TW202330592A - 具有經減少之多聚化(MULTIMERISATION)的scFv及抗體 - Google Patents

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馬蒂亞斯 Ｍ 莫騰森
斯蒂恩 利斯比
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Abstract

本發明揭露用於產生具有經減少之形成多聚體的傾向之scFv變異體的方法。

Description

具有經減少之多聚化(MULTIMERISATION)的scFv及抗體
本說明書包含與本申請案一起提交之呈電腦可讀格式之序列表。序列表形成本揭露內容之一部分且整體併入說明書中。 發明領域
本發明係關於具有經減少之形成多聚體的傾向之scFv及抗體之變異體。特定言之，本發明係關於包含該等scFv之雙特異性抗體。
本發明進一步關於包含一或多種本發明抗體之醫藥組成物及其用於治療癌症之用途。
發明背景
scFv片段及抗體(諸如雙特異性抗體)已廣泛用於抗體輔助診斷及治療。
預靶向放射免疫療法(Pretargeted radioimmunotherapy，PRIT)係利用抗體與特定目標之有效結合，使治療聚焦於靶向位點之醫藥方法的一個實例。
WO2018204873揭露SADA技術，其受益於能夠取決於濃度而組裝或分解之SADA區域。此特性與PRIT結合尤其有益。連接至SADA區域之能夠結合細胞毒性劑及目標位點的雙特異性抗體可以多聚形式，尤其四聚形式投予，且結合至抗體目標位點，而未結合分子將在投予細胞毒性劑之前分解且經由腎臟自血漿流中移除。
對於SADA-PRIT療法重要的是，多聚形式，尤其四聚形式之分子大小高於腎清除極限且藉此提供長血漿半衰期，且單體形式低於腎清除極限，提供短血漿半衰期。
對於包含一或多種抗體之醫藥組成物，同樣重要的是，一或多種抗體在醫藥組成物之儲放時限期間保持穩定，避免抗體降解以及抗體之間及/或抗體與組成物之其他組分之間的非預期附聚或交叉反應。
發明概要
在第一態樣中，本發明係關於一種產生scFv區域之變異體的方法，scFv區域包含輕鏈可變區域(VL)、重鏈可變區域(VH)及VL與VH之間的一或多個雙硫鍵，該方法包含以下步驟： a.鑑別在VL與VH之間形成該一或多個雙硫鍵的半胱胺酸殘基；及 b.用不同於半胱胺酸之胺基酸取代步驟a.中所鑑別之形成該等雙硫鍵中之一或多者的該等半胱胺酸殘基。
與在VH與VL區域之間具有雙硫鍵的scFv相比，本發明之變異scFv (本身為scFv)具有經減少之形成多聚體的能力及/或傾向。
在另一態樣中，本發明係關於根據本發明方法製備之scFv區域。
在另一態樣中，本發明係關於雙特異性抗體，其包含能夠結合DOTA或DOTAM金屬螯合物之第一scFv區域、能夠結合腫瘤抗原之第二scFv區域及SADA區域，其中第一scFv區域及/或第二scFv區域在VH與VL區域之間不含雙硫鍵。
在另一態樣中，本發明係關於包含本發明之scFv或雙特異性抗體的組成物，尤其醫藥組成物，及此類組成物用於診斷或治療癌症之用途。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含本發明之scFv或雙特異性抗體的套組。
本發明亦關於聚核苷酸、包含此類聚核苷酸之表現載體或構築體、包含此類聚核苷酸或表現載體或構築體之宿主細胞，及此類宿主細胞用於製備本發明之scFv或雙特異性抗體的用途。
其他態樣提供於申請專利範圍中。 定義
DOTA ：十二烷四乙酸(Dodecane Tetraacetic Acid，DOTA)亦稱為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7 10-四乙酸，且具有式(CH 2CH 2NCH 2CO 2H) 4，亦稱為C 16H 28N 4O 8· xH 2O。
DOTA 金屬螯合物：意謂具有錯合結合金屬離子之DOTA。
DOTA 之衍生物：意欲意謂包含DOTA環系統且能夠螯合金屬離子之化合物。此類化合物之實例包括苯甲基-DOTA及WO2019010299A中所揭露之雙特異性螯合劑。其他DOTA衍生物揭露於WO2010099536 A1中。 DOTAM ：為包含能夠結合金屬離子之環系統的螯合劑。其具有1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,7-雙(乙酸酯)-4,10-雙(乙醯胺)之系統命名且具有式C 16H 30N 6O 6·2H 2O。
胺基酸取代 ：意欲意謂一個胺基酸經不同胺基酸置換。在本說明書中，關於參考序列之術語胺基酸取代意欲意謂所討論之胺基酸序列可自參考序列開始且引入該(等)胺基酸取代來產生，即使所討論之序列實際上由不涉及參考序列之另一方法產生。
序列一致性 ：術語序列一致性意欲意謂二個核酸或胺基酸序列之相關性的量度。序列一致性係藉由比對二個序列且找出最長重疊、對重疊中之匹配數進行計數及藉由將匹配數除以重疊中之核苷酸或胺基酸殘基數來計算序列一致性來確定。序列一致性通常以百分比(%)表示。
多種計算演算法可供熟習此項技術者用於產生序列比對及計算序列一致性。如本文所用，序列比對係指成對比對。若干演算法執行此操作，包括序列比對程式Clustal Omega[doi:10.1038/msb.2011.75]。 如本文所用，使用以下演算法執行序列比對： 演算法：Clustal Omega (1.2.4)，
(http://www.clustal.org/omega/)。
抗體或抗體片段 ：抗體片段為抗體之一部分，諸如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv及其類似物。不論結構，抗體片段均與完整抗體所識別之相同抗原結合。舉例而言，3F8單株抗體片段與3F8所識別的表位結合。術語「抗體片段」亦包括藉由結合至特定抗原以形成複合物而如同抗體一樣起作用的任何合成或基因工程化蛋白質。舉例而言，抗體片段包括由可變區組成的經分離之片段，諸如由重鏈及輕鏈之可變區組成的「Fv」片段；其中輕鏈與重鏈可變區藉由肽連接子連接的重組單鏈多肽分子(「scFv蛋白」)；以及由模擬高變區之胺基酸殘基組成的最小識別單元。
scFv 區域：由通常藉由連接子序列分隔之抗體輕(VL)及重(VH)鏈之可變區組成的單鏈多肽。VL及VH區之次序可改變，且具有VL-VH次序之scFv可在特異性無顯著變化之情況下變為具有VH-VL次序之scFv並不罕見。分隔VL及VH之連接子序列通常包含諸如G、S及T之小的疏水性胺基酸殘基或由該等殘基組成，且可具有5-50個胺基酸之大小。一種較佳連接子由四個甘胺酸及一個絲胺酸殘基或此類序列之重複，例如此序列之2、3、4或5次重複組成。
取代 ：以通常方式理解為多肽中之一個胺基酸殘基經不同胺基酸殘基置換。取代在本說明書及申請專利範圍中以格式[原始胺基酸][位置][新胺基酸]描述，且使用單字母代碼。在多於一種胺基酸為給定位置之可能的取代基之情形下，可能的取代基由逗號分隔。舉例而言，多肽之位置9之甘胺酸殘基經丙胺酸殘基取代記為G9A，且位置9之甘胺酸殘基經丙胺酸或纈胺酸取代記為G9A，V。
區域：意欲意謂具有由其胺基酸序列界定之自身結構及功能的多肽或多肽之一部分。多肽可為單區域多肽，其中單區域形成整個多肽，或多肽可為多區域多肽，其中該等區域排列為序列之獨立部分。對於多區域多肽，通常在區域之間提供連接子序列以確保區域之間的距離，使得各區域可在沒有來自多肽之其他部分(區域)之位阻的情況下摺疊且發揮其功能。
CDR ：互補決定區(Complementarity Determining Region，CDR)為抗體之可變區的一部分且對抗體之結合特異性至關重要。由二條重鏈及二條輕鏈組成之典型抗體具有6個CDR序列，三個在輕鏈可變區域(VL)中且三個在重鏈可變區域(VH)中。
醫藥組成物 ：如本文所用，術語「醫藥組成物」意欲意謂用於作為藥物或醫藥投予有需要之患者的組成物。醫藥組成物由醫藥級成分(例如，如歐洲藥典(European Pharmacopoeia)第10版中所描述)使用醫藥或藥劑師領域中已知的方法及技術製備。
較佳實施例之詳細說明
本發明之一些實施例提供於申請專利範圍中。
在一個實施例中，本發明係關於一種產生scFv區域之變異體的方法，scFv區域包含輕鏈可變區域(VL)、重鏈可變區域(VH)及VL與VH之間的一或多個雙硫鍵，該方法包含以下步驟： a.鑑別在VL與VH之間形成該一或多個雙硫鍵的半胱胺酸殘基；及 b.用不同於半胱胺酸之胺基酸取代步驟a.中所鑑別之形成該等雙硫鍵中之一或多者的該等半胱胺酸殘基。
根據本發明，步驟a.中所鑑別之雙硫鍵中之一者或全部可藉由用其他胺基酸取代形成該(等)鍵之半胱胺酸而移除。較佳用其他胺基酸取代形成雙硫鍵之二個半胱胺酸以避免任何自由半胱胺酸。
本發明係基於以下觀測結果：許多scFv區域及包含scFv區域之構築體可形成多聚體，諸如二聚體或三聚體；或多種形式之單體形式。此對於意欲用於醫藥用途之化合物而言不合乎需要，其中一般需要化合物之高均一性及純度。此外，與具有較高同質性之類似化合物相比，scFv區域及包含scFv區域之構築體的異質性使回收及純化複雜化。
諸位發明人已意識到，scFv之VH與VL之間的雙硫鍵引起多聚化(multimerization)及替代雙硫鍵結形成，導致觀測到scFv之多聚體及多種形式形成，且在VH與VL區域之間不具有雙硫鍵的scFv具有較低的形成多聚體之傾向，或多種形式可使用本發明方法提供。
所獲得之scFv與根據本發明方法衍生出變異體之scFv具有類似結合特性。熟習此項技術者將進一步意識到根據本發明衍生自scFv之變異體實際上本身亦為scFv。
在天然抗體中，VL及VH序列為免疫球蛋白輕鏈及重鏈之一部分，且在自然界中，輕鏈及重鏈藉由在與VL及VH序列相鄰之恆定區中發現的一或多個雙硫鍵連接。然而，由於scFv僅由藉由連接子連接之VL及VH序列組成，因此在與VL及VH序列相鄰之恆定區中發現且在天然抗體中連接含有VL及VH鏈之鏈的雙硫鍵不存在於scFv中，且因此慣例為在scFv中VL與VH序列之間引入雙硫鍵以改良scFv之穩定性。本發明係基於本發明人之認識，亦即在scFv之VH及VL區域之間引入的穩定雙硫鍵會導致異質性，此對於scFv之至少一些用途可能不利。
本領域已知VH及VL區域可在同一區域中之二個半胱胺酸殘基之間包含額外雙硫鍵(區域內雙硫鍵)，且諸位發明人已進一步意識到，與區域間雙硫鍵(VL區域與VH區域之間)形成對比，此等區域內雙硫鍵對於觀測到的異質性而言不重要，或至少較不重要。
在一個實施例中，本發明係關於一種產生scFv區域之變異體的方法，其中與原始scFv區域相比，該等變異體引起較少多聚體形成。
在另一實施例中，本發明係關於在VH與VL區域之間不具有雙硫鍵的scFv在包含scFv及額外區域之多肽構築體中的用途，其中該多肽構築體具有低的多聚化傾向，或與在scFv之VH與VL區域之間具有雙硫鍵且除此額外雙硫鍵以外具有相同序列之類似多肽相比至少較低的形成多聚體之傾向。
多聚體形成可使用此項技術中已知的用於確定分子量之技術，例如層析方法偵測。
在本發明之一個實施例中，多聚體形成係藉由SDS-PAGE凝膠電泳確定。
在本發明之一個實施例中，scFv區域為包含額外抗體片段之多肽的一部分。舉例而言，scFv可為除scFv區域之外亦包含以下中之一或多者的多肽之一部分：額外scFv區域、免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈、Fc區域、鉸鏈區等。
在一個較佳實施例中，scFv區域為雙特異性或多特異性抗體之一部分。此類雙特異性或多特異性抗體之一種形式為包含二條免疫球蛋白重鏈及二條融合多肽之鏈的雙特異性抗體，該融合多肽包含C端融合至scFv區域之免疫球蛋白輕鏈，其中第一結合特異性由免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變區提供，且第二結合特異性由scFv區域提供。
此類雙特異性或多特異性抗體之另一形式為包含二個或更多個scFv區域之多肽，各scFv區域提供結合特異性。
在一個實施例中，本發明係關於一種雙特異性或多特異性抗體，其進一步包含SADA區域，亦稱為四聚化區域。
自組裝及分解(self assembly and disassembly，SADA)區域為能夠取決於濃度在溶液中自發地組裝及分解的短胺基酸區域。包含SADA區域之複合物通常以至少二種不同形式，亦即高濃度下之四聚形式及低濃度下之單體形式存在。自組裝及分解(SADA)技術已揭露於WO 2018204873A1中，其以全文引用之方式併入。
SADA複合物可經設計，使得四聚形式具有遠高於腎清除極限之分子量且單體形式具有低於腎清除極限之分子量，意謂四聚形式將具有高血漿半衰期，因為其不排泄至尿液中，且單體形式具有低血漿半衰期，因為其排泄至尿液中。
根據本發明使用之較佳SADA區域包括包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之序列或與此等序列中之一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%序列一致性之序列的區域。
根據本發明使用之較佳SADA區域包括具有以下序列之區域： a. SEQ ID No. 5或與此序列的不同之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代的序列； b. SEQ ID No. 6或與此序列的不同之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代的序列； c. SEQ ID No. 7或與此序列的不同之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代的序列； d. SEQ ID No. 8或與此序列的不同之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代的序列； e. SEQ ID No. 9或與此序列的不同之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代的序列； f. SEQ ID No. 10或與此序列的不同之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代的序列； g. SEQ ID No. 11或與此序列的不同之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代的序列；或 h. SEQ ID No. 12或與此序列的不同之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代的序列。
根據本發明之較佳SADA區域為包含與SEQ ID NO: 5之胺基酸6-36具有至少80%序列一致性，且與SEQ ID NO:5之序列的不同之處在於一或多個取代之序列的區域，其中該區域維持二聚化或四聚化之能力。
熟習此項技術者可藉由簡單常規實驗容易地判定具有給定取代之此類區域是否維持二聚化或四聚化之能力，或在文獻，例如以引用之方式併入的J. Gencel-Augusto及G- Lozano; Genes & Development 34:1128-1146中找到此類資訊。
根據本發明之較佳SADA區域為胺基酸序列與SEQ ID NO: 5之胺基酸6-36之序列的不同之處在於1、2、3、4或5個選自以下取代之取代的區域： E6V，Q，K，G，D或A； Y7S，N，H，F，D或C； F8Y，V，S，L，I或C； T9S，P，N或A； L10V，I或F； Q11R，L，K，H或E； I12V，T，M，L或F； R13S，P，L，H，G或C； G14W，R或A； R15S，P，L，H，G或C； E16V，Q，K，G，D或A； F18Y，V，S，L，I或C； E19V，Q，K，G，D或A； M20V，T，R，L，K或I； F21L或I； R22L或G； E23V，Q，K，G，D或A； L24M； N25S，I或D； E26V，Q，K，G，D或A； A27V，T，S，G或D； L28W，V，M或F； E29Q，G或D； L30V，R，I，H或F； K31T，R，Q，N，M或E； D32Y，V，N，H，G或A； A33V，T，S，P，G或D； Q34R，L，K，H或E； 使用SEQ ID NO: 5之編號。
L24P取代完全消除四聚化且不應應用。
包含SEQ ID NO: 5之胺基酸6-36之序列的p53四聚化區域為較佳SADA區域。
本發明與SADA技術結合尤其適用，使用包含一或多個scFv及一個SADA區域之構築體，該構築體經構築以使得包含四個此類單體之四聚複合物具有高於腎清除極限之大小，而此類複合物之單體具有低於腎清除極限之大小。通常，包含一或多個scFv及一個SADA區域之此類構築體在單體形式中具有約50-60 kD之分子量。複合物將在以其四聚形式投予後結合至其目標，且未結合複合物將在血漿中分解且快速排泄，因為其大小低於腎清除極限。然而，若多肽之一部分形成由scFv之VH與VL之間的雙硫鍵介導之多聚體，則在理論上且視實際構築體而定，歸因於所形成之多聚體，經分解之複合物的清除可能較不有效。
因此，與SADA技術結合使用本發明以減少多聚體形成尤其有益。
在一個實施例中，本發明係關於一種包含VL及VH且能夠結合抗原之scFv區域，其中該scFv可根據如前述技術方案中任一項之方法獲得。較佳地，VH及VL不藉由任何雙硫鍵連接。
在一個實施例中，本發明之scFv區域進一步包含VH與VL之間的連接子。連接子有時亦稱為間隔子，係為了分隔單一蛋白質中之多個區域而創建之短胺基酸序列。連接子為此項技術中已知的且本發明不限於連接子之任何特定序列。一般而言，連接子之目的為連接及/或分隔複合物之不同元件，且通常主要由諸如甘胺酸、絲胺酸及蘇胺酸等小的親水性胺基酸構成。
在一個實施例中，本發明係關於一種能夠結合DOTA金屬螯合物之抗體或抗體片段，且包含： 6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 44-49之序列或與SEQ ID NO: 44-49之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其包含SEQ ID NO: 1之序列或與SEQ ID NO: 1具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列；及 VH序列，其包含SEQ ID NO: 2之序列或與SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列； 其中對應於SEQ ID NO: 1之位置111及SEQ ID NO: 2之位置45的胺基酸不為半胱胺酸。
能夠結合DOTA之抗體及抗體片段可衍生自經親和力成熟以增加對DOTA之親和力的鼠類抗體2D12.5 (WO 2010/099536)。當基於2D12.5產生scFv時，藉由在對應於SEQ ID NO: 3之位置111及179的位置插入半胱胺酸來產生穩定雙硫鍵。使此雙硫鍵穩定之scFv在若干輪中親和力成熟，產生許多對DOTA-金屬具有改良之親和力的經修飾之抗體，包括命名為C825之scFv (SEQ ID NO: 3)。所插入之雙硫鍵似乎已視為必需的，因為WO 2010/099526解釋自最後一次親和力成熟中出現的所有變異體因為其損失穩定雙硫鍵而經丟棄。
C825之後經頻繁使用，且已經人源化以獲得具有極佳DOTA-金屬結合特性之抗體，在向人類投予時產生較少不良反應，且似乎已維持位於對應的mC825 scFv SEQ ID NO: 3中之位置111與179之間的雙硫鍵不變。
現在諸位發明人出人意料地發現，位置111與179之間的雙硫鍵並非為獲得功能性抗體必選的，事實上，移除此雙硫鍵，包括對應於mC825 scFv (SEQ ID NO 3)之位置111及179的半胱胺酸係有利的。
scFv能夠結合DOTA金屬螯合物之事實意欲意謂scFv能夠以約10 -4M或更小，例如在10 -4M至10 -12M範圍內，例如在10 -5M至10 -10M範圍內，例如在10 -6M至10 -9M範圍內的結合常數Kd特異性結合DOTA金屬螯合物，尤其DOTA結合 175Lu。
在一個實施例中，本發明之scFv包含由SEQ ID NO: 1及2組成之VL及VH區域。
在一個實施例中，scFv包含SEQ ID NO: 4之序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列。
在一個實施例中，本發明之scFv區域能夠結合GD2，且包含： 6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 13-18之序列或與SEQ ID NO: 13-18之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其包含SEQ ID NO: 19之序列或與SEQ ID NO: 19具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列；及 VH序列，其包含SEQ ID NO: 20之序列或與SEQ ID NO: 20具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列； 其中對應於SEQ ID NO: 19之位置97及SEQ ID NO: 20之位置44的胺基酸不為半胱胺酸。
scFv能夠結合GD2之事實意欲意謂scFv能夠以約10 -4M或更小，例如在10 -4M至10 -12M範圍內，例如在10 -5M至10 -10M範圍內，例如在10 -6M至10 -9M範圍內的結合常數Kd特異性結合GD2。
在一個實施例中，本發明之scFv區域包含SEQ ID NO: 21之序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列。
在一個實施例中，本發明之scFv區域能夠結合CD38，且包含： 6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 22-27之序列或與SEQ ID NO: 22-27之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其包含SEQ ID NO: 28之序列或與SEQ ID NO: 28具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列；及 VH序列，其包含SEQ ID NO: 29之序列或與SEQ ID NO: 29具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列； 其中對應於SEQ ID NO: 28之位置100及SEQ ID NO: 29之位置44的胺基酸不為半胱胺酸。
scFv能夠結合CD38之事實意欲意謂scFv能夠以約10 -4M或更小，例如在10 -4M至10 -12M範圍內，例如在10 -5M至10 -10M範圍內，例如在10 -6M至10 -9M範圍內的結合常數Kd特異性結合CD38。
在一個實施例中，CDR序列由SEQ ID NO: 22-27組成。
在一個實施例中，本發明之scFv包含SEQ ID NO: 30之序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 30具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列。
在一個實施例中，本發明之scFv區域能夠結合CD20，且包含： 6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 31-36之序列或與SEQ ID NO: 31-36之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其包含SEQ ID NO: 37之序列或與SEQ ID NO: 37具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列；及 VH序列，其包含SEQ ID NO: 38之序列或與SEQ ID NO: 38具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列； 其中對應於SEQ ID NO: 37之位置99及SEQ ID NO: 38之位置44的胺基酸不為半胱胺酸。
scFv能夠結合CD20之事實意欲意謂scFv能夠以約10 -4M或更小，例如在10 -4M至10 -12M範圍內，例如在10 -5M至10 -10M範圍內，例如在10 -6M至10 -9M範圍內的結合常數Kd特異性結合CD20。
較佳地，CDR序列由SEQ ID NO: 31-36組成。
在一個實施例中，本發明之scFv包含SEQ ID NO: 39之序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 39具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列。
在一個實施例中，本發明之scFv區域能夠結合GPA33，且包含： 6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 50-55之序列或與SEQ ID NO: 50-55之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其具有SEQ ID NO: 56之序列或與SEQ ID NO: 56具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列，其中位置44之胺基酸不為半胱胺酸；及 VH序列，其具有SEQ ID NO: 57之序列或與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列，其中位置100之胺基酸不為半胱胺酸。
此實施例之scFv可包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 61之序列，或與SEQ ID NO: 61具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列。
在一個實施例中，本發明之scFv能夠結合RSV且包含 6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 62之胺基酸26-35、53-59、98-109、177-181、199-201及238-246或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其具有SEQ ID NO: 62之胺基酸1-120的序列或與SEQ ID NO: 62之胺基酸1-120具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列；及 VH序列，其具有SEQ ID NO: 62之胺基酸151-256的序列或與SEQ ID NO: 62之胺基酸151-256具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列； 其中VL及VH不藉由雙硫鍵連接。
在一個實施例中，本發明之scFv能夠結合B7H3且包含 6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 63之胺基酸26-33、51-58、97-107、175-180、198-200及237-245或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其具有SEQ ID NO: 63之胺基酸149-255的序列或與SEQ ID NO: 63之胺基酸149-256具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列；及 VH序列，其具有SEQ ID NO: 63之胺基酸1-118的序列或與SEQ ID NO: 63之胺基酸1-118具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列； 其中VL及VH不藉由雙硫鍵連接。
在一個實施例中，本發明之scFv能夠結合HER2且包含 6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 64之胺基酸27-32、50-52、89-97、164-171、189-196及235-247或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其具有SEQ ID NO: 64之胺基酸1-108的序列或與SEQ ID NO: 64之胺基酸1-108具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列；及 VH序列，其具有SEQ ID NO: 64之胺基酸138-258的序列或與SEQ ID NO: 64之胺基酸138-256具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列； 其中VL及VH不藉由雙硫鍵連接。
在一個實施例中，本發明之scFv能夠結合HER2且包含 6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 66之胺基酸26-33、51-58、97-108、176-181、199-201及238-246或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其具有SEQ ID NO: 66之胺基酸150-256的序列或與SEQ ID NO: 66之胺基酸150-256具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列；及 VH序列，其具有SEQ ID NO: 66之胺基酸1-119的序列或與SEQ ID NO: 66之胺基酸1-119具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列； 其中VL及VH不藉由雙硫鍵連接。
在一個實施例中，本發明之scFv能夠結合DOTAM且包含 6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 68之胺基酸302-310、327-333、372-387、455-462、480-482及519-530或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成； VL序列，其具有SEQ ID NO: 68之胺基酸429-540的序列或與SEQ ID NO: 68之胺基酸429-540具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列；及 VH序列，其具有SEQ ID NO: 68之胺基酸278-398的序列或與SEQ ID NO: 68之胺基酸278-398具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的序列； 其中VL及VH不藉由雙硫鍵連接。
在一個實施例中，本發明係關於包含第一及第二結合位點之雙特異性抗體，其中第一及第二結合位點中之至少一者為在VH與VL區域之間不包含雙硫鍵的scFv。
雙特異性抗體之若干形式為此項技術中已知的且本發明不限於任何特定此類形式。雙特異性抗體之一個實例為包含二條抗體重鏈及二個融合多肽的抗體，該等融合多肽包含抗體輕鏈，其中scFv序列融合至輕鏈之C端。雙特異性抗體之另一實例為包含二個或更多個彼此串聯連接之scFv序列的分子。
在一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包含不包含連接VH及VL之雙硫鍵的第一scFv區域及/或不包含連接VH及VL之雙硫鍵的第二scFv區域。
在一個實施例中，本發明之雙特異性抗體進一步包含一或多個連接子序列。
在一個較佳實施例中，本發明係關於一種雙特異性抗體，其包含能夠結合螯合劑之第一scFv區域、能夠結合腫瘤抗原之第二scFv區域及SADA區域，其中第一scFv區域及/或第二scFv區域在VH與VL區域之間包含/不包含雙硫鍵。較佳地，第一及第二scFv為本發明之scFv。腫瘤抗原可為已知主要存在於腫瘤細胞表面上，尤其實體腫瘤表面上的任何抗原。
此類腫瘤抗原之實例包括：HER2、B7-H3、CA6、CD138、CD20、CD19、CD22、CD27L、CD30、CD33、CD37、CD38、CD47、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79b、EGFR、EGFRvIII、FRα、GCC、GPNMB、間皮素、MUC16、NaPi2b、連接蛋白(Nectin) 4、PSMA、STEAP1、Trop-2、5T4、AGS-16、αvβ6、CA19.9、CAIX、CD138、CD174、CD180、CD227、CD326、CD79a、CEACAM5、CRIPTO、DLL3、DS6、內皮素B受體、FAP、GD2、間皮素、PMEL 17、SLC44A4、TENB2、TIM-1、CD98、內皮唾酸蛋白(Endosialin)/CD248/TEM1、纖維連接蛋白(Fibronectin)胞外區域B、LIV-1、黏蛋白1、p-鈣黏蛋白、骨膜蛋白(peritosin)、Fyn、SLTRK6、肌腱蛋白(Tenascin) c、VEGFR2及PRLR。
腫瘤抗原之較佳實例包括GD2、CD38、B7-H3、CD33、GPA33。
GD2係在神經外胚層來源之腫瘤，諸如神經母細胞瘤及黑色素瘤上表現的雙唾液酸神經節苷脂。正常組織上之表現高度受限。
CD38，亦稱為環狀ADP核糖水解酶，可見於許多免疫細胞，包括CD4 +、CD8 +、B淋巴球及自然殺手細胞之表面上。骨髓瘤細胞上之表現極高。
B7-H3，亦即B7同源物3，亦稱為CD276，係以二種異型體存在之第I型跨膜蛋白。其在正常組織中具有有限表現且在許多不同癌症類型(例如神經母細胞瘤)上以高頻率表現。
CD33，亦稱為唾液酸結合類Ig凝集素3，係細胞表面抗原。其在骨髓譜系之細胞上表現。其可在漿細胞骨髓瘤之一些病例中異常表現。
GPA33，亦即醣蛋白33，係在大於95%之人類大腸癌中表現之細胞表面抗原。
能夠結合螯合劑或結合金屬離子之螯合劑的結合位點可為此項技術中已知的任何此類結合位點。螯合劑之較佳實例包括DOTA、DOTAM及此等之變異體。能夠結合螯合劑或結合金屬離子之螯合劑的適合結合位點之實例可見於WO 2010/099539，其揭露能夠結合DOTA或DOTA衍生物之結合位點且該等結合位點基於抗體2D12.5；及WO 2019/201959，其揭露能夠結合DOTAM之兔抗體，該等專利以引用之方式併入。
在一個實施例中，本發明之雙特異性抗體進一步包含SADA區域。
較佳地，本發明之雙特異性抗體包含： a.能夠結合螯合劑之第一scFv結合位點； b.能夠結合腫瘤抗原之第二scFv結合位點；及 c. SADA區域。
在一個實例中，本發明之雙特異性抗體包含： a.第一scFv結合位點，其能夠結合DOTA金屬螯合物且包含SEQ ID NO: 1之VL序列及SEQ ID NO: 2之VH序列； b.能夠結合腫瘤抗原之第二scFv結合位點；及 c. SADA區域。
在另一實例中，本發明之雙特異性抗體包含： a.第一scFv結合位點，其能夠結合DOTAM金屬螯合物且包含SEQ ID NO: 68之胺基酸429-540的VL序列及SEQ ID NO: 68之胺基酸278-398的VH序列； b.能夠結合腫瘤抗原之第二scFv結合位點；及 c. SADA區域。
本發明之雙特異性抗體的較佳實例包括包含以下序列中之一者或由以下序列中之一者組成的雙特異性抗體：SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68或SEQ ID NO: 69。
在一個實施例中，本發明係關於包含本發明之scFv或雙特異性抗體的組成物。較佳地，組成物為醫藥組成物。
在一個實施例中，本發明係關於本發明之雙特異性抗體用於診斷或治療癌症之用途。
癌症較佳為實體癌症或腫瘤。
在一個實施例中，本發明係關於根據本發明之雙特異性抗體在包含以下步驟之方法中的用途： a.向有需要之患者投予雙特異性抗體；及 b.在保持期之後，投予DOTA、DOTAM或其衍生物； 其中DOTA、DOTAM或其衍生物結合放射核種。
在一個實施例中，本發明係關於根據本發明之包含能夠結合DOTA-金屬或DOTAM-金屬之第一scFv、能夠結合腫瘤抗原之第二scFv及SADA區域的雙特異性抗體在包含以下步驟之方法中的用途： a.向有需要之患者投予雙特異性抗體；及 b.在保持期之後，投予DOTA、DOTAM或其衍生物； 其中DOTA、DOTAM或其衍生物結合放射核種。
在此實施例中，包含能夠結合DOTA-金屬、DOTAM-金屬或其衍生物之第一scFv、能夠結合腫瘤抗原之第二scFv及SADA區域的雙特異性抗體較佳以四聚形式投予。
保持期應經選擇，以便提供足以允許雙特異性抗體找到且結合至腫瘤抗原且允許呈四聚形式之未結合雙特異性抗體分解成單體形式且藉此自血流快速清除的時間。
保持期可在48-96小時範圍內選擇。
在一個實施例中，該方法進一步包含在步驟a之後且在步驟b之前投予清除劑。
在本發明之一個實施例中，DOTA或其衍生物係選自DOTA、苯甲基DOTA及雙螯合化合物 其中X 1、X 2、X 3及X 4各自獨立地為一孤對電子(亦即提供一氧陰離子)或H； X 5、X 6及X 7各自獨立地為一孤對電子(亦即提供一氧陰離子)或H； Y 1為O或S；且 n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22；且 M1係選自 175Lu 3 +、 45Sc 3 +、 69Ga 3 +、 71Ga 3 +、 89Y 3 +、 113In 3 +、 115In 3 +、 139La 3 +、 136Ce 3 +、 138Ce 3 +、 140Ce 3 +、 142Ce 3 +、 151Eu 3 +、 153Eu 3 +、 159Tb 3 +、 154Gd 3 +、 155Gd 3 +、 156Gd 3 +、 157Gd 3 +、 158Gd 3 +或 160Gd 3 +； M2係選自放射核種。
在一個實施例中，放射核種係選自由以下組成之群： 211At、 51Cr、 57Co、 58Co、 67Cu、 152Eu、 67Ga、 111In、 59Fe、 212Pb、 177Lu、 223Ra、 224Ra、 186Re、 188Re、 75Se、 99mTc、 227Th、 89Zr、 90Y、 94mTc、 64Cu、 68Ga、 66Ga、 86Y、 82Rb、 110mIn、 209Bi、 211Bi、 212Bi、 213Bi、 210Po、 211Po、 212Po、 214Po、 215Po、 216Po、 218Po、 211At、 215At、 217At、 218At、 221Fr、 223Ra、 224Ra、 226Ra、 225Ac、 227Ac、 227Th、 228Th、 229Th、 230Th、 232Th、 231Pa、 233U、 234U、 235U、 236U、 238U、 237Np、 238Pu、 239Pu、 240Pu、 244Pu、 241Am、 244Cm、 245Cm、 248Cm、 249Cf及 252Cf，較佳選自 177Lu、 99mTc、 64Cu及 89Zr。
結合放射核種之螯合劑，諸如結合至放射核種之DOTA或DOTAM或其任何衍生物；可投予二次或甚至更多次。當結合放射核種之螯合劑投予超過一次時，建議個別投予間隔24小時或更長時間。
結合放射核種之螯合劑的二次或更多次投予可使用相同放射核種，或可針對各投予使用不同放射核種。
此類重複投予結合放射核種之螯合劑，諸如結合放射核種之DOTA或其衍生物；已關於GD2-SADA揭露於WO 2021/242848 (以引用之方式併入)中，然而，諸位發明人已意識到，使用螯合劑(諸如DOTA)之重複投予的方法；結合放射核種不一定限於GD2-SADA，而是可應用於本發明之雙特異性抗體。
在一個實例中，向需要此類治療或診斷之患者投予能夠結合腫瘤抗原的本發明之雙特異性抗體；48小時後，向患者投予結合α-發射體之螯合劑，在投予結合α-發射體之螯合劑後24小時，投予結合β-發射體之螯合劑的第二次投予。藉由使用此類方法，使用α-發射體治療之益處及β-發射體之益處得到結合。
在另一實例中，向需要此類治療或診斷之患者投予能夠結合腫瘤抗原的本發明之雙特異性抗體；48小時後，向患者投予結合適合於PET或SPECT掃描之放射核種的螯合劑，且進行PET或SPECT掃描。視掃描結果而定，可藉由在第一次投予結合放射核種之螯合劑後24小時投予結合適合於治療癌症之放射核種的螯合劑來起始治療程序，且可甚至藉由投予第二或後續劑量的適合於治療癌症之放射核種來繼續治療。
因此，一個實施例，本發明係關於根據本發明之雙特異性抗體在包含以下步驟之方法中的用途： a.向有需要之患者投予雙特異性抗體；及 b.在保持期之後，投予結合放射核種之螯合劑， c.在另一保持期之後，投予結合放射核種之螯合劑；及 d.任擇地重複步驟c.一或多次。
在一個實施例中，該方法進一步包含偵測放射核種之定位。偵測可使用用於偵測放射核種之熟知方法及設備，諸如PET或SPECT掃描器來進行。
在一個實施例中，癌症係選自骨肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、平滑肌肉瘤、梭狀細胞肉瘤、腦瘤、小細胞肺癌、視網膜母細胞瘤、HTLV-1感染之T細胞白血病。
本發明進一步關於包含根據本發明之雙特異性抗體的套組。較佳地，套組進一步包含螯合劑，諸如DOTA、DOTAM或DOTA之衍生物。
套組可進一步包含使用說明書或此類說明書之鏈結。
本發明之scFv區域及/或雙特異性抗體可使用此項技術中已知的方法製備。
提供本發明之scFv區域及/或雙特異性抗體的一種較佳方法係提供編碼所需scFv或雙特異性抗體之聚核苷酸，為該聚核苷酸提供適合的調控序列，諸如啟動子、終止子、強化子、核糖體結合位點、Kozak序列、聚腺苷酸化位點等；將構築體插入適合的宿主細胞中，該宿主細胞隨後在引起所需scFv或雙特異性抗體表現之條件下生長。
聚核苷酸序列可使用此項技術中已知的技術，例如使用PCT技術組裝，或可合成，例如使用商業提供此類序列。
因此，在一個實施例中，本發明係關於編碼本發明之scFv區域或雙特異性抗體的聚核苷酸；包含此類聚核苷酸序列之表現載體或構築體，或包含該聚核苷酸、表現載體或構築體之宿主細胞。
在一個實施例中，本發明係關於一種產生本發明之scFv或雙特異性抗體的方法，其包含以下步驟： a.提供包含編碼本發明之scFv或雙特異性抗體之聚核苷酸、表現載體或構築體的宿主細胞； b.使宿主細胞在誘導scFv或雙特異性抗體表現之條件下生長；及 c.自生長培養液回收該scFv或該雙特異性抗體。
序列 SEQ ID NO: 1：本發明之DOTA-金屬結合抗體的VL胺基酸序列； SEQ ID NO: 2：本發明之DOTA-金屬結合抗體的VH胺基酸序列； SEQ ID NO: 3：mC825之胺基酸序列； SEQ ID NO:4：本發明之huC825 scFv (不具有雙硫鍵)的胺基酸序列； SEQ ID NO: 5-12：SADA區域之胺基酸序列； SEQ ID NO: 13-18展示GD2 scFv之CDR序列； SEQ ID NO: 19：GD2 scFv之VL序列； SEQ ID NO: 20：GD2 scFv之VH序列； SEQ ID NO: 21：不具有半胱胺酸之GD2 scFv； SEQ ID NO:22-27展示CD38 scFv之CDR序列； SEQ ID NO: 28：抗CD38 scFv之VL序列； SEQ ID NO: 29：抗CD38 scFv之VH序列； SEQ ID NO: 30展示不具有半胱胺酸之抗CD38的胺基酸序列； SEQ ID NO: 31-36展示抗CD20 scFv之CDR序列； SEQ ID NO: 37：抗CD20 scFv之VL序列； SEQ ID NO: 38：抗CD20 scFv之VH序列； SEQ ID NO: 39展示不具有半胱胺酸之抗CD20 scFv的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 40：展示不具有雙硫鍵之GD2-SADA構築體的胺基酸序列； SEQ ID NO: 41：展示不具有雙硫鍵之CD38-SADA構築體的胺基酸序列； SEQ ID NO: 42：展示不具有雙硫鍵之CD20-SADA構築體的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 43：展示具有雙硫鍵之GD2-SADA構築體的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 44-49展示C825之CDR序列 SEQ ID NO: 50-55：抗GPA33之CDR序列 SEQ ID NO: 56：抗GPA33之VL序列 SEQ ID NO: 57：抗GPA33之VH序列 SEQ ID NO: 58：不具有半胱胺酸之GPA33-SADA構築體 SEQ ID NO: 59：在DOTA scFv中具有半胱胺酸之GPA33-SADA構築體 SEQ ID NO: 60：在DOTA scFv及GPA33 scFv中具有半胱胺酸之GPA33-SADA構築體 SEQ ID NO: 61：不具有半胱胺酸之GPA33 scFv SEQ ID NO: 62：展示在VL與VH序列之間不具有雙硫鍵之RSV-SADA構築體的胺基酸序列。胺基酸1-120為抗RSV scFv之VH序列，胺基酸151-256為抗RSV scFv之VL序列。抗RSV scFv之輕鏈CDR序列為SEQ ID NO: 62之胺基酸177-181、199-201及238-246；且抗RSV scFv之重鏈CDR序列為SEQ ID NO: 62之胺基酸26-35、53-59及98-109。 SEQ ID NO: 63：展示在VL與VH序列之間不具有雙硫鍵之B7H3-SADA構築體的胺基酸序列。胺基酸1-118為抗B7H3之VH序列，胺基酸149-255為抗B7H3 scFv之VL序列。抗B7H3 scFv之輕鏈CDR序列為SEQ ID NO: 63之胺基酸175-180、198-200及237-245；且抗B7H3 scFv之重鏈CDR序列為SEQ ID NO: 63之胺基酸26-33、51-58及97-107。 SEQ ID NO: 64：展示基於曲妥珠單抗，在VL與VH序列之間不具有雙硫鍵的HER2-SADA構築體TR-4 (抗HER2 (VL-VH)×抗DOTA (VH-VL))之胺基酸序列。胺基酸1-108為HER2 scFv之VL序列，胺基酸138-258為抗HER2 scFv之VH序列。抗HER2 scFv之輕鏈CDR序列為SEQ ID NO: 64之胺基酸27-32、50-52及89-97；且抗HER2 scFv之重鏈CDR序列為SEQ ID NO: 64之胺基酸164-171、189-196及235-247。 SEQ ID NO: 65：展示基於曲妥珠單抗，在VL與VH序列之間不具有雙硫鍵的HER2-SADA構築體TR-7 (抗HER2 (VH-VL)×抗DOTA (VH-VL))之胺基酸序列。胺基酸1-120為抗HER2 scFv之VH序列，胺基酸151-258為抗HER2 scFv之VL序列。 SEQ ID NO: 66：展示基於帕妥株單抗，在VL與VH序列之間不具有雙硫鍵的HER2-SADA構築體PE-1 (抗HER2 (VH-VL)×抗DOTA (VH-VL))之胺基酸序列。胺基酸1-119為抗HER2 scFv之VH序列，胺基酸150-256為抗HER2 scFv之VL序列。抗HER2 scFv之輕鏈CDR序列為SEQ ID NO: 66之胺基酸176-181、199-201及238-246；且抗HER2 scFv之重鏈CDR序列為SEQ ID NO: 66之胺基酸26-33、51-58及97-108。 SEQ ID NO: 67：展示基於帕妥株單抗，在VL與VH序列之間不具有雙硫鍵的HER2-SADA構築體PE-3 (抗HER2 (VL-VH)×抗DOTA (VH-VL))之胺基酸序列。胺基酸1-107為抗HER2 scFv之VL序列，胺基酸138-256為抗HER2 scFv之VH序列。 SEQ ID NO: 68：展示在VL與VH序列之間不具有雙硫鍵的CD20-DOTAM-SADA構築體Ri-12 (抗CD20 (VL-VH)×抗DOTAM (VH-VL))之胺基酸序列。胺基酸278-398為抗DOTAM scFv之VH序列；胺基酸429-540為抗DOTAM scFv之VL序列。抗DOTAM scFv之輕鏈CDR序列為SEQ ID NO: 68之胺基酸455-462、480-482及519-530；且抗DOTAM scFv之重鏈CDR序列為SEQ ID NO: 68之胺基酸302-310、327-333及372-387。 SEQ ID NO: 69：展示在VL與VH序列之間不具有雙硫鍵的CD20-DOTAM-SADA構築體Ri-13 (抗CD20 (VL-VH)×抗DOTAM (VL-VH))之胺基酸序列。胺基酸278-389為抗DOTAM scFv之VL序列，胺基酸420-540為抗DOTAM scFv之VH序列。
所引述之全部參考文獻均以引用之方式併入本文中。
附圖及實例係為了解釋而非限制本發明而提供。熟習此項技術者將瞭解，本發明之態樣、實施例、申請專利範圍及任何項目可以組合。
除非另外提及，否則所有百分比均以重量/重量計。除非另外提及，否則所有量測皆在標準條件(環境溫度及壓力)下進行。除非另外提及，否則測試條件係根據歐洲藥典8.0。 實例材料及方法：
蛋白質之產生： 合成所欲蛋白質之核苷酸序列，包括用於引導表現之調控序列，且將其插入表現載體中。
將表現載體轉染至CHO細胞中且使轉型體在用於表現蛋白質之標準培養基中生長，隨後自培養液回收蛋白質。
SDS-PAGE凝膠電泳： 預鑄造凝膠Thermo Fisher Bolt Bis-Tris 4-12%凝膠由Thermo Fisher Scientific, MA USA提供，且根據製造商說明書使用。在電泳之後，使用製造商說明書，用考馬斯染色凝膠。 實例 1 ： GD2 - SADA 中之雙硫鍵交聯
製備且純化具有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的GD2-SADA構築體。
GD2-SADA構築體包含GD2 scFv (胺基酸編號：1-252)、DOTA結合scFv (胺基酸275-533)及SADA區域(胺基酸545-583)。構築體包含GD2 scFv之VH與VL之間由半胱胺酸C97及C179形成的雙硫鍵，及DOTA結合scFv之VH與VL之間由半胱胺酸C369及C513形成的一個雙硫鍵。
使用SE-HPLC分析經純化之構築體(參見圖1)，且發現其主要呈四聚形式，然而，峰看起來寬且觀測到高分子肩峰，表明峰中可能存在一些不均勻性。
為了解決不均質性，製備GD2-SADA之截短型式，稱為GD2-SADA減P53區域，其中分子在胺基酸G533後截短，意謂SADA區域損失。
亦藉由SE-HPLC分析截短形式，參見圖2。如所預期，截短形式因缺乏SADA區域而缺乏四聚化之能力，因此發現大部分為單體，但在層析圖處亦可發現一些二聚體、三聚體及四聚體(參見圖2)。
實驗展示GD2-SADA構築體形成多聚體，主要為二聚體，且多聚化並非僅由SADA區域引起。 實例 2 ：多聚體之 SDS - PAGE 分析
藉由SDS-PAGE層析進一步分析實例1中所製備之GD2-SADA構築體及截短形式，參見圖3。
GD2-SADA及截短GD2-SADA在非還原條件下分離且始終展示多聚體，尤其二聚體及三聚體之存在。當在還原條件下分析截短形式時，所有形式均崩潰成單體形式，證實觀所測到的多聚化係由雙硫鍵引起。 實例 3 ： CD20 - SADA
在此實例中，產生能夠結合CD20及DOTA之雙特異性抗體的變異體。抗CD20位點在VH及VL區之次序方面變化且具有或不具有連接VH及VL之雙硫鍵。DOTA結合位點為SEQ ID NO: 4中所揭露之scFv且SADA區域為SEQ ID NO: 5中所揭露之區域。
抗CD20 scFv之VL序列的胺基酸序列揭露於SEQ ID NO: 37中，且為了形成不具有雙硫鍵之抗CD20 scFv，位置99之半胱胺酸經甘胺酸(G)取代。抗CD20 scFv之VH序列的胺基酸序列揭露於SEQ ID NO: 38中，且為了形成不具有雙硫鍵之抗CD20 scFv，位置44之半胱胺酸經甘胺酸(G)取代。
構築體Ri-3A之序列揭露於SEQ ID NO: 39中。 產生以下構築體
抗CD20 抗DOTA SADA
Ri-1A VH-VL方向，VH與VL之間無雙硫鍵 VH-VL方向，VH與VL之間無雙硫鍵 P53區域(SEQ ID NO: 5)
Ri-2A VH-VL方向，VH與VL之間一個雙硫鍵 VH-VL方向，VH與VL之間無雙硫鍵 P53區域(SEQ ID NO: 5)
Ri-3A VL-VH方向，VH與VL之間無雙硫鍵 VH-VL方向，VH與VL之間無雙硫鍵 P53區域(SEQ ID NO: 5)
Ri-4A VH-VL方向，VH與VL之間一個雙硫鍵 VH-VL方向，VH與VL之間無雙硫鍵 P53區域(SEQ ID NO: 5)
四種構築體在還原及非還原條件下在SDS-PAGE上分離(參見圖4)。
該圖展示在非還原條件下，在VH與VH之間包含雙硫鍵的構築體(Ri-2A及Ri-4A)形成高分子量多聚體，且在VH與VH之間不具有雙硫鍵的構築體(Ri-1A及Ri-3A)中多聚體含量強烈減少或甚至不存在。
在還原條件下，所有四種構築體崩潰成單體形式。 實例 4 ： CD38 - SADA
在此實例中，產生能夠結合CD38及DOTA之雙特異性抗體的變異體。DOTA結合位點係基於SEQ ID NO: 3中所揭露之scFv且為SEQ ID NO: 4中所揭露之scFv。DOTA結合位點在含有位置111及194之半胱胺酸的VH及VL之間包含一個雙硫鍵。SADA區域為SEQ ID NO: 5中所揭露之區域。
抗CD38 scFv之VL序列的胺基酸序列揭露於SEQ ID NO: 28中，且為了形成不具有雙硫鍵之抗CD38 scFv形成，位置100之半胱胺酸經麩醯胺酸(Q)取代。VH序列之胺基酸序列揭露於SEQ ID NO: 29中，且為了形成不具有雙硫鍵之抗CD38 scFv，位置44之半胱胺酸經甘胺酸(G)取代。 產生以下構築體
抗CD38 scFv 抗DOTA SADA
YMS9a 含有一個VH-VL雙硫鍵 含有一個VH-VL雙硫鍵 P53區域(SEQ ID NO: 5)
YMS9c 含有一個VH-VL雙硫鍵 不具有VH-VL雙硫鍵 P53區域(SEQ ID NO: 5)
YMS9d 不具有VH-VL雙硫鍵 不具有VH-VL雙硫鍵 P53區域(SEQ ID NO: 5)
在非還原SDS-PAGE上分析構築體，參見圖5。
結果展示YMS9a及YMS9c含有大量多聚體，而YMS9d中多聚體之量顯著減少或不存在。
結果亦展示YMS9a及YMS9c引起單體條帶中之一些不均勻性。不均勻性在還原條件下消失。
藉由在非還原及還原條件下，將各種量3.2 µg、1.6 µg、1.1 µg及0.5 µg負載於SDS-PAGE凝膠上，進一步分析YMS9d產物。結果示於圖6中，展示蛋白質在還原及非還原條件均溶離為單一條帶，且僅在具有高蛋白質負載之泳道中可在非還原條件下看見數個額外模糊條帶。 實例 5 ：藉由 SPR 測定之 CD38 - SADA 活體外效力
在此實例中，藉由SPR分析測試本發明之SADA構築體的結合特性。
藉由SPR分析來分析根據實例4製備之YMS9a (在DOTA結合位點之VL與VH之間具有雙硫鍵且在CD38結合位點之VL與VH之間具有雙硫鍵)及YMS9d (在VL與VH之間不具有雙硫鍵)與DOTA之結合及與CD38之結合。
結果展示YMS9a與YMS9d之間的活體外結合功效無顯著差異。 實例6 . 不具有鏈間DS 鍵之CD38 -SADA 的HMW 形式
化合物YMS9d如實例4中所製備，且製備10 mg/ml之溶液。在製備溶液之後，使其在室溫下平衡3小時。藉由SE-HPLC分析溶液。
將儲備溶液之樣品濃縮至20 mg/ml。在製備溶液之後，使其在室溫下平衡3小時。藉由SE-HPLC分析溶液。
將10 mg/ml溶液及20 mg/ml溶液各自稀釋至1 mg /ml。在製備溶液之後，使其在室溫下平衡3小時。藉由SE-HPLC分析溶液。
結果示於圖7中，且展示化合物在高濃度下形成高分子量形式(圖7中圈出之峰)，且幾乎所有此等高分子形式在稀釋後分解成四聚體。 實例 7 . 藉由 SPR 測定之 CD38 及 Lu - DOTA 結合
藉由SPR分析如實例6中所描述自10 mg/ml及20 mg/ml溶液稀釋之樣品的結合特性。結果展示於下表中： 與CD38之結合
樣品 Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM)
自10 mg/ml稀釋 1.4×10 5 1.1×10 -3 7.5
自20 mg/ml稀釋 1.3×10 5 1.1×10 -3 8.1
與Lu-DOTA之結合
樣品 Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM)
自10 mg/ml稀釋 8.9×10 4 2.1×10 -3 2.4
自20 mg/ml稀釋 8.6×10 4 2.0×10 -3 2.3
結果展示HMW形式之形成及後續分解不顯著改變結合特性。 實例 8 ： CD38 - SADA 與達烏迪細胞 (Daudi cell ) 之活體外結合
在此實例中使用在CD38 scFv之VH與VL鏈之間包含一個雙硫鍵的化合物YMS9c，及在VH與VL之間不具有任何雙硫鍵的YMS9d。如實例4中所描述製備化合物。 化合物經 125I標記且與達烏迪細胞一起培育，達烏迪細胞包含暴露於其表面上之CD38抗原。培育之後，沖洗細胞且計算結合至細胞之放射性：
YMS9c (CD38 scFv中有雙硫鍵) YMS9d (VH與VL之間無雙硫鍵)
Bmax (cpm) 462617 679547
結果展示，不具有VH-VL雙硫鍵之YMS9d；與在抗CD38位點上具有雙硫鍵之YMS9c相比具有較高結合。 實例 9 ：攜帶達烏迪之小鼠中的生物分佈 ( 活體內 )
向攜帶達烏迪腫瘤之小鼠給予10 mg/kg如實例4中所製備之在CD38 scFv中之VH與VL鏈之間包含一個雙硫鍵的YMS9c，及在VH與VL之間不具有任何雙硫鍵的YMS9d。
在投予CD38-SADA化合物後48 h，向小鼠投予5 MBq 177Lu-DOTA/ 177Lu-Bn-DOTA。
在投予放射性後2小時及24小時，藉由將一些小鼠(n=4)安樂死及解剖且計算以下選定組織中發現的放射性之量來確定生物分佈：血液、腫瘤及腎臟。 計算腫瘤:血液比率：
YMS9c (CD38 scFv中有雙硫鍵) YMS9d (CD38 scFv中無雙硫鍵)
2 h 24 h 2 h 24 h
腫瘤:血液 0.389 8.345 1.989 62.218
實例展示與在CD38 scFv之VH與VL之間具有雙硫鍵的結合物相比，在VL與VH之間不具有雙硫鍵的CD38-SADA結合物的腫瘤:血液吸收較高。 實例 10 ： RSV - SADA
在此實例中，產生能夠結合RSV及DOTA之雙特異性抗體的變異體。DOTA結合位點為SEQ ID NO: 4中所揭露之scFv且SADA區域為SEQ ID NO: 5中所揭露之區域。
產生二種型式之RSV-SADA結合物，一種型式，亦即PalDOT-SAD，在RSV結合scFv之VL與VH之間具有雙硫鍵；及一種型式，亦即PA-3A，在RSV結合scFv之VL與VH之間不具有雙硫鍵。
構築體PA-3A之序列揭露於SEQ ID NO: 62中。
二種構築體經表現且在非還原SDS-PAGE凝膠上電泳，如圖8中所示，其中泳道2為PA-3A且泳道4為PalDOT-SAD。結果展示在VH與VL之間不具有雙硫鍵之構築體以單一離散條帶形式電泳，而在抗RSV scFv中之VH與VL之間具有一個雙硫鍵的型式展示存在若干條帶。 實例 11 ： B7H3 - SADA
在此實例中，產生能夠結合B7H3及DOTA之雙特異性抗體的變異體。DOTA結合位點為SEQ ID NO: 4中所揭露之scFv且SADA區域為SEQ ID NO: 5中所揭露之區域。
產生二種型式之B7H3-SADA結合物，一種型式，亦即3BH-4，在B7H3結合scFv之VL與VH之間具有雙硫鍵；及一種型式，亦即3BH-5，在B7H3結合scFv之VL與VH之間不具有雙硫鍵。
構築體3BH-5之序列揭露於SEQ ID NO: 63中。
二種構築體經表現且在非還原SDS-PAGE凝膠上電泳，如圖9中所示，其中泳道2為3BH-5且泳道4為3BH-4。結果展示在VH與VL之間不具有雙硫鍵的構築體以單一離散條帶形式電泳，而在抗B7H3 scFv中之VH與VL之間具有一個雙硫鍵的型式展示存在至少一個較高分子量條帶。 實例 12 ： HER2 - SADA
在此實例中，產生能夠結合HER2及DOTA之雙特異性抗體的變異體。SADA區域為SEQ ID NO: 5中所揭露之區域。
產生八種型式之HER2-SADA結合物，一個系列(TR系列)，使用衍生自臨床抗體曲妥珠單抗之抗HER2 scFv，具有四種構築體：
名稱 設計 抗腫瘤DS 抗DOTA DS
TR-3 抗HER2(VL-VH)×抗DOTA (VH-VL) 是 是
TR-4 抗HER2(VL-VH)×抗DOTA (VH-VL) 否 否
TR-7 抗HER2(VH-VL)×抗DOTA (VH-VL) 否 否
TR-8 抗HER2(VH-VL)×抗DOTA (VH-VL) 否 是
以及一個系列(PE系列)，使用衍生自臨床抗體之抗HER2 scFv；帕妥株單抗，具有四種構築體：
名稱 設計 抗腫瘤DS 抗DOTA DS
PE-1 抗HER2(VH-VL)×抗DOTA (VH-VL) 否 否
PE-2 抗HER2(VH-VL)×抗DOTA (VH-VL) 否 是
PE-3 抗HER2(VL-VH)×抗DOTA (VH-VL) 否 否
PE-4 抗HER2(VL-VH)×抗DOTA (VH-VL) 否 是
TR系列之構築體與PE系列之構築體的不同之處在於，TR系列中之抗HER2 scFv位點的VH及VL序列不同於PE系列中之抗HER2 scFv位點的VH及VL序列。
構築體TR-4之序列揭露於SEQ ID NO: 64中。
構築體TR-7之序列揭露於SEQ ID NO: 65中。
構築體PE-1之序列揭露於SEQ ID NO: 66中。
構築體PE-3之序列揭露於SEQ ID NO: 67中。
構築體經表現且在非還原SDS-PAGE凝膠上電泳。圖10A展示TR系列之SDS-page凝膠，且圖10B展示PE系列之SDS-PAGE凝膠。結果展示在VH與VL之間不具有雙硫鍵的構築體以單一離散條帶形式電泳，而在HER2 scFv中之VH與VL之間具有一個雙硫鍵的型式展示存在至少一個高分子量條帶。 實例 13 ：抗 CD20 - 抗 DOTAM - SADA
在此實例中，產生能夠結合CD20及DOTAM之雙特異性抗體的變異體。SADA區域為SEQ ID NO: 5中所揭露之區域。 產生二種型式之抗CD20-抗DOTAM-SADA結合物：
名稱 設計 抗腫瘤DS 抗DOTA DS
Ri-12 抗CD20(VL-VH)×抗DOTAM (VH-VL) 否 否
Ri-13 抗CD20(VL-VH)×抗DOTAM (VL-VH) 否 否
構築體Ri-12之序列揭露於SEQ ID NO: 68中。
構築體Ri-13之序列揭露於SEQ ID NO: 69中。
二種構築體經表現且在非還原SDS-PAGE凝膠上電泳，如圖11中所示，其中泳道2為Ri-12且泳道3為Ri-13。 序列：
SEQ ID NO. 1: HVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 2: QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG SEQ ID NO. 3: HVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG SEQ ID NO. 4: HVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG SEQ ID NO. 5: KPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEP SEQ ID NO. 6: RSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQK SEQ ID NO. 7: RHGDEDTYYLQVRGRENFEILMKLKESLELMELVPQPLVDSYRQQQQLLQRP SEQ ID NO. 8: QAIKKELTQIKQKVDSLLENLEKIEKE SEQ ID NO. 9: STRRILGLAIESQDAGIKTITMLDEQKEQLNRIEEGLDQINKDMRETEKTLTEL SEQ ID NO. 10: MCGAPSATQPATAETQHIADQVRSQLEEKENKKFPVFKAVSFKSQVVAGTNYFIKVHVGDEDFVHLRVFQSLPHENKPLTLSNYQTNKAKHDELTYF SEQ ID NO. 11: DEISMMGRVVKVEKQVQSIEHKLDLLLGFY SEQ ID NO. 12: TVAEAKRQAAEDALAVINQQEDSSESCWNCGRKASETCSGCNTARYCGSFCQHKDWEKHH SEQ ID NO. 13: KASQSVSNDVT SEQ ID NO. 14: SASNRYS SEQ ID NO. 15: QQDYSS SEQ ID NO. 16: NYGVH SEQ ID NO. 17: VIWAGGITNYNSAFMS SEQ ID NO. 18: RGGHYGYALDY SEQ ID NO. 19: EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGGGTKLEIKR SEQ ID NO. 20: QVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 21: EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 22: EDIYNR SEQ ID NO. 23: GAT SEQ ID NO. 24: QQYWSNPYT SEQ ID NO. 25: GFSLTSYG SEQ ID NO. 26: MWRGGST SEQ ID NO. 27: AKSMITTGFVMDS SEQ ID NO. 28: DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTFTISSLQPEDFATYYCQQYWSNPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 29: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGVMWRGGSTDYNAAFKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKSMITTGFVMDSWGQGTLVTVSS SEQ ID NO. 30: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGVMWRGGSTDYNAAFKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKSMITTGFVMDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTFTISSLQPEDFATYYCQQYWSNPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO. 31: SSVSY SEQ ID NO. 32: ATS SEQ ID NO. 33: QQWTSNPPT SEQ ID NO. 34: GYTFTSYN SEQ ID NO. 35: IYPGNGDT SEQ ID NO. 36: ARSTYYGGDWYFNV SEQ ID NO. 37: QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK SEQ ID NO. 38: QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA SEQ ID NO. 39: QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA SEQ ID NO. 40: EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGA SEQ ID NO. 41: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWIGVMWRGGSTDYNAAFKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKSMITTGFVMDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTFTISSLQPEDFATYYCQQYWSNPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAP SEQ ID NO. 42: QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGA SEQ ID NO. 43: EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGA SEQ ID NO. 44: TGAVTASNY SEQ ID NO. 45: GHN SEQ ID NO. 46: ALWYSDHWV SEQ ID NO. 47: GFSLTDYG SEQ ID NO. 48: IWSGGGT SEQ ID NO. 49: ARRGSYPYNYFDA SEQ ID NO. 50: GFAFSTYD SEQ ID NO. 51: ISSGGSYT SEQ ID NO. 52: APTTVVPFAY SEQ ID NO. 53: QNVRTV SEQ ID NO. 54: LAS SEQ ID NO. 55: LQHWSYPLT SEQ ID NO. 56: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSTYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAPTTVVPFAYWGQGTLVTVSA SEQ ID NO. 57: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVRTVVAWYQQKPGKAPKTLIYLASNRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCLQHWSYPLTFGSGTKLEVKR SEQ ID NO. 58: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSTYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAPTTVVPFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVRTVVAWYQQKPGKAPKTLIYLASNRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCLQHWSYPLTFGSGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAP SEQ ID NO. 59: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSTYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAPTTVVPFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVRTVVAWYQQKPGKAPKTLIYLASNRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCLQHWSYPLTFGSGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAP SEQ ID NO. 60: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSTYDMSWVRQAPGKCLEWVSTISSGGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAPTTVVPFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVRTVVAWYQQKPGKAPKTLIYLASNRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCLQHWSYPLTFGCGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAP SEQ ID NO. 61: EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSTYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAPTTVVPFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVRTVVAWYQQKPGKAPKTLIYLASNRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCLQHWSYPLTFGSGTKLEVKR SEQ ID NO. 62: QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKSQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGA SEQ ID NO. 63: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQATGQGLEWMGWIFPGDGSTQYNEKFQGRVTMTTNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSVTPKEKVTITCRASQSISDYLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSISGVPSRFSGSGSGSDFTLTINSLEAEDAATYYCQNGHSFPLTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAP SEQ ID NO. 64: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAP SEQ ID NO. 65: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAP SEQ ID NO. 66: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAP SEQ ID NO. 67: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQAPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLGTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAP SEQ ID NO. 68: QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGA SEQ ID NO. 69: QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSHSVYSDNDLAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGGYDDESDTYGFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSTPLGDTTHTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGA
(無)
圖1展示GD2-SADA構築體之SE-HPLC層析圖。關於更多細節，參見實例1。
圖2展示缺乏SADA區域之截短GD2-SADA構築體的SE-HPLC層析圖。關於更多細節，參見實例1。
圖3展示GD2-SADA構築體及缺乏SADA區域之截短型式在非還原條件下的考馬斯(Coomassie)染色SDS-PAGE凝膠。後者亦在還原條件下進行分析。關於更多細節，參見實例2。
圖4展示CD20-SADA構築體之變異體的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。關於更多細節，參見實例3。
圖5展示CD38-SADA構築體之變異體的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。關於更多細節，參見實例4。
圖6展示變異體YMS9d在非還原條件或還原條件下之考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。關於更多細節，參見實例4。
圖7展示稀釋方案及經稀釋樣品之SE-HPLC層析圖。關於更多細節，參見實例6。
圖8展示在VH與VL序列之間具有或不具有雙硫鍵之RSV-SADA構築體的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。關於更多細節，參見實例10。
圖9展示在VH與VL序列之間具有或不具有雙硫鍵之B7H3-SADA構築體的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。關於更多細節，參見實例11。
圖10A展示在VH與VL序列之間具有或不具有雙硫鍵的基於曲妥珠單抗(Trastuzumab)之HER2-SADA構築體的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。關於更多細節，參見實例12。
圖10B展示在VH與VL序列之間具有或不具有雙硫鍵的基於帕妥株單抗(Pertuzumab)之HER2-SADA構築體的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。關於更多細節，參見實例12。
圖11展示CD20-DOTAM-SADA構築體之考馬斯染色SDS-PAGE凝膠。關於更多細節，參見實例13。
TW202330592A_111148037_SEQL.xml
(無)

Claims (82)

  1. 一種雙特異性抗體，其包含能夠結合一螯合劑或一結合一金屬離子之螯合劑的一第一scFv區域、能夠結合一腫瘤抗原之一第二scFv區域及一SADA區域，其中該第一scFv區域及/或該第二scFv區域中之VH及VL區域不藉由一雙硫鍵連接。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體，其中該第一scFv區域不包含連接該VH及該VL之一雙硫鍵，且該第二scFv區域不包含連接該VH及該VL之一雙硫鍵。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其進一步包含一或多個連接子序列。
  4. 如前述請求項中任一項之雙特異性抗體，其中能夠結合一螯合劑或一結合一金屬離子之螯合劑的該第一scFv區域係選自能夠結合DOTA、DOTA之一衍生物、DOTAM或結合一金屬離子之此等中之任一者的scFv。
  5. 如請求項4之雙特異性抗體，其中該第一scFv能夠結合DOTA-金屬，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 44-49之序列或與SEQ ID NO: 44-49之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  6. 如請求項5之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 1之序列或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置111之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 2之序列或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置45之胺基酸不為半胱胺酸。
  7. 如請求項5或6之雙特異性抗體，其中該第一scFv包含SEQ ID NO: 4之序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  8. 如請求項4之雙特異性抗體，其中該第一scFv能夠結合DOTAM，且包含6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 68之胺基酸302-310、327-333、372-387、455-462、480-482及519-530或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  9. 如請求項8之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 68之胺基酸429-540的序列或與SEQ ID NO: 68之胺基酸429-540具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 68之胺基酸278-398的序列或與SEQ ID NO: 68之胺基酸278-398具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  10. 如請求項8或9之雙特異性抗體，其中該第一scFv包含SEQ ID NO: 68之胺基酸278-540或SEQ ID NO: 69之胺基酸278-540的序列或由SEQ ID NO: 68之胺基酸278-540或SEQ ID NO: 69之胺基酸278-540的序列組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 68之胺基酸278-540或SEQ ID NO: 69之胺基酸278-540具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  11. 如前述請求項中任一項之雙特異性抗體，其中該腫瘤抗原係選自：HER2、B7-H3、CA6、CD138、CD20、CD19、CD22、CD27L、CD30、CD33、CD37、CD38、CD47、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79b、EGFR、EGFRvIII、FRα、GCC、GPNMB、間皮素、MUC16、NaPi2b、連接蛋白(Nectin) 4、PSMA、STEAP1、Trop-2、5T4、AGS-16、αvβ6、CA19.9、CAIX、CD138、CD174、CD180、CD227、CD326、CD79a、CEACAM5、CRIPTO、DLL3、DS6、內皮素B受體、FAP、GD2、間皮素、PMEL 17、SLC44A4、TENB2、TIM-1、CD98、內皮唾酸蛋白(Endosialin)/CD248/TEM1、纖維連接蛋白(Fibronectin)胞外區域B、LIV-1、黏蛋白1、p-鈣黏蛋白、骨膜蛋白(peritosin)、Fyn、SLTRK6、肌腱蛋白(Tenascin) c、VEGFR2及PRLR。
  12. 如請求項11之雙特異性抗體，其中該腫瘤抗原係選自：GD2、CD38、CD20、B7-H3、GPA33、RSV或HER2。
  13. 如請求項12之雙特異性抗體，其中該第二scFv能夠結合GD2，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 13-18之序列或與SEQ ID NO: 13-18之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  14. 如請求項13之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 19之序列或與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置97之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 20之序列或與SEQ ID NO: 20具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置44之胺基酸不為半胱胺酸。
  15. 如請求項13或14之雙特異性抗體，其中該第二scFv包含SEQ ID NO: 21之序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  16. 如請求項12之雙特異性抗體，其中該第二scFv能夠結合CD38，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 22-27之序列或與SEQ ID NO: 22-27之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  17. 如請求項16之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 28之序列或與SEQ ID NO: 28具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置100之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 29之序列或與SEQ ID NO: 29具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置44之胺基酸不為半胱胺酸。
  18. 如請求項16或17之雙特異性抗體，其中該第二scFv包含SEQ ID NO: 30之序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 30具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  19. 如請求項12之雙特異性抗體，其中該第二scFv能夠結合CD20，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 31-36之序列或與SEQ ID NO: 31-36之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  20. 如請求項19之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 37之序列或與SEQ ID NO: 37具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置99之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 38之序列或與SEQ ID NO: 38具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置44之胺基酸不為半胱胺酸。
  21. 如請求項19或20之雙特異性抗體，其中該第二scFv包含SEQ ID NO: 39之序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 39具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  22. 如請求項12之雙特異性抗體，其中該第二scFv能夠結合GPA33，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 50-55之序列或與SEQ ID NO: 50-55之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  23. 如請求項22之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 56之序列或與SEQ ID NO: 56具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置44之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 57之序列或與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置100之胺基酸不為半胱胺酸。
  24. 如請求項22或23之雙特異性抗體，其中該第二scFv包含SEQ ID NO: 61之序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 61具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  25. 如請求項12之雙特異性抗體，其中該第二scFv能夠結合RSV，且包含6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 62之胺基酸26-35、53-59、98-109、177-181、199-201及238-246或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  26. 如請求項25之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 62之胺基酸151-256的序列或與SEQ ID NO: 62之胺基酸151-256具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 62之胺基酸1-120的序列或與SEQ ID NO: 62之胺基酸1-120具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  27. 如請求項25或26之雙特異性抗體，其中該第二scFv包含SEQ ID NO: 62之胺基酸1-256的序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 62之胺基酸1-256具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  28. 如請求項12之雙特異性抗體，其中該第二scFv能夠結合B7H3，且包含6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 63之胺基酸26-33、51-58、97-107、175-180、198-200及237-245或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  29. 如請求項28之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 63之胺基酸149-255的序列或與SEQ ID NO: 63之胺基酸149-255具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 63之胺基酸1-118的序列或與SEQ ID NO: 63之胺基酸1-118具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  30. 如請求項28或29之雙特異性抗體，其中該第二scFv包含SEQ ID NO: 63之胺基酸1-255的序列或由其組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 63之胺基酸1-255具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  31. 如請求項12之雙特異性抗體，其中該scFv能夠結合HER2，且包含6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 64之胺基酸27-32、50-52、89-97、164-171、189-196及235-247或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  32. 如請求項31之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 64之胺基酸1-108的序列或與SEQ ID NO: 64之胺基酸1-108具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 64之胺基酸138-258的序列或與SEQ ID NO: 64之胺基酸138-258具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  33. 如請求項31或32之雙特異性抗體，其中該第二scFv包含SEQ ID NO: 64之胺基酸1-258或SEQ ID NO: 65之胺基酸1-258的序列或由SEQ ID NO: 64之胺基酸1-258或SEQ ID NO: 65之胺基酸1-258的序列組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 64之胺基酸1-258或SEQ ID NO: 65之胺基酸1-258具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  34. 如請求項12之雙特異性抗體，其中該scFv能夠結合HER2，且包含6個CDR序列，其由SEQ ID NO: 66之胺基酸26-33、51-58、97-108、176-181、199-201及238-246或與此等序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  35. 如請求項34之雙特異性抗體，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 66之胺基酸150-256的序列或與SEQ ID NO: 66之胺基酸150-256具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 66之胺基酸1-119的序列或與SEQ ID NO: 66之胺基酸1-119具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  36. 如請求項34或35之雙特異性抗體，其中該第二scFv包含SEQ ID NO: 66之胺基酸1-256或SEQ ID NO: 67之胺基酸1-256的序列或由SEQ ID NO: 66之胺基酸1-256或SEQ ID NO: 67之胺基酸1-256的序列組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 66之胺基酸1-256或SEQ ID NO: 67之胺基酸1-256具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  37. 如前述請求項中任一項之雙特異性抗體，其中該SADA區域係選自包含SEQ ID NO: 5-12之序列中之一者或與SEQ ID NO: 5-12中之一者的不同之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代之序列的區域。
  38. 如前述請求項中任一項之雙特異性抗體，其中該SADA區域包含SEQ ID NO: 5之胺基酸6-36的一胺基酸序列或與SEQ ID NO: 5之胺基酸6-36的不同之處在於一或多個選自以下之取代的一序列： E6V，Q，K，G，D或A； Y7S，N，H，F，D或C； F8Y，V，S，L，I或C； T9S，P，N或A； L10V，I或F； Q11R，L，K，H或E； I12V，T，M，L或F； R13S，P，L，H，G或C； G14W，R或A； R15S，P，L，H，G或C； E16V，Q，K，G，D或A； F18Y，V，S，L，I或C； E19V，Q，K，G，D或A； M20V，T，R，L，K或I； F21L或I； R22L或G； E23V，Q，K，G，D或A； L24M； N25S，I或D； E26V，Q，K，G，D或A； A27V，T，S，G或D； L28W，V，M或F； E29Q，G或D； L30V，R，I，H或F； K31T，R，Q，N，M或E； D32Y，V，N，H，G或A； A33V，T，S，P，G或D； Q34R，L，K，H或E； 使用SEQ ID NO: 5之編號。
  39. 如前述請求項中任一項之雙特異性抗體，其包含以下序列中之一者或由以下序列中之一者組成：SEQ ID NO: 40、41、42、58、59、62、63、64、65、66、67、68及69。
  40. 一種產生一scFv區域之變異體的方法，該scFv區域包含一輕鏈可變區域(VL)、一重鏈可變區域(VH)及該VL與該VH之間的一或多個雙硫鍵，該方法包含以下步驟： a.鑑別在VL與VH之間形成該一或多個雙硫鍵的半胱胺酸殘基；及 b.用不同於半胱胺酸之胺基酸取代步驟a.中所鑑別之形成該等雙硫鍵中之一或多者的該等半胱胺酸殘基。
  41. 如請求項40之方法，其中與該scFv區域相比，該等變異體引起較少多聚體形成。
  42. 如請求項41之方法，其中多聚體形成係藉由SDS-PAGE凝膠電泳確定。
  43. 如請求項40至42中任一項之方法，其中該scFv區域為包含額外抗體片段之一多肽的一部分。
  44. 如請求項40至43中任一項之方法，其中該scFv區域為一雙特異性抗體或一多特異性抗體之一部分。
  45. 如請求項44之方法，其中該雙特異性抗體或該多特異性抗體進一步包含一SADA區域。
  46. 一種scFv區域，其包含一VL及一VH且能夠結合一抗原，其中該scFv可根據如請求項40至45之方法獲得。
  47. 如請求項46之scFv區域，其中該VH及該VL不藉由任何雙硫鍵連接。
  48. 如請求項46或47之scFv區域，其中該scFv進一步包含該VH與該VL之間的一連接子。
  49. 如請求項46至48中任一項之scFv區域，其中該scFv能夠結合DOTA-金屬，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 44-49之序列或與SEQ ID NO: 44-49之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  50. 如請求項49之scFv，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 1之序列或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置111之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 2之序列或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置45之胺基酸不為半胱胺酸。
  51. 如請求項49或50之scFv，其包含SEQ ID NO: 4之序列或由該序列組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  52. 如請求項46至48中任一項之scFv區域，其中該scFv能夠結合GD2，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 13-18之序列或與SEQ ID NO: 13-18之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  53. 如請求項52之scFv，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 19之序列或與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置97之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 20之序列或與SEQ ID NO: 20具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置44之胺基酸不為半胱胺酸。
  54. 如請求項51或52之scFv，其包含SEQ ID NO: 21之序列或由該序列組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  55. 如請求項46至48中任一項之scFv區域，其中該scFv能夠結合CD38，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 22-27之序列或與SEQ ID NO: 22-27之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  56. 如請求項55之scFv，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 28之序列或與SEQ ID NO: 28具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置100之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 29之序列或與SEQ ID NO: 29具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置44之胺基酸不為半胱胺酸。
  57. 如請求項55或56之scFv，其包含SEQ ID NO: 30之序列或由該序列組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 30具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  58. 如請求項46至48中任一項之scFv區域，其中該scFv能夠結合CD20，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 31-36之序列或與SEQ ID NO: 31-36之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  59. 如請求項58之scFv，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 37之序列或與SEQ ID NO: 37具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置99之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 38之序列或與SEQ ID NO: 38具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置44之胺基酸不為半胱胺酸。
  60. 如請求項58或59之scFv，其包含SEQ ID NO: 39之序列或由該序列組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 39具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  61. 如請求項46至48中任一項之scFv區域，其中該scFv能夠結合GPA33，且包含6個CDR序列，其各自由SEQ ID NO: 50-55之序列或與SEQ ID NO: 50-55之序列的不同之處在於1或2個取代的序列組成。
  62. 如請求項61之scFv，其包含 a.一VL序列，其具有SEQ ID NO: 56之序列或與SEQ ID NO: 56具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置44之胺基酸不為半胱胺酸；及 b.一VH序列，其具有SEQ ID NO: 57之序列或與SEQ ID NO: 57具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列，其中位置100之胺基酸不為半胱胺酸。
  63. 如請求項61或62之scFv，其包含SEQ ID NO: 61之序列或由該序列組成，或包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 61具有至少90%序列一致性，例如至少95%序列一致性，例如至少96%序列一致性，例如至少97%序列一致性，例如至少98%序列一致性或至少99%序列一致性的一序列。
  64. 一種組成物，其包含一如請求項1至39中任一項之雙特異性抗體或一如請求項46至63中任一項之scFv。
  65. 如請求項64之組成物，其為一醫藥組成物。
  66. 一種一如請求項1至39中任一項之雙特異性抗體、一如請求項46至63中任一項之scFv或一如請求項64或65之組成物的用途，其用於診斷或治療癌症。
  67. 如請求項66之用途，其用於一用於治療或診斷癌症之方法，該方法包含以下步驟： a.向一有需要之患者投予一如請求項1至39中任一項之雙特異性抗體；及 b.在一保持期之後，投予一結合一放射核種之螯合劑。
  68. 如請求項67之用途，其中該保持期在24小時至96小時之範圍內。
  69. 如請求項67至68中任一項之用途，其中該螯合劑為DOTA、DOTAM或其一衍生物，選自DOTA、苯甲基DOTA及雙螯合化合物 其中X1、X2、X3及X4各自獨立地為一孤對電子(亦即提供一氧陰離子)或H； X5、X6及X7各自獨立地為一孤對電子(亦即提供一氧陰離子)或H； Y1為O或S；且 n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22；且 M1係選自175Lu3+、45Sc3+、69Ga3+、71Ga3+、89Y3+、113In3+、115In3+、139La3+、136Ce3+、138Ce3+、140Ce3+、142Ce3+、151Eu3+、153Eu3+、159Tb3+、154Gd3+、155Gd3+、156Gd3+、157Gd3+、158Gd3+或160Gd3+；且 M2係選自放射核種。
  70. 如請求項66至69中任一項之用途，其中該放射核種係選自 211At、 51Cr、 57Co、 58Co、 67Cu、 152Eu、 67Ga、 111In、 59Fe、 212Pb、 177Lu、 223Ra、 224Ra、 186Re、 188Re、 75Se、 99mTc、 227Th、 89Zr、 90Y、 94mTc、 64Cu、 68Ga、 66Ga、 86Y、 82Rb、 110mIn、 209Bi、 211Bi、 212Bi、 213Bi、 210Po、 211Po、 212Po、 214Po、 215Po、 216Po、 218Po、 211At、 215At、 217At、 218At、 218Rn、 219Rn、 220Rn、 222Rn、 226Rn、 221Fr、 223Ra、 224Ra、 226Ra、 225Ac、 227Ac、 227Th、 228Th、 229Th、 230Th、 232Th、 231Pa、 233U、 234U、 235U、 236U、 238U、 237Np、 238Pu、 239Pu、 240Pu、 244Pu、 241Am、 244Cm、 245Cm、 248Cm、 249Cf及 252Cf，較佳選自 177Lu、 99mTc、 64Cu及 89Zr。
  71. 如請求項66至70中任一項之用途，其進一步包含在步驟a.之後且在步驟b.之前投予一清除劑。
  72. 如請求項66至71中任一項之用途，其進一步包含偵測該放射核種之定位。
  73. 如請求項72之用途，其中該放射核種係使用一PET或SPECT掃描器偵測。
  74. 如請求項66至73中任一項之用途，其中該癌症係選自骨肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、平滑肌肉瘤、梭狀細胞肉瘤、腦瘤、小細胞肺癌、視網膜母細胞瘤、HTLV-1感染之T細胞白血病。
  75. 如請求項66至74中任一項之用途，其進一步包含一第二且任擇的進一步投予結合一放射核種之螯合劑。
  76. 一種套組，其包含一如請求項1至39中任一項之雙特異性抗體。
  77. 如請求項76之套組，其進一步包含一可由該雙特異性抗體結合之螯合劑。
  78. 如請求項76或77之套組，其進一步包含使用說明書。
  79. 一種聚核苷酸，其編碼一如請求項1至39中任一項之雙特異性抗體或一如請求項46至63中任一項之scFv。
  80. 一種表現載體或構築體，其包含如請求項79之聚核苷酸。
  81. 一種宿主細胞，其包含如請求項79之聚核苷酸或如請求項80之表現載體或構築體。
  82. 一種產生一如請求項1至39中任一項之雙特異性抗體或一如請求項46至63中任一項之scFv的方法，其包含以下步驟： a.提供一如請求項81之宿主細胞； b.使該宿主細胞在誘導該聚核苷酸表現之條件下生長；及 c.自生長培養液回收該scFv或該雙特異性抗體。
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