TW202340254A - 抗btla抗體及其於治療癌症之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明描述抗BTLA抗體及其抗原結合片段。亦描述編碼該等抗體之核酸、包含該等抗體之組合物，以及產生該等抗體及使用該等抗體治療或預防有需要之個體之癌症的方法。
Description
本發明係關於經分離抗B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)單株抗體或其抗原結合片段、編碼該等抗體之核酸及表現載體、含有該等載體之重組細胞，以及包含該等抗體之組合物。亦提供製備該等抗體之方法及使用該等抗體治療包括癌症及/或相關併發症之疾病的方法。
B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)屬於CD28免疫球蛋白超家族。其為共抑制免疫檢查點分子且與PD-1及CTLA-4共用結構及功能相似性。BTLA之表現限於免疫細胞(T細胞、B細胞、DC、NK細胞等)。在其配位體HVEM結合後，BTLA之胞內域經由兩種磷酸酶SHP1及SHP2傳訊以抑制T細胞及B細胞中之下游TCR及BCR傳訊。BTLA在T細胞分化期間具有與其他抑制性檢查點相比不同的表現圖譜，表明同時或依序阻斷多個抑制性分子可改良基於T細胞之療法。因此，BTLA為用於治療且可能治癒BTLA-陽性癌症之癌症免疫療法的理想目標。
在一個通用態樣中，本發明係關於特異性結合B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)之經分離單株抗體或其抗原結合片段。
提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有以下之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3：
(1) 分別為SEQ ID NO: 7、8、153、10、11及12；或
(2) 分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6；
其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)，較佳地人類BTLA，視情況該單株抗體或其抗原結合片段並非天然存在。SEQ ID NO:153由胺基酸序列CAREDGYPYYTLDX
1W表示，其中X
1為選自C、A、S、T或V之胺基酸。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有以下之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3：
(1) 分別為SEQ ID NO: 7、8、9、10、11及12；或
(2) 分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6；
其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)，較佳地人類BTLA，視情況該單株抗體或其抗原結合片段並非天然存在。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:15或13至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO:16或14至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多肽序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，經分離抗BTLA單株抗體或其抗原結合片段包含：
(1) 具有SEQ ID NO:15之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:16之多肽序列的輕鏈可變區；或
(2) 具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類或人源化的。
在某些實施例中，人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有以下之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3：
(1) 分別為SEQ ID NO: 7、8、150、10、11及12；
(2) 分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6；
(3) 分別為SEQ ID NO: 7、8、9、10、11及12；
(4) 分別為SEQ ID NO: 7、8、149、10、11及12；
(5) 分別為SEQ ID NO: 7、8、151、10、11及12；或
(6) 分別為SEQ ID NO: 7、8、152、10、11及12。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:141、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145或147至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO:142、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146或148至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多肽序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，經分離人源化抗BTLA單株抗體或其抗原結合片段包含：
(1) 具有SEQ ID NO:141之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:142之多肽序列的輕鏈可變區；
(2) 具有SEQ ID NO:17之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:18之多肽序列的輕鏈可變區；
(3) 具有SEQ ID NO:19之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:20之多肽序列的輕鏈可變區；
(4) 具有SEQ ID NO:21之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:22之多肽序列的輕鏈可變區；
(5) 具有SEQ ID NO:23之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:24之多肽序列的輕鏈可變區；
(6) 具有SEQ ID NO:25之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:26之多肽序列的輕鏈可變區；
(7) 具有SEQ ID NO:27之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:28之多肽序列的輕鏈可變區；
(8) 具有SEQ ID NO:29之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:30之多肽序列的輕鏈可變區；
(9) 具有SEQ ID NO:31之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:32之多肽序列的輕鏈可變區；
(10) 具有SEQ ID NO:33之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:34之多肽序列的輕鏈可變區；
(11) 具有SEQ ID NO:35之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:36之多肽序列的輕鏈可變區；
(12) 具有SEQ ID NO:37之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:38之多肽序列的輕鏈可變區；
(13) 具有SEQ ID NO:39之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:40之多肽序列的輕鏈可變區；
(14) 具有SEQ ID NO:41之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:42之多肽序列的輕鏈可變區；
(15) 具有SEQ ID NO:43之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:44之多肽序列的輕鏈可變區；
(16) 具有SEQ ID NO:45之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:46之多肽序列的輕鏈可變區；
(17) 具有SEQ ID NO:47之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:48之多肽序列的輕鏈可變區；
(18) 具有SEQ ID NO:49之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:50之多肽序列的輕鏈可變區；
(19) 具有SEQ ID NO:51之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:52之多肽序列的輕鏈可變區；
(20) 具有SEQ ID NO:53之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:54之多肽序列的輕鏈可變區；
(21) 具有SEQ ID NO:55之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:56之多肽序列的輕鏈可變區；
(22) 具有SEQ ID NO:57之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:58之多肽序列的輕鏈可變區；
(23) 具有SEQ ID NO:59之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:60之多肽序列的輕鏈可變區；
(24) 具有SEQ ID NO:61之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:62之多肽序列的輕鏈可變區；
(25) 具有SEQ ID NO:63之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:64之多肽序列的輕鏈可變區；
(26) 具有SEQ ID NO:65之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:66之多肽序列的輕鏈可變區；
(27) 具有SEQ ID NO:67之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:68之多肽序列的輕鏈可變區；
(28) 具有SEQ ID NO:69之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:70之多肽序列的輕鏈可變區；
(29) 具有SEQ ID NO:71之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:72之多肽序列的輕鏈可變區；
(30) 具有SEQ ID NO:73之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:74之多肽序列的輕鏈可變區；
(31) 具有SEQ ID NO:75之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:76之多肽序列的輕鏈可變區；
(32) 具有SEQ ID NO:77之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:78之多肽序列的輕鏈可變區；
(33) 具有SEQ ID NO:79之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:80之多肽序列的輕鏈可變區；
(34) 具有SEQ ID NO:81之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:82之多肽序列的輕鏈可變區；
(35) 具有SEQ ID NO:83之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:84之多肽序列的輕鏈可變區；
(36) 具有SEQ ID NO:85之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:86之多肽序列的輕鏈可變區；
(37) 具有SEQ ID NO:87之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:88之多肽序列的輕鏈可變區；
(38) 具有SEQ ID NO:89之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:90之多肽序列的輕鏈可變區；
(39) 具有SEQ ID NO:91之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:92之多肽序列的輕鏈可變區；
(40) 具有SEQ ID NO:93之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:94之多肽序列的輕鏈可變區；
(41) 具有SEQ ID NO:95之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:96之多肽序列的輕鏈可變區；
(42) 具有SEQ ID NO:97之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:98之多肽序列的輕鏈可變區；
(43) 具有SEQ ID NO:99之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:100之多肽序列的輕鏈可變區；
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(59) 具有SEQ ID NO:131之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:132之多肽序列的輕鏈可變區；
(60) 具有SEQ ID NO:133之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:134之多肽序列的輕鏈可變區；
(61) 具有SEQ ID NO:135之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:136之多肽序列的輕鏈可變區；
(62) 具有SEQ ID NO:137之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:138之多肽序列的輕鏈可變區；
(63) 具有SEQ ID NO:139之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:140之多肽序列的輕鏈可變區；
(64) 具有SEQ ID NO:143之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:144之多肽序列的輕鏈可變區；
(65) 具有SEQ ID NO:145之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:146之多肽序列的輕鏈可變區；或
(66) 具有SEQ ID NO:147之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:148之多肽序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段特異性結合食蟹獼猴BTLA。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段以小於約25 nM、20 nM、15 nM、5 nM、2 nM、1 nM或0.5 nM之K
D結合至人類BTLA。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段為人類BTLA之促效劑且在結合至BTLA時活化BTLA之下游傳訊。
在某些實施例中，單株抗體或其抗原結合片段能夠抑制B細胞增殖及/或T細胞及/或漿細胞活化。T細胞可例如選自由以下組成之群：CD4 T細胞、CD8 T細胞、Th1 T細胞、TFH T細胞、αβ T細胞及γδ T細胞。
在某些實施例中，單株抗體或其抗原結合片段能夠阻斷或消除結合至疱疹病毒侵入介體(herpes virus entry mediator：HVEM)之BTLA。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段結合至BTLA且能夠增加促炎性細胞介素產生，諸如(例如)干擾素γ (IFNγ)、介白素-2 (IL-2)、C-X-C模體趨化介素配位體9 (CXCL9)、C-X-C模體趨化介素配位體10 (CXCL10)、介白素1β (IL1β)及腫瘤壞死因子α (TNFα)；調節經結合藥物之活性；及/或與具有殺滅癌症作用之另一單株抗體或其抗原結合片段形成雙特異性抗體。
亦提供包含本發明之單株抗體或其抗原結合片段的經分離雙特異性抗體或其抗原結合片段。
亦提供經分離核酸，其編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段。
亦提供載體，其包含編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段的經分離核酸。
亦提供包含載體之宿主細胞，該等載體包含編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段的經分離核酸。
在某些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含本發明之經分離單株抗體或其抗原結合片段或經分離雙特異性抗體或其抗原結合片段，及醫藥學上可接受之載劑。
亦提供特異性靶向有需要之個體之癌細胞表面上之B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)的方法，其包含向該個體投與本發明之醫藥組合物。
亦提供治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與本發明之醫藥組合物。在某些實施例中，癌症為實體腫瘤，較佳為具有浸潤性T細胞之實體腫瘤，更佳為具有浸潤性T效應細胞之實體腫瘤，更佳為具有表現BTLA之T效應細胞的實體腫瘤，最佳為具有表現BTLA之浸潤性T效應細胞及在腫瘤微環境中高度表現之BTLA配位體HVEM的實體腫瘤。癌症可例如為BTLA-陽性癌症。癌症之實例可例如選自但不限於黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌及肝癌。
在某些實施例中，醫藥組合物進一步包含第二治療性抗癌劑。第二治療性抗癌劑可例如為抗PD1抗體或其抗原結合片段。
亦提供產生本發明之單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段的方法。該等方法包含在產生單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之核酸的細胞，及自細胞或培養物回收單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段。
亦提供產生醫藥組合物之方法，該醫藥組合物包含本發明之單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段。該等方法包含將單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段與醫藥學上可接受之載劑組合以獲得醫藥組合物。
亦提供測定個體中BTLA之含量的方法。該等方法包含(a)自個體獲得樣本；(b)使該樣本與本發明之抗BTLA單株抗體或其抗原結合片段接觸；及(c)測定個體中BTLA之含量。在某些實施例中，樣本為組織樣本。組織樣本可例如為癌症組織樣本。在某些實施例中，樣本為血液樣本。在某些實施例中，樣本包含T細胞(例如，CD4、CD8、Th1、TFH、αβ、γδ)、B細胞、樹突狀細胞(DC)及自然殺手(NK)細胞。
相關申請案之交叉參考
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本申請案含有以電子方式提交之序列表。電子序列表(065798.8WO2 Sequence Listing.xml；大小：148,818位元組；及創建日期：2023年1月19日)之內容以全文引用之方式併入本文中。
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除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同的含義。此外，本文所使用之某些術語具有如本說明書中所闡述之含義。
必須注意，除非上下文另有明確地指示，否則如本文及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個提及物。
除非另有說明，否則任何數值，諸如本文所述之濃度或濃度範圍，應理解為在所有情況下均以術語「約」修飾。因此，數值通常包括所述值±10%。舉例而言，1 mg/mL之濃度包括0.9 mg/mL至1.1 mg/mL。同樣，1%至10% (w/v)之濃度範圍包括0.9% (w/v)至11% (w/v)。除非上下文另外明確地指示，否則如本文所用，使用的數字範圍明確地包括所有可能的子範圍、在彼範圍內的所有個別數值，包括此類範圍內之整數及該等值之分數。
除非另外指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為指系列中之每一要素。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所描述之本發明特定實施例的許多等效物。本發明意欲涵蓋該等等效方案。
如本文所使用之術語「包含(comprises/comprising)」、「包括(includes/including)」、「具有(has/having)」、「含有(contains/containing)」或其任何其他變化形式應理解為暗示包括所陳述之整數或整數群而非排除任何其他整數或整數群，且意欲為非排他性的或開放性的。舉例而言，包含要素清單之組合物、混合物、製程、方法、製品或設備不必僅限於彼等要素，但可包括未明確地列出或該組合物、混合物、製程、方法、製品或設備所固有之其他要素。此外，除非明確地相反陳述，否則「或」係指包括性的或，而非指排他性的或。舉例而言，條件A或B藉由以下各者中之任一者得以滿足：A為真(或存在)且B為假(或不存在)；A為假(或不存在)且B為真(或存在)；以及A與B皆為真(或存在)。
如本文所用，在多個所述要素之間的連接性術語「及/或」係理解為涵蓋個別選項及組合選項。舉例而言，當兩個要素藉由「及/或」連結時，第一個選項係指第一要素之適用性，不含第二要素。第二個選項係指第二要素之適用性，不含第一要素。第三選項係指第一要素與第二要素一起之適用性。此等選項中之任一者應理解為在該含義之範圍內，且因此滿足如本文所用之術語「及/或」之要求。該等選項中多於一者之同時適用性亦應理解為在該含義之範圍內，且因此滿足術語「及/或」之要求。
如本文所使用，如本說明書及申請專利範圍通篇所使用之術語「由……組成(consists of)」或諸如「由……組成(consist of)」或「由……組成(consisting of)」之變化形式指示包括任何所敍述整數或整數群，但不可將額外整數或整數群添加至規定方法、結構或組合物中。
如本文所使用，如在整個說明書及申請專利範圍中使用的術語「基本上由…組成(consists essentially of)」或諸如「基本上由…組成(consist essentially of)」或「基本上由…組成(consisting essentially of)」之變化形式指示包含任何所述整數或整數群，且視情況包含不會實質上改變指定方法、結構或組合物之基礎或新穎特性的任何所述整數或整數群。參見M.P.E.P. § 2111.03。
如本文所使用之「個體(subject)」意謂任何動物，較佳地哺乳動物，最佳地人類。如本文中所使用，術語「哺乳動物(mammal)」涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物之實例包括但不限於母牛、馬、綿羊、豬、貓、犬、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、猴、人類等，更佳地人類。
字詞「右」、「左」、「下」及「上」表示參考之附圖中之方向。
亦應當理解，當提及較佳發明之組分的尺寸或特徵時，本文中使用之術語「約」、「近似地」、「大體上」、「實質上」及類似術語指示，所描述之尺寸/特徵並非嚴格的界限或參數且如一般熟習此項技術者所理解，不排除相對於其之功能上相同或類似之微小變化。在最低限度下，包括數值參數之此類提及將包括使用此項技術中認可之數學及工業原理(例如捨入、量測值或其他系統誤差、製造容限等)不會改變最低有效數位之變化。
術語「一致(identical)」或「一致性」百分比在兩個或更多個核酸或多肽序列(例如抗BTLA抗體及編碼其之聚核苷酸，BTLA多肽及編碼其之BTLA聚核苷酸)之上下文中係指使用以下序列比較演算法中之一者或藉由目視檢查量測，兩個或更多個序列或子序列在針對最大對應關係進行比較及比對時為相同的或具有一定百分比的相同胺基酸殘基或核苷酸。
就序列比較而言，通常一個序列充當參考序列，將測試序列與其比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。隨後，序列比較演算法基於指定程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
可以進行用於比較之序列的最佳比對，例如藉由Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 1981; 2:482之局部同源演算法、藉由Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 1970；48: 443之同源性比對演算法、藉由Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444之相似性檢索方法、藉由此等演算法之電腦化實施方案(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由目視檢查(一般參見，Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel等人編, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.及John Wiley & Sons, Inc., 1995 增刊(Ausubel))。
適合於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法之實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人, J. Mol. Biol. 1990; 215: 403-410及Altschul等人, Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402中。執行BLAST分析之軟體為可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此演算法包括首先藉由鑑別查詢序列中之長度W之短字來鑑別高評分序列對(HSP)，該等短字在與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足某些正值臨限值分數T。T稱為鄰域字分數臨限值(Altschul等人，同上)。此等初始鄰域匹配字組(word hit)充當用於起始檢索之種子以尋找含有其之較長HSP。匹配字組接著沿各序列在兩個方向上延伸，只要累積對準分數增加即可。
對於核苷酸序列，使用參數M (一對匹配殘基之獎勵分數；始終＞0)及N (錯配殘基之罰分；始終＜0)計算累積分數。對於胺基酸序列，使用計分矩陣計算累積分數。在以下情況時，匹配字組沿各方向之延伸中斷：累積比對分值自其達成之最大值降低數量X；累積分值由於一或多個負分殘基比對之累加而變成零或低於零；或達至任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(就核苷酸序列而言)使用字長(W) 11、期望值(E) 10、M=5、N=-4及兩股之比較作為預設參數。對於胺基酸序列而言，BLASTP程式使用字長(W) 3、期望值(E) 10及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))作為預設參數。
除了計算序列同一性百分比外，BLAST演算法還對兩個序列之間的相似性進行統計分析(參見例如，Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 1993; 90:5873-5787)。藉由BLAST演算法得到之一種相似性量測結果為最小總和機率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間隨機出現匹配之機率的指示。舉例而言，若測試核酸與參考核酸比較時的最小總機率小於約0.1，更佳小於約0.01，且最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。
兩個核酸序列或多肽實質上一致之另一指示為，由第一核酸編碼之多肽可對由第二核酸編碼之多肽具有免疫交叉反應性，如下文所描述。因此，多肽通常與第二多肽實質上一致，例如，其中兩個肽僅因保守取代而不同。兩個核酸序列實質上一致之另一指示為，兩個分子在嚴格條件下彼此雜交。
如本文所使用，術語「經分離」意謂生物組分(諸如核酸、肽或蛋白質)實質上已與其中天然存在該組分之生物體的其他生物組分，亦即其他染色體及染色體外DNA及RNA、及蛋白質分離，分開產生或純化脫離。「經分離」之核酸、肽及蛋白質因此包括藉由標準純化方法純化之核酸及蛋白質。「經分離」核酸、肽及蛋白質可為組合物之一部分且在該組合物不為核酸、肽或蛋白質之天然環境之一部分時仍經分離。該術語亦涵蓋藉由於宿主細胞中重組表現而製備之核酸、肽及蛋白質以及以化學方式合成之核酸。
如本文所使用，術語「聚核苷酸」同義地稱為「核酸分子」、「核苷酸」或「核酸」，係指可為未經修飾之RNA或DNA或經修飾之RNA或DNA的任何聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸。「聚核苷酸」包括但不限於單股DNA及雙股DNA、作為單股區與雙股區之混合物的DNA、單股RNA及雙股RNA以及作為單股區與雙股區之混合物的RNA、包含可為單股區或更通常雙股區或單股區與雙股區之混合物的DNA及RNA之雜交分子。另外，「聚核苷酸」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者之三股區域。術語聚核苷酸亦包括含有一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有出於穩定性或出於其他原因而經修飾之主鏈的DNA或RNA。「經修飾」鹼基包括例如三苯甲基化鹼基及不常見之鹼基(諸如肌苷)。已對DNA及RNA進行多種修飾；因此，「聚核苷酸」涵蓋如典型地在自然界中發現之聚核苷酸的化學、酶促或代謝修飾形式，以及病毒及細胞所特有的DNA及RNA之化學形式。「聚核苷酸」亦涵蓋相對短之核酸鏈，常常稱為寡核苷酸。
如本文中所使用，術語「載體」為其中可以可操作方式插入另一核酸區段以便產生該區段之複製或表現的複製子。
如本文中所使用，術語「宿主細胞」係指包含本發明之核酸分子的細胞。「宿主細胞」可為任何類型之細胞，例如初級細胞、培養物中之細胞或來自細胞株之細胞。在一個實施例中，「宿主細胞」為轉染有本發明之核酸分子的細胞。在另一實施例中，「宿主細胞」為此類經轉染細胞之後代或潛在後代。細胞之後代與母細胞可能相同或可能不相同，例如歸因於後代可能出現突變或環境影響或核酸分子整合至宿主細胞基因體中。
如本文所使用之術語「表現」係指基因產物之生物合成。該術語涵蓋基因轉錄成RNA。該術語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多肽，且進一步涵蓋所有天然存在之轉錄後及轉譯後修飾。所表現之抗體可處於宿主細胞之細胞質內、進入諸如細胞培養物之生長培養基的胞外環境中或錨定至細胞膜。
如本文所使用，術語「肽」、「多肽」或「蛋白質」可指包含胺基酸之分子且可由熟習此項技術者辨識為蛋白質。本文使用胺基酸殘基之習知的單字母或三字母代碼。術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換地使用以指代任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可為線性或分支的，其可以包含經修飾之胺基酸，且其可間雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋經天然修飾或藉由干預修飾之胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、醣基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記組分結合。該定義亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)之多肽，以及此項技術中已知之其他修飾。
本文所描述之肽序列係根據常用慣例書寫，由此肽之N端區處於左側上且C端區處於右側上。儘管胺基酸之異構體形式係已知的，但除非另外明確指示，否則胺基酸以L-形式表示。
抗體
本發明大體上係關於經分離之B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)抗體、編碼該等抗體之核酸及表現載體、含有該等載體之重組細胞、表現該等抗體之重組細胞及包含該等抗體之組合物。亦揭示製備抗體之方法及使用抗體治療諸如癌症之疾病的方法。本發明之抗體具有一或多種所需功能特性，包括但不限於結合至BTLA之高親和力、針對BTLA之高特異性、阻斷疱疹病毒侵入介體(HVEM)與BTLA之結合的能力、抑制B細胞增殖及/或T細胞及/或漿細胞活化之能力、增加促炎性細胞介素產生之能力，及單獨或與其他抗癌療法組合投與時抑制個體及動物模型中之腫瘤生長的能力。促炎性細胞介素可包括但不限於介白素2 (IL-2)、C-X-C模體趨化介素配位體9 (CXCL9)、C-X-C模體趨化介素配位體10 (CXCL10)、介白素1β (IL1β)、腫瘤壞死因子α (TNFα)及干擾素γ。T細胞可包括但不限於CD4 T細胞、CD8 T細胞、Th1 T細胞、TFH T細胞、αβ T細胞及γδ T細胞。
在一個通用態樣中，本發明係關於結合B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)之經分離單株抗體或其抗原結合片段。
如本文所使用之術語「抗體」係在廣泛意義上使用且包括免疫球蛋白或抗體分子，包括人類、人源化、複合及嵌合的單株或多株抗體及抗體片段。一般而言，抗體為對特異性抗原展現結合特異性之蛋白質或肽鏈。抗體結構係熟知的。視重鏈恆定域胺基酸序列而定，免疫球蛋白可分成五個主要類別(亦即，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。IgA及IgG進一步細分類為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。因此，本發明之抗體可屬於五個主要類別或相應子類中的任一類。較佳地，本發明之抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。脊椎動物物種之抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列分為兩種明顯不同類型(亦即κ及λ)之一。因此，本發明之抗體可含有κ或λ輕鏈恆定域。根據特定實施例，本發明之抗體包括來自大鼠或人類抗體之重鏈及/或輕鏈恆定區。除重鏈恆定域及輕鏈恆定域之外，抗體含有由輕鏈可變區及重鏈可變區構成之抗原結合區，各可變區含有三個域(亦即，互補決定區1-3；CDR1、CDR2及CDR3)。輕鏈可變區域可替代地稱為LCDR1、LCDR2及LCDR3，且重鏈可變區域可替代地稱為HCDR1、HCDR2及HCDR3。
「互補決定區」(CDR)為結合抗原之抗體區。CDR可使用多種界定來定義，諸如Kabat((Wu等人.
J Exp Med132: 211-50, 1970) (Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)、Chothia (Chothia等人，J Mol Biol 196: 901-17, 1987)、IMGT (Lefranc等人，
Dev Comp Immunol27: 55-77, 2003)及AbM (Martin及Thornton
J Bmol Biol263: 800-15, 1996)。描述多種界定與可變區編號之間的對應關係(參見例如Lefranc等人，
Dev Comp Immunol27: 55-77, 2003；Honegger及Pluckthun,
J Mol Biol309:657-70, 2001；國際免疫遺傳學(IMGT)資料庫(International ImMunoGeneTics (IMGT) database)；網路資源，http://www_imgt_org)。可獲得的程式(諸如UCL Business PLC之abYsis)可用於界定CDR。除非在本說明書另外明確地陳述，否則如本文中所使用之術語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」及「LCDR3」包括由上文所描述方法(Kabat、Chothia、IMGT或AbM)中任一者定義的CDR。編號系統(包括例如Kabat編號及IMGT獨特編號系統)之間的對應關係為熟習此項技術者熟知(參見例如Kabat；Chothia；Martin；Lefranc等人)。
表1
| IMGT | Kabat | AbM | Chothia | |
| V HCDR1 | 27-38 | 31-35 | 26-35 | 26-32 |
| V HCDR2 | 56-65 | 50-65 | 50-58 | 53-55 |
| V HCDR3 | 105-117 | 95-102 | 95-102 | 96-101 |
| V LCDR1 | 27-38 | 24-34 | 24-34 | 26-32 |
| V LCDR2 | 56-65 | 50-56 | 50-56 | 50-52 |
| V LCDR3 | 105-117 | 89-97 | 89-97 | 91-96 |
如本文所使用，「經分離抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如，特異性結合至BTLA之經分離抗體實質上不含不結合至BTLA的抗體)。另外，經分離抗體實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
如本文所使用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體群體獲得之抗體，亦即除可以少量存在的可能天然存在之突變以外，包含該群體之個別抗體為相同的。本發明之單株抗體可藉由融合瘤方法、噬菌體呈現技術、單一淋巴球基因選殖技術或藉由重組DNA方法製造。舉例而言，單株抗體可藉由融合瘤產生，該融合瘤包括自具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因體的諸如基因轉殖小鼠或大鼠之基因轉殖非人類動物獲得之B細胞。
如本文所用，術語「抗原結合片段」係指抗體片段，諸如例如雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、(dsFv)
2、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定性雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、單域抗體(sdab)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、由包含一或多個CDR之抗體的一部分形成之多特異性抗體、駱駝單域抗體、奈米抗體、域抗體、二價域抗體、或結合於抗原但不包含完整抗體結構之任何其他抗體片段。抗原結合片段能夠結合至與親本抗體或親本抗體片段結合之相同抗原。根據特定實施例，抗原結合片段包含輕鏈可變區、輕鏈恆定區及重鏈之Fd段。根據其他特定實施例，抗原結合片段包含Fab及F(ab')。
如本文所使用，術語「單鏈抗體」係指本領域中之習知單鏈抗體，其包含藉由具有約15至約20個胺基酸之短肽連接之重鏈可變區及輕鏈可變區。
如本文所使用，術語「單域抗體」係指本領域中之習知單域抗體，其包含重鏈可變區及重鏈恆定區或僅包含重鏈可變區。
如本文所使用，術語「人類抗體」係指人類產生之抗體或使用此項技術中已知之任何技術製造的具有與人類產生之抗體對應之胺基酸序列的抗體。此人類抗體之定義包括完整或全長抗體、其片段及/或包含至少一種人類重鏈及/或輕鏈多肽之抗體。
如本文中所使用，術語「人源化抗體」及/或「人源化抗原結合域」係指經修飾以增加與人類抗體之序列同源性的非人類抗體，使得保持抗體之抗原結合特性，但降低其在人體內之抗原性。
如本文所使用，術語「嵌合抗體」係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列衍生自兩種或更多種物種的抗體。輕鏈及重鏈兩者之可變區常常對應於衍生自一個哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)之具有所需特異性、親和力及能力的抗體可變區，而恆定區對應於衍生自另一哺乳動物物種(例如人類)之抗體序列，以避免在該物種中引發免疫反應。
如本文所使用，術語「多特異性抗體」係指包含複數個免疫球蛋白可變域序列之抗體，其中該複數個免疫球蛋白可變域序列中之第一免疫球蛋白可變域序列對第一抗原決定基具有結合特異性且該複數個免疫球蛋白可變域序列中之第二免疫球蛋白可變域序列對第二抗原決定基具有結合特異性。在一實施例中，第一及第二抗原決定基位於同一抗原上，例如同一蛋白質(或多聚蛋白質之亞單元)。在一實施例中，第一抗原決定基與第二抗原決定基重疊或實質上重疊。在一實施例中，第一抗原決定基與第二抗原決定基不重疊或實質上不重疊。在一實施例中，第一及第二抗原決定基位於不同抗原上，例如不同蛋白質(或多聚體蛋白質之不同亞單元)上。在一實施例中，多特異性抗體包含第三、第四或第五免疫球蛋白可變域。在一實施例中，多特異性抗體為雙特異性抗體分子、三特異性抗體分子或四特異性抗體分子。
如本文所用，術語「雙特異性抗體」係指結合不超過兩個抗原決定基或兩個抗原的多特異性抗體。雙特異性抗體之特徵在於第一免疫球蛋白可變域序列對第一抗原決定基具有結合特異性且第二免疫球蛋白可變域序列對第二抗原決定基具有結合特異性。在一實施例中，第一及第二抗原決定基位於同一抗原上，例如同一蛋白質(或多聚蛋白質之亞單元)。在一實施例中，第一抗原決定基與第二抗原決定基重疊或實質上重疊。在一實施例中，第一及第二抗原決定基位於不同抗原上，例如不同蛋白質(或多聚體蛋白質之不同亞單元)上。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一抗原決定基具有結合特異性之重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列以及對第二抗原決定基具有結合特異性之重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一抗原決定基具有結合特異性之半抗體或其片段以及對第二抗原決定基具有結合特異性之半抗體或其片段。在一實施例中，雙特異性抗體包含對第一抗原決定基具有結合特異性之scFv或其片段以及對第二抗原決定基具有結合特異性之scFv或其片段。在一實施例中，第一抗原決定基位於BTLA上且第二抗原決定基位於PD-1、PD-L1、CTLA -4、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD33、CD3及/或其他腫瘤相關之免疫抑制劑或表面抗原上。
如本文中所使用，「特異性結合至BTLA」之抗體係指抗體及/或抗原結合域以1×10
− 7M或更小、較佳地1×10
− 8M或更小、更佳地5×10
− 9M或更小、1×10
− 9M或更小、5×10
− 10M或更小，或1×10
− 10M或更小之KD結合至BTLA，較佳地人類BTLA。在某些實施例中，抗體及/或抗原結合域結合至食蟹獼猴BTLA。術語「KD」係指解離常數，其係自Kd與Ka之比(亦即，Kd/Ka)獲得且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可鑒於本發明，使用此項技術中之方法測定。舉例而言，抗體之KD可以藉由使用表面電漿子共振，諸如藉由使用生物感測器系統，例如Biacore®系統，或藉由使用生物膜層干涉測量術，諸如Octet RED96系統測定。
抗體之KD值越小，則該抗體結合至目標抗原之親和力越高。在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段以小於約25 nM、20 nM、15 nM、5 nM、2 nM、1 nM或0.5 nM之K
D結合至人類BTLA。
如本文所使用，術語「IC
50」係指本發明之單株或雙特異性抗體或其抗原結合片段的半最大抑制濃度。IC
50為本發明之單株或雙特異性抗體或其抗原結合片段抑制HVEM之結合或抑制細胞中BTLA之功能的效能之量測值。在某些實施例中，單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之KD小於約10
-7M、小於約10
-8M、小於約10
-9M、小於約10
-10M、小於約10
-11M、小於約10
-12M或小於約10
-13M。
如本文所使用，術語「EC
50」係指本發明之單株或雙特異性抗體或其抗原結合片段的半最大有效濃度。EC
50係指單株或雙特異性抗體或其抗原結合片段在指定暴露時間內誘導基線與最大值之間一半的生物反應(亦即，細胞死亡)的濃度。在某些實施例中，單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之EC
50小於約1 μM、約1000 nM至約100 nM、約100 nM至約10 nM、約10 nM至約1 nM、約1000 pM至約500 pM、約500 pM至約200 pM、小於約200 pM、約200 pM至約150 pM、約200 pM至約100 pM、約100 pM至約10 pM或約10 pM至約1 pM。
根據一特定態樣，本發明係關於經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中單株抗體或其抗原結合片段或抗原結合域包含具有以下之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3：
(1) 分別為SEQ ID NO: 7、8、153、10、11及12；或
(2) 分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6；
其中該抗體或其抗原結合片段或其抗原結合域特異性結合B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)，較佳地人類BTLA，視情況該單株抗體或其抗原結合片段並非天然存在。SEQ ID NO:153由胺基酸序列CAREDGYPYYTLDX
1W表示，其中X
1為選自C、A、S、T或V之胺基酸。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有以下之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3：
(1) 分別為SEQ ID NO: 7、8、9、10、11及12；或
(2) 分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6；
其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)，較佳地人類BTLA，視情況該單株抗體或其抗原結合片段並非天然存在。
根據另一特定態樣，本發明係關於經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 15或13至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO: 16或14至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。根據一個較佳實施例，本發明之經分離單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有與SEQ ID NO: 13至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有與SEQ ID NO: 14至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。根據一個較佳實施例，本發明之經分離單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有與SEQ ID NO: 15至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有與SEQ ID NO: 16至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。
根據一特定實施例，經分離抗BTLA單株抗體或其抗原結合片段包含：
(1) 具有SEQ ID NO:15之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:16之多肽序列的輕鏈可變區；或
(2) 具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其分別包含具有SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。在另一實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 13至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有與SEQ ID NO: 14至少85%、較佳地90%更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。較佳地，經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 13之多肽序列的重鏈可變區；及具有SEQ ID NO: 14之多肽序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明係關於經分離單株抗體或其抗原結合片段，其分別包含具有SEQ ID NO:7、8、9、10、11及12之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。在另一實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO: 15至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有與SEQ ID NO: 16至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。較佳地，經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 15之多肽序列的重鏈可變區；及具有SEQ ID NO: 16之多肽序列的輕鏈可變區。
根據另一特定態樣，本發明係關於本發明之經分離單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中單株或雙特異性抗體或其抗原結合片段為嵌合的。
根據另一特定態樣，本發明係關於本發明之經分離單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中單株或雙特異性抗體或其抗原結合片段為人類或人源化的。
根據另一特定態樣，本發明係關於一種人源化單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有以下之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3：
(1) 分別為SEQ ID NO:7、8、150、10、11及12；
(2) 分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6；
(3) 分別為SEQ ID NO: 7、8、9、10、11及12；
(4) 分別為SEQ ID NO: 7、8、149、10、11及12；
(5) 分別為SEQ ID NO: 7、8、151、10、11及12；或
(6) 分別為SEQ ID NO: 7、8、152、10、11及12。
根據另一特定態樣，本發明係關於一種人源化單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:141、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145或147至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO:142、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146或148至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之多肽序列的輕鏈可變區。
根據另一特定態樣，人源化抗BTLA單株抗體或其抗原結合片段包含：
(1) 具有SEQ ID NO:141之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:142之多肽序列的輕鏈可變區；
(2) 具有SEQ ID NO:17之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:18之多肽序列的輕鏈可變區；
(3) 具有SEQ ID NO:19之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:20之多肽序列的輕鏈可變區；
(4) 具有SEQ ID NO:21之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:22之多肽序列的輕鏈可變區；
(5) 具有SEQ ID NO:23之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:24之多肽序列的輕鏈可變區；
(6) 具有SEQ ID NO:25之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:26之多肽序列的輕鏈可變區；
(7) 具有SEQ ID NO:27之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:28之多肽序列的輕鏈可變區；
(8) 具有SEQ ID NO:29之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:30之多肽序列的輕鏈可變區；
(9) 具有SEQ ID NO:31之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:32之多肽序列的輕鏈可變區；
(10) 具有SEQ ID NO:33之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:34之多肽序列的輕鏈可變區；
(11) 具有SEQ ID NO:35之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:36之多肽序列的輕鏈可變區；
(12) 具有SEQ ID NO:37之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:38之多肽序列的輕鏈可變區；
(13) 具有SEQ ID NO:39之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:40之多肽序列的輕鏈可變區；
(14) 具有SEQ ID NO:41之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:42之多肽序列的輕鏈可變區；
(15) 具有SEQ ID NO:43之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:44之多肽序列的輕鏈可變區；
(16) 具有SEQ ID NO:45之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:46之多肽序列的輕鏈可變區；
(17) 具有SEQ ID NO:47之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:48之多肽序列的輕鏈可變區；
(18) 具有SEQ ID NO:49之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:50之多肽序列的輕鏈可變區；
(19) 具有SEQ ID NO:51之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:52之多肽序列的輕鏈可變區；
(20) 具有SEQ ID NO:53之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:54之多肽序列的輕鏈可變區；
(21) 具有SEQ ID NO:55之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:56之多肽序列的輕鏈可變區；
(22) 具有SEQ ID NO:57之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:58之多肽序列的輕鏈可變區；
(23) 具有SEQ ID NO:59之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:60之多肽序列的輕鏈可變區；
(24) 具有SEQ ID NO:61之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:62之多肽序列的輕鏈可變區；
(25) 具有SEQ ID NO:63之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:64之多肽序列的輕鏈可變區；
(26) 具有SEQ ID NO:65之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:66之多肽序列的輕鏈可變區；
(27) 具有SEQ ID NO:67之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:68之多肽序列的輕鏈可變區；
(28) 具有SEQ ID NO:69之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:70之多肽序列的輕鏈可變區；
(29) 具有SEQ ID NO:71之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:72之多肽序列的輕鏈可變區；
(30) 具有SEQ ID NO:73之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:74之多肽序列的輕鏈可變區；
(31) 具有SEQ ID NO:75之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:76之多肽序列的輕鏈可變區；
(32) 具有SEQ ID NO:77之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:78之多肽序列的輕鏈可變區；
(33) 具有SEQ ID NO:79之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:80之多肽序列的輕鏈可變區；
(34) 具有SEQ ID NO:81之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:82之多肽序列的輕鏈可變區；
(35) 具有SEQ ID NO:83之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:84之多肽序列的輕鏈可變區；
(36) 具有SEQ ID NO:85之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:86之多肽序列的輕鏈可變區；
(37) 具有SEQ ID NO:87之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:88之多肽序列的輕鏈可變區；
(38) 具有SEQ ID NO:89之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:90之多肽序列的輕鏈可變區；
(39) 具有SEQ ID NO:91之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:92之多肽序列的輕鏈可變區；
(40) 具有SEQ ID NO:93之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:94之多肽序列的輕鏈可變區；
(41) 具有SEQ ID NO:95之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:96之多肽序列的輕鏈可變區；
(42) 具有SEQ ID NO:97之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:98之多肽序列的輕鏈可變區；
(43) 具有SEQ ID NO:99之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:100之多肽序列的輕鏈可變區；
(44) 具有SEQ ID NO:101之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:102之多肽序列的輕鏈可變區；
(45) 具有SEQ ID NO:103之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:104之多肽序列的輕鏈可變區；
(46) 具有SEQ ID NO:105之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:106之多肽序列的輕鏈可變區；
(47) 具有SEQ ID NO:107之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:108之多肽序列的輕鏈可變區；
(48) 具有SEQ ID NO:109之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:110之多肽序列的輕鏈可變區；
(49) 具有SEQ ID NO:111之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:112之多肽序列的輕鏈可變區；
(50) 具有SEQ ID NO:113之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:114之多肽序列的輕鏈可變區；
(51) 具有SEQ ID NO:115之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:116之多肽序列的輕鏈可變區；
(52) 具有SEQ ID NO:117之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:118之多肽序列的輕鏈可變區；
(53) 具有SEQ ID NO:119之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:120之多肽序列的輕鏈可變區；
(54) 具有SEQ ID NO:121之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:122之多肽序列的輕鏈可變區；
(55) 具有SEQ ID NO:123之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:124之多肽序列的輕鏈可變區；
(56) 具有SEQ ID NO:125之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:126之多肽序列的輕鏈可變區；
(57) 具有SEQ ID NO:127之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:128之多肽序列的輕鏈可變區；
(58) 具有SEQ ID NO:129之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:130之多肽序列的輕鏈可變區；
(59) 具有SEQ ID NO:131之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:132之多肽序列的輕鏈可變區；
(60) 具有SEQ ID NO:133之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:134之多肽序列的輕鏈可變區；
(61) 具有SEQ ID NO:135之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:136之多肽序列的輕鏈可變區；
(62) 具有SEQ ID NO:137之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:138之多肽序列的輕鏈可變區；
(63) 具有SEQ ID NO:139之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:140之多肽序列的輕鏈可變區；
(64) 具有SEQ ID NO:143之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:144之多肽序列的輕鏈可變區；
(65) 具有SEQ ID NO:145之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:146之多肽序列的輕鏈可變區；或
(66) 具有SEQ ID NO:147之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:148之多肽序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段，其分別包含具有SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。在另一實施例中，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有分別與SEQ ID NO: 17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有分別與SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56或58至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。較佳地，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有各別地SEQ ID NO: 17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57之多肽序列的重鏈可變區；及具有各別地SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56或58之多肽序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段，其分別包含具有SEQ ID NO:7、8、9、10 11及12之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。在另一實施例中，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有分別與SEQ ID NO: 59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97或99至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有分別與SEQ ID NO: 60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98或100至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。較佳地，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有各別地SEQ ID NO: 59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97或99之多肽序列的重鏈可變區；及具有各別地SEQ ID NO: 60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98或100之多肽序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段，其分別包含具有SEQ ID NO:7、8、149、10、11及12之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。在另一實施例中，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有分別與SEQ ID NO:101、109、117、125、127、129、131、133或135至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有分別與SEQ ID NO:102、110、118、126、128、130、132、134或136至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。較佳地，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有各別地SEQ ID NO:101、109、117、125、127、129、131、133或135之多肽序列的重鏈可變區；及具有各別地SEQ ID NO:102、110、118、126、128、130、132、134或136之多肽序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有各別地SEQ ID NO:7、8、150、10、11及12之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。在另一實施例中，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有分別與SEQ ID NO:103、111、119、137、139、141、143、145或147至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有分別與SEQ ID NO:104、112、120、138、140、142、144、146或148至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。較佳地，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有各別地SEQ ID NO:103、111、119、137、139、141、143、145或147之多肽序列的重鏈可變區；及具有各別地SEQ ID NO:104、112、120、138、140、142、144、146或148之多肽序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段，其分別包含具有SEQ ID NO:7、8、151、10、11及12之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。在另一實施例中，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有分別與SEQ ID NO:105、113或121至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有分別與SEQ ID NO:106、114或122至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。較佳地，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有各別地SEQ ID NO:105、113或121之多肽序列的重鏈可變區；及具有各別地SEQ ID NO:106、114或122之多肽序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本發明係關於一種經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段，其分別包含具有SEQ ID NO: 7、8、152、10、11及12之多肽序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。在另一實施例中，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有分別與SEQ ID NO:107、115或123至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的重鏈可變區，及具有分別與SEQ ID NO:108、116或124至少85%、較佳地90%、更佳地95%或更多(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致之多肽序列的輕鏈可變區。較佳地，經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段包含具有各別地SEQ ID NO:107、115或123之多肽序列的重鏈可變區；及具有各別地SEQ ID NO:108、116或124之多肽序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段為人類BTLA之促效劑且在結合至BTLA時活化BTLA之下游傳訊。
在某些實施例中，單株抗體或其抗原結合片段能夠抑制B細胞增殖及/或T細胞及/或漿細胞活化。T細胞可例如選自由以下組成之群：CD4 T細胞、CD8 T細胞、Th1 T細胞、TFH T細胞、αβ T細胞及γδ T細胞。
在某些實施例中，單株抗體或其抗原結合片段能夠阻斷或消除結合至疱疹病毒侵入介體(HVEM)之BTLA。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段結合至BTLA且能夠增加促炎性細胞介素產生，諸如(例如)干擾素γ (IFNγ)、介白素-2 (IL-2)、C-X-C模體趨化介素配位體9 (CXCL9)、C-X-C模體趨化介素配位體10 (CXCL10)、介白素1β (IL1β)及腫瘤壞死因子α (TNFα)。在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段能夠增加干擾素γ (IFNγ)、介白素-2 (IL-2)、C-X-C模體趨化介素配位體9 (CXCL9)、C-X-C模體趨化介素配位體10 (CXCL10)、介白素1β (IL1β)及/或腫瘤壞死因子α (TNFα)生產超過對照抗BTLA抗體或其抗原結合片段。如本文中所使用，對照抗BTLA抗體可為能夠結合BTLA且阻斷BTLA與HVEM之結合的抗體。本文所使用之對照抗體之實例可包括但不限於JS004抗BTLA抗體。
在另一通用態樣中，本發明係關於一種經分離核酸，其編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段。熟習此項技術者應瞭解，可改變(例如置換、缺失、插入等)蛋白質之編碼序列而不改變蛋白質之胺基酸序列。因此，熟習此項技術者應理解，編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段的核酸序列可改變而不改變蛋白質之胺基酸序列。
在另一通用態樣中，本發明係關於一種載體，其包含編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段的經分離核酸。可使用熟習此項技術者鑒於本發明已知之任何載體，諸如質體、黏質體、噬菌體載體或病毒載體。在一些實施例中，載體為諸如質體之重組表現載體。載體可包括用於建立表現載體之習知功能的任何元件，例如啟動子、核糖體結合元件、終止子、增強子、選擇標記物及複製起點。啟動子可為組成型、誘導型或可抑制型啟動子。能夠將核酸遞送至細胞之多種表現載體為此項技術中已知的且可在本文用於在細胞中產生抗體或其抗原結合片段。可使用習知的選殖技術或人工基因合成來產生根據本發明之實施例之重組表現載體。
在另一通用態樣中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段的經分離核酸。熟習此項技術者鑒於本發明已知之任何宿主細胞可用於重組表現本發明之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，宿主細胞為大腸桿菌TG1或BL21細胞(用於表現例如scFv或Fab抗體)、CHO-DG44或CHO-K1細胞或HEK293細胞(用於表現例如全長IgG抗體)。根據特定實施例，藉由諸如化學轉染、熱休克或電穿孔之習知方法將重組表現載體轉移至宿主細胞中，其中其經穩定整合於宿主細胞基因體中以使得有效地表現重組核酸。
在另一通用態樣中，本發明係關於一種產生本發明之單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段的方法，其包含在產生本發明之單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之核酸的細胞，及自細胞或細胞培養(例如，自上清液)回收單株及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段。表現之單株及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段可自細胞收集且根據此項技術中已知且如本文所描述之習知技術純化。
醫藥組合物
在另一通用態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含經分離單株抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體或其抗原結合片段、經分離聚核苷酸及/或本發明之分離多肽及醫藥學上可接受之載劑。
如本文中所使用之術語「醫藥組合物」意謂包含本發明之經分離聚核苷酸、本發明之分離多肽、抗BTLA單株抗體或其抗原結合片段及/或本發明之雙特異性抗體亦即醫藥學上可接受之載劑的產物。本發明之聚核苷酸、多肽、抗BTLA單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體及包含其之組合物亦適用於製造用於本文提及之治療性應用的藥劑。
如本文所使用，術語「載劑」係指任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑、油、脂質、含脂質之囊泡、微球體、脂質體囊封體或此項技術中熟知用於醫藥調配物中之其他材料。應理解，載劑、賦形劑或稀釋劑之特徵將視用於特定應用之投與途徑而定。如本文中所使用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指不干擾根據本發明之組合物之有效性或根據本發明之組合物之生物活性的無毒性物質。根據特定實施例，鑒於本發明，適用於抗體醫藥組合物的任何醫藥學上可接受之載劑可用於本發明。
醫藥活性成分與醫藥學上可接受之載劑的調配物係此項技術中已知的，例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (例如第21版(2005)及任何後續版本)。其他成分之非限制性實例包括緩衝劑、稀釋劑、溶劑、張力調控劑、防腐劑、穩定劑及螯合劑。一或多種醫藥學上可接受之載劑可用於調配本發明之醫藥組合物。
在本發明之一個實施例中，醫藥組合物為液體調配物。液體調配物之較佳實例為水性調配物，亦即包含水之調配物。液體調配物可包含溶液、懸浮液、乳液、微乳液、凝膠及類似者。水性調配物典型地包含至少50% w/w水或至少60%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95% w/w水。
在一個實施例中，醫藥組合物可調配為可例如經由注入裝置(例如，注射器或輸液泵)注射的可注射劑。舉例而言，注射可經皮下、肌內、腹膜內、玻璃體內或靜脈內遞送。
在另一實施例中，醫藥組合物為固體調配物，例如冷凍乾燥或噴霧乾燥組合物，其可按原樣使用或由醫師或患者在使用之前向其添加溶劑及/或稀釋劑。固體劑型可包括錠劑，諸如壓縮錠劑及/或包衣錠劑，及膠囊(例如，硬或軟明膠膠囊)。舉例而言，醫藥組合物亦可呈藥囊、糖衣藥丸、散劑、粒劑、口含錠或復原用散劑形式。
劑型可立即釋放，在此情況下其可包含水溶性或可分散載劑，或其可為延遲釋放、持續釋放或調節釋放，在此情況下其可包含調節劑型在胃腸道中或在皮膚下之溶解速率的不可溶於水之聚合物。
在其他實施例中，醫藥組合物可經鼻內、頰內或舌下遞送。
水性調配物中之pH可在pH 3與pH 10之間。在本發明之一個實施例中，調配物之pH為約7.0至約9.5。在本發明之另一實施例中，調配物之pH為約3.0至約7.0。
在本發明之另一實施例中，醫藥組合物包含緩衝液。緩衝劑之非限制性實例包括：精胺酸、天冬胺酸、二羥乙甘胺酸、檸檬酸鹽、磷酸氫二鈉、反丁烯二酸、甘胺酸、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、離胺酸、順丁烯二酸、蘋果酸、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉、丁二酸鹽、酒石酸、麥黃酮及參(羥基甲基)-胺基甲烷及其混合物。緩衝液可單獨地存在或以約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在於聚集物中。包含此等特異性緩衝液中之每一者的醫藥組合物構成本發明之替代實施例。
在本發明之另一實施例中，醫藥組合物包含防腐劑。防腐劑之非限制性實例包括：氯化苯索銨、苯甲酸、苯甲醇、溴硝醇、4-羥基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己定、氯苯甘油醚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、4-羥基苯甲酸乙酯、咪唑烷脲(imidurea)、4-羥基苯甲酸甲酯、酚、2-苯氧基乙醇、2-苯乙醇、4-羥基苯甲酸丙酯、脫氫乙酸鈉、硫柳汞(thiomerosal)及其混合物。防腐劑可單獨地存在或以約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在於聚集物中。包含此等特異性防腐劑中之每一者的醫藥組合物構成本發明之替代實施例。
在本發明之另一實施例中，醫藥組合物包含等張劑。等張劑之非限制性實例包括鹽(諸如氯化鈉)、胺基酸(諸如甘胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、色胺酸及蘇胺酸)、醛醇(諸如甘油、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇及1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，PEG400)及其混合物。等張劑之另一實例包括糖。糖之非限制性實例可為單醣、二醣或多醣，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、聚葡萄糖、普魯蘭(pullulan)、糊精、環糊精、α及β-HPCD、可溶澱粉、羥乙基澱粉及羧甲基纖維素鈉。等張劑之另一實例為糖醇，其中術語「糖醇」定義為具有至少一個-OH基團之C(4-8)烴。糖醇之非限制性實例包括甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛矛醇(dulcitol)、木糖醇及阿拉伯糖醇。等張劑可單獨地存在或以約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在於聚集物中。包含此等特異性等張劑中之每一者的醫藥組合物構成本發明之替代實施例。
在本發明之另一實施例中，醫藥組合物包含螯合劑。螯合劑之非限制性實例包括檸檬酸、天冬胺酸、乙二胺四乙酸(EDTA)之鹽及其混合物。螯合劑可單獨地存在或以約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在於聚集物中。包含此等特異性螯合劑中之每一者的醫藥組合物構成本發明之替代實施例。
在本發明之另一實施例中，醫藥組合物包含穩定劑。穩定劑之非限制性實例包括一或多種聚集抑制劑、一或多種氧化抑制劑、一或多種界面活性劑及/或一或多種蛋白酶抑制劑。
在本發明之另一實施例中，醫藥組合物包含穩定劑，其中該穩定劑為羧基纖維素/羥基纖維素及其衍生物(諸如HPC、HPC-SL、HPC-L及HPMC)、環糊精、2-甲基硫代乙醇、聚乙二醇(諸如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯啶酮、鹽(諸如氯化鈉)、含硫之物質，諸如單硫代甘油或硫代乙醇酸。穩定劑可單獨地存在或以約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度處在於聚集物中。包含此等特異性穩定劑中之每一者的醫藥組合物構成本發明之替代實施例。
在本發明之其他實施例中，醫藥組合物包含一或多種界面活性劑，較佳地界面活性劑、至少一種界面活性劑或兩種不同界面活性劑。術語「界面活性劑(surfactant)」係指任何包含水可溶(親水性)部分及脂肪可溶(親脂性)部分之分子或離子。界面活性劑可例如選自由以下組成之群：陰離子型界面活性劑、陽離子型界面活性劑、非離子型界面活性劑及/或兩性離子型界面活性劑。界面活性劑可單獨地存在或以約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在於聚集物中。包含此等特異性界面活性劑中之每一者的醫藥組合物構成本發明之替代實施例。
在本發明之另一實施例中，醫藥組合物包含一或多種蛋白酶抑制劑，諸如(例如) EDTA及/或苯甲脒鹽酸(HCl)。蛋白酶抑制劑可單獨地存在或以約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在於聚集物中。包含此等特異性蛋白酶抑制劑中之每一者的醫藥組合物構成本發明之替代實施例。
在另一通用態樣中，本發明係關於一種產生包含本發明之單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物的方法，其包含將單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段與醫藥學上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組合物。
使用方法
在另一通用態樣中，本發明係關於一種治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與包含本發明之抗BTLA單株及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物。在某些實施例中，癌症為實體腫瘤，較佳為具有浸潤性T細胞之實體腫瘤，更佳為具有浸潤性T效應細胞之實體腫瘤，更佳為具有表現BTLA之T效應細胞的實體腫瘤，最佳為具有表現BTLA之浸潤性T效應細胞及在腫瘤微環境中高度表現之BTLA配位體HVEM的實體腫瘤。癌症可例如選自但不限於黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌及肝癌。
在另一通用態樣中，本發明係關於一種靶向個體之癌細胞表面上之BTLA以達成細胞殺滅的方法，該方法包含向該個體投與特異性結合至BTLA之經分離單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段或包含本發明之經分離單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物。抗BTLA單株或雙特異性抗體或抗原結合片段與BTLA之結合可阻斷疱疹病毒侵入介體(HVEM)與BTLA之結合；在結合至BTLA之時活化BTLA之下游傳訊；可抑制B細胞增殖及/或T細胞及/或漿細胞活化；增加促炎性細胞介素產生，諸如例如IL-2、CXCL9、CXCL10、IL1β及TNFα。單株或雙特異性抗體或其抗原結合片段可例如用以募集結合藥物，及/或可與介導所靶向癌細胞之死亡的另一單株抗體形成雙特異性抗體。
抗BTLA單株或雙特異性抗體或抗原結合片段與BTLA之結合可增加促炎性細胞介素產生(諸如例如IL-2、CXCL9、CXCL10、IL1β及TNFα)超過對照抗BTLA單株或雙特異性抗體或其抗原結合片段。如本文中所使用，對照抗BTLA抗體可為能夠結合BTLA且阻斷BTLA與HVEM之結合的抗體。本文所使用之對照抗體之實例可包括但不限於JS004抗BTLA抗體。
結合BTLA之抗體及其抗原結合片段之功能活性可藉由此項技術中已知且如本文所描述之方法表徵。用於表徵結合BTLA之抗體及其抗原結合片段的方法包括但不限於親和力及特異性分析，包括Biacore、ELISA及OctetRed分析，及藉由FACS偵測抗體及抗原結合片段與細胞(經BTLA轉染之細胞或自然表現BTLA之細胞)上之BTLA的結合。根據特定實施例，用於表徵結合BTLA之抗體及其抗原結合片段的方法包括下文所描述之彼等者。
在另一通用態樣中，本發明係關於一種治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與特異性結合BTLA之經分離單株抗體或其抗原結合片段及/或雙特異性抗體或其抗原結合片段或本發明之醫藥組合物。癌症可例如選自由以下組成之群：黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌及肝癌。
如本文中參考抗BTLA抗體或其抗原結合片段所使用，治療有效量意謂調節有需要之個體之免疫反應的抗BTLA抗體或其抗原結合片段之量。另外，如本文中參考抗BTLA抗體或其抗原結合片段所使用，治療有效量意謂引起治療疾病、病症或病狀；預防或減緩疾病、病症或病狀之進展；或減少或完全減輕與疾病、病症或病狀相關之症狀的抗BTLA抗體或其抗原結合片段之量。
根據特定實施例，待治療之疾病、病症或病狀為癌症。癌症可例如為黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌及肝癌。
根據特定實施例，治療有效量係指足以實現以下作用中之一者、兩者、三者、四者或更多者的治療劑之量：(i)降低或減輕待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀之嚴重程度；(ii)縮短待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀之持續時間；(iii)防止待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀之進展；(iv)使得待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀消退；(v)防止待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀之發展或發作；(vi)防止待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀之復發；(vii)減少患有待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀之個體住院；(viii)縮減患有待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀之個體的住院時長；(ix)延長患有待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀之個體的存活期；(xi)抑制或減輕個體中待治療之疾病、病症或病狀或其相關症狀；及/或(xii)增強或改善另一治療劑之防治性或治療作用。
治療有效量或劑量可根據諸如以下之多種因素而變化：待治療之疾病、病症或病狀、投與方式、目標部位、個體之生理狀態(包括例如年齡、體重、健康狀況)、個體為人類抑或動物、所投與之其他藥物及治療為防治性的抑或治療性的。治療劑量經最佳滴定以使安全及功效最佳化。
根據特定實施例，本文所描述之組合物經調配以適用於針對個體之預期投與途徑。舉例而言，本文所描述之組合物可經調配以適用於靜脈內、皮下或肌內投與。
如本文所使用，術語「治療(treat/treating/treatment)」全部意指至少一種與癌症相關之可量測物理參數之改善或逆轉，該參數在個體中並非必需為可辯別的，但在個體中可為可辯別的。術語「治療(treat/treating/treatment)」亦可指引起疾病、病症或病狀消退，預防疾病、病症或病狀惡化，或至少減緩疾病、病症或病狀惡化。在一特定實施例中，「治療(treat/treating/treatment)」係指緩解一或多種與諸如腫瘤或更佳地癌症之疾病、病症或病狀相關之症狀、預防其發展或發作，或縮短其持續時間。在一特定實施例中，「治療(treat/treating/treatment)」係指預防疾病、病症或病狀復發。在一特定實施例中，「治療(treat/treating/treatment)」係指延長患有疾病、病症或病狀之個體之存活期。在一特定實施例中，「治療(treat/treating/treatment)」係指消除個體之疾病、病症或病狀。
根據特定實施例，提供用於治療癌症之組合物。對於癌症療法，所提供之組合物可與包括但不限於以下之另一治療組合使用：化學療法、抗CD20 mAb、抗EGFR mAb、抗HER-2 mAb、抗CD19 mAb、抗CD33 mAb、抗CD47 mAb、抗CD73 mAb、抗PD-1 mAb、抗PD-L1 mAb、抗CTLA mAb、抗TNFR2 mAb、抗OX40 mAb、其他免疫腫瘤學藥物、抗血管生成劑、輻射療法、抗體-藥物結合物(ADC)、靶向療法、其他抗癌藥物及/或靶向包括但不限於PD1及PD-L1之免疫調節目標的治療。針對BTLA之抗體可用以與針對PD-1、PD-L1、CTLA -4、CTLA、TNFR2、OX40、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD33、CD73、CD47及/或CD3之配偶體mAb構築雙特異性抗體。識別BTLA上之兩種不同抗原決定基的兩種抗體亦可用以構築雙特異性抗體以治療表現BTLA之癌症/腫瘤。
如本文中所使用，術語「組合(in combination)」在向個體投與兩種或更多種療法之上下文中係指使用超過一種療法。 使用術語「組合」不限制向個體投與療法之次序。舉例而言，第一治療劑(例如，本文所描述之組合物)可在向個體投與第二治療劑之前(例如之前5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週)投與、與其同時投與，或在其之後(例如之後5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週)投與。
在另一通用態樣中，本發明係關於一種測定個體中BTLA之含量的方法。該等方法包含(a)自個體獲得樣本；(b)使該樣本與本發明之單株抗體或其抗原結合片段接觸；及(c)測定個體中BTLA之含量。
如本文中所使用，「樣本(sample)」係指自個體分離之生物樣本且可包括但不限於全血、血清、血漿、血球、內皮細胞、組織活檢體(例如，癌症組織)、淋巴液、腹水液、間質液、骨髓、腦脊髓液、唾液、黏液、痰、汗液、尿液或任何其他分泌液、排泄物或其他體液。「血液樣本」係指全血或其任何餾份，包括血球、血清及血漿。樣本可例如包含Treg細胞。
在某些實施例中，個體中BTLA之含量可利用選自但不限於西方墨點法分析、免疫組織化學(IHC)及ELISA之分析測定。相對蛋白質含量可藉由利用西方墨點分析及IHC測定，且絕對蛋白質含量可藉由利用ELISA測定。當測定BTLA之相對含量時，可在至少兩個樣本之間測定BTLA之含量，例如，在不同時間點來自個體的樣本之間、在來自同一個體之不同組織的樣本之間及/或在來自不同個體之樣本之間。替代地，當藉由諸如ELISA測定BTLA之絕對含量時，樣本中BTLA之絕對含量可藉由在測試樣本之前建立ELISA之標準來測定。熟習此項技術者應瞭解，該等分析技術用於利用本發明之抗體或其抗原結合片段來測定來自個體之樣本中BTLA之含量。
利用測定來自個體之樣本中BTLA之含量的方法可使得診斷疾病中之異常(升高、降低或不足) BTLA含量及作出適當的治療決策。此類疾病可為癌症。另外藉由監測個體中BTLA之含量，罹患如上文所指示之疾病的風險可基於知曉特定疾病中及/或在特定疾病之進展期間BTLA之含量而判定。
實施例
本發明亦提供以下非限制性實施例。
實施例1為一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有以下之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3：
(1) 各別地SEQ ID NO: 7、8、153、10、11及12；或
(2) 各別地SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6；
其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合BTLA，較佳地特異性結合人類BTLA，視情況該單株抗體或其抗原結合片段並非天然存在。
實施例2為一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有以下之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3：
(1) 各別地SEQ ID NO: 7、8、9、10、11及12；或
(2) 各別地SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6；
其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合BTLA，較佳地特異性結合人類BTLA，視情況該單株抗體或其抗原結合片段並非天然存在。
實施例3為如實施例1或2之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有與SEQ ID NO: 15或13至少95%一致之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO: 16或14至少95%一致之多肽序列的輕鏈可變區。
實施例4為如實施例1至3中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：
(1) 具有SEQ ID NO:15之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:16之多肽序列的輕鏈可變區；或
(2) 具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變區。
實施例5為如實施例1至4中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合及/或人類或人源化的。
實施例6為如實施例5之經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段，其中該經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有以下之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3：
(1) 各別地SEQ ID NO:7、8、150、10、11及12；
(2) 各別地SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6；
(3) 各別地SEQ ID NO: 7、8、9、10、11及12；
(4) 各別地SEQ ID NO: 7、8、149、10、11及12；
(5) 各別地SEQ ID NO: 7、8、151、10、11及12；或
(6) 各別地SEQ ID NO: 7、8、152、10、11及12。
實施例7為如實施例6之經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段，其中該經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:141、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145或147至少95%一致之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO:142、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146或148至少95%一致之多肽序列的輕鏈可變區。
實施例8為如實施例7之經分離人源化單株抗體或其抗原結合片段，其中該經分離單株抗體或其抗原結合片段包含：
(1) 具有SEQ ID NO:141之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:142之多肽序列的輕鏈可變區；
(2) 具有SEQ ID NO:17之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:18之多肽序列的輕鏈可變區；
(3) 具有SEQ ID NO:19之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:20之多肽序列的輕鏈可變區；
(4) 具有SEQ ID NO:21之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:22之多肽序列的輕鏈可變區；
(5) 具有SEQ ID NO:23之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:24之多肽序列的輕鏈可變區；
(6) 具有SEQ ID NO:25之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:26之多肽序列的輕鏈可變區；
(7) 具有SEQ ID NO:27之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:28之多肽序列的輕鏈可變區；
(8) 具有SEQ ID NO:29之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:30之多肽序列的輕鏈可變區；
(9) 具有SEQ ID NO:31之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:32之多肽序列的輕鏈可變區；
(10) 具有SEQ ID NO:33之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:34之多肽序列的輕鏈可變區；
(11) 具有SEQ ID NO:35之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:36之多肽序列的輕鏈可變區；
(12) 具有SEQ ID NO:37之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:38之多肽序列的輕鏈可變區；
(13) 具有SEQ ID NO:39之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:40之多肽序列的輕鏈可變區；
(14) 具有SEQ ID NO:41之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:42之多肽序列的輕鏈可變區；
(15) 具有SEQ ID NO:43之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:44之多肽序列的輕鏈可變區；
(16) 具有SEQ ID NO:45之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:46之多肽序列的輕鏈可變區；
(17) 具有SEQ ID NO:47之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:48之多肽序列的輕鏈可變區；
(18) 具有SEQ ID NO:49之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:50之多肽序列的輕鏈可變區；
(19) 具有SEQ ID NO:51之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:52之多肽序列的輕鏈可變區；
(20) 具有SEQ ID NO:53之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:54之多肽序列的輕鏈可變區；
(21) 具有SEQ ID NO:55之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:56之多肽序列的輕鏈可變區；
(22) 具有SEQ ID NO:57之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:58之多肽序列的輕鏈可變區；
(23) 具有SEQ ID NO:59之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:60之多肽序列的輕鏈可變區；
(24) 具有SEQ ID NO:61之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:62之多肽序列的輕鏈可變區；
(25) 具有SEQ ID NO:63之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:64之多肽序列的輕鏈可變區；
(26) 具有SEQ ID NO:65之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:66之多肽序列的輕鏈可變區；
(27) 具有SEQ ID NO:67之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:68之多肽序列的輕鏈可變區；
(28) 具有SEQ ID NO:69之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:70之多肽序列的輕鏈可變區；
(29) 具有SEQ ID NO:71之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:72之多肽序列的輕鏈可變區；
(30) 具有SEQ ID NO:73之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:74之多肽序列的輕鏈可變區；
(31) 具有SEQ ID NO:75之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:76之多肽序列的輕鏈可變區；
(32) 具有SEQ ID NO:77之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:78之多肽序列的輕鏈可變區；
(33) 具有SEQ ID NO:79之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:80之多肽序列的輕鏈可變區；
(34) 具有SEQ ID NO:81之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:82之多肽序列的輕鏈可變區；
(35) 具有SEQ ID NO:83之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:84之多肽序列的輕鏈可變區；
(36) 具有SEQ ID NO:85之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:86之多肽序列的輕鏈可變區；
(37) 具有SEQ ID NO:87之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:88之多肽序列的輕鏈可變區；
(38) 具有SEQ ID NO:89之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:90之多肽序列的輕鏈可變區；
(39) 具有SEQ ID NO:91之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:92之多肽序列的輕鏈可變區；
(40) 具有SEQ ID NO:93之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:94之多肽序列的輕鏈可變區；
(41) 具有SEQ ID NO:95之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:96之多肽序列的輕鏈可變區；
(42) 具有SEQ ID NO:97之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:98之多肽序列的輕鏈可變區；
(43) 具有SEQ ID NO:99之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:100之多肽序列的輕鏈可變區；
(44) 具有SEQ ID NO:101之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:102之多肽序列的輕鏈可變區；
(45) 具有SEQ ID NO:103之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:104之多肽序列的輕鏈可變區；
(46) 具有SEQ ID NO:105之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:106之多肽序列的輕鏈可變區；
(47) 具有SEQ ID NO:107之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:108之多肽序列的輕鏈可變區；
(48) 具有SEQ ID NO:109之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:110之多肽序列的輕鏈可變區；
(49) 具有SEQ ID NO:111之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:112之多肽序列的輕鏈可變區；
(50) 具有SEQ ID NO:113之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:114之多肽序列的輕鏈可變區；
(51) 具有SEQ ID NO:115之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:116之多肽序列的輕鏈可變區；
(52) 具有SEQ ID NO:117之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:118之多肽序列的輕鏈可變區；
(53) 具有SEQ ID NO:119之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:120之多肽序列的輕鏈可變區；
(54) 具有SEQ ID NO:121之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:122之多肽序列的輕鏈可變區；
(55) 具有SEQ ID NO:123之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:124之多肽序列的輕鏈可變區；
(56) 具有SEQ ID NO:125之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:126之多肽序列的輕鏈可變區；
(57) 具有SEQ ID NO:127之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:128之多肽序列的輕鏈可變區；
(58) 具有SEQ ID NO:129之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:130之多肽序列的輕鏈可變區；
(59) 具有SEQ ID NO:131之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:132之多肽序列的輕鏈可變區；
(60) 具有SEQ ID NO:133之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:134之多肽序列的輕鏈可變區；
(61) 具有SEQ ID NO:135之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:136之多肽序列的輕鏈可變區；
(62) 具有SEQ ID NO:137之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:138之多肽序列的輕鏈可變區；
(63) 具有SEQ ID NO:139之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:140之多肽序列的輕鏈可變區；
(64) 具有SEQ ID NO:143之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:144之多肽序列的輕鏈可變區；
(65) 具有SEQ ID NO:145之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:146之多肽序列的輕鏈可變區；或
(66) 具有SEQ ID NO:147之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:148之多肽序列的輕鏈可變區。
實施例9為如實施例1至8中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段以小於約25 nM、20 nM、15 nM、5 nM、2 nM、1 nM或0.5 nM之K
D結合至人類BTLA。
實施例10為如實施例1至8中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段為人類BTLA之促效劑且在結合至BTLA時活化BTLA之下游傳訊。
實施例11為如實施例1至8中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段能夠抑制B細胞增殖及/或T細胞及/或漿細胞活化。
實施例12為如實施例11之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該T細胞係選自由以下組成之群：CD4 T細胞、CD8 T細胞、Th1 T細胞、TFH T細胞、αβ T細胞及γδ T細胞。
實施例13為如實施例1至8中任一項之經分離單株抗體或抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段能夠阻斷或消除結合至疱疹病毒侵入介體(HVEM)之BTLA。
實施例14為如實施例1至8中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段能夠增加促炎性細胞介素產生；及/或調節結合藥物之募集；及/或與具有殺滅癌症作用之另一mAb或其抗原結合片段形成雙特異性抗體。
實施例15為如實施例14之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該促炎性細胞介素係選自干擾素γ (IFNγ)、介白素-2 (IL-2)、C-X-C模體趨化介素配位體9 (CXCL9)、C-X-C模體趨化介素配位體10 (CXCL10)、介白素1β (IL1β)及/或腫瘤壞死因子α (TNFα)。
實施例16為如實施例1至15中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段特異性結合食蟹獼猴BTLA。
實施例17為一種經分離雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含如實施例1至16中任一項之單株抗體或其抗原結合片段。
實施例18為一種經分離核酸，其編碼如實施例1至16中任一項之單株抗體或抗原結合片段。
實施例19為一種經分離核酸，其編碼如實施例17之雙特異性抗體或其抗原結合片段。
實施例20為一種載體，其包含如實施例18或19之經分離核酸。
實施例21為一種宿主細胞，其包含如實施例20之載體。
實施例22為一種醫藥組合物，其包含如實施例1至16中任一項之經分離單株抗體或抗原結合片段或如實施例17之雙特異性抗體或其抗原結合片段，及醫藥學上可接受之載劑。
實施例23為一種靶向癌細胞表面上之BTLA及/或治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該有需要之個體投與如實施例22之醫藥組合物。
實施例24為如實施例23之方法，其中該癌症為實體腫瘤，較佳為具有浸潤性T細胞之實體腫瘤，更佳為具有浸潤性T效應細胞之實體腫瘤，更佳為具有表現BTLA之T效應細胞的實體腫瘤，最佳為具有表現BTLA之浸潤性T效應細胞及在腫瘤微環境中高度表現之BTLA配位體HVEM的實體腫瘤。
實施例25為如實施例23或24之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌及肝癌。
實施例26為如實施例23至25中任一項之方法，其中該個體包含表現BTLA之T細胞、B細胞、樹突狀細胞(DC)或自然殺手(NK)細胞。
實施例27為如實施例23至26中任一項之方法，其中該醫藥組合物進一步包含第二抗癌劑。
實施例28為如實施例27之方法，其中該第二抗癌劑為抗-PD-1抗體或其抗原結合片段。
實施例29為一種產生如實施例1至16中任一項之單株抗體或抗原結合片段或如實施例17之雙特異性抗體或其抗原結合片段的方法，其包含在產生該單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼該單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之核酸的細胞，及自該細胞或培養物回收該單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段。
實施例30為一種產生包含如實施例1至16中任一項之單株抗體或其抗原結合片段或如實施例17之雙特異性抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物的方法，其包含將該單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段與醫藥學上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組合物。
實施例31為一種測定個體中BTLA之含量的方法，該方法包含：
a. 自該個體獲得樣本；
b. 使該樣本與如實施例1至16中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段接觸；及
c. 測定該個體中BTLA之含量。
實施例32為如實施例31之方法，其中該樣本為組織樣本或血液樣本，視情況其中該組織樣本為癌症組織樣本。
實施例33為如實施例31之方法，其中該樣本包含T細胞、B細胞、樹突狀細胞(DC)或自然殺手(NK)細胞。
實例
實例
1
：
鑑別與食蟹獼猴
BTLA
交叉反應之抗人類
BTLA
阻斷抗體。
此實例描述兩種小鼠主導抗體候選物-HFB6-2及HFB6-3 (下表2至5中所描述之序列)之鑑別-基於其將HVEM介導之T細胞抑制逆轉至與基準抗BTLA阻斷抗體(在本文中稱為JS004)類似程度的能力。
表2：藉由IMGT方法所測定的抗BTLA mAb之重鏈的CDR區1至3。
| VH | HC CDR1 | SEQ ID NO: | HC CDR2 | SEQ ID NO: | HC CDR3 | SEQ ID NO: |
| HFB6-2 | CTASGVNIKDTYMYW | 1 | GRIDPANGYTRYD | 2 | CAVNDGYFEYFDVW | 3 |
| HFB6-3 | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDCW | 9 |
表3：藉由IMGT方法所測定的抗BTLA mAb之輕鏈之CDR區1至3。
| VL | VL CDR1 | SEQ ID NO: | VL CDR2 | SEQ ID NO: | VL CDR3 | SEQ ID NO: |
| HFB6-2 | CKSSQSLLDSDGKPYLNW | 4 | LVSKLDS | 5 | CWQDTHFPRTF | 6 |
| HFB6-3 | CKSSQSLLDVDGKTYLNW | 10 | LVSKLDS | 11 | CWQGTHFPRTF | 12 |
表4：抗BTLA mAb之重鏈可變區之序列。
| mAb 殖株 | VH 序列 | SEQ ID NO: |
| HFB6-2 | EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGVNIKDTYMYWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGYTRYDPKFQDKATVTADTSSNTAHLQLSSLTSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGAGTTVTVSS | 13 |
| HFB6-3 | EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTDSGFNIKDTYIHWVTQRPQQGLEWIGRIDPANGFTRYDPKFQGKATITSDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTSVTVSS | 15 |
表5：抗BTLA mAb之輕鏈可變區之序列。
| mAb 殖株 | VL 序列 | SEQ ID NO: |
| HFB6-2 | DVVMTQAPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKPYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQDTHFPRTFGGGTKLEIK | 14 |
| HFB6-3 | DVVMTQSPLTLSLTIGQPASISCKSSQSLLDVDGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK | 16 |
在HVEM-BTLA阻斷報導子分析中，將經工程改造以表現TCR活化物(TCRa)及HVEM (BTLA之配位體)的CHO細胞株與表現BTLA之Jurkat報導子細胞株及由NFAT結合啟動子驅動之螢光素酶報導子共培養。基於抗BTLA抗體緩解HVEM-BTLA相互作用且恢復螢光素酶報導子信號之能力篩選一組抗BTLA抗體候選物(圖1A至圖1B)。HFB6-2及HFB6-3能夠在此報導子分析中將TCR活化恢復至與基準JS004類似的程度。
在圖2A至圖2B中，將過度表現人類BTLA之HEK293細胞及過度表現食蟹獼猴BTLA之Expi293細胞與不同濃度之抗BTLA親本抗體一起培育。結合至目標細胞之抗BTLA抗體藉由FACS用AF647結合之抗人類IgG Fc 第2抗體定量。HFB6-2及HFB6-3展示以單數位nM及低於nM之EC
50結合至人類BTLA及食蟹獼猴BTLA (表6)。
表6：結合至人類及食蟹獼猴BTLA之HFB-2及HFB-6
| 抗體 | hBTLA 結合 EC 50(nM) | CynoBTLA 結合 EC 50(nM) |
| HFB6-2 | 2.342 | 0.6135 |
| HFB6-3 | 1.446 | 0.8231 |
| JS004 | 0.8045 | 0.5611 |
實例
2
：
HFB6-2
及
HFB6-3
為抗
BTLA
阻斷劑。
此實例表明HFB6-2及HFB6-3阻斷重組HVEM可溶性蛋白與細胞BTLA之間的相互作用且緩解T細胞中HVEM介導之TCR抑制。
在圖3A中，重組HVEM可溶性蛋白與DyLight 650 (DL650)螢光團結合。將過度表現hBTLA之HEK293細胞(HEK293.BTLA)與增加濃度之HFB6-2及HFB6-3在4℃下預培育30分鐘，且隨後再與DL650結合之HVEM預培育30分鐘。洗滌之後，藉由FACS量測仍與HEK293.BTLA細胞上之BTLA締合的可溶性HVEM。HFB6-2及HFB6-3以單數位nM IC
50阻斷可溶性HVEM與細胞BTLA相互作用。
在圖3B中，在HVEM-BTLA阻斷報導子分析中評估HFB6-2及HFB6-3之功能阻斷劑活性。在此分析中，將經工程改造以表現TCR活化物(TCRa)及HVEM (BTLA之配位體)的CHO細胞株與表現BTLA之Jurkat報導子細胞株及由NFAT結合啟動子驅動之螢光素酶報導子共培養。應用HFB6-2及HFB6-3以與基準JS004類似之劑量依賴性方式恢復螢光素酶報導子。
表7：HFB6-2及HFB6-3阻斷能力
| 抗體 | 可溶性 HVEM-hBTLA 阻斷， IC 50(nM) | BTLA-HVEM 阻斷報導子分析， EC50 (nM) |
| HFB6-2 | 5.451 | 10.19 |
| HFB6-3 | 7.706 | 12.47 |
| JS004 | 4.323 | 10.37 |
實例
3
：
HFB6-2
及
HFB6-3
結合至初級
T
及
B
細胞
。
此實例表明HFB6-2及HFB6-3分別以單數位nM EC
50及低於nM之EC
50結合至初級T細胞及B細胞。
在圖4A至圖4D中，初級T細胞及B細胞藉由EasySep™人類T細胞分離套組及B細胞分離套組(STEMCELL Technologies；Vancouver,Canada)自人類PBMC分離。將分離之T細胞或B細胞與不同濃度之抗BTLA親本抗體一起培育。結合至目標細胞之抗BTLA抗體藉由FACS用AF647結合之抗人類IgG Fc 第2抗體定量。
實例
4
：
HFB6-2
及
HFB6-3
逆轉
HVEM
介導的對初級
CD4+ T
細胞
增殖之抑制。
在圖5A至圖5B中，將細胞培養盤在4℃用抗CD3抗體以及重組HVEM-Fc融合蛋白或對照Fc蛋白質(ctl-Fc)塗佈隔夜。初級CD4
+T細胞藉由EasySep™人類CD4+ T細胞分離套組(STEMCELL Technologies)自人類PBMC分離且用CFSE標記。將CD4+ T細胞添加至抗-CD3及HVEM-Fc塗佈盤上且與抗CD28及抗BTLA阻斷抗體及同型匹配對照抗體(MGO53)一起培育。4天後，CD4
+T細胞增殖藉由與未刺激之CD4
+T細胞相關之CFSE稀釋液(% CFSElo)定量。HFB6-2及HFB6-3逆轉HVEM介導的對初級CD4+T細胞增殖之抑制。
實例
5
：
在混合淋巴球反應
(MLR)
分析
中
，
HFB6-3
增加
IFNγ
產生且與抗
PD1
協同作用。
在圖6 MLR分析中，CD14
+單核球係使用EasySep™人類單核球分離套組自一種PBMC供體分離，使用GM-CSF及IL-4歷經5天分化成不成熟樹突狀細胞，且隨後再使用LPS經過額外2天分化成成熟樹突狀細胞(moDC)。隨後，在存在抗BTLA抗體及/或抗PD1抗體之情況下，將moDC與來自第二供體之初級T細胞以1:10比率混合。5天後，藉由AlphaLISA量測上清液中之IFNγ。在測試的兩個moDC:T細胞對中，相較於同型-對照(MGO53)，僅HFB6-3增強IFNγ產生。HFB6-3與抗PD1組合進一步增強IFNγ產生。
實例
6
：
HFB6-3
單獨或與抗
PD1
組合誘導原發性解離腫瘤培養物中之
IFNγ
及促炎性細胞介素產生。
藉由人類腫瘤解離套組(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach，Germany)將來自肺及黑色素瘤癌症患者之原發性腫瘤組織解離至單細胞懸浮液中。藉由FACS量測腫瘤浸潤淋巴球(TIL)上之BTLA及PD1表現。將1×10
5個解離之腫瘤細胞與HFB6-3及/或抗PD1 (10μg/ml)在存在抗CD3 (10ng/ml)之情況下一起培養。在處理後第3天收集上清液且用人類細胞介素/趨化介素48-Plex Discovery Assay® (HD48) (Eve Technologies；Calgary，Canada)分析。亦在處理後第7天收集上清液且用IFNγ ELISA (R&D systems；Minneapolis，MN)分析。HFB6-3在多種原發性肺腫瘤及黑色素瘤腫瘤培養物中上調多種促炎性細胞介素時顯示單一藥劑作用以及與抗PD1之協同作用。
在圖7A至圖7G中，自肺患者TIL 320解離之腫瘤組織具有比TIL619更高的BTLA+ CD4+ T細胞%。在TIL320中，僅HFB6-3處理增加IL-2、CXCL9、IL1β及IFNγ產生。相較於任一單一藥劑處理，HFB6-3與抗PD1之組合進一步增強IL-2、CXCL10、TNFα及IFNγ產生(圖7B、圖7D、圖7E及圖7G)。在TIL619中，HFB6-3沒有顯示單一藥劑作用。然而，相較於僅抗PD1處理，HFB6-3與抗PD1組合進一步增強IL-2、CXCL9、CXCL10、TNFa及IFNγ產生(圖7B、圖7C、圖7D、圖7E及圖7G)。
實例
7
：
野生型
C57BL/6
小鼠及
hBTLA
基因敲入小鼠中之
HFB6-2
及
HFB6-3
之期望
PK
特徵曲線
在此實驗(圖8A及圖8B)中，將單劑量(10mg/kg)之HFB6-2、HFB6-3及基準JS004注射至野生型C57BL/6小鼠(靜脈內途徑，圖8A)及hBTLA基因敲入小鼠(腹膜內途徑，hBTLA KI，圖8B)中。在1小時、24小時及72小時，抽取野生型C57BL/6小鼠之血液。在0.5小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時及168小時，抽取hBTLA KI小鼠之血液。藉由ELISA量測所選抗體之血漿濃度。
向wt C57BL/6或hBTLA KI小鼠單次靜脈內或腹膜內投與HFB6-2或HFB6-3 (10 mg/kg)，產生＞40 μg/ml之血漿濃度持續至少72小時(圖8A及圖8B)；支持用於功效評估之q3d或更低投藥頻率。
實例
8
：
HFB6-2
及
HFB6-3
人源化抗體之功能特徵分析
基於標準人源化方案產生21種人源化HFB6-2變異體(例如，HFB6-2hz1至HFB6-hz21)，且測試所得人源化變異體以鑑別保持親本HFB6-2阻斷活性之高親和力結合劑。
在圖9中，在ELISA結合分析中評估人源化HFB6-2變異體與重組人類BTLA之結合。在ELISA分析中，所有測試之HFB6-2人源化變異體保持親本HFB6-2抗體結合親和力。其中，HFB6-2hz16、HFB6-2hz18及HFB6-2hz20在HVEM-BTLA阻斷報導子分析中展示與親本HFB6-2最接近的功能阻斷活性(圖9及表8)。
表8：人源化HFB6-2變異體在ELISA及報導子分析中之EC
50
| 抗體 | ELISA EC 50(nM) | 報導子 EC 50(nM) |
| JS004-hG4P | 2.428 | 13.12 |
| HFB6-2-hG4P | 2.345 | 11.47 |
| HFB6-2hz8-hG4P | 3.96 | 66.85 |
| HFB6-2hz9-hG4P | 3.292 | 36.67 |
| HFB6-2hz0-hG4P | 3.214 | 46.99 |
| HFB6-2hz11-hG4P | 3.664 | 19.41 |
| HFB6-2hz12-hG4P | 5.053 | 43.21 |
| HFB6-2hz15-hG4P | 2.744 | 19.57 |
| HFB6-2hz16-hG4P | 2.392 | 10.84 |
| HFB6-2hz17-hG4P | 2.404 | 18.22 |
| HFB6-2hz18-hG4P | 2.242 | 10.82 |
| HFB6-2hz19-hG4P | 2.549 | 22.11 |
| HFB6-2hz20-hG4P | 2.507 | 9.774 |
基於標準人源化方案產生在HCDR3上包括Cys突變體之45種人源化HFB6-3變異體(例如，HFB6-3hz1-hG4P至HFB6-3hz21-hG4P、HFB6-3hz20-hG4P-C109A/S/T/V)。因為在HFB6-3之HCDR3上存在不成對的Cys，所以若干人源化變異體上之C109突變成A/S/T/V。在HVEM-BTLA阻斷報導子分析(圖10A至圖10C)中，多種人源化HFB6-3變異體，包括但不限於HFB6-3hz6-hG4P、HFB6-3hz13-hG4P、HFB6-3hz20-hG4P、HFB6-3hz20-hG4P-C109A、HFB6-3hz24-hG4P-C109A、HFB6-3hz25-hG4P-C109A、HFB6-3hz24-hG4P-C109S、HFB6-3hz25-hG4P-C109S，使TCR活化恢復接近親本HFB6-3之程度。
人源化抗體序列提供於下表9至12中。
表9：HFB6-2及HFB6-3 mAb之人源化重鏈可變區之序列。
| VH | VH 序列 | SEQ ID NO: |
| HFB6-2hz1-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYTRYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 17 |
| HFB6-2hz2-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYTRYAQKFQGRATVTADTSTSTVYLELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 19 |
| HFB6-2hz3-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYARYAQKFQGRATITADESTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 21 |
| HFB6-2hz4-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYARYAQKFQGRATVTADKSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 23 |
| HFB6-2hz5-hG4P | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVNIKDTYMYWVRQAPGKGLEWIGRIDPANGYTRYADSVKGRFTISADNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 25 |
| HFB6-2hz6-hG4P | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAASGVNIKDTYMYWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGYTRYNPSFKSRATVSADKSKNQASLKLSSLTAADTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 27 |
| HFB6-2hz7-hG4P | EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGVNIKDTYMYWVRQMPGKGLEWIGRIDPANGYTRYSPSFQGQATVSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 29 |
| HFB6-2hz8-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYTRYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 31 |
| HFB6-2hz9-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYTRYAQKFQGRATVTADTSTSTVYLELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 33 |
| HFB6-2hz10-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYARYAQKFQGRATITADESTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 35 |
| HFB6-2hz11-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYARYAQKFQGRATVTADKSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 37 |
| HFB6-2hz12-hG4P | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVNIKDTYMYWVRQAPGKGLEWIGRIDPANGYTRYADSVKGRFTISADNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 39 |
| HFB6-2hz13-hG4P | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAASGVNIKDTYMYWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGYTRYNPSFKSRATVSADKSKNQASLKLSSLTAADTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 41 |
| HFB6-2hz14-hG4P | EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGVNIKDTYMYWVRQMPGKGLEWIGRIDPANGYTRYSPSFQGQATVSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 43 |
| HFB6-2hz15-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYTRYAQKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 45 |
| HFB6-2hz16-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYTRYAQKFQGRATVTADTSTSTVYLELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 47 |
| HFB6-2hz17-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYARYAQKFQGRATITADESTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 49 |
| HFB6-2hz18-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGVNIKDTYMYWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGYARYAQKFQGRATVTADKSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 51 |
| HFB6-2hz19-hG4P | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVNIKDTYMYWVRQAPGKGLEWIGRIDPANGYTRYADSVKGRFTISADNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 53 |
| HFB6-2hz20-hG4P | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAASGVNIKDTYMYWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGYTRYNPSFKSRATVSADKSKNQASLKLSSLTAADTAVYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 55 |
| HFB6-2hz21-hG4P | EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGVNIKDTYMYWVRQMPGKGLEWIGRIDPANGYTRYSPSFQGQATVSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCAVNDGYFEYFDVWGQGTTVTVSS | 57 |
| HFB6-3hz1-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFTRYAQKFQGRVTMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 59 |
| HFB6-3hz2-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFTRYAQKFQGRATITSDTSTSTVYLELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 61 |
| HFB6-3hz3-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFARYAQKFQGRATITSDESTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 63 |
| HFB6-3hz4-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFARYAQKFQGRATITSDKSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 65 |
| HFB6-3hz5-hG4P | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCADSGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWIGRIDPANGFTRYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 67 |
| HFB6-3hz6-hG4P | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 69 |
| HFB6-3hz7-hG4P | EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKDSGFNIKDTYIHWVRQMPGKGLEWIGRIDPANGFTRYSPSFQGQATISADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 71 |
| HFB6-3hz8-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFTRYAQKFQGRVTMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 73 |
| HFB6-3hz9-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFTRYAQKFQGRATITSDTSTSTVYLELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 75 |
| HFB6-3hz10-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFARYAQKFQGRATITSDESTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 77 |
| HFB6-3hz11-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFARYAQKFQGRATITSDKSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 79 |
| HFB6-3hz12-hG4P | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCADSGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWIGRIDPANGFTRYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 81 |
| HFB6-3hz13-hG4P | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 83 |
| HFB6-3hz14-hG4P | EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKDSGFNIKDTYIHWVRQMPGKGLEWIGRIDPANGFTRYSPSFQGQATISADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 85 |
| HFB6-3hz15-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFTRYAQKFQGRVTMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 87 |
| HFB6-3hz16-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFTRYAQKFQGRATITSDTSTSTVYLELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 89 |
| HFB6-3hz17-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFARYAQKFQGRATITSDESTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 91 |
| HFB6-3hz18-hG4P | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKDSGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANGFARYAQKFQGRATITSDKSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 93 |
| HFB6-3hz19-hG4P | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCADSGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWIGRIDPANGFTRYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 95 |
| HFB6-3hz20-hG4P | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 97 |
| HFB6-3hz21-hG4P | EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKDSGFNIKDTYIHWVRQMPGKGLEWIGRIDPANGFTRYSPSFQGQATISADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCAREDGYPYYTLDCWGQGTTVTVSS | 99 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109A | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDAWGQGTTVTVSS | 101 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109S | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDSWGQGTTVTVSS | 103 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109T | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDTWGQGTTVTVSS | 105 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109V | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDVWGQGTTVTVSS | 107 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109A | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDAWGQGTTVTVSS | 109 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109S | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDSWGQGTTVTVSS | 111 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109T | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDTWGQGTTVTVSS | 113 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109V | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDVWGQGTTVTVSS | 115 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109A | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDAWGQGTTVTVSS | 117 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109S | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDSWGQGTTVTVSS | 119 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109T | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDTWGQGTTVTVSS | 121 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109V | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSFKSRATISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDVWGQGTTVTVSS | 123 |
| HFB6-3hz22-hG4P-C109A | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCADSGFTIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVGRIDPANGFTRYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDGYPYYTLDAWGQGTTVTVSS | 125 |
| HFB6-3hz23-hG4P-C109A | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVGRIDSANGFTRYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDGYPYYTLDAWGQGTTVTVSS | 127 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109A | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSLKSRVTISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDAWGQGTTVTVSS | 129 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109A | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFSISDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSLKSRVTISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDAWGQGTTVTVSS | 131 |
| HFB6-3hz26-hG4P-C109A | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGFSISDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSLKSRVTISVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDAWGQGTTVTVSS | 133 |
| HFB6-3hz27-hG4P-C109A | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGFSISDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDSANGFTRYNPSLKSRVTISVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDAWGQGTTVTVSS | 135 |
| HFB6-3hz22-hG4P-C109S | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCADSGFTIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVGRIDPANGFTRYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDGYPYYTLDSWGQGTTVTVSS | 137 |
| HFB6-3hz23-hG4P-C109S | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVGRIDSANGFTRYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREDGYPYYTLDSWGQGTTVTVSS | 139 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109S | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFNIKDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSLKSRVTISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDSWGQGTTVTVSS | 141 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109S | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCADSGFSISDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSLKSRVTISSDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDSWGQGTTVTVSS | 143 |
| HFB6-3hz26-hG4P-C109S | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGFSISDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDPANGFTRYNPSLKSRVTISVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDSWGQGTTVTVSS | 145 |
| HFB6-3hz27-hG4P-C109S | QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGFSISDTYIHWVRQPPGKGLEWIGRIDSANGFTRYNPSLKSRVTISVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCAREDGYPYYTLDSWGQGTTVTVSS | 147 |
表10：HFB6-2及HFB6-3 mAb之人源化輕鏈可變區之序列
| VL | VL 序列 | SEQ ID NO: |
| HFB6-2hz1-hG4P | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEGVGVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 18 |
| HFB6-2hz2-hG4P | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEGVGVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 20 |
| HFB6-2hz3-hG4P | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEGVGVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 22 |
| HFB6-2hz4-hG4P | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEGVGVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 24 |
| HFB6-2hz5-hG4P | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEGVGVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 26 |
| HFB6-2hz6-hG4P | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEGVGVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 28 |
| HFB6-2hz7-hG4P | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEGVGVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 30 |
| HFB6-2hz8-hG4P | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQAPRRLIYLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 32 |
| HFB6-2hz9-hG4P | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQAPRRLIYLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 34 |
| HFB6-2hz10-hG4P | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQAPRRLIYLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 36 |
| HFB6-2hz11-hG4P | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQAPRRLIYLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 38 |
| HFB6-2hz12-hG4P | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQAPRRLIYLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 40 |
| HFB6-2hz13-hG4P | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQAPRRLIYLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 42 |
| HFB6-2hz14-hG4P | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQAPRRLIYLVSKLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDLAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 44 |
| HFB6-2hz15-hG4P | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 46 |
| HFB6-2hz16-hG4P | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 48 |
| HFB6-2hz17-hG4P | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 50 |
| HFB6-2hz18-hG4P | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 52 |
| HFB6-2hz19-hG4P | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 54 |
| HFB6-2hz20-hG4P | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 56 |
| HFB6-2hz21-hG4P | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKPYLNWLQQKPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQDTHFPRTFGQGTKLEIK | 58 |
| HFB6-3hz1-hG4P | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 60 |
| HFB6-3hz2-hG4P | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 62 |
| HFB6-3hz3-hG4P | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 64 |
| HFB6-3hz4-hG4P | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 66 |
| HFB6-3hz5-hG4P | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 68 |
| HFB6-3hz6-hG4P | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 70 |
| HFB6-3hz7-hG4P | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 72 |
| HFB6-3hz8-hG4P | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 74 |
| HFB6-3hz9-hG4P | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 76 |
| HFB6-3hz10-hG4P | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 78 |
| HFB6-3hz11-hG4P | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 80 |
| HFB6-3hz12-hG4P | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 82 |
| HFB6-3hz13-hG4P | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 84 |
| HFB6-3hz14-hG4P | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 86 |
| HFB6-3hz15-hG4P | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 88 |
| HFB6-3hz16-hG4P | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 90 |
| HFB6-3hz17-hG4P | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 92 |
| HFB6-3hz18-hG4P | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 94 |
| HFB6-3hz19-hG4P | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 96 |
| HFB6-3hz20-hG4P | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 98 |
| HFB6-3hz21-hG4P | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 100 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109A | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 102 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109S | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 104 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109T | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 106 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109V | DVVMTQSPLSLPLTLGQPASISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 108 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109A | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 110 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109S | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 112 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109T | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 114 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109V | EIVMTQSPATLSLSPGERATISCRSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQAPRRLIYLVSKRDSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 116 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109A | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 118 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109S | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 120 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109T | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 122 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109V | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 124 |
| HFB6-3hz22-hG4P-C109A | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 126 |
| HFB6-3hz23-hG4P-C109A | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 128 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109A | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 130 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109A | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 132 |
| HFB6-3hz26-hG4P-C109A | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 134 |
| HFB6-3hz27-hG4P-C109A | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 136 |
| HFB6-3hz22-hG4P-C109S | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 138 |
| HFB6-3hz23-hG4P-C109S | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 140 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109S | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 142 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109S | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 144 |
| HFB6-3hz26-hG4P-C109S | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 146 |
| HFB6-3hz27-hG4P-C109S | DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSLLDVDGKTYLNWFQQKPGQPPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCWQGTHFPRTFGQGTKLEIK | 148 |
表11：藉由IMGT方法所測定的人源化抗BTLA mAb之人源化重鏈的CDR區1至3。
| VH | HC CDR1 | SEQ ID NO: | HC CDR2 | SEQ ID NO: | HC CDR3 | SEQ ID NO: |
| HFB6-2hz1-hG4P至 HFB6-2hz21-hG4P | CTASGVNIKDTYMYW | 1 | GRIDPANGYTRYD | 2 | CAVNDGYFEYFDVW | 3 |
| HFB6-3hz1-hG4P至 HFB6-3hz21-hG4P | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDCW | 9 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109A | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDAW | 149 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109S | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDSW | 150 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109T | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDTW | 151 |
| HFB6-3hz6-hG4P-C109V | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDVW | 152 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109A | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDAW | 149 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109S | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDSW | 150 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109T | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDTW | 151 |
| HFB6-3hz13-hG4P-C109V | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDVW | 152 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109A | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDAW | 149 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109S | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDSW | 150 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109T | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDTW | 151 |
| HFB6-3hz20-hG4P-C109V | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDVW | 152 |
| HFB6-3hz22-hG4P-C109A | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDAW | 149 |
| HFB6-3hz23-hG4P-C109A | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDAW | 149 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109A | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDAW | 149 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109A | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDAW | 149 |
| HFB6-3hz26-hG4P-C109A | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDAW | 149 |
| HFB6-3hz27-hG4P-C109A | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDAW | 149 |
| HFB6-3hz22-hG4P-C109S | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDSW | 150 |
| HFB6-3hz23-hG4P-C109S | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDSW | 150 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109S | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDSW | 150 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109S | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDSW | 150 |
| HFB6-3hz26-hG4P-C109S | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDSW | 150 |
| HFB6-3hz27-hG4P-C109S | CTDSGFNIKDTYIHW | 7 | GRIDPANGFTRYD | 8 | CAREDGYPYYTLDSW | 150 |
表12：藉由IMGT方法所測定的人源化抗BTLA mAb之人源化輕鏈的CDR區1至3。
| VL | LC CDR1 | SEQ ID NO: | LC CDR2 | SEQ ID NO: | LC CDR3 | SEQ ID NO: |
| HFB6-2hz1-hG4P至 HFB6-2hz21-hG4P | CKSSQSLLDSDGKPYLNW | 4 | LVSKLDS | 5 | CWQDTHFPRTF | 6 |
| HFB6-3hz1-hG4P至 HFB6-3hz27-hG4P-C109S | CKSSQSLLDVDGKTYLNW | 10 | LVSKLDS | 11 | CWQGTHFPRTF | 12 |
實例
9
：
具有半胱胺酸突變之
HFB6-3
人源化變異體之結合及交叉反應。
在圖11A及圖11B中，將過度表現人類BTLA之HEK293 (圖11A)及過度表現食蟹獼猴BTLA之Expi293細胞(圖11B)與不同濃度之具有半胱胺酸突變之所選HFB6-3人源化變異體一起培育。結合至目標細胞之抗BTLA抗體藉由FACS用AF647結合之抗人類IgG Fc 第2抗體定量。HFB6-3hz24-hG4P-C109A、HFB6-3hz25-hG4P-C109A、HFB6-3hz24-hG4P-C109S及HFB6-3hz25-hG4P-C109S以單數位nM及低於nM之EC
50結合至人類BTLA及食蟹獼猴BTLA，類似於親本HFB6-3 (圖11A及圖11B以及表13)。
表13：HFB6-3人源化抗體能夠結合人類及食蟹獼猴BTLA。
| 抗體 | HEK293T.hBTLA 結合 EC 50(nM) | Expi293.cynoBTLA 結合 EC 50(nM) |
| JS004-hG4P | 5.971 | 5.245 |
| HFB6-3-hG4P | 3.206 | 5.695 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109A | 3.265 | 6.895 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C-109A | 3.196 | 9.686 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109S | 3.595 | 7.828 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109S | 4.037 | 8.828 |
| HFB6-3z20-hG4P | 3.844 | 7.375 |
實例
10
：具有
半胱胺酸突變之
HFB6-3
人源化變異體之阻斷活性
。
此實例表明具有半胱胺酸突變之所選HFB6-3人源化變異體阻斷重組HVEM可溶性蛋白與細胞BTLA之間的相互作用且緩解T細胞中HVEM介導之TCR抑制，與親本HFB6-3抗體相當。
在圖12A中，重組HVEM可溶性蛋白與DyLight 650 (DL650)螢光團結合。將過度表現hBTLA之HEK293細胞(HEK293.BTLA)與增加濃度之具有半胱胺酸突變體之所選HFB6-3人源化變異體或親本HFB6-3在4℃預培育30分鐘，且隨後與DL650結合之HVEM再預培育30分鐘。洗滌之後，藉由FACS量測仍與HEK293.BTLA細胞上之BTLA締合的可溶性HVEM。HFB6-3hz24-hG4P-C109A、HFB6-3hz25-hG4P-C109A、HFB6-3hz24-hG4P-C109S及HFB6-3hz25-hG4P-C109S以單數位nM IC
50阻斷可溶性HVEM及細胞BTLA，其與親本HFB6-3相當(圖12A及表14)。
表14：HFB6-3人源化抗體阻斷可溶性HVEM及細胞BTLA相互作用。
| 抗體 | hrHVEM-His-DL650/HEK293T.hBTLA 阻斷 (IC 50(nM)) |
| JS004-hG4P | 1.472 |
| HFB6-3-hG4P | 2.690 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109A | 2.636 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109A | 2.611 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109S | 3.216 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109S | 3.203 |
| HFB6-3hz20-hG4P | 2.906 |
在圖12B中，在HVEM BTLA阻斷報導子分析中評估具有半胱胺酸突變之所選HFB6-3人源化變異體之功能阻斷活性。在此分析中，將經工程改造以表現TCR活化物(TCRa)及HVEM (BTLA之配位體)的CHO細胞株與表現BTLA之Jurkat報導子細胞株及由NFAT結合啟動子驅動之螢光素酶報導子共培養。應用HFB6-3hz24-hG4P-C109A、HFB6-3hz25-hG4P-C109A、HFB6-3hz24-hG4P-C109S及HFB6-3hz25-hG4P-C109S以與親本HFB6-3類似之劑量依賴性方式恢復螢光素酶報導子(圖12B及表15)。
表15：HFB6-3人源化抗體阻斷HVEM/BTLA相互作用。
| 抗體 | CHO.TCRa.hHVEM/Jurkat.hBTLA.NFAT-luc (EC 50(nM)) |
| HFB6-3-hG4P | 7.896 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109A | 13.04 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109A | 10.16 |
| HFB6-3hz24-hG4P-C109S | 16.60 |
| HFB6-3hz25-hG4P-C109S | 14.40 |
實例 11 ： 具有半胱胺酸突變之 HFB6-3 人源化變異體逆轉HVEM
介導的對初級 CD4+ T 細胞 增殖之抑制。
在圖13中，在與實例4相同的分析中評估具有半胱胺酸突變之所選HFB6-3人源化變異體。類似於親本HFB6-3抗體，HFB6-3hz24-hG4P-C109A、HFB6-3hz25-hG4P-C109A、HFB6-3hz24-hG4P-C109S及HFB6-3hz25-hG4P-C109S逆轉HVEM介導的對初級CD4+ T細胞增殖之抑制。
實例
12
：具有
半胱胺酸突變之
HFB6-3
人源化變異體誘導原發性解離腫瘤培養物中之
IFNγ
及促炎性細胞介素產生。
在圖14A至圖14C及圖15A至圖15C中，分析與實例6中相同。TIL F及TIL O為來自肺癌患者之解離腫瘤樣本。在圖14A至圖14C中，相較於TIL F中之僅單一藥劑處理，HFB6-3hz24-hG4P-C109S與抗PD1組合處理增強CXCL9、IL2、IL1β、TNFα、IFNγ、GM-CSF及IL-17A產生，在圖15A至圖15C中，在TIL O中，僅HFB6-3hz24-hG4P-C109S處理將IL1β、TNFα及IFNγ產生增強至比抗PD1或基準JS004更強的程度。
熟習此項技術者應瞭解，在不脫離本發明之較寬廣發明理念之情況下，可對上述實施例作出改變。因此，應瞭解，本發明不限於所揭示之特定實施例，而是希望涵蓋如本說明書所限定之本發明精神及範疇內之修改。
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述發明內容以及以下本申請案之較佳實施例之詳細描述。然而應瞭解，本申請案不限於附圖中所示的確切實施例。
圖1A至圖1B展示曲線圖，其表明經由HVEM-BTLA阻斷報導子分析鑑別抗BTLA阻斷抗體HFB6-2及HFB6-3。
圖2A至圖2B展示曲線圖，其表明在FACS結合分析中，HFB6-2及HFB6-3抗體能夠結合HEK293人類BTLA (圖2A)及Expi293食蟹獼猴BTLA (圖2B)中之人類及食蟹獼猴BTLA。
圖3A至圖3B展示曲線圖，其表明HFB6-2及HFB6-3抗體為細胞BTLA/可溶性HVEM阻斷(圖3A)及BTLA-HVEM阻斷T細胞報導子(圖3B)分析中之抗BTLA阻斷劑。
圖4A至圖4D展示曲線圖，其表明HFB6-2及HFB6-3抗體結合至初級T及B細胞。
圖5展示曲線圖，其表明HFB6-2及HFB6-3抗體逆轉HVEM介導的對初級CD4+ T細胞增殖之抑制。
圖6展示曲線圖，其表明在混合淋巴球反應(MLR)分析中，HFB6-3增加IFNγ產生且與抗PD1協同作用。
圖7A至7G展示曲線圖，其表明單獨或與抗PD1抗體組合之HFB6-3抗體在原發性解離腫瘤培養物中誘導IFNγ及促炎性細胞介素產生。
圖8A至圖8B展示曲線圖，其表明野生型C57BL/6小鼠及hBTLA基因敲入小鼠中之HFB6-2及HFB6-3抗體的適宜PK特徵曲線。
圖9展示曲線圖，其表明HFB6-2人源化抗體在ELISA結合分析及HVEM-BTLA阻斷報導子分析中之功能分析。
圖10A至圖10C展示曲線圖，其表明人源化HFB6-3抗體(包括人源化HFB6-3抗體之HCDR3中的Cys突變體)在HVEM-BTLA阻斷報導子分析中之結果。
圖11A至圖11B展示曲線圖，其表明在FACS結合分析中，人源化HFB6-3抗體變異體能夠結合HEK293T人類BTLA表現細胞(圖11A)及Expi293食蟹獼猴BTLA表現細胞(圖11B)中之人類及食蟹獼猴BTLA。
圖12A至圖12B展示曲線圖，其表明在FACS阻斷分析(圖12A)及CHO.TCRa.hHVEM/Jurkat.hBTLA.NFAT-luc阻斷報導子分析(圖12B)中，人源化HFB6-3抗體變異體能夠阻斷細胞BTLA及可溶性HVEM相互作用。
圖13展示曲線圖，其表明具有半胱胺酸突變之人源化HFB6-3抗體變異體能夠逆轉HVEM介導的對初級CD4+ T細胞增殖之抑制。
圖14A至圖14C展示曲線圖，其表明具有半胱胺酸突變之人源化HFB6-3抗體變異體在原發性解離腫瘤培養物中誘導IFNγ及促炎性細胞介素產生。
圖15A至圖15C展示曲線圖，其表明具有半胱胺酸突變之人源化HFB6-3抗體變異體在原發性解離腫瘤培養物中誘導IFNγ及促炎性細胞介素產生。
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Claims (32)
- 一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有以下之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3： (1) 分別為SEQ ID NO: 7、8、153、10、11及12；或 (2) 分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6； 其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合B-及T-淋巴球弱化子(BTLA)，較佳地人類BTLA，視情況該單株抗體或其抗原結合片段並非天然存在。
- 如請求項1之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有與SEQ ID NO: 15或13至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO: 16或14至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1或2之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (1) 具有SEQ ID NO:15之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:16之多肽序列的輕鏈可變區；或 (2) 具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1至3中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合及/或人類或人源化的。
- 如請求項4之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有以下之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3： (1) 分別為SEQ ID NO:7、8、150、10、11及12； (2) 分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、5及6； (3) 分別為SEQ ID NO: 7、8、9、10、11及12； (4) 分別為SEQ ID NO: 7、8、149、10、11及12； (5) 分別為SEQ ID NO: 7、8、151、10、11及12；或 (6) 分別為SEQ ID NO: 7、8、152、10、11及12。
- 如請求項5之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該經分離單株抗體或其抗原結合片段包含具有與SEQ ID NO:141、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145或147至少95%一致之多肽序列的重鏈可變區，或具有與SEQ ID NO:142、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146或148至少95%一致之多肽序列的輕鏈可變區。
- 如請求項6之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該經分離單株抗體或其抗原結合片段包含： (1) 具有SEQ ID NO:141之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:142之多肽序列的輕鏈可變區； (2) 具有SEQ ID NO:17之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:18之多肽序列的輕鏈可變區； (3) 具有SEQ ID NO:19之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:20之多肽序列的輕鏈可變區； (4) 具有SEQ ID NO:21之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:22之多肽序列的輕鏈可變區； (5) 具有SEQ ID NO:23之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:24之多肽序列的輕鏈可變區； (6) 具有SEQ ID NO:25之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:26之多肽序列的輕鏈可變區； (7) 具有SEQ ID NO:27之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:28之多肽序列的輕鏈可變區； (8) 具有SEQ ID NO:29之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:30之多肽序列的輕鏈可變區； (9) 具有SEQ ID NO:31之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:32之多肽序列的輕鏈可變區； (10) 具有SEQ ID NO:33之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:34之多肽序列的輕鏈可變區； (11) 具有SEQ ID NO:35之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:36之多肽序列的輕鏈可變區； (12) 具有SEQ ID NO:37之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:38之多肽序列的輕鏈可變區； (13) 具有SEQ ID NO:39之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:40之多肽序列的輕鏈可變區； (14) 具有SEQ ID NO:41之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:42之多肽序列的輕鏈可變區； (15) 具有SEQ ID NO:43之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:44之多肽序列的輕鏈可變區； (16) 具有SEQ ID NO:45之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:46之多肽序列的輕鏈可變區； (17) 具有SEQ ID NO:47之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:48之多肽序列的輕鏈可變區； (18) 具有SEQ ID NO:49之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:50之多肽序列的輕鏈可變區； (19) 具有SEQ ID NO:51之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:52之多肽序列的輕鏈可變區； (20) 具有SEQ ID NO:53之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:54之多肽序列的輕鏈可變區； (21) 具有SEQ ID NO:55之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:56之多肽序列的輕鏈可變區； (22) 具有SEQ ID NO:57之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:58之多肽序列的輕鏈可變區； (23) 具有SEQ ID NO:59之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:60之多肽序列的輕鏈可變區； (24) 具有SEQ ID NO:61之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:62之多肽序列的輕鏈可變區； (25) 具有SEQ ID NO:63之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:64之多肽序列的輕鏈可變區； (26) 具有SEQ ID NO:65之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:66之多肽序列的輕鏈可變區； (27) 具有SEQ ID NO:67之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:68之多肽序列的輕鏈可變區； (28) 具有SEQ ID NO:69之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:70之多肽序列的輕鏈可變區； (29) 具有SEQ ID NO:71之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:72之多肽序列的輕鏈可變區； (30) 具有SEQ ID NO:73之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:74之多肽序列的輕鏈可變區； (31) 具有SEQ ID NO:75之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:76之多肽序列的輕鏈可變區； (32) 具有SEQ ID NO:77之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:78之多肽序列的輕鏈可變區； (33) 具有SEQ ID NO:79之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:80之多肽序列的輕鏈可變區； (34) 具有SEQ ID NO:81之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:82之多肽序列的輕鏈可變區； (35) 具有SEQ ID NO:83之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:84之多肽序列的輕鏈可變區； (36) 具有SEQ ID NO:85之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:86之多肽序列的輕鏈可變區； (37) 具有SEQ ID NO:87之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:88之多肽序列的輕鏈可變區； (38) 具有SEQ ID NO:89之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:90之多肽序列的輕鏈可變區； (39) 具有SEQ ID NO:91之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:92之多肽序列的輕鏈可變區； (40) 具有SEQ ID NO:93之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:94之多肽序列的輕鏈可變區； (41) 具有SEQ ID NO:95之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:96之多肽序列的輕鏈可變區； (42) 具有SEQ ID NO:97之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:98之多肽序列的輕鏈可變區； (43) 具有SEQ ID NO:99之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:100之多肽序列的輕鏈可變區； (44) 具有SEQ ID NO:101之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:102之多肽序列的輕鏈可變區； (45) 具有SEQ ID NO:103之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:104之多肽序列的輕鏈可變區； (46) 具有SEQ ID NO:105之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:106之多肽序列的輕鏈可變區； (47) 具有SEQ ID NO:107之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:108之多肽序列的輕鏈可變區； (48) 具有SEQ ID NO:109之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:110之多肽序列的輕鏈可變區； (49) 具有SEQ ID NO:111之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:112之多肽序列的輕鏈可變區； (50) 具有SEQ ID NO:113之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:114之多肽序列的輕鏈可變區； (51) 具有SEQ ID NO:115之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:116之多肽序列的輕鏈可變區； (52) 具有SEQ ID NO:117之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:118之多肽序列的輕鏈可變區； (53) 具有SEQ ID NO:119之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:120之多肽序列的輕鏈可變區； (54) 具有SEQ ID NO:121之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:122之多肽序列的輕鏈可變區； (55) 具有SEQ ID NO:123之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:124之多肽序列的輕鏈可變區； (56) 具有SEQ ID NO:125之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:126之多肽序列的輕鏈可變區； (57) 具有SEQ ID NO:127之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:128之多肽序列的輕鏈可變區； (58) 具有SEQ ID NO:129之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:130之多肽序列的輕鏈可變區； (59) 具有SEQ ID NO:131之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:132之多肽序列的輕鏈可變區； (60) 具有SEQ ID NO:133之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:134之多肽序列的輕鏈可變區； (61) 具有SEQ ID NO:135之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:136之多肽序列的輕鏈可變區； (62) 具有SEQ ID NO:137之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:138之多肽序列的輕鏈可變區； (63) 具有SEQ ID NO:139之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:140之多肽序列的輕鏈可變區； (64) 具有SEQ ID NO:143之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:144之多肽序列的輕鏈可變區； (65) 具有SEQ ID NO:145之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:146之多肽序列的輕鏈可變區；或 (66) 具有SEQ ID NO:147之多肽序列的重鏈可變區，及具有SEQ ID NO:148之多肽序列的輕鏈可變區。
- 如請求項1至7中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段以小於約25 nM、20 nM、15 nM、5 nM、2 nM、1 nM或0.5 nM之K D結合至人類BTLA。
- 如請求項1至7中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段為人類BTLA之促效劑且在結合至BTLA時活化BTLA之下游傳訊。
- 如請求項1至7中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段能夠抑制B細胞增殖及/或T細胞及/或漿細胞活化。
- 如請求項10之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該T細胞係選自由以下組成之群：CD4 T細胞、CD8 T細胞、Th1 T細胞、TFH T細胞、αβ T細胞及γδ T細胞。
- 如請求項1至7中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段能夠阻斷或消除結合至疱疹病毒侵入介體(herpes virus entry mediator：HVEM)之BTLA。
- 如請求項1至7中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段能夠增加促炎性細胞介素產生；調節經結合藥物之募集；及/或與具有殺滅癌症作用之另一mAb或其抗原結合片段形成雙特異性抗體。
- 如請求項13之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該促炎性細胞介素係選自干擾素γ (IFNγ)、介白素-2 (IL-2)、C-X-C模體趨化介素配位體9 (CXCL9)、C-X-C模體趨化介素配位體10 (CXCL10)、介白素1β (IL1β)及/或腫瘤壞死因子α (TNFα)。
- 如請求項1至14中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段特異性結合食蟹獼猴BTLA。
- 一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含如請求項1至15中任一項之單株抗體或其抗原結合片段。
- 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至15中任一項之單株抗體或其抗原結合片段。
- 一種經分離核酸，其編碼如請求項16之雙特異性抗體或其抗原結合片段。
- 一種載體，其包含如請求項17或18之經分離核酸。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項19之載體。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段或如請求項16之雙特異性抗體或其抗原結合片段，及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種靶向癌細胞表面上之BTLA及/或治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與如請求項21之醫藥組合物。
- 如請求項22之方法，其中該癌症為實體腫瘤，較佳為具有浸潤性T細胞之實體腫瘤，更佳為具有浸潤性T效應細胞之實體腫瘤，更佳為具有表現BTLA之T效應細胞的實體腫瘤，最佳為具有表現BTLA之浸潤性T效應細胞及在腫瘤微環境中高度表現之BTLA配位體HVEM的實體腫瘤。
- 如請求項22或23之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌及肝癌。
- 如請求項22至24中任一項之方法，其中該個體包含表現BTLA之T細胞、B細胞、樹突狀細胞(DC)或自然殺手(NK)細胞。
- 如請求項22至25中任一項之方法，其中該醫藥組合物進一步包含第二抗癌劑。
- 如請求項26之方法，其中該第二抗癌劑為抗PD1抗體或其抗原結合片段。
- 一種產生如請求項1至15中任一項之單株抗體或其抗原結合片段或如請求項16之雙特異性抗體或其抗原結合片段的方法，其包含在產生該單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養包含編碼該單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段之核酸的細胞，及自該細胞或培養物回收該單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段。
- 一種產生包含如請求項1至15中任一項之單株抗體或抗原結合片段或如請求項16之雙特異性抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物的方法，其包含將該單株抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體或其抗原結合片段與醫藥學上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組合物。
- 一種測定個體中BTLA之含量的方法，該方法包含： a. 自該個體獲得樣本； b. 使該樣本與如請求項1至15中任一項之經分離單株抗體或其抗原結合片段接觸；及 c. 測定該個體中BTLA之含量。
- 如請求項30之方法，其中該樣本為組織樣本或血液樣本，視情況其中該組織樣本為癌症組織樣本。
- 如請求項30之方法，其中該樣本包含T細胞、B細胞、樹突狀細胞(DC)或自然殺手(NK)細胞。
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