TW202339784A - 草藥組成物、其製備方法及其用途 - Google Patents

草藥組成物、其製備方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202339784A
TW202339784A TW111144013A TW111144013A TW202339784A TW 202339784 A TW202339784 A TW 202339784A TW 111144013 A TW111144013 A TW 111144013A TW 111144013 A TW111144013 A TW 111144013A TW 202339784 A TW202339784 A TW 202339784A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
herbal
jgf
weight
cells
cov
Prior art date
Application number
TW111144013A
Other languages
English (en)
Inventor
許中華
傅淑玲
林東毅
兵岳忻
Original Assignee
國立陽明交通大學
臺北市立聯合醫院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 國立陽明交通大學, 臺北市立聯合醫院 filed Critical 國立陽明交通大學
Publication of TW202339784A publication Critical patent/TW202339784A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/63—Oleaceae (Olive family), e.g. jasmine, lilac or ash tree
    • A61K36/634—Forsythia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/23—Apiaceae or Umbelliferae (Carrot family), e.g. dill, chervil, coriander or cumin
    • A61K36/233—Bupleurum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A61K36/284—Atractylodes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/481—Astragalus (milkvetch)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
    • A61K36/532—Agastache, e.g. giant hyssop
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
    • A61K36/539—Scutellaria (skullcap)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/57—Magnoliaceae (Magnolia family)
    • A61K36/575—Magnolia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/63—Oleaceae (Olive family), e.g. jasmine, lilac or ash tree
    • A61K36/638—Ligustrum, e.g. Chinese privet
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation, decoction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/37—Extraction at elevated pressure or temperature, e.g. pressurized solvent extraction [PSE], supercritical carbon dioxide extraction or subcritical water extraction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本揭露提供一種草藥組成物，包括來自連翹、黃芩、柴胡、厚朴、藿香、黃芪、白朮和女貞子中的至少五種草藥組合的萃取物。本揭露亦提供製備該草藥組成物的方法及藉由將有效量的該草藥組成物投藥有需要的個體以預防或治療病毒感染的方法。

Description

草藥組成物、其製備方法及將其投藥以預防或治療呼吸道疾病之方法
本發明涉及草藥組成物，尤其涉及用於預防或治療由病毒感染所引起的呼吸系統疾病的草藥組成物。
冠狀病毒(CoV)為一大類病毒，可引起呼吸系統疾病，並導致從類似於普通感冒至嚴重而復雜的呼吸系統衰竭的症狀。已鑑定出許多人類冠狀病毒株，例如CoV-229E、CoV-OC43、CoV-NL63及CoV-HKU1，其通常會導致輕度、自限性上呼吸道感染，例如無症狀感染或輕度類流感生病狀態，例如流鼻涕、打噴嚏、頭痛、咳嗽、喉嚨痛及發燒。然而，過去幾十年中出現了幾次大流行，例如嚴重急性呼吸道症候群(SARS)、中東呼吸症候群(MERS)及最近的冠狀病毒疾病2019(COVID-19)，這些疾病係由冠狀病毒株引起，導致嚴重的急性呼吸系統症候群，例如嚴重的肺炎甚至死亡。截至2021年5月中旬，全球已記
直到現在，仍然沒有特定的抗病毒治療可用於或被證明可有效治療或預防個體的冠狀病毒感染。雖然已核准和使用幾種疫苗，但仍然存在一定比例的嚴重副作用，例如血栓、心肌炎及其他嚴重疾病。
因此，存在提供有效且安全的療法以預防或治療冠狀病毒感染的未滿足的需求。
鑑於上述情況，本揭露提供一種草藥組成物，其能夠誘導宿主細胞表面的ACE2降解，並抑制冠狀病毒在其宿主中進入和複製所必需的蛋白質的表現，從而預防和保護個體免受病毒感染。
在本揭露的至少一個實施例中，用於預防或治療病毒感染的草藥組成物包含草藥組合及其藥學上可接受的載體的煎劑，其中，草藥組合包含選自由連翹(Forsythia suspensa)、黃芩(Scutellaria baicalensis)、柴胡(Bupleurum Chinese)、厚朴(Magnolia officinalis)、藿香(Agastache rugosa)、黃芪(Astragalus membranaceus)、白朮(Atractylodes macrocephala)及女貞子(女貞(Ligustrum lucidum)的種子)所組成的群組中之至少五種。在至少一個實施例中，草藥煎劑係水萃取物或乙醇萃取物。在至少一個實施例中，該草藥組成物包含從草藥組合獲得的煎劑，該草藥組合基於其總重量包含按重量計25%至35%的連翹、按重量計18%至26%的黃芩、按重量計15%~25%的柴胡、按重量計15%~25%的厚朴、按重量計7%~15%的藿香、按重量計1%~5%的黃芪、按重量計1%~5%的女貞子以及按重量計1%~5%的白朮。在至少一個實施例中，該草藥組成物包 含萃取自含有8mg至10mg連翹、6mg至8mg黃芩、4mg至6mg柴胡、4mg至6m厚朴及1mg至3mg的藿香的草藥組合的煎劑。
在本揭露的至少一個實施例中，提供一種製備草藥組成物的方法，包括提供包含連翹、黃芩、柴胡、厚朴、藿香、黃芪、白朮及女貞子中的至少五種的草藥組合；以包括水和乙醇中的至少一種之萃取溶液藉由煮沸萃取草藥；以及自萃取物中去除固體物以獲得煎劑。在至少一個實施例中，該萃取包括將萃取液中的草藥組合煮沸至少一小時，包括但不限於2小時、3小時和4小時。在至少一個實施例中，萃取包括在至少70℃，包括80℃、90℃、100℃、110℃及120℃的溫度下煮沸萃取溶液中之草藥組合。在至少一個實施例中，萃取包括在至少1個大氣壓下，包括但不限於1.1個大氣壓、1.2個大氣壓及1.3個大氣壓下煮沸萃取溶液中之草藥組合。在至少一個實施例中，該方法包括以與萃取液之重量比為0.5：1至5：1的草藥組合中萃取。
在本揭露的至少一個實施例中，萃取草藥煎劑包括將草藥原料(即，草藥組合)於萃取溶液中煮沸至少一小時，例如1小時至6小時，及/或將草藥原料浸入在沸點附近溫度的萃取液中至少一小時，例如1小時至6小時。在一些實施例中，草藥原料與萃取液的重量比為0.5：1至5：1，例如1：1、2：1、3：1、4：1及5：1。
在本揭露的至少一個實施例中，製備草藥組成物的方法復包括濃縮液體部分以獲得濃縮萃取物。
在本揭露的至少一個實施例中，提供一種用於預防或治療有此需求的個體的病毒感染的方法，該方法包括投藥個體有效量的上述草藥組成物的至少一種。
在本揭露的至少一個實施例中，病毒感染係由冠狀病毒所引起。在一些實施例中，該冠狀病毒係SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、小鼠肝炎病毒(MHV)或豬流行性下痢病毒(PEDV)。在一些實施例中，該冠狀病毒係SARS-CoV-2變體、例如D614G突變株、B.1.1.7(Alpha)突變株、B.1.351(Beta)突變株及P1突變株等，但不限於此。
在本揭露的至少一個實施例中，來自草藥組成物中草藥原料的萃取物以約25克/週至約1,000克/週的有效量投藥於個體，例如自約50克/週至約800g/週、以及自約100g/週至約500g/週。
在本揭露中，所提供的草藥組成物作為抗病毒劑，其可抑制病毒複製並減少宿主細胞中的病毒數量。此外，本揭露提供的草藥組成物是安全的，可以解決先前技術的副作用問題。因此，本揭露提供一種有效的抗病毒感染策略，其有助於控制冠狀病毒的爆發。
專利或申請文件至少包含一張彩色圖示。帶有彩色附圖的本專利或專利申請公開的副本將在請求和支付必要費用後由辦公室提供。
藉由閱讀以下實施例的描述並參考附圖，可以更充分了解本揭露。
圖1A至圖1D說明本揭露的草藥組成物對SARS-CoV-2刺突(spike,S)蛋白和ACE2受體之間交互作用的抑制活性。圖1A檢測JGF的草藥組成物的細胞毒性。以指定量的草藥組成物處理BHK-21及Calu-3細胞，並藉由乳酸脫氫酶(LDH)測定法檢查細胞活力/存活率。對照組代表未處理組，以作為陰性對照。使用Triton-100的處理則作為陽性對照。數據以平均值±SD(標準差) 表示；誤差線表示SD。n.s.表示與對照組相比不顯著。圖1B顯示藉由西方墨點分析之以40μg/mL JGF處理的Calu-3細胞中ACE2的表現(上圖)。以α以微管蛋白標準化後量化ACE2表現水平。來自三個獨立實驗的量化分析顯示於下圖中。*表示P<0.05。圖1C顯示在指定量的JGF存在下之可視化的細胞-細胞融合，細胞為表現SARS-CoV-2 S蛋白的BHK-21細胞及表現ACE2的Calu-3細胞。圖1D量化在各種JGF濃度下的合胞體(syncytium)形成。與對照相比，20至80μg/mL JGF處理顯著抑制合胞體形成。*表示P<0.05。
圖2A和圖2B分別說明JGF的草藥組成物對肺纖維母細胞WI-38及MRC-5細胞的細胞活力影響的長條圖。以各種低濃度的JGF(0至20μg/mL)處理細胞48和72小時。每組經JGF處理的樣品均相對未處理的對照組(CTL)進行標準化。使用結晶紫測定法測定細胞活力。數據代表三個獨立的實驗，並以平均值±SD表示；誤差線表示SD。
圖3A至圖3F顯示JGF的草藥組成物誘導ACE2的溶酶體-依賴性降解。圖3A顯示WI-38及MRC-5細胞以三種劑量的JGF(0至20μg/mL)處理3及24小時。隨後以全細胞裂解物進行西方墨點法以檢測ACE2的表現。肌動蛋白作為內部對照。圖3B顯示圖3A中ACE2條帶強度的量化，其中圖3A代表使用Image J(National Institute of Mental Health,Bethesda,MD,USA)進行的三個不同的測定。數據表示為平均值±SD；誤差線表示SD。顯示了顯著差異(* P<0.05，與對照組相比)。圖3C顯示在存在或不存在JGF的情況下，加入環己醯亞胺(CHX；10μg/mL)處理0至180分鐘後WI-38細胞中ACE2降解的時程，其以西方墨點法分析。右側曲線顯示的是Image J量化的三個獨立實驗中的ACE2水平，結果表示為平均值±SD；誤差線表示SD。顯著差異也被表示(* P <0.05，與對照DMSO組相比)。圖3D顯示WI-38細胞以DMSO(載體對照)或BafA1(10μM)預處理30分鐘，隨後與JGF(10μg/mL)培育2小時的西方墨點法結果，而圖3E顯示圖3D西方墨點法的定量化長條圖。隨後以全細胞裂解物進行西方墨點法以檢測ACE2的表現。肌動蛋白作為內部對照。
圖4A至圖4C顯示JGF的草藥組成物降低WI-38和MRC-5細胞中的TMPRSS2水平。圖4A顯示以JGF(0至20μg/mL)處理3和24小時的WI-38和MRC-5細胞。隨後以全細胞裂解物進行西方墨點法以檢測TMPRSS2的表現。肌動蛋白作為內部對照。圖4B顯示圖4A中所示的TMPRSS2條帶強度的量化，其中圖4A代表Image J的三個獨立測定。圖4C顯示以JGF(0、10和20μg/mL)處理24小時的WI-38和MRC-5細胞。藉由qRT-PCR測定TMPRSS2的mRNA水平。數據表示為平均值±SD；誤差線表示SD。顯著差異表示為* P<0.05(與對照組相比)。
圖5A至圖5I顯示JGF的草藥組成物對小鼠模型肺組織中ACE2和TMPRSS2水平的影響。圖5A顯示小鼠藉由餵食管餵食(oral gavage)接受JGF的實驗方案。圖5B顯示藉由餵食管餵食接受JGF的小鼠肺組織中的ACE2和TMPRSS2水平。圖5C顯示了小鼠通過蒸汽噴射法接受JGF的實驗方案。圖5D顯示藉由蒸汽噴霧(steam spray)接受JGF的小鼠肺組織中的ACE2和TMPRSS2水平。圖5E顯示每隔一天藉由餵食管餵食接受JGF的小鼠的體重變化(%)。圖5F和圖5G分別顯示在第1天和第17天分析的小鼠血清的肝功能(AST和ALT)和腎功能(BUN和肌酸酐)測量值。圖5H和圖5I顯示JGF的草藥組成物對其他組織(包括腎臟、皮質和大腸)中ACE2和TMPRSS2水平的影響。在進行分別如圖5A和圖5C所示實驗之後，沒有觀察到表現水平的顯著差異。
圖6A至圖6C說明JGF的草藥組成物對Vero E6細胞中SARS-CoV-2斑塊形成的抑制作用。圖6A顯示以不同濃度的JGF(0至800μg/mL)處理72小時的Vero E6細胞的細胞活力。每組經JGF處理的樣品都對比未處理的對照進行標準化。使用MTT測定法測定細胞活力。圖6B顯示以JGF(0至200μg/mL)預處理Vero E6細胞1小時，然後以SARS-CoV-2感染3天的實驗方案。圖6C顯示以結晶紫染色斑塊的實驗結果。在量化長條圖中，數據代表三個獨立的實驗，並以平均值±SD表示；誤差線表示SD。
圖7顯示在UV 254nm檢測下，JGF的草藥組成物的HPLC指紋圖譜。峰1：黃芩苷(baicalin)，保留時間(rt)=23.0分鐘；峰2：wagonin-7-O-glucuronide，rt=25.6分鐘；峰3：wagonin-7-O-glucose，rt=27.0分鐘；峰4：黃芩素(baicalein)，rt=32.4分鐘。
圖8顯示共軛焦影像，其描繪表現eGFP的BHK-21細胞為綠色以及DiI標記的Calu-3細胞為紅色。在沒有SARS-CoV-2 S蛋白的情況下，表現eGFP的BHK-21細胞可以附著但不與Calu-3細胞融合。當eGFP和SARS-CoV-2棘蛋白在BHK-21細胞中共表現時，BHK-21可與DiI標記的Calu-3細胞融合，形成一個包含eGFP和DiI訊號的大合胞體。
圖9A至圖9H顯示草藥組成物JGLF對不同細胞模型中ACE2和TMPRSS2表現、細胞活力、NO的產生及IL-6的產生的影響。數據包含三個獨立實驗，並以平均值±SD表示；誤差線表示SD。顯著差異表示為* p<0.05,** p<0.01。圖9A和圖9B分別顯示在不同時間點和劑量的JGLF處理下ACE2和TMPRSS2的表現。西方墨點分析檢測ACE2和TMPRSS2的表現。微管蛋白作為內部對照。圖9C至圖9F顯示用或不用LPS處理的RAW264.7細胞中的細胞 活力和NO的產生。RAW264.7細胞以不同濃度的JGLF(0至800μg/ml)或LPS(1μg/ml)處理24小時。藉由MTT和Griess測定法測定細胞活力和NO的產生。細胞活力相對於對照組標準化，NO的產生相較於陽性(LPS)組標準化。圖9G和圖9H顯示用或不用LPS處理24小時的RAW264.7細胞中IL-6的產生。RAW264.7細胞用不同濃度的JGLF(0至800μg/ml)及/或LPS(1μg/ml)處理24小時。IL-6蛋白的產生由ELISA確定，且每組都相對陽性(單獨的LPS)組進行標準化。圖9I顯示JGLF的草藥組成物在UV 254nm檢測下的HPLC指紋圖譜。峰1：連翹苷A(forsythoside A)，保留時間(rt)=17.05分鐘；峰2：特女貞苷(specnuezhenide)，rt=19.18分鐘；峰3：黃芩苷，rt=24.43分鐘；峰4：oroxyloside，rt=27.55分鐘；峰5：acacetin-7-O-glucose，rt=31.21分鐘：峰6：漢黃芩苷(wogonoside)，rt=29.37分鐘：峰7：漢黃芩素，rt=34.65；峰8：漢黃芩素(wogonin)，rt=42.24。
圖10A至圖10H顯示草藥組成物JGEF對不同細胞模型中ACE2和TMPRSS2表現、細胞活力、NO的產生和IL-6的產生的影響。數據包含三個獨立實驗，並以平均值±SD表示；誤差線表示SD。圖10A和圖10B分別顯示在不同時間點和劑量下以JGEF處理的ACE2及TMPRSS2的表現，以及JGEF處理後不同時間和劑量下的TMPRSS2表現。西方墨點分析檢測ACE2和TMPRSS2的表現。微管蛋白作為內部對照。圖10C至圖10F顯示用或不用LPS處理的RAW264.7細胞中的細胞活力和NO的產生。RAW264.7細胞以不同濃度的JGEF(0至800pg/ml)或LPS(1μg/ml)處理24小時。藉由MTT和Griess測定法測定細胞活力和NO的產生。細胞活力相對於對照組標準化，且NO的產生相對於陽性(LPS)組標準化。圖10G和圖10H顯示用或不用LPS處理的RAW264.7 細胞中IL-6的產生。RAW264.7細胞以不同濃度的JGEF(0至800μg/ml)及/或LPS(1μg/ml)處理24小時。IL-6蛋白的產生由ELISA測定，且每組都相對陽性(單獨的LPS)組進行標準化。
圖11A至圖11F顯示草藥組成物JGEF-E對不同細胞模型中ACE2和TMPRSS2表現、細胞活力和NO的產生的影響。數據包含三個獨立實驗，並以平均值±SD表示；誤差線表示SD。圖11A和圖11B分別顯示在不同時間點和劑量下以JGEF-E處理的ACE2表現和TMPRSS2表現。西方墨點分析檢測ACE2和TMPRSS2的表現。微管蛋白作為內部對照。圖11C至圖11F顯示用或不用LPS處理的RAW264.7細胞中的細胞活力和NO的產生。RAW264.7細胞以不同濃度的JGEF-E(0至200μg/ml)或LPS(1μg/ml)處理24小時。藉由MTT和Griess測定法測定細胞活力和NO的產生。細胞活力相對於對照組標準化，而NO的產生相對於陽性(LPS)組標準化。
以下將對本揭露實施例所體現的技術方案進行更加清楚、完整的描述，所描述的實施例顯然僅為本揭露實施例的一部分，而不僅限於此。本揭露亦可如在不同示例中所描述的被實施或應用。本技術領域中具有通常知識者在沒有作出創造性勞動之前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本揭露保護的範圍。
需進一步說明的是，除非明確地限於一個指示物，在本揭露中所使用的單數形式「一」和「該」包括複數指示物。除非內文另有明確說明，否則術語「或」可與術語「及/或」互換使用。
如本文所用，術語「包含」或「包括」用於指代包含在本揭露中但仍開放性包含未指明的要素或步驟的組成物、方法及其各自的組分，無論必要與否。
本揭露涉及一種草藥組成物、一種製備該草藥組成物的方法，以及一種藉由使用該草藥組成物在有需要的個體中預防或治療病毒感染的方法。
在至少一個實施例中，藉由本揭露的方法預防或治療的病毒感染可由冠狀病毒(CoV)引起。在至少一個實施例中，該冠狀病毒係SARS-CoV或SARS-CoV-2。
在至少一個實施例中，病毒感染導致呼吸道症狀，包括喉嚨痛、頭痛、咳嗽、發燒、流鼻涕、腹瀉或新的味覺或嗅覺喪失。在一些實施例中，病毒感染亦導致包括疲勞、緊張或壓力的症狀。
CoV的結構蛋白包括核衣殼(N)、小套膜(E)、基質(M)及三聚體棘(S)醣蛋白，其對於在感染期間之病毒體組裝以及完成病毒生命週期的功能至關重要。在一些實施例中，本揭露之預防或治療病毒感染的方法包括向有此需要的個體投藥草藥組成物，其誘導血管收縮素-轉換酵素2(ACE2)受體的降解，從而阻斷冠狀病毒S蛋白和宿主細胞的交互作用，以及抑制冠狀病毒在宿主體內進入及/或複製所需的蛋白質的表現，例如跨膜絲胺酸蛋白酶2(TMPRSS2)，從而影響承受病毒感染或加重病情進展的風險。因此，本揭露的草藥組成物可具有抗病毒活性並且可用於有效預防或治療病毒感染。
如本文所用，術語「預防」或「避免」係指針對疾病或疾病的症狀或病況的預防或避免措施，其包括但不限於向個體施用或投藥一種或多種活性劑，其中該個體尚未被診斷為患有該疾病或該疾病的症狀或病況，但可能為易 感於或易罹患該疾病的患者。提供本揭露的預防措施以避免、預防或延遲疾病或疾病的症狀或病況的發生。
如本文所用，術語「治療」或「處理」係指獲得所需的藥理和/或生理作用，例如抑制病毒進入及/或在宿主中複製。就完全或部分預防疾病或其症狀或病症而言，該作用可以是預防性的，或者就完全或部分治癒、減輕、緩解、補救或改善疾病或歸因於該疾病或其症狀或病況的不利影響而言，該作用可以是治療性的。
如本文所用，術語「患者」和「個體」可互換使用。術語「個體」係指人或動物。個體的例子包括但不限於人、猴子、小鼠、大鼠、土撥鼠、雪貂、兔子、倉鼠、牛、馬、豬、鹿、狗、貓、狐狸、狼、雞、鴯鶓、鴕鳥、及魚。在本揭露的一些實施例中，個體係哺乳動物，例如人等靈長類動物。
如本文所用，短語「有效量」係指對有需要的個體賦予期望的預防或治療效果(例如，減少宿主中的病毒數量)之所需的活性劑的量。正如本技術領域中具通常知識者所認知的，有效劑量可能會有所不同，其取決於給藥途徑、賦形劑的使用、與其他治療共同使用的可能性、以及待治療的病症。
如本文所用，術語「投藥」、「投予」或「施用」係指藉由一方法或途徑而將活性劑置於患者體內，其導致活性劑至少部分定位在所需部位以產生所需效果。本文所述的活性劑可藉由本技術領域已知的任何合適的途徑施用。例如，本揭露的草藥組成物藉由口服投藥給個體。
在至少一個實施例中，本揭露的草藥組成物包含草藥組合及其藥學上可接受的載體的煎劑，其中該草藥組合包含連翹、黃芩、柴胡、厚朴、藿香、黃芪、白朮和女貞子中的至少五種。
在至少一個實施例中，基於草藥原料的總重量，草藥組合包含以重量計25%至35%(例如，25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%和35%)的連翹，以重量計18%至26%(例如，18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%和26%)的黃芩，以重量計15%至25%(例如，15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%和25%)的柴胡，以重量計15%至25%(例如，15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%和25%)的厚朴，以重量計7%至15%(例如，按重量計7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%和15%)的藿香，以重量計25%至35%(例如，25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%和35%)的黃芪，以重量計7%至15%(例如，7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%和15%)的女貞子，以及以重量計7%至15%(例如，7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%和15%)的白朮。
在至少一個實施例中，草藥組成物中之藥學上可接受的載體可以是稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、助流劑、表面活性劑或其任何組合。組成物中的載體係「可接受的」，其意義上係指與組成物的活性劑相容(例如，能夠穩定活性劑)，並且對接受施用的個體無害。一或多種增溶劑可作為藥物賦形劑以遞送活性成分。其他載體的實例包括膠體氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素和十二烷基硫酸鈉。在一些實施例中，草藥組成物包含選自水、乙醇、麥芽糖糊精、結晶纖維素及其任何組合之藥學上可接受的載體。
許多實施例已被用於說明本揭露。以下實施例不應視為對本揭露範圍的限制。
實施例
為了更詳細地描述本揭露，以下將結合實施例提供和詳細描述該草藥組成物、其製備方法和用途。本揭露中使用但未在本文中註明之材料為可商購的。
製備例1
JGF的草藥組成物使用五種草藥：連翹(Forsythia suspensa)10毫克(總重量的30.3%)、黃芩(Scutellaria baicalensis)8毫克(總重量的24.2%)、柴胡(Bupleurum Chinese)6毫克(總重量的18.2%)、厚朴(Magnolia officinalis)6毫克(佔總重量的18.2%)以及藿香(Agastache rugosa)3毫克(佔總重量的9.0%)。
JGLF的草藥組成物包含黃芩(Scutellaria baicalensis)(3~9克)、連翹(Forsythia suspensa)(3~9克)、黃芪(Astragalus membranaceus)(3~9克)、柴胡(Bupleurum Chinese)(3~9克)、藿香(Agastache rugosa)(2~5克)及女貞子(Ligustrum lucidum的種子)(2~5g)。
JGEF的草藥組成物包含黃芩(Scutellaria baicalensis)(3~9克)、連翹(Forsythia suspensa)(3~9克)、黃芪(Astragalus membranaceus)(3~9克)、柴胡(Bupleurum Chinese)(3~9克)、藿香(Agastache rugosa)(2~5克)、厚朴(Magnolia officinalis)(2~5克)、女貞子(Ligustrum lucidum的種子)(2~5克)、白朮(Atractylodes macrocephala)(2~5克)。
所有成分均購自經過認證的製藥公司(臺灣，科達製藥股份有限公司)。JGF由臺北市立聯合醫院林森中醫昆明院區(臺灣臺北)製作。
用於JGF、JGLF及JGEF的草藥浸泡在水中，隨後使用自動草藥煮沸機在大氣壓力下(即1atm的壓力)煮沸4小時。最終產品重量為110克/包， 體積為100毫升/包。進行HPLC以確保JGF和JGLF的品質和標準含量，如圖7和圖9I所示。
製備例2
將30wt%的連翹、24wt%的黃芩、18wt%的柴胡、18wt%的厚朴及9wt%的藿香浸泡在水中，草藥重量與水的體積比為1：1，隨後在1.2atm的壓力下煮沸2小時。最終產品重量為110克/包，體積為100毫升/包。
製備例3
將24wt%的連翹、24wt%的黃芩、18wt%的柴胡、9wt%厚朴、9wt%的藿香、9wt%的黃芪、9wt%的女貞子以及27wt%的白朮浸泡在水中，其中草藥重量與水的體積比為1：5，隨後在1.5個大氣壓下煮沸4小時。最終產品重量為110克/包，體積為100毫升/包。
製備例4
將製備例1中描述的JGEF或JGLF以草藥重量與水的體積比為1：5浸泡在水中，隨後在1.5個大氣壓下煮沸4小時。最終產品重量為110克/包，體積為100毫升/包。
製備例5
本實施例中，以製備例2或3中所述草藥的用量製備乙醇萃取物，不同之處在於以重量/體積比為1：1的方式將草藥與浸泡在95%的酒精中，培育3天，以獲取來自草藥組成物的乙醇萃取物。
製備例6
本實施例中，乙醇萃取物是以上述草藥JGEF的用量製備而成。在乾燥並浸泡在冷的95%乙醇中後，測量JGEF-E的草藥的乾重。將200毫升的 95%乙醇添加到40克(乾重)的JGEF-E草藥中。將混合物以超音波震盪30分鐘並過濾。萃取液留存備用。重複第二和第三步驟，直到乙醇不著色(本萃取為5次)。萃取物先經過吸濾器，然後經過烘箱以去除乙醇。將剩餘溶液冷凍乾燥。稱量最終產物，並以DMSO將其重新溶解為160mg/ml以用於後續實驗。
藥理學實施例1：材料和方法
本揭露所提供用於預防或治療冠狀病毒感染的中藥組成物的療效於以下藥理學實施例2至8中進行測定。這些實施例中所使用的實驗方法描述如下。
臨床環境及參與者
作為抗COVID-19的預防措施，JGF被施用於醫院的一線工作人員。該組成物提供給臺北地區的另外五家公立醫院。臨床研究於2020年2月20日至2020年5月20日進行。受試者將JGF作為一種補充性預防策略。無症狀受試者建議每週服用一劑，而表現出類COVID-19症狀的受試者則建議每週服用兩劑。
總共提供了2468包JGF給1086人，其中396人參與問卷調查。所有參與者都來自臺北地區(臺北市及新北市)。該研究經臺北市立聯合醫院人體研究倫理審查委員會(TCHIRB-10904015)批准。然後要求參與者自行填寫線上問卷或親自到院填寫。調查問卷記錄個人的人口統計資訊、服用JFG前的症狀、症狀或不良反應的任何改善以及滿意度。
細胞培養及病毒
BHK-21細胞和Calu-3細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)和1×青黴素/鏈黴素溶液的Dulbecco’s Modified Eagle培養液(DMEM，Gibco)中培養。 Vero E6細胞維持在補充有10% FBS的高葡萄糖DMEM(GeneDireX)中。正常人類肺上皮WI-38 VA-13分株2RA和纖維母細胞MRC-5細胞購自生物資源保存及研究中心(BCRC，臺灣新竹)。細胞於37℃及混合95%的空氣和5%的二氧化碳的條件下，於補充10% FBS、2mM L-麩醯胺酸、1.5g/L碳酸氫鈉、0.1mM非必需胺基酸和1.0mM丙酮酸鈉的最低必需培養基(Eagle，Gibco)中培養。
SARS-CoV-2株3586(TSGH_15 GISAID登錄號EPI_ISL_436100)於國防醫學院預防醫學研究所分離，並在Vero E6細胞中擴增。使用溶斑試驗(plaque assay)測定病毒滴度(titer)。SARS-CoV-2在BSL-3實驗室進行。
細胞-細胞融合試驗
Calu-3作為靶細胞接種於12孔板(每孔1×106個)，於48小時形成單層細胞膜。將BHK-21細胞接種在6孔板(每孔4×105)中，並用增強型綠色螢光蛋白(GFP)和棘(spike)質體以1：5的比例轉染24小時。使用細胞解離緩衝液(Gibco)穫取GFP/棘共表現BHK-21細胞，並重懸浮於無血清DMEM中。對於棘介導的細胞-細胞融合試驗，將作為供體細胞的GFP/棘共表現BHK-21細胞添加至Calu-3細胞中，並在4℃下培育45分鐘以允許細胞-細胞結合。然後以PBS洗滌。更換生長培養基，然後將細胞在37℃下培育4小時以允許細胞-細胞融合。培育後，在每個孔中隨機選擇五個視野，使用倒立螢光顯微鏡(Olympus IX70)記錄表現GFP的細胞影像。使用ImageJ軟體對表現GFP的細胞影像的延伸區域進行量化，以測定細胞融合的程度。對照組之EGFP陽性區域從0小時到4小時的倍數變化作為衡量兩種實驗條件下倍數變化的基礎。如下式所示，如果GFP的相對面積變化小於對照組，則標準化百分比將小於100%，表示JGF的有效抑 制。另一方面，如果GFP的相對面積變化等於甚至大於對照組，則標準化百分比將大約等於或大於100%，此反過來意指抑制無效。
標準化百分比(%)=(GFP區域倍數變化)/(對照之GFP區域倍數變化)×100
SARS-CoV-2斑塊形成試驗
將Vero E6細胞(4×105/孔)接種到12孔板中。在感染SARS-CoV-2株3586之前，將細胞在37℃和5% CO2條件下以JGF(50、100和200μg/mL)處理3小時，並偶爾搖動。在JGF處理後，加入50μL SARS-CoV-2(2×103斑塊形成單位(PFU)/孔)樣品並在37℃下吸附1小時。吸收期後，去除培養基，加入4mL之含1.55%(v/v)甲基纖維素及含JGF的DMEM(添加2% FBS)，在37℃及5% CO2條件下培養3天。然後將細胞用10%甲醛在室溫下固定1小時，並在室溫下將0.5%(w/v)結晶紫添加到經固定的細胞中至少30分鐘。SARS-CoV-2病毒(nCoV-19/Taiwan/4/2020)係從臺灣疾病管制署(CDC)所獲得。所有涉及活SARS-CoV-2的實驗均根據生物安全委員會的要求，在國防醫學院預防醫學研究所中經CDC核准的BSL-3和BSL-4設施中進行。
細胞活力測定
將細胞(5×104個細胞/孔)接種到12孔培養盤中並培育過夜。然後以JGF(0至800μg/mL)處理細胞48和72小時。培育後，以PBS沖洗每個孔，將附著在孔底的細胞固定並以1%結晶紫溶液或(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)(MTT)溶液染色，如T.Y.Lin,H.Y.Hsu,W.H.Sun,T.H.Wu及S.M.Tsao“Induction of Cbl-dependent epidermal growth factor receptor degradation in Ling Zhi-8 suppressed lung cancer,”Int.J.Cancer 140(2017)2596-2607所述。
乳酸脫氫酶(LDH)測定法檢測JGF在BHK-21和Calu-3細胞中的細胞毒性
JGF對BHK-21和Calu-3細胞的細胞毒性使用細胞毒性檢測KitPLUS(LDH；Merck)測定。BHK-21和Calu-3細胞接種在96孔盤中(1×104個細胞/孔)。在37℃培育過夜後，將細胞置於含有不同濃度JGF(20、40和80μg/mL)的生長培養基中，然後在37℃培育24小時。未處理的細胞為低對照，因此其在正常情況下自發性釋放LDH。以裂解緩衝液(5μL)處理15分鐘的細胞為高對照，其用於測定細胞中LDH的最大釋放量。為測定LDH活性，將100μL之反應混合物(藉由混合催化劑和染料溶液新鮮地製備)添加到每個孔中，並在室溫下培育15分鐘。多功能微量盤式分析儀(TECAN SPARK)用於測量樣品在490nm波長處的吸光度。細胞毒性百分比由3次獨立實驗確定，而細胞毒性由下式確定：
細胞毒性(%)=(JGF處理組之吸光度-未處理組之吸光度)/(Triton處理組之吸光度-未處理組之吸光度)×100
用於西方墨點分析的樣品製備
以含有1% Na3VO4的冷PBS沖洗細胞，藉由將細胞刮入含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑混合物(Sigma Chemical Co.)之裂解緩衝液(10mM HEPES(pH 7.9)、10mM KCl、0.1mM EDTA和0.1mM EGTA)之中以獲取細胞。全細胞裂解物在4℃下以13,000×g離心10分鐘。收集上清液作為細胞萃取物。使用Bradford測定法(Bio-Rad,Hercules，CA)測定細胞裂解物中的蛋白質濃度。然後對細胞裂解物樣品(30μg)進行西方墨點分析。β-肌動蛋白的表現作為內部對照。在本揭露中使用的西方墨點測定的程序係本領域公知的。抗ACE2、TMPRSS2和肌動蛋白的抗體購自GeneTex(臺灣新竹)。
RNA萃取及定量聚合酶鏈反應(q-PCR)
使用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從細胞中分離全部RNA。藉由使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme，JS，China)進行cDNA合成。藉由使用Fast SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific)和Applied Biosystems Model 7000儀器(Thermo Fisher Scientific)進行三次重複q-PCR。使用2-ΔCt對數據進行定量(ΔCt=Ct目標基因-CtGAPDH；Ct：當樣品的螢光值等於閾值時的循環數)。本研究的引子序列包括hTMPRSS2-F：5’-CCTCTAACTGGTGTGATGGCGT-3’(SEQ ID NO.：1)；hTMPRSS2-R：5’-TGCCAGGACTTCCTCTGAGATG-3’(SEQ ID NO.：2)；hGAPDH-F：5’-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’(SEQ ID NO.：3)；及hGAPDH-R：5’-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAG-3’(SEQ ID NO.：4)。
動物模型
六至八個月大的雄性C57BL/6小鼠購自國家實驗動物中心(臺灣臺北)。為確定JGF對小鼠各器官中ACE2及TMPRSS2表現的影響，將小鼠隨機分為實驗組(n=3)。對於實驗1，餵食小鼠JGF(8毫克/小鼠/天)兩次。對於實驗2，使用低溫蒸汽法(30至32度)將JGF充填在密閉空間中並讓小鼠吸入。暴露於JGF 30分鐘後，將小鼠轉移到正常環境中10分鐘，然後再暴露30分鐘。小鼠在接受JGF 3小時後被處死。所有程序均根據國立陽明交通大學實驗動物照護及使用委員會(IACUC)的指南和規定核准並執行(IACUC核准號：1100511)。
統計分析
使用GraphPad Prism8中的t檢定確定實驗組之間的統計差異。P<0.05的值表示統計上顯著的結果。實驗進行三次或按指示進行，所有數據均表示為平均值±標準差(SD)。
藥理學實施例2：JGF治療人類受試者的臨床觀察
臨床觀察涉及接受JGF並參與問卷調查的396名受試者。參與者的平均年齡為45.9歲，標準差為14.1歲。男女比例分別為35.1%(男性)和64.9%(女性)。下表1總結了參與調查問卷的396名受試者的人口統計學和臨床特徵。
結果發現，喉嚨痛係報告最多的類COVID-19症狀，其中34名受試者表現出此種症狀。咳嗽和頭痛係第二和第三最常報告的類COVID-19症狀，味覺和嗅覺喪失(味覺異常)是最不常報告的類COVID-19症狀。報告的非類COVID-19症狀包括疲勞(n=128)及緊張(tension)(n=102)。
服用JGF7天後，91.2%的喉嚨痛受試者報告症狀有所改善。亦報告非類COVID-19症狀的改善，例如疲勞(81.3%)和緊張(68.6%)。
表1.具有類COVID-19症狀之受試者的人口學和臨床特徵
Figure 111144013-A0202-12-0021-2
藥理學實施例3：JGF阻止膜融合及合胞體形成
存在於細胞膜上的SARS-CoV-2的S蛋白觸發受體依賴性合胞體形成，並採用基於螢光的細胞-細胞融合測定以檢測表現SARS-CoV-2的細胞間膜融合之形成。例如，BHK-21細胞同時表現SARS-CoV-2 S蛋白和增強型綠色螢光蛋白(GFP)並作為效應物，而Calu-3細胞表現內源性hACE2並作為靶細胞。
對於該測定，BHK-21細胞與Calu-3細胞的結合顯示SARS-CoV-2 S蛋白與ACE2受體結合，合胞體形成係膜融合的結果。為證實JGF對BHK-21和Calu-3細胞的細胞毒性，以20至80μg/mL之不同濃度的JGF處理細胞。Triton-100處理則作為陽性對照。與未接受JGF處理的對照組相比，LDH測定顯示JGF未引起顯著量的細胞死亡，顯示JGF對BHK-21細胞或Calu-3細胞均無細胞毒性，如圖1A所示。
接著藉由西方墨點法測定JGF對Calu-3細胞中ACE2表現的影響。結果表現，ACE2的水平顯著降低，在40μg/mL之JGF處理的情況下降低大約70%，如圖1B所示。
鑑於在細胞-細胞融合實驗中細胞-細胞融合的發生可視覺化為合胞體形成，共軛焦顯微成像的結果如圖8所示，僅於SARS-CoV-2 S蛋白存在的情況下，Calu-3細胞的DiI標記細胞區室與大合胞體中的GFP訊號共定位，意指表現GFP的BHK-21細胞與DiI-標記的Calu-3細胞融合。
在細胞-細胞融合測定中，螢光顯微影像顯示JGF的處理抑制合胞體形成，如圖1C和圖1D所示。卡莫司他(camostat)，係TMPRSS2蛋白酶的藥理學抑制劑，如圖1C和圖1D，以其治療導致合胞體形成受到抑制，並作為陽性對照組。亦顯示JGF之抑制呈現劑量依賴性，意指JGF可以專一性中斷SARS- CoV-2 S介導的膜融合。這些結果表示，JGF可作為抗SARS-CoV-2劑，因為其可抑制膜融合，其為病毒感染第一步之一。
藥理學實施例4：JGF對人類纖維母細胞WI-38及MRC-5細胞無細胞毒性影響
兩種人類肺細胞株，上皮細胞WI-38和纖維母細胞MRC-5，用於測定JGF之細胞毒性影響。使用結晶紫測定以測定JGF抑制人類肺細胞活性的濃度。如圖2A和圖2B所示，發現JGF對WI-38或MRC-5細胞均未表現出細胞毒性，因此JGF對細胞是安全無毒的。
藥理學實施例5：JGF誘導ACE2的溶酶體依賴性降解
如前圖1A至圖1D所示，發現JGF有效地阻斷棘蛋白與ACE2受體之間的交互作用並抑制膜融合，此於病毒感染中發揮作用。進一步研究JGF抑制SARS-CoV-2感染正常人類肺細胞的機制。
已經證明，藉由靶向肺細胞中的ACE2以阻止SARS-CoV-2棘受體與ACE2結合，可預防SARS-CoV-2感染。因此，進一步研究以顯示JGF對WI-38和MRC5細胞中ACE2蛋白水平的影響。
如圖3A和圖3B所示，發現在3小時的處理中，以JGF進行的短暫處理使ACE2的表現顯著降低約40%至50%，但是當用JGF處理更長時間(24小時)時，ACE2的水平會增加。這些結果顯示JGF暫時下調ACE2水平以減少SARS-CoV-2的感染。
這些結果表顯示，JGF於短時間內顯著抑制ACE2的總蛋白水平。因此，進一步檢測JGF下調ACE2水平的機制。例如，檢查JGF誘導的ACE2降解是否依賴於蛋白酶體或溶酶體系統。最初，以環己醯亞胺(CHX)處理後分析 WI-38細胞中ACE2的半衰期，CHX係一種阻斷蛋白質合成的核醣體抑制劑。結果發現，當WI-38細胞與JGF和CHX共同處理時，ACE2的水平以時間依賴性方式顯著下調，如圖3C所示，表明JGF可誘導ACE2的降解。接著，使用溶酶體抑制劑BafA1，發現經JGF處理後，BafA1恢復WI38細胞中的ACE2水平，如圖3D和圖3E所示。
這些結果顯示，JGF可用於藉由誘導ACE2降解以預防SARS-CoV-2感染。
藥理學實施例6：JGF下調TMPRSS2水平
TMPRSS2是另一種在SARS-CoV-2感染中發揮作用的膜蛋白。因此，進一步檢測JGF是否影響WI38和MRC-5細胞中TMPRSS2的表現。如圖4A和4B所示，發現JGF在短時間內不影響TMPRSS2的表現。然而，JGF的長期治療有效地將TMPRSS2的表現下調40%至70%。同時，JGF在24小時處理中顯著降低TMPRSS2的mRNA，如圖4C所示。這些結果顯示JGF調節了控制TMPRSS2合成的訊號轉導。
藥理實施例7：JGF下調小鼠多個器官ACE2和TMPRSS2的表現
已知ACE2及TMPRSS2在一些人體器官中表現。例如，ACE2大量存在於肺和小腸的上皮中。正如M.Dong,J.Zhang,X.Ma,J.Tan,L.Chen,S.Liu,Y.Xin,and L.Zhuang,“ACE2,TMPRSS2 distribution and extrapulmonary organ injury in patients with COVID-19,”Biomed.Pharmacother.131(2020)110678所述，已在心臟、消化道、腎臟和腦中檢測到ACE2和TMPRSS2的mRNA表現。
因此，檢測小鼠肺、腦、大腸和腎組織中ACE2和TMPRSS2的水平。
為確定JGF是否影響小鼠該些器官中ACE和TMPRSS2的水平，進行一系列體內實驗。最初，研究口服攝入的JGF對小鼠體內的影響。連續飼餵JGF 2天可有效降低小鼠肺中ACE2和TMPRSS2的蛋白質水平，如圖5A和圖5B所示。例如，發現在接受JGF投藥的小鼠中，ACE單體水平顯著降低45%；然而，肺組織中ACE2的二聚體形式並未減少。另一方面，JGF將TMPRSS2的蛋白質水平降低50%，亦顯示於圖5B中。
另外，基於中醫之觀點，藥物藉由蒸汽的方法經過鼻腔吸收，其可使草藥快速進入鼻腔和肺，以治療感冒症狀。亦採用蒸汽法，讓小鼠吸入JGF，如圖5C所示。如圖5D所示，發現小鼠吸入JGF後ACE2(包括單體和二聚體)降低50%以上；然而，在短期接觸JGF後TMPRSS2水平沒有變化。
另發現，JGF不影響小鼠的體重，如圖5E所示。此外，為檢查以JGF餵養的小鼠的肝腎損傷程度，在JGF治療結束後分析血液樣本中的天門冬胺酸轉胺酶(AST)/丙胺酸轉胺酶(ALT)和血尿素氮(BUN)/肌酸酐(CRE)水平。結果示於圖5F和圖5G中，顯示JGF在小鼠模型中既不影響肝功能也不引起腎毒性。這些結果顯示，JGF可於沒有副作用的情況下減少SARS-CoV-2的感染。此外，圖5H和圖5I顯示JGF處理沒有改變其他組織(包括腎臟、皮質和大腸)中ACE2和TMPRSS2的表現水平。
藥理實施例8：JGF抑制SARS-CoV-2在Vero E6細胞上的斑塊形成
上文顯示JGF藉由減少ACE2和TMPRSS2以避免病毒感染細胞。因此，進一步研究JGF是否可抑制SARS-CoV-2的感染及增生。
選擇Vero E6細胞以研究SARS-CoV-2感染。最初，檢測JGF對Vero E6細胞活力的影響。如圖6A所示，發現即使在高濃度的JGF下，JGF亦不表現對Vero E6細胞的細胞毒性影響。50細胞毒性濃度(CC50)高於800μg/mL。
接著，進行病毒溶斑形成試驗，以檢測JGF於預防SARS-CoV-2感染方面之功效。Vero E6細胞在SARS-CoV-2感染前以JGF預處理，如圖6B所示。結果發現，與用於COVID-19的抗病毒藥物瑞德西韋(REM)在2μM的濃度相比，JGF以濃度依賴性方式顯著抑制溶斑形成，如圖6C所示。例如，200μg/mL的JGF可使SARA-CoV-2的溶斑形成減少70%。綜上所述，這些結果顯示JGF減少SARS-CoV-2的感染和增生。
藥理學實施例9：JGLF下調ACE2及TMPRSS2表現，且展現抗發炎效果
如圖9A和圖9B所示，WI38細胞短期處理(3小時)中，JGLF劑量依賴性地抑制ACE2的蛋白表現；然而，TMPRSS2水平在短期接觸JGF後沒有變化。另一方面，JGLF在最高濃度的長期治療(24小時)下將TMPRSS2的蛋白表現降低60%，而不影響ACE2水平。上述數據顯示，JGLF藉由減少ACE2和TMPRSS2以預防病毒感染細胞。因此，進一步研究JGLF是否可抑制發炎。
已發現JGLF不影響巨噬細胞的活力，亦不誘導發炎因子NO的產生，因此，JGLF與JGF一樣安全，並且與LPS相比對細胞無毒，如圖9C和圖9D所示。此外，LPS存在的情況下(如圖9E和圖9F所示)，JGLF不影響LPS刺激的巨噬細胞的活力，但抑制NO產生。也就是說，在LPS刺激巨噬細胞發炎後，JGLF不影響細胞存活，但抑制LPS誘導的NO產生。
最後，於使用或不用LPS處理的巨噬細胞中，單用JGLF輕微誘導介白素-6發炎因子(如圖9G所示)，但顯著抑制LPS誘導的介白素-6產生(如圖9H所示)。
藥理實施例10：JGEF下調TMPRSS2表現，且展現抗發炎效果
如圖10A和圖10B所示，JGEF在WI38細胞中影響短期治療中ACE2蛋白表現和長期治療中TMPRSS2蛋白表現。接著，進一步研究JGEF對RAW26.7細胞發炎的影響。與JGLF類似，單用JGEF不影響巨噬細胞的活力(如圖10C所示)，亦不誘導發炎因子NO的產生(如圖10D所示)。如圖10E和圖10F所示，在LPS存在下，巨噬細胞的活力不受JGEF的影響，但LPS刺激的巨噬細胞的NO產生受到抑制。
此外，在巨噬細胞中，與LPS相比，單用JGEF不影響發炎症因子介白素-6(如圖10G所示)，但抑制LPS誘導的介白素-6產生(如圖10H所示)。
藥理學實施例11：JGEF-E下調TMPRSS2表現，且展現抗發炎效果
首先，JGEF-E抑制TMPRSS2的蛋白表現但不影響ACE2蛋白表現，如圖11A和圖11B所示。其次，JGEF-E不影響巨噬細胞的活性，相對於LPS，其亦不誘導發炎因子NO的產生，如圖11C和圖11D所示。最後，JGEF-E不影響LPS刺激的巨噬細胞的活力，但抑制LPS刺激的巨噬細胞的NO產生，如圖11E和圖11F所示。
雖然以上對本發明的一些實施例進行詳細描述，但是本技術領域中具通常知識者可對所示實施例進行各種修改和變化而不實質背離本揭露的教 示和優點。這樣的修改和變化因此包含在如所附申請專利範圍中闡述之本揭露的範圍內。

Claims (15)

  1. 一種用於預防或治療病毒感染的草藥組成物，包含草藥組合及其藥學上可接受的載體的煎劑，其中，該草藥組合包含選自由連翹(Forsythia suspensa)、黃芩(Scutellaria baicalensis)、柴胡(Bupleurum Chinese)、厚朴(Magnolia officinalis)、藿香(Agastache rugosa)、黃芪(Astragalus membranaceus)、白朮(Atractylodes macrocephala)及女貞子(女貞(Ligustrum lucidum)的種子)所組成的群組中之至少五種。
  2. 如請求項1所述之草藥組成物，其中，該煎劑係水萃取物或乙醇萃取物。
  3. 如請求項1所述之草藥組成物，其中，該草藥組合基於其總重量包含：按重量計25%至35%的連翹、按重量計18%至26%的黃芩、按重量計15%至25%的柴胡、按重量計15%至25%的厚朴、按重量計7%至15%的藿香、按重量計25%至35%的黃芪、按重量計7%至15%的女貞子，以及按重量計7%至15%的白朮。
  4. 一種製備如請求項1所述之草藥組成物的方法，包含：
    提供包含選自由連翹、黃芩、柴胡、厚朴、藿香、黃芪、白朮及女貞子所組成群組中之至少五種之草藥組合；
    以包括水和乙醇中之至少一種之萃取溶液藉由煮沸來萃取草藥；以及
    自萃取物中去除固體物以獲得煎劑。
  5. 如請求項4所述之方法，其中，該萃取包括將該萃取溶液中的該草藥組合煮沸至少1小時。
  6. 如請求項5所述之方法，其中，該萃取包括將該萃取溶液中的該草藥組合煮沸2至4小時。
  7. 如請求項4所述之方法，其中，該萃取包括在至少70℃的溫度下煮沸該萃取溶液中之該草藥組合。
  8. 如請求項7所述之方法，其中，該萃取包括在100℃至120℃的溫度下煮沸該萃取溶液中之該草藥組合。
  9. 如請求項4所述之方法，其中，該萃取包括在至少1atm的大氣壓力下煮沸該萃取溶液中之該草藥組合。
  10. 如請求項9所述之方法，其中，該萃取包括在至少1.1至1.3atm的大氣壓力下煮沸該萃取溶液中之該草藥組合。
  11. 如請求項4所述之方法，其中，該草藥組合與該萃取溶液的重量比為0.5：1至5：1。
  12. 一種用於預防或治療有此需求的個體的病毒感染的方法，包括投藥該個體有效量的請求項1所述之草藥組成物。
  13. 如請求項12所述之方法，其中，該病毒感染係由冠狀病毒所引起。
  14. 如請求項13所述之方法，其中，該冠狀病毒係嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸症候群冠狀病毒(MERS-CoV)、新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)、小鼠肝炎病毒(MHV)或豬流行性下痢病毒(PEDV)。
  15. 如請求項12所述之方法，其中，該冠狀病毒係SARS-CoV-2變體。
TW111144013A 2021-11-18 2022-11-17 草藥組成物、其製備方法及其用途 TW202339784A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163280635P 2021-11-18 2021-11-18
US63/280,635 2021-11-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202339784A true TW202339784A (zh) 2023-10-16

Family

ID=86324795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111144013A TW202339784A (zh) 2021-11-18 2022-11-17 草藥組成物、其製備方法及其用途

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20230149494A1 (zh)
TW (1) TW202339784A (zh)

Also Published As

Publication number Publication date
US20230149494A1 (en) 2023-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liang et al. Insights into forsythia honeysuckle (Lianhuaqingwen) capsules: A Chinese herbal medicine repurposed for COVID-19 pandemic
CN113244212B (zh) 黄芩素在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染疾病的药物中的应用
RU2505306C2 (ru) Композиция для профилактики и лечения вирусных инфекций
CN113855654A (zh) 一种预防和治疗冠状病毒感染的组合物
CN109419786A (zh) 大麻二酚在制备抗流感的药物中的用途
TW202339784A (zh) 草藥組成物、其製備方法及其用途
Xiaomei et al. Danshen (Radix Salviae Miltiorrhizae) reverses renal injury induced by myocardial infarction
US11045516B2 (en) Compositions for preventing or treating diseases or disorders associated with neuro-inflammation, neuro-apoptosis, or neuro-oxidative damage and uses thereof
CN116018143A (zh) 用于治疗由sars-cov-2病毒引起的病毒感染的包含地尔硫卓的组合物
JP7461688B2 (ja) 薬草組成物、その製造方法、およびそれを投与することによるウイルス感染の予防または治療方法
KR101665016B1 (ko) 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물
CN111643612A (zh) 一种防治新冠病毒肺炎的中药组合物及其制备方法与用途
Traeder Extract from Cistus× Incanus L. Pandalis also Effective Against “British” Alpha (B. 1.1. 7) and “South African” Beta (B. 1.351) SARS-CoV-2 Variants
JP4779316B2 (ja) ジコッピ配合モノアミン再取り込み阻害剤
EP4331598A1 (en) Antiviral fungal extracts
WO2024005563A1 (ko) 편도유래줄기세포를 유효성분으로 포함하는 감염성 폐 질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN110075131A (zh) 寨卡病毒减毒株在治疗脑胶质瘤中的应用
WO2023048334A1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타럼 probio 88, 이의 추출물 및 조성물
CN118161481A (zh) 甘草酚在预防与治疗骨质疏松症中的应用
WO2024062228A9 (en) Composition comprising abutilon fruticosum, acacia nubica, acacia bussei and myrsine africana, methods of preparation and therapeutic uses
US20210330728A1 (en) Methods of Clinical Treatment of a Mammal Experiencing a Viral Respiratory Infection and/or Inflammation Resulting from a Viral Respiratory Infection Using Botanical Infusion
GB2622661A (en) Composition
Xu et al. Gastrodin alleviates angiotensin Ⅱ-induced hypertension and myocardial apoptosis and PRDX2/p53 pathway activation
WO2024046653A1 (en) Antiviral fungal extracts
CN113171437A (zh) 小柴胡组合物在制备抗冠状病毒的抗病毒制剂中的应用