CN111051349A - Strep-tag特异性嵌合受体及其用途 - Google Patents

Strep-tag特异性嵌合受体及其用途 Download PDF

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D·布施
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Abstract

本公开提供了标签特异性融合蛋白，用于选择性地检测包含strep‑tag肽的分子或包含strep‑tag肽的细胞。所公开的实施例包括可以在用于监测和/或调节表达strep‑tag肽的免疫疗法细胞的试剂和方法中使用的标签特异性融合蛋白。还提供了包括特异性结合带标签的靶标的融合蛋白和包含编码标签特异性融合蛋白的多核苷酸的重组宿主细胞的实施方案。还提供了表达带标签的标志物的免疫疗法细胞。

Description

STREP-TAG特异性嵌合受体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年9月6日提交的美国专利申请号62/555,012的优先权权益，出于所有目的将其通过引用并入本文，如同在此完整阐述。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为360056_450WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为28.9KB，创建于2018年9月3日，正在通过EFS-Web电子提交。
背景技术
遗传修饰的T细胞的过继转移已成为各种恶性肿瘤的有效疗法。应用最广泛的策略是输注表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体(CAR)的患者来源T细胞。这种方法具有许多理论上的优势，包括将T细胞靶向任何细胞表面抗原的能力，规避主要组织相容性复合体的丧失作为肿瘤逃逸机制的能力，以及采用单一载体构建体来治疗任何患者的能力(无论人白细胞抗原单倍型如何)。例如，迄今为止，针对B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的CAR临床试验已靶向在恶性淋巴样细胞以及正常B细胞上表达的CD19、CD20或CD22抗原(Brentjens etal.,Sci Transl Med 2013；5(177):177ra38；Haso et al.,Blood 2013；121(7):1165-74；James et al.,J Immunol 2008；180(10):7028-38；Kalos et al.,Sci Transl Med 2011；3(95):95ra73；Kochenderfer et al.,J Clin Oncol 2015；33(6):540-9；Lee et al.,Lancet 2015；385(9967):517-28；Porter et al.,Sci Transl 25 Med 2015；7(303):303ra139；Savoldo et al.,J Clin Invest 2011；121(5):1822-6；Till et al.,Blood2008；112(6):2261-71；Till et al.,Blood 2012；119(17):3940-50；Coiffier et al.,NEngl J Med 2002；346(4):235-42)。
然而，过继细胞疗法仍在发展中。例如，靶向B细胞恶性肿瘤中CD19的CAR T细胞疗法不仅破坏了癌性B细胞，而且破坏了正常B细胞。健康B细胞数量的减少或缺乏(一种称为B细胞发育不全的疾病)可能会损害患者产生抵抗感染的抗体的能力。调节CAR T免疫应答的特异性和强度提出了另一个挑战。在“脱靶肿瘤”毒性的示例性悲剧案例中，转移性结肠癌患者接受了表达对ERBB2特异的嵌合抗原受体(在结肠癌中高度表达)的T细胞，所施用的细胞定位在肺并触发针对健康肺组织中低水平ERBB2的CRS(细胞因子释放综合征)事件后，转移性结肠癌患者死亡。参见，例如，Morgan et al.,Mol.Ther.18(4):843-851(2010)。
附图说明
图1显示了(左上)示例性表达构建体的示意图，该构建体编码具有
Figure BDA0002401853890000021
II(SEQ ID NO：19)(“STII”)肽铰链区的抗CD19嵌合抗原受体(CAR)并进一步编码截短的EGFR转导标志物；(右上)表达编码的抗CD19-STII CAR的宿主细胞的模型；(左下)编码抗STIICAR和截短的EGFR转导标志物的示例性表达构建体；(右下)表达编码的抗STII CAR的宿主细胞的模型。
图2示出了示例性抗STII CAR设计的示意图。左：具有中等长度间隔子(IgG4CH3)的抗STII CAR。中：具有长间隔子(IgG4/2NQ CH2-CH3)的抗STII CAR。右：用VH-VL或VL-VH方向的中等或长间隔子和scFv结合结构域(“5G2”或“3E8”)生成的示例性抗STII CAR的描述。
图3显示了图2所示的构建体在原代PBMC中的表达。(A，左上角)未转导的PBMC。(B，左下角)用抗CD19-STII CAR表达构建体转导的PBMC。(C，右下角)用抗STII CAR表达构建体转导的PBMC。在细胞进行γ-逆转录病毒转导后的第4天，使用生物素化的抗EGFR单克隆抗体和链霉亲和素-PE在流式细胞术实验中检测转导的细胞。将细胞在活淋巴细胞上预门控。数字表示检测细胞百分比。
图4A和4B提供了来自流式细胞术实验的数据，其显示了来自(A)未转导的原代PBMC和(B)经转导以表达本公开的高亲和力抗STII CAR的原代PBMC的表达数据。在细胞进行γ-逆转录病毒转导后的第4天，使用生物素化的抗EGFR单克隆抗体和链霉亲和素-PE在流式细胞术实验中检测转导的细胞。将细胞在活淋巴细胞上预门控。数字表示检测细胞百分比。
图5A和5B显示了根据本公开的示例性抗STII CAR T细胞的特异性和反应性。(A)由抗STII CAR转导的人T细胞产生的IFN-γ(ng/mL)，如图注所示。X轴，从左到右：阴性对照(抗CD19-Hi CAR T细胞)；表达1、2或3个STII的抗CD19 CAR T细胞；用PMA/IONO活化的T细胞(阳性对照)。(B)FACS数据显示羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的抗STII CAR T细胞在用抗CD19-Hi CAR T细胞或培养基(上排)、或抗CD19-1STII CAR T细胞或培养基(下排)刺激后的增殖。
图6A-6C提供了来自细胞毒性测定的数据，其中将表达所示抗STII CAR构建体的效应T细胞与表达(A)抗CD19-Hi CAR T细胞；(B)抗CD19-1STII CAR T细胞；或(C)抗CD19-3STII CAR T细胞的1x103个Cr51标记的靶T细胞以所示的效应子：靶标物的比例(x轴)下一式三份地孵育4小时。使用基于铬释放检测的标准公式计算特异性裂解。数据表示一式三份的平均值±SD。
图7显示了来自细胞毒性测定的数据，其中确定了抗CD19-STII CAR T细胞和抗STII CAR T细胞的杀伤活性。圆形：效应抗CD19-STII CAR T细胞与靶CD19+K562细胞的共培养；正方形：与靶CD19-1STII CAR T细胞共培养的抗Strep Tag II CAR T细胞；三角形：效应抗STII CAR T细胞与未转导的T细胞的共培养；菱形：效应抗CD19-STII CAR T细胞与未修饰的靶K562细胞的共培养。Y轴：靶细胞的特异性裂解百分比。X轴：效应子：靶标物的比例。
图8显示了来自细胞毒性测定的数据，其中效应抗STII CAR T细胞与表达抗CD19-STII CAR的靶HEK293细胞一起孵育。最上面的三条曲线(圆形、正方形和朝上的三角形代表数据点)表明在所示的效应子：靶标物的比例下抗STII CAR的杀伤能力。底部曲线(朝下的三角形)来自使用未转导细胞的阴性对照。
图9显示了具有小鼠跨膜和信号传导结构域以及小鼠IgG1 CH3间隔子(左)或Myc-tag间隔子(右)的抗STII CAR构建体的示意图。
图10A和10B显示了暴露于靶细胞后表达图9中所示的抗STII CAR构建体的小鼠T细胞的细胞因子的产生。(A)Y轴：如图注所示，用抗STII CAR转导的小鼠T细胞产生的IFN-γ(ng/mL)。X轴，从左至右：阴性对照(小鼠抗CD19-Hi CAR T细胞)；具有或不具有截短的EGFR转导标志物的小鼠抗CD19-STII CAR T细胞；用PMA/IONO活化的T细胞(阳性对照)；培养基。(B)Y轴：抗STII CAR T细胞产生的IL-2(ng/mL)。X轴，从左到右：阴性对照(小鼠抗CD19-Hi CAR T细胞)；具有或不具有截短的EGFR转导标志物的小鼠抗CD19-STII CAR T细胞；用PMA/IONO活化的小鼠T细胞(阳性对照)；培养基。
图11A-11G显示了小鼠抗STII CAR T细胞的CAR表达和体内细胞裂解活性。(A)流式细胞术数据显示在小鼠T细胞中的抗STII CAR表面表达(示于左图)。(B)在施用抗CD19-1STII CAR T细胞(1STII标签)和辐射后，检查抗STII CAR T细胞疗法在B细胞发育不良的小鼠中的效果的实验治疗方案图。(C)流式细胞术数据显示根据(B)中所示的治疗方案输注第1组抗STII CAR T细胞后靶细胞(抗CD19-1 STII CAR T；黑色圈)和效应细胞(抗STIICAR T；空心圈)的细胞数量(PBMC中的％)。(D)流式细胞术数据显示在输注抗STII CAR T细胞后+3天和+42天的对照或第1组小鼠的PBMC中的B细胞(CD19+CD45.1-)；抗CD19-1 STIICAR T细胞(CD45.1+EGFR+STII+)；以及抗STII CAR T细胞(CD45.1+EGFR+Myc+)的频率。(E)流式细胞术数据显示输注第2组抗STII CAR T细胞(见(B))后靶细胞(抗CD19-1STII CAR T)和效应(抗STII CAR T)细胞的细胞数量(PBMC中的百分比)。(F)来自流式细胞术实验的数据，其显示了输注抗CD19-STII CAR T细胞后+3天(顶部六幅图)和+42天(底部六幅图)的对照和第2组小鼠的PBMC中的B细胞(CD19+CD45.1-)、抗CD19-1STII CAR T细胞(CD45.1+EGFR+STII+)和抗STII CAR T细胞(CD45.1+EGFR+)Myc+)的频率。(G)流式细胞术数据的汇总，其显示了治疗小鼠相对于健康小鼠的PBMC中的B细胞频率。
图12A显示了在施用抗CD19-3 STII CAR T细胞(3个STII标签)和辐射后，检查抗STII CAR T细胞疗法在患有B细胞发育不良的小鼠中的效果的实验治疗方案的图。图12B提供了来自流式细胞术实验的数据，其显示了用于治疗的抗CD19-3STII CAR T细胞(左)和分选的抗STII CAR T细胞(右)的数量。
图13A-13I显示了在按照图12(A)所示的方案接受治疗的小鼠中的B细胞耗竭，如在输注抗STII CAR T细胞之前测得的。(A-H)来自流式细胞术实验的数据：(A)谱系标记的PBMC的前向散射(FS)对数与侧向散射(SS)对数图；门控活淋巴细胞；(B)TX Red(Y轴)与藻红蛋白缀合的抗CD19抗体(CD19-PE)(X轴)的散点图；门控活细胞；(C)SS对数与CD19PE；(D)从图13(C)所示的实验总结细胞数量的直方图；CD19+分数示于散点图(E)和直方图(F)，CD19耗竭分数示于(G，H)。(I)PBMC中的B细胞耗竭，如用CD19PE染色后使用抗PE磁珠测定的。
图14提供了来自流式细胞术实验的数据，该实验测量了接受图12(A)所示治疗的小鼠的PBMC中的B细胞数量。顶行(“pos”)：来自未接受辐射或抗CD19-3 STII CAR T细胞的小鼠的细胞。中行(“样本”)：来自接受辐射和抗CD19-3STII CAR T细胞，然后是抗STII CART细胞的小鼠的细胞。底行(“neg”)：来自接受辐射和抗CD19-3STII CAR T细胞，但不接受抗STII CAR T细胞的小鼠的细胞。Y轴：针对天然杀伤细胞表面抗原1.1(NK1.1)的抗体。X轴：CD19+细胞(用抗CD19抗体染色)。
图15A提供了来自流式细胞术实验的数据，其显示了在图12A所示的治疗方案的过程中抗CD19-3 STII CAR T(三角形)；OT-1CD45.1/2+抗STII CAR T(正方形)；和CD90.1+CART(三角形)的细胞数量(血液中的％)。图15B提供了来自流式细胞术实验的数据，其显示了在图12A所示的治疗方案的过程中的内源性B细胞数量(血液中的％)。“Pos”：来自未接受辐射或抗CD19-3 STII CAR T细胞的小鼠的细胞。“样本”：来自接受辐射和抗CD19-3STII CART细胞，然后是抗STII CAR T细胞的小鼠的细胞。“负”：来自，接受辐射和抗CD19-3STII CART细胞，但不接受抗STII CAR T细胞的小鼠的细胞。灰色阴影＝B细胞发育不良的窗口。
图16A-16D显示了来自流式细胞术实验的数据，该实验测量在完成图15A所示的治疗方案后B细胞(用抗CD19抗体染色)、抗CD19-3STII CAR T细胞和抗STII CAR T细胞(用抗EGFRt抗体染色)的细胞数量。样本取自：(A)血液；(B)骨髓；(C)淋巴结；(D)脾脏。
图17A-17C示出了本公开的示例性表达构建体的示意图。(A)表达构建体，其编码具有3STII铰链区的抗CD19 CAR并进一步编码截短的EGFR转导标志物，其中EGFRt编码部分通过编码自切割P2A多肽的多核苷酸与CAR编码部分分离(“m19-3STII-28z_E”)。(B)表达构建体，其编码具有CD8铰链、CD8跨膜部分和CD28-4-1BB-z信号传导结构域的抗CD19 CAR，并进一步编码与3STII肽融合的EGFRt转导标志物，其中EGFRt-3STII编码部分通过编码自切割P2A多肽的多核苷酸(“ml9-28z-E-3STII”)与CAR编码部分分隔开。(C)编码抗STII CAR和截短的EGFR转导标志物的表达构建体，其CAR和标志物编码部分通过编码自切割P2A多肽的多核苷酸分割开。图17D-17F提供了来自流式细胞术实验的代表性数据，其显示了被转导的细胞表达的所示的构建体(在左侧)，而细胞的示意图在右侧。
图18A显示了实验治疗方案图，其中，在第40天向经亚致死剂量辐射的(6Gy)C57/BL6小鼠施用2x106个小鼠CD90.1+/-T细胞，该CD90.1+/-T细胞表达(1)ml9-3STII-28z_E或(2)ml9-28z_E-3STII。图18B提供了来自流式细胞术实验的数据，其显示了(1)ml9-3STII-28z_E或(2)ml9-28z_E-3STII的细胞表面表达。用抗ST别藻蓝蛋白(Y-轴)和抗EGFRt(X-轴)对细胞染色。
图19提供了来自流式细胞术实验的数据，其显示了接受：m19-3STII-28z_E CAR T细胞(左图)(n＝2)；表达抗CD19 CAR的没有STII肽的T细胞(中图)；或m19-28z_E-3STII(右图)(n＝2)的CD90.1+/-C57/BL6小鼠中的B细胞耗竭。使用抗CD19抗体对B细胞染色。
图20A显示了实验治疗方案的图，其中，对经亚致死剂量辐射的(6Gy)C57/BL6小鼠在第0天施用2x106个小鼠CD90.1+/-细胞，该小鼠CD90.1+/-细胞表达(1)ml9-3STII-28z_E或(2)m19-28z_E-3STII，然后在+40天输注2.5x106个CD45.1+/-抗STII CAR T细胞。图20B提供了来自流式细胞术实验的数据，其显示了(1)ml9-3STII-28z-E和(2)ml9-28z-E-3STII的细胞表面表达。(3)显示在转导的T细胞中抗STII CAR构建体表达的直方图。
图21A(i)-(ii)和21B(i)-(ii)显示了根据图20(A)所示的治疗方案注射抗STIICAR T细胞后6天进行的流式细胞术实验的数据。(A)注射了m19-3STII-28z_E的T细胞的小鼠的散点图。N＝2(i,ii)。门控B细胞。右图(a)和(b)显示了在转导的T细胞中所示构建体的表达。(B)来自注射了表达ml9-28z_E3STII的T细胞的小鼠的散点图。N＝2(i,ii)。门控B细胞。左图(a)和(b)显示了在转导的T细胞中构建体的表达。
图22A(i)-(ii)和22B(i)-(ii)显示了根据图20A所示的治疗方案在注射抗STIICAR T细胞后30天进行的流式细胞术实验的数据。(A)注射了m19-3STII-28z_E的T细胞的小鼠的散点图。N＝2(i,ii)。门控B细胞。右图(a)和(b)显示了在转导的T细胞中构建体的表达。(B)来自注射了表达m19-28z_E3STII的T细胞的小鼠的散点图。N＝2(i,ii)。门控B细胞。左图(a)和(b)显示了在转导的T细胞中构建体的表达。
图23A和23B显示了流式细胞术实验的数据，该实验测量在完成图20(A)所示的治疗方案后的B细胞(大图，用抗CD19抗体染色)、抗CD19-3STII CAR T细胞和抗STII CAR T细胞(小图，用抗EGFRt抗体染色)的数量。样本取自：(A)(顶部)血液；(底部)骨髓；(B)(顶部)淋巴结；和(底部)脾脏。如图22A(i)(a-b)、(ii)(a-b)和22B(i)(a-b)、(ii)(a-b)所示，分析了由转导和转移的和转移的T细胞表达的CAR构建体。
具体实施方式
本公开提供标签特异性融合蛋白，用于选择性地检测包含Strep-tag的分子或包含Strep-tag的细胞。标签特异性融合蛋白可用于监测和/或调节表达标志物的细胞表面分子(例如是CAR或含有Strep-tag的标志物)的免疫疗法细胞的活性。用于检测标带标签的分子或带标签的细胞的本公开的示例性融合蛋白(或在其细胞表面表达此类融合蛋白的细胞)可包含(a)细胞外组分，所述细胞外组分包含特异性结合strep-tag肽(如本文所定义；例如，包含氨基酸序列WSHPQFEK(SEQ ID NO:19)的肽或由其组成的肽)的结合结构域；(b)包含效应子结构域或其功能部分的细胞内组分；(c)连接细胞外和细胞内组分的跨膜结构域。
在某些实施例中，本公开提供了融合蛋白(或在其细胞表面上表达这种融合蛋白的细胞)，其可以检测或消融靶细胞，所述靶细胞包含：编码细胞表面受体的第一多核苷酸，所述细胞表面受体包括(a)细胞外组分，所述细胞外组分包含特异性结合靶抗原的结合结构域，(b)包含效应子结构域或其功能部分的细胞内组分，和(c)连接细胞外组分和细胞内组分的跨膜组分；第二多核苷酸，其编码带标签的标志物并包含编码包含标签肽的标志物的多核苷酸，其中所述编码的标签肽包含strep-tag肽，所述strep-tag肽任选地包含SEQID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成；编码自切割多肽的第三多核苷酸，位于编码细胞表面受体的第一多核苷酸与第二多核苷酸编码带标签的标志物的多核苷酸之间。在一些实施例中，公开的融合蛋白(或在其细胞表面表达该融合蛋白的细胞)可以检测或消融表达包含strep-tag肽(例如，包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成)的融合蛋白的靶细胞。如SEQ ID NO：19所示)。在某些实施丽中，包含strep-tag肽的融合蛋白包含标志物、细胞表面受体或同时包含两者，如本文进一步讨论。
本公开的组合物可用于例如调节包含带标签的细胞(例如用于细胞免疫疗法、植入物和移植物中的带标签的细胞)的细胞疗法的方法。例如，表达异源分子(例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))的免疫疗法细胞在施用时几乎没有效果或可能导致一种或多种不良事件。本公开提供了用于调节(例如，中和、杀死、活化、刺激或以其他方式调节)免疫疗法细胞的试剂。在某些实施例中，本文所述的组合物和方法将具有用于选择性地调节(例如，根据需要杀死或活化)带标签的免疫疗法细胞(例如带标签的CAR T细胞或包含带标签的标志物的CAR T细胞)的用途。
在更详细地阐述本公开之前，提供其用于本文的某些术语的定义可以有助于对其的理解。其他定义贯穿全文来阐述。
在本说明书中，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当时包括其分数的分数(例如，整数的十分之一和一百分之一)。而且，除非另外指出，否则本文所述的涉及任何物理特征(例如聚合物亚基、大小或厚度)的任何数值范围，，应理解为包括所述范围内的任何整数。如本文所用，除非另外指出，否则术语“约”意为所述范围、值或结构的±20％。应当理解，本文所用术语“一(a)”和“一(an)”是指所列举的组分中的“一或多”。应将替代方案(例如“或”)的使用理解为意指替代方案中的一个、两个或任意组合。如本文所用，术语“包括”、“有”和“包含”，该术语和其变体旨在解释为非限制性。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的元素、组分、事件或情况可能出现或可能不出现，并且该描述包括该元素、组分、事件或情况出现的情况以及它们不出现的情况。
另外，应该理解，本申请公开了衍生自本文所述的结构和亚基的各种组合的单独构建体或构建体组的程度与如同逐个地列出每个构建体或构建体组的程度相同。因此，特定结构或特定亚基的选择在本公开的范围内。
术语“基本上由……组成”并不等同于“包含”，并且是指权利要求的指定材料或步骤，或者是指基本不影响要求保护的主题的基本特征的那些。例如，当存在以下时，蛋白质结构域、区域或模块(例如结合结构域、铰链区或接头)或蛋白质(其可以具有一个或多个结构域、区域或模块)“基本上由特定的氨基酸序列组成”：结构域、区域、模块或蛋白质的氨基酸序列包括延伸、缺失、突变或其组合(例如，氨基或羧基末端或结构域之间的氨基酸)，该延伸、缺失、突变或其组合共同构成结构域、区域、模块或蛋白质长度的最多20％(例如，最多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)并且基本不影响结构域、区域、模块或蛋白质的活力(例如结合蛋白的靶结合亲和力)(即活力减少不超过50％，例如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)。
如本文所用，“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。
如本文所用，“突变”是指分别与参考或野生型核酸分子或多肽分子相比，核酸分子或多肽分子的序列变化。突变可导致几种不同类型的序列变化，包括核苷酸或氨基酸的取代、插入或缺失。
“保守取代”是指不显著影响或改变特定蛋白质的结合特征的氨基酸取代。通常，保守取代是其中取代的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的取代。保守取代包括在以下组之一中发现的取代：第1组：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)，丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)；第2组：天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或Z)；第3组：天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gin或Q)；第4组：精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)；第5组：异亮氨酸(He或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)；第6组：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Tip或W)。
另外或替代地，可以通过相似的功能、化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂族、芳族或含硫)将氨基酸分组为保守取代基。例如，出于取代目的，脂族分组可包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。其他保守取代基包括：含硫：Met和半胱氨酸(Cys或C)；酸性：Asp、Glu、Asn和Gin；小脂族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gin；极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大脂族非极性残基：Met、Leu、He、Val和Cys；以及大芳族残基：Phe、Tyr和Tip。其他信息可以在Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company中找到。
如本文所用，“蛋白质”或“多肽”是指氨基酸残基的聚合物。蛋白质适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸聚合物的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。
如本文所用，“融合蛋白”是指在单链中具有至少两个不同结构域的蛋白质，其中所述结构域不是天然一起存在于蛋白质中。可以使用PCR、工程重组等构建编码融合蛋白的多核苷酸，或者可以合成此类融合蛋白。融合蛋白可进一步包含其他成分，例如标签、接头或转导标志物。在某些实施例中，由宿主细胞(例如，T细胞)表达或产生的融合蛋白位于细胞表面，其中融合蛋白被锚定至细胞膜(例如，通过跨膜结构域)并包含细胞外部分(例如，包含结合结构域)和细胞内部分(例如，包含信号传导结构域、效应子结构域、共刺激结构域或其组合)。
“核酸分子”或“多核苷酸”是指包括共价连接的核苷酸的聚合化合物，其可以由天然亚基(例如嘌呤或嘧啶碱基)或非天然亚基(例如吗啉环)组成。嘌呤碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，嘧啶碱基包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸分子包括聚核糖核酸(RNA)、聚脱氧核糖核酸(DNA)，其可以是单链或双链的cDNA、基因组DNA和合成DNA。如果是单链，则核酸分子可以是编码链或非编码链(反义链)。编码氨基酸序列的核酸分子包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核苷酸序列的某些形式还可以包括内含子，以至于内含子将通过共转录或转录后机制被除去。换句话说，由于遗传密码的冗余或简并或通过剪接，不同的核苷酸序列可编码相同的氨基酸序列。
还设想了本公开的核酸分子的变体。变体核酸分子与本文定义的或参考的多核苷酸的核酸分子至少70％、75％、80％、85％、90％相同，并且优选95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同，或在严格的杂交条件下与多核苷酸杂交：在约65-68℃的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或在约42℃的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺。核酸分子变体保留编码具有本文所述功能(例如特异性结合靶分子)的融合蛋白或其结合结构域的能力。
“序列同一性百分比”是指通过比较序列确定的两个或更多个序列之间的关系。确定序列同一性的优选方法被设计为在所比较的序列之间给出最佳匹配。例如，为了最佳比较目的，比对序列(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口)。此外，出于比较的目的，可以忽略非同源序列。除非另外指出，否则本文所参考的序列同一性百分比是在参考序列的长度上计算的。确定序列同一性和相似性的方法可以在可公开获得的计算机程序中找到。序列比对和百分比同一性计算可以使用BLAST程序(例如，BLAST 2.0、BLASTP、BLASTN或BLASTX)进行。BLAST程序中使用的数学算法可以在Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997的《核酸研究》中找到。在本公开的上下文中，将理解的是，在使用序列分析软件进行分析的情况下，分析的结果基于所引用程序的“默认值”。“默认值”是指首次初始化时最初随软件加载的任何一组值或参数。
术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果材料是天然存在的即为天然环境)中除去。例如，没有分离存在于活体动物中的天然存在的核酸或多肽，而是分离了与天然系统中的一些或所有共存物质分离的相同核酸或多肽。这样的核酸可以是载体的一部分和/或这样的核酸或多肽可以是组合物(例如细胞裂解物)的一部分，并且仍然被分离，因为这样的载体或组合物不是核酸或多肽的天然环境的一部分。
术语“基因”意指与产生多肽链有关的DNA片段。它包括编码区之前和之后的区域(“前导区和尾区”)以及各个编码段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“功能变体”是指与本公开的亲本或参考化合物在结构上或基本相似但组成略有不同(例如，一个碱基、原子或官能团是不同的、被添加或被去除)的多肽或多核苷酸，使得该多肽或编码的多肽能够以亲本多肽活性水平的至少50％(优选至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％)的效率执行编码的亲本多肽的至少一种功能。换句话说，与亲本或参考多肽相比，当功能变体在所选测定(如用于测量结合亲和力的测定法(例如，用于测量缔合(Ka)或解离(KD)常数的
Figure BDA0002401853890000101
或四聚体染色法))中表现出不超过50％的性能降低时，本公开的多肽或编码的多肽的功能变体具有“相似的结合”、“相似的亲和力”或“相似的活性”。
如本文所用，“功能性部分”或“功能性片段”是指仅包含亲本或参考化合物的结构域、部分或片段的多肽或多核苷酸，并且该多肽或编码的多肽保留与亲本或参考化合物的结构域、部分或片段相关的活性的至少50％，优选亲本多肽活性的至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％水平，或提供生物学益处(例如，效应子功能)。当存在以下时，本公开的多肽或编码的多肽的“功能性部分”或“功能性片段”具有“相似的结合”或“相似的活性”：与亲本或参考多肽相比(优选在亲和力方面与亲本或参考相比不超过20％或10％，或不超过对数差异)，例如用于测量结合亲和力或测量效应子功能的测定(例如，细胞因子释放)，功能性部分或片段在所选测定中表现出不超过50％的性能降低。
如本文所用，“异源的”或“非内源的”或“外源的”是指对于宿主细胞或受试者不是天然的任何基因、蛋白质、化合物、核酸分子，或对于任何基因、蛋白质、化合物、核酸分子不是天然的活性，或对于已经改变的宿主细胞或受试者天然的化合物。异源的、非内源的或外源的包括已突变或以其他方式改变的基因、蛋白质、化合物或核酸分子，使得在天然和改变后的基因、蛋白质、化合物或核酸分子之间的结构、活性或两者不同。在某些实施例中，异源、非内源或外源基因、蛋白质或核酸分子(例如受体、配体等)对于宿主细胞或受试者而言可能不是内源的，而是编码此类基因、蛋白质或核酸分子的核酸可能已经通过缀合、转化、转染、电穿孔等添加到宿主细胞中，其中添加的核酸分子可以整合到宿主细胞基因组中或可以作为染色体外遗传物质(例如，作为质粒或其他自我复制载体)存在。
术语“同源”或“同源物”是指在宿主细胞、物种或菌株中发现的或衍生自宿主细胞、物种或菌株的基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。例如，编码多肽的异源或外源多核苷酸或基因可以与天然多核苷酸或基因同源并编码同源多肽或活性，但是该多核苷酸或多肽可以具有改变的结构、序列、表达水平或其任何组合。非内源性多核苷酸或基因以及所编码的多肽或活性可以来自相同物种、不同物种或其组合。
如本文所用，术语“内源的”或“天然的”是指通常存在于宿主细胞或受试者中的多核苷酸、基因、蛋白质、化合物、分子或活性。
如本文所用，术语“表达”是指基于核酸分子(例如基因)的编码序列产生多肽的过程。该过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任何组合。表达的核酸分子通常与表达控制序列(例如启动子)可操作地连接。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上两个或更多个核酸分子的缔合，从而一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，该编码序列在该启动子的转录控制下)，该启动子与该编码序列可操作地连接。“未连接”是指相关的遗传要素彼此之间不紧密关联，并且其中一个的功能不影响另一个。
如本文所用，“表达载体”是指含有核酸分子的DNA构建体，该核酸分子可操作地连接至能够影响核酸分子在合适宿主中表达的合适控制序列。此类控制序列包括实现转录的启动子、控制此类转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒或仅是潜在的基因组插入物。一旦转化进合适的宿主，载体就可以独立于宿主基因组复制和发挥功能，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”、“病毒”和“载体”经常互换使用。
在将核酸分子插入细胞中的上下文中，术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及将核酸分子掺入到真核或原核细胞中，其中核酸分子可以被掺入细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，被转化成自主复制子，或被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。如本文所用，术语“工程的”、“重组的”或“非天然的”是指包括至少一种遗传改变或已通过引入外源性核酸分子而被修饰的生物、微生物、细胞、核酸分子或载体，其中这种改变或修饰是通过基因工程(即人为干预)引入的。遗传改变包括例如引入编码蛋白质、融合蛋白或酶的可表达核酸分子的修饰，或细胞遗传物质的其他核酸分子的添加、缺失、取代或其他功能破坏。其他修饰包括例如非编码调节区，在该非编码调节区中所述修饰改变多核苷酸、基因或操纵子的表达。
如本文所述，多于一个异源核酸分子可以作为分离的核酸分子、作为多个单独控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单个核酸分子或其任何组合被引入宿主细胞。当将两个或更多个异源核酸分子引入宿主细胞时，应理解，两个或更多个异源核酸分子可作为单个核酸分子(例如，在单个载体上)在分开的载体上在单个位点或多个位点或任何其组合整合到宿主染色体中。所提及的异源核酸分子或蛋白质活性的数目是指编码核酸分子的数目或蛋白质活性的数目，而不是引入宿主细胞中的分开的核酸分子的数目。
术语“构建体”是指含有重组核酸分子的任何多核苷酸。构建体可以存在于载体(例如细菌载体、病毒载体)中或可以整合到基因组中。“载体”是能够转运另一个核酸分子的核酸分子。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可以包括染色体、非染色体、半合成或合成的核酸分子。本公开的载体还包括转座子系统(例如，Sleeping Beauty，参见，例如，Geurts et al.,Mol.Ther.8:108,2003:Mátés et al.,Nat.Genet.41:753,2009)。示例性载体是能够自主复制的载体(附加载体)、能够将多核苷酸递送至细胞基因组的载体(例如病毒载体)或能够表达与其连接的核酸分子的载体(表达载体)。
如本文所用，术语“宿主”是指目标为用异源核酸分子进行遗传修饰以产生目的多肽(例如，本公开的融合蛋白)的细胞(例如，T细胞)或微生物。在某些实施例中，宿主细胞可以任选地已经拥有或被修饰为包含其他遗传修饰，该其他遗传修饰赋予与例如异源蛋白质的生物合成相关或不相关的所需性质(例如，包含可检测的标志物；缺失、改变或截短内源性TCR；或增加共刺激因子的表达)。
如本文所用，相对于混合物中的细胞类型的量，“富集的”或“耗竭的”是指在一个或多个富集或耗竭过程或步骤中产生的细胞混合物中“富集的”类型的数量增加、“耗竭的”细胞的数量减少或两者兼有。因此，取决于经历富集过程的原始细胞群的来源，混合物或组合物可包含30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上(数目或数量)的“富集的”的细胞。经受耗竭过程的细胞可导致混合物或组合物包含50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％以下百分比(数目或数量)的“耗竭的”细胞。在某些实施例中，混合物中某种细胞类型的量将被富集，同时不同的细胞类型的量将被耗竭，例如富集CD4+细胞同时耗竭CD8+细胞、或富集CD62L+同时耗竭CD62L–细胞的细胞、或其组合。
“T细胞受体”(TCR)是指免疫球蛋白超家族成员(具有可变的结合结构域、恒定结构域、跨膜区和短的细胞质尾巴；参见，例如，Janeway et al.,Immunobiology:The ImmuneSystem in Health and Disease,3rd Ed.,Current Biology Publications,p.4:33,1997)，其能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽。TCR可以存在于细胞表面或呈可溶性形式，通常由具有α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)、或γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)的异二聚体组成。与免疫球蛋白一样，TCR链(例如，α链、β链)的细胞外部分包含两个免疫球蛋白结构域、位于N末端与细胞膜相邻的可变结构域(例如，α链可变结构域或Vα，β链可变结构域或Vβ；通常是基于Kabat编号的1到116位氨基酸((Kabat et al.,"Sequences ofProteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,5th ed.)和一个恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常是基于Kabat的117至259位氨基酸，β-链恒定结构域或Cβ，通常是基于Kabat的117至295位氨基酸)。同样，像免疫球蛋白，可变结构域包含由构架区(FR)隔开的互补决定区(CDR)(参见，例如，Jores et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia et al.,EMBO J.7:3745,1988；see also Lefranc et al.,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在某些实施例中，TCR存在于T细胞(或T淋巴细胞)的表面上并与CD3复合物缔合。如本公开中使用的TCR的来源可以来自各种动物物种，例如人、小鼠、大鼠、兔或其他哺乳动物。
在本领域中已知“CD3”是六链的多蛋白复合物(参见，Abbas and Lichtman,2003；Janeway et al.,p.172and 178,1999)。在哺乳动物中，复合物包含CD3γ链、CD3ε链、两条CD3s链和CD3ζ链的同二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε的跨膜区带负电，这是允许这些链与带正电的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε的细胞内尾部各包含单个保守的基序，称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM，而每个CD3ζ链均具有三个ITAM。不希望受到理论的束缚，认为ITAM对于TCR复合体的信号传递能力是重要的。如本公开中使用的CD3可以来自各种动物物种，包括人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。
“主要组织相容性复合体分子”(MHC分子)是指将肽抗原递送至细胞表面的糖蛋白。MHC I类分子是异二聚体，由跨α链(具有三个α结构域)的膜和非共价结合的β2微球蛋白组成。MHC II类分子由两个跨膜糖蛋白α和β组成，两者都跨膜。每条链都有两个结构域。MHCI类分子将起源于胞质溶胶的肽递送至细胞表面，其中肽：MHC复合体被CD8+T细胞识别。MHCII类分子将起源于囊泡系统的肽递送至细胞表面，在此处它们被CD4+T细胞识别。MHC分子可以来自各种动物物种，包括人、小鼠、大鼠、猫、狗、山羊、马或其他哺乳动物。
“CD4”是指协助TCR与抗原呈递细胞通讯的免疫球蛋白共受体糖蛋白(参见，Campbell&Reece,Biology 909(Benjamin Cummings,Sixth Ed.,2002)；UniProtKBP01730)。CD4存在于免疫细胞(如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)的表面，并包括在细胞表面表达的四个免疫球蛋白结构域(D1至D4)。在抗原呈递过程中，CD4与TCR复合物一起被募集以结合到MHCII分子的不同区域(CD4结合MHCIIβ2，而TCR复合物结合MHCIIα1/β1)。不希望受到理论束缚，相信与TCR复合物的紧密接近使CD4相关的激酶分子将存在于CD3的细胞质结构域上的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)磷酸化。该活性被认为是放大由活化的TCR产生的信号，以便产生各种类型的T辅助细胞。
如本文所用，术语“CD8共受体”或“CD8”是指细胞表面糖蛋白CD8，其为α-α同二聚体或α-β异二聚体。CD8共受体协助细胞毒性T细胞(CD8+)的功能，并通过其胞质酪氨酸磷酸化途径的信号传递来起作用(Gao and Jakobsen,Immunol.Today 21:630-636,2000；Coleand Gao,Cell.Mol.Immunol.1:81-88,2004)。在人中，有五(5)条不同的CD8β链(参见UniProtKB标识符P10966)和单条CD8α链(参见UniProtKB标识符P01732)。
“嵌合抗原受体”(CAR)是指经工程改造以包含以宿主细胞中天然不存在或天然不存在的方式连接在一起的两个或更多个天然存在的氨基酸序列的融合蛋白，当存在于细胞表面时，该融合蛋白可以起受体的作用。本公开的CAR包括包含抗原结合结构域(即，得自或衍生自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，例如衍生自对癌症抗原特异的抗体或TCR的scFv或scTCR，或衍生自或得自NK细胞的杀伤性免疫受体的或抗原结合结构域)的细胞外部分，其与跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域(任选地包含共刺激结构域)连接(参见，例如Sadelain et al.,Cancer Discov.,3(4):388(2013)；see also Harris andKranz,Trends Pharmacol.Sci.,37(3):220(2016)；Stone et al.,CancerImmunol.Immunother.,63(11):1163(2014))。在某些实施例中，结合蛋白包含含有抗原特异性TCR结合结构域的CAR(参见，例如Walseng et al.,Scientific Reports 7:10713,2017；TCR CAR构建体及其方法的全部内容在此通过引用并入本文)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指TCRα链或β链(或γδTCR的γ链和δ链)或抗体重链或轻链的结构域，其参与结合抗原。天然TCR的α链和β链的可变结构域(分别为Vα和Vβ)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个通常保守的框架区(FR)和三个CDR。抗体重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域通常也各自包含四个通常保守的框架区(FR)和三个CDR。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，并且在本领域中已知是指赋予抗原特异性和/或结合亲和力的TCR或抗体可变区中氨基酸的非连续序列。通常，在每个可变区中存在三个CDR(即，在TCRα链和β链可变区中的每个具有三个CDR；在抗体重链和轻链可变区中的每个中具有3个CDR)。对于TCR，CDR3被认为是负责识别加工抗原的主要CDR。CDR1和CDR2主要与MHC相互作用。可变结构域序列可以与编号方案(例如，Kabat，EU，国际免疫遗传学信息系统(IMGT)和Aho)比对，这可以允许对等效残基位置进行注释，并使用抗原受体编号和受体分类(ANARCI)软件工具比较不同分子(2016,Bioinformatics 15:298-300)。
如本文所用，“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的免疫原性分子。这种免疫应答可能涉及抗体的产生、特定免疫学上具有活性的细胞(例如，T细胞)的活化或两者。抗原(免疫原性分子)可以是例如肽、糖肽、多肽、糖多肽、多核苷酸、多糖、脂质等。显而易见，抗原可以合成、重组产生或衍生自生物学样本。可以包含一种或多种抗原的示例性生物样本包括组织样本、肿瘤样本、细胞、生物液或其组合。抗原可以由经过修饰或基因工程改造以表达抗原的细胞来产生。
术语“表位”或“抗原表位”包括被同源结合分子识别并特异性结合的任何分子、结构、氨基酸序列或蛋白质决定簇，例如免疫球蛋白、T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体、或其他结合分子、结构域或蛋白质。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“改善”是指对受试者(例如人或非人哺乳动物，如灵长类、马、猫、狗、山羊、小鼠或大鼠)疾病、失调或病症的医学管理。通常，以足以引起治疗或预防益处的量施用包含表达本公开的融合蛋白的宿主细胞和任选的佐剂的合适剂量或治疗方案。治疗或预防/预防性益处包括改善临床结果；减轻或缓和与疾病有关的症状(例如B细胞发育不良)；减少症状的发生；改善生活质量；延长无病状态；减少疾病程度；稳定疾病状态；延迟疾病进展；缓解；生存；延长生存期；或其任何组合。
表达本公开的融合蛋白的宿主细胞或融合蛋白的“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生治疗效果(包括改善临床结果；减轻或缓和与疾病有关的症状；减少症状的发生；改善生活质量；延长无病状态；减少疾病程度；稳定疾病状态；延迟疾病进展；缓解；生存；以统计学显著的方式延长生存期生存)的融合蛋白或宿主细胞的量。当涉及单独施用的单独的活性成分或表达单一活性成分的细胞时，治疗有效量是指该成分或单独表达该成分的细胞的作用。当提及组合时，治疗有效量是指活性成分或组合的辅助活性成分与表达导致治疗效果的活性成分的细胞的组合量，无论是相继施用还是同时施用。组合也可以是表达超过一种活性成分的细胞，例如两种不同的融合蛋白(例如，CAR)，它们特异性地结合streptag肽(例如，包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成)或本公开的融合蛋白。
术语“药学上可接受的赋形剂或载剂”或“生理上可接受的赋形剂或载剂”是指生物学相容性载体，例如生理盐水，在本文中将更详细描述，其适于在人或其他非人哺乳动物受试者中施用且通常被认为是安全的或不会引起严重不良事件。
如本文所用，“统计学上显著”是指当使用Student’s t-test计算出的p值等于0.050或以下，并且指示不太可能偶然出现所测量的特定事件或结果。
如本文所用，术语“过继免疫疗法(adoptive immune therapy)”或“过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)”是指施用天然存在的或基因工程改造的疾病抗原特异性的免疫细胞(例如T细胞)。过继细胞免疫疗法可以是自体的(免疫细胞来自受体)、同种异体的(免疫细胞来自相同物种的供体)或同基因的(免疫细胞来自与受体基因上相同的供体)。
如本文所用，“靶向消融”是指选择性杀死(例如，通过诱导细胞凋亡、裂解、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、或通过另一种机理)靶细胞(例如，表达具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的标签肽的细胞)。如本文所述，表达本公开的融合蛋白的宿主细胞比其他细胞选择性地(即，特异性地或优先地)靶向表达具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的标签肽的细胞，其中与靶细胞的结合诱导消除靶(即带标签的)细胞的靶向免疫反应。
在任何本公开的实施例中，融合蛋白或其结合结构域能够特异性地结合至strep-tag肽。如本文所用，术语“strep-tag肽”是指能够与链霉亲和素(其是从链霉菌纯化的四聚体蛋白，由于其对生物素的高亲和力而广泛用于分子生物学方案)或与streptactin(这是经工程改造的链菌亲和素的突变蛋白)特异性结合的肽。本公开的示例性strep-tag肽与生物素竞争结合链霉亲和素或streptactin，并且包括例如原始
Figure BDA0002401853890000161
标签(WRHPQFGG,SEQID NO:48)；和
Figure BDA0002401853890000162
Tag II(在本文中也称为“STII”，其是原始
Figure BDA0002401853890000163
的优化版本，由氨基酸序列WSHPQFEK(SEQ ID NO:19)组成)；及其变体，包括公开在以下的：例如，参见Schmidt and Skerra,Nature Protocols,2:1528-1535(2007)，美国专利号7,981,632；和PCT公开号WO 2015/067768，所述strep-tag肽、含step-tag肽的多肽及其序列通过引用并入本文。
融合蛋白
在某些方面，本公开提供了融合蛋白，其包含：(a)细胞外组分，其包含特异性结合strep-tag肽的结合结构域；(b)包含效应子结构域或其功能部分的细胞内组分；(c)连接细胞外和细胞内组分的跨膜结构域。
在某些实施例中，strep-tag肽包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成。
如本文所用，“结合结构域”(也称为“结合区”或“结合部分”)是指具有与靶标(例如，包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的肽)特异性和非共价联合、合并或结合的能力的分子或其部分(例如肽、寡肽、多肽、蛋白质(如融合蛋白))。结合结构域包括生物分子、分子复合物(即，包含两个或更多个生物分子的复合物)或其他目的靶标的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合伴侣。示例性的结合结构域包括单链免疫球蛋白可变区(例如，scTCR、scFv、Fab、TCR可变区)、受体胞外域、配体(例如，细胞因子、趋化因子)或为其与生物分子结合、分子复合物或其他目的靶标的特定能力而选择的合成多肽。在某些实施例中，结合结构域是scFv、scTCR或配体。在某些实施例中，结合结构域是嵌合的、人的或人源化的。
在一些实施例中，结合结构域包含：(a)SEQ ID NO：22、28或34中任一项所示的重链CDR 1氨基酸序列，或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：22、28或34的变体；(b)SEQ ID NO：23、29或35中任一个所示的重链CDR 2氨基酸序列，或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：23、29或35的变体；和(c)SEQ ID NO：24、30或36中任一个所示的重链CDR 3氨基酸序列，或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：24、30或36的变体。
在某些实施例中，结合结构域包含(a)SEQ ID NO：25、31或37中任一项所示的轻链CDR 1氨基酸序列，或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：25、31或37的变体；(b)SEQ ID NO：26、32或38中任一个所示的轻链CDR 2氨基酸序列，或具有1或2个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：26、32或38的变体；(c)SEQ ID NO：27、33或39中任一个所示的轻链CDR 3氨基酸序列，或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：27、33或39的变体。
在任何本公开的实施例中，结合结构域可包含来自5G2抗体、3E8抗体、4E2抗体、3C9抗体或4C4抗体的CDR序列。
在一些实施例中，结合结构域包含：(a)SEQ ID NO：28所示的重链CDR1氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：29所示的重链CDR2氨基酸序列；(c)SEQ ID NO：30所示的重链CDR3酸序列；(d)SEQ ID NO：31所示的轻链CDR1氨基酸序列；(e)SEQ ID NO：32所示的轻链CDR2氨基酸序列；(e)SEQ ID NO：33所示的轻链CDR3酸序列。
在其他实施例中，结合结构域包含：(a)SEQ ID NO：22所示的重链CDR1氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：23所示的重链CDR2氨基酸序列；(c)SEQ ID NO：24所示的重链CDR3酸序列；(d)SEQ ID NO：25所示的轻链CDR1氨基酸序列；(e)SEQ ID NO：26所示的轻链CDR2氨基酸序列；和(e)SEQ ID NO：27所示的轻链CDR3酸序列。在其他实施例中，结合结构域包含：(a)SEQ ID NO：34所示的重链CDR1氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：35所示的重链CDR2氨基酸序列；(c)SEQ ID NO：36所示的重链CDR3酸序列；(d)SEQ ID NO：37所示的轻链CDR1氨基酸序列；(e)SEQ ID NO：38所示的轻链CDR2氨基酸序列；和(e)SEQ ID NO：39所示的轻链CDR3酸序列。
在又其他实施例中，本公开的结合结构域包括CDR和任选的如PCT公开号WO 2015/067768中公开的“C23.21”抗体的VH和VL序列，所述CDR、VH和VL序列通过引用并入本文。
可以从本公开的结合结构域获得或衍生出的其他抗体包括“Anti-Strep-tag II抗体”(ab76949)，可从
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商购获得；“StrepMAB-Immo”和“StrepMAB-Classic”两者都公开在例如Schmidt and Skerra,Nature Protocols,2:1528-1535(2007)，并且可以从IbaLife Sciences商购获得；和Strep-tag抗体(Qiagen，目录号34850)。这些抗体的CDR、VH和VL序列也以引用的方式并入。
在某些实施例中，结合结构域是包含VH结构域、VL结构域和肽接头的scFv。在特定的实施例中，scFv包含通过肽接头与VL结构域连接的VH结构域，其可以处于VH-接头-VL取向或VL-接头-VH取向。在一些实施例中，scFv包含VH结构域、VL结构域和肽接头，其中VH和VL结构域基于3E8抗体、5G2抗体、4E2抗体、3C9抗体或4C4抗体的VH和VL结构域。
在其他实施例中，scFv包含VH结构域、VL结构域和肽接头，其中VH和VL结构域基于C23.21抗体的VH和VL结构域。
在其他实施例中，scFv包含VH结构域、VL结构域和肽接头，其中VH和VL结构域基于Anti-Strep-tag II抗体的VH和VL结构域；StrepMAB-Immo；StrepMAB-Classic；或Strep-tag抗体或其任何组合。
在进一步的实施例中，scFv包含与SEQ ID NO：3；10；或16所示的氨基酸序列至少90％相同的轻链可变区(VL)；和与SEQ ID NO：2；8；或14所示的氨基酸序列至少90％相同的重链可变区(VH)。在进一步的实施例中，scFv包含VL，所述VL包含SEQ ID NO：3；10；或16所示的氨基酸序列或由其组成；和VH，所述VH由SEQ ID NO：2；8；或14所示的氨基酸序列或由其组成。在另外的实施例中，scFv包含(a)SEQ ID NO：3的VL和SEQ ID NO：2的VH；(b)SEQ ID NO：10的VL和SEQ ID NO：8的VH或(c)SEQ ID NO：16的VL和SEQ ID NO：14的VH。可以对本公开的任何scFv进行工程改造，使得VL结构域的C末端通过短肽序列连接至VH结构域的N末端，反之亦然(即，((N)VL(C)-接头-(N)VH(C)或(N)VH(C)-接头-(N)VL(C)。在特定的实施例中，scFv包含SEQ ID NO：5、6、11、12、17或18中任一氨基酸序列或由其组成。
如本文所用，“特异性结合”或“特异性针对”是指结合蛋白(例如，T细胞受体或嵌合抗原受体)或结合结构域(或其融合蛋白)与靶分子(例如，包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的strep-tag肽)的缔合或结合，亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M)等于或大于10 5M-1(其等于该缔合反应的打开速率[Kon]与关闭速率[Koff]之比)，而不会与样本中的任何其他分子或组分显着缔合或结合。结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)可分类为“高亲和力”结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)或“低亲和力”结合蛋白或结合结构域(或其融合蛋白)。“高亲和力”结合蛋白或结合结构域是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M 1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、或至少1013M-1的结合蛋白或结合结构域。“低亲和力”结合蛋白或结合结构域是指Ka为至多107M-1、至多106M-1、或至多105M-1的结合蛋白或结合结构域。或者，亲和力可定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)，单位为M(例如10-5M至10-13M)。
在某些实施例中，受体或结合结构域可具有“增强的亲和力”，其是指与野生型(或亲本)结合结构域相比对靶抗原具有更强结合的选择的或工程改造的受体或结合结构域。例如，增强的亲和力可能是由于对靶抗原的Ka(平衡缔合常数)高于野生型结合结构域，由于对靶抗原的Kd(解离常数)小于野生型结合结构域的解离常数，由于对靶抗原的解离速率(koff)小于野生型结合结构域的解离速率，或其组合。在某些实施例中，可以对融合蛋白进行密码子优化以增强在特定宿主细胞(例如T细胞)中的表达(Scholten et al.,Clin.Immunol.119:135,2006)。
已知多种测定可用于鉴定与特定靶标特异性结合的本发明的结合结构域，以及确定结合结构域或融合蛋白的亲和力，例如Western blot、ELISA、分析超速离心法、光谱学和表面等离振子共振
Figure BDA0002401853890000191
分析(参见，例如Scatchard et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949；Wilson,Science 295:2103,2002；Wolff et al.,Cancer Res.53:2560,1993；和美国专利号5,283,173,5,468,614等)。用于评估亲和力或表观亲和力或相对亲和力的测定也是已知的。在某些实例中，通过评估与各种浓度的四聚体的结合来测量对融合蛋白的表观亲和力，例如，使用标记的四聚体通过流式细胞术。在一些实例中，使用标记的四聚体的2倍稀释度在一定浓度范围内测量融合蛋白的表观KD，然后通过非线性回归确定结合曲线，表观KD被确定为产生最大结合的一半的配体浓度。
如本文所用，“效应子结构域”是融合蛋白或受体的细胞内部分或结构域，当接收适当的信号时，其可以直接或间接促进细胞中的生物学或生理学应答。在某些实施例中，效应子结构域来自蛋白质或其部分或蛋白质复合物，其在结合时或当蛋白质或其部分或蛋白质复合物直接结合至靶分子并触发来自效应子结构域的信号时接收信号。
当效应子结构域包含一个或多个信号传导结构域或基序(例如在共刺激分子中发现的基于细胞内酪氨酸的活化基序(ITAM))时，它可以直接促进细胞应答。不希望受理论束缚，据信ITAM对于由T细胞受体或包含T细胞效应子结构域的融合蛋白进行配体结合后的T细胞活化是重要的。在某些实施例中，细胞内组分或其功能部分包含ITAM。示例性效应子结构域包括来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、Wnt、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或其任何组合的效应子结构域。在某些实施例中，效应子结构域包含淋巴细胞受体信号传导结构域(例如CD3ζ或其功能部分)。
在进一步的实施例中，融合蛋白的细胞内组分包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)或其组合的共刺激结构域或其功能部分。在某些实施例中，细胞内组分包含CD28共刺激结构域或其功能部分(其可任选地包括在天然CD28蛋白的186-187位的LL-GG突变(参见Nguyen et al.,Blood 102:4320,2003))、4-IBB共刺激结构域或其功能部分、或两者。
在某些实施例中，效应子结构域包含CD3ζ或其功能部分。在进一步的实施例中，效应子结构域包含来自CD27的一部分或结构域。在进一步的实施例中，效应子结构域包含来自CD28的一部分或结构域。在又进一步的实施例中，效应子结构域包含4-1BB的一部分或结构域。在进一步的实施例中，效应子结构域包含来自OX40的一部分或结构域。
本公开的细胞外组分和细胞内组分通过跨膜结构域连接。如本文所用，“跨膜结构域”是可以插入或跨越细胞膜的跨膜蛋白的一部分。跨膜结构域具有在细胞膜中热力学稳定的三维结构，并且长度范围通常为约15个氨基酸至约30个氨基酸。跨膜结构域的结构可包含α螺旋、β桶、β折叠、β螺旋或其任何组合。在某些实施例中，跨膜结构域包含或衍生自已知的跨膜蛋白(例如，CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD27跨膜结构域、CD28跨膜结构域或其任何组合)。
在某些实施例中，融合蛋白的细胞外组分还包含位于结合结构域和跨膜结构域之间的接头。如本文所用，当指连接结合和跨膜结构域的融合蛋白的组分时，“接头”可以是具有约两个氨基酸至约500个氨基酸的氨基酸序列，其可以提供柔性和通过连接子连接的两个区域、结构域、基序、片段或模块之间的构想运动空间。例如，本公开的接头可以使结合结构域远离表达融合蛋白的宿主细胞的表面，以使得宿主细胞与靶细胞之间能够适当接触、抗原结合和活化(Patel et al.,Gene Therapy 6:412-419,1999)。可以基于所选的靶分子、所选的结合表位或抗原结合结构域的大小和亲和力改变接头长度以使抗原识别最大化(参见，例如Guest et al.,J.Immunother.28:203-11,2005；PCT公开号WO 2014/031687)。示例性的接头包括具有甘氨酸-丝氨酸氨基酸链的具有GlyxSery的1至约10个重复的接头，其中x和y各自独立地是0至10的整数，条件是x和y不都是0(例如，(Gly4Ser)2(SEQ ID NO:20)；(Gly3Ser)2(SEQ ID NO:21)；Gly2Ser；或其组合，例如(Gly3Ser)2Gly2Ser(SEQ ID NO:49))。
本公开的接头还包括免疫球蛋白恒定区(即，任何同种型的CH1、CH2、CH3或CL)及其部分。在某些实施例中，接头包含CH3结构域、CH2结构域或两者。在某些实施例中，接头包含CH2结构域和CH3结构域。在进一步的实施例中，CH2结构域和CH3结构域各自是相同的同种型。在特定的实施例中，CH2结构域和CH3结构域是IgG4或IgG1同种型。在其他实施例中，CH2结构域和CH3结构域各自是不同的同种型。在特定的实施例中，CH2包含N297Q突变。不希望受理论束缚，据信具有N297Q突变的CH2结构域不结合FcγR(参见，例如，Sazinsky etal.,PNAS 105(51):20167(2008))。在某些实施例中，接头包含人免疫球蛋白恒定区或其部分。
在本文描述的任何实施例中，接头可包含铰链区或其部分。铰链区是具有可变长度和序列的柔性氨基酸聚合物(通常富含脯氨酸和半胱氨酸氨基酸)，并连接较大和较不柔性的免疫球蛋白蛋白区域。例如，铰链区连接抗体的Fc区和Fab区，并连接TCR的恒定区和跨膜区。在某些实施例中，接头包含免疫球蛋白恒定区或其部分和铰链区或其部分。在某些实施例中，接头包含甘氨酸-丝氨酸接头，所述甘氨酸-丝氨酸接头包含SEQ ID NO：20或21或49所示的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施例中，细胞外组分、结合结构域、接头、跨膜结构域、细胞内组分或共刺激结构域中的一个或多个包含连接氨基酸。“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”是指蛋白的两个相邻结构域、基序、区、模块或片段之间的一个或多个(例如，约2-20个)氨基酸残基，例如在结合结构域和相邻接头之间，在跨膜结构域和相邻细胞外或细胞内结构域之间，或在连接两个结构域、基序、区、模块或片段的连接子的一端或两端(例如，在连接子和相邻结合结构域之间，或在连接子和相邻铰链之间)。连接氨基酸可以由融合蛋白的构建体设计产生(例如，在构建编码融合蛋白的多核苷酸期间，由于使用限制酶位点或自切割肽序列而产生的氨基酸残基)。例如，融合蛋白的跨膜结构域可在氨基末端、羧基末端或两者具有一个或多个连接氨基酸。
蛋白质标签是固定在目标蛋白质上或在基因上融合到目标蛋白质或成为目标蛋白质一部分的独特肽序列，可以被例如异源或非内源同源结合分子或底物(例如，受体、配体、抗体、碳水化合物或金属基质)或本公开的融合蛋白识别或结合。蛋白质标签可用于检测、鉴定、分离、追踪、纯化、富集、靶向、或在生物学上或化学上修饰带标签的目标蛋白质，尤其是当带标签的蛋白质是细胞蛋白质或细胞(例如，生物样本，如外周血)的异质群体的一部分。在带标签的细胞表面蛋白中，标签被本公开的同源结合分子或融合蛋白特异性结合的能力(即，与具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的标签肽结合)与细胞表面蛋白(例如，CAR、TCR)所包含的结合结构域特异性结合靶分子的能力不同或附加于此。在某些实施例中，本公开的融合蛋白的蛋白质标签包含Myc标签、His标签、Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、HA标签、Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Sof标签、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标签或其任何组合。在一些实施例中，本公开的融合蛋白可以进一步包含蛋白质标签(在本文中也称为“肽标签”或“标签肽”)，条件是该蛋白质标签不是strep-tag(例如，不包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列)。
在本文描述的任何实施例中，融合蛋白可以是或可以包含CAR或TCR。制备包括CAR在内的融合蛋白的方法描述于，例如，美国专利号6,410,319；美国专利号7,446,191；美国专利公开号2010/065818；美国专利号8,822,647；PCT公开号WO2014/031687；美国专利号7,514,537；Brentjens et al.,2007,Clin.Cancer Res.13:5426,and Walseng et al.,Scientific Reports 7:10713,2017，其技术在此通过引用并入。生产工程改造的TCR的方法描述于例如Bowerman et al.,Mol.Immunol.,46(15):3000(2009)，其技术通过引用并入本文。
在某些实施例中，TCR的抗原结合片段包含单链TCR(scTCR)，其包含TCR Vα和Vβ结构域TCR两者，但仅包含单个TCR恒定结构域(Cα或Cβ)。在某些实施例中，TCR的抗原结合片段或嵌合抗原受体是嵌合的(例如，包含来自超过一个供体或物种的氨基酸残基或基序)、人源化的(例如，包含来自非人生物的残基，被改变或取代以降低在人中的免疫原性的风险)、或人的。
举例来说，用于分离和纯化重组产生的可溶性融合蛋白的方法可包括从合适的宿主细胞/载体系统获得上清液，所述宿主细胞/载体系统将重组的可溶性融合蛋白分泌到培养基中，然后使用可商购的过滤器浓缩培养基。浓缩后，可将浓缩物施加于单一合适的纯化基质或一系列合适的基质，例如亲和基质或离子交换树脂。可以采用一个或多个反相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。当从自然环境中分离免疫原时，也可以使用这些纯化方法。大规模生产本文所述的一种或多种分离的/重组的可溶性融合蛋白的方法包括分批细胞培养，对其进行监测和控制以维持合适的培养条件。可溶性融合蛋白的纯化可以根据本文所述和本领域已知的方法进行，并与国内外监管机构的法律和准则相符。
本文所述的融合蛋白可以根据用于测定宿主细胞(例如T细胞)活性的许多本领域公认的方法中的任何一种来进行功能表征，包括测定T细胞结合、活化或诱导，还包括测定抗原特异性的T细胞应答。实例包括确定T细胞增殖、T细胞细胞因子释放、抗原特异性T细胞刺激、MHC限制性T细胞刺激、CTL活性(例如，通过检测从预载靶细胞释放的51Cr或铕释放)、T细胞表型标志物表达以及T细胞功能的其他度量。可以在Lefkovits(Immunology MethodsManual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques,1998)找到进行这些和类似测定的程序。另见Current Protocols in Immunology；Weir,Handbook of ExperimentalImmunology,Blackwell Scientific,Boston,MA(1986)；Mishell and Shigii(eds.)Selected Methods in Cellular Immunology,Freeman Publishing,San Francisco,CA(1979)；Green and Reed,Science 281:1309(1998)及其中引用的参考文献。
可以根据本文所述和本领域中实践的方法确定细胞因子的水平，包括例如ELISA、ELISPOT、细胞内细胞因子染色和流式细胞术及其组合(例如，细胞内细胞因子染色和流式细胞术)。可以通过分离淋巴细胞，例如外周血细胞样本中的循环淋巴细胞或淋巴结细胞中的细胞，用抗原刺激细胞，并测量细胞因子产生、细胞增殖和/或细胞生存力，例如通过掺入氚化的胸苷或非放射性测定，例如MTT测定等，来确定由抗原特异性引发或免疫应答刺激引起的免疫细胞增殖和克隆扩增。可以例如通过确定Th1细胞因子(例如IFN-γ、IL-12、IL-2和TNF-β)和2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13)的水平来检查本文所述的免疫原对Th1免疫应答和Th2免疫应答之间的平衡的作用。
多核苷酸、载体和宿主细胞
在某些方面，提供了编码如本文所述的融合蛋白中的任何一种或多种的核酸分子，该多核苷酸在本文中可以称为“编码抗标签的多核苷酸”，并且所编码的融合蛋白在本文中可以称为“抗标签融合蛋白。可以将编码本公开的所需融合蛋白的多核苷酸插入合适的载体(例如，病毒载体或非病毒质粒载体)中，以引入目标宿主细胞(例如，免疫细胞，如T细胞)中。
在某些实施例中，标志物可用于鉴定、监测或分离用编码本文提供的融合蛋白的异源多核苷酸转导的宿主细胞。在某些实施例中，编码抗标签的多核苷酸还包含编码标志物的多核苷酸。在进一步的实施例中，编码标志物的多核苷酸位于编码融合蛋白的多核苷酸的3'，或位于编码融合蛋白的多核苷酸的5'。
示例性标志物包括绿色荧光蛋白、人CD2的胞外域、截短的人EGFR(huEGFRt，(参见Wang et al.,Blood 118:1255,2011)、截短的人CD19(huCD19t)；截短的人CD34(huCD34t)；或截短的人NGFR(huNGFRt)。在某些实施例中，编码的标志物包括EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。在上述任何实施例中，标志物可以包含肽标签，但是应当理解，抗标签融合蛋白通常不包含具有与融合蛋白结合的标签相同的氨基酸序列的肽标签。例如，优选的是，与包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的标签结合的抗标签融合蛋白(或表达其的宿主细胞)自身不包含(或者，在宿主细胞自身不表达)具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的肽。
在本文所述的任何实施例中，编码抗标签融合蛋白的多核苷酸可进一步包含编码标志物的多核苷酸和编码自切割多肽的多核苷酸，其中编码自切割多肽的多核苷酸位于编码融合蛋白的多核苷酸和编码标志物的多核苷酸之间。当宿主细胞表达编码抗标签的多核苷酸、编码标志物的多核苷酸和自切割多肽时，融合蛋白和标志物将作为单独的分子存在于宿主细胞表面。在某些实施例中，自切割的多肽包含来自猪捷申病毒1型的2A肽(P2A；SEQID NO：40或41)，明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasigna virus)(T2A；SEQ ID NO：42或43)，马鼻炎病毒A(E2A；SEQ ID NO：44或45)，或口蹄疫病毒(F2A))。进一步的2A的示例性核酸和氨基酸序列在以下阐明：例如Kim et al.(PLOS One 6:e18556,2011,其2A核酸和氨基酸序列全部内容通过引用并入本文)。
在某些实施例中，本公开的编码抗标签的多核苷酸包含编码VH的多核苷酸，该编码VH的多核苷酸包含SEQ ID NO：1；7；或13中任一项所示的核苷酸序列或由其组成；进一步包括编码VL的多核苷酸，该编码VL的多核苷酸包含SEQ ID NO：4；9；或15中任一项所示的核苷酸序列或由其组成。
代表性的带标签的嵌合效应子分子，例如含有一种或多种标签肽的CAR，在PCT公开号WO 2015/095895中描述，其标签和带标签的效应分子通过引用并入本文。
在另一方面，本公开提供了抗标签融合蛋白或在其细胞表面上表达抗标签融合蛋白的细胞，用于检测或监测表达带标签的细胞表面蛋白(例如带标签的嵌合抗原受体(CAR)、带标签的T细胞受体(TCR)或带标签的标志物)的宿主细胞。例如，待检测或监测的宿主细胞可以表达异源的非带标签的CAR或非带标签的TCR，并且还表达带标签的标志物。在某些实施例中，编码带标签的标志物的多核苷酸包括编码包含strep-tag肽的标志物的多核苷酸，该strep-tag肽可以包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成。在某些实施例中，待检测或监测的免疫细胞可包含嵌合多核苷酸，其中所述嵌合多核苷酸包含编码异源细胞表面受体(例如CAR或TCR)的第一多核苷酸，编码带标签的标志物的第二多核苷酸，该带标签的标志物包含编码包含标签肽的标志物的多核苷酸，其中编码的标签肽包含strep-tag肽(例如，包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的肽)，以及编码自切割多肽的第三多核苷酸，该自切割多肽位于编码细胞表面受体的第一多核苷酸和编码带标签的标志物的第二多核苷酸之间。
图17C提供了示例性的编码抗标签融合蛋白的多核苷酸的示意图。
图17A提供了示例性多核苷酸的示意图，该多核苷酸编码对靶抗原(CD19)具有特异性的带标签的(strep-tag)细胞表面受体(CAR)。
图17B提供了编码对靶抗原(CD19)具有特异性的细胞表面受体(CAR)的示例性多核苷酸和编码带标签的(strep-tag)标志物(tEGFR)的多核苷酸的示意图。
在某些实施例中，嵌合多核苷酸包含编码细胞表面受体的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸包含(a)第一细胞外组分，所述第一细胞外组分包含与靶抗原特异性结合的结合结构域，(b)细胞内组分，其包含效应子结构域或其功能性部分，和(c)连接细胞外组分和细胞内组分的跨膜组分，和编码带标签的标志物的第二个多核苷酸，包含编码包含标签肽的标志物的多核苷酸，其中编码的标签肽包括strep-tag肽，在某些实施例中，其可以包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成。在进一步的实施例中，由嵌合多核苷酸编码的细胞表面受体是或包含CAR或TCR，该CAR或TCR与靶抗原(例如癌症抗原，如CD19、CD20、CD22、ROR1、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、GD2、GD3、HPV E6、HPV E7、Her2、L1-CAM、LewisA、Lewis Y、MUC1、MUC16、PSCA、PSMA、CD56、CD23、CD24、CD30、CD33、CD37、CD44v7/8、CD38、CD56、CD123、CA125、c-MET、FcRH5、WT1、叶酸受体α、VEGF-α、VEGFR1、VEGFR2、IL-13Rα2、IL-11Rα、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、SSX-2、PRAME、HA-1、PSA、ephrin A2、ephrin B2、anNKG2D、NY-ESO-1、TAG-72、间皮素、NY-ESO、5T4、BCMA、FAP、碳酸酐酶9、ERBB2、BRAFV600E、或CEA抗原)特异性结合。
在本文描述的任何实施例中，由本公开的嵌合多核苷酸编码的自切割多肽编码P2A、T2A、E2A或F2A。
在某些实施例中，编码的带标签的标志物包括EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。编码的带标签的标志物可以在标志物内的任何位置包含标志物，条件是当带标签的标志物在宿主细胞表面表达时，构建体的标签肽部分可以被本公开的融合蛋白特异性结合。在特定的实施例中，编码标签的多核苷酸位于编码标志物的多核苷酸的3'，或编码标签的多核苷酸位于编码标志物的多核苷酸的5'。在其他实施例中，编码标签的多核苷酸位于编码标志物的多核苷酸内。
在特定实施例中，嵌合多核苷酸包含以下结构的5'-端至3'-端的结构：(a)(编码细胞表面受体的第一多核苷酸)-(编码自切割多肽的第三多核苷酸)-(编码带标签的标志物的第二多核苷酸)；或(b)(编码带标签的标志物的第二多核苷酸)-(编码自切割多肽的第三多核苷酸)-(编码细胞表面受体的第一多核苷酸)。
在本文描述的任何实施例中，可以针对包含多核苷酸的宿主细胞对本公开的多核苷酸(即，编码抗标签融合蛋白的多核苷酸或编码细胞表面蛋白和带标签的标志物的多核苷酸)进行密码子优化(参见，例如，Scholten et al.,Clin.Immunol.119:135-145(2006))。
在进一步的方面，提供了表达构建体，其中所述表达构建体包含可操作地连接至表达控制序列(例如启动子)的本公开的多核苷酸(例如，编码抗标签融合蛋白的多核苷酸或编码细胞表面蛋白和带标签的标志物的多核苷酸)。在某些实施例中，表达构建体包含在载体中。示例性载体可包含多核苷酸，该多核苷酸能够转运与其连接的另一多核苷酸或能够在宿主生物中复制。载体的一些实例包括质粒、病毒载体、粘粒和其他。一些载体可能能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)，而其他载体可以整合到宿主细胞的基因组中，或在引入宿主细胞后促进多核苷酸插入物的整合，从而与宿主基因组一起复制(例如，慢病毒载体、逆转录病毒载体)。另外，一些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达(这些载体可以称为“表达载体”)。根据相关实施例，还应理解，如果将一种或多种试剂(例如，如本文所述的编码融合蛋白的多核苷酸)共同施用给受试者，则每种试剂可存在于分开的或相同的载体中，以及多种载体(各自包含不同的试剂或相同的试剂)可以被引入细胞或细胞群体或被施用于受试者。
在某些实施例中，本公开的多核苷酸可以可操作地连接至载体的某些元件。例如，可以有效地连接实现它们所连接的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列。表达控制序列可包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及可能增强蛋白质分泌的序列。表达控制序列可被有效连接，如果它们与目的基因和以反式或远距离作用来控制目的基因的表达控制序列邻接。
在某些实施例中，载体包括质粒载体或病毒载体(例如选自慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体的载体)。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒(如正粘病毒(例如流感病毒))、弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台)、正链RNA病毒(如小核糖核酸病毒和甲病毒)以及双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘、鸡痘和金丝雀痘))。其他病毒包括例如诺瓦克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的例子包括禽白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,ThirdEdition,B.N.Fields et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。
“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒，其使用逆转录酶被逆转录成DNA，然后将逆转录的DNA掺入宿主细胞基因组中。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的属。γ逆转录病毒的例子包括小鼠干细胞病毒、小鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮组织增殖病病毒。
如本文所用，“慢病毒载体”是指用于基因递送的基于HIV的慢病毒载体，其可以是整合的或非整合的，具有相对大的包装能力，并且可以转导多种不同的细胞类型。慢病毒载体通常是在三个(包装、包膜和转移)或更多质粒瞬时转染到生产细胞后产生的。像HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面受体的相互作用进入靶细胞。进入时，病毒RNA经历逆转录，该逆转录由病毒逆转录酶复合体介导。、逆转录的产物是双链线性病毒DNA，其是病毒整合到感染细胞DNA中的底物。
在某些实施例中，病毒载体可以是γ逆转录病毒，例如莫洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)衍生的载体。在其他实施例中，病毒载体可以是更复杂的逆转录病毒衍生的载体，例如慢病毒衍生的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。其他实例包括衍生自HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和Maedi-Visna病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒的病毒载体和包装细胞以含有CAR转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的，并且先前已经描述于例如美国专利8,119,772；Walchli et al.,PLoS One6:327930,2011；Zhao et al.,J.Immunol.174:4415,2005；Engels et al.,Hum.GeneTher.14:1155,2003；Frecha et al.,Mol.Ther.18:1748,2010；and Verhoeyen et al.,Methods Mol.Biol.506:97,2009。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也是可商购的。其他病毒载体也可用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(AAV)的载体；衍生自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体，复制缺陷型HSV和减毒的HSV(Krisky et al.,Gene Ther.5:1517,1998)。
最近开发的用于基因治疗用途的其他载体也可以与本公开的组合物和方法一起使用。这样的载体包括衍生自杆状病毒和α-病毒的那些。(Jolly,D J.1999.EmergingViral Vectors.pp 209-40 in Friedmann T.ed.The Development of Human GeneTherapy.New York:Cold Spring Harbor Lab)或质粒载体(例如sleeping beauty或其他转座子载体)。
当病毒载体基因组包含要在宿主细胞中作为单独的转录物表达的多个多核苷酸时，病毒载体还可以在两个(或更多个)转录物之间包含允许双顺反子或多顺反子表达的附加序列。在病毒载体中使用的此类序列的实例包括内部核糖体进入位点(IRES)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2A肽或其任何组合。
可通过使用本领域已知的任何合适的分子生物学工程技术来完成用于基因工程和产生目的融合蛋白的表达载体的构建。为了获得有效的转录和翻译，每个重组表达构建体中的多核苷酸包括至少一个合适的表达控制序列(也称为调节序列)，例如前导序列，特别是可操作地(即，有效地)连接至编码免疫原的核苷酸序列的启动子。
在某些实施例中，本公开的多核苷酸用于转染/转导宿主细胞(例如T细胞)以用于过继转移疗法(例如靶向癌症抗原或靶向表达标签肽的过继转移细胞)。已经描述了用所需核酸转染/转导T细胞的方法(例如，美国专利申请公开号US2004/0087025)，使用具有所需靶标特异性的T细胞的过继转移程序(例如，Schmitt et al.,Hum.Gen.20:1240,2009；Dossett et al.,Mol.Ther.17:742,2009；Till et al.,Blood 112:2261,2008；Wang etal.,Hum.Gene Ther.18:712,2007；Kuball et al.,Blood 109:2331,2007；US 2011/0243972；US 2011/0189141；Leen et al.,Ann.Rev.Immunol.25:243,2007)，从而基于本文的教导，包括针对本公开的融合蛋白的那些，设想了将这些方法适应本公开的实施例。因此，在另一方面，提供了宿主细胞，其包含本公开的多核苷酸并表达编码的融合蛋白或表达编码的细胞表面受体和带标签的标志物。在某些实施例中，宿主细胞包含：(a)本公开的编码融合蛋白的多核苷酸或编码融合蛋白的表达构建体，其中宿主细胞表达编码的融合蛋白；或(b)本公开的嵌合多核苷酸或嵌合多核苷酸表达构建体，其中宿主细胞表达编码的细胞表面受体和编码的带标签的标志物。
在某些实施例中，宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。如本文所指，“造血祖细胞”是可以衍生自造血干细胞或胎儿组织并且能够进一步分化成成熟细胞类型(例如，免疫系统细胞)的细胞。示例性的造血祖细胞包括具有CD24Lo Lin–CD117+表型的那些或在胸腺中发现的那些(称为胸腺祖细胞)。
如本文所用，“免疫系统细胞”是指源自骨髓中造血干细胞的免疫系统的任何细胞，其产生两个主要谱系，即髓系祖细胞(其产生诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨核细胞和粒细胞的髓系细胞)和淋巴样祖细胞(其产生诸如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)和NK-T细胞的淋巴样细胞)。示例性免疫系统细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、干细胞记忆T细胞、天然杀伤细胞(例如，NK细胞或NK-T细胞)、B细胞和树突状细胞。巨噬细胞和树突状细胞可以称为“抗原呈递细胞”或“APC”，，当与肽复合的APC表面上的主要组织相容性复合体(MHC)受体与T细胞表面的TCR相互作用时，它们是专门可以活化T细胞的细胞。
“T细胞”或“T淋巴细胞”是在胸腺中成熟并产生T细胞受体(TCR)的免疫系统细胞。T细胞可以是幼稚的(不暴露于抗原；与TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表达增加，而CD45RO的表达减少)、记忆T细胞(TM)(经历过抗原且-存活时间长)和效应细胞(经历过抗原，细胞毒性)。TM可以进一步分为中央记忆T细胞(TCM，与原始T细胞相比，CD62L、CCR7、CD28、CD 127、CD45RO和CD95的表达增加，以及CD54RA的表达减少)和效应记忆T细胞(TEM，与幼稚T细胞或TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD45RA的表达减少，以及CD127的表达增加)。
效应T细胞(TE)是指经历过抗原的CD8+细胞毒性T淋巴细胞，与TCM相比，CD62L、CCR7、CD28表达降低且对粒酶和穿孔素呈阳性。辅助T细胞(TH)是CD4+细胞，通过释放细胞因子来影响其他免疫细胞的活性。CD4+T细胞可以激活和抑制适应性免疫反应，而这两种功能中的哪一种被诱导将取决于其他细胞和信号的存在。可以使用已知技术收集T细胞，并且可以通过已知技术(例如通过与抗体的亲和结合、流式细胞术或免疫磁选择)来富集或耗竭各种亚群或其组合。其他示例性T细胞包括调节性T细胞，例如CD4+CD25+(Foxp3+)调节性T细胞和Treg17细胞，以及Tr1、Th3、CD8+CD28-和Qa-1限制性T细胞。
“T细胞系的细胞”是指显示T细胞的至少一种表型特征的细胞、或其前体或祖细胞，所述其前体或祖细胞将所述细胞与其他淋巴样细胞以及红系或髓系细胞区分开。这种表型特征可以包括对T细胞特异的一种或多种蛋白质(例如，CD3+、CD4+、CD8+)或对T细胞特异的生理、形态、功能或免疫学特征的表达。例如，T细胞系的细胞可以是定型为T细胞谱系的祖细胞或前体细胞；CD25+未成熟和灭活的T细胞；已经历CD4或CD8谱系定型的细胞；CD4+CD8+双阳性的胸腺祖细胞；单阳性CD4+或CD8+；TCRαβ或TCRγδ；或成熟的功能性或活化的T细胞。
在某些实施例中，免疫系统细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、天然杀伤细胞(例如，K细胞或NK-T细胞)、树突状细胞、B细胞或其任何组合。在某些实施例中，免疫系统细胞是CD4+T细胞。在某些实施例中，T细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞记忆T细胞或其任何组合。
宿主细胞可以包括可以接受载体或掺入核酸或表达蛋白质的任何单个细胞或细胞培养物。该术语还涵盖宿主细胞的后代，无论在遗传上还是在表型上相同或不同。合适的宿主细胞可以取决于载体，并且可以包括哺乳动物细胞、动物细胞、人细胞、猿猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。可以通过使用病毒载体、通过磷酸钙沉淀来转化、DEAE-葡聚糖，电穿孔、显微注射或其他方法诱导这些细胞来掺入载体或其他材料。参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2d ed.(Cold SpringHarbor Laboratory,1989)。
在任何前述实施例中，包含编码抗标签融合蛋白的异源多核苷酸的宿主细胞是免疫细胞，其被修饰以减少或消除编码多肽产物的一个或多个内源基因的表达，所述多肽产物选自PD-1，LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、HLA分子、TCR分子或其任何组分或组合。
不希望受到理论的束缚，某些内源表达的免疫细胞蛋白可能下调修饰的免疫宿主细胞(例如，PD-1、LAG-3、CTLA4、TIGIT)的免疫活性，或可能与用于由宿主细胞表达的本公开的异源抗标签融合蛋白竞争，或可能干扰本公开的异源表达的结合蛋白的结合活性并干扰免疫宿主细胞与表达标签的靶细胞或融合蛋白的结合(例如，包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的标签肽，或其任何组合。此外，同种异体受体可将供体免疫细胞上表达的供体免疫细胞上表达的内源蛋白(例如，免疫宿主细胞蛋白，例如HLA)识别为外源蛋白，这可能导致同种异体受体消除或抑制供体免疫细胞。
因此，减少或消除这种内源基因或蛋白质的表达或活性可以改善宿主细胞在自体或同种异体宿主环境中的活性、耐受性和持久性，并且允许普遍施用细胞(例如，施用到任何受体，无论HLA类型如何)。在某些实施例中，修饰的宿主免疫细胞是供体细胞(例如同种异体细胞)或自体细胞。在某些实施例中，本公开的修饰的免疫宿主细胞包含编码PD-1、LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、HLA组分(例如，编码α1巨球蛋白、α2巨球蛋白、α3巨球蛋白、β1微球蛋白或β2微球蛋白的基因)或TCR组分(例如，编码TCR可变区或TCR恒定区的基因)(参见，例如，Torikai et al.,Nature Sci.Rep.6:21757(2016)；Torikai et al.,Blood 119(24):5697(2012)；和Torikai et al.,Blood 122(8):1341(2013)，其基因编辑技术、组合物和过继细胞疗法的全部内容通过引用并入本文)的一个或多个基因的染色体基因敲除。如本文所用，术语“染色体基因敲除”是指宿主细胞中的基因改变，其阻止宿主细胞产生功能活性内源多肽产物。导致染色体基因敲除的改变可以包括，例如，引入的无义突变(包括过早终止密码子的形成)、错义突变、基因缺失和链断裂、以及抑制内源性基因在宿主细胞中的表达的抑制性核酸分子的异源表达。
在某些实施例中，染色体基因敲除或基因敲入是通过宿主细胞的染色体编辑来进行的。可以使用例如核酸内切酶进行染色体编辑。如本文所用，“核酸内切酶”是指能够催化多核苷酸链内的磷酸二酯键裂解的酶。在某些实施例中，核酸内切酶能够切割靶基因，从而使靶基因失活或“敲除”。核酸内切酶可以是天然存在的、重组的、基因修饰的或融合的核酸内切酶。核酸内切酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的不同机制修复。在同源重组期间，供体核酸分子可用于供体基因“敲入”，用于靶基因“敲除”，并任选地通过供体基因敲入或靶基因敲除事件使靶基因失活。NHEJ是容易出错的修复过程，其通常导致切割位点的DNA序列改变，例如，至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。NHEJ可用于“敲除”靶基因。核酸内切酶的实例包括锌指核酸酶、TALE核酸酶、CRISPR-Cas核酸酶、大范围核酸酶和megaTAL。
如本文所用，“锌指核酸酶”(ZFN)是指包含与非特异性DNA切割结构域融合的锌指DNA结合结构域的融合蛋白，例如Fok1核酸内切酶。每个约30个氨基酸的锌指基序与约3个碱基对的DNA结合，某些残基上的氨基酸可以变化以改变三联体序列特异性(参见，例如Desjarlais et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.90:2256-2260,1993；Wolfe et al.,J.Mol.Biol.285:1917-1934,1999)。多个锌指基序可以串联连接以产生对所需DNA序列的结合特异性，例如长度范围为约9至约18个碱基对的区域。作为背景，ZFN通过催化基因组中位点特异性DNA双链断裂(DSB)的形成来介导基因组编辑，并且通过同源性定向修复促进包含与DSB位点的基因组同源的侧翼序列的转基因的靶向整合。或者，由ZFN产生的DSB可以通过非同源末端连接(HEJ)的修复导致靶基因的敲除，这是一个容易出错的细胞修复途径，会导致核苷酸在切割位点处插入或缺失。在某些实施例中，基因敲除包含使用ZFN分子进行的插入、缺失、突变或其组合。
如本文所用，“转录激活子样效应因子核酸酶”(TALEN)是指包含TALE DNA结合结构域和DNA切割结构域的融合蛋白，例如Fok1核酸内切酶。“TALE DNA结合结构域”或“TALE”由一个或多个TALE重复结构域/单元组成，每个通常具有高度保守的33-35个氨基酸序列以及不同的第12和第13个氨基酸。TALE重复结构域参与TALE与靶DNA序列的结合。不同的氨基酸残基，称为重复可变残基(RVD)，与特异性核苷酸识别相关。确定了这些TALE的DNA识别的天然(经典)代码，使得TALE的12和13位的HD(组氨酸-天冬氨酸)序列导致TALE与胞嘧啶(C)结合、NG(天冬酰胺-甘氨酸)与T核苷酸结合、NI(天冬酰胺-异亮氨酸)与A结合、NN(天冬酰胺-天冬酰胺)与G或A核苷酸结合、以及NG(天冬酰胺-甘氨酸)与T核苷酸结合。非经典(非典型)RVD也是已知的(参见，例如，美国专利公开号US2011/0301073，该非典型RVD通过引用整体并入本文)。TALEN可用于指导T细胞基因组中的位点特异性双链断裂(DSB)。非同源末端连接(NHEJ)连接双链断裂两侧的DNA，在双链断裂中几乎没有或没有序列重叠以进行退火，从而引入敲除基因表达的错误。或者，同源性指导的修复可以在DSB的位点引入转基因，条件是转基因中存在同源的侧翼序列。在某些实施例中，基因敲除包含插入、缺失、突变或其组合，并使用TALEN分子制备。
如本文所用，“成簇的规则间隔的短回文重复/Cas”(CRISPR/Cas)核酸酶系统是指采用CRISPR RNA(crRNA)指导的Cas核酸酶通过碱基配对互补来识别基因组内靶位点的系统(称为原间隔序列)，然后切割DNA(如果一个短的、保守的原间隔序列相关基序(PAM)紧跟在互补靶序列的3'之后)。根据Cas核酸酶的序列和结构，将CRISPR/Cas系统分为三种类型(即I型、I型和III型)。I型和III型的crRNA指导的监视复合体需要多个Cas亚基。研究最多的II型系统至少包含三个组分：RNA指导的Cas9核酸酶、crRNA和反式作用crRNA(tracrRNA)。tracrRNA包含双链体形成区。crRNA和tracrRNA形成双链体，能够与Cas9核酸酶相互作用并指导Cas9/crRNA：tracrRNA通过crRNA上的间隔子与PAM上游的目标DNA上的原间隔序列之间的沃森-克里克碱基配对，与目标DNA上的特定位点复合。Cas9核酸酶在crRNA间隔子限定的区域内切割双链断裂。NHEJ修复导致插入和/或缺失，从而破坏了目标基因座的表达。或者，可以通过同源性指导的修复将具有同源侧翼序列的转基因引入DSB的位点。可以将crRNA和tracrRNA工程改造成单个指导RNA(sgRNA或gRNA)(参见，例如，Jineket al.,Science 337:816-21,2012)。此外，可以改变或编程与靶位点互补的指导RNA的区域以靶向所需序列(Xie et al.,PLOS One 9:e100448,2014；美国专利申请公开号US2014/0068797，美国专利申请公开号US 2014/0186843；美国专利号8,697,359，和PCT公开号WO 2015/071474；每个都通过引用并入)。在某些实施例中，基因敲除包括插入、缺失、突变或其组合，并使用CRISPR/Cas核酸酶系统制备。
示例性的gRNA序列和使用该gRNA序列敲除编码免疫细胞蛋白的内源基因的方法包括Ren et al.,Clin.Cancer Res.23(9):2255-2266(2017)中描述的那些，其gRNA、CAS9DNA、载体和基因敲除技术的全部内容在此通过引用并入。
如本文所用，“大范围核酸酶”，也称为“归巢内切核酸酶”，是指特征在于大识别位点(约12至约40个碱基对的双链DNA序列)的内切脱氧核糖核酸酶。根据序列和结构基序，大范围核酸酶可分为五个家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys box和PD-(D/E)XK。示例性的大范围核酸酶包括I-SceI、I-Ceul、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-Csml、I-Panl、I-SceII、I-Ppol、I-SceIII、I-Crel、I-TevI、I-TevII和I-TevIII，其识别序列是已知的(参见，例如，美国专利号5,420,032和6,833,252；Belfort et al.,Nucleic Acids Res.25:3379-3388,1997；Dujon et al.,Gene 82:115-118,1989；Perler et al.,Nucleic Acids Res.22:1125-1127,1994；Jasin,Trends Genet.12:224-228,1996；Gimble et al.,J.Mol.Biol.263:163-180,1996；Argast et al.,J.Mol.Biol.280:345-353,1998)。
在某些实施例中，天然存在的大范围核酸酶可用于促进选自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA4、TIGIT、HLA编码基因或TCR组分编码基因的靶标的位点特异性基因组修饰。在其他实施例中，将对靶基因具有新结合特异性的工程改造的大范围核酸酶用于位点特异性基因组修饰(参见，例如Porteus et al.,Nat.Biotechnol.23:967-73,2005；Sussman et al.,J.Mol.Biol.342:31-41,2004；Epinat et al.,Nucleic Acids Res.31:2952-62,2003；Chevalier et al.,Molec.Cell 10:895-905,2002；Ashworth et al.,Nature 441:656-659,2006；Paques et al.,Curr.Gene Ther.7:49-66,2007；美国专利公开号US 2007/0117128；US 2006/0206949；US 2006/0153826；US 2006/0078552；和US 2004/0002092)。在进一步的实施例中，使用归巢内切核酸酶产生染色体基因敲除，被TALEN的模块化DNA结合结构域修饰以制备称为megaTAL的融合蛋白。MegaTAL不仅可用于敲除一个或多个靶基因，还可用于当与编码目的多肽的外源供体模板结合使用时引入(敲入)异源或外源多肽。
在某些实施例中，染色体基因敲除包含被引入宿主细胞(例如，免疫细胞)的抑制性核酸分子，该宿主细胞包含编码与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原特异性受体的异源多核苷酸，其中抑制性核酸分子编码靶标特异性抑制剂，并且其中编码的靶标特异性抑制剂抑制内源基因在宿主免疫细胞中的表达(即PD-1、TIM3、LAG3、CTLA4、TIGIT、HLA组分或TCR组分或其任何组合的表达)。
使用敲除程序或试剂后，可以通过宿主免疫细胞的DNA测序直接确认染色体基因敲除。染色体基因敲除也可以从敲除后不存在基因表达(例如，不存在由该基因编码的mRNA或多肽产物)来推断。
在其他方面，提供了试剂盒，其包含(a)本文所述的载体或表达构建体和(b)用于将载体或表达构建体转导至宿主细胞中的试剂。
用途
本公开还提供了调节(例如消融、刺激或活化)本文所述的修饰的细胞(例如靶向标签肽的CAR T细胞或用标签肽标志物的CAR T细胞)的方法。在某些实施例中，提供了用于靶向消融带标签的细胞的方法，其中所述方法包括向受试者施用经修饰以在其细胞表面表达本公开的抗标签融合蛋白的免疫细胞，其中所述受试者先前已被施用表达包含标签肽的细胞表面蛋白的细胞(该细胞在本文中可以称为“带标签的细胞”)，标签肽是strep-tag肽(例如，包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的肽)，从而诱导靶向免疫反应，消除带标签的细胞。
当先前施用的带标签的细胞(例如，用于免疫疗法治疗疾病如癌症，包括例如B细胞癌)具有不期望的活性(例如，在受试者中引发脱靶细胞或组织的免疫应答)或活性水平(例如，引发不合适的高强度、持续时间或两者的免疫反应，例如细胞因子释放综合征(CRS)事件)时，这样的消融方法可能是有用的。在某些实施例中，将表达抗标签融合蛋白的修饰的免疫细胞施用于具有与带标签的细胞的存在相关的至少一种不良事件的受试者。
在某些实施例中，带标签的细胞表面蛋白包含CAR、TCR或标志物。在某些实施例中，标志物包括EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。在某些实施例中，标签肽包含在标志物中。
在任何上述实施例中，表达抗标签融合蛋白的修饰的免疫细胞选自T细胞、NK细胞或NK-T细胞。在特定的实施例中，免疫细胞是T细胞。
在某些实施例中，预先将带标签的细胞作为免疫疗法、植入物或移植物施用于受试者。在特定的实施例中，表达抗标签融合蛋白的带标签的细胞或修饰的免疫细胞对受试者是同种异体的、自体的或同基因的。在进一步的实施例中，在包含带标签的细胞的免疫疗法、植入物或移植物之后，受试者患有或被怀疑患有移植物抗宿主病(GVHD)或宿主抗移植物疾病(HvGD)。在某些实施例中，施用带标签的细胞以治疗过度增殖疾病。如本文所用，“过度增殖疾病”是指与正常或未患病的细胞相比过度生长或增殖。示例性的过度增殖疾病包括肿瘤、癌症、赘生物组织、癌、肉瘤、恶性细胞、恶性前细胞以及非肿瘤性或非恶性过度增殖疾病(例如，腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、血管瘤、纤维化、再狭窄以及自身免疫疾病，如类风湿性关节炎，骨关节炎、牛皮癣、炎性肠病等)。
此外，“癌症”可以指细胞的任何加速增殖，包括实体瘤、腹水瘤、血液或淋巴瘤或其他恶性肿瘤；结缔组织恶性肿瘤；转移性疾病；器官或干细胞移植后微小残留病；多药耐药性癌症、原发性或继发性恶性肿瘤、与恶性肿瘤相关的血管生成或其他形式的癌症。
当受试者证实与带标签的细胞相关的一种或多种不良作用时，可以确定带标签的细胞(即带标签的免疫疗法的或带标签的非免疫疗法细胞)的消融是必要的。例如，发炎、发烧、肺或脑水肿、血压或心率变化、健康细胞(例如白血球)的数量不合期望地低、带标签的细胞的数量不合期望地高、细胞因子水平升高、皮疹、水泡、黄疸、腹泻、呕吐、腹部绞痛、疲劳、疼痛、僵硬，呼吸急促、体重减轻、眼睛干涩或视力改变、口干、阴道干燥和肌肉无力可能是带标签的细胞需要消融的指标。
在用修饰的免疫细胞处理后，可以直接或间接地确定表达抗标签融合蛋白的修饰的免疫细胞引起带标签的细胞消融的能力。在某些实施例中，所述方法还包括在向所述受试者施用修饰的免疫细胞之后，检测以下的存在和/或测量其量：(i)在受试者中或从受试者获得的样本中剩余的带标签的细胞；(ii)在受试者中或从受试者获得的样本中存在的修饰的免疫细胞；(iii)受试者中的一种或多种细胞因子；或(iv)其任何组合。在特定的实施例中，所述方法进一步包括检测细胞的存在和/或监测细胞的数量，所述细胞在施用带标签的细胞后减少(例如，在施用带标签的抗CD19 CAR T细胞后，表达CD19的健康B细胞减少)。
可以通过本发明治疗的受试者通常是人和其他灵长类受试者，例如用于兽医学目的的猴子和猿。在任何上述实施例中，受试者可以是人受试者。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。如医学领域的技术人员所确定的，可以以适合于待治疗的疾病、病症或失调的方式施用根据本公开的细胞。在任何上述实施例中，将包含本文所述的融合蛋白的细胞通过静脉内、腹膜内、肿瘤内施用至骨髓、淋巴结或脑脊髓液中，以便遇到要消融的带标签的细胞。组合物的合适剂量、合适持续时间和施用频率将由诸如以下因素来确定：患者的状况；疾病、病症或失调的大小、类型和严重性；带标签的细胞的不合期望的类型、水平或活性，活性成分的特定形式；和施用方法。
在任何上述实施例中，本公开的方法包括施用表达本公开的融合蛋白的宿主细胞。组合物中的细胞量是至少一个细胞(例如，一个融合蛋白修饰的CD8+T细胞亚群；一个融合蛋白修饰的CD4+T细胞亚群)或更通常大于102个细胞，例如最多106个细胞、最多107个细胞、最多108个细胞、最多109个细胞或超过1010个细胞。在某些实施例中，以约106至约1010个细胞/m2的范围，优选约105至约109个细胞/m2的范围施用细胞。细胞的数量将取决于组合物预期的最终用途以及其中所包含的细胞类型。例如，经修饰以包含对特定抗原具有特异性的融合蛋白的细胞将包含含有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多个这样的细胞的细胞群。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为1升以下、500毫升以下、250毫升以下、或100毫升以下。在实施例中，所需细胞的密度通常大于104个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。可以在一段时间内以单次输注或多次输注的形式施用细胞。临床相关数目的免疫细胞可以分配为多次输注，其累积等于或超过106、107、108、109、1010、或011个细胞。
本文还提供了单位剂量，其包含本公开的宿主细胞(例如，包含本公开的多核苷酸的修饰的免疫细胞)或宿主细胞组合物。在某些实施例中，单位剂量包括(i)包含至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的修饰的CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％的修饰CD8+T细胞的组合物，比例约为1：1，其中单位剂量包含减少量的或基本不包含幼稚T细胞(即，与具有相当数量的PBMC的患者样本相比，小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％、或小于约1％幼稚T细胞群体存在于单位剂量)。
在一些实施例中，单位剂量包括(i)包含至少约50％的修饰的CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约50％的修饰的CD8+T细胞的组合物，比例约为1：1，其中单位剂量包含减少量的或基本不含幼稚T细胞。在进一步的实施例中，单位剂量包括(i)包含至少约60％的修饰的CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约60％的修饰的CD8+T细胞的组合物，比例约为1：1，其中单位剂量包含减少量的或基本不含幼稚T细胞。在又进一步的实施例中，单位剂量包括(i)包含至少约70％的修饰的CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约70％的修饰的CD8+T细胞的组合物，比例约为1：1，其中单位剂量包含减少量的或基本不含幼稚T细胞。在一些实施例中，单位剂量包括(i)包含至少约80％的修饰的CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约80％的修饰的CD8+T细胞的组合物，比例约为1：1，其中单位剂量包含减少量的或基本不含幼稚T细胞。在一些实施例中，单位剂量包括(i)包含至少约85％的修饰的CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约85％的修饰的CD8+T细胞的组合物，比例约为1：1，其中单位剂量包含减少量的或基本不含幼稚T细胞。在一些实施例中，单位剂量包括(i)包含至少约90％的修饰的CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约90％的修饰的CD8+T细胞的组合物，比例约为1：1，其中单位剂量包含减少量的或基本不含幼稚T细胞。
在本文所述的任何实施例中，单位剂量包含相等或近似相等数量的工程改造的CD45RA-CD3+CD8+和工程改造的CD45RA-CD3+CD4+TM细胞。
还设想了药物组合物，其包含本公开的融合蛋白或表达所述融合蛋白的细胞和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。合适的赋形剂包括水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。在实施例中，包含本文公开的融合蛋白或宿主细胞的组合物还包含合适的输注介质。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)、5％葡萄糖水溶液，可以使用林格氏乳酸盐。输注介质可以补充人血清白蛋白或其他人血清成分。
如医学领域技术人员所确定的，可以以适合于待治疗(或预防)的疾病或病症的方式施用药物组合物。组合物的合适剂量、合适的持续时间和施用频率将由诸如以下因素决定：患者的健康状况、患者的大小(即体重、质量或体表面积)、患者病症的类型和严重性、带标签的细胞的不合期望的类型或水平或活性、活性成分的特殊形式、以及施用方法。通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处(例如本文所述，包括改善临床结果，如更通常地完全或部分缓解、或延长无疾病时间和/或总体生存期、或减轻症状严重程度)的量提供组合物。为了预防使用，剂量应足以预防、延迟与疾病或病症相关的疾病的发作或减轻其严重性。根据本文所述的方法施用免疫原性组合物的预防益处可以通过进行临床前(包括体外和体内动物研究)和临床研究，并分析通过适当的统计、生物学和临床方法及技术从中获得的数据来确定，所有这些都可以由本领域技术人员容易地实践。
本文设想的某些治疗或预防方法包括施用包含稳定整合到细胞染色体中的本文所述所需多核苷酸的宿主细胞(可以是自体的、同种异体的或同基因的)。例如，可以使用自体的、同种异体的或同基因的免疫系统细胞(例如，T细胞、抗原呈递细胞、天然杀伤细胞)来离体产生这种细胞组合物，以便向受试者施用所需的表达融合蛋白的T细胞组合物作为过继免疫疗法。在某些实施例中，宿主细胞是造血祖细胞或人免疫细胞。在某些实施例中，免疫系统细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞或其任何组合。在某些实施例中，免疫系统细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合。在特定的实施例中，细胞是CD4+T细胞。在特定的实施例中，细胞是CD8+T细胞。
如本文所用，组合物的施用是指将其递送给受试者，而与递送的途径或方式无关。施用可以连续或间歇地以及肠胃外进行。施用可以用于治疗已经被证实具有公认病症、疾病或失调状态的受试者，或者用于治疗易感或处于发展这种病症、疾病或失调状态的受试者。与辅助疗法的共同施用可包括在给药方案上同时和/或以任何顺序相继递送多种试剂(例如表达融合蛋白的重组(即，工程改造的)宿主细胞和一种或多种细胞因子；免疫抑制疗法，如钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、微管抑制剂、低剂量的霉酚酸前药或其任何组合)。
在某些实施例中，向受试者施用多种剂量的本文所述的重组宿主细胞，其可以在约两周至约四周的施用之间的间隔内施用。
在仍进一步的实施例中，被治疗的受试者进一步接受免疫抑制疗法，例如钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、微管抑制剂、低剂量的霉酚酸前药或其任何组合。在又进一步的实施例中，被治疗的受试者已经接受了非清髓性或清髓造血细胞移植，其中可以在非清髓性造血细胞移植后至少两到至少三个月施用所述治疗，并且其中移植的细胞可以任选地用具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列加标签。
药物组合物的有效量是指在所需剂量和时间段内足以达到所需临床结果或有益治疗的量，如本文所述。有效量可以一次或多次施用方式递送。如果对已知或确认患有疾病或疾病状态的受试者施用，则术语“治疗量”可以用于涉及治疗，而“预防有效量”可以用于描述对易感或有风险患上疾病或疾病状态(例如复发)的受试者施用有效量作为预防过程。
CTL免疫应答的水平可以通过本文所述和本领域常规实践的多种免疫学方法中的任何一种来确定。可以在施用由例如T细胞表达的本文描述的任何一种融合蛋白之前和之后，确定CTL免疫应答的水平。可以使用本领域常规实践的几种技术和方法中的任一种来进行用于确定CTL活性的细胞毒性测定(参见，例如Henkart et al.,"Cytotoxic T-Lymphocytes"in Fundamental Immunology,Paul(ed.)(2003Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA),pages 1127-50，以及其中引用的参考文献)。
抗原特异性T细胞应答通常通过根据本文所述的任何T细胞功能参数(例如，增殖、细胞因子释放、CTL活性、改变的细胞表面标志物表型等)通过观察的T细胞应答的比较来确定，这种比较可以产生在适当情况下暴露于同源抗原(例如，当由免疫相容性抗原呈递细胞呈递时用于引发或激活T细胞的抗原)的T细胞与暴露于结构上不同或无关的对照抗原的同一来源群体的T细胞之间。对同源抗原的应答大于(具有统计学显著性)对表示抗原特异性的对照抗原的应答。
可以从受试者获得生物学样本，用于确定针对本文所述的对带标签的蛋白质或细胞的免疫应答的存在和水平。本文所用的“生物样本”可以是血液样本(可以从中制备血清或血浆)、活检样本、体液(例如肺灌洗液、腹水、粘膜洗涤液、滑液)、骨髓、淋巴结、组织外植体、器官培养物或受试者或生物学来源的任何其他组织或细胞制剂。也可以在接受任何免疫原性组合物之前从受试者获得生物样本，该生物样本可用作建立基线(即免疫前)数据的对照。
本文描述的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿或小瓶。这样的容器可以冷冻以保持制剂的稳定性。在某些实施例中，单位剂量包含本文所述的重组宿主细胞，其剂量为约107个细胞/m2至约1011个细胞/m2。开发用于在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的剂量和治疗方案，包括例如肠胃外或静脉内施用或制剂。
如果主题组合物是肠胃外施用，则该组合物还可包含无菌的水性或油性溶液或悬浮液。合适的无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂包括水、林格氏溶液、等渗盐溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或聚乙二醇与水的混合物。水溶液或悬浮液可进一步包含一种或多种缓冲剂，例如乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或酒石酸钠。当然，用于制备任何剂量单位制剂的任何材料应是药学上纯的，并且在使用量上基本上是无毒的。另外，可以将活性化合物掺入缓释制备物和制剂中。如本文所用，剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合作为待治疗受试者的单位剂量；每个单位可以包含预定量的重组细胞或活性化合物，所述重组细胞或活性化合物经计算可与合适的药物载剂结合产生期望的效果。
通常，合适的剂量和治疗方案以足以提供治疗或预防益处的量提供活性分子或细胞。与未治疗的受试者相比，可以通过在治疗的受试者中建立改善的临床结果(例如，更通常是完全或部分缓解、或延长无病生存期)来监测这种应答。先前对肿瘤蛋白的免疫应答增加通常与改善的临床结果相关。通常可以使用标准的增殖、细胞毒性或细胞因子测定法来评估这种免疫应答，这是本领域常规的，并且可以使用在治疗之前和之后从受试者获得的样本来进行。
在进一步的方面，提供了试剂盒，其包含(a)宿主细胞，(b)组合物，或(c)本文所述的单位剂量。在某些实施例中，试剂盒包含(1)单位剂量的带标签的细胞和(2)表达对strep-tag肽具有特异性的融合蛋白的修饰的免疫细胞，在某些实施例中，strep-tag肽可以包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成。换句话说，试剂盒可同时提供带标签的细胞以用于免疫疗法、植入物或移植物，以及可以靶向带标签的细胞以进行调节(例如消融)的修饰的免疫细胞(有需要的话)。
根据本公开的方法可以进一步包括在联合疗法中施用一种或多种其他药剂来治疗疾病或失调。例如，在某些实施例中，联合疗法包括与(并发、同时或相继)免疫检查点抑制剂一起施用融合蛋白(或表达该蛋白的工程改造的宿主细胞)。在一些实施例中，联合疗法包括将本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程宿主细胞)与刺激性免疫检查点剂的激动剂一起施用。在进一步的实施例中，联合疗法包括将本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与诸如化疗剂、放射疗法、手术、抗体或其任何组合的次级疗法(secondary therapy)一起施用。
如本文所用，术语“免疫抑制剂(immune suppression agent)”或“免疫抑制剂(immunosuppression agent)”是指提供抑制信号以帮助控制或抑制免疫应答的一种或多种细胞、蛋白质、分子、化合物或复合物。例如，免疫抑制剂包括以下分子：部分或完全阻断免疫刺激；减少、预防或延迟免疫激活；或增加、激活或上调免疫抑制。靶向的示例性免疫抑制剂(例如，带有免疫检查点抑制剂)包括PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4、B7-H3、B7-H4、CD244/2B4、HVEM、BTLA、CD160、TIM3、GAL9、KIR、PVR1G(CD112R)、PVRL2、腺苷、A2aR、免疫抑制细胞因子(例如IL-10、IL-4、IL-1RA、IL-35)、IDO、精氨酸酶、VISTA、TIGIT、LAIR1、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、Treg细胞或其任何组合。
免疫抑制剂抑制剂(也称为免疫检查点抑制剂)可以是化合物、抗体、抗体片段或融合多肽(例如Fc融合物，如CTLA4-Fc或LAG3-Fc)、反义分子、核酶或RNAi分子、或低分子量有机分子。在本文公开的任何实施例中，方法可以包括将本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与以下免疫抑制成分中的任一种的一种或多种抑制剂单独地或以任何组合一起施用。
在某些实施例中，融合蛋白与PD-1抑制剂结合使用，例如PD-1特异性抗体或其结合片段，例如pidilizumab、nivolumab(Keytruda，以前是MDX-1106)、pembrolizumab(Opdivo)，以前是MK-3475)、MEDI0680(以前是AMP-514)、AMP-224、BMS-936558或其任意组合。在进一步的实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与PD-L1特异性抗体或其结合片段组合使用，例如BMS-936559、durvalumab(MEDI4736)、atezolizumab(RG7446)、avelumab(MSB0010718C)、MPDL3280A或其任何组合。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与LAG3抑制剂组合使用，例如LAG525、IMP321、IMP701、9H12、BMS-986016或其任何组合。
在某些实施例中，融合蛋白与CTLA4抑制剂组合使用。在特定的实施例中，将本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与CTLA4特异性抗体或其结合片段组合使用，例如ipilimumab、tremelimumab、CTLA4-Ig融合蛋白(例如abatacept、belatacept)或其任意组合。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与B7-H3特异性抗体或其结合片段组合使用，例如enoblituzumab(MGA271)、376.96或两者。B7-H4抗体结合片段可以是scFv或其融合蛋白，如描述于例如Dangaj et al.,CancerRes.73:4820,2013，以及那些描述于美国专利号9,574,000和PCT专利公开号WO/201640724A1和WO 2013/025779A1。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与CD244抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与BLTA、HVEM、CD 160或其任何组合抑制剂的组合使用。抗CD-160抗体描述于例如PCT公开号WO 2010/084158。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与TIM3的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与Gal9的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与腺苷信号传导抑制剂组合使用，例如诱饵腺苷受体。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与A2aR抑制剂组合使用。
在某些实施例中，将本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与KIR抑制剂组合使用，例如lirilumab(BMS-986015)。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与抑制性细胞因子(通常是除TGFβ以外的细胞因子)或Treg发育或活性抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与IDO抑制剂组合使用，例如左旋-1-甲基色氨酸、epacadostat Liu et al.,Blood 115:3520-30,2010)、ebselen(Terentis et al.,Biochem.49:591-600,2010)、indoximod、NLG919(Mautino et al.,American Association for Cancer Research 104th AnnualMeeting 2013；Apr 6-10,2013)、1-methyl-tryptophan(1-MT)-tira-pazamine或其任何组合。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与精氨酸酶抑制剂组合使用，例如N(ω)-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、N-ω-羟基-nor-1-精氨酸(nor-NOHA)、L-NOHA、2(S)-氨基-6-硼己酸(ABH)、S-(2-硼乙基)-L-半胱氨酸(BEC)或其任何组合。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与VISTA抑制剂组合使用，例如CA-170(Curis,Lexington,Mass.)。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与TIGIT抑制剂(例如COM902(Compugen，多伦多，加拿大安大略))、CD155抑制剂(例如COM701(Compugen))或两者组合使用。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与PVRIG、PVRL2抑制剂或两者组合使用。抗PVRIG抗体描述于例如PCT公开号WO 2016/134333。抗PVRL2抗体描述于例如PCT公开号WO 2017/021526。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与LAIR1抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5抑制剂或其任何组合来组合使用。
在某些实施例中，将本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)与增加刺激性免疫检查点分子的活性(即，是激动剂)的试剂组合使用。例如，本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)可以与CD137(4-lBB)激动剂(例如，urelumab)、CD 134(OX-40)激动剂(例如，MEDI6469、MEDI6383或MEDI0562)、lenalidomide、pomalidomide、CD27激动剂(例如CDX-1127)、CD28激动剂(例如TGN1412、CD80或CD86)、CD40激动剂(例如CP-870,893、rhuCD40L或SGN-40)、CD122激动剂(例如IL-2)、GITR激动剂(例如PCT专利公开号为WO 2016/054638中所述的人源化单克隆抗体))、ICOS(CD278)激动剂(例如，GSK3359609、mAb 88.2、JTX-2011、Icos 145-1、Icos 314-8)或其任意组合来组合使用。在本文公开的任何实施例中，方法可以包括将本公开的融合蛋白(或表达相同的工程改造的宿主细胞)与刺激性免疫检查点分子的一种或多种激动剂(包括前述的任何一种)单独地或以任何组合一起施用。
在某些实施例中，联合疗法包含本公开的融合蛋白(或表达该融合蛋白的工程改造的宿主细胞)和次级疗法，其包含以下一种或多种：由非发炎的实体瘤表达的对癌症抗原具有特异性的抗体或其抗原结合片段、放射治疗、手术、化学治疗剂、细胞因子、RNAi或其任何组合。
在某些实施例中，组合疗法方法包括施用融合蛋白并进一步施用放射治疗或手术。放射疗法在本领域中是众所周知的，并且包括X射线疗法，例如γ射线疗法，以及放射药物疗法。适合于治疗受试者中给定的癌症或非发炎的实体瘤的手术和外科技术是本领域普通技术人员众所周知的。
在某些实施例中，组合疗法方法包括施用修饰的细胞并进一步施用化学治疗剂。化学治疗剂包括但不限于染色质功能抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制药物、DNA损伤剂、抗代谢物(诸如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和糖修饰类似物)、DNA合成抑制剂、DNA相互作用剂(诸如嵌合剂)和DNA修复抑制剂。说明性化学治疗剂包括但不限于以下群组：抗代谢物/抗癌剂，诸如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin)和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)))；抗增殖剂/抗有丝分裂剂，包括天然产物，诸如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨(vinorelbine))；微管破坏剂，诸如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛(docetaxel))、长春花新碱、长春花碱、诺考达唑(nocodazole)、埃博霉素和长春瑞滨、表鬼臼毒素(依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))；DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环类、博莱霉素、白消安(busulfan)、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(Cytoxan)、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、六甲基三聚氰胺奥沙利铂、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、氮芥、丝裂霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)、亚硝基脲、普卡霉素、甲苄肼、紫杉醇、泰索帝(taxotere)、替莫唑胺、替尼泊苷(teniposide)、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(etoposide)(VP 16))；抗生素，诸如放线菌素D(dactinomycin)(放线菌素D(actinomycin D))、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星(idarubicin)、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其系统地代谢L-天冬酰胺并剥夺不具有合成自身天冬酰胺能力的细胞)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，诸如氮芥(nitrogen mustard)(二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲佐菌素)、三嗪-达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，诸如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位复合物(顺铂、卡铂)、甲苄肼、羟基脲、米托坦(mitotane)、氨基苯乙哌啶酮；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide))和芳香酶抑制剂(来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole))；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(诸如组织纤维蛋白溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(布雷菲德菌素(breveldin))；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(TNP470、染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab))；嵌合抗原受体；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素D、替尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)和米托蒽醌、托泊替康(topotecan)、伊立替康)、皮质类固醇(可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松(prednisone)和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂、毒素(诸如霍乱毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶毒素或白喉毒素)，以及半胱天冬酶激活剂；和染色质干扰物。
细胞因子越来越多地用于操纵宿主针对抗癌活性的免疫反应。参见例如Floros&Tarhini,Semin.Oncol.42(4):539-548,2015。可用于促进免疫抗癌或抗肿瘤应答的细胞因子包括，例如，IFN-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-24和GM-CSF单独或与本公开的表达其的结合蛋白或细胞的任何组合结合。
在其他方面，提供了用于活化或刺激经修饰以在其细胞表面上表达本公开的融合蛋白的免疫细胞(即宿主细胞)的方法，其中所述方法包括使修饰的免疫细胞与strep-tag肽(在一些实施例中，其包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成)接触，其在足以活化修饰的免疫细胞的条件和时间下进行。在某些实施例中，strep-tag肽位于细胞表面上。在某些实施例中，strep-tag肽包含在细胞表面蛋白中，例如细胞表面受体或标志物。在进一步的实施例中，细胞表面受体包含CAR或TCR。在特定的实施例中，细胞表面蛋白包含1至约5个strep-tag肽(例如1、2、3、4、5或6个strep-tag肽)。
在其他方面，提供了用于活化或刺激修饰的免疫细胞的方法，其中所述方法包括使修饰的免疫细胞与特异性结合修饰的免疫细胞的细胞表面上的strep-tag肽的结合蛋白接触，从而活化或刺激所述修饰的免疫细胞，其中所述修饰的免疫细胞包含(a)第一多核苷酸，其编码细胞表面受体，其任选地编码含有strep-tag肽的细胞表面受体，其中所述细胞表面受体特异性结合靶抗原；和(b)第二多核苷酸，其编码细胞表面标志物，其任选地编码含有标签肽的细胞表面标志物，其中编码的strep-tag肽任选地包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成，并且条件是细胞表面受体和细胞表面标志物中的至少一个包含strep-tag肽。举例说明，活化或刺激修饰的免疫细胞的实例包括使以下(a)和(b)接触：(a)在其细胞表面表达SEQ ID NO：19的strep-tag肽(例如，表达为与CAR融合或表达为与转导标志物(如EGFRt)融合)的抗CD19 CAR T细胞，(b)特异性结合strep-tag肽的结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段，任选地包含在融合蛋白中)。
在某些实施例中，细胞表面受体包含标签肽。在进一步的实施例中，细胞表面受体包含CAR或TCR。在其他实施例中，细胞表面标志物包含标签肽。在某些实施例中，细胞表面受体和细胞表面标志物均包含strep-tag肽。
在某些实施例中，待活化或刺激的修饰的宿主细胞包括免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞或NK-T细胞)。在某些实施例中，细胞表面受体是或包含CAR或TCR。在进一步的实施例中，标志物包括EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。在特定的实施例中，修饰的免疫细胞被多次活化或刺激，并且可以在体外(in vitro)、离体(ex vivo)或体内(in vivo)被活化或刺激。
示例
示例1
抗STII和带有STII标签的CAR的设计和表达
用于过继免疫疗法的带标签的CAR描述于PCT公开号WO 2015/095895。为了研究表达这种CAR的细胞是否可以选择性靶向消融，产生了编码抗CD19-STII(SEQ ID NO：19)(带标签的CAR)和抗STII CAR的表达构建体。示例性构建体显示在图1中(左上方和左下方)，表达编码的CAR的细胞的示意图显示在右方。
使用衍生自小鼠抗STII单克隆抗体5G2和3E8的scFv(VH-VL和VL-VH方向；SEQ IDNO 5、6、11和12)产生了另外的抗STII CAR。将scFv序列亚克隆到具有中等长度(仅IgG4CH3)或长(IgG4CH2N297QCH3)免疫球蛋白间隔结构域的4-1BB-CD3ζCAR载体中，以产生图2所示的CAR设计。
接下来，用图1所示的CAR构建体转导原代PBMC，并进行表达测定。简而言之，通过流式细胞术分析细胞，并使用生物素化的抗EGFR抗体和链霉亲和素PE检测EGFRt转导标志物。抗CD19-STII和抗STII CAR均显示出稳定的表达(图3；“B”和“C”)。在原代PBMC中也表达了其他高亲和力的抗STII CAR(图4B)。
示例2
抗STII CAR T细胞的功能表征
接下来，测试图2中所示的抗STII CAR构建体对带STII标签的CAR T细胞的识别。简而言之，用抗STII CAR构建体转导人T细胞，并与抗CD19-STII CAR T细胞(抗CD19 CAR中包含的一个，两个或三个STII肽标签)或对照抗CD19 CAR T细胞(无STII)一起孵育。将用PMA/伊诺霉素刺激的T细胞用作阳性对照。在24小时时，通过ELISA检查培养物上清液的IFN-γ。如图5A所示，所有抗STII CAR T细胞响应于靶CAR T细胞而产生细胞因子。具有5G2scFv结合结构域的抗STII CAR T细胞产生的细胞因子数量最多，而基于3E8的CAR T细胞产生的细胞因子数量却较少。反应性似乎随着靶中存在的STII肽的数量增加而增加。
进行增殖测定以研究抗STII CAR T细胞相应于带标签的靶细胞的扩增。用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记抗STII CAR T细胞，并用对照抗CD19 CAR T细胞(无STII)或抗CD19-STII CAR T细胞刺激。刺激后3天通过流式细胞仪分析细胞。结果显示在图5B中。测试的所有抗STII CAR T细胞均响应于刺激而增殖，同时基于5G2的抗STII CAR T细胞比基于3E8的抗STII CAR T细胞扩增得更多。
示例3
抗STII CAR T细胞的体外细胞裂解活性
进行体外细胞毒性测定以测量抗STII CAR T细胞的特异性杀伤活性。在一个实验中，在不同效应子：靶标物的比例(30：1、10：1、3：1、1：1)下，将Cr51标记的靶细胞(对照抗CD19 CAR T；抗CD19-1STII；抗CD19-3 STII)与抗STII CAR T细胞共培养(4h)。然后使用标准制剂通过铬的释放确定特异性裂解。数据示于图1和6A-6C中。所有测试的抗STII CAR T细胞均具有针对靶细胞的细胞裂解活性，其中基于5G2的细胞具有最强的活性。值得注意的是，基于5G2的抗STII CAR T细胞在1:1E:T下裂解了约40％的抗CD19-3STII细胞。
在另一个实验中，测试了抗STII CAR T细胞(针对抗CD19-STII CAR T细胞)和抗CD19-STII CAR T细胞(针对CD19+K562细胞)的杀伤活性。简而言之，用抗CD3/抗CD28刺激试剂刺激PBMC 2天，然后用CAR构建体进行γ-逆转录病毒转导。根据制造商的说明，使用铕TDA释放测定(Perkin Elmer)通过ELISA测量特异性裂解(Y轴)。如图7所示，两组CAR T细胞均以剂量依赖性方式表现出对它们各自靶标的杀伤活性。在第三个实验中，在将抗STII(效应子)和表达抗CD19-STII CAR的细胞(靶标)进行更长的时间的共同孵育后，测量了杀伤活性。用抗CD3/抗CD28刺激PBMC2天，并用抗STII CAR构建体转导原代细胞。将表达抗CD19-STII CAR的HEK293细胞用作靶标。将细胞共孵育20h，并使用xCELLIGENCE RTCA测定(ACEABiosciences，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚)通过阻抗测量靶细胞的裂解。抗STII CAR T细胞的杀伤能力以时间依赖和剂量依赖的方式增加(图8)。
示例4
用于体内动物研究的抗STII CAR的构建和测试
为了确定示例3中所述的体外结果是否可以为人用疗法提供参考，需要进行体内动物研究。为此，当施用于小鼠模型时，使用小鼠类成分来产生抗STII CAR，以降低免疫原性风险。简而言之，将5G2 scFv(VH-VL构型)亚克隆到具有小鼠跨膜和细胞内组分以及由以下任何一种组成的间隔子的CAR构建体中：(1)小鼠IgGl CH3结构域(中间间隔子)；或(2)单个Myc标签+单个G4S接头(短间隔子)。示例性的CAR设计如图9所示。
接下来，转导小鼠T细胞以表达图9所示的抗STII CAR。通过对同样由构建体编码的2Myc-EGFRt转导标志物染色确定CAR表达。将抗STII小鼠CAR T细胞与mCD19-STII CAR T细胞(在CAR间隔区中包含的或与共表达的截短EGFR融合的STII拷贝)或阴性对照细胞(抗CD19 CAR T，没有STII)一起孵育。未处理的和PMA/伊诺霉素处理的T细胞用作阳性对照。细胞因子的产生(IFN-γ，图10A；IL-2，图10B)在24小时测量。这些数据表明，抗STII CAR将小鼠T细胞特异性重定向到表达细胞表面STII(作为CAR的一部分或在EGFRt/STII融合物中)的细胞。
实施例5
使用抗STII CAR T细胞的减少标记的CAR T的副作用
接下来，抗STII CAR T细胞在体内消除STII标记的CAR T细胞并由此减少来自标记的CAR T细胞的副作用的能力(在这种情况下，允许在辐射和用标记的抗CD19 CAR T细胞治疗后从B细胞发育不良中恢复)。首先，检查CAR的细胞表面表达。简而言之，将用CAR表达构建体转导的CD45.1+小鼠T细胞用小鼠抗CD19、抗CD45.1、抗EGFR、抗STII和抗Myc单克隆抗体染色，并通过流式细胞术分析。所有CAR的细胞表面表达均得到确认(图11A)。然后根据图11B所示的治疗方案将细胞注射入CD45.2+C57/Bl6小鼠。简而言之，所有小鼠在第0天接受6Gy全身辐射(TBI)，在第+27天接受2Gy(TBI)，以减少B细胞数量。未治疗的小鼠仅接受辐射，不接受CAR T细胞。对照小鼠接受抗CD19-1STII CAR T细胞(第+0天)，但不接受抗STIICAR T细胞。在第0天给测试小鼠施用5x106个CD45.1+小鼠抗CD19-STII-CD28ζ+EGFRt+脾细胞。在第+28天，向测试小鼠输注1x107个CD45.1+小鼠T细胞，该小鼠T细胞表达具有短(一个Myc标签)间隔子(治疗“第1组”)或带有中等长度(CH3)间隔子(治疗“第2组”)的抗STIICAR。在整个治疗过程中，通过流式细胞仪监测PBMC中的T细胞和B细胞数量。
来自第1组小鼠的数据显示在图11C和11D中。简而言之，在输注抗STII CAR T细胞后第28、31、42、56和70天监测抗CD19-1STII CAR T细胞和抗STII CAR T细胞的频率。如图11C所示，具有Myc标签间隔子的抗STII细胞在体内被有效转移并部分消除了抗CD19-STII细胞。还通过流式细胞术测量了B细胞数量(在输注抗STII CAR T细胞后第+31天和+42天)。图11D显示用表达具有短(Myc标签)间隔子的抗STII CAR的T细胞治疗不能逆转小鼠中的B细胞发育不良。
来自第2组小鼠的数据显示在图11E和11F中。输注抗STII CAR T细胞后第28、31、42、56和70天，监测PBMC中抗CD19-1STII CAR T细胞和抗STII CAR T细胞的频率。如图11E所示，具有Myc标签间隔子的抗STII细胞在体内被有效转移并消除了抗CD19-STII细胞。还通过流式细胞术测量了B细胞数量(在输注抗STII CAR T细胞后第+31天和+42天)。图11F显示用表达具有中等间隔子的抗STII CAR的T细胞治疗有效地逆转小鼠中的B细胞发育不良(左下图)。来自实验治疗方案的B细胞恢复数据总结在图11G中。
在图12A所示的第二实验治疗中，C57/Bl6小鼠如上所述接受亚致死辐射，然后在第+0天输注1x106小鼠CD45.1+抗CD19-3STII-28z CAR T细胞以诱导B细胞发育不良。在第35天，小鼠接受((1.5x 106个OT-1CD45.1/2+抗STII CAR T细胞，随后接受在第113天接受2.5x106个OT-1CD90.1+抗STII CAR T细胞。始终通过流式细胞术监测B细胞数量。图12B显示了输注前的抗CD19-3STII-28z CAR T细胞的表达(左)和纯化的抗STII CAR T细胞的分选(右)。首次抗STII CAR T细胞转移后，监测CAR T细胞数量，显示抗CD19 CAR T细胞数量持续下降(图15A)。还监测了内源性B细胞数量，显示了与未治疗(“阴性”)小鼠相比，已治疗(“样本”)小鼠的显著恢复(图15B)。
在辐射和将抗CD19-3 STII CAR T细胞输注入小鼠后，但在转移抗STII CAR T细胞之前，确认了内源性B细胞的耗竭。简而言之，通过流式细胞术和门控活淋巴细胞来分析PBMC(图13A)。然后使用CD19PE通过流式细胞仪(13B-13H)或使用抗PE磁微珠(MiltenyiBiotec)分析门控细胞的CD19表达(图13I)。如图14-16D所示，输注抗STII CAR T细胞能够恢复内源性B细胞(请参阅“样本”数据)。值得注意的是，从原发组织的终点分析表明，CAR T细胞和恢复的B细胞主要存在于脾脏中，而淋巴结则较少见(图16A-16D)。
实施例6
STII和CAR在抗原特异性T细胞中的非偶联表达
前述实施例中使用的带标签的CAR T细胞表达STII作为CAR分子的一部分。然而，标签肽被表达的位点可能影响标签肽被有效展示以被抗标签CAR T细胞识别的能力。为了测试这一点，设计了表达构建体以使抗CD19 CAR的表达与STII标签的表达解偶联。具体而言，将STII编码序列融合到EGFRt编码序列的3'端。CAR和EGFRt:STII编码区由自切割肽序列分开，因此编码的CAR和EGFRt:STII蛋白作为单独的分子定位在细胞膜上。图17B和17E。
在图18A所示的实验中，测试了两种表达构建体(抗CD19-3STII-28z_EGFRt和抗CD19-28z_E-3STII)在小鼠中的表达和活性。简而言之，小鼠接受亚致死剂量的辐射，随后接受用任何一种构建体转导的2x106个C57/Bl6 CD90.1+/-T细胞。流式细胞术分析表明，CAR和STII表达未偶联的细胞(抗CD19-28z_E-3STII)比那些表达STII作为CAR一部分的细胞更有效地扩增。图18B。用表达任一种构建体的CAR T细胞治疗减少内源性B细胞数量。图19。
检查了STII和CAR表达解偶联对抗STII CAR T细胞识别的影响。在第0天，小鼠接受亚致死剂量的辐射，然后输注用任一种CAR-STII构建体转导的2x106个C57/Bl6 CD90.1+/-T细胞。在第+40天，给小鼠输注2.5x 106个CD45.1+/-抗STII细胞。图20A。证实了三种CART细胞类型的表达(图。20B)。在第+6和+35天输注抗STII CAR T细胞后，通过流式细胞术分析B细胞数量(分别为图21A-21B和图22A-22B)。出人意料的是，在接受抗CD19-28z_E-3STIICAR T细胞的小鼠中，内源性B细胞的恢复率更高，这表明将STII与抗CD19 CAR解偶联可以改善抗STII CAR T细胞的识别和杀伤力。
端点分析表明，在所有被分析的原发组织中均存在恢复的B细胞，而且抗STII CART细胞数量高于带标签的抗CD19 CAR T细胞。图23A和23B。不希望被理论所束缚，这些数据表明，当标签和抗原特异性受体在细胞表面上以独立的分子表达时，带标签的抗CAR T细胞可以更有效地靶向带标签的抗原特异性T细胞。
可以将上述各种实施例组合以提供进一步的实施例。本说明书中提及的和/或美国临时专利申请号62/555,012列出的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物的全部内容通过引用合并于此。如果需要采用各种专利、申请和出版物的概念以提供其他实施例，则可以修改实施例的各方面。
可以根据以上详细描述对实施例进行这些和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解释为将权利要求书限制为说明书和权利要求书中公开的特定实施例，而应解释为包括所有可能的实施例以及这些权利要求的等同物的全部范围。因此，权利要求不受公开内容的限制。
序列表
<110> 弗雷德哈钦森癌症研究中心
慕尼黑科技大学
刘凌峰
S·R·里德尔
D·布施
S·弗兰伯
<120> STREP-TAG特异性嵌合受体及其用途
<130> 360056.450WO
<140> PCT
<141> 2018-09-06
<150> US 62/555,012
<151> 2017-09-06
<160> 49
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 3E8 VH
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagac tgggggaggc tttgtgaagc ctggaggctc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatggca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc atcaccagtg atggcggtgg cacccactat 180
ccagatactg tgaagggccg attcaccatc tccagagact ttgccaaaaa caccctgtac 240
ctgcagatga gcagtctgag gtctgaggac acagcctggt atttctgtgc aagacatgag 300
ccccgactga tagcctggtt tgctcactgg ggccaaggaa ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 3E8 VH
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Gly Thr His Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Trp Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 3E8 VL
<400> 3
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 3E8 VL
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gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctct 60
atctcttgca gatctagtca gagcattgtt catagtaatg gatacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acgaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
atcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattattgct ttcaaggttc acatgttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaac 337
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<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII 3E8 scFv
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Gly Thr His Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Trp Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu
130 135 140
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
145 150 155 160
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
165 170 175
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser
180 185 190
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
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Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 6
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII 3E8 scFv
<400> 6
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Gly Thr His Tyr Pro Asp Thr Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Trp Tyr Phe Cys Ala
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Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 5G2 VH
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 5G2 VL
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tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
cgcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 5G2 VL
<400> 10
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
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<220>
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<400> 11
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Phe
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu
130 135 140
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
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Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
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Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
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Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
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Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
245
<210> 12
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII 5G2 scFv
<400> 12
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
130 135 140
Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
210 215 220
Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 13
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 4E2 VH
<400> 13
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 4E2 VH
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Leu
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65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 4E2 VL
<400> 15
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ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII mAb 4E2 VL
<400> 16
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII 4E2 scFv
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu
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Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
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Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
245
<210> 18
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列抗STII 4E2 scFv
<400> 18
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser
130 135 140
Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Leu Lys
180 185 190
Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
210 215 220
Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列Strep-Tag II
<400> 19
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(Gly4Ser)2接头
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(Gly3Ser)2接头
<400> 21
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E8 HCDR1 amino acid
<400> 22
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E3 HCDR2 amino acid
<400> 23
Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Gly Thr His
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E8 HCDR3
<400> 24
Ala Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His
1 5 10
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E8 LCDR1
<400> 25
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E8 LCDR2
<400> 26
Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列3E8 LCDR3
<400> 27
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 HCDR1
<400> 28
Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 HCDR2
<400> 29
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 HCDR3
<400> 30
Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 LCDR1
<400> 31
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 LCDR2
<400> 32
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列5G2 LCDR3
<400> 33
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 HCDR1
<400> 34
Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Thr
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 HCDR2
<400> 35
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 HCDR3
<400> 36
Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 LCDR1
<400> 37
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 LCDR2
<400> 38
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列4E2 LCDR3
<400> 39
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列P2A
<400> 40
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 41
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列P2A mod
<400> 41
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列T2A
<400> 42
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 43
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列T2A mod
<400> 43
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 44
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列E2A
<400> 44
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Ser Asp Val Glu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 45
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列E2A mod
<400> 45
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Ser
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 46
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列F2A
<400> 46
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列F2A mod
<400> 47
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列Strep-tag
<400> 48
Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(Gly3Ser)2Gly2Ser接头
<400> 49
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10

Claims (92)

1.一种融合蛋白，包含：
(a)细胞外组分，其包含特异性结合于strep-tag肽的结合结构域；
(b)细胞内组分，其包含效应子结构域或其功能部分；
(c)跨膜结构域，其连接细胞外组分和细胞内组分。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述结合结构域是scFv、scTCR或配体。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述结合结构域是嵌合的、人的或人源化的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述strep-tag肽包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，其中，所述结合结构域是包含来自5G2抗体3E8抗体或4E2抗体的CDR的scFv。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述scFv包含基于5G2抗体、3E8抗体或4E2抗体的重链和轻链可变区。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中，所述scFv包含与SEQ ID NO：10、3或16所示的氨基酸序列至少90％相同的轻链可变区(VL)；和与SEQ ID NO：8、2或14所示的氨基酸序列至少90％相同的重链可变区(VH)。
8.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中，所述scFv包含VL和VH，所述VL由SEQ ID NO：10；3；或16所示的氨基酸序列或由其组成，所述VH包含SEQ ID NO：8；2；或14所示的氨基酸序列或由其组成。
9.根据权利要求7或8所述的融合蛋白，其中，所述scFv包含：
(a)SEQ ID NO：10的VL和SEQ ID NO：8的VH；
(b)SEQ ID NO：3的VL和SEQ ID NO：2的VH；或
(c)SEQ ID NO：16的VL和SEQ ID NO：14的VH。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中，所述scFv包含SEQ ID NO：11或12所示的氨基酸序列或由其组成。
11.根据权利要求9的融合蛋白，其中，所述scFv包含SEQ ID NO：5或6所示的氨基酸序列或由其组成。
12.根据权利要求9的融合蛋白，其中，所述scFv包含SEQ ID NO：17或18所示的氨基酸序列或由其组成。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白，其中，所述细胞内组分或其功能部分包括细胞内基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。
14.根据权利要求1-13所述的融合蛋白，其中，所述效应子结构域包含CD3ζ或其功能部分。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的融合蛋白，其中，所述细胞内组分或其功能部分还包含共刺激结构域或其功能部分，所述共刺激结构域或其功能部分选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)或其组合。
16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中，所述细胞内组分还包含CD28共刺激结构域或其功能部分、4-lBB共刺激结构域或其功能部分、或CD28共刺激结构域或其功能部分和4-lBB共刺激结构域或其功能部分两者。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的融合蛋白，其中，所述跨膜结构域包括CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD27跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白，其中，所述细胞外组分还包含位于所述结合结构域与所述跨膜结构域之间的接头。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中，所述接头包含免疫球蛋白恒定区或其部分。
20.根据权利要求19的融合蛋白，其中，所述免疫球蛋白恒定区或其部分包含CH3结构域、CH2结构域或两者。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的融合蛋白，其中，所述接头包含CH2结构域和CH3结构域。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中，所述CH2结构域和所述CH3结构域各是相同的同种型。
23.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中，所述CH2结构域和所述CH3结构域各是不同的同种型。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的融合蛋白，其中，所述CH2结构域和所述CH3结构域是IgG4或IgG1同种型。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的融合蛋白，其中，所述CH2结构域包含N297Q突变。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的融合蛋白，其中，所述免疫球蛋白恒定区或其部分包含人免疫球蛋白恒定区或其部分。
27.根据权利要求18-26中任一项所述的融合蛋白，其中，所述接头包含铰链区或其部分。
28.根据权利要求18-27中任一项所述的融合蛋白，其中，所述接头包含免疫球蛋白恒定区或其部分和铰链区或其一部分。
29.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中，所述接头包含甘氨酸-丝氨酸接头，所述甘氨酸-丝氨酸接头包含SEQ ID NO：20、21或49所示的氨基酸序列或由组成。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的融合蛋白，其中，所述细胞外组分还包含蛋白质标签，条件是所述蛋白质标签不包含所述strep-tag肽。
31.根据权利要求30所述的融合蛋白，其中，所述蛋白质标签是Myc标签、His标签、Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、HA标签，Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Sof标签、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标签或其任何组合。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的融合蛋白，其中，细胞外组分、结合结构域、接头、跨膜结构域、细胞内组分和共刺激结构域中的一个或多个包含连接氨基酸。
33.分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1-32中任一项所述的融合蛋白。
34.根据权利要求33所述的分离的多核苷酸，其进一步包含编码标志物的多核苷酸。
35.根据权利要求34的分离的多核苷酸，其中，编码标志物的多核苷酸位于编码融合蛋白的多核苷酸的3'或位于编码融合蛋白的多核苷酸的5'。
36.根据权利要求34或35所述的分离的多核苷酸，其中，编码的标志物包括EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。
37.根据权利要求34-36中任一项的分离的多核苷酸，其进一步包含编码自切割多肽的多核苷酸，其中，编码自切割多肽的多核苷酸位于编码细胞内组分的多核苷酸和编码标志物的多核苷酸之间。
38.根据权利要求37所述的分离的多核苷酸，其中，编码的自切割多肽是猪捷申病毒1型的2A肽(P2A)、明脉扁刺蛾β四体病毒2A肽(T2A)、马鼻炎病毒A(E2A)或口蹄疫病毒(F2A)。
39.根据权利要求33-38中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，针对包含多核苷酸的宿主细胞对多核苷酸进行密码子优化。
40.嵌合多核苷酸，包含编码细胞表面受体的第一多核苷酸、编码带标签的标志物的第二多核苷酸、以及位于编码细胞表面受体的第一多核苷酸和编码带标签的标志物的第二多核苷酸之间的编码自切割多肽的第三多核苷酸，其中：
(1)编码细胞表面受体的第一多核苷酸包含：
(a)细胞外组分，其包含特异性结合靶抗原的结合结构域，
(b)细胞内组分，其包含效应子结构域或其功能部分，和
(c)跨膜组分，其连接细胞外组分和细胞内组分；以及
(2)编码带标签的标志物的第二多核苷酸包含编码含有标签肽的标志物的多核苷酸，其中，编码的标签肽包括strep-tag肽。
41.根据权利要求40所述的嵌合多核苷酸，其中，编码的strep-tag肽包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成。
42.根据权利要求40或41所述的嵌合多核苷酸，其中，编码的标志物包括EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的嵌合多核苷酸，其中，细胞外组分的编码的结合结构域特异性结合与过度增殖疾病相关的靶抗原。
44.根据权利要求43所述的嵌合多核苷酸，其中，所述过度增殖疾病是癌症。
45.根据权利要求43或44所述的嵌合多核苷酸，其中，所述靶抗原选自CD19抗原、CD20抗原、CD22抗原、ROR1抗原、EGFR抗原、EGFRvIII抗原、EGP-2抗原、EGP-40抗原、GD2抗原、GD3抗原、HPV E6抗原、HPV E7抗原、Her2抗原、LI-CAM抗原、Lewis A抗原、Lewis Y抗原、MUC1抗原、MUC16抗原、PSCA抗原、PSMA抗原、CD56抗原、CD23抗原、CD24抗原、CD30抗原、CD33抗原、CD37抗原、CD44v7/8抗原、CD38抗原、CD56抗原、CD123抗原、CA125抗原、c-MET抗原、FcRH5抗原、WT1抗原、叶酸受体α抗原、VEGF-α抗原、VEGFR1抗原、VEGFR2抗原、IL-13Rα2抗原、IL-1IRα抗原、MAGE-A1抗原、MAGE-A3抗原、MAGE-A4抗原、SSX-2抗原、PRAME抗原、HA-1抗原、PSA抗原、ephrin A2抗原、ephrin B2抗原、NKG2D抗原、NY-ESO-1抗原、TAG-72抗原、间皮素抗原、5T4抗原、BCMA抗原、FAP抗原、碳酸酐酶9抗原、ERBB2抗原、BRAFV600E抗原或CEA抗原。
46.根据权利要求40-45中任一项所述的嵌合多核苷酸，其中，编码的细胞表面受体包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
47.根据权利要求40-46中任一项所述的嵌合多核苷酸，其中，编码的自切割多肽是P2A、T2A、E2A或F2A。
48.根据权利要求40-47中任一项所述的嵌合多核苷酸，其中，多核苷酸包含以下结构的5'端至3'端的结构：
(a)(编码细胞表面受体的第一多核苷酸)-(编码自切割多肽的第三多核苷酸)-(编码带标签的标志物的第二多核苷酸)；或
(b)(编码带标签的标志物的第二多核苷酸)-(编码自切割多肽的第三多核苷酸)-(编码细胞表面受体的第一多核苷酸)。
49.表达构建体，其包含与表达控制序列可操作地连接的根据权利要求33-39中任一项所述的编码融合蛋白的多核苷酸或根据权利要求40-48中任一项所述的嵌合多核苷酸。
50.载体，其包含根据权利要求49的表达构建体。
51.根据权利要求50所述的载体，其中，所述载体包括质粒载体或病毒载体。
52.根据权利要求51所述的载体，其中，所述载体是病毒载体，并且所述病毒载体选自慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
53.宿主细胞，其包含：
(a)根据权利要求33-39中任一项的编码融合蛋白的多核苷酸或根据权利要求49所述的编码融合蛋白的表达构建体，其中，所述宿主细胞表达编码的融合蛋白；或
(b)根据权利要求40-48中任一项所述的嵌合多核苷酸或根据权利要求49所述的嵌合多核苷酸表达构建体，其中，所述宿主细胞表达所述编码的细胞表面受体和所述编码的标志物。
54.根据权利要求53所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是免疫细胞。
55.根据权利要求54所述的宿主细胞，其中，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或NK-T细胞。
56.根据权利要求54或55所述的宿主，其中，所述免疫系统细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合。
57.根据权利要求53-55中任一项所述的宿主细胞，其包含以下基因的的染色体基因敲除：PD-1基因；LAG3基因；TIM3基因；CTLA4基因；HLA成分基因；TCR成分基因或其任何组合。
58.组合物，其包含根据权利要求1-32中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
59.组合物，其包含权利要求53-57中任一项所述的宿主细胞和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
60.单位剂量，其包含治疗有效量的根据权利要求53-57中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求58所述的宿主细胞组合物。
61.用于活化或刺激免疫细胞的方法，所述免疫细胞经修饰以在其表面上表达根据权利要求1-32中任一项所述的融合蛋白，所述方法包括在足以使修饰的免疫细胞被活化的条件和时间下，使修饰的免疫细胞与strep-tag肽接触。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述strep-tag肽包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中，所述strep-tag肽包含在细胞表面蛋白中。
64.根据权利要求63所述的方法，其中，所述细胞表面蛋白包含1至约5个strep-tag肽。
65.根据权利要求61至64中任一项所述的方法，其中，所述细胞表面蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或标志物。
66.根据权利要求61-65中任一项所述的方法，其中，所述修饰的免疫细胞被多次活化或刺激。
67.活化或刺激修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括使修饰的免疫细胞与特异性结合修饰的免疫细胞的细胞表面上的strep-tag肽的结合蛋白接触，从而活化或刺激修饰的免疫细胞；其中，所述修饰的免疫细胞包含：
(a)第一多核苷酸，其编码细胞表面受体，其任选地编码含有所述strep-tag肽的细胞表面受体，其中，所述细胞表面受体特异性结合靶抗原；和
(b)第二多核苷酸，其编码细胞表面标志物，其任选地编码含有strep-tag肽的细胞表面标志物，
条件是细胞表面受体和细胞表面标志物中的至少一个包含标签肽。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述strep-tag肽包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成。
69.根据权利要求67或68所述的方法，其中，所述细胞表面受体包含所述strep-tag肽。
70.根据权利要求67-69中任一项所述的方法，其中，所述细胞表面受体包括CAR或TCR。
71.根据权利要求67-70中任一项所述的方法，其中，所述细胞表面标志物包括所述strep-tag肽。
72.根据权利要求67-71中任一项所述的方法，其中，所述细胞表面标志物包括EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。
73.根据权利要求67-72中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或NK-T细胞。
74.根据权利要求67-73中任一项所述的方法，其中，所述细胞表面受体和/或所述细胞表面标志物包含1至约5个标签肽。
75.根据权利要求67-74中任一项所述的方法，其中，所述修饰的免疫细胞被多次活化或刺激。
76.用于靶向消融带标签的细胞的方法，包括对受试者施用免疫细胞，所述免疫细胞修饰以在其细胞表面表达根据权利要求1-32中任一项所述的融合蛋白，其中，所述受试者先前已经被施用了表达细胞表面蛋白的带标签的细胞，所述细胞表面蛋白包含strep-tag肽，从而诱导消除带标签的细胞的靶向免疫反应。
77.根据权利要求76所述的方法，其中，所述strep-tag肽包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中，所述细胞表面蛋白包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和/或标志物。
79.权利要求76-78中任一项的方法，其中，所述标志物包括EGFRt、CD19t、CD34t或NGFRt。
80.根据权利要求76-79中任一项所述的方法，其中，所述免疫细胞选自T细胞、NK细胞或NK-T细胞。
81.根据权利要求80所述的方法，其中，所述免疫细胞是T细胞。
82.根据权利要求81所述的方法，其中，所述免疫系统细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞，效应记忆T细胞或其任何组合。
83.根据权利要求76-82中任一项所述的方法，其中，所述带标签的细胞先前作为细胞免疫疗法、植入物或移植物施用于所述受试者。
84.根据权利要求76-83中任一项所述的方法，其进一步包括，在向所述受试者施用所述修饰的免疫细胞之后，检测以下的存在和/或测量其量：
(i)在受试者中或从受试者获得的样本中剩余的带标签的细胞；
(ii)在受试者中或从受试者获得的样本中存在的修饰的免疫细胞；
(iii)在受试者中的一种或多种细胞因子；或
(iv)其任何组合。
85.根据权利要求76-84中任一项所述的方法，其中，将表达融合蛋白的修饰的免疫细胞施用于具有至少一种与所述带标签的细胞的存在相关的不良事件的受试者。
86.根据权利要求76-85中任一项所述的方法，其中，表达融合蛋白的带标签的细胞和/或修饰的免疫细胞对受试者是同种异体的、自体的或同基因的。
87.根据权利要求76-86中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有或被怀疑患有移植物抗宿主病(GvHD)或宿主抗移植物疾病(HvGD)。
88.根据权利要求76-87中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
89.试剂盒，其包含：
(a)根据权利要求50-52中任一项所述的载体、或根据权利要求49所述的表达构建体；和
(b)用于将(a)的载体或表达构建体转导到宿主细胞中的试剂。
90.试剂盒，其包含：
(a)根据权利要求53-57中任一项所述的宿主细胞；和/或
(b)根据权利要求58或59所述的组合物；和/或
(c)根据权利要求59所述的单位剂量。
91.根据权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中，所述结合结构域包含：
(a)SEQ ID NO：22、28或34中任一项所示的重链CDR 1氨基酸序列、或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：22、28或34的变体；
(b)SEQ ID NO：23、29或35中任一项所示的重链CDR 2氨基酸序列、或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：23、29或35的变体；
(c)SEQ ID NO：24、30或36中任一项所示的重链CDR 3氨基酸序列、或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：24、30或36的变体。
92.根据权利要求1-5或91中任一项所述的融合蛋白，其中，所述结合结构域包含：
(a)SEQ ID NO：25、31或37中任一项所示的轻链CDR 1氨基酸序列、或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：25、31或37的变体；
(b)SEQ ID NO：26、32或38中任一项所示的轻链CDR 2氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：26、32或38的变体；
(c)SEQ ID NO：27、33或39中任一项所示的轻链CDR 3氨基酸序列、或具有1-3个氨基酸取代和/或缺失的SEQ ID NO：27、33或39的变体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944050A (zh) * 2020-08-19 2020-11-17 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗b7-h3抗体及其应用
CN112250767A (zh) * 2020-12-08 2021-01-22 北京艺妙神州医药科技有限公司 一种结合Strep-Tag II标签的抗体及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3288570A4 (en) 2015-04-29 2018-11-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
US11192935B2 (en) * 2015-06-19 2021-12-07 Sebastian Kobold PD-1-CD28 fusion proteins and their use in medicine
WO2019222642A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Senti Biosciences, Inc. Engineered immune cells and methods of use
CA3235607A1 (en) * 2021-11-02 2023-05-11 Soheil MESHINCHI Treatments for cancers utilizing cell-targeted therapies and associated research protocols

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101529253A (zh) * 2006-06-21 2009-09-09 阿珀吉尼科斯有限公司 Il-4和/或il-10细胞因子在人癌症中的差异表达
WO2010006772A2 (en) * 2008-07-14 2010-01-21 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Use of cd95 inhibitors for the treatment of inflammatory disorders
KR101342974B1 (ko) * 2012-11-06 2013-12-18 명지대학교 산학협력단 신규 펩티드 태그 및 이의 용도
WO2015095895A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof
WO2016176651A2 (en) * 2015-04-29 2016-11-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
WO2018134691A2 (en) * 2017-01-20 2018-07-26 Juno Therapeutics Gmbh Cell surface conjugates and related cell compositions and methods

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
DE10113776B4 (de) 2001-03-21 2012-08-09 "Iba Gmbh" Isoliertes streptavidinbindendes, kompetitiv eluierbares Peptid, dieses umfassendes Fusionspeptid, dafür codierende Nukleinsäure, Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Gewinnung des Fusionsproteins
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
WO2003078619A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
EP2559759A1 (en) 2003-01-28 2013-02-20 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
WO2006076678A2 (en) 2005-01-13 2006-07-20 The Johns Hopkins University Prostate stem cell antigen vaccines and uses thereof
DK2662442T3 (en) 2005-10-18 2015-07-06 Prec Biosciences Rationally designed mechanuclease with altered dimer formation affinity
US8119772B2 (en) 2006-09-29 2012-02-21 California Institute Of Technology MART-1 T cell receptors
KR101319499B1 (ko) 2008-02-22 2013-10-17 엘지디스플레이 주식회사 화학적 자기조립 방법을 이용한 나노선 혹은탄소나노튜브의 적층 및 패턴형성 방법과, 이를 적용한액정표시장치의 제조방법
CA3138111A1 (en) 2008-08-26 2010-03-04 City Of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
EP2210903A1 (en) 2009-01-21 2010-07-28 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD160 monoclonal antibodies and uses thereof
EP2258719A1 (en) 2009-05-19 2010-12-08 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Multiple target T cell receptor
CN103025344B (zh) 2010-05-17 2016-06-29 桑格摩生物科学股份有限公司 新型dna-结合蛋白及其用途
JP6120848B2 (ja) 2011-08-15 2017-04-26 メディミューン，エルエルシー 抗ｂ７−ｈ４抗体およびその使用
ES2960803T3 (es) 2012-05-25 2024-03-06 Univ California Métodos y composiciones para la modificación de ADN diana dirigida por RNA y para la modulación de la transcripción dirigida por RNA
PT2884999T (pt) 2012-08-20 2021-01-05 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Método e composições para imunoterapêutica celular
EP3144390B1 (en) 2012-12-12 2020-03-18 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP2934576A1 (en) 2012-12-19 2015-10-28 The Johns Hopkins University Anti-human b7-h4 antibodies and their uses
EP2871189A1 (en) 2013-11-07 2015-05-13 Institut Pasteur High-affinity monoclonal anti-strep-tag antibody
JP2016537028A (ja) 2013-11-18 2016-12-01 クリスパー セラピューティクス アーゲー Ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓシステムの材料及び方法
CN113307880A (zh) 2014-01-13 2021-08-27 希望之城公司 在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体(CAR)及其使用方法
CN106804108B (zh) 2014-09-12 2021-08-10 基因泰克公司 抗-b7-h4抗体及免疫缀合物
US10463732B2 (en) 2014-10-03 2019-11-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) antibodies and methods of use thereof
DK3295951T3 (da) 2015-02-19 2020-07-20 Compugen Ltd Anti-pvrig-antistoffer og fremgangsmåder for anvendelse
JO3620B1 (ar) 2015-08-05 2020-08-27 Amgen Res Munich Gmbh مثبطات نقطة فحص مناعية للاستخدام في علاج سرطانات محمولة عبر الدم
KR20200041377A (ko) 2017-09-06 2020-04-21 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 Strep-tag 특이적 결합 단백질 및 그 용도

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101529253A (zh) * 2006-06-21 2009-09-09 阿珀吉尼科斯有限公司 Il-4和/或il-10细胞因子在人癌症中的差异表达
WO2010006772A2 (en) * 2008-07-14 2010-01-21 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Use of cd95 inhibitors for the treatment of inflammatory disorders
KR101342974B1 (ko) * 2012-11-06 2013-12-18 명지대학교 산학협력단 신규 펩티드 태그 및 이의 용도
WO2015095895A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof
WO2016176651A2 (en) * 2015-04-29 2016-11-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
WO2018134691A2 (en) * 2017-01-20 2018-07-26 Juno Therapeutics Gmbh Cell surface conjugates and related cell compositions and methods

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GREGORY A. MASTERS等: "Clinical Cancer Advances 2015: Annual Report on Progress Against Cancer From the American Society of Clinical Oncology" *
LINGFENG LIU等: "Inclusion of Strep-tag II in design of antigen receptors for T-cell immunotherapy" *
葛保胜: "G 蛋白偶联受体结构生物学进展" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944050A (zh) * 2020-08-19 2020-11-17 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗b7-h3抗体及其应用
CN112250767A (zh) * 2020-12-08 2021-01-22 北京艺妙神州医药科技有限公司 一种结合Strep-Tag II标签的抗体及其应用

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AU2018327225A1 (en) 2020-02-27
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