TW202330615A - Ｅｐｈｒｉｎ ａ型受體１０特異性抗體、表現其之嵌合抗原受體ｔ細胞及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種對ephrin A型受體10 (EphA10)具有特異性之抗體或其抗原結合片段。本發明亦係關於一種醫藥組合物、用於治療及/或預防有需要之個體的由EphA10引起之疾病及/或病症的方法及用於偵測樣本中之EphA10的方法。

Description

EPHRIN　A型受體10特異性抗體、表現其之嵌合抗原受體T細胞及其應用
本發明係關於對ephrin A型受體10(EphA10)具有特異性之抗體或其抗原結合片段、表現其之嵌合抗原受體T細胞及其應用。
利用治療性單株抗體治療包括實體及血液系統惡性疾病在內之人類疾病係得到充分驗證及確定的。嵌合或人類化單株抗體因其較低之免疫副作用而特別適用於治療應用。在開發用於癌症治療之各種免疫療法中，嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法被視為一種強大的策略。一般而言，CAR T細胞療法係藉由以下方式執行：對患者之T細胞進行基因修飾以使其表現腫瘤特異性CAR，離體細胞擴增並將其再回輸至患者體內。儘管在急性淋巴球性白血病之臨床試驗中實現高達92%的完全恢復率，但CAR T細胞療法之臨床經驗仍受到若干挑戰限制，例如CAR-T細胞之擴增及腫瘤特異性抗原之選擇。
因此，需要開發一種治療癌症的新穎方法。
本發明提供一種新穎癌症抗原受體及其應用。
因此，本發明提供一種對EphA10之抗原決定基具有特異性的抗體或其抗原結合片段。因此，根據本發明之抗體可用於治療及/或預防由EphA10活性及/或信號傳導引起或與EphA10活性及/或信號傳導相關之疾病及/或病症。本發明之抗體亦可用於偵測EphA10。
在一些實施例中，本發明提供一種對EphA10中之抗原決定基具有特異性的抗體或其抗原結合片段；其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區之互補決定區(CDR)及輕鏈可變區之互補決定區，其中該重鏈可變區之該等互補決定區包含CDRH1區、CDRH2區及CDRH3區，且該輕鏈可變區之該等互補決定區包含CDRL1區、CDRL2區及CDRL3區，且其中： 該CDRH1區包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或其實質上類似之序列；該CDRH2區包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列或其實質上類似之序列；該CDRH3區包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列或其實質上類似之序列；且 該CDRL1區包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列或其實質上類似之序列；該CDRL2區包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列或其實質上類似之序列；該CDRL3區包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列或其實質上類似之序列。
在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列或其實質上類似之序列的重鏈可變區；及包括含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列或其實質上類似之序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段進一步對EphA4、EphA5及EphA7中之至少一者具有特異性。
在一些實施例中，該抗體係單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體或奈米抗體。
在一些實施例中，該抗體係多特異性的。
在本發明之一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段與治療劑結合。治療劑之實例包括但不限於抗代謝物、烷化劑、類烷化劑、DNA小溝(minor groove)烷化劑、蒽環黴素(anthracyclines)、抗生素、卡奇黴素(calicheamicin)、抗有絲分裂劑、拓樸異構酶抑制劑、HDAC抑制劑、蛋白酶體抑制劑及放射性同位素。
在本發明之一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段係在細胞之表面上表現。該細胞可為免疫細胞或幹細胞。在本發明之一個實施例中，該免疫細胞係T細胞。在另一態樣中，幹細胞可為誘導性富潛能幹細胞。
本發明亦提供一種載體，其編碼該抗體或其抗原結合片段。
在另一態樣中，本發明提供一種經基因工程改造之細胞，其表現該抗體或其抗原結合片段，或含有該載體。該經基因工程改造之細胞可為免疫細胞或幹細胞。此外，本發明提供一種免疫細胞，其係由經基因工程改造之細胞分化得到。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含有效量的該抗體或其抗原結合片段、該經基因工程改造之細胞或該免疫細胞。
本發明提供一種用於抑制有需要之個體中EphA10介導之信號傳導的方法，其包含向該個體投與該醫藥組合物。或者，本發明提供一種用於抑制有需要之個體中EphA10介導之信號傳導的醫藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、經基因工程改造之細胞或免疫細胞。
本發明亦提供一種用於在罹患由EphA10活性及/或信號傳導引起或與EphA10活性及/或信號傳導相關之疾病及/或病症的個體中治療、預防性治療及/或預防該等疾病及/或病症的方法，其包含向該個體投與該醫藥組合物。或者，本發明提供一種用於在罹患由EphA10活性及/或信號傳導引起或與EphA10活性及/或信號傳導相關之疾病及/或病症的個體中治療、預防性治療及/或預防該等疾病及/或病症的醫藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、經基因工程改造之細胞或免疫細胞。
本發明亦提供一種用於在罹患腫瘤之個體中治療、預防性治療及/或預防該腫瘤的方法，其包含向該個體投與該醫藥組合物。在本發明之一些實施例中，腫瘤係實體腫瘤。腫瘤之實例包括但不限於腎細胞癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、前列腺癌、惡性神經膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤。或者，本發明提供一種用於在罹患腫瘤之個體中治療、預防性治療及/或預防該腫瘤的醫藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、經基因工程改造之細胞或免疫細胞。
本發明提供一種用於偵測樣本中之EphA10的方法，其包含使該樣本與該抗體或其抗原結合片段接觸。
本發明提供一種用於中和有需要之個體中之EphA10的方法，其包含向該個體投與該抗體或其抗原結合片段。或者，本發明提供一種用於中和有需要之個體中之EphA10的醫藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、經基因工程改造之細胞或免疫細胞。
本發明提供一種用於偵測樣本中之EphA10的套組，其中該套組包含該抗體或其抗原結合片段。
以下部分中詳細描述本發明。本發明之其他特徵、目的及優點可見於實施方式及申請專利範圍中。
應瞭解，本發明不限於本文所描述之特定材料及方法。亦應瞭解，本文所使用之術語係出於描述特定實施例之目的且不意欲限制本發明之範圍，本發明之範圍將僅由所附申請專利範圍限制。
必須注意的是，除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一個(種)(a/an)」及「該(the)」包括複數個(種)指示物。
如本文所使用，術語「抗體」意謂與特定抗原(EphA10)特異性結合或相互作用的包含至少一個互補決定區(CDR)之任何抗原結合分子或分子複合物。術語「抗體」包括免疫球蛋白分子以及其多聚體(例如IgM)，該等免疫球蛋白分子包含四條多肽鏈，即藉由二硫鍵互連的兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或V H)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域，即C H1、C H2及C H3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或V L)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域(C L1)。V H區及V L區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，間雜有稱為構架區(FR)的更為保守之區域。各V H及V L由三個CDR及四個FR構成，自胺基末端至羧基末端按以下次序佈置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明之不同實施例中，抗EphA10抗體(或其抗原結合部分)之FR可與人類生殖系序列一致，或可經天然或人工修飾。胺基酸共同序列可以基於兩個或更多個CDR之並列分析來界定。
如本文所使用，術語「對……具有特異性」意謂抗體不與其他抗原決定基發生顯著程度的交叉反應。
如本文所使用，術語「抗原決定基」係指抗原上抗體所結合之位點。
如本文所使用，術語「互補決定區」(CDR)係指在重鏈及輕鏈多肽之可變區內發現的不連續抗原組合位點。CDR描述於Kabat等人，J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)；Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of proteins of immunological interest」 (1991)；Chothia等人, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；及MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)，其中定義包括相互比較時胺基酸殘基的重疊或子集。
當應用於多肽時，術語「相當大的相似性」或「實質上類似」意謂兩個肽序列在諸如藉由程式GAP或BESTFIT，使用預設空位權重最佳地比對時，共有至少95%序列一致性，甚至更佳地至少98%或99%序列一致性。不一致之殘基位置較佳因保守性胺基酸取代而不同。「保守性胺基酸取代」係這樣一種胺基酸取代，其中胺基酸殘基經側鏈(R基團)具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)之另一胺基酸殘基取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白質之功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同的情況下，可上調序列一致性或相似度百分比以根據取代之保守性質加以校正。進行此調節之方式係熟習此項技術者熟知的。側鏈具有類似化學特性之胺基酸組的實例包括(1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含有醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及(7)含硫側鏈係半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。或者，保守性置換係在以引用的方式併入本文中之Gonnet等人(1992)Science 256: 1443-1445中所揭示的PAM250對數概似矩陣中具有正值的任何變化。「中等保守性」置換係在PAM250對數概似矩陣中具有非負值的任何變化
如本文所使用，術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。單株抗體係藉由此項技術中可用或已知的任何手段，自單一殖株得到，該殖株包括任何真核、原核或噬菌體殖株。
如本文所使用，術語「嵌合」抗體係指具有來源於非人類免疫球蛋白之可變序列及通常選自人類免疫球蛋白模板之人類免疫球蛋白恆定區的抗體。
非人類抗體之「人類化」形式係含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部的CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區且全部或實質上全部的FR區係人類免疫球蛋白序列之FR區。
如本文所使用，術語「奈米抗體」係指包含小型單一可變域(自駱駝及單峰駝獲得的抗體之VHH)的抗體。自駱駝及單峰駝(雙峰駱駝(Camelus baclrianus)及單峰駱駝(Calelus dromaderius))家族成員(包括新世界成員，諸如駱馬物種(羊駝(Lama pacos)、大羊駝(Lama glama)及瘦駝(Lama vicugna)))獲得的抗體蛋白已在大小、結構複雜性及對人類個體之抗原性方面進行表徵。來自在自然界中所發現之此哺乳動物家族的某些IgG抗體缺少輕鏈，且因此在結構上不同於來自其他動物之抗體的具有兩條重鏈及兩條輕鏈之典型四鏈四級結構。
如本文所使用，術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」及類似術語包括特異性結合抗原以形成複合物的任何天然存在、可以酶方式獲得、合成或經基因工程改造之多肽或醣蛋白。
如本發明中所使用，術語「治療劑」意謂適合投與哺乳動物，例如人類的具有治療或藥理學作用之任何化合物、物質、藥物、藥物或活性成分。如本文所使用，術語「免疫細胞」係指在免疫反應中起作用之細胞。免疫細胞為造血來源的，且包括淋巴球，諸如B細胞及T細胞；自然殺手細胞；骨髓細胞，諸如單核球、巨噬細胞、嗜伊紅血球、肥大細胞、嗜鹼性球及顆粒球。
如本文所使用，術語「T細胞」包括CD4 +T細胞及CD8 +T細胞。術語T細胞亦包括T輔助1型T細胞、T輔助2型T細胞、T輔助17型T細胞及抑制性T細胞。
如本文所使用，術語「幹細胞」係指呈未分化或部分地分化狀態之細胞，其具有自我更新特性且具有自然分化為更易分化之細胞類型的發育潛能，關於發育潛能無特定隱含含義(亦即，分化全能、富潛能、多潛能等)。自我更新意謂幹細胞能夠增殖且產生更多此類幹細胞，同時維持其發育潛能。因此，術語「幹細胞」係指在特定情況下具有分化為更特定或分化表型之發育潛能，且在某些情況下保持增殖而不實質上分化之能力的任何細胞亞群。
當用於「富潛能細胞」時，術語「富潛能」係指具有在不同條件下分化成全部三種生殖細胞層(內胚層、中胚層及外胚層)特有之細胞類型之能力的細胞。富潛能細胞主要係藉由使用例如裸小鼠畸胎瘤形成分析測定的其分化成全部三種胚層之能力來表徵。富潛能性亦藉由表現胚胎幹(ES)細胞標誌物證實，但針對富潛能性之較佳測試展示分化成該三種胚層中之各者之細胞的能力。
如本文所使用，術語「iPS細胞」與「誘導性富潛能幹細胞」可互換使用且係指自分化細胞(例如非富潛能細胞)，通常為成體分化細胞，例如藉由使該細胞與任何化合物中之至少一種化合物接觸，而在技術上得到(例如藉由完全或部分反向誘導)的富潛能細胞，該等化合物選自黃嘌呤、黃苷、次黃嘌呤或其類似物，例如具有黃嘌呤核之化合物。
如本文所使用，術語「載體」意指能夠轉運所連接之另一種核酸的核酸分子。載體之一種類型為「質體」，其係指環狀雙股DNA環，其中可連接額外DNA區段。載體之另一類型為病毒載體，其中額外DNA區段可連接至病毒基因體中。某些載體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入至宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因體中，且藉此與宿主基因體一起複製。此外，某些載體能夠引導其操作性連接之基因的表現。此類載體在本文中被稱作「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質體形式。由於質體為載體之最常用形式，故在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括發揮等效功能的此類其他形式之表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒以及腺相關病毒)。
術語細胞之「經基因工程改造(genetically engineered)」或「基因工程改造(genetic engineering)」意指使用遺傳物質操縱基因以改變細胞中之基因拷貝及/或基因表現量。遺傳物質可呈DNA或RNA形式。遺傳物質可藉由包括病毒轉導及非病毒轉染在內之各種方式轉移至細胞中。在經基因工程改造之後，細胞中某些基因之表現量可永久或暫時改變。
在細胞個體發生之情形中，形容詞「分化(differentiated)」或「分化(differentiating)」為相對術語。「分化細胞」為相對於供比較之細胞，在發育途徑中進一步向下發展的細胞。因此，幹細胞可分化為譜系限制性前驅細胞，該等細胞又可進一步沿路徑向下分化為其他類型之前驅細胞，且接著分化為末期分化細胞，該末期分化細胞在某一組織類型中起特有的作用，且可保持或可不保持進一步增殖之能力。
如本發明中所使用，術語「醫藥組合物」意謂含有向哺乳動物，例如人類投與以預防、治療或消除哺乳動物所患之特定疾病或病理病況之治療劑的混合物。
如本文所使用，術語「治療有效量」或「有效量」係指當投與哺乳動物或其他個體用於治療疾病時，足以實現對該疾病之該治療的抗體之量。
如本文所使用，術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及類似術語涵蓋哺乳動物，特別是人類之疾病的任何治療，且包括：(a)預防可能易患疾病但尚未診斷出患有該疾病的個體發生該疾病；(b)抑制疾病，亦即，遏制其發展；及(c)緩解疾病，亦即，使疾病消退。
術語「預防(preventing)」或「預防(prevention)」在此項技術中為公認的，且當與病況結合使用時，其包括在病況發作之前投與藥劑以相對於未接受該藥劑之個體，降低個體之醫學病況之症狀的發生頻率或嚴重程度，或延遲其發作。
如本文可互換地使用的，術語「個人(individual)」、「個體(subject)」、「宿主」及「患者」係指哺乳動物，包括但不限於鼠類(大鼠、小鼠)、非人類靈長類動物、人類、犬科動物、貓科動物、有蹄動物(例如馬科動物、牛科動物、綿羊科動物、豬科動物、山羊科動物)等。
如本文所使用，術語「需要治療」係指由照護者(例如在人類之情況下為醫師、護士、護理從業者或個人；在包括非人類之哺乳動物在內之動物的情況下為獸醫)作出的個體需要治療或將受益於治療之判斷。此判斷係基於多種因素作出，該等因素係在照護者之專業知識領域內，且包括個體由於可用本發明之化合物治療之病況而患病或將患病的知識。
「癌症」、「腫瘤」及類似術語包括癌變前細胞、贅生性細胞、轉型細胞及癌細胞，且可指實體腫瘤或非實體癌症(參見例如Edge等人, AJCC Cancer Staging Manual (第7版, 2009)；Cibas及Ducatman Cytology: Diagnostic principles and clinical correlates (第3版, 2009))。癌症包括良性贅瘤及惡性贅瘤(異常生長)兩者。「轉型」係指自發性或誘導性表型變化，例如細胞不朽化、形態變化、異常細胞生長、減少之接觸抑制及固著及/或惡性疾病(參見Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (第3版, 1994))。儘管轉型可由用轉型病毒感染及併入新基因體DNA或攝入外源DNA引起，其亦可自發產生或在暴露於致癌物之後產生。
如本文所使用，術語「樣本」涵蓋獲自個人、個體或患者之多種樣本類型，且可用於診斷性或監測分析中。該定義涵蓋血液及生物來源之其他液體樣本；固體組織樣本，諸如活組織檢查試樣或組織培養物或源自其之細胞及其後代。
本發明產生對ephrin A型受體10中之抗原決定基具有特異性的抗體或其抗原結合片段。
EphA10係ephrin受體，即受體酪胺酸激酶(RTK)最大亞家族之成員，且在發育、血管生成及細胞分化中具有重要功能。先前的研究指示開發靶向EphA10之單株抗體用於癌症免疫療法的治療應用。已發現，(1)EphA10水平在除睪丸外之正常組織中極低；(2)相較於正常組織，EphA10水平在各種類型之癌症中較高；(3)EphA10缺失藉由增強CTL介導之抗腫瘤免疫而誘導腫瘤消退。
具體言之，抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區之互補決定區(CDR)及輕鏈可變區之互補決定區，其中該重鏈可變區之該等互補決定區包含CDRH1區、CDRH2區及CDRH3區，且該輕鏈可變區之該等互補決定區包含CDRL1區、CDRL2區及CDRL3區，且其中： 該CDRH1區包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似之序列；該CDRH2區包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似之序列；該CDRH3區包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似之序列；且 該CDRL1區包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似之序列；該CDRL2區包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似之序列；該CDRL3區包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似之序列。
序列表示於表1中。 表1：
SEQ ID NO 序列名稱 序列
1 VH CDR1 SYAMN
2 VH CDR2 GITPILGTANYAQKFQG
3 VH CDR3 DTPRAATFDDAFDI
4 VL CDR1 TGSSSNIGAGYDVH
5 VL CDR2 GNSNRPS
6 VL CDR3 LVSYRGAIGGTRV
7 VH EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGGITPILGTANYAQKFQGRVTFTADESTSTAYMELNSLRSEDTAVYYCARDTPRAATFDDAFDIWGKGTLVTVSS
8 VL QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQAEDEAEYYCLVSYRGAIGGTRVFGGGTKVTVLG
9 scFv胺基酸 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGGITPILGTANYAQKFQGRVTFTADESTSTAYMELNSLRSEDTAVYYCARDTPRAATFDDAFDIWGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQAEDEAEYYCLVSYRGAIGGTRVFGGGTKVTVLG
10 scFv DNA GAGGTCCAGCTGGTACAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATGCTATGAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGAATCACCCCTATCCTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGTTTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAACAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTATACTACTGTGCGAGAGATACCCCTCGGGCTGCTACGTTCGATGATGCTTTTGATATTTGGGGCAAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGAGTATTACTGCTTGGTCTCCTATAGGGGTGCTATTGGTGGTACTCGAGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列或其實質上類似之序列的重鏈可變區；及包括含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列或其實質上類似之序列的輕鏈可變區。在一些其他實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的實質上類似之序列的重鏈可變區。在一些其他實施例中，該抗體或其抗原結合片段包括含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的實質上類似之序列的輕鏈可變區。
根據本發明之抗體可為全長的(例如IgG1或IgG4抗體)或可僅包含抗原結合部分(例如Fab、F(ab') 2或scFv片段)，且可視需要經修飾以影響功能性。
一般熟習此項技術者已知之各種技術均可用於確定抗體是否「對多肽或蛋白質內之一或多個胺基酸具有特異性」。例示性技術包括例如常規交叉阻斷分析，諸如Antibodies, Harlow及Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)所描述之分析；丙胺酸掃描突變分析；肽墨點分析(Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463)；及肽裂解分析。另外，可採用諸如抗原決定基切除、抗原決定基提取及抗原化學修飾之類方法(Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496)。可用於鑑別與抗體特異性結合之多肽內之胺基酸的另一方法為藉由質譜法偵測之氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換方法涉及氘標記感興趣蛋白質，隨後使抗體與該氘標記之蛋白質結合。接下來，將蛋白質/抗體複合物轉移至水中以允許氫-氘交換在除了受抗體保護之殘基(其保持氘標記)以外的所有殘基處發生。在抗體解離之後，對目標蛋白進行蛋白酶裂解及質譜分析，由此揭露對應於與抗體相互作用之特定胺基酸的氘標記之殘基。參見例如Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen及Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A。
藉由使用此項技術中已知之常規方法，可以容易地確定抗體是否對與參考抗EphA10抗體相同之抗原決定基具有特異性或與參考抗EphA10抗體競爭結合。舉例而言，為了確定測試抗體是否與本發明之參考抗EphA10抗體結合至相同之抗原決定基，使參考抗體結合至EphA10蛋白。接下來，評估測試抗體與EphA10分子結合之能力。若在EphA10與參考抗EphA10抗體飽和結合之後，測試抗體仍能夠結合至EphA10，則可推斷測試抗體與參考抗EphA10抗體結合至不同的抗原決定基。另一方面，若在EphA10與參考抗EphA10抗體飽和結合之後，測試抗體不能夠結合至EphA10分子，則測試抗體可結合至與本發明之參考抗EphA10抗體所結合之抗原決定基相同的抗原決定基。接著，可進行其他常規實驗(例如肽突變及結合分析)，以確認所觀察到的測試抗體結合之缺乏實際上係由於與參考抗體結合至同一抗原決定基，還是空間阻斷(或另一現象)造成所觀察到的結合之缺乏。此類實驗可使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞分析技術或此項技術中可用之任何其他定量或定性抗體結合分析來進行。根據本發明之某些實施例，當在競爭性結合分析中量測時，若例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍過量之一種抗體將另一種抗體之結合抑制至少50%但較佳地75%、90%或甚至99%，則兩種抗體結合至相同(或重疊)的抗原決定基。或者，若抗原中降低或消除一種抗體之結合的基本上所有胺基酸突變皆降低或消除另一種抗體之結合，則將兩種抗體視為結合至相同抗原決定基。若僅一小組減少或消除一種抗體之結合的胺基酸突變減少或消除另一種抗體之結合，則認為兩種抗體具有「重疊的抗原決定基」。
抗體亦包括完整抗體分子之抗原結合片段。抗體之抗原結合片段可使用任何適合之標準技術，諸如蛋白水解消化或涉及編碼抗體可變域及視情況存在之恆定域之DNA之操縱及表現的重組基因工程改造技術，例如自完整抗體分子得到。此類DNA係已知的及/或可自例如商業來源、DNA庫(包括例如噬菌體-抗體庫)容易地獲得，或可以合成。可以對DNA定序，並以化學方式或藉由使用分子生物學技術定序及操縱，例如將一或多個可變域及/或恆定域佈置成適合組態，或引入密碼子，產生半胱胺酸殘基，修飾、添加或缺失胺基酸等。
抗原結合片段之非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab') 2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基組成的最小識別單元(例如經分離之互補決定區(CDR)，諸如CDR3肽)，或受限制之FR3-CDR3-FR4肽。其他經工程改造之分子，諸如域特異性抗體、單域抗體、域缺失抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體等)、小模組免疫藥物(SMIP)及鯊魚可變IgNAR域亦涵蓋在如本文所使用之表述「抗原結合片段」內。
抗體之抗原結合片段通常包含至少一個可變域。可變域可為任何大小或胺基酸組成且一般將包含與一或多個構架序列相鄰或同框之至少一個CDR。在具有與V L域相關聯之V H域的抗原結合片段中，V H及V L域可相對於彼此以任何適合的佈置定位。舉例而言，可變區可為二聚體且含有V H-V H、V H-V L或V L-V L二聚體。或者，抗體之抗原結合片段可以含有單體V H或V L域。
在某些實施例中，抗體之抗原結合片段可含有與至少一個恆定域共價連接之至少一個可變域。可見於本發明之抗體之抗原結合片段內的可變域及恆定域之非限制性例示性組態包括：(i) V H-C H1；(ii) V H-C H2；(iii) V H-C H3；(iv) V H-C H1-C H2；(V) V H-C H1-C H2-C H3；(vi) V H-C H2-C H3；(vii) V H-C L；(viii) V L-C H1；(ix) V L-C H2；(x) V L-C H3；(xi) V L-C H1-C H2；(xii) V L-C H1-C H2-C H3；(xiii) V L-C H2-C H3；及(xiv) V L-C L。在可變域及恆定域之任何組態，包括上文所列之例示性組態中的任一者中，可變域及恆定域可彼此直接連接或可以藉由完全或部分鉸鏈區或連接子區連接。鉸鏈區可由至少2個(例如5個、10個、15個、20個、40個、60個或更多個)胺基酸組成，該等胺基酸在單個多肽分子中之相鄰可變域及/或恆定域之間產生可撓性或半可撓性鍵聯。此外，本發明抗體之抗原結合片段可包含上文列出的任何可變域及恆定域組態彼此非共價締合及/或與一或多個單體V H或V L域(例如藉由二硫鍵)非共價締合之均二聚體或雜二聚體(或其他多聚體)。
相較於得到抗體之相應生殖系序列，本文所揭示之抗EphA10抗體可在重鏈及輕鏈可變域之構架區及/或CDR區中包含一或多個胺基酸取代、插入及/或缺失。此類突變可容易地藉由比較本文所揭示之胺基酸序列與可得自例如公共抗體序列資料庫之生殖系序列來確定。本發明包括一種抗體及其抗原結合片段，其來源於本文所揭示之胺基酸序列中之任一者，其中在一或多個構架區及/或CDR區內之一或多個胺基酸突變為得到該抗體之生殖系序列的相應殘基，或另一哺乳動物生殖系序列之相應殘基，或相應生殖系殘基之保守性胺基酸取代(此類序列變化在本文中統稱為「生殖系突變」)。以本文所揭示之重鏈及輕鏈可變區序列為起始物質，熟習此項技術者可以容易地產生許多包含一或多個個別生殖系突變或其組合的抗體及抗原結合片段。在某些實施例中，V H及/或V L域內之所有構架及/或CDR殘基全部回復突變為在得到該抗體之初始生殖系序列中發現的殘基。在其他實施例中，僅某些殘基回復突變為原始生殖系序列，例如僅FR1之前8個胺基酸內或FR4之最後8個胺基酸內發現之突變殘基，或僅CDR1、CDR2或CDR3內發現之突變殘基。在其他實施例中，構架及/或CDR殘基中之一或多者突變成不同生殖系序列(亦即，不同於最初得到該抗體之生殖系序列的生殖系序列)之相應殘基。此外，本發明之抗體可含有構架區及/或CDR區內兩個或更多個生殖系突變之任何組合，例如其中某些個別殘基突變為特定生殖系序列之相應殘基，而與原始生殖系序列不同之某些其他殘基維持不變或突變為不同生殖系序列之相應殘基。一旦獲得，即可容易地測試含有一或多個生殖系突變之抗體及抗原結合片段的一或多種所需特性，該等特性為諸如改善之結合特異性、增加之結合親和力、改善或增強之拮抗或促效生物特性(視具體情況而定)、降低之免疫原性等。本發明內涵蓋以此一般方式獲得的抗體及抗原結合片段。
本發明亦包括這樣一種抗EphA10抗體，其包含具有一或多個保守性取代的本文所揭示之V H、V L及/或CDR胺基酸序列中之任一者的變異體。舉例而言，本發明包括這樣一種抗EphA10抗體，該抗體具有相對於本文所揭示之V H、V L及/或CDR胺基酸序列中之任一者含例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等保守性胺基酸取代的V H、V L及/或CDR胺基酸序列。
在本發明之一些實施例中，根據本發明之抗體係人類化抗體。為了改善根據本發明之人類化抗體之結合親和力，人類構架區中之一些胺基酸殘基經CDR之物種(例如嚙齒動物)中的相應胺基酸殘基置換。
本發明之抗體可為單特異性、雙特異性或多特異性的。多特異性抗體可對一種目標多肽之不同抗原決定基具有特異性或可含有對多於一種目標多肽具有特異性之抗原結合域。本發明之抗EphA10抗體可連接至另一官能性分子(例如另一種肽或蛋白質)，或與另一官能性分子共表現。舉例而言，抗體或其片段可與一或多個其他分子實體，諸如另一抗體或抗體片段功能性連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式)，以產生具有第二結合特異性之雙特異性或多特異性抗體。舉例而言，本發明包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白之一個臂對EphA10或其片段具有特異性，且免疫球蛋白之另一個臂對第二治療目標具有特異性或與治療部分結合。
在本發明之一個較佳實施例中，抗體或其抗原結合片段與治療劑結合。
在本發明之一些實施例中，治療劑表示細胞生長抑制劑或細胞毒性劑或具有相應放射性同位素之同位素螯合劑。細胞生長抑制或細胞毒性劑之實例包括但不限於抗代謝物(例如氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲胺喋呤(methotrexate)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、羥基脲、硫鳥嘌呤(6-TG)、巰基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷(cytarabine)、噴司他丁(pentostatin)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)、克拉屈濱(cladribine)(2-CDA)、天冬醯胺酶(asparaginase)、吉西他濱(gemcitabine)、卡培他濱(capecitibine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、胞嘧啶甲胺喋呤、甲氧苄啶(trimethoprim)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)或培美曲塞(pemetrexed))；烷化劑(例如美法侖(cmelphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、噻替派(thiotepa)、異環磷醯胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈脲菌素(streptozocin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、絲裂黴素C (mitomycin C)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、烏拉莫司汀(uramustine)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、四硝酸酯(tetranitrate)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺(altretamine)、米托唑胺(mitozolomide)或替莫唑胺(temozolomide))；類烷化劑(例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、賽特鉑(satraplatin)或特瑞鉑(triplatin))；DNA小溝烷化劑(例如倍癌黴素(duocarmycins)，諸如CC-1065及任何類似物或其衍生物；吡咯并苯并二氮呯或其任何類似物或衍生物)；蒽環黴素(例如道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、艾達黴素(idarubicin)或伐柔比星(valrubicin)；抗生素(例如放線菌素D(dactinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)、安麴黴素(anthramycin)、鏈佐黴素(streptozotocin)、短桿菌素D(gramicidin D)、絲裂黴素(例如絲裂黴素C)；卡奇黴素；抗有絲分裂劑(包括例如類美登素(maytansinoids)(諸如DM1、DM3及DM4)、奧瑞他汀(auristatins)(包括例如單甲基奧瑞他汀E (MMAE)及單甲基奧瑞他汀F (MMAF))、海兔毒素(dolastatins)、念珠藻素(cryptophycins)、長春花生物鹼(vinca alkaloids)(例如長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine))、紫杉烷(taxanes)(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)或新穎紫杉烷)、妥布賴森(tubulysins)及秋水仙鹼(colchicines))；拓樸異構酶抑制劑(例如伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)、喜樹鹼(camptothecin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)或米托蒽醌(mitoxantrone))；HDAC抑制劑(例如伏立諾他(vorinostat)、羅米地辛(romidepsin)、西達本胺(chidamide)、帕比司他(panobinostat)或貝林司他(belinostat))；蛋白酶體抑制劑(例如肽基亞硼酸)；以及放射性同位素，諸如At 211、I 131、I 125、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、Bi 212或Bi 213、P 32及Lu之放射性同位素，包括Lu 177。同位素螯合劑之實例包括但不限於乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺-N,N,N',N",N"-五乙酸鹽(DTPA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N"'-四乙酸鹽(DOTA)、1,4,7,10-肆(2-羥丙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(THP)、三伸乙基四胺-N,N,N',N",N"',N"'-六乙酸鹽(TTHA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N"'-肆(亞甲基膦酸鹽) (DOTP)及巰基乙醯基三甘胺酸(MAG3)。
在本發明之一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段係在細胞表面上表現。特定言之，細胞係T細胞或幹細胞，諸如iPSC。誘導性富潛能幹細胞可藉由將山中因子(Yamanaka factor)誘導至體細胞中來再程式化。與胚胎幹細胞相同，iPSC能夠分化成三種胚層之細胞，而無需關注倫理問題。利用此特性，iPSC展現出有前景的臨床用途應用。
在本發明之一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段呈嵌合抗原受體之形式。
術語「嵌合抗原受體」或者「CAR」係指包含至少細胞外抗原結合域、跨膜域及胞質信號傳導域(在本文中亦稱為「胞內信號傳導域」)的重組多肽構築體，該胞質信號傳導域包含來源於如下所定義之刺激分子的功能性信號傳導域。在一些實施例中，CAR多肽構築體中之各域係在同一多肽鏈中，例如構成嵌合融合蛋白。在一些實施例中，CAR多肽構築體中各域彼此不相鄰，例如在不同多肽鏈中。CAR之產生及構築由以下概括：Jayarama等人, EBioMedicine 58 (2020) 102931；Zhang等人, Biomarker Research (2017) 5:22；Feins等人, Am J Hematol. (2019) 94:S3-S9；及Roselli等人, J Clin Invest. 2021;131(2):e142030。
該抗體或其抗原結合片段可在編碼該抗體或其抗原結合片段之載體中編碼。例示性載體為慢病毒載體。「慢病毒」係指能夠感染分裂細胞及非分裂細胞之反轉錄病毒屬。慢病毒之若干實例包括HIV (人類免疫缺乏病毒：包括第1型HIV及第2型HIV)；馬感染性貧血病毒；貓免疫缺乏病毒(FIV)；牛免疫缺乏病毒(BIV)；及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。
在另一態樣中，本發明提供一種經基因工程改造之細胞，其表現該抗體或其抗原結合片段，或含有該載體。該經基因工程改造之細胞可為免疫細胞或幹細胞。此外，本發明提供一種免疫細胞，其係由經基因工程改造之細胞分化得到。
在本發明之一個實施例中，產生具有攜帶EphA10基因之慢病毒的抗EphA10 iPSC及T細胞。另外，iPSC將此等分化成CAR-免疫細胞。觀察到此等CAR-免疫細胞對癌細胞之細胞毒性作用。本發明提供一種克服腫瘤抗原之特異性並產生用於臨床癌症治療應用之無限制性CAR-免疫細胞的方法。
本發明提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體或其抗原結合片段、基因工程改造之細胞或免疫細胞。本發明之醫藥組合物係用適合稀釋劑、載劑、賦形劑及提供改良之轉移、遞送、耐受性及類似特性之其他試劑調配。該等組合物可以調配用於特定應用，諸如用於獸醫學應用或人類醫藥應用。所用組合物及賦形劑、稀釋劑及/或載劑之形式將取決於抗體之預期應用及用於治療應用之投與模式。眾多適當調配物可於所有醫藥化學家已知之處方集：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa。此等調配物包括例如粉劑、糊劑、軟膏、凝膠劑、蠟、油、脂質、含有脂質(陽離子型或陰離子型)之囊泡(諸如LIPOFECTIN.TM., Life Technologies, Carlsbad, Calif.)、DNA結合物、無水吸收糊劑、水包油及油包水乳液、乳液卡波蠟(carbowax)(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠劑及含有卡波蠟之半固體混合物。亦參見Powell等人, 「Compendium of excipients for parenteral formulations」 PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311。
向患者投與之抗體的劑量可取決於患者之年齡及體型、目標疾病、病況、投與途徑及類似因素而變化。較佳劑量通常根據體重或體表面積計算。當使用本發明之抗體治療成年患者的與EphA10相關之病況或疾病時，靜脈內投與本發明之抗體可為有利的。取決於病況之嚴重程度，可調整治療之頻率及持續時間。投與抗體之有效劑量及時程可憑經驗確定；例如，可藉由定期評估來監測患者進展，且相應地調整劑量。此外，可使用此項技術中熟知之方法(例如Mordenti等人, 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351)執行劑量之種間縮放。
各種遞送系統為吾人所知且可用於投與本發明之醫藥組合物，例如囊封於脂質體中、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒之重組細胞、受體介導之內吞作用(參見例如Wu等人, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。引入方法包括但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及經口途徑。該組合物可以藉由任何適宜途徑投與，例如藉由輸注或彈丸注射、藉由經上皮或黏膜皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸黏膜和腸黏膜等)吸收投與並且可以與其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身性或局部的。
可使用標準針及注射器皮下或靜脈內遞送本發明之醫藥組合物。此外，關於皮下遞送，筆式遞送裝置易於在遞送本發明之醫藥組合物時應用。此類筆式遞送裝置可為可再用的或拋棄式的。可再用的筆式遞送裝置一般利用含有醫藥組合物之可替換套筒。在投與了套筒內之所有醫藥組合物且套筒變空後，可容易地丟棄空套筒且用含有醫藥組合物之新套筒替換。接著，可再使用筆式遞送裝置。在拋棄式筆式遞送裝置中，不存在可替換套筒。實際上，拋棄式筆式遞送裝置用保持在該裝置內之儲集器中的醫藥組合物預填充。一旦清空儲集器之醫藥組合物，即棄去整個裝置。
在某些情況中，該醫藥組合物可在控制釋放系統中遞送。在一個實施例中，可以使用泵(參見Langer, 同上文；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201)。在另一實施例中，可使用聚合材料；參見Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (編輯), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Fla。在另一實施例中，控制釋放系統可置放在該組合物之目標附近，因此僅需要全身性劑量之一部分(參見例如Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, 同上文, 第2卷, 第115-138頁)。其他受控釋放系統論述於Langer, 1990, Science 249:1527-1533之綜述中。
可注射製劑可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴等之劑型。此等可注射製劑可藉由公開已知之方法製備。舉例而言，可注射製劑可例如藉由在習知用於注射之無菌水性介質或油性介質中溶解、懸浮或乳化上文所描述之抗體或其鹽來製備。作為注射用水性介質，存在例如生理鹽水、含有葡萄糖及其他助劑之等張溶液等，其可與適當增溶劑，諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子型界面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50 (氫化蓖麻油之聚氧乙烯(50 mol)加合物)]等組合使用。採用例如芝麻油、大豆油等作為油性介質，其可與增溶劑，諸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等組合使用。較佳將由此製備之注射液填充於適當安瓿中。
上文所描述的供經口或非經腸使用之醫藥組合物宜製備成呈適於符合活性成分之劑量之單位劑量的劑型。此類呈單位劑量之劑型包括例如錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。
本發明提供一種用於抑制有需要之個體中EphA10介導之信號傳導的方法，其包含向該個體投與該醫藥組合物。或者，本發明提供一種用於抑制有需要之個體中EphA10介導之信號傳導的醫藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、經基因工程改造之細胞或免疫細胞。
本發明亦提供一種用於在罹患由EphA10活性及/或信號傳導引起或與EphA10活性及/或信號傳導相關之疾病及/或病症的個體中治療、預防性治療及/或預防該等疾病及/或病症的方法，其包含向該個體投與該醫藥組合物。或者，本發明提供一種用於在罹患由EphA10活性及/或信號傳導引起或與EphA10活性及/或信號傳導相關之疾病及/或病症的個體中治療、預防性治療及/或預防該等疾病及/或病症的醫藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、經基因工程改造之細胞或免疫細胞。
本發明亦提供一種用於在罹患腫瘤之個體中治療、預防性治療及/或預防該腫瘤的方法，其包含向該個體投與該醫藥組合物。在本發明之一些實施例中，腫瘤係實體腫瘤。腫瘤之實例包括但不限於腎細胞癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、前列腺癌、惡性神經膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤。或者，本發明提供一種用於在罹患腫瘤之個體中治療、預防性治療及/或預防該腫瘤的醫藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、經基因工程改造之細胞或免疫細胞。
本發明提供一種用於偵測樣本中之EphA10的方法，其包含使該樣本與該抗體或其抗原結合片段接觸。
本發明提供一種用於中和有需要之個體中之EphA10的方法，其包含向該個體投與該抗體或其抗原結合片段。或者，本發明提供一種用於中和有需要之個體中之EphA10的醫藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、經基因工程改造之細胞或免疫細胞。
本發明提供一種用於偵測樣本中之EphA10的套組，其中該套組包含抗體或其抗原結合片段。
本發明之抗EphA10抗體亦可用於偵測及/或量測樣本中之EphA10或EphA10表現細胞，例如用於診斷目的。舉例而言，抗EphA10抗體或其片段可用於診斷以EphA10異常表現(例如過度表現、表現不足、缺乏表現等)為特徵病況或疾病。用於EphA10之例示性診斷分析可包含例如使獲自患者之樣本與本發明之抗EphA10抗體接觸，其中該抗EphA10抗體係用可偵測標記或報導體分子標記。或者，未標記之抗EphA10抗體可與自身經可偵測標記之二次抗體組合用於診斷應用中。可偵測標記或報導體分子可為放射性同位素，諸如 3H、 14C、 32P、 35S或 125I；螢光或化學發光部分，諸如異硫氰酸螢光素或若丹明(rhodamine)；或酶，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或螢光素酶。可用於偵測或量測樣本中之EphA10的特定例示性分析包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)及螢光活化細胞分選(FACS)。
提供以下實例以幫助熟習此項技術者實施本發明。 實例
噬菌體呈現庫篩選
使用人類B細胞來源之scFv噬菌體呈現庫(Creative BioLabs, USA)淘選在C末端與DDK/His標籤融合之重組人類EphA10細胞外域蛋白質(Glu34-Ala565)，轉錄物變異體3(Creative Biomart, USA, 目錄號EPHA10-369H)。使用ELISA篩選陽性殖株。藉由DNA定序鑑別獨特的CMU #13。藉由FACS，使用表現全長人類EphA10之NIH 3T3細胞證實該等獨特殖株之結合特異性。
EphA10-scFv 質體之構築 .
根據SEQ ID NO: 9及10中所示，合成抗EphA10 (CMU #2) scFv序列並將該序列選殖至真核表現載體中。
抗 EphA10 抗體產生
藉由使用ExpiFectamine 293轉染套組(Thermo Fisher Scientific)將表現質體短暫轉染至HEK293細胞中，產生抗EphA10 (CMU #2)抗體。簡言之，將質體稀釋於Opti-MEM中，在室溫下與預先稀釋之ExpiFectamine混合20–30分鐘，並添加至HEK293細胞中。使轉染效率最佳化以測定產生具有良好產率及純度之抗EphA10抗體的最佳質體比率。在轉染後4–5天，收集來自經轉染細胞之上清液並經由0.45 μm過濾器單元(Nalgene)過濾。使用抗His珠粒純化出上清液中之抗EphA10抗體。接著，將純化之抗EphA10抗體等分並在-80℃儲存。
酶聯免疫吸附分析 (ELISA)
將ScFv序列與小鼠IgG2a序列融合並次選殖至pcDNA3.1質體中。將三種ScFv-小鼠IgG2a質體轉染至HEK293細胞中。藉由蛋白質A樹脂純化三種ScFv-小鼠IgG2a抗體。利用間接ELISA針對經塗覆之9種EPHA抗原(EphA1-8及10，R&D系統)測試三種抗體。
結果顯示於圖1中。
T 細胞之分離及純化
利用流式細胞分析技術，使用人類PBMC或經分離之T細胞作為效應細胞且使用各種EphA10陽性人類乳癌細胞株檢查重定向細胞之細胞毒性。使用標準程序，利用Ficoll密度梯度離心自健康供體分離PBMC。簡言之，在離心後，在室溫下將細胞於10 ml紅血球溶解緩衝液(Sigma–Aldrich)中培育10分鐘，用PBS洗滌，使其以6×10 6個細胞/毫升之濃度再懸浮於RPMI-1640培養基中。或者，使用Pan T細胞分離套組II (Miltenyi Biotec)自PBMC中分離出T細胞。對於T細胞活化，將2×10 6個T細胞在塗有1 μg抗CD3抗體及1 μg抗CD28抗體(eBioscience)之24孔盤中培養。將細胞在5% CO2含濕氣培育箱中在37℃下培育3天。目標細胞溶解係以經PI染色之細胞的百分比測定。所有實驗均一式兩份進行。
EphA10 - CAR - T 慢病毒載體之構築
將CMU #2 ScFv(SEQ ID NO: 10)選殖並插入含有CD8鉸鏈、CD28 TM及IC、41-BB及CD3ζ之第三代CAR-T慢病毒載體中。合成CMU #2 ScFv序列並將其次選殖至第三代CAR-T慢病毒載體(pCDH-EF1a-MCS)(Creative BioLabs, USA)中。為了產生EphA10 CAR慢病毒，將第三代CAR-T慢病毒載體及包裝載體(LentiArt™病毒包裝套組，Creative Biolabs, USA，目錄號CART-027CL)共轉染至HEK293細胞中。
EphA10 - CAR T ( EphA10 - CAR T ) 之產生
使用人類CD8 +T細胞產生EphA10-CAR T。簡言之，用編碼CMU#2 ScFv (SEQ ID NO: 9)之CAR慢病毒穩定轉導CD8 +T細胞。所有EphA10-CAR T細胞株皆維持在KBM502培養基(Kohjin Bio, Japan)中。每2個月測試EphA10-CAR T細胞株之黴漿菌污染情況。
細胞毒性分析
在非放射性細胞毒性分析中評價EphA10-CAR-T細胞的細胞毒性潛力。將EphA10-CAR-T細胞與EphA10陽性MDA-MB-231細胞以10之效應物比目標比率(E/T比率=10；效應細胞：EphA10-CAR-T細胞；目標細胞：MDA-MB-231細胞)共培養24小時。利用MTT分析來分析MDA-MB-231之細胞生存力。
結果顯示於圖2中。EphA10-CAR-T細胞處理明顯降低MDA-MB-231之生存力。
儘管已結合上述特定實施例描述本發明，但其許多替代方案以及其修改及變化對於一般熟習此項技術者而言將為顯而易見的。所有此類替代方案、修改及變化被視為屬於本發明之範圍內。
圖1顯示針對抗EphA10抗體CMU #2之結合親和力分析的結果。
圖2顯示，藉由將抗EphA10 CAR T細胞與乳癌細胞共培養來驗證抗EphA10 CAR-T細胞的增加之細胞毒性作用。
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Claims (26)

  1. 一種對ephrin A型受體10 A10(EphA10)具有特異性的抗體或其抗原結合片段；其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區之互補決定區(CDR)及輕鏈可變區之互補決定區，其中該重鏈可變區之該等互補決定區包含CDRH1區、CDRH2區及CDRH3區，且該輕鏈可變區之該等互補決定區包含CDRL1區、CDRL2區及CDRL3區，且其中： 該CDRH1區包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或其實質上類似之序列；該CDRH2區包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列或其實質上類似之序列；該CDRH3區包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列或其實質上類似之序列；且 該CDRL1區包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列或其實質上類似之序列；該CDRL2區包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列或其實質上類似之序列；該CDRL3區包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列或其實質上類似之序列。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列或其實質上類似之序列的重鏈可變區；及包括含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列或其實質上類似之序列的輕鏈可變區。
  3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其進一步對EPHA4、EPHA5及EPHA7中之至少一者具有特異性。
  4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體或奈米抗體。
  5. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為多特異性的。
  6. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其與治療劑結合。
  7. 如請求項6之抗體或其抗原結合片段，其中該治療劑係選自由以下組成之群：抗代謝物、烷化劑、類烷化劑、DNA小溝烷化劑、蒽環黴素(anthracyclines)、抗生素、卡奇黴素(calicheamicins)、抗有絲分裂劑、拓樸異構酶抑制劑、HDAC抑制劑、蛋白酶體抑制劑及放射性同位素。
  8. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其係在細胞之表面上表現。
  9. 如請求項8之抗體或其抗原結合片段，其中該細胞係免疫細胞或幹細胞。
  10. 如請求項8之抗體或其抗原結合片段，其中該細胞係T細胞。
  11. 如請求項8之抗體或其抗原結合片段，其中該細胞係誘導性富潛能幹細胞。
  12. 一種載體，其編碼如請求項1之抗體或其抗原結合片段。
  13. 一種經基因工程改造之細胞，其表現如請求項1之抗體或其抗原結合片段。
  14. 如請求項13之經基因工程改造之細胞，其係免疫細胞或幹細胞。
  15. 如請求項13之經基因工程改造之細胞，其係T細胞。
  16. 如請求項13之經基因工程改造之細胞，其係誘導性富潛能幹細胞。
  17. 一種免疫細胞，其係由如請求項13之經基因工程改造之細胞分化得到。
  18. 一種醫藥組合物，其包含有效量的如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項13之經基因工程改造之細胞或如請求項17之免疫細胞。
  19. 一種用於抑制有需要之個體中EphA10介導之信號傳導的醫藥組合物，其包含有效量的如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項13之經基因工程改造之細胞或如請求項17之免疫細胞。
  20. 一種用於在罹患由EphA10活性及/或信號傳導引起或與EphA10活性及/或信號傳導相關之疾病及/或病症的個體中治療、預防性治療及/或預防該等疾病及/或病症的醫藥組合物，其包含有效量的如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項13之經基因工程改造之細胞或如請求項17之免疫細胞。
  21. 一種用於在罹患腫瘤之個體中治療、預防性治療及/或預防該腫瘤的醫藥組合物，其包含有效量的如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項13之經基因工程改造之細胞或如請求項17之免疫細胞。
  22. 如請求項21之醫藥組合物，其中該腫瘤係實體腫瘤。
  23. 如請求項22之醫藥組合物，其中該腫瘤係選自由以下組成之群：腎細胞癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、前列腺癌、惡性神經膠質瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤。
  24. 一種用於偵測樣本中之EphA10的方法，其包含使該樣本與如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
  25. 一種用於中和有需要之個體中之EphA10的醫藥組合物，其包含有效量的如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項13之經基因工程改造之細胞或如請求項17之免疫細胞。
  26. 一種用於偵測樣本中之EphA10的套組，其中該套組包含如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段。
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