方法，其包含向該個體投與有效量之：(A)如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段；(B)如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 C14之宿主細胞或如 實施例 C15之細胞群體；及/或(E)如 實施例 C16之醫藥組合物，視情況其中：(a)該個體為(i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或(ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物；(b)該個體患有疾病、病症或病狀或具有患上疾病、病症或病狀之風險；及/或(c)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑，且視情況其中：(i)該Wnt傳訊為或包含Wnt/β-連環蛋白傳訊；及/或(ii)該方法促進、刺激、增強及/或支持募集多種各自包含(ii-1) Fzd4及(ii-2) LRP5或LRP6之受體複合物。
實施例 C20.如 實施例 C17 至 C19中任一項之方法，其中該疾病、病症或病狀包含以下中之一或多者： (a)視網膜病變，視情況為視網膜血管疾病(視情況由血管發育抑制或過量血管生成引起)及/或視情況選自由以下組成之群：滲出性玻璃體視網膜病變、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、早產兒視網膜病變、諾里氏病、糖尿病性視網膜病變(DR)、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性黃斑缺血、老年性黃斑變性(AMD) (包括濕性AMD及乾性AMD)、早產兒視網膜病變(ROP)、骨質疏鬆假膠質瘤症候群(OPPG)、視網膜靜脈阻塞及科阿氏病； (b)血管病症，視情況血管畸形或血管功能不全，進一步視情況與缺血誘發之新血管生成相關； (c)骨骼疾病或骨骼損傷，視情況選自由以下組成之群：骨質疏鬆(包括骨質疏鬆假膠質瘤(OPPG)症候群及幼年型原發性骨質疏鬆)、骨礦物質密度變化及癌症相關骨質溶解； (d)肌肉萎縮疾病，視情況選自由以下組成之群：肌肉減少症、惡病質及肌肉失養症；及/或 (e)神經或神經退行性疾病，視情況選自由以下組成之群：中風、創傷性腦損傷、癲癇症、阿茲海默氏症、巴金森氏症、杭丁頓氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、弗里德賴希運動失調、路易體疾病、脊髓性肌肉萎縮症、運動神經元疾病、多發性硬化、巴登氏病及庫賈氏病。
實施例 C21.如 實施例 C17 至 C20中任一項之方法，其中： (I)該投與為：(i)向該個體的一或多隻眼睛，視情況玻璃體內或經由眼部滴劑；(ii)局部投與，視情況向眼睛、耳、鼻(視情況鼻內)、皮膚(視情況透皮或經上表皮)、黏膜、皮膚或陰道，或藉由吸入；或(iii)非經腸投與，視情況藉由注射(視情況靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、鞘內、動脈內、關節內、骨內或腹膜內投與)或藉由吸入；或(iv)經腸投與，視情況經口、舌下、經頰或經直腸；及/或 (II)該投與包含以如下向該個體的一或多隻眼睛投與如技術方案1至20中任一項之多特異性抗體或抗體片段：每隻眼約0.1-100000 ng、每隻眼約1-100000 ng、每隻眼約1-10000 ng、每隻眼約10-10000 ng、每隻眼約1-100 ng、每隻眼約200-300 ng、每隻眼約300-400 ng、每隻眼約400-500 ng、每隻眼約500-600 ng、每隻眼約600-700 ng、每隻眼約700-800 ng、每隻眼約800-900 ng、每隻眼約900-1000 ng、每隻眼約1000-2000 ng、每隻眼約2000-3000 ng、每隻眼約3000-4000 ng、每隻眼約4000-5000 ng、每隻眼約5000-6000 ng、每隻眼約6000-7000 ng、每隻眼約7000-8000 ng、每隻眼約8000-9000 ng、每隻眼約9000-10000 ng、每隻眼約10000-20000 ng、每隻眼約20000-30000 ng、每隻眼約30000-40000 ng、每隻眼約40000-50000 ng、每隻眼約50000-60000 ng、每隻眼約60000-70000 ng、每隻眼約70000-80000 ng、每隻眼約80000-90000 ng或每隻眼約90000-100000 ng。
實施例 C22.一種誘導、促進、刺激、增強及/或支持目標細胞中之Wnt傳訊之方法，其包含使該目標細胞與有效量之以下各者接觸：(A)如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段；(B) 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合；(C)如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合；及/或(D)如 實施例 C14之宿主細胞或如 實施例 C15之細胞群體；及/或(E)如 實施例 C16之醫藥組合物，視情況其中：(I)該接觸係在活體外、離體或活體內進行，(II)該方法係用於(i)製備細胞及/或組織用於植入，(ii)幹細胞之分化，及/或(iii)製備類器官，(III)該方法係用於骨形成、血管形成及/或神經形成及/或分化。
實施例 C23.一種製造如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段之方法，其包含：(a)在允許表現該多特異性抗體或抗體片段之條件下培養包含如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合的細胞，及(b)自來自(a)之細胞培養物收穫及純化該多特異性抗體或抗體片段。
實施例 C24.一種製造如 實施例 C14之宿主細胞或此類細胞之群體之方法，其包含將如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合及/或如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合引入一或多個細胞中，視情況其中該引入在活體外、離體或活體內進行。
實施例 C25.如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段；如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合；如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合；如 實施例 C14之宿主細胞或如 實施例 C15之細胞群體；及/或如 實施例 C16之醫藥組合物，其用於醫療。
實施例 C26.如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段；如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合；如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合；如 實施例 C14之宿主細胞或如 實施例 C15之細胞群體；及/或如 實施例 C16之醫藥組合物，其用於治療疾病、病症或病狀，視情況其中該疾病、病症或病狀包含 實施例 C20中敍述之彼等者中之一或多者。
實施例 C27.一種如 實施例 C1 至 C9中任一項之多特異性抗體或抗體片段；如 實施例 C10 或 C11之核酸或核酸組合；如 實施例 C12 或 C13之載體或載體組合；如 實施例 C14之宿主細胞或如 實施例 C15之細胞群體；及/或如 實施例 C16之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療疾病、病症或病狀的藥劑，視情況其中該疾病、病症或病狀包含 實施例 C20中敍述之彼等者中之一或多者。 附錄 附錄表 A ： 由 Kabat 定義之抗 Fzd4 VH CDR 及 FR 序列
SEQ ID NO: 名稱 序列 註釋
110 抗Fzd4 FRH1共同序列 EVQLVESGGGLV X 1 PGGSLRLSCAASGFTFT X 1為任何胺基酸。
111 抗Fzd4 FRH1 EVQLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASGFTFT   
112 抗Fzd4 FRH1 EVQLVESGGGLV KPGGSLRLSCAASGFTFT   
120 抗Fzd4 CDRH1共同序列 X 1 YAMS X 1為任何胺基酸。
121 抗Fzd4 CDRH1 SYAMS   
122 抗Fzd4 CDRH1 NYAMS   
123 抗Fzd4 CDRH1 AYAMS   
124 抗Fzd4 CDRH1 QYAMS   
130 抗Fzd4 FRH2共同序列 WVRQAPGKGLEWVS   
131 抗Fzd4 FRH2 WVRQAPGKGLEWVS   
140 抗Fzd4 CDRH2共同序列 AISGSGGSTYYA X 1 SVKG X 1為任何胺基酸。
141 抗Fzd4 CDRH2 AISGSGGSTYYA ESVKG   
142 抗Fzd4 CDRH2 AISGSGGSTYYA DSVKG   
143 抗Fzd4 CDRH2 AISGSGGSTYYA ASVKG   
144 抗Fzd4 CDRH2 AISGSGGSTYYA SSVKG   
150 抗Fzd4 FRH3共同序列 RFTISRD X 1 SKNTLYLQMNSL X 2X 3 EDTAVYYCAR X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；及X 3為任何胺基酸。
151 抗Fzd4 FRH3 RFTISRD NSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAR   
152 抗Fzd4 FRH3 RFTISRD DSKNTLYLQMNSL KTEDTAVYYCAR   
160 抗Fzd4 CDRH3共同序列 ATGFGTVVF X 1 Y X 1為任何胺基酸。
161 抗Fzd4 CDRH3 ATGFGTVVF DY   
170 抗Fzd4 FRH4共同序列 WGQGTLVTVSS   
171 抗Fzd4 FRH4 WGQGTLVTVSS   
附錄表 B ：抗 Fzd4 VH 序列
SEQ ID NO: 名稱 序列 註釋
180 抗Fzd4 VH共同序列 EVQLVESGGGLVX 1PGGSLRLSCAASGFTFTX 2YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAX 3SVKGRFTISRDX 4SKNTLYLQMNSLX 5X 6EDTAVYYCARATGFGTVVFX 7YWGQGTLVTVSS X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；及X 7為任何胺基酸。
181 抗Fzd4 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSS   
182 抗Fzd4 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSS   
183 抗Fzd4 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTQYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSS   
184 抗Fzd4 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSS   
185 抗Fzd4 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTAYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSS   
186 抗Fzd4 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYASSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSS   
187 抗Fzd4 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSS   
188 抗Fzd4 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSS   
附錄表 C ：抗 Fzd4 VL 及 VL CDR 以及 FR 序列
SEQ ID NO: 名稱 序列
211 抗Fzd4 FRL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
221 抗Fzd4 CDRL1 RASQSISSYLN
231 抗Fzd4 FRL2 WYQQKPGKAPKLLIY
241 抗Fzd4 CDRL2 AASSLQS
251 抗Fzd4 FRL3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
261 抗Fzd4 CDRL3 QQSYSTPLT
271 抗Fzd4 FRL4 FGGGTKVEIK
281 抗Fzd4 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
附錄表 D ：抗 LRP5/6 VH CDR 及 FR 序列
SEQ ID NO: 名稱 序列 註釋
310 抗LRP5/6 FRH1共同序列 X 1 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSC X 2X 3 S X 1為任何胺基酸；X2為任何胺基酸；及X3為任何胺基酸。
311 抗LRP5/6 FRH1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC ASS   
312 抗LRP5/6 FRH1 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTSS   
320 抗LRP5/6 CDRH1共同序列 ANI X 1 SIET X 1為任何胺基酸。
321 抗LRP5/6 CDRH1 ANI QSIET   
322 抗LRP5/6 CDRH1 ANI NSIET   
323 抗LRP5/6 CDRH1 ANI SSIET   
330 抗LRP5/6 FRH2共同序列 LGW X 1 RQAPGK X 2X 3 E X 4X 5X 6 X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；及X 6為任何胺基酸。
331 抗LRP5/6 FRH2 LGW YRQAPGK QRE LIA   
332 抗LRP5/6 FRH2 LGW YRQAPGK GRE WIA   
333 抗LRP5/6 FRH2 LGW YRQAPGK QRE WIA   
340 抗LRP5/6 CDRH2共同序列 N X 1 RGGGY X 2 X 1為任何胺基酸；及X 2為任何胺基酸。
341 抗LRP5/6 CDRH2 N MRGGGY M   
350 抗LRP5/6 FRH3共同序列 KYA X 1 S X 2 KGRFT X 3 S X 4X 5X 6X 7 KNT X 8 YLQMNSL X 9X 10 EDTAVYYC X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；X 7為任何胺基酸；X 8為任何胺基酸；X 9為任何胺基酸；及X 10為任何胺基酸。
351 抗LRP5/6 FRH3 KYA DS LKGRFT MS TDNSKNT MYLQMNSL RAEDTAVYYC   
352 抗LRP5/6 FRH3 KYA GS LKGRFT MS TESAKNT MYLQMNSL KPEDTAVYYC   
360 抗LRP5/6 CDRH3共同序列 YVKLR X 1X 2X 3 YVY X 1為任何胺基酸；X2為任何胺基酸；及X3為任何胺基酸。
361 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR DEDYVY   
362 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR DDDYVY   
363 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR DEEYVY   
364 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR DESYVY   
365 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR DEAYVY   
366 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR DETYVY   
367 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR ESEYVY   
368 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR ESTYVY   
369 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR ESSYVY   
300 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR EDEYVY   
301 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR ESDYVY   
302 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR SDEYVY   
303 抗LRP5/6 CDRH3 YVKLR SSDYVY   
370 抗LRP5/6 FRH4共同序列 X 1 GQGT X 2 VTVSS X 1為任何胺基酸；及X2為任何胺基酸。
371 抗LRP5/6 FRH4 RGQGT QVTVSS   
372 抗LRP5/6 FRH4 WGQGT LVTVSS   
附錄表 E ：抗 LRP5/6 VH 序列
SEQ ID NO: 名稱 序列 註釋
380 抗LRP5/6 VH共同序列 X 1VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCX 2X 3SANIX 4SIETLGWX 5RQAPGKX 6X 7EX 8X 9X 10NX 11RGGGYX 12KYAX 13SX 14KGRFTX 15SX 16X 17X 18X 19KNTX 20YLQMNSLX 21X 22EDTAVYYCYVKLRX 23X 24X 25YVYX 26GQGTX 27VTVSS X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；及X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；X 7為任何胺基酸；X 8為任何胺基酸；X 9為任何胺基酸；及X 10為任何胺基酸；X 11為任何胺基酸；X 12為任何胺基酸；X 13為任何胺基酸；X 14為任何胺基酸；X 15為任何胺基酸；X 16為任何胺基酸；X 17為任何胺基酸；X 18為任何胺基酸；X 19為任何胺基酸；X 20為任何胺基酸；X 21為任何胺基酸；X 22為任何胺基酸；X 23為任何胺基酸；X 24為任何胺基酸；X 25為任何胺基酸；X 26為任何胺基酸；及X 27為任何胺基酸。
381 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDEDYVYRGQGTQVTVSS   
382 抗LRP5/6 VH DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTSSANINSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYAGSLKGRFTMSTESAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCYVKLRDDDYVYRGQGTQVTVSS   
383 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANINSIETLGWYRQAPGKGREWIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDDDYVYWGQGTLVTVSS   
384 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANINSIETLGWYRQAPGKQREWIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDDDYVYWGQGTLVTVSS   
385 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANINSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDDDYVYRGQGTQVTVSS   
386 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDDDYVYRGQGTQVTVSS   
387 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANISSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDDDYVYRGQGTQVTVSS   
388 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANINSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDEDYVYRGQGTQVTVSS   
389 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANINSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLREDEYVYRGQGTQVTVSS   
390 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANINSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRESDYVYRGQGTQVTVSS   
391 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANINSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRSDEYVYRGQGTQVTVSS   
392 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANINSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRSSDYVYRGQGTQVTVSS   
393 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDEEYVYRGQGTQVTVSS   
394 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDESYVYRGQGTQVTVSS   
395 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDEAYVYRGQGTQVTVSS   
396 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDETYVYRGQGTQVTVSS   
397 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRESEYVYRGQGTQVTVSS   
398 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRESTYVYRGQGTQVTVSS   
399 抗LRP5/6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRESSYVYRGQGTQVTVSS   
附錄表 F ： 連接子單元 序列
SEQ ID NO: 名稱 序列
101 連接子單元1 GGGGS
102 連接子單元2 GGSGS
103 連接子單元3 GSGSG
104 連接子單元4 GGGS
105 連接子單元5 GGGGGS
附錄表 G ：恆定域 序列
SEQ ID NO: 名稱 序列
11 人類IgG CK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
12 人類IgG CL GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
21 人類IgG1 CH1，參考1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
22 人類IgG1 CH1，參考2 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
31 人類IgG1鉸鏈，參考 EPKSCDKTHTCPPCP
41 人類IgG1 CH2，參考 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
42 人類IgG1 CH2，參考+ LALAPG APE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAK
43 人類IgG1 CH2，參考+ LALA APE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
44 人類IgG1 CH2，參考+ IAHA APELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
45 人類IgG1 CH2，參考+ LALAPG-IAHA APE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAK
46 人類IgG1 CH2，參考+ LALA-IAHA APE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
51 人類IgG1 CH3，參考1 (356E及358M) GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
52 人類IgG1 CH3，參考2 (356D及358L) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
53 人類IgG1 CH3，參考3 (356D、358L及V422I) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
54 人類IgG1 CH3，參考4 (356D、358L及A431G) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
61 人類IgG1 CH3，參考1 + HQ GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
62 人類IgG1 CH3，參考2 + HQ GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
63 人類IgG1 CH3，參考3 + HQ GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
64 人類IgG1 CH3，參考4 + HQ GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHN QYTQKSLSLSPGK
66 人類IgG1 CH3，參考1 + HA GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
67 人類IgG1 CH3，參考2+ HA GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
68 人類IgG1 CH3，參考3 + HA GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
69 人類IgG1 CH3，參考4 + HA GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHN AYTQKSLSLSPGK
加底線殘基為相對於對應參考序列之差異。 附錄表 H ： Fc 區序列
SEQ ID NO: 名稱 序列
71 人類IgG1 Fc，參考1 (356E及358M) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
72 人類IgG1 Fc，參考2 (356D及358L) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
73 人類IgG1 Fc，參考3 (356D、358L及V422I) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
74 人類IgG1 Fc，參考4 (356D、358L及A431G) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
81 人類IgG1 Fc，參考1 + LALAPG DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
82 人類IgG1 Fc，參考2 + LALAPG DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
83 人類IgG1 Fc，參考3 + LALAPG DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
84 人類IgG1 Fc，參考4 + LALAPG DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
86 人類IgG1 Fc，參考1 + LALA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
87 人類IgG1 Fc，參考2 + LALA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
88 人類IgG1 Fc，參考3 + LALA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
89 人類IgG1 Fc，參考4 + LALA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
91 人類IgG1 Fc，參考1 + IAHAHQ DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
92 人類IgG1 Fc，參考2 + IAHAHQ DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
93 人類IgG1 Fc，參考3 + IAHAHQ DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
94 人類IgG1 Fc，參考4 + IAHAHQ DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHN QYTQKSLSLSPGK
96 人類IgG1 Fc，參考1 + IAHAHA DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
97 人類IgG1 Fc，參考2 + IAHAHA DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
98 人類IgG1 Fc，參考3 + IAHAHA DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
99 人類IgG1 Fc，參考4 + IAHAHA DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHN AYTQKSLSLSPGK
471 人類IgG1 Fc，參考1 + LALAPG-IAHAHQ DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
472 人類IgG1 Fc，參考2 + LALAPG-IAHAHQ DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
473 人類IgG1 Fc，參考3 + LALAPG-IAHAHQ DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
474 人類IgG1 Fc，參考4 + LALAPG-IAHAHQ DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHN QYTQKSLSLSPGK
476 人類IgG1 Fc，參考1 + LALAPG-IAHAHA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
477 人類IgG1 Fc，參考2 + LALAPG-IAHAHA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
478 人類IgG1 Fc，參考3 + LALAPG-IAHAHA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
479 人類IgG1 Fc，參考4 + LALAPG-IAHAHA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHN AYTQKSLSLSPGK
481 人類IgG1 Fc，參考1 + LALA-IAHAHQ DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
482 人類IgG1 Fc，參考2 + LALA-IAHAHQ DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
483 人類IgG1 Fc，參考3 + LALA-IAHAHQ DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
484 人類IgG1 Fc，參考4 + LALA-IAHAHQ DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHN QYTQKSLSLSPGK
486 人類IgG1 Fc，參考1 + LALA-IAHAHA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
487 人類IgG1 Fc，參考2 + LALA-IAHAHA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
488 人類IgG1 Fc，參考3 + LALA-IAHAHA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
489 人類IgG1 Fc，參考4 + LALA-IAHAHA DKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHN AYTQKSLSLSPGK
加底線殘基為相對於對應參考序列之差異。 附錄表 I ： 雙特異性 - 例示性 共同序列
SEQ ID NO: 名稱 序列 註釋
401 雙特異性LC共同序列 X 1VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCX 2X 3SANIX 4SIETLGWX 5RQAPGKX 6X 7EX 8X 9X 10NX 11RGGGYX 12KYAX 13SX 14KGRFTX 15SX 16X 17X 18X 19KNTX 20YLQMNSLX 21X 22EDTAVYYCYVKLRX 23X 24X 25YVYX 26GQGTX 27VTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；及X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；X 7為任何胺基酸；X 8為任何胺基酸；X 9為任何胺基酸；及X 10為任何胺基酸；X 11為任何胺基酸；X 12為任何胺基酸；X 13為任何胺基酸；X 14為任何胺基酸；X 15為任何胺基酸；X 16為任何胺基酸；X 17為任何胺基酸；X 18為任何胺基酸；X 19為任何胺基酸；X 20為任何胺基酸；X 21為任何胺基酸；X 22為任何胺基酸；X 23為任何胺基酸；X 24為任何胺基酸；X 25為任何胺基酸；X 26為任何胺基酸；及X 27為任何胺基酸。
402 雙特異性HC共同序列(LALAPG) EVQLVESGGGLVX 1PGGSLRLSCAASGFTFTX 2YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAX 3SVKGRFTISRDX 4SKNTLYLQMNSLX 5X 6EDTAVYYCARATGFGTVVFX 7YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；及X 7為任何胺基酸。
407 雙特異性HC共同序列(LALA) EVQLVESGGGLVX 1PGGSLRLSCAASGFTFTX 2YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAX 3SVKGRFTISRDX 4SKNTLYLQMNSLX 5X 6EDTAVYYCARATGFGTVVFX 7YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；及X 7為任何胺基酸。
408 雙特異性HC共同序列(IAHAHQ) EVQLVESGGGLVX 1PGGSLRLSCAASGFTFTX 2YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAX 3SVKGRFTISRDX 4SKNTLYLQMNSLX 5X 6EDTAVYYCARATGFGTVVFX 7YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；及X 7為任何胺基酸。
409 雙特異性HC共同序列(IAHAHA) EVQLVESGGGLVX 1PGGSLRLSCAASGFTFTX 2YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAX 3SVKGRFTISRDX 4SKNTLYLQMNSLX 5X 6EDTAVYYCARATGFGTVVFX 7YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLAQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；及X 7為任何胺基酸。
460 雙特異性HC共同序列(LALAPG-IAHAHQ) EVQLVESGGGLVX 1PGGSLRLSCAASGFTFTX 2YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAX 3SVKGRFTISRDX 4SKNTLYLQMNSLX 5X 6EDTAVYYCARATGFGTVVFX 7YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；及X 7為任何胺基酸。
461 雙特異性HC共同序列(LALAPG-IAHAHA) EVQLVESGGGLVX 1PGGSLRLSCAASGFTFTX 2YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAX 3SVKGRFTISRDX 4SKNTLYLQMNSLX 5X 6EDTAVYYCARATGFGTVVFX 7YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；及X 7為任何胺基酸。
462 雙特異性HC共同序列(LALA-IAHAHQ) EVQLVESGGGLVX 1PGGSLRLSCAASGFTFTX 2YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAX 3SVKGRFTISRDX 4SKNTLYLQMNSLX 5X 6EDTAVYYCARATGFGTVVFX 7YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；及X 7為任何胺基酸。
463 雙特異性HC共同序列(LALA-IAHAHA) EVQLVESGGGLVX 1PGGSLRLSCAASGFTFTX 2YAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAX 3SVKGRFTISRDX 4SKNTLYLQMNSLX 5X 6EDTAVYYCARATGFGTVVFX 7YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK X 1為任何胺基酸；X 2為任何胺基酸；X 3為任何胺基酸；X 4為任何胺基酸；X 5為任何胺基酸；X 6為任何胺基酸；及X 7為任何胺基酸。
附錄表 J ： 雙特異性 - 例示性 HC 及 LC 序列
SEQ ID NO: 名稱 序列
1 hp4SD1-3 LC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYADSLKGRFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYVKLRDEDYVYRGQGTQVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2 hp4SD1-3 HC (具有LALAPG Fc) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
7 hp4SD1-3變異HC (具有LALA Fc) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
8 hp4SD1-3變異HC (具有IAHAHQ Fc) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
9 hp4SD1-3變異HC (具有IAHAHA Fc) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
450 hp4SD1-3變異HC (具有LALAPG-IAHAHQ Fc) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
451 hp4SD1-3變異HC (具有LALAPG-IAHAHA Fc) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
452 hp4SD1-3變異HC (具有LALA-IAHAHQ Fc) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN QYTQKSLSLSPGK
453 hp4SD1-3變異HC (具有LALA-IAHAHA Fc) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLM ASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL AQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN AYTQKSLSLSPGK
421 4SD1-03_LALAPG LC DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTSSANINSIETLGWYRQAPGKQRELIANMRGGGYMKYAGSLKGRFTMSTESAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCYVKLRDDDYVYRGQGTQVTVSSGGSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
422 4SD1-03_LALAPG HC (具有LALAPG Fc) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARATGFGTVVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
附錄表 K ：混雜 序列
SEQ ID NO: 名稱 序列
3 人類Norrin MRKHVLAASFSMLSLLVIMGDTDSKTDSSFIMDSDPRRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVLLARCEGHCSQASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCHCEECNS
4 人類Fzd4 MAWRGAGPSVPGAPGGVGLSLGLLLQLLLLLGPARGFGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEVPLPHKTPIQPGEECHSVGTNSDQYIWVKRSLNCVLKCGYDAGLYSRSAKEFTDIWMAVWASLCFISTAFTVLTFLIDSSRFSYPERPIIFLSMCYNIYSIAYIVRLTVGRERISCDFEEAAEPVLIQEGLKNTGCAIIFLLMYFFGMASSIWWVILTLTWFLAAGLKWGHEAIEMHSSYFHIAAWAIPAVKTIVILIMRLVDADELTGLCYVGNQNLDALTGFVVAPLFTYLVIGTLFIAAGLVALFKIRSNLQKDGTKTDKLERLMVKIGVFSVLYTVPATCVIACYFYEISNWALFRYSADDSNMAVEMLKIFMSLLVGITSGMWIWSAKTLHTWQKCSNRLVNSGKVKREKRGNGWVKPGKGSETVV
5 人類LRP5 MEAAPPGPPWPLLLLLLLLLALCGCPAPAAASPLLLFANRRDVRLVDAGGVKLESTIVVSGLEDAAAVDFQFSKGAVYWTDVSEEAIKQTYLNQTGAAVQNVVISGLVSPDGLACDWVGKKLYWTDSETNRIEVANLNGTSRKVLFWQDLDQPRAIALDPAHGYMYWTDWGETPRIERAGMDGSTRKIIVDSDIYWPNGLTIDLEEQKLYWADAKLSFIHRANLDGSFRQKVVEGSLTHPFALTLSGDTLYWTDWQTRSIHACNKRTGGKRKEILSALYSPMDIQVLSQERQPFFHTRCEEDNGGCSHLCLLSPSEPFYTCACPTGVQLQDNGRTCKAGAEEVLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQVDDIRHAIAIDYDPLEGYVYWTDDEVRAIRRAYLDGSGAQTLVNTEINDPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTSRKILVSEDLDEPRAIALHPVMGLMYWTDWGENPKIECANLDGQERRVLVNASLGWPNGLALDLQEGKLYWGDAKTDKIEVINVDGTKRRTLLEDKLPHIFGFTLLGDFIYWTDWQRRSIERVHKVKASRDVIIDQLPDLMGLKAVNVAKVVGTNPCADRNGGCSHLCFFTPHATRCGCPIGLELLSDMKTCIVPEAFLVFTSRAAIHRISLETNNNDVAIPLTGVKEASALDFDVSNNHIYWTDVSLKTISRAFMNGSSVEHVVEFGLDYPEGMAVDWMGKNLYWADTGTNRIEVARLDGQFRQVLVWRDLDNPRSLALDPTKGYIYWTEWGGKPRIVRAFMDGTNCMTLVDKVGRANDLTIDYADQRLYWTDLDTNMIESSNMLGQERVVIADDLPHPFGLTQYSDYIYWTDWNLHSIERADKTSGRNRTLIQGHLDFVMDILVFHSSRQDGLNDCMHNNGQCGQLCLAIPGGHRCGCASHYTLDPSSRNCSPPTTFLLFSQKSAISRMIPDDQHSPDLILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYWVDGRQNIKRAKDDGTQPFVLTSLSQGQNPDRQPHDLSIDIYSRTLFWTCEATNTINVHRLSGEAMGVVLRGDRDKPRAIVVNAERGYLYFTNMQDRAAKIERAALDGTEREVLFTTGLIRPVALVVDNTLGKLFWVDADLKRIESCDLSGANRLTLEDANIVQPLGLTILGKHLYWIDRQQQMIERVEKTTGDKRTRIQGRVAHLTGIHAVEEVSLEEFSAHPCARDNGGCSHICIAKGDGTPRCSCPVHLVLLQNLLTCGEPPTCSPDQFACATGEIDCIPGAWRCDGFPECDDQSDEEGCPVCSAAQFPCARGQCVDLRLRCDGEADCQDRSDEADCDAICLPNQFRCASGQCVLIKQQCDSFPDCIDGSDELMCEITKPPSDDSPAHSSAIGPVIGIILSLFVMGGVYFVCQRVVCQRYAGANGPFPHEYVSGTPHVPLNFIAPGGSQHGPFTGIACGKSMMSSVSLMGGRGGVPLYDRNHVTGASSSSSSSTKATLYPPILNPPPSPATDPSLYNMDMFYSSNIPATARPYRPYIIRGMAPPTTPCSTDVCDSDYSASRWKASKYYLDLNSDSDPYPPPPTPHSQYLSAEDSCPPSPATERSYFHLFPPPPSPCTDSS
6 人類LRP6 MGAVLRSLLACSFCVLLRAAPLLLYANRRDLRLVDATNGKENATIVVGGLEDAAAVDFVFSHGLIYWSDVSEEAIKRTEFNKTESVQNVVVSGLLSPDGLACDWLGEKLYWTDSETNRIEVSNLDGSLRKVLFWQELDQPRAIALDPSSGFMYWTDWGEVPKIERAGMDGSSRFIIINSEIYWPNGLTLDYEEQKLYWADAKLNFIHKSNLDGTNRQAVVKGSLPHPFALTLFEDILYWTDWSTHSILACNKYTGEGLREIHSDIFSPMDIHAFSQQRQPNATNPCGIDNGGCSHLCLMSPVKPFYQCACPTGVKLLENGKTCKDGATELLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQLEDIRHAIAIDYDPVEGYIYWTDDEVRAIRRSFIDGSGSQFVVTAQIAHPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTRLNGTMRKILISEDLEEPRAIVLDPMVGYMYWTDWGEIPKIERAALDGSDRVVLVNTSLGWPNGLALDYDEGKIYWGDAKTDKIEVMNTDGTGRRVLVEDKIPHIFGFTLLGDYVYWTDWQRRSIERVHKRSAEREVIIDQLPDLMGLKATNVHRVIGSNPCAEENGGCSHLCLYRPQGLRCACPIGFELISDMKTCIVPEAFLLFSRRADIRRISLETNNNNVAIPLTGVKEASALDFDVTDNRIYWTDISLKTISRAFMNGSALEHVVEFGLDYPEGMAVDWLGKNLYWADTGTNRIEVSKLDGQHRQVLVWKDLDSPRALALDPAEGFMYWTEWGGKPKIDRAAMDGSERTTLVPNVGRANGLTIDYAKRRLYWTDLDTNLIESSNMLGLNREVIADDLPHPFGLTQYQDYIYWTDWSRRSIERANKTSGQNRTIIQGHLDYVMDILVFHSSRQSGWNECASSNGHCSHLCLAVPVGGFVCGCPAHYSLNADNRTCSAPTTFLLFSQKSAINRMVIDEQQSPDIILPIHSLRNVRAIDYDPLDKQLYWIDSRQNMIRKAQEDGSQGFTVVVSSVPSQNLEIQPYDLSIDIYSRYIYWTCEATNVINVTRLDGRSVGVVLKGEQDRPRAVVVNPEKGYMYFTNLQERSPKIERAALDGTEREVLFFSGLSKPIALALDSRLGKLFWADSDLRRIESSDLSGANRIVLEDSNILQPVGLTVFENWLYWIDKQQQMIEKIDMTGREGRTKVQARIAQLSDIHAVKELNLQEYRQHPCAQDNGGCSHICLVKGDGTTRCSCPMHLVLLQDELSCGEPPTCSPQQFTCFTGEIDCIPVAWRCDGFTECEDHSDELNCPVCSESQFQCASGQCIDGALRCNGDANCQDKSDEKNCEVLCLIDQFRCANGQCIGKHKKCDHNVDCSDKSDELDCYPTEEPAPQATNTVGSVIGVIVTIFVSGTVYFICQRMLCPRMKGDGETMTNDYVVHGPASVPLGYVPHPSSLSGSLPGMSRGKSMISSLSIMGGSSGPPYDRAHVTGASSSSSSSTKGTYFPAILNPPPSPATERSHYTMEFGYSSNSPSTHRSYSYRPYSYRHFAPPTTPCSTDVCDSDYAPSRRMTSVATAKGYTSDLNYDSEPVPPPPTPRSQYLSAEENYESCPPSPYTERSYSHHLYPPPPSPCTDSS
410 抗LRP5/6 CDRH3 DEDY模體 DEDY
411 抗LRP5/6 CDRH3 DEDY模體突變體 DEEY
412 抗LRP5/6 CDRH3 DEDY模體突變體 DESY
413 抗LRP5/6 CDRH3 DEDY模體突變體 DEAY
414 抗LRP5/6 CDRH3 DEDY模體突變體 DETY
415 抗LRP5/6 CDRH3 DEDY模體突變體 ESEY
416 抗LRP5/6 CDRH3 DEDY模體突變體 ESTY
417 抗LRP5/6 CDRH3 DEDY模體突變體 ESSY
418 抗LRP5/6 CDRH3 DDDY模體 DDDY
430 人類生殖系3-66*01 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS
431 抗LRP5/6 VH (hVHH3-H1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASANINSIETLGWVRQAPGKGLEWVSNMRGGGYMKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARKLRDDDYVYWGQGTLVTVSS
440 人類生殖系IGHV3-23*04 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
441 人類生殖系IGHJ4*01 YFDYWGQGTLVTVSS
附錄表 L ：抗 LRP5/6 VH CDR 及 FR 序列 ， 基於 IMGT 或 Kabat
SEQ ID NO: 名稱 序列
311 抗LRP5/6 FRH1 (IMGT) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC ASS
321 抗LRP5/6 CDRH1 (IMGT) ANI QSIET
531 抗LRP5/6 FRH2 (IMGT) LGW YRQAPGK QRE LIAN
541 抗LRP5/6 CDRH2 (IMGT) MRGGGY M
351 抗LRP5/6 FRH3 (IMGT) KYA DS LKGRFT MS TDNSKNT MYLQMNSL RAEDTAVYYC
361 抗LRP5/6 CDRH3 (IMGT) YVKLR DEDYVY
371 抗LRP5/6 FRH4 (IMGT) RGQGT QVTVSS
611 抗LRP5/6 FRH1 (Kabat) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSANIQS
621 抗LRP5/6 CDRH1 (Kabat) IETLG
631 抗LRP5/6 FRH2 (Kabat) WYRQAPGKQRELIA
641 抗LRP5/6 CDRH2 (Kabat) NMRGGGYMKYADSLKG
651 抗LRP5/6 FRH3 (Kabat) RFTMSTDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCYV
661 抗LRP5/6 CDRH3 (Kabat) KLRDEDYVY
671 抗LRP5/6 FRH4 (Kabat) RGQGTQVTVSS
圖 1提供四價雙特異性Wnt傳訊促效劑4SD1-03_LALAPG之胺基酸序列，其包含：抗Fzd4抗體4SD1之兩條重鏈及兩條輕鏈，其中抗LRP5/6 VHH域經由連接子序列GGSGS (SEQ ID NO: 102)與各抗Fzd4抗體輕鏈之N端融合；及其相關IgG樣抗體結構，其中兩條重鏈經由二硫鍵接合，且各輕鏈經由二硫鍵與重鏈接合。VHH域以斜體顯示；連接子序列為GGSGS (SEQ ID NO: 102)；CDR加底線且為粗體；重鏈之Fc域中之LALAPG突變以灰色顯示；及Fc域以灰色突出顯示；抗Fzd4 VL及VH域各自包含三個CDR且亦突出顯示(基於Kabat編號定義之抗Fzd4 CDR)。
圖 2A顯示對4SD1-03_LALAPG之VHH3域進行以人源化VHH駱駝序列之各種胺基酸修飾。VHH表示親本駱駝序列；3-66*01表示人類基因體資料庫中鑑別之最接近人類序列；及hVHH3-H1至hVHH3-H4包括指示之胺基酸取代。基於VH內之實際殘基編號(「seq」)及基於Martin編號「AbM」之胺基酸殘基編號顯示於序列上。
圖 2B顯示在蛋白A純化之後， 圖 2A中顯示之VHH3之各種人源化形式的尺寸排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)概況。x軸顯示以ml為單位之溶離體積；y軸顯示毫吸光度單位(milli absorbance unit；mAU)。hVHH3-H4顯示最佳表現及最高純度，如藉由單峰及高mAU值所指示。箭頭指示預期滯留體積。
圖 3顯示與hVHH3-H4中之潛在脫醯胺作用模體NS之修飾相關之VHH的SEC概況。x軸顯示以ml為單位之溶離體積；y軸顯示毫吸光度單位(mAU)。圖顯示hVHH3-H4中之N29可例如經Q置換而不影響純度。
圖 4提供與hVHH3-H4中之潛在異構化模體DDD之修飾相關之VHH的SEC概況。x軸顯示以ml為單位之溶離體積；y軸顯示毫吸光度單位(mAU)。層析圖顯示在蛋白A溶離之後，來自對DDD模體進行之各種胺基酸取代對於純度的影響。
圖 5顯示VHH3中之潛在氧化敏感殘基M51及M57之修飾。左側表顯示對M51或M57殘基進行之各種胺基酸取代，且顯示任何所測試胺基酸對M51或M57之取代不耐受且引起極不佳的產率。右側層析圖顯示不同M51及M57突變之所得純度之實例。x軸顯示以ml為單位之溶離體積；y軸顯示毫吸光度單位(mAU)。
圖 6提供為了得到hp4SD1-03進行之對4SD1-03_LALAPG之VHH3域的修飾(將VHH3人源化且併入N29Q及D102E取代)及對4SD1-03_LALAPG之VH域的修飾(併入N31S及DF62E取代，且改變構架區序列以進一步模擬人類生殖系編碼的序列)的圖。
圖 7顯示為了修飾潛在地可能胺基酸對4SD1-03_LALAPG之重鏈進行的各種胺基酸取代；CDR1中之N31經修飾為Q、S或A；CDR2中之D62經修飾為E、S或A；及CDR3中之D108經修飾為E、S或A。圖顯示相較於親本分子，CDR1 N31及CDR2 D62之突變具有類似或更高的Wnt傳訊活性。N31S突變引起效力增加五倍。然而，CDR3 D108無法在不損失效力之情況下置換。測試額外突變，但引起Wnt傳訊活性降低，如右側圖中所示。藉由質譜分析測試N31S、D62E及D108之組合，且在加速脅迫條件後未顯示異構化。
圖 8顯示4SD1區之VH區與其最接近人類生殖系IGHV3-23*04 a之序列之間的比對。基於此比對，構築FR序列中含有變化之4SD1-03_LALAPG之構架突變體以模擬人類生殖系編碼之序列(如右上方表中所示)。構架突變之hp4SD1-03保留良好表現及純化概況，如尺寸排阻層析(SEC)概況中所示。在基於細胞之STF分析中，構架突變之hp4SD1-03之效力顯示比親本分子4SD1-03_LALAPG高五倍。此外，當在pH 5.5下在42℃下之熱脅迫持續2週之後藉由質譜分析分析時，hp4SD1-03未顯示異構化傾向。
圖 9提供所得四價雙特異性Wnt傳訊促效劑hp4SD1-03之胺基酸序列，其包含上文提及之對親本4SD1-03_LALAPG序列之修飾。此構築體具有與親本構築體相同的通用結構。VHH域以斜體顯示；連接子序列為GGGGS (SEQ ID NO: 101)；CDR加底線且為粗體；重鏈之Fc域中之LALAPG突變以灰色顯示；及Fc域以灰色突出顯示；抗Fzd4 VL及VH域各自包含三個CDR且亦突出顯示(基於Kabat編號定義之抗Fzd4 CDR)。
圖 10A為顯示相較於親本構築體4SD1-03_LALAPG，經修飾之構築體hp4SD1-03之Wnt傳訊活性的圖，兩種構築體均包含LALAPG Fc突變體。表中顯示之EC 50指示hp4SD1-03具有大約高十倍的Wnt傳訊活性。
圖 10B顯示比較hp4SD1-03及4SD1-03_LALAPG (兩者均包含LALAPG Fc突變體)之如實例5中所描述之基於 Axin2表現之Wnt/ β-連環蛋白傳訊活性評定之例示性結果，其中Norrin作為對照。如表中所示，hp4SD1-03顯示EC 50大約降低11.5倍。
圖 11顯示在視網膜損傷之小鼠模型中，相較於親本構築體4SD1-03_LALAPG，用經修飾之構築體hp4SD1-03處理的效果。頂部之時間軸概述經由75%氧氣、隨後玻璃體內注射任一構築體誘導視網膜損傷，及藉由染色無血管(AV)及簇區域檢查視網膜組織。下方之用同工凝集素B4 (IB4)染色之視網膜平放影像顯示未受損的視網膜；受損視網膜(陰性對照)；及來自用Eylea® (陽性對照)經修飾之構築體hp4SD1-03或親本構築體4SD1-03_LALAPG處理之動物的視網膜，其中劑量如右側表中所示。右側圖顯示無血管組織或簇區域相對於由各處理引起之總區域的百分比，且證實hp4SD1-03相較於4SD1-03_LALAPG具有更佳結果。對於各圖而言，自左至右，條杠對應於：無處理；Eylea®、4SD1-03_LALAPG及hp4SD1-03。*指示在ANOVA測試中p ＜ 0.05，**指示p ＜ 0.01，***指示p ＜ 0.001，****指示p ＜ 0.0001。
圖 12顯示在視網膜損傷之VEGF誘導之視網膜血管滲漏兔模型中，用指示量之經修飾之構築體hp4SD1-03處理之效果。劑量顯示於表中，且VEGF誘導之視網膜滲漏評分顯示於隨附圖中。用10 μg hp4SD1-03/眼睛或2 μg/眼睛處理引起滲漏約75%減少，且用0.4 μg hp4SD1-03/眼睛或0.08 μg/眼睛處理亦顯著降低血管滲漏。*指示在ANOVA測試中p ＜ 0.05，且**指示p ＜0.01。在第3天，媒劑與hp4SD1-03處理之間的視網膜血管滲漏比較。
圖 13提供如所指示處理之兔視網膜組織之螢光素血管造影影像。在所有測試動物中均觀測到功效。
圖 14顯示hVHH3-H4序列內具有胺基酸取代以置換位置103處之D或位置101-103處之DED的各種突變體之活性。上圖及下表顯示相較於在位置101-103含有DED之hp4SD1-03之活性，各種突變體之STF活性。層析圖顯示在蛋白A純化之後，與hVHH3-H4中之DED之修飾相關的純度。x軸顯示以ml為單位之溶離體積；y軸顯示毫吸光度單位(mAU)。此等資料顯示hp4SD1-03之D101及D103兩者均可置換而不降低分子之活性。
圖 15A 至 圖 15C顯示在小鼠OIR模型中，用高濃度之hp4SD1-03處理之效果。 圖 15A描繪OIR研究設計； 圖 15B顯示視網膜無血管(AV)及新生血管簇(neovascular tuft；NV)區域之染色。用同工凝集素B4 (IB4)染色之視網膜平放影像顯示未處理及用40 nM、400 nM及4000 nM hp4SD1-03處理。 圖 15C提供 圖 15B中之成像結果之定量圖。*指示在ANOVA測試中p ＜ 0.05，**指示p ＜ 0.01，****指示p ＜ 0.0001。
圖 16A 至 圖 16B顯示在用親本4SD1-03_LALAPG處理後，選擇基因及蛋白質之表現增加。 圖 16A為 LEF1及 MFSD2A之mRNA表現，且 圖 16B為兩種緊密連接蛋白質ZO-1及CLDN5之蛋白質表現。
圖 16C提供來自實例7之例示性西方墨點分析結果。用hp4SD1-03處理人類視網膜微血管內皮細胞(human retinal microvascular endothelial cell；HRMEC)增加Wnt傳訊中之關鍵細胞質分子DVL3之磷酸化(增加磷酸化DVL3與未磷酸化DVL3之比率)。
圖 17A 至圖 17C提供來自如實例8中所描述之結合動力學之評定的例示性結果。藉由BLI量測人類Fzd4 CRD對4SD1-03_LALAPG或hp4SD1-03之單價結合。 圖 17A提供人類Fzd4 CRD對4SD1-03_LALAPG之例示性結合感測圖譜。紅線表示藉由擬合即時結合感測圖譜(藍線)，使用1:1 Langmuir結合模型產生之全域擬合。 圖 17B提供人類Fzd4 CRD對hp4SD1-03之例示性結合感測圖譜。紅線表示藉由擬合即時結合感測圖譜(綠線)，使用1:1 Langmuir結合模型產生之全域擬合。 圖 17C提供顯示在所指示人類Fzd4 CRD濃度下，在人類Fzd4 CRD對4SD1-03_LALAPG或hp4SD1-03之結合中觀測到之KD、k on及k dis(亦稱為k off)值的表。
圖 18A 至圖 18C提供來自如實例8中所描述之結合動力學之評定的例示性結果。藉由SPR量測4SD1-03_LALAPG或hp4SD1-03對人類Fzd4 CRD之結合。 圖 18A提供人類Fzd4 CRD對4SD1-03_LALAPG之例示性結合感測圖譜。 圖 18B提供人類Fzd4 CRD對hp4SD1-03之例示性結合感測圖譜。 圖 18C提供顯示在4SD1-03_LALAPG或hp4SD1-03對人類Fzd4 CRD之結合中觀測到之K D、k a(亦稱為k on)及k d(亦稱為k off)值的表。指示在四個不同捕獲濃度下觀測到之值的平均值。
圖 19A 至圖 19B提供hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。突出顯示相對於hp4SD1-03引入之額外胺基酸取代。
圖 20提供在暫時轉染Expi293F™細胞中產生之hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA之蛋白A親和樹脂純化之後，實例9中獲得之例示性SEC層析圖。在SDS-PAGE凝膠上分析突出顯示之級分。
圖 21提供來自如實例9中所描述之解鏈溫度評估之例示性結果。三個頂部圖為hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA之例示性解鏈曲線，各自重複分析兩次。表(右上)提供來自重複兩次進行之各樣品之平均Tm1值。底部圖顯示來自重複分析兩次之各樣品之Tagg值的重疊。
圖 22提供來自實例9中之Wnt傳訊分析之例示性結果。圖(左)顯示在天然表現Fzd4及LRP5之bEnd.3細胞中使用螢光素酶報導系統獲得之hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ及hp4SD1-03 AAA的例示性劑量反應曲線。表(右)顯示來自擬合曲線之EC50值。
圖 23提供來自實例9中與新生Fc受體FcRn結合之評定的例示性結果。圖為hp4SD1-03、hp4SD1-03-AAQ及hp4SD1-03-AAA之例示性感測圖譜。hp4SD1-03顯示如所預期之與FcRn的結合，且相比之下，在hp4SD1-03-AAQ或hp4SD1-03-AAA突變體之情況下未觀測到結合。
圖 24 至圖 34提供可包含本文所揭示之抗Fzd4抗體及抗LRP5/6抗體之可變域序列中之任一者的各種多特異性抗體結構之例示性及非限制性實施例。在 圖 24 至圖 34中，除非另外指示，否則以下適用： (1)各域呈現為其中具有顯示域名稱(例如CH3、VH1等)之文字的矩形； (2)彼此連接之一組多個域表示多肽(例如重鏈多肽、輕鏈多肽等)； (3)多肽內各域之方向係根據顯示域名稱之文字的方向，自N端至C端； (4) 各域之間可視需要使用連接子或鉸鏈，且多肽之間(及/或域內)可存在二硫鍵，可能以允許正確形成抗原結合位點，即使當各圖未明確顯示連接子、鉸鏈或二硫鍵時； (5)自VH2延伸至另一域之線意謂連接子可能或可能不存在於VH2與另一域之間； (6)圖中顯示之CH1、CH2、CH3及/或CL域可儘可能省略，且在適當時可用鉸鏈或連接子置換； (7)CH1、CH2及CH3域可分別具有任何(重鏈)同型； (8)當超過一個CH1域存在於結構中時CH1域序列可能或可能不彼此相同或可能或可能不具有相同同型，當超過一個CH2域存在於結構中時CH2域序列可能或可能不彼此相同或可能或可能不具有相同同型，且當超過一個CH3域存在於結構中時CH3域序列可能或可能不彼此相同或可能或可能不具有相同同型； (9)輕鏈恆定(CL)域可為κCL域或λCL域； (10)當超過一個CL域存在於結構中時，所有CL域可為κCL或所有CL域可為λCL，或者一個CL可為κCL且另一CL可為λCL域，且CL域序列可能或可能不彼此相同； (11)當κ及λCL域兩者均存在時，在一些情況下，與CL域配對之CH1域可為變異CH1域，其中之一者可為優先與κCL結合的變異CH1，且另一CH1域可為優先與λCL結合的變異CH1 (分子中具有κ及λCL及κ偏好CH1以及λ偏好CH1潛在地允許有效生產)； (12)一般而言，VH1及VL1 (若VL1存在)形成第一抗原(例如Fzd4)之抗原結合區，且VH2形成第二抗原(例如LRP5及/或LRP6)抗原結合區；( 13)在VH1-VL1對中，若單獨VH1給予對第一抗原足夠的特異性(亦即奈米抗體)，則VL1可省略，即使圖中顯示VL1；及( 14)即使當圖中未明確顯示VL2時，包含VH2之抗原結合區可進一步包含VL2，只要VH2-VL2對保留與第二抗原結合即可。
圖 24提供可與本文揭示之抗Fzd4抗體及抗LRP5/6抗體之可變域序列中之任一者一起使用之各種多特異性抗體結構的一些例示性及非限制性實施例。左上(加框)之結構為本文所揭示之有些特異性雙特異性抗體(例如hp4SD1-03、hp4SD1-03 AAQ、hp4SD1-03 AAA)所具有之例示性結構。加框結構具有；兩個第一多肽(其在本文中亦可稱為重鏈)，自N端至C端各自包含VH1、CH1、CH2及CH3；及兩個第二多肽(其在本文中亦可稱為輕鏈)，自N端至C端各自包含VH2、視情況存在之連接子、VL1及CL。各對VH1及VL1形成對第一抗原具有特異性之抗原結合區，且各VH2形成對第二抗原具有特異性之抗原結合區。儘管加框結構中未明確顯示鉸鏈或二硫鍵，但加框結構例如可在單一多肽內之CH1與CH2之間包含鉸鏈，且鉸鏈之間及CH1與CL域之間可存在二硫鍵，如左下方結構中所示(二硫鍵顯示為虛線)。或者，加框抗體可例如在單一多肽內之CH1與CH2之間包含鉸鏈，且鉸鏈之間及CL與鉸鏈之間可存在二硫鍵，如右下方結構中所示(二硫鍵顯示為虛線)。圖中顯示及本文所描述之任何結構中可存在鉸鏈及二硫鍵(諸如左下方及右側結構中顯示之彼等)，即使未明確顯示。
圖 25提供 圖 24中所示之抗體結構之例示性變體。在加框抗體之一些變體中，VH2可重新定位至不同位置，例如第一多肽中VH1之N端(右上)、第二多肽中CL之C端(左下)或第一多肽中CH3之C端(右下)。 圖 25中描繪之等效變體(重新定位VH2)可進一步適用於 圖 24 至圖 34中顯示之任何結構或其變體(視需要)，即使未明確顯示或陳述。
圖 26提供 圖 24中所示之抗體結構之其他例示性變體。在加框抗體之一些變體中，VH2可進一步包括例如第二多肽中另一VH2之N端(左上)、第一多肽中VH1之N端(右上)、第二多肽中CL之C端(左下)或第一多肽中CH3之C端(右下)。 圖 26中描繪之等效變體(添加VH2至第一及/或第二多肽之N端或C端)可進一步適用於 圖 24 至圖 34中顯示之任何結構或其變體(視需要)，即使未明確顯示或陳述。
圖 27提供 圖 25中所示之抗體結構之一些例示性變體。具體言之，VH1及VL1之位置相對於 圖 25中所示之抗體結構調換。 圖 27中描繪之等效變體(調換VH1及VL1)可進一步適用於 圖 24 至圖 34中顯示之任何結構或其變體(視需要)，即使未明確顯示。
圖 28提供 圖 25中所示之抗體結構之一些例示性變體。具體言之，CH1及CL之位置相對於 圖 25中所示之抗體結構調換。 圖 28中描繪之等效變體(調換CH1及CL)可進一步適用於 圖 24 至圖 34中顯示之任何結構或其變體(視需要)，即使未明確顯示。
圖 29提供 圖 25中所示之抗體結構之一些例示性變體。具體言之，CH3域相對於 圖 25中所示之抗體結構不存在。 圖 29中描繪之等效變體(移除CH3)可進一步適用於 圖 24 至圖 34中顯示之任何結構或其變體(視需要)，即使未明確顯示。
圖 30提供 圖 25中所示之抗體結構之一些例示性變體。具體言之，CH2域相對於 圖 25中所示之抗體結構不存在。 圖 30中描繪之等效變體(移除CH2)可進一步適用於 圖 24 至圖 34中顯示之任何結構或其變體(視需要)，即使未明確顯示。
圖 31提供 圖 25中所示之抗體結構之一些例示性變體。具體言之，CH2及CH3域相對於 圖 25中所示之抗體結構不存在。在一些情況下，可存在鉸鏈及二硫鍵以允許兩個第一多肽二聚化，如所示(二硫鍵顯示為虛線)。 圖 31中描繪之等效變體(移除CH2及CH3)可進一步適用於 圖 24 至圖 34中顯示之任何結構或其變體(視需要)，即使未明確顯示。
圖 32A提供 圖 25中所示之抗體結構之一些例示性變體。具體言之，所顯示之結構為 圖 25中所示之抗體結構的一半，亦即包含一個第一多肽及一個第二多肽，且含有一個第一抗原結合區及一個第二抗原結合區。 圖 32A中描繪之等效變體(半結構或半抗體)可進一步適用於 圖 24 至圖 34中顯示之任何結構或其變體(視需要)，即使未明確顯示。
圖 32B提供 圖 32A中所示之半抗體結構之其他例示性變體，其不包含CH2及CH3但包含CH1。該等結構可包含CH1之鉸鏈或部分鉸鏈C端(上方四個結構)，且VH2可位於VL1之N端(左上)、VH1之N端(自左側開始上方第二個)、CL之C端(自右側開始上方第二個)或鉸鏈或部分鉸鏈之C端(右上)。或者，該等結構可能不包含鉸鏈(下方四個結構)，且VH2可位於VL1之N端(左上)、VH1之N端(自左側開始上方第二個)、CL之C端(自右側開始上方第二個)或CH1之C端(右上)。
圖 33提供可包含本文揭示之抗Fzd4抗體及抗LRP5/6抗體之可變域序列中之任一者之各種多特異性抗體結構的其他例示性及非限制性實施例。在頂部顯示之結構中，VH1及VL1形成scFv且進一步與VH2融合。在N端至C端方向上，scFv可包含VH1、視情況存在之連接子及VL1或VL1、視情況存在之連接子及VH1，且VH2可置於scFv之N端(左上及自左側開始上方第二個)或scFv之C端(右上及自右側開始上方第二個)。此類結構可進一步連接或二聚化。舉例而言，如下方結構中所示，加框結構可與另一加框結構(左下)或與頂部其他三個變體中之各者(左下、右下及自右側開始下方第二個)融合。
圖 34提供 圖 24之加框結構之其他例示性變體。具體言之，VH1及VL1形成scFv且進一步與VH2融合。因此，抗體結構可包含兩個第一多肽，自N端至C端其各自包含VH2、VL1、視情況存在之連接子、VH1、CH1、CH2及CH3 (左上，加框)。在加框結構之其他變體中，CH3域可不存在(左中)，CH2域可不存在(中部中間)，或CH2及CH3域可不存在(右中)。鉸鏈及二硫鍵可存在，例如如下方結構中所示(二硫鍵顯示為虛線)。
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Claims (33)

  1. 一種多特異性抗體或抗體片段，其至少包含： (A)第一抗原結合區，其與捲曲類受體4 (frizzled class receptor 4；Fzd4)特異性結合且包含第一重鏈可變域(VH1)及第一輕鏈可變域(VL1) (B)第二抗原結合區，其與低密度脂蛋白受體相關蛋白5及/或6 (LRP5及/或LRP6)特異性結合且至少包含第二重鏈可變域(VH2)， 其中： (A)該VH1包含： (i)具有如下胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (CDRH1)： (i-1)與SEQ ID NO: 121之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之CDRH1胺基酸序列具有至少80%一致性，視情況根據Kabat定義；或 (i-2)包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181中所含之CDRH1胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat定義； (ii)具有如下胺基酸序列之重鏈互補決定區2 (CDRH2)： (ii-1)與SEQ ID NO: 141之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之CDRH2胺基酸序列具有至少90%一致性，視情況根據Kabat定義； 或 (ii-2)包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列或由其組成，包含SEQ ID NO: 181中所含之CDRH2胺基酸序列或由其組成，視情況由Kabat定義；及 (iii)具有如下胺基酸序列之重鏈互補決定區3 (CDRH3)： (iii-1)與SEQ ID NO: 161之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 181中所含之CDRH3胺基酸序列具有至少90%一致性，視情況由Kabat定義；或 (iii-2)包含SEQ ID NO: 161之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 181中所含之CDRH3胺基酸序列或由其組成，視情況由Kabat定義；及 該VL1包含： (iv)具有如下胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (CDRL1)： (iv-1)與SEQ ID NO: 221之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281中所含之CDRL1胺基酸序列具有至少90%一致性，視情況由Kabat定義；或 (iv-2)包含SEQ ID NO: 221之胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 281中所含之CDRL1胺基酸序列或由其組成，視情況根據Kabat定義； (v)具有包含以下或由以下組成之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2 (CDRL2)： (v-1) SEQ ID NO: 241之胺基酸序列；或 (v-2) SEQ ID NO: 281中所含之CDRL2胺基酸序列，視情況根據Kabat定義；及 (vi)具有包含以下或由以下組成之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3 (CDRL3)： (vi-1) SEQ ID NO: 261之胺基酸序列；或 (vi-2) SEQ ID NO: 281中所含之CDRL3胺基酸序列，視情況根據Kabat定義；及 (B)該VH2包含： (i)具有包含以下或由以下組成之胺基酸序列之CDRH1： (i-1) SEQ ID NO: 321之胺基酸序列；或 (i-2) SEQ ID NO: 381中所含之CDRH1胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat定義； (ii)具有如下胺基酸序列之CDRH2： (ii-1)與SEQ ID NO: 341之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之CDRH3胺基酸序列具有至少90%一致性，視情況根據IMGT或Kabat定義； (ii-2)包含SEQ ID NO: 341之胺基酸序列或由其組成；或 (ii-3)包含SEQ ID NO: 381中所含之CDRH2胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat定義；及 (iii)具有如下胺基酸序列之CDRH3： (iii-1)與SEQ ID NO: 361之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 381中所含之CDRH3胺基酸序列具有至少90%一致性，視情況根據IMGT或Kabat定義；或 (iii-2)包含SEQ ID NO: 361及363-366中之任一者的胺基酸序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 381及393-396中之任一者中所含的CDRH3胺基酸序列或由其組成，視情況根據IMGT或Kabat定義。
  2. 如請求項1之多特異性抗體或抗體片段，其中： (A)該VH1包含： (i)該VH1之該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3，其包含SEQ ID NO: 181中所含之胺基酸序列，視情況根據Kabat；或 (ii) CDRH1、CDRH2及CDRH3，其分別包含SEQ ID NO: 121、141及161之胺基酸序列，及 該VL1包含： (i)該VL1之該CDRL1、該CDRL2及該CDRL3，其包含SEQ ID NO: 281中所含之胺基酸序列，視情況根據Kabat，或 (ii) CDRL1、CDRL2及CDRL3，其分別包含SEQ ID NO: 221、241及261之胺基酸序列；及 (B)該VH2包含： (i)該VH2之該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3，其包含SEQ ID NO: 381及393-396中之任一者中所含之胺基酸序列，視情況根據IMGT或Kabat；或 (ii) CDRH1、CDRH2及CDRH3，其分別包含SEQ ID NO: 321、341及361之胺基酸序列，分別包含SEQ ID NO: 321、341及363之胺基酸序列，分別包含SEQ ID NO: 321、341及364之胺基酸序列，分別包含SEQ ID NO:321、341及365或SEQ ID NO:321、341及366之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之多特異性抗體或抗體片段，其中： (A) (i)該VH1包含與SEQ ID NO: 181之胺基酸序列具有至少80%一致性之胺基酸序列；及/或 (ii)該VL1包含與SEQ ID NO: 281之胺基酸序列具有至少80%一致性之胺基酸序列；及/或 (B)該VH2包含與SEQ ID NO: 381及393-396中之任一者中所含之胺基酸序列具有至少80%一致性之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之多特異性抗體或抗體片段，其中： (A)該VH1包含含有SEQ ID NO: 181之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；及/或 該VL1包含含有SEQ ID NO: 281之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列；及/或 (B)該VH2包含含有SEQ ID NO: 381及393-396中之任一者中所含之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
  5. 如請求項1之多特異性抗體或抗體片段，其中： (A)該VH1包含由SEQ ID NO: 181之胺基酸序列組成的胺基酸序列；及 該VL1包含由SEQ ID NO: 281之胺基酸序列組成的胺基酸序列；及 (B)該VH2包含由SEQ ID NO: 381及393-396中之任一者中所含之胺基酸序列組成的胺基酸序列。
  6. 如請求項1之多特異性抗體，其包含： (A)第一抗原結合區，其與Fzd4特異性結合且包含VH1及VL1， (B)第二抗原結合區，其與LRP5及/或LRP6特異性結合且至少包含VH2， 其中： (i)該VH1之該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3與具有SEQ ID NO: 181之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)的彼等者一致； (ii)該VL1之該CDRL1、該CDRL2及該CDRL3與具有SEQ ID NO: 281之胺基酸序列之輕鏈可變域(VL)的彼等者一致；及 (iii)該VH2之該CDRH1、該CDRH2及該CDRH3與具有SEQ ID NO: 381之胺基酸序列之VH的彼等者一致。
  7. 如請求項8之多特異性抗體，其中： (i)該VH1包含SEQ ID NO: 181之胺基酸序列或由其組成；及 (ii)該VL1包含SEQ ID NO: 281之胺基酸序列或由其組成；及 (iii)該VH2包含SEQ ID NO: 381之胺基酸序列或由其組成。
  8. 如請求項1至7中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其中該VH2為奈米抗體、包含其或包含於其中。
  9. 如請求項1至7中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其為雙特異性抗體或抗體片段。
  10. 如請求項1至7中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其包含片段可結晶(fragment crystallizable；Fc)區，視情況其中該Fc區： (I)屬於IgG、IgA、IgE、IgD、IgM，視情況屬於IgG1、IgG4、IgG2或IgG3，進一步視情況屬於人類，或其變體； (II)包含一或多個降低Fc效應功能之胺基酸取代，視情況其中該一或多個胺基酸取代位於選自由以下組成之群之位置處：位置234、235、236、237、265、297及329，根據EU編號； (III)至少包含以下胺基酸取代，根據EU編號： (ii-1) L234A、L235A及P329G； (ii-2) L234A及L235A； (ii-3) I253A、H310A及H435Q；及/或 (ii-4) I253A、H310A及H435A， 視情況相對於人類IgG1 Fc區及/或SEQ ID NO: 71-74中之任一者(視情況不包括C端K)；及/或 (IV)包含含有以下中之任一者或與其至少80%一致之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 71-74、81-84、86-89、91-94、96-99、471-474、476-479、481-484及486-489 (視情況不包括C端K)。
  11. 如請求項1至7中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其包含： (a)第一多肽，其包含該VH1；及 (b)第二多肽，其 以N端至C端之次序包含以下： (b-1)該VH2； (b-2)視情況存在之連接子，其視情況為肽連接子，進一步視情況為可撓性連接子，視情況其中該連接子： (i)包含一或多個胺基酸，視情況一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二個胺基酸； (ii)由小胺基酸組成，該等胺基酸由G、S及/或A組成； (iii)包含含有選自由以下組成之群之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、G、GG、GGG、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GSS、SGS及SSG；及/或 (iv)包含含有選自由以下組成之群之胺基酸序列之胺基酸或肽的多個重複序列或由其組成：SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、G、GG、GGG、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GSS、SGS及SSG；及 (b-3)該VL1。
  12. 如請求項11之多特異性抗體或抗體片段，其中： (a)該第一多肽； (i)包含與以下中之任一者具有至少80%一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、7、8、9、450、451、452及453 (視情況不具有C端K)； 及/或 (ii)包含含有以下中之任一者之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、7、8、9、450、451、452及453 (視情況不具有C端K)；及 (b)該第二多肽： (i)包含與SEQ ID NO: 1具有至少80%一致性之胺基酸序列；及/或 (ii)包含含有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
  13. 如請求項12之多特異性抗體或抗體片段，其中： (a)該第一多肽包含含有以下之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、7、450或451 (視情況不具有C端K)；及 (b)該第二多肽包含含有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列。
  14. 如請求項13之多特異性抗體或抗體片段，其包含：經由一或多個二硫鍵彼此形成二聚體之該等第一多肽中的兩者；及該等第二多肽中的兩者，其中該等第二多肽中之一者經由二硫鍵與該等第一多肽中之一者相互作用，且該等第二多肽中之另一者經由二硫鍵與該等第一多肽中之另一者相互作用。
  15. 如請求項1至7中任一項之多特異性抗體或抗體片段，其包含： (A)兩個或更多個Fzd4結合區，其中該等Fzd4結合區中之至少一者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及/或 (B)兩個或更多個LRP5及/或LRP6結合區，其中該等LRP5及/或LRP6結合區中之至少一者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
  16. 如請求項15之多特異性抗體或抗體片段，其中： (I)該多特異性抗體或抗體片段中所包含之該一或多個Fzd4結合區之數目與該一或多個LRP5及/或LRP6結合區之數目的比率選自由以下組成之群：2:1、1:2、2:2、3:1、1:3、3:2、2:3、3:3、4:1、1:4、4:2、2:4、4:3、3:4及4:4； (II)該多特異性抗體或抗體片段中所包含之該一或多個Fzd4結合區之數目及該一或多個LRP5及/或LRP6結合區之數目：分別為2及1；分別為1及2；分別為2及2；分別為3及1；分別為1及3；分別為3及2；分別為2及3；分別為3及3；分別為4及1；分別為1及4；分別為4及2；分別為2及4；分別為4及3；分別為3及4；或分別為4及4；及/或 (III)該多特異性抗體或抗體片段包含： (a)兩個相同Fzd4結合區，其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及一個LRP5及/或LRP6結合區，其為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中； (b)兩個Fzd4結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中，或(ii)其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及一個LRP5及/或LRP6結合區，其為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中； (c)一個Fzd4結合區，其為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個相同LRP5及/或LRP6結合區，其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中； (d)一個Fzd4結合區，其為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個LRP5及/或LRP6結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中，或(ii)其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中； (e)兩個相同Fzd4結合區，其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個相同LRP5及/或LRP6結合區，其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中； (f)兩個Fzd4結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中，或(ii)其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個相同LRP5及/或LRP6結合區，其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中； (g)兩個相同Fzd4結合區，其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個LRP5及/或LRP6結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中，或(ii)其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中；及/或 (h)兩個Fzd4結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中，或(ii)其中之各者為該第一抗原結合區、包含其或包含於其中；及兩個LRP5及/或LRP6結合區，其彼此不同且(i)其中之至少一者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中，或(ii)其中之各者為該第二抗原結合區、包含其或包含於其中。
  17. 一種編碼如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段之核酸或核酸組合，視情況其中該核酸為DNA、cDNA、RNA、mRNA、經修飾之mRNA或DNA/RNA雜交體。
  18. 如請求項17之核酸或核酸組合，其編碼如請求項11至14中任一項之多特異性抗體或抗體片段且包含： (a)第一核酸，其編碼該第一多肽；及 (b)第二核酸，其編碼該第二多肽。
  19. 一種載體或載體組合，其包含如請求項17或18之核酸或核酸組合，視情況其中： (i)該載體包含一或多個與該核酸以可操作方式連接之啟動子； (ii)該載體為表現載體；及/或 (iii)該載體包含質體、病毒載體(視情況為腺相關病毒、腺病毒、慢病毒或逆轉錄病毒)、基於脂質之載體、自我複製RNA載體、病毒樣粒子、基於聚合物之載體及/或奈米粒子，視情況為基於脂質之奈米粒子。
  20. 如請求項19之載體或載體組合，其編碼如請求項11至14中任一項之多特異性抗體或抗體片段且包含： (a)第一載體，其包含編碼該第一多肽之第一核酸；及 (b)第二載體，其包含編碼該第二多肽之第二核酸。
  21. 一種宿主細胞，其包含： (A)如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段； (B)如請求項17或18之核酸或核酸組合；及/或 (C)如請求項19或20之載體或載體組合， 視情況其中該宿主細胞為： (i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或 (ii)非哺乳動物，視情況為植物、細菌、真菌、酵母、原生動物或昆蟲， 且視情況其中該宿主細胞為： (i)人類胚胎腎(human embryonal kidney；HEK)細胞，視情況為HEK293細胞或其變體，進一步視情況為Expi293F™細胞； (ii)中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary；CHO)細胞； (iii)免疫細胞；或 (iv)融合瘤。
  22. 一種細胞群體，其包含兩種或更多種如請求項21之宿主細胞。
  23. 一種醫藥組合物，其包含： (I) (A)如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段； (B)如請求項17或18之核酸或核酸組合； (C)如請求項19或20之載體或載體組合；及/或 (D)如請求項21之宿主細胞或如請求項22之細胞群體；及 (II)醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
  24. 一種以下各者之用途： (A)如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段； (B)如請求項17或18之核酸或核酸組合； (C)如請求項19或20之載體或載體組合； (D)如請求項21之宿主細胞或如請求項22之細胞群體；及/或 (E)如請求項23之醫藥組合物， 其用於製造用於治療有需要之個體之藥劑，視情況其中： (a)該個體為 (i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或 (ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物； (b)該個體患有疾病、病症或病狀或具有患上疾病、病症或病狀之風險；及/或 (c)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑。
  25. 一種以下各者之用途： (A)如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段； (B)如請求項17或18之核酸或核酸組合； (C)如請求項19或20之載體或載體組合； (D)如請求項19之宿主細胞或如請求項21之細胞群體；及/或 (E)如請求項22之醫藥組合物， 其用於製造用於治療或預防有需要之個體之疾病、病症或病狀之藥劑，視情況其中： (a)該個體為 (i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或 (ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物；及/或 (b)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑。
  26. 一種以下各者之用途： (A)如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段； (B)如請求項17或18之核酸或核酸組合； (C)如請求項19或20之載體或載體組合； (D)如請求項21之宿主細胞或如請求項22之細胞群體；及/或 (E)如請求項23之醫藥組合物， 其用於製造用於誘導、促進、刺激、增強及/或支持個體之目標細胞中之Wnt傳訊之藥劑，視情況其中： (a)該個體為 (i)哺乳動物，視情況為人類、非人類靈長類動物、猴、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、嚙齒動物、倉鼠、大鼠或小鼠；或 (ii)非哺乳動物脊椎動物，視情況為鳥、魚、兩棲動物或爬蟲動物； (b)該個體患有疾病、病症或病狀或具有患上疾病、病症或病狀之風險；及/或 (c)該方法進一步包含向該個體投與額外藥劑，視情況佐劑或治療劑， 且視情況其中： (i)該Wnt傳訊為或包含Wnt/β-連環蛋白傳訊；及/或 (ii)該方法促進、刺激、增強及/或支持募集多種受體複合物，該等受體複合物各自包含(ii-1) Fzd4及(ii-2) LRP5或LRP6。
  27. 如請求項24至26中任一項之用途，其中該疾病、病症或病狀包含以下中之一或多者： (a)視網膜病變，視情況為視網膜血管疾病(視情況由血管發育抑制或過量血管生成引起)及/或視情況選自由以下組成之群：滲出性玻璃體視網膜病變、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、早產兒視網膜病變、諾里氏病(Norrie disease)、糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy；DR)、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性黃斑缺血、老年性黃斑變性(AMD) (包括濕性AMD及乾性AMD)、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity；ROP)、骨質疏鬆假膠質瘤症候群(OPPG)、視網膜靜脈阻塞及科阿氏病(Coats disease)； (b)血管病症，視情況血管畸形或血管功能不全，進一步視情況與缺血誘發之新血管生成相關； (c)骨骼疾病或骨骼損傷，視情況選自由以下組成之群：骨質疏鬆(包括骨質疏鬆假膠質瘤(OPPG)症候群及幼年型原發性骨質疏鬆)、骨礦物質密度變化及癌症相關骨質溶解； (d)肌肉萎縮疾病，視情況選自由以下組成之群：肌肉減少症、惡病質及肌肉失養症；及/或 (e)神經或神經退行性疾病，視情況選自由以下組成之群：中風、創傷性腦損傷、癲癇症、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、巴金森氏症(Parkinson's disease)、杭丁頓氏症(Huntington's disease)、肌萎縮性脊髓側索硬化症、弗里德賴希運動失調(Friedreich ataxia)、路易體疾病(Lewy body disease)、脊髓性肌肉萎縮症、運動神經元疾病、多發性硬化、巴登氏病(Batten disease)及庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)。
  28. 如請求項24至26中任一項之用途，其中： (I)該投藥為： (i)投與該個體的一或多隻眼睛，視情況玻璃體內或經由眼部滴劑； (ii)局部投與，視情況向眼睛、耳、鼻(視情況鼻內)、皮膚(視情況經皮或經上表皮)、黏膜、皮膚或陰道，或藉由吸入；或 (iii)非經腸投與，視情況藉由注射(視情況靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、鞘內、動脈內、關節內、骨內或腹膜內投與)或藉由吸入；或 (iv)經腸投與，視情況經口、舌下、經頰或經直腸；及/或 (II)該投與包含以如下向該個體的一或多隻眼睛投與如請求項1至20中任一項之多特異性抗體或抗體片段：每隻眼約0.1-100000 ng、每隻眼約1-100000 ng、每隻眼約1-10000 ng、每隻眼約10-10000 ng、每隻眼約1-100 ng、每隻眼約200-300 ng、每隻眼約300-400 ng、每隻眼約400-500 ng、每隻眼約500-600 ng、每隻眼約600-700 ng、每隻眼約700-800 ng、每隻眼約800-900 ng、每隻眼約900-1000 ng、每隻眼約1000-2000 ng、每隻眼約2000-3000 ng、每隻眼約3000-4000 ng、每隻眼約4000-5000 ng、每隻眼約5000-6000 ng、每隻眼約6000-7000 ng、每隻眼約7000-8000 ng、每隻眼約8000-9000 ng、每隻眼約9000-10000 ng、每隻眼約10000-20000 ng、每隻眼約20000-30000 ng、每隻眼約30000-40000 ng、每隻眼約40000-50000 ng、每隻眼約50000-60000 ng、每隻眼約60000-70000 ng、每隻眼約70000-80000 ng、每隻眼約80000-90000 ng或每隻眼約90000-100000 ng。
  29. 一種以下各者之用途： (A)如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段； (B)如請求項17或18之核酸或核酸組合； (C)如請求項19或20之載體或載體組合； (D)如請求項19之宿主細胞或如請求項21之細胞群體；及/或 (E)如請求項22之醫藥組合物， 其用於製造用於誘導、促進、刺激、增強及/或支持目標細胞中之Wnt傳訊之藥劑，視情況其中： (I)該接觸在活體內進行， (II)該方法係用於(i)製備用於植入之細胞及/或組織，(ii)分化幹細胞，及/或(iii)製備類器官， (III)該方法係用於骨形成、血管形成及/或神經形成及/或分化。
  30. 一種誘導、促進、刺激、增強及/或支持目標細胞中之Wnt傳訊之方法，其包含使該目標細胞與有效量之以下各者接觸： (A)如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段； (B)如請求項17或18之核酸或核酸組合； (C)如請求項19或20之載體或載體組合； (D)如請求項19之宿主細胞或如請求項21之細胞群體；及/或 (E)如請求項22之醫藥組合物， 視情況其中： (I)該接觸在活體外或離體進行， (II)該方法係用於(i)製備用於植入之細胞及/或組織，(ii)分化幹細胞，及/或(iii)製備類器官， (III)該方法係用於骨形成、血管形成及/或神經形成及/或分化。
  31. 一種製造如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段之方法，其包含： (a)在允許表現該多特異性抗體或抗體片段之條件中培養包含如請求項17或18之核酸或核酸組合之細胞，及 (b)自來自(a)之細胞培養物收穫及純化該多特異性抗體或抗體片段。
  32. 一種製造如請求項21之宿主細胞或如請求項22之此類細胞之群體之方法，其包含將如請求項17或18之核酸或核酸組合及/或如請求項19或20之載體或載體組合引入一或多個細胞中，視情況其中該引入在活體外、離體或活體內進行。
  33. 一種如請求項1至16中任一項之多特異性抗體或抗體片段、如請求項17或18之核酸或核酸組合、如請求項19或20之載體或載體組合、如請求項20之宿主細胞、或如請求項22之細胞群體、及/或如請求項23之醫藥組合物之用途，其用於製造藥劑。
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