CN116194133A - 抗gd2 sada缀合物及其用途 - Google Patents

抗gd2 sada缀合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116194133A
CN116194133A CN202180059161.6A CN202180059161A CN116194133A CN 116194133 A CN116194133 A CN 116194133A CN 202180059161 A CN202180059161 A CN 202180059161A CN 116194133 A CN116194133 A CN 116194133A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dota
seq
lys
sada
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180059161.6A
Other languages
English (en)
Inventor
B·H·桑迪奇
N·K·V·张
M·阿赫麦德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Original Assignee
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Memorial Sloan Kettering Cancer Center filed Critical Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Publication of CN116194133A publication Critical patent/CN116194133A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/0474—Organic compounds complexes or complex-forming compounds, i.e. wherein a radioactive metal (e.g. 111In3+) is complexed or chelated by, e.g. a N2S2, N3S, NS3, N4 chelating group
    • A61K51/0482—Organic compounds complexes or complex-forming compounds, i.e. wherein a radioactive metal (e.g. 111In3+) is complexed or chelated by, e.g. a N2S2, N3S, NS3, N4 chelating group chelates from cyclic ligands, e.g. DOTA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/04—Chelating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本发明技术涉及包括自组装分解(SADA)多肽和GD2特异性抗原结合结构域的蛋白质缀合物用于在经历靶向α放射免疫疗法的受试者中预防或减轻诸如脑、肾脏和/或骨髓损伤的脱靶组织毒性的用途。本文还公开了提高抗GD2‑SADA缀合物抗肿瘤反应的体内持久性的预靶向放射免疫疗法(PRIT)方法。

Description

抗GD2 SADA缀合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月27日提交的美国临时专利申请号63/030,591的权益和优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明技术涉及采用包括自组装分解(self-assembly and disassembly，SADA)多肽和GD2特异性抗原结合结构域的缀合物的方法。具体而言，本公开文本提供了用于在经历靶向α放射免疫疗法的受试者中预防或减轻诸如脑、肾脏和/或骨髓损伤的脱靶组织毒性的方法。本文还公开了提高抗GD2-SADA蛋白缀合物的抗肿瘤反应的体内持久性的预靶向放射免疫疗法(PRIT)方法。
政府支持声明
本发明是在由美国国家癌症研究所/国立卫生研究院授予的CA008748下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术
对本发明技术背景的以下描述仅仅是为了帮助理解本发明技术而提供的，并不承认描述或构成本发明技术的现有技术。
转移性疾病仍然是癌症治愈的主要障碍。虽然局部疾病可以通过手术或辐射疗法控制，但扩散广、远处和隐匿性转移则需要全身性疗法。然而，由于治疗指数(TI，肿瘤累积摄取与正常组织累积摄取的比率)较差，许多这些治疗对重要器官具有非计划中的剂量限制性毒性(Lin,A.等人,Sci Transl Med 11(2019))。目前，超过90％的临床试验未能获得FDA批准(Dowden,H.和Munro,J.Nature Reviews Drug Discovery 18,495-496(2019))，其中相当数量是由于剂量限制性肾脏、肝脏或骨髓毒性。例如，如果治疗剂过小(<70kDa)并且通过肾小球过滤，则需要更大的剂量或延长的给药方案来克服短的血清半衰期，其与附随的成本过高、后勤和器官毒性风险增加的缺点相关。参见例如，Pinzani,V.等人,CancerChemoth Pharm 35,1-9(1994)。即使具有肿瘤特异性靶标，常规的一步递送系统(如抗体药物缀合物(ADC)或放射性标记的免疫球蛋白G(IgG)蛋白)也通常具有10:1以下的TI，并且剂量受限于对肾脏、肝或骨髓的毒性。因此，全身性细胞毒性疗法的脱靶效应造成癌症治愈的主要障碍，特别是在基因组、身体和智力后果可能严重且持久的儿童中。
因此，持续需要具有有效的动力学和/或药理特性且相关毒性降低或无相关毒性的药剂。
发明内容
在一个方面，本公开文本提供了一种用于在有需要的受试者中减少或减轻α放射免疫疗法相关毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；以及向所述受试者施用有效量的包含发射α粒子的同位素的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合。在某些实施方案中，所述受试者已经接受或正在接受一个或多个周期的α放射免疫疗法。发射α粒子的同位素的例子包括但不限于213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At或255Fm。所述α放射免疫疗法相关毒性可以是对选自脑、肾脏、膀胱、肝脏、骨髓和脾脏的一个或多个器官的毒性。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在另一个方面，本公开文本提供了一种用于增加β放射免疫疗法在有需要的受试者中的功效的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；(b)在施用所述抗GD2 SADA缀合物后约48小时向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；(c)在施用所述第一剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；以及(d)在施用所述第二剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。在一些实施方案中，在没有进一步施用本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的情况下，施用所述放射性标记的DOTA半抗原。在其他实施方案中，所述方法进一步包括将步骤(a)-(d)重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个另外的循环。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在又另一个方面，本公开文本提供了一种用于增加β放射免疫疗法在有需要的受试者中的功效的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用第一有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；(b)在施用所述第一有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约48小时向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；(c)在施用所述第一有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约7天向所述受试者施用第二有效量的所述抗GD2SADA缀合物；(d)在施用所述第二有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约48小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；(e)在施用所述第二有效量的所述抗GD2SADA缀合物后约7天向所述受试者施用第三有效量的所述抗GD2 SADA缀合物；以及(f)在施用所述第三有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约48小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。在一些实施方案中，所述受试者是人。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是相同的。在本文公开的方法的其他实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量中的任何两个可以是相同的。在本文公开的方法的某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是不同的。在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述发射β粒子的同位素是86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu或67Cu。
在一个方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的GD2相关癌症的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；(b)在施用所述抗GD2SADA缀合物后约48小时向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素或发射α粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；(c)在施用所述第一剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；以及(d)在施用所述第二剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。在一些实施方案中，在没有进一步施用本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的情况下，施用所述放射性标记的DOTA半抗原。在其他实施方案中，所述方法进一步包括将步骤(a)-(d)重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个另外的循环。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在另一个方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的GD2相关癌症的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用第一有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；(b)在施用所述第一有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约48小时向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素或发射α粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；(c)在施用所述第一有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约7天向所述受试者施用第二有效量的所述抗GD2SADA缀合物；(d)在施用所述第二有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约48小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；(e)在施用所述第二有效量的所述抗GD2SADA缀合物后约7天向所述受试者施用第三有效量的所述抗GD2 SADA缀合物；以及(f)在施用所述第三有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约48小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。在一些实施方案中，所述受试者是人。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是相同的。在本文公开的方法的其他实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量中的任何两个可以是相同的。在本文公开的方法的某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是不同的。所述发射β粒子的同位素的例子包括86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu或67Cu。所述发射α粒子的同位素的例子包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At或255Fm。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，所述受试者患有或被诊断为患有GD2相关癌症，如神经母细胞瘤、黑色素瘤、软组织肉瘤、脑肿瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌或梭形细胞肉瘤。
在本文公开的方法的任何以上实施方案中，所述DOTA半抗原选自DOTA、Pr oteus-DOTA、DOTA-Bn、DOTA-去铁胺、DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2、Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Tyr-D-Ly s(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、D OTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-D TPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2、Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HS G)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2和Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与已经用抗DOTA×抗GD2 IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致所述受试者的肾细胞凋亡减少。在本文所述的方法的某些实施方案中，与已经用抗DOTA×抗GD2IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致在所述受试者中的免疫原性降低。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与已经用抗DOTA×抗GD2 IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致所述受试者的卵巢萎缩的严重程度降低。在本文公开的方法的一些实施方案中，与已经用抗DOTA×抗GD2 IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致所述受试者的缓解期延长。在本文所述的方法的任何前述实施方案中，所述抗DOTA×抗GD2 IgG-scFv-BsAb包含(a)包含分别地SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH)序列和轻链可变结构域(VL)序列的GD2特异性抗原结合结构域，以及(b)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的重链可变结构域(VH)序列和SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的轻链可变结构域(VL)序列的DOTA特异性抗原结合结构域。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，与没有接受所述抗GD2 SADA缀合物的对照GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致所述受试者的肾细胞凋亡减少、卵巢萎缩的严重程度降低和/或缓解期延长。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的GD2特异性抗原结合结构域包含分别地SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH)序列和轻链可变结构域(VL)序列。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗GD2SADA缀合物的DOTA特异性抗原结合结构域包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的重链可变结构域(VH)序列和SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的轻链可变结构域(VL)序列。
在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述GD2特异性抗原结合中的所述VH结构域序列和所述VL结构域序列可以经由肽内接头连接。另外地或可替代地，在一些实施方案中，在所述GD2特异性抗原结合结构域中的所述VH结构域序列与所述VL结构域序列之间的所述肽内接头的序列是SEQ ID NO:19-21中的任一个。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，所述DOTA特异性抗原结合中的所述VH结构域序列和所述VL结构域序列可以经由肽内接头连接。另外地或可替代地，在一些实施方案中，在所述DOTA特异性抗原结合结构域中的所述VH结构域序列与所述VL结构域序列之间的所述肽内接头的序列是SEQ ID NO:19-21中的任一个。
在本发明技术的方法的任何和所有实施方案中，所述GD2特异性抗原结合结构域和所述DOTA特异性抗原结合结构域可以经由肽内接头连接。另外地或可替代地，在一些实施方案中，在所述GD2特异性抗原结合结构域与所述DOTA特异性抗原结合结构域之间的所述肽内接头的序列是SEQ ID NO:19-21中的任一个。
在某些实施方案中，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：(i)SEQ ID NO:5的VL序列；(ii)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(iii)SEQ ID NO:1的VH序列；(iv)包含SEQ IDNO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(v)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；(vi)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(vii)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；(viii)包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及(ix)SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
在一些实施方案中，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：(i)SEQ ID NO:5的VL序列；(ii)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(iii)SEQ ID NO:1的VH序列；(iv)包含SEQ IDNO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(v)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；(vi)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(vii)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；(viii)包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及(ix)SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
在其他实施方案中，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：(i)SEQ ID NO:1的VH序列；(ii)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(iii)SEQ ID NO:5的VL序列；(iv)包含SEQ IDNO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(v)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；(vi)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(vii)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；(viii)包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及(ix)SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
在一些实施方案中，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：(i)SEQ ID NO:1的VH序列；(ii)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(iii)SEQ ID NO:5的VL序列；(iv)包含SEQ IDNO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(v)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；(vi)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(vii)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；(viii)包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及(ix)SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
在本文公开的方法的任何和所有前述实施方案中，所述GD2 SADA缀合物的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22-35或38-39。
本文还公开了试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本发明技术的抗GD2 SADA缀合物、DOTA半抗原和用于在α放射免疫疗法或β放射免疫疗法(例如，PRIT)中使用所述缀合物、所述半抗原的说明书。
附图说明
图1A-1E示出了体外多步骤有效载荷递送和抗GD2/抗DOTA SADA缀合物(又名SADA-BsAb)活性的概览。图1A示出了4种不同有效载荷递送策略的示意图。指示了肿瘤特异性结构域和DOTA特异性结构域。还指示了随着时间的推移血液中有效载荷的浓度、肿瘤中有效载荷的浓度和血液中非有效载荷抗体的浓度。每条曲线的面积(AUC)表示每种策略的相对暴露。图1B示出了代表性的抗GD2/抗DOTA SADA缀合物的示意图。每个单体由3个结构域组成，从N末端至C末端分别为：抗肿瘤结构域、抗DOTA结构域和SADA结构域。SADA结构域自组装成四聚体(220kDa)，但也分解为单体(55kDa)。图1C示出了具有所指示的高分子量和低分子量杂质的抗GD2/抗DOTA P53无HIS-SADA缀合物(又名P53-SADA-BsAb无HIS；(SEQ IDNO:22))的代表性SEC-HPLC色谱图。图1D示出了如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的，与抗GD2/抗DOTA IgG-scFv-BsAb(又名IgG-scFv-BsAb)相比，抗GD2/抗DOTA P53-SADA缀合物(又名P53-SADA-BsAb；(SEQ ID NO:27))和抗GD2/抗DOTA P63-SADA缀合物(又名P63-SADA-BsAb；(SEQ ID NO:28))的归一化GD2结合动力学。对于每条曲线，将最大结合归一化为100。图1E示出了通过流式细胞术进行的抗GD2/抗DOTA P53-SADA缀合物(又名P53-SADA-BsAb LS；(SEQ ID NO:23))和抗GD2/抗DOTA P63-SADA缀合物(又名P63-SADA-BsAb LS；(SEQ ID NO:24))的代表性细胞结合分析。每条曲线表示一种BsAb或对照BsAb(无关肿瘤特异性)的荧光图。
图2A-2D示出了本发明技术的SADA-BsAb的体内药代动力学和生物分布。图2A示出了所测试的SADA-BsAb的血清清除动力学。向无肿瘤小鼠(n＝3)注射131I放射性标记的P53-SADA-BsAb LS(SEQ ID NO:23)或P63-SADA-BsAb LS(SEQ ID NO:24)，并且在48小时内连续放血。图表示相对于峰值浓度(0.5小时)归一化的每单位血液剩余BsAb的量。图2B示出了使用两步SADA-PRIT的施用剂量与组织摄取之间的关系。向小鼠(n＝5)施用P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)(1.25nmol)和以下3种剂量之一的DOTA[177Lu]：3.7、18.5或37MBq(分别为20、100或200pmol)。指示了肿瘤、肾脏和血液中DOTA有效载荷的水平。还示出了在每种剂量下肿瘤与血液之间的治疗指数。将组织摄取归一化为pmol DOTA[177Lu]/克组织。图2C-2D分别示出了使用本发明技术的SADA-BsAb的示例性示意图和PET/CT图像。如示意图所描绘的，向小鼠(n＝1-2)注射P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)或IgG-scFv-BsAb(注射和不注射清除剂)，随后注射DOTA[86Y](向下的箭头对应于每次注射)。在施用DOTA后18小时，对小鼠成像30分钟(向上的箭头)。代表性图像使用相同尺度进行归一化。箭头指向皮下肿瘤(左图)或膀胱(中图)。
图3A-3B示出了本发明技术的SADA-BsAb的免疫原性。将小鼠(n＝5)用P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)或IgG-scFv-BsAb免疫，并且4周后放血。小鼠接受后续剂量的BsAb，并且4周后再次放血。通过ELISA测量抗BsAb滴度，并且将其相对于单克隆抗BsAb标准品归一化。使用Mann Whitney检验计算统计学显著性。与P53-SADA-BsAb相比，IgG-scFv-BsAb的**P＝0.0079。
图4A示出了神经母细胞瘤异种移植物治疗模型的示意图(左)和平均肿瘤反应(右)。一个剂量的BsAb(SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28)(1.25nmol，三角形)之后是48小时后的一个剂量的DOTA[177Lu](18.5MBq，100pmol，星形)，每周一次持续3周。每条实线表示一个治疗组(n＝10)。黑色虚线表示无可测量的肿瘤，并且加框六边形表示肿瘤植入。计算肿瘤平均值，直到至少一只小鼠被实施安乐死。将数据显示为平均值±标准差。图4B示出了每个实验组的单独肿瘤反应。每条实线表示来自单只小鼠的肿瘤，并且虚线表示组平均值。图4C示出了每个实验组的无进展存活率分析。当肿瘤的体积达到500mm3时，它们被认为“在进展中”。如果小鼠被处死用于组织学分析但在那时原本是健康的，则将它们删掉。图4D示出了在所治疗的小鼠中观察到的器官病状的图示。每个条表示一个治疗组，并且每个图表示卵巢(左)或膀胱(右)的分析。Y轴值表示所分析的小鼠展示出毒性的百分比。指示了4级、3级和2级毒性相比于正常表型。对于IgG-scFv-BsAb、P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)和对照小鼠(年龄匹配的无肿瘤同窝仔畜)n＝9，并且对于P63-SADA-BsAb(SEQ ID NO:28)n＝6。通过双因素方差分析(ANOVA)与Tukey校正或对数秩(Mantel-Cox)检验计算统计学显著性。仅DOTA[177Lu]与P53-SADA-BsAb、P63-SADA-BsAb或IgG-scFv-BsAb之间的****P<0.0001。
图5A示出了DOTA[177Lu]神经母细胞瘤异种移植物治疗模型的示意图(左)和平均肿瘤反应(右)。一个剂量的BsAb(SEQ ID NO:27)(1.25nmol，三角形)之后是48小时后的一个剂量的DOTA[177Lu](55.5MBq，300pmol，星形)，每周一次持续3周。每条实线表示一个治疗组(n＝5)。黑色虚线表示无可测量的肿瘤，并且加框六边形表示肿瘤植入。计算肿瘤平均值，直到至少一只小鼠被实施安乐死。将数据显示为平均值±标准差。图5B示出了每个实验组的无进展存活率分析。当肿瘤的体积达到500mm3时，它们被认为“在进展中”。如果小鼠被处死用于组织学分析但在那时原本是健康的，则将它们删掉。
图5C示出了Proteus[225Ac]神经母细胞瘤异种移植物治疗模型的示意图(左)和平均肿瘤反应(右)。Proteus DOTA半抗原的结构描述于WO 2019/010299中。通过混合以下两种双功能DOTA螯合剂合成Proteus-DOTA：商购的2,2',2”-(10-(17-氨基-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十七烷基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(胺-PEG4-DOTA)以及由商购的p-SCN-Bn-DOTA和LuCl3·6H2O制备的2-(4-异硫氰酰基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-四乙酸的非放射性的镥复合物(p-SCN-Bn-DOTA·Lu3+复合物)。一个剂量的BsAb(SEQ ID NO:27)(1.25nmol，三角形)之后是48小时后的一个剂量的Proteus[225Ac](37kBq，2.4nmol，星形)。每条实线表示一个治疗组(n＝5)。黑色虚线表示无可测量的肿瘤，并且加框六边形表示肿瘤植入。计算肿瘤平均值，直到至少一只小鼠被实施安乐死。将数据显示为平均值±标准差。图5D示出了每个实验组的无进展存活率分析。当肿瘤的体积达到500mm3时，它们被认为“在进展中”。如果小鼠被处死用于组织学分析但在那时原本是健康的，则将它们删掉。通过双因素方差分析(ANOVA)与Tukey校正或对数秩(Mantel-Cox)检验计算统计学显著性。在仅DOTA[177Lu]或仅Proteus[225Ac]与P53-SADA-BsAb(SEQID NO:27)或IgG-scFv-BsAb之间的**P＝0.034，****P<0.0001。
图6A示出了Proteus[225Ac]小细胞肺癌患者源性异种移植物(PDX)治疗模型的示意图(左)和平均肿瘤反应(右)。一个剂量的BsAb(SEQ ID NO:27)(1.25nmol，三角形)之后是48小时后的一个剂量的Proteus[225Ac](37kBq，621pmol，星形)。每条线表示一个治疗组(n＝5)。黑色虚线表示无可测量的肿瘤，并且加框六边形表示肿瘤植入。计算肿瘤平均值，直到至少一只小鼠被实施安乐死。将数据显示为平均值±标准差。图6B示出了每个实验组的单独肿瘤反应。每条实线表示来自单只小鼠的肿瘤，并且虚线表示组平均值。图6C每个实验组的无进展存活率分析。当肿瘤的体积达到500mm3时，它们被认为“在进展中”。出乎意料地，在此研究中没有小鼠死亡。通过双因素方差分析(ANOVA)与Sidak校正或对数秩(Mantel-Cox)检验计算统计学显著性。在仅Proteus[225Ac]与P53-SADA-BsAb之间的****P<0.0001。
图7A示出了神经母细胞瘤异种移植物治疗模型的示意图(左)和平均肿瘤反应(右)。一个剂量的BsAb(SEQ ID NO:28)(1.25nmol，三角形)之后是在施用BsAb后48h、72h和96h的3个随后剂量的DOTA[177Lu](18.5MBq，100pmol，竖条)，每周一次持续3周。每条实线表示一个治疗组(n＝5-10)。黑色虚线表示无可测量的肿瘤，并且加框六边形表示肿瘤植入。计算肿瘤平均值，直到至少一只小鼠被实施安乐死。将数据显示为平均值±标准差。图7B示出了每个实验组的单独肿瘤反应。每条实线表示来自单只小鼠的肿瘤，并且虚线表示组平均值。图7C示出了每个实验组的无进展存活率分析。当肿瘤的体积达到500mm3时，它们被认为“在进展中”。如果小鼠被处死用于组织学分析但在那时原本是健康的，则将它们删掉。图7D示出了在所治疗的小鼠中观察到的器官病状的图示。每个条表示一个治疗组，并且每个图表示卵巢(左)或膀胱(右)的分析。Y轴值表示所分析的小鼠展示出毒性的百分比。指示了3级毒性和无病状(正常)。对于3x-3x n＝6，对于1x-3x和2x-6x n＝2，并且对于对照(年龄匹配的无肿瘤同窝仔畜)n＝9。通过双因素方差分析(ANOVA)与Tukey校正或对数秩(Mantel-Cox)检验计算统计学显著性。在仅DOTA[177Lu]与3x-3x、1x-3x或2x-6x之间的***P<0.0005，****P<0.0001。
图8A示出了以下实验组中每一个中的DOTA[177Lu]治疗小鼠的示例性血液学分析：P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)、P63-SADA-BsAb(SEQ ID NO:28)、IgG-scFv-BsAb、对照组(仅DOTA[177Lu])和年龄匹配的无肿瘤同窝仔畜。示出了来自小鼠血液的白细胞(WBC，左)、红细胞(RBC，中)和血小板(PLT，右)计数。将所有小鼠在第一剂量的DOTA[177Lu]后14天放血。每个符号是指单只小鼠(n＝10)。黑色虚线是指来自在第0天用300cGy全身辐照(TBI)辐照的年龄匹配小鼠的平均值，并且灰色条表示此平均值上下的一个标准差。图8B示出了在所治疗的小鼠的血浆中的FLT3L水平。将所有小鼠在第一剂量的DOTA[177Lu]后21天放血。每个符号是指单只小鼠(n＝10)。图8C示出了所治疗的小鼠的体重变化。每周至少监测一次体重，并且将其相对于每只单独小鼠的治疗前体重归一化。每条实线表示一个治疗组(n＝10)。黑色虚线表示体重增加或减少10％。计算平均体重，直到至少一只小鼠被实施安乐死。将数据显示为平均值±标准差。
图9A示出了以下实验组中每一个中的DOTA[177Lu]治疗小鼠的示例性血液学分析：P63-SADA-BsAb(SEQ ID NO:28)3x-3x方案、P63-SADA-BsAb(SEQ ID NO:28)1x-3x方案、P63-SADA-BsAb(SEQ ID NO:28)2x-6x方案、对照组(仅DOTA[177Lu])和年龄匹配的无肿瘤同窝仔畜。示出了来自小鼠血液的白细胞(WBC，左)、红细胞(RBC，中)和血小板(PLT，右)计数。将所有小鼠在第一剂量的DOTA[177Lu]后14天放血。每个符号是指单只小鼠(n＝5-10)。黑色虚线是指来自在第0天用300cGy全身辐照(TBI)辐照的年龄匹配小鼠的平均值。灰色条表示平均值±一个标准差。图9B示出了在所治疗的小鼠的血浆中的FLT3L水平。将所有小鼠在第一剂量的DOTA[177Lu]后21天放血。每个符号是指单只小鼠(n＝10)。图9C示出了所治疗的小鼠的体重变化。每周至少监测一次体重，并且将其相对于每只单独小鼠的治疗前体重归一化。每条实线表示一个治疗组(n＝10)。黑色虚线表示体重增加或减少10％。计算平均体重，直到至少一只小鼠被实施安乐死。将数据显示为平均值±标准差。
图10示出了来自所治疗的裸小鼠的卵巢的代表性H&E染色。正常卵巢(左，同窝仔畜对照)、3级萎缩卵巢(中，P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27))和4级萎缩卵巢(右，IgG-scFv-BsAb)。将小鼠在治疗开始后的第110天与第230天之间处死。
图11A示出了在用P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)治疗的神经母细胞瘤PDX治疗模型中的单独DOTA[177Lu]肿瘤反应。每条实线表示来自单只小鼠的肿瘤，并且虚线表示组平均值。图11B示出了在所治疗的小鼠中观察到的膀胱病状的图示。每个条表示一个治疗组(n＝5)。Y轴值表示所分析的小鼠展示出毒性的百分比。指示了4级毒性、3级毒性、2级毒性和无病状(正常)。图11C示出了在用P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)治疗的神经母细胞瘤模型中的单独Proteus[225Ac]肿瘤反应，其中每条线表示来自单只小鼠的肿瘤，并且虚线表示组平均值。图11D示出了在所治疗的小鼠中观察到的肾脏病状的图示。以每10个连续视野的观察数量测量所有病状，从含有最多病状的视野开始。每个组(x轴)表示一个治疗组或年龄匹配的同窝仔畜对照，并且每个单独的散点图表示不同的肾脏损伤染色。描绘了管状蛋白沉积、上皮细胞凋亡、裂解的半胱天冬酶3(CC-3)阳性细胞和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)阳性细胞。
图12A示出了在用P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)治疗的神经母细胞瘤模型中DOTA[177Lu]治疗小鼠的示例性血液学分析。示出了来自小鼠血液的白细胞(WBC，左)、红细胞(RBC，中)和血小板(PLT，右)计数。将所有小鼠在第一剂量的DOTA[177Lu]后14天放血。每个符号是指单只小鼠(n＝5)。图12B示出了来自所治疗的小鼠的膀胱的代表性H&E染色。示出了正常膀胱(左，同窝仔畜对照)、2级膀胱(中左，IgG-scFv-BsAb)、3级多病灶膀胱(中右，P53-SADA-BsAb)和4级弥漫性膀胱(右，P53-SADA-BsAb)。将小鼠在治疗开始后第120天处死。
图13A示出了在用P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)治疗的神经母细胞瘤模型中Proteus[225Ac]治疗小鼠的示例性血液学分析。示出了来自小鼠血液的白细胞(WBC，左)、红细胞(RBC，中)和血小板(PLT，右)计数。将所有小鼠在第一剂量的Proteus[225Ac]后14天放血。每个符号是指单只小鼠(n＝5)。图13B示出了来自IgG-scFv-BsAb治疗小鼠的肾脏的代表性图像。裂解的半胱天冬酶3(CC-3)阳性肾脏(左)、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)阳性肾脏(中左)、H&E染色肾脏伴上皮坏死与管状蛋白沉积和4级多病灶膀胱(中右)以及4级弥漫性膀胱(右)。将小鼠在治疗开始后的第100天与第120天之间处死。
图14示出了候选SADA结构域的结构特性。序列是指所使用的特定氨基酸，从N末端氨基酸开始计数。PDB ID是指所参考的晶体结构。单体的分子大小展示了每个SADA结构域的理论分子量。使用Discovery Studio计算表面积和氢键数量。
图15示出了本发明技术的候选SADA-BsAb(SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28)的生物化学特性。假设每个scFv为25kDa，计算总单体大小。从使用expi293细胞的至少2次转染计算产率。通过SEC-HPLC确定纯度。高分子量和低分子量杂质分别被定义为主峰前或主峰后的峰。通过在37℃下孵育并每周通过SEC-HPLC定量来确定稳定性。
图16示出了如通过SPR所确定的本文公开的SADA-BsAb的GD2结合动力学的总结。使用双态反应模型计算值。Chi2值显示了原始数据与拟合数据(RU)之间的误差。通过将IgG-scFv-BsAb的KD除以P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)或P63-SADA-BsAb(SEQ ID NO:28)的KD计算倍数变化。
图17示出了P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)的药代动力学特性的总结。将NSG小鼠(n＝10)在静脉内施用BsAb后从0.5至168小时连续放血。使用WinNonlin软件程序(Pharsight Corp.)通过血清浓度-时间数据的非隔室分析进行药代动力学分析。
图18示出了从小鼠生物分布研究计算出的SADA PRIT剂量测定估计值以及它们相应的肿瘤与非肿瘤比率。向荷瘤小鼠(n＝3-5/时间点)给药每种BsAb(SEQ ID NO:27和SEQID NO:28)(1.25nmol)和DOTA[177Lu](18.5MBq)，相隔48小时。将小鼠在递送有效载荷后2、24、48或120小时处死。在施用DOTA[177Lu]前4小时，IgG-scFv-BsAb治疗小鼠接受25μg清除剂。
图19示出了在PET/CT扫描后DOTA[86Y]的组织生物分布的总结。向荷瘤小鼠给药每种BsAb(SEQ ID NO:27)(1.25nmol)和DOTA[86Y](3.7MBq)，相隔48小时，并且在成像后立刻处死。将值归一化为每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。两步IgG-scFv-BsAb治疗小鼠没有接受清除剂(CA)。三步IgG-scFv-BsAb治疗小鼠接受25mg CA。
图20示出了在用所指示的BsAb(SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28)/DOTA[177Lu]有效载荷方案治疗的裸小鼠中血清化学、全血细胞计数和组织病理学的总结。由通过职业认证的兽医病理学家进行解释。正常被定义为与未治疗的年龄匹配的同窝仔畜对照小鼠没有显著差异，或者在相同年龄的此小鼠品系的已知正常范围内。通过H&E载玻片的显微镜分析确定组织病理学异常。将小鼠在开始治疗后的111、155和230天递交用于评估。
图21示出了在用所指示的BsAb(SEQ ID NO:27)/DOTA[177Lu]有效载荷方案治疗的DKO小鼠中血清化学、全血细胞计数和组织病理学的总结。由通过职业认证的兽医病理学家进行解释。正常被定义为与未治疗的年龄匹配的同窝仔畜对照小鼠没有显著差异，或者在相同年龄的此小鼠品系的已知正常范围内。通过H&E载玻片的显微镜分析确定组织病理学异常。将小鼠在开始治疗后的120天递交用于评估。
图22A示出了在用所指示的BsAb(SEQ ID NO:27)/Proteus[225Ac]有效载荷方案治疗的DKO小鼠中血清化学、全血细胞计数和组织病理学的总结。由通过职业认证的兽医病理学家进行解释。正常被定义为与未治疗的年龄匹配的同窝仔畜对照小鼠没有显著差异，或者在相同年龄的此小鼠品系的已知正常范围内。通过H&E载玻片的显微镜分析确定组织病理学异常。将小鼠在开始治疗后的80-120天递交用于评估。CC-3：裂解的半胱天冬酶3免疫组织化学。
图22B示出了在用所指示的BsAb(SEQ ID NO:27)/Proteus[225Ac]有效载荷方案治疗的DKO小鼠中血清化学、全血细胞计数和组织病理学的总结。由通过职业认证的兽医病理学家进行解释。正常被定义为与未治疗的年龄匹配的同窝仔畜对照小鼠没有显著差异，或者在此年龄的此小鼠品系的已知正常范围内。通过H&E载玻片的显微镜分析确定组织病理学异常。将小鼠在开始治疗后的163、210和309天递交用于评估。MF：多病灶的。1级：极少的；2级：轻度的；3级：中度的
图23A示出了在DOTA[177Lu]小细胞肺癌患者源性异种移植物(PDX)治疗模型中的平均肿瘤反应。每个剂量的BsAb(SEQ ID NO:27)(1.25nmol，三角形)之后是48小时后的一定剂量的DOTA[177Lu](37kBq，700pmol，星形)。每条线表示一个治疗组(n＝4-5)。黑色虚线表示无可测量的肿瘤，并且星号表示肿瘤植入。计算肿瘤平均值，直到至少一只小鼠被实施安乐死。将数据显示为平均值±标准差。图23B示出了在DOTA[225Ac]小细胞肺癌患者源性异种移植物(PDX)治疗模型中的平均肿瘤反应。每个剂量的BsAb(SEQ ID NO:27)(1.25nmol，三角形)之后是48小时后的一定剂量的DOTA[225Ac](37kBq，700pmol，星形)。每条线表示一个治疗组。黑色虚线表示无可测量的肿瘤。计算肿瘤平均值，直到至少一只小鼠被实施安乐死。将数据显示为平均值±标准差。图23C示出了每个实验组的无进展存活率分析。当肿瘤的体积达到500mm3时，它们被认为“在进展中”。
图24A-24B示出了本发明技术的SADA-BsAb的体内生物分布。将荷瘤裸小鼠(IMR32Luc sc，右肋腹)用1.25nmol每种BsAb治疗，并且48小时后用18.5MBq(100pmol)DOTA177Lu治疗。在DOTALu177前4小时，将BC151(IgG-scFv-BsAb)用清除剂处理。将小鼠在施用Lu177后24h处死，并且收集器官并在γ计数器(Perkin Elmer)上读取。对计数进行衰减校正，并且将其相对于注射剂量(18.5MBq和器官重量)归一化。TC101＝SEQ ID NO:22，TC134＝SEQ ID NO:27，TC135＝SEQ ID NO:28，并且TC135-H＝SEQ ID NO:38。肾脏摄取不受6xHIS标签的存在或不存在的影响。
图25A-25B示出了本发明技术的SADA-BsAb的体内生物分布以及它们相应的基于图24A-24B中描述的结果的肿瘤与非肿瘤比率(将值归一化为肿瘤摄取(肿瘤与血液、肿瘤与肝脏、肿瘤与肾脏))。TC101＝SEQ ID NO:22，TC134＝SEQ ID NO:27，TC135＝SEQ ID NO:28，并且TC135-H＝SEQ ID NO:38。图25B表示来自图24A-24B的列表数据。肾脏摄取不受6xHIS标签的存在或不存在的影响。
图26示出了在24小时和在48小时血液中P53-SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)的浓度(n＝5)。将NSG小鼠(n＝10)在静脉内施用BsAb后从0.5至168小时连续放血。使用WinNonlin软件程序(Pharsight Corp.)通过血清浓度-时间数据的非隔室分析进行药代动力学分析。
具体实施方式
应理解，下面以不同详细程度描述了本发明方法的某些方面、模式、实施方案、变化形式和特征，以提供对本发明技术的实质性理解。
在实践本发明方法时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见例如，Sambrook和Russell编辑(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版；丛书Ausubel等人编辑(2007)CurrentProtocols in Molecular Biology；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson等人(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at OxfordUniversity Press)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,第5版；Gait编辑(1984)OligonucleotideSynthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic AcidHybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring HarborLaboratory)；Makrides编辑(2003)Gene Transfer and Expression in MammalianCells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Academic Press,London)；以及Herzenberg等人编辑(1996)Weir’s Handbook ofExperimental Immunology。检测和测量多肽基因表达产物水平(即，基因翻译水平)的方法是本领域熟知的，并且包括使用多肽检测方法，如抗体检测和定量技术。(还参见，Strachan和Read,Human Molecular Genetics,第二版(John Wiley and Sons,Inc.,NY,1999))。
通过将肿瘤靶向剂(例如，抗肿瘤IgG)与细胞毒性有效载荷(例如，螯合的放射性同位素)分开递送，利用多步骤靶向策略来克服TI的限制。例如，常规的两步预靶向放射免疫疗法(PRIT)首先施用工程化的双特异性抗体(BsAb)或化学修饰的单克隆抗体(步骤1，t1/2约数天)，随后在数小时或数天后递送小的放射性有效载荷(步骤2，t1/2约数分钟)，所述有效载荷寻出肿瘤结合抗体(图1A)。虽然此策略确实减少了一些组织中的毒性，但血液中残留的循环抗体足以阻止治疗指数或功效的任何实质性改善。一种解决方案是三步PRIT，其中在施用肿瘤靶向IgG(步骤1)后，引入清除剂步骤(步骤2)以在递送细胞毒性有效载荷(步骤3)前从血液中去除循环抗体。虽然包括清除剂可以改善TI，但最佳的清除剂剂量将根据肿瘤大小和抗原密度而变化，使临床转译大大复杂化。虽然高剂量的清除剂应当最大限度地去除IgG，但它也可能干扰肿瘤处的有效载荷摄取。相反，不足剂量的清除剂会在血液中留下大量的IgG，捕获注射的有效载荷，使它循环并且最终伤害骨髓和其他正常组织。因此，理想的靶向策略需要可以在有效载荷递送前始终从血液中清除自己而无需优化另外的或外源性试剂的肿瘤靶向平台。
本公开文本提供了用于使用特别设计的自组装分解(SADA)结构域向肿瘤多步骤递送细胞毒性有效载荷的新型平台(图1B)。当与BsAb融合时，所得SADA-BsAb自组装成稳定的四聚体复合物(220kDa)，其以高亲合力结合肿瘤，但是在血液中循环一段时间(数小时)后也可以分解为小二聚体(110kDa)或单体(55kDa)。重要的是，当四聚体复合物超过肾脏滤过的分子量(MW)截止值时，小单体下降到阈值以下，并且能够迅速且完全地从血液中清除。
虽然许多蛋白质疗法受益于较长的终末半衰期，但使用此类蛋白质递送高细胞毒性有效载荷不可避免地伤害敏感组织(如骨髓)。迄今，使用远远低于本文公开的两步SADA-PRIT方法达到的有效载荷剂量，FDA批准的所有8种抗体-药物缀合物和FDA批准的两种放射性标记的蛋白质疗法在临床开发期间都已经展示出一些骨髓毒性。本公开文本证明了本发明技术的SADA-BsAb与携带α(225Ac 1.48MBq/kg)或β(177Lu 6,660MBq/kg)放射性同位素的放射性有效载荷组合可在多种小鼠模型中消融已长成的实体瘤，而无需任何清除剂。取而代之的是，SADA平台利用在长寿命的大尺寸蛋白质与小肽之间的血液保留的狭窄窗口，暂时维持血浆半衰期的时间恰好足以有效地到达肿瘤，随后从血液中迅速且完全地清除。另外，与更常规的基于IgG的平台相比，这种快速清除使得SADA-BsAb的免疫原性大大降低，一种在需要多个治疗周期的治疗策略中至关重要的优势。
本文公开的方法消除了对肾脏、肝脏、骨髓、脾脏或脑的所有临床或组织学毒性，同时递送极大剂量的细胞毒性有效载荷。考虑到在常规RIT中这些器官对辐射相关毒性的敏感性，这些结果是关键且临床相关的。参见例如，Bodei等人,European Journal ofNuclear Medicine and Molecular Imaging 42,5-19(2015)；
Figure BDA0004113638650000111
等人,Journal ofNuclear Medicine 47,140-149(2006)；Gupta等人,Cancer Biotherapy andRadiopharmaceuticals 27,593-599(2012)；Heskamp等人,Journal of Nuclear Medicine58,926-933(2017)；Muselaers等人,Journal of Nuclear Medicine 57,34-34(2016)；Poty等人,Clinical Cancer Research 25,868-880(2019)；Vallabhajosula等人,Journalof Nuclear Medicine 46,850-858(2005)。
特别地，在本公开文本中实现的无骨髓毒性剂量水平(高达6,600MBq/kg)比目前在临床中使用的剂量水平(通常<150MBq/kg)呈指数级升高，展示了SADA-BsAb对放射敏感组织提供的安全界限。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科技术语通常都具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。例如，对“一个/一种细胞”的提及包括两个/两种或更多个/更多种细胞的组合，等等。通常，本文所用的命名和以下所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学以及核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域熟知且常用的那些。
如本文所用，关于数字的术语“约”通常视为包括落在所述数字任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字，除非上下文另外说明或另外明显看出(这样的数字低于可能值的0％或超过可能值的100％的情况除外)。
如本文所用，向受试者“施用”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、瘤内或局部。施用包括自我施用和由另一人施用。
如本文所用，术语“抗体”共同地指代免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合、以及在任何脊椎动物中例如在哺乳动物(如人、山羊、兔和小鼠)以及非哺乳动物物种中在免疫反应期间产生的类似分子(如鲨鱼免疫球蛋白)。如本文所用，“抗体”(包括完整免疫球蛋白)和“抗原结合片段”与目的分子(或一组高度类似的目的分子)特异性结合，而基本上排除与其他分子的结合(例如，对于目的分子的结合常数比对于生物样品中的其他分子的结合常数大至少103M-1、大至少104M-1或大至少105M-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包括基因工程化形式如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog和Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)；Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。
更具体地，抗体是指特异性识别并结合抗原表位的至少包含轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成，它们各自具有可变区，称为重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由抗体识别的抗原。通常，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。存在两种类型的轻链，兰布达(λ)和卡帕(κ)。存在五种主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，它们决定了抗体分子的功能活性。每条重链和轻链都含有恒定区和可变区(所述区域也称为“结构域”)。组合起来，重链可变区和轻链可变区特异性结合抗原。轻链可变区和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区。已经定义了框架区和CDR的范围(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，将其通过引用特此并入)。Kabat数据库目前在线上维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区(即组成性轻链和重链的组合框架区)主要采用β-片层构象，并且CDR形成连接β-片层结构并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分的环。因此，框架区起到形成支架的作用，所述支架通过链间非共价相互作用使CDR以正确取向定位。
CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依序编号，并且通常还依据定位特定CDR的链来标识。因此，VH CDR3位于发现它所在的抗体的重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自发现它所在的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合靶抗原(例如，GD2)的抗体将具有特定的VH区和VL区序列，因此具有特定的CDR序列。具有不同特异性(即对于不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR因抗体而异，但CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。如本文所用，“免疫球蛋白相关组合物”是指抗体(包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段与抗原特异性结合。
如本文所用，术语“抗体相关多肽”意指包括单链抗体在内的抗原结合抗体片段，其可以单独包含一个或多个可变区或者包含一个或多个可变区与以下多肽要素中的全部或部分的组合：抗体分子的铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。所述技术中还包括一个或多个可变区以及铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。可用于本发明方法中的抗体相关分子是例如但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。例子包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”或“抗原结合片段”可以包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段或抗原结合片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“双特异性抗体”或“BsAb”是指可以同时与具有不同结构的两种靶标(例如，两种不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位或者半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位)结合的免疫球蛋白相关组合物。多种不同的双特异性抗体结构是本领域已知的。在一些实施方案中，双特异性抗体中的每个抗原结合部分都包括VH和/或VL区；在一些此类实施方案中，VH和/或VL区是在特定单克隆抗体中发现的那些。在一些实施方案中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，每个抗原结合部分包括来自不同单克隆抗体的VH和/或VL区。在一些实施方案中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，其中两个抗原结合部分中的一个包括具有VH和/或VL区的免疫球蛋白分子，所述VH和/或VL区含有来自第一单克隆抗体的CDR；并且另一个抗原结合部分包括具有VH和/或VL区的抗体片段(例如，Fab、F(ab')、F(ab')2、Fd、Fv、dAB、scFv等)，所述VH和/或VL区含有来自第二单克隆抗体的CDR。
如本文所用，术语“缀合”是指通过本领域技术人员已知的任何方法使两个分子缔合。合适的缔合类型包括化学键和物理键。化学键包括例如共价键和配位键。物理键包括例如氢键、偶极相互作用、范德华力、静电相互作用、疏水相互作用和芳环堆积。
如本文所用，术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH VL)。通过使用过短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如以下文献中：EP404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。单链抗体分子可以包含具有多个单独分子的聚合物，例如二聚体、三聚体或其他聚合物。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，从而使得它们能够成为单条蛋白质链，在其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。Bird等人(1988)Science242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:5879-5883。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶促切割或化学切割来制备。
任何上述抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性筛选所述片段。
如本文所用，“抗原”是指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原可以是GD2。也可以将抗原施用至动物以在动物中产生免疫反应。
术语“抗原结合片段”是指完整免疫球蛋白结构的片段，其具有负责与抗原结合的多肽部分。可用于本发明技术中的抗原结合片段的例子包括scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab′和F(ab′)2，但不限于此。
“结合亲和力”意指分子(例如，抗体)的单个结合位点与分子的结合配偶体(例如，抗原或抗原肽)之间的总非共价相互作用的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的标准方法(包括本文所述的那些)来测量。低亲和力复合物含有通常倾向于容易从抗原解离的抗体，而高亲和力复合物含有通常倾向于更长时间地保持与抗原结合的抗体。
如本文所用，“结合结构域”是指与靶部分或实体特异性结合的部分或实体。通常，结合结构域与其靶标之间的相互作用是非共价的。在一些实施方案中，结合结构域可以是或包括任何化学类别的部分或实体，包括例如碳水化合物、脂质、核酸、金属、多肽、小分子。在一些实施方案中，结合结构域可以是或包括多肽(或其复合物)、免疫球蛋白相关组合物的靶标结合部分、细胞因子、配体(例如，受体配体)、受体、毒素等。在某些实施方案中，结合结构域可以是或包括适配体。在其他实施方案中，结合结构域可以是或包括肽核酸(PNA)。
如本文所用，术语“生物样品”意指源自活细胞的样品材料。生物样品可以包括从受试者分离的组织、细胞、细胞的蛋白质或膜提取物和生物流体(例如，腹水或脑脊液(CSF))，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。本发明技术的生物样品包括但不限于取自以下的样品：乳腺组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头或颈、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑下垂体、肾脏组织、肌肉、食管、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、毛发、颊、皮肤、血清、血浆、CSF、精子、前列腺液、精液、尿液、粪便、汗液、唾液、痰、粘液、骨髓、淋巴液和泪液。生物样品也可以从内脏的活检或从癌症获得。生物样品可以从受试者获得以进行诊断或研究；或者可以从未患病的个体获得，作为对照或用于基础研究。样品可以通过标准方法来获得，所述标准方法包括例如静脉穿刺和手术活检。在某些实施方案中，生物样品是通过针吸活检获得的组织样品。
如本文所用，术语“嵌合抗体”意指这样的抗体，在其中使用重组DNA技术将来自一种物种的单克隆抗体的Fc恒定区(例如，小鼠Fc恒定区)用来自另一种物种的抗体的Fc恒定区(例如，人Fc恒定区)替代。一般参见，Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人美国专利号4,816,567；Cabilly等人,欧洲专利申请0125,023；Better等人,Science 240:1041-1043,1988；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443,1987；Liu等人,J.Immunol 139:3521-3526,1987；Sun等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218,1987；Nishimura等人,Cancer Res47:999-1005,1987；Wood等人,Nature 314:446-449,1885；以及Shaw等人,J.Natl.CancerInst.80:1553-1559,1988。
如本文所用，“清除剂”是与存在于受试者血液隔室中的过量双功能抗体结合以促进经由肾脏迅速清除的药剂。在施用半抗原前使用清除剂有助于在PRIT系统中获得更好的肿瘤与背景比。清除剂的例子包括500kD-葡聚糖-DOTA-Bn(Y)(Orcutt等人,Mol CancerTher.11(6):1365-1372(2012))、500kD氨基葡聚糖-DOTA缀合物、针对预靶向抗体的抗体等。
如本文所用，术语“共有FR”意指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区。抗体的FR区不接触抗原。
如本文所用，“对照”是在实验中出于比较目的使用的替代样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，在实验目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗的功效的相关性的情况下，通常采用阳性对照(已知展现出所需治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(不接受治疗或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用，“剂型”和“单位剂型”，术语“剂型”是指用于待治疗受试者(例如，人类患者)的治疗剂的物理离散单位。每个单位含有经计算或证明当根据适当的给药方案施用至相关群体时产生所需治疗效果的预定量的活性材料。例如，在一些实施方案中，这种量是适于根据给药方案施用的单位剂量量(或其整数分数)，已经确定所述给药方案在施用至相关群体(即，采用治疗性给药方案)时与所需的或有益的结局相关。然而，将理解，向任何特定患者施用的总剂量将由医疗专业人员(例如，医师)在合理的医疗判断范围内进行选择。
如本文所用的“给药方案”(或“治疗方案”)是通常隔开一段时间单独施用至受试者的一组单位剂量(通常多于一个)。在一些实施方案中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，其可以涉及一个或多个剂量。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，每个剂量彼此隔开相同长度的时间段；在某些实施方案中，给药方案包括多个剂量并且至少两个不同的时间段隔开单独的剂量。在一些实施方案中，在预定的时间段内连续(例如，通过输注)施用治疗剂。在其他实施方案中，每天一次(QD)或每天两次(BID)施用治疗剂。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，每个剂量彼此隔开相同长度的时间段；在其他实施方案中，给药方案包括多个剂量并且至少两个不同的时间段隔开单独的剂量。在一些实施方案中，给药方案内的所有剂量都具有相同的单位剂量量。在某些实施方案中，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施方案中，给药方案包括第一剂量量的第一剂量，随后是与第一剂量量不同的第二剂量量的一个或多个另外的剂量。在其他实施方案中，给药方案包括第一剂量量的第一剂量，随后是与第一剂量量相同的第二剂量量的一个或多个另外的剂量。在一些实施方案中，当在相关群体中施用时给药方案与所需的或有益的结局相关(即，是治疗性给药方案)。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需的治疗和/或预防效果的量，例如导致预防或减少本文所述的疾病或病症或者与本文所述的疾病或病症相关的一种或多种体征或症状的量。在治疗性或预防性应用的背景下，施用至受试者的组合物的量将根据组合物、疾病的程度、类型和严重程度以及根据个体的特征(如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性)而变化。熟练技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。组合物也可以与一种或多种另外的治疗性化合物组合施用。在本文所述的方法中，可以将治疗性组合物施用至具有本文所述的疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。如本文所用，组合物的“治疗有效量”是指疾病或病症的生理影响得到改善或消除的组合物水平。可以在一次或多次施用中给予治疗有效量。
如本文所用，术语“效应细胞”意指参与免疫反应的效应阶段的免疫细胞，所述效应阶段与免疫反应的认知阶段和激活阶段相反。示例性的免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。效应细胞表达特定的Fc受体并且执行特定的免疫功能。效应细胞可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，例如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达FcαR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞参与靶细胞的特异性杀伤以及将抗原呈递至免疫系统的其他组分，或者与呈递抗原的细胞的结合。
如本文所用，术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合丧失，但是与后者的结合不丧失。
如本文所用，“表达”包括以下中的一项或多项：基因转录成前体mRNA；前体mRNA的剪接和其他加工以产生成熟mRNA；mRNA稳定性；成熟mRNA翻译成蛋白质(包括密码子使用和tRNA可用性)；以及翻译产物的糖基化和/或其他修饰(如果适当的表达和功能需要)。
如本文所用，术语“基因”意指含有用于RNA产物的经调控的生物合成的所有信息的DNA区段，包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其他非翻译区。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列可以出于比较目的被比对。当所比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度随序列共享的匹配或同源位置数而变。多核苷酸或多核苷酸区域(或者多肽或多肽区域)与另一个序列具有一定百分比(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意味着，当比对时，在比较两个序列时，该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序确定此比对以及同源性或序列同一性百分比。在一些实施方案中，使用默认参数进行比对。一种比对程序是BLAST，使用默认参数。具体而言，程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在美国国家生物技术信息中心找到。生物学上等同的多核苷酸是具有指定同源性百分比并编码具有相同或相似生物活性的多肽的多核苷酸。如果两个序列彼此共享小于40％的同一性或小于25％的同一性，则将它们视为“无关的”或“非同源的”。
如本文所用，非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中受体的高变区残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的具有所需特异性、亲和力和能力的高变区残基(供体抗体)替代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步完善抗体性能，如结合亲和力。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv)的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有FR序列的FR区，尽管FR区可以包括改善结合亲和力的一个或多个氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。参见例如，Ahmed和Cheung,FEBS Letters588(2):288-297(2014)。
如本文所用，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)前后，以及VH中的31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)前后(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)))。
如本文所用，当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，术语“相同”或“同一性”百分比是指当在比较窗口或特定区域上比较和比对以求最大对应时，如使用采用以下所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查(例如，NCBI网站)所测量的，两个或更多个序列或子序列相同或者具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域(例如，编码本文所述的SADA-BsAb的核苷酸序列或本文所述的SADA-BsAb的氨基酸序列)上约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。然后此类序列被说成“基本上相同”。此术语也涉及或者可以应用于测试序列的互补体。所述术语还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。在一些实施方案中，在长度为至少约25个氨基酸或核苷酸或者长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域中存在同一性。
如本文所用，术语“完整抗体”或“完整免疫球蛋白”意指具有通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽的抗体。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是单独的生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，个体、患者或受试者是人。
如本文所用，“KD”是指结合结构域(例如，SADA结构域、抗体或其结合组分)从具有其配偶体(例如，相应的SADA结构域或者抗体或其结合组分所结合的表位)的复合物解离的解离常数。
如本文所用，“koff”是指结合剂(例如，SADA结构域、抗体或其结合组分)从具有其配偶体(例如，相应的SADA结构域或者抗体或其结合组分所结合的表位)的复合物解离的解离速率常数。
如本文所用，“kon”是指结合剂(例如，SADA结构域、抗体或其结合组分)与其配偶体(例如，相应的SADA结构域或者抗体或其结合组分所结合的表位)缔合的缔合速率常数。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体(即，除了可能少量存在的可能自然发生的突变之外，构成所述群体的单独抗体是相同的)获得的抗体。例如，单克隆抗体可以是源自单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)而不是产生它的方法的抗体。单克隆抗体组合物对特定表位展示出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。可以使用本领域已知的多种技术来制备单克隆抗体，所述技术包括例如但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如，待根据本发明方法使用的单克隆抗体可以通过最初由Kohler等人,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。例如，“单克隆抗体”也可以使用Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
如本文所用，“接头”通常是指连接两个或更多个不同目的区域(例如，特定目的结构和/或功能结构域或部分)的分子或实体部分。接头可能缺乏所定义的或刚性的结构和/或可能不会实质性地改变两个或更多个不同目的区域内的一个或多个结构域或者一个或多个部分的相关功能。在一些实施方案中，接头是或包含多肽，并且可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸长。在某些实施方案中，多肽接头可以具有是或包含GGGGS GGGGS GGGGS(即，[G4S]3)(SEQ ID NO:19)、GGGGS GGGGS GGGGSGGGGS(即，[G4S]4)(SEQ ID NO:20)或GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS(即，[G4S]6)(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列。
如本文所用，“多聚体”是指单体单元的复合体，并且可以包括三聚体和四个单体的多聚体(四聚体)或者多于四个单体的多聚体(五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体等)。促进单体单元的缔合以形成多聚体复合体的结构域称为“多聚化结构域”。
如本文所用，“有效载荷”是指通过与另一个实体缔合而递送至目的位点(例如，至细胞、组织、肿瘤或有机体)的部分或实体。在一些实施方案中，有效载荷是或包含检测剂或治疗剂。本领域普通技术人员将理解有效载荷实体可以属于任何化学类别。例如，在一些实施方案中，有效载荷实体可以是或包括碳水化合物、同位素、脂质、核酸、金属、纳米颗粒(例如，陶瓷或聚合物纳米颗粒)、多肽、小分子等。仅举几个例子，在一些实施方案中，治疗剂有效载荷可以是或包括毒素(例如，毒性肽、小分子或同位素[例子，放射性同位素])；在一些实施方案中，检测剂有效载荷可以是或包括荧光实体或药剂、放射性实体或药剂、通过结合可检测的药剂或实体(例如，标签、半抗原、配体等)、催化剂等。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其配制品是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences(第20版,编辑A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)中。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”意指任何RNA或DNA，其可以是未修饰的或修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、作为单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链和双链区域的混合物的RNA以及包含DNA和RNA的杂交分子，所述DNA和RNA可以是单链的或更通常是双链的或者单链和双链区域的混合物。另外，多核苷酸是指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA以及出于稳定性或其他原因对骨架进行修饰的DNA或RNA。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于意指包含通过肽键或修饰的肽键(即，肽电子等排体)彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。多肽既是指通常称为肽、糖肽或寡聚物的短链，也是指通常称为蛋白质的较长链。多肽可以含有除了20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。多肽包括通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰充分描述于基础教材和更详细的专题论文以及长篇研究文献中。
如本文所用的术语“放射性同位素”具有其本领域理解的含义，是指经历放射性衰变的同位素。在一些实施方案中，放射性同位素可以是或包括以下中的一种或多种：锕-225、砹-211、铋-212、碳-14、铬-51、氯-36、钴-57、钴-58、铜-67、铕-152、镓-67、氢-3、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131、铟-111、铁-59、铅-212、镥-177、磷-32、镭-223、镭-224、铼-186、铼-188、硒-75、硫-35、锝(technicium)-99m、钍-227、钇-90和锆-89。
如本文所用，术语“重组”当关于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者指示所述材料源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在所述细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因，或者表达原本异常表达、表达不足或完全不表达的天然基因。
如本文所用，术语“分开”治疗使用是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，术语“依序”治疗使用是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径相同或不同。更具体地，依序使用是指一种活性成分的整个施用在一种或多种其他活性成分的施用开始前。因此，可以在施用一种或多种其他活性成分前几分钟、几小时或几天内施用一种活性成分。在这种情况下，没有同时治疗。
如本文所用，“特异性结合”是指分子(例如，抗体或其抗原结合片段)识别并结合另一个分子(例如，抗原)，但是基本上不识别并结合其他分子。如本文所用，术语“特异性结合”特定分子(例如，多肽或多肽上的表位)、“特异性结合至”所述特定分子或对所述特定分子具有“特异性”可以例如通过分子对其所结合的分子的KD为约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M来展现。术语“特异性结合”还可以指代这样的结合，其中分子(例如，抗体或其抗原结合片段)与特定抗原(例如，GD2)或特定抗原上的表位结合，而基本上不与任何其他抗原或抗原表位结合。
如本文所用，术语“同时”治疗使用是指通过相同途径并且同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，“表面等离子体共振”是指这样的光学现象，其允许实时分析特异性结合相互作用，例如通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化，如通过使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，瑞典乌普萨拉和新泽西州皮斯卡塔韦)。关于进一步的说明，参见Jonsson,U.等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson,U.等人,(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.等人,(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；以及Johnnson,B.等人,(1991)Anal Biochem.198:268-277。
如本文所用，术语“治疗剂”旨在意指当以有效量存在时对有需要的受试者产生所需治疗效果的化合物。
如本文所用的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖对受试者(如人)的本文所述的疾病或障碍的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即使障碍消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，治疗意指与疾病相关的症状例如得到缓和、减少、治愈或处于缓解状态。
还应理解，如本文所述的障碍的各种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗以及不到完全治疗，并且其中实现了一些生物学或医学上相关的结果。治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗，或者是针对急性病症治疗的单次或几次施用。
考虑了本文所述的抗GD2 SADA缀合物的一种或多种氨基酸序列修饰。例如，可能希望改善抗GD2 SADA缀合物的结合亲和力和/或其他生物特性。通过将适当的核苷酸变化引入抗GD2 SADA缀合物核酸中或通过肽合成来制备抗GD2 SADA缀合物的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗GD2 SADA缀合物的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。只要所获得的抗GD2 SADA缀合物具有所需的特性，就可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得目的抗GD2 SADA缀合物。修饰还包括蛋白质糖基化模式的变化。进行取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但是也考虑了FR改变。“保守取代”在下表中示出。
Figure BDA0004113638650000191
Figure BDA0004113638650000201
本发明技术的抗GD2 SADA缀合物组合物
本发明技术的抗GD2 SADA缀合物(例如，抗DOTA双特异性抗原结合片段)包含P53或P63的自组装分解(SADA)多肽，其与GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域融合。在一些实施方案中，此类缀合物的特征在于它们在相关条件下(例如，在缀合物在其中高于阈值浓度或pH的情况下所存在的溶液中和/或当存在于由有效载荷的受体的相关水平或密度表征的靶位点处时)多聚化以形成所需大小的复合物，并且在其他条件(例如，不存在相关的环境多聚化触发物)下分解成更小的形式。
SADA结构域由多聚化结构域构成，每个多聚化结构域由以平行或反平行取向缔合的螺旋束构成。含有SADA结构域的人多肽的例子包括p53、p63、p73、核不均一核糖核蛋白(hnRNPC)C、或突触相关蛋白23(SNAP-23)的N末端结构域、细胞周期蛋白D相关蛋白(CBFA2T1)、或其变体或片段。参见图14。下面提供了人p53四聚化结构域和p63四聚化结构域的示例性氨基酸序列：
人p53四聚化结构域氨基酸序列(321-359)(SEQ ID NO:36)
KPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEP
人p63四聚化结构域氨基酸序列(396-450)(SEQ ID NO:37)
RSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQ
KQ
本文公开的抗GD2 SADA缀合物的GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域中的每一个可以包含重链可变结构域(VH)序列和轻链可变结构域(VL)序列。下面提供了所述抗GD2 SADA缀合物的GD2特异性抗原结合结构域的示例性VH和VL氨基酸序列：
hu3F8 VH
QVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)
hu3F8 VL
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKR(SEQ ID NO:5)
SEQ ID NO:1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列分别是NYGVH(SEQ ID NO:2)、VIWAGGITNYNSAFMS(SEQ ID NO:3)和RGGHYGYALDY(SEQ ID NO:4)，并且按出现顺序加下划线。SEQ ID NO:5的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列分别是KASQSVSNDVT(SEQ ID NO:6)、SASNRYS(SEQ ID NO:7)和QQDYSS(SEQ ID NO:8)，并且按出现顺序加下划线。
下面提供了所述抗GD2 SADA缀合物的DOTA特异性抗原结合结构域的示例性VH和VL氨基酸序列：
huC825 VH
HVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)
huC825 VL
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(SEQ ID NO:13)
C825 VH
HVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSS(SEQ ID NO:17)
C825 VL
QAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG(SEQ ID NO:18)
SEQ ID NO:9和17的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列分别是DYGVH(SEQ ID NO:10)、VIWSGGGTAYNTALIS(SEQ ID NO:11)、RGSYPYNYFDA(SEQ ID NO:12)，并且按出现顺序加下划线。SEQ ID NO:13和18的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列分别是GSSTGAVTASNYAN(SEQID NO:14)、GHNNRPP(SEQ ID NO:15)和ALWYSDHWV(SEQ ID NO:16)，并且按出现顺序加下划线。
在一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的GD2特异性抗原结合结构域包含分别地SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH)序列和轻链可变结构域(VL)序列。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的DOTA特异性抗原结合结构域包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的重链可变结构域(VH)序列和SEQ ID NO:13或SEQID NO:18的轻链可变结构域(VL)序列。在本发明技术的抗GD2SADA缀合物的任何和所有实施方案中，所述SADA多肽是或包含p53或p63的四聚化结构域。在一些实施方案中，所述SADA多肽是或包含与SEQ ID NO:36和37中任一个所示的序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，所述SADA多肽是或包含与SEQ ID NO:36和37中任一个所示的序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列，并且其中以上这些序列中加下划线的氨基酸残基是保守的。
另外地或可替代地，在本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的某些实施方案中，所述SADA多肽经由接头与所述GD2特异性抗原结合结构域或所述DOTA特异性抗原结合结构域共价连接。可以使用本领域已知的任何合适的接头。在一些实施方案中，所述SADA多肽经由多肽接头与所述GD2特异性抗原结合结构域或所述DOTA特异性抗原结合结构域连接。在某些实施方案中，所述多肽接头是Gly-Ser接头。在另外的实施方案中，多肽接头是或包含(GGGGS)n的序列，其中n表示重复的GGGGS单元的数量并且为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多。在所述抗GD2 SADA缀合物的其他实施方案中，所述SADA多肽直接与所述GD2特异性抗原结合结构域或所述DOTA特异性抗原结合结构域融合。
在本文公开的抗GD2 SADA缀合物的任何前述实施方案中，所述GD2特异性抗原结合中的所述VH结构域序列和所述VL结构域序列可以经由肽内接头连接。在某些实施方案中，所述肽内接头是Gly-Ser接头，或者包含(GGGGS)n的序列，其中n表示重复的GGGGS单元的数量并且为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多。另外地或可替代地，在一些实施方案中，在所述GD2特异性抗原结合结构域中的所述VH结构域序列与所述VL结构域序列之间的所述肽内接头的序列是SEQ ID NO:19-21中的任一个。
在本文公开的抗GD2 SADA缀合物的任何和所有实施方案中，所述DOTA特异性抗原结合中的所述VH结构域序列和所述VL结构域序列可以经由肽内接头连接。在某些实施方案中，所述肽内接头是Gly-Ser接头，或者包含(GGGGS)n的序列，其中n表示重复的GGGGS单元的数量并且为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多。另外地或可替代地，在一些实施方案中，在所述DOTA特异性抗原结合结构域中的所述VH结构域序列与所述VL结构域序列之间的所述肽内接头的序列是SEQ ID NO:19-21中的任一个。
在本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的任何和所有实施方案中，所述GD2特异性抗原结合结构域和所述DOTA特异性抗原结合结构域可以经由肽内接头连接。在某些实施方案中，所述肽内接头是Gly-Ser接头，或者包含(GGGGS)n的序列，其中n表示重复的GGGGS单元的数量并且为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多。另外地或可替代地，在一些实施方案中，在所述GD2特异性抗原结合结构域与所述DOTA特异性抗原结合结构域之间的所述肽内接头的序列是SEQ ID NO:19-21中的任一个。
在某些实施方案中，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：(i)SEQ ID NO:5的VL序列；(ii)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(iii)SEQ ID NO:1的VH序列；(iv)包含SEQ IDNO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(v)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；(vi)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(vii)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；(viii)包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及(ix)SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
在一些实施方案中，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：(i)SEQ ID NO:5的VL序列；(ii)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(iii)SEQ ID NO:1的VH序列；(iv)包含SEQ IDNO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(v)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；(vi)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(vii)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；(viii)包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及(ix)SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
在其他实施方案中，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：(i)SEQ ID NO:1的VH序列；(ii)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(iii)SEQ ID NO:5的VL序列；(iv)包含SEQ IDNO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(v)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；(vi)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(vii)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；(viii)包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及(ix)SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
在一些实施方案中，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：(i)SEQ ID NO:1的VH序列；(ii)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(iii)SEQ ID NO:5的VL序列；(iv)包含SEQ IDNO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(v)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；(vi)包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；(vii)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；(viii)包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及(ix)SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
下面提供了示例性的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物(例如，抗DOTA双特异性抗原结合片段)：
抗GD2×抗DOTA P53 SADA(无HIS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、huC825-scFv、(IgG3间隔子)、huP53-tet)(SEQ ID NO:22)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(TPLGDTTHT)SGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGA
抗GD2×抗DOTA P53 SADA(LS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、huC825-scFv、(IgG3间隔子)、huP53-tet)(SEQ ID NO:23)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(TPLGDTTHT)SGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAPHHHHHH抗GD2×抗DOTA P63 SADA(LS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、huC825-scFv、(IgG3间隔子)、huP63-tet)(SEQ ID NO:24)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(TPLGDTTHT)SGRSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQKQGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×抗DOTA P53 SADA(SS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、huC825-scFv、(IgG3间隔子)、huP53-tet)(SEQ ID NO:25)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(TPLGDTTHT)SGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×抗DOTA P63 SADA(SS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、huC825-scFv、(IgG3间隔子)、huP63-tet)(SEQ ID NO:26)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(TPLGDTTHT)SGRSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQKQGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×抗DOTA P53 SADA(LL)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、huC825-scFv、(IgG3间隔子)、huP53-tet)(SEQ ID NO:27)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(TPLGDTTHT)SGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×抗DOTA P63 SADA(LL)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、huC825-scFv、(IgG3间隔子)、huP63-tet)(SEQ ID NO:28)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(TPLGDTTHT)SGRSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQKQGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×鼠抗DOTA P53 SADA(无HIS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、C825-scFv、(IgG3间隔子)、huP53-tet)(SEQ ID NO:29)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG(TPLGDTTHT)SGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGA
抗GD2×鼠抗DOTA P53 SADA(LS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、C825-scFv、(IgG3间隔子)、huP53-tet)(SEQ ID NO:30)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG(TPLGDTTHT)SGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAPHHHHHH抗GD2×鼠抗DOTA P63 SADA(LS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、C825-scFv、(IgG3间隔子)、huP63-tet)(SEQID NO:31)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG(TPLGDTTHT)SGRSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQKQGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×鼠抗DOTA P53 SADA(SS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、C825-scFv、(IgG3间隔子)、huP53-tet)(SEQ ID NO:32)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG(TPLGDTTHT)SGKPLDGEYFTLQIRGR ERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×鼠抗DOTA P63 SADA(SS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、C825-scFv、(IgG3间隔子)、huP63-tet)(SEQ ID NO:33)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG(TPLGDTTHT)SGRSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQKQGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×鼠抗DOTA P53 SADA(LL)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、C825-scFv、(IgG3间隔子)、huP53-tet)(SEQ ID NO:34)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG(TPLGDTTHT)SGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×鼠抗DOTA P63 SADA(LL)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、C825-scFv、(IgG3间隔子)、huP63-tet)(SEQ ID NO:35)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG(TPLGDTTHT)SGRSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQKQGGSGGAPHHHHHH
抗GD2×抗DOTA P63 SADA(LL)(无HIS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、huC825-scFv、(IgG3间隔子)、huP63-tet)(SEQ ID NO:38)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(TPLGDTTHT)SGRSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQKQGGSGGA
抗GD2×抗DOTA P53 SADA(LL)(无HIS)多肽(hu3F8-scFv、GS接头、huC825-scFv、(IgG3间隔子)、huP53-tet)(SEQ ID NO:39)
EIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGCGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKCLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTDYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQQKPGQCPRGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLLGGKAALTLLGAQPEDEAEYYCALWYSDHWVIGGGTKLTVLG(TPLGDTTHT)SGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKE PGGSGGA
缀合物产生。本文所述的抗GD2 SADA缀合物可以使用本领域已知的分子生物学方法由核酸分子产生。将核酸分子插入载体中，所述载体在引入适当的宿主细胞中时能够表达融合蛋白。适当的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入载体中的任何方法都可以用于构建在转录/翻译控制信号的控制下编码本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(参见Sambrook等人Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory；Current Protocols in Molecular Biology,编辑Ausubel等人,Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience,NY)。
编码本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的核酸分子的表达可以由第二核酸序列调控，使得所述分子在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，编码本发明技术的抗GD2SADA缀合物的核酸分子的表达可以由本领域已知的启动子和/或增强子元件控制。
核酸构建体包括编码抗GD2 SADA缀合物的序列，所述抗GD2 SADA缀合物包括SADA结构域、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域。通常，此类抗原结合结构域将由VH和/或VL区产生。在鉴定和选择展示出所需结合和/或功能特性的抗原结合结构域后，将每个抗原结合结构域的可变区分离、扩增、克隆并且测序。可以对VH和VL核苷酸序列进行修饰，包括添加编码氨基酸和/或携带限制性位点的核苷酸序列、缺失编码氨基酸的核苷酸序列或取代编码氨基酸的核苷酸序列。所述抗原结合结构域可以由人抗体、人源化抗体或嵌合抗体产生。
将编码本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的核酸构建体通过本领域已知的方法插入表达载体或病毒载体中，并且将核酸分子可操作地连接到表达控制序列。
在适当的情况下，可以修饰编码如本文所述的抗GD2 SADA缀合物的核酸序列以包括经优化用于在特定细胞类型或生物体中表达的密码子(例如，参见美国专利号5,670,356和美国专利号5,874,304)。密码子优化的序列是合成序列，并且优选编码由非密码子优化的亲本多核苷酸编码的相同多肽(或全长多肽的具有与全长多肽基本上相同的活性的生物活性片段)。在一些实施方案中，编码抗体组分的遗传物质的编码区可以全部或部分地包括改变的序列以优化密码子使用用于特定细胞类型(例如，真核或原核细胞)。例如，可以优化如本文所述的人源化重(或轻)链可变区的编码序列以在细菌细胞中表达。可替代地，可以优化所述编码序列以在哺乳动物细胞(例如，CHO)中表达。可以将这种序列描述为密码子优化的序列。
将含有核酸分子的表达载体转化到合适的宿主细胞中，以允许产生由核酸构建体编码的蛋白质。示例性宿主细胞包括原核细胞(例如，大肠杆菌)和真核细胞(例如，COS或CHO细胞)。使用表达载体转化的宿主细胞在允许产生本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的条件下生长，随后回收所述抗GD2 SADA缀合物。
本公开文本的抗GD2 SADA缀合物可以通过任何技术来纯化。例如，抗GD2SADA缀合物可以作为可溶性多肽或包涵体从细胞中回收，它们可以通过8M盐酸胍和透析定量地从其中提取。为了进一步纯化本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，可以使用常规的离子交换色谱法、疏水作用色谱法、反相色谱法或凝胶过滤。也可以在从真核或原核细胞分泌后从条件培养基中回收本发明技术的抗GD2 SADA缀合物。
在一些实施方案中，如本领域将理解的，可以在不进一步修饰的情况下使用抗GD2SADA缀合物。在一些实施方案中，可以将抗GD2 SADA缀合物掺入组合物或配制品中。
用于将药剂或其组分与其他部分或实体缀合的多种技术是本领域熟知的，并且可以根据本公开文本的实践加以利用。仅举一个例子，放射性标记的抗GD2 SADA缀合物可以根据本领域熟知的技术来产生。例如，在一些实施方案中，抗GD2 SADA缀合物可以通过与碘化钠和/或碘化钾以及化学氧化剂(如次氯酸钠)或酶促氧化剂(如乳过氧化物酶)接触而碘化。在一些实施方案中，抗GD2 SADA缀合物可以通过配体交换过程用锝-99m标记，例如通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并且将所述抗GD2 SADA缀合物施加到所述柱上。在一些实施方案中，将本发明技术的抗GD2 SADA缀合物使用直接标记技术标记，例如通过将高锝酸盐、还原剂(如SNCl2)、缓冲溶液(如邻苯二甲酸钠钾溶液)与所述抗GD2 SADA缀合物一起孵育。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素与抗GD2SADA缀合物结合的中间官能团是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或对氨基苄基-DOTA(Bn-DOTA)。放射性同位素可以通过例如剂量测定来检测。
本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的治疗用途
在一个方面，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物组合物(例如，任何本文所述的其抗GD2×抗DOTA抗原结合片段)可用于治疗GD2相关癌症。这种治疗可以用于被鉴定为具有病理上高水平的GD2的患者(例如，通过本领域已知的常规检测方法诊断的患者)或被诊断为患有已知与此类病理水平相关的疾病的患者。可以由本发明技术的抗GD2 SADA缀合物组合物治疗的GD2相关癌症的例子包括但不限于：神经母细胞瘤、黑色素瘤、软组织肉瘤、脑肿瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌或视网膜母细胞瘤。在一些实施方案中，所述软组织肉瘤是脂肪肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤或梭形细胞肉瘤。
本发明技术的组合物可以与可用于GD2相关癌症的治疗中的其他治疗剂联合采用。例如，可以将本发明技术的抗GD2 SADA缀合物与选自以下的至少一种另外的治疗剂分开地、依序地或同时地施用：烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、抑制细胞的生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、二膦酸盐治疗剂和靶向生物治疗剂(例如，US6306832、WO 2012007137、WO 2005000889、WO 2010096603等中描述的治疗性肽。)纳米颗粒、脂质体、其他DOTA半抗原(Proteus样等)。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是化学治疗剂。特定化学治疗剂包括但不限于环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达曲沙(10-乙基-10-脱氮-氨基喋呤)、塞替派、卡铂、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、蛋白质结合的紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、替莫唑胺、拓扑替康、长春新碱、长春碱、艾日布林、突变霉素、卡培他滨、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、亮丙瑞林、阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、利塞膦酸盐、帕米膦酸盐、伊班膦酸盐、阿仑膦酸盐、地诺单抗、唑来膦酸盐、曲妥珠单抗、泰克博(tykerb)、蒽环类(例如，柔红霉素和多柔比星)、贝伐单抗、奥沙利铂、美法仑、依托泊苷、氮芥、博来霉素、微管毒药、番荔枝内酯或其组合。
本发明技术的抗GD2 SADA缀合物组合物可以任选地以单剂量施用至有需要的受试者。可替代地，给药方案可以包括在肿瘤出现后的不同时间进行的多次施用。施用可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、颅内、瘤内、鞘内或局部。施用包括自我施用和由另一人施用。还应理解，如所描述的医学病症的各种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗以及不到完全治疗，并且其中实现了一些生物学或医学上相关的结果。在一些实施方案中，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物组合物构成药物配制品，可以将所述药物配制品以一个或多个剂量施用至有需要的受试者。可以调整剂量方案以提供所需反应(例如，治疗反应)。
通常，足以实现治疗效果的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物组合物的有效量的范围从约0.000001mg/千克体重/天至约10,000mg/千克体重/天。通常，剂量范围为从约0.0001mg/千克体重/天至约100mg/千克体重/天。对于施用抗GD2 SADA缀合物，剂量的范围从每周、每两周或每三周约0.0001至100mg/kg受试者体重，并且更通常为0.01至5mg/kg受试者体重。例如，剂量可以是每周、每两周或每三周1mg/kg体重或10mg/kg体重，或者在每周、每两周或每三周1-10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，抗GD2 SADA缀合物的单剂量的范围从0.1-10,000微克/kg体重。在一个实施方案中，载体中的抗GD2SADA缀合物浓度的范围从每递送一毫升0.2至2000微克。可以在多个时机施用抗GD2SADA缀合物。单剂量之间的间隔可以是每小时、每日、每周、每月或每年。如通过测量受试者中抗GD2 SADA缀合物的血液水平所指示的，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调整剂量以在受试者中实现以下血清抗GD2 SADA缀合物浓度：从约75μg/mL至约125μg/mL、100μg/mL至约150μg/mL、从约125μg/mL至约175μg/mL或从约150μg/mL至约200μg/mL。可替代地，抗GD2 SADA缀合物可以作为持续释放配制品施用，在这种情况下需要不太频繁的施用。剂量和频率根据抗GD2SADA缀合物在受试者中的半衰期而变化。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对较不频繁的间隔施用相对较低的剂量。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，或直到受试者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用预防性方案。
PRIT。在一个方面，本公开文本提供了用于检测有需要的受试者的肿瘤的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的能够与DOTA半抗原和GD2抗原结合的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达由所述抗GD2SADA缀合物识别的所述GD2抗原的肿瘤；(b)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；以及(c)通过检测由所述抗GD2 SADA缀合物发射的高于参考值的放射性水平来检测肿瘤在所述受试者中的存在。在一些实施方案中，所述受试者是人。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述放射性标记是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素、俄歇发射体或其任何组合。发射β粒子的同位素的例子包括86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。发射α粒子的同位素的例子包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At和255Fm。俄歇发射体的例子包括111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl和203Pb。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，使用正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描检测由所述抗GD2 SADA缀合物发射的放射性水平。
在一个方面，本公开文本提供了用于选择受试者进行预靶向放射免疫疗法的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的能够与DOTA半抗原和GD2抗原结合的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达由所述抗GD2 SADA缀合物识别的所述GD2抗原的肿瘤；(b)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；(c)检测由所述抗GD2 SADA缀合物发射的放射性水平；以及(d)当由所述抗GD2 SADA缀合物发射的放射性水平高于参考值时，选择所述受试者进行预靶向放射免疫疗法。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述DOTA半抗原选自(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-N H2；(iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2；(iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(H SG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(v i)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；(viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2；(ix)A c-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2；(xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(x ii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2；(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HS G)-NH2；(xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2；(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xx)DOTA和(xxi)Proteus-DOTA。所述放射性标记可以是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素或俄歇发射体。放射性标记的例子包括213Bi、211At、225Ac、152D y、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186R e、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th或64Cu。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述受试者被诊断为患有或怀疑患有GD2相关癌症，如神经母细胞瘤、黑色素瘤、脑肿瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌或梭形细胞肉瘤。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服、瘤内或鼻内施用所述抗GD2SADA缀合物和/或所述放射性标记的DOTA半抗原。在某些实施方案中，将所述抗GD2 SADA缀合物和/或所述放射性标记的DOTA半抗原施用到受试者的脑脊液或血液中。
在本文公开的方法的一些实施方案中，在施用所述放射性标记的DOTA半抗原后2至120小时之间检测由所述抗GD2 SADA缀合物发射的放射性水平。在本文公开的方法的某些实施方案中，由所述抗GD2 SADA缀合物发射的放射性水平表示为每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。所述参考值可以通过以下方式来计算：测量存在于非肿瘤(正常)组织中的放射性水平，并且计算存在于非肿瘤(正常)组织中的平均放射性水平±标准差。在一些实施方案中，所述参考值是标准摄取值(SUV)。参见Thie JA,J Nucl Med.45(9):1431-4(2004)。在一些实施方案中，肿瘤与正常组织之间的放射性水平的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
在一个方面，本公开文本提供了用于在有需要的受试者中减少或减轻α放射免疫疗法相关毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；以及向所述受试者施用有效量的包含发射α粒子的同位素的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合。在某些实施方案中，所述受试者已经接受或正在接受一个或多个周期的α放射免疫疗法。发射α粒子的同位素的例子包括但不限于213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At或255Fm。所述α放射免疫疗法相关毒性可以是对选自脑、肾脏、膀胱、肝脏、骨髓和脾脏的一个或多个器官的毒性。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在另一个方面，本公开文本提供了用于增加β放射免疫疗法在有需要的受试者中的功效的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；(b)在施用所述抗GD2 SADA缀合物后约36-96小时(例如，约48小时)向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；(c)在施用所述第一剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；以及(d)在施用所述第二剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。在一些实施方案中，在没有进一步施用本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的情况下，施用所述放射性标记的DOTA半抗原。在其他实施方案中，所述方法进一步包括将步骤(a)-(d)重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个另外的循环。在一些实施方案中，所述受试者是人。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的有效量可以是约0.5mg/kg至约400mg/kg。另外地或可替代地，在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的有效量是约0.5mg/kg、约0.55mg/kg、约0.6mg/kg、约0.65mg/kg、约0.7mg/kg、约0.75mg/kg、约0.8mg/kg、约0.85mg/kg、约0.9mg/kg、约0.95mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg、约105mg/kg、约110mg/kg、约115mg/kg、约120mg/kg、约125mg/kg、约130mg/kg、约135mg/kg、约140mg/kg、约145mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg、约225mg/kg、约250mg/kg、约275mg/kg、约300mg/kg、约325mg/kg、约350mg/kg、约375mg/kg或约400mg/kg。也考虑了所列举值的中间的值和范围。在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量可以是50pmol-500pmol/克肿瘤。另外地或可替代地，在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量是约50pmol/g肿瘤、约55pmol/g肿瘤、约60pmol/g肿瘤、约65pmol/g肿瘤、约70pmol/g肿瘤、约75pmol/g肿瘤、约80pmol/g肿瘤、约85pmol/g肿瘤、约90pmol/g肿瘤、约95pmol/g肿瘤、约100pmol/g肿瘤、约125pmol/g肿瘤、约150pmol/g肿瘤、约175pmol/g肿瘤、约200pmol/g肿瘤、约225pmol/g肿瘤、约250pmol/g肿瘤、约275pmol/g肿瘤、约300pmol/g肿瘤、约325pmol/g肿瘤、约350pmol/g肿瘤、约375pmol/g肿瘤、约400pmol/g肿瘤、约425pmol/g肿瘤、约450pmol/g肿瘤、约475pmol/g肿瘤或约500pmol/g肿瘤。也考虑了所列举值的中间的值和范围。在某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量是约50pmol至10nmol(例如，50pmol、60pmol、70pmol、80pmol、90pmol、100pmol、200pmol、300pmol、400pmol、500pmol、600pmol、700pmol、800pmol、900pmol、1nmol、2nmol、3nmol、4nmol、5nmol、6nmol、7nmol、8nmol、9nmol、10nmol)。也考虑了所列举值的中间的值和范围。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是相同的。在本文公开的方法的其他实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量中的任何两个可以是相同的。在本文公开的方法的某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是不同的。在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述发射β粒子的同位素是86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu或67Cu。
在又另一个方面，本公开文本提供了用于增加β放射免疫疗法在有需要的受试者中的功效的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用第一有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2 SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；(b)在施用所述第一有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约36-96小时(例如，约48小时)向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；(c)在施用所述第一有效量的所述抗GD2SADA缀合物后约7天向所述受试者施用第二有效量的所述抗GD2 SADA缀合物；(d)在施用所述第二有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约36-96小时(例如，约48小时)向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；(e)在施用所述第二有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约7天向所述受试者施用第三有效量的所述抗GD2 SADA缀合物；以及(f)在施用所述第三有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约36-96小时(例如，约48小时)向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。在一些实施方案中，所述受试者是人。在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和/或第三有效量可以是约0.5mg/kg至约400mg/kg。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和/或第三有效量是约0.5mg/kg、约0.55mg/kg、约0.6mg/kg、约0.65mg/kg、约0.7mg/kg、约0.75mg/kg、约0.8mg/kg、约0.85mg/kg、约0.9mg/kg、约0.95mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg、约105mg/kg、约110mg/kg、约115mg/kg、约120mg/kg、约125mg/kg、约130mg/kg、约135mg/kg、约140mg/kg、约145mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg、约225mg/kg、约250mg/kg、约275mg/kg、约300mg/kg、约325mg/kg、约350mg/kg、约375mg/kg或约400mg/kg。也考虑了所列举值的中间的值和范围。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和第三有效量是相同的。在本文公开的方法的其他实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和第三有效量中的任何两个可以是相同的。在本文公开的方法的某些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和第三有效量是不同的。在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量可以是50pmol-500pmol/克肿瘤。另外地或可替代地，在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量是约50pmol/g肿瘤、约55pmol/g肿瘤、约60pmol/g肿瘤、约65pmol/g肿瘤、约70pmol/g肿瘤、约75pmol/g肿瘤、约80pmol/g肿瘤、约85pmol/g肿瘤、约90pmol/g肿瘤、约95pmol/g肿瘤、约100pmol/g肿瘤、约125pmol/g肿瘤、约150pmol/g肿瘤、约175pmol/g肿瘤、约200pmol/g肿瘤、约225pmol/g肿瘤、约250pmol/g肿瘤、约275pmol/g肿瘤、约300pmol/g肿瘤、约325pmol/g肿瘤、约350pmol/g肿瘤、约375pmol/g肿瘤、约400pmol/g肿瘤、约425pmol/g肿瘤、约450pmol/g肿瘤、约475pmol/g肿瘤或约500pmol/g肿瘤。也考虑了所列举值的中间的值和范围。在某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量是约50pmol至10nmol(例如，50pmol、60pmol、70pmol、80pmol、90pmol、100pmol、200pmol、300pmol、400pmol、500pmol、600pmol、700pmol、800pmol、900pmol、1nmol、2nmol、3nmol、4nmol、5nmol、6nmol、7nmol、8nmol、9nmol、10nmol)。也考虑了所列举值的中间的值和范围。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是相同的。在本文公开的方法的其他实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量中的任何两个可以是相同的。在本文公开的方法的某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是不同的。在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述发射β粒子的同位素是86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu或67Cu。
将所述抗GD2 SADA缀合物在一定条件下并在一定时间段内(例如，根据给药方案)施用，所述条件和时间段足以使其使肿瘤细胞饱和。在一些实施方案中，在施用所述抗GD2SADA缀合物后，从血流中清除未结合的抗GD2 SADA缀合物。在一些实施方案中，在可以足以允许清除未结合的抗GD2 SADA缀合物的时间段后施用所述放射性标记的DOTA半抗原。
可以在施用所述抗GD2 SADA缀合物后1.5至4天之间的任何时间施用所述放射性标记的DOTA半抗原。例如，在一些实施方案中，在施用所述抗GD2 SADA缀合物后36小时、48小时、96小时或其中的任何范围施用所述放射性标记的DOTA半抗原。
这种本文所述的抗GD2 SADA缀合物的治疗有效性可以通过计算曲线下面积(AUC)肿瘤:AUC正常组织比率来确定。在一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的AUC肿瘤:AUC正常组织比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
另外地或可替代地，在本文公开的前述方法的一些实施方案中，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、瘤内、口服或鼻内施用所述抗GD2 SADA缀合物和/或所述放射性标记的DOTA半抗原。
在一个方面，本公开文本提供了用于治疗有需要的受试者的GD2相关癌症的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；(b)在施用所述抗GD2 SADA缀合物后约36-96小时(例如，约48小时)向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素或发射α粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；(c)在施用所述第一剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；以及(d)在施用所述第二剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。在一些实施方案中，在没有进一步施用本发明技术的抗GD2 SADA缀合物的情况下，施用所述放射性标记的DOTA半抗原。在其他实施方案中，所述方法进一步包括将步骤(a)-(d)重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个另外的循环。在一些实施方案中，所述受试者是人。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的有效量可以是约0.5mg/kg至约400mg/kg。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的有效量是约0.5mg/kg、约0.55mg/kg、约0.6mg/kg、约0.65mg/kg、约0.7mg/kg、约0.75mg/kg、约0.8mg/kg、约0.85mg/kg、约0.9mg/kg、约0.95mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg、约105mg/kg、约110mg/kg、约115mg/kg、约120mg/kg、约125mg/kg、约130mg/kg、约135mg/kg、约140mg/kg、约145mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg、约225mg/kg、约250mg/kg、约275mg/kg、约300mg/kg、约325mg/kg、约350mg/kg、约375mg/kg或约400mg/kg。也考虑了所列举值的中间的值和范围。在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量可以是50pmol-500pmol/克肿瘤。另外地或可替代地，在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量是约50pmol/g肿瘤、约55pmol/g肿瘤、约60pmol/g肿瘤、约65pmol/g肿瘤、约70pmol/g肿瘤、约75pmol/g肿瘤、约80pmol/g肿瘤、约85pmol/g肿瘤、约90pmol/g肿瘤、约95pmol/g肿瘤、约100pmol/g肿瘤、约125pmol/g肿瘤、约150pmol/g肿瘤、约175pmol/g肿瘤、约200pmol/g肿瘤、约225pmol/g肿瘤、约250pmol/g肿瘤、约275pmol/g肿瘤、约300pmol/g肿瘤、约325pmol/g肿瘤、约350pmol/g肿瘤、约375pmol/g肿瘤、约400pmol/g肿瘤、约425pmol/g肿瘤、约450pmol/g肿瘤、约475pmol/g肿瘤或约500pmol/g肿瘤。也考虑了所列举值的中间的值和范围。在某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量是约50pmol至10nmol(例如，50pmol、60pmol、70pmol、80pmol、90pmol、100pmol、200pmol、300pmol、400pmol、500pmol、600pmol、700pmol、800pmol、900pmol、1nmol、2nmol、3nmol、4nmol、5nmol、6nmol、7nmol、8nmol、9nmol、10nmol)。也考虑了所列举值的中间的值和范围。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是相同的。在本文公开的方法的其他实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量中的任何两个可以是相同的。在本文公开的方法的某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是不同的。在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述发射β粒子的同位素是86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu或67Cu。所述发射α粒子的同位素的例子包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At或255Fm。
在另一个方面，本公开文本提供了用于治疗有需要的受试者的GD2相关癌症的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用第一有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽、GD2特异性抗原结合结构域和DOTA特异性抗原结合结构域的本发明技术的抗GD2SADA缀合物，其中所述抗GD2 SADA缀合物被配置为定位于表达GD2的肿瘤；(b)在施用所述第一有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约36-96小时(例如，约48小时)向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素或发射α粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗GD2 SADA缀合物结合；(c)在施用所述第一有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约7天向所述受试者施用第二有效量的所述抗GD2 SADA缀合物；(d)在施用所述第二有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约36-96小时(例如，约48小时)向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；(e)在施用所述第二有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约7天向所述受试者施用第三有效量的所述抗GD2 SADA缀合物；以及(f)在施用所述第三有效量的所述抗GD2 SADA缀合物后约36-96小时(例如，约48小时)向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。在一些实施方案中，所述受试者是人。在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和/或第三有效量可以是约0.5mg/kg至约400mg/kg。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和/或第三有效量是约0.5mg/kg、约0.55mg/kg、约0.6mg/kg、约0.65mg/kg、约0.7mg/kg、约0.75mg/kg、约0.8mg/kg、约0.85mg/kg、约0.9mg/kg、约0.95mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg、约105mg/kg、约110mg/kg、约115mg/kg、约120mg/kg、约125mg/kg、约130mg/kg、约135mg/kg、约140mg/kg、约145mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg、约225mg/kg、约250mg/kg、约275mg/kg、约300mg/kg、约325mg/kg、约350mg/kg、约375mg/kg或约400mg/kg。也考虑了所列举值的中间的值和范围。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和第三有效量是相同的。在本文公开的方法的其他实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和第三有效量中的任何两个可以是相同的。在本文公开的方法的某些实施方案中，所述抗GD2 SADA缀合物的第一有效量、第二有效量和第三有效量是不同的。在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量可以是50pmol-500pmol/克肿瘤。另外地或可替代地，在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量是约50pmol/g肿瘤、约55pmol/g肿瘤、约60pmol/g肿瘤、约65pmol/g肿瘤、约70pmol/g肿瘤、约75pmol/g肿瘤、约80pmol/g肿瘤、约85pmol/g肿瘤、约90pmol/g肿瘤、约95pmol/g肿瘤、约100pmol/g肿瘤、约125pmol/g肿瘤、约150pmol/g肿瘤、约175pmol/g肿瘤、约200pmol/g肿瘤、约225pmol/g肿瘤、约250pmol/g肿瘤、约275pmol/g肿瘤、约300pmol/g肿瘤、约325pmol/g肿瘤、约350pmol/g肿瘤、约375pmol/g肿瘤、约400pmol/g肿瘤、约425pmol/g肿瘤、约450pmol/g肿瘤、约475pmol/g肿瘤或约500pmol/g肿瘤。也考虑了所列举值的中间的值和范围。在某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和/或第三剂量是约50pmol至10nmol(例如，50pmol、60pmol、70pmol、80pmol、90pmol、100pmol、200pmol、300pmol、400pmol、500pmol、600pmol、700pmol、800pmol、900pmol、1nmol、2nmol、3nmol、4nmol、5nmol、6nmol、7nmol、8nmol、9nmol、10nmol)。也考虑了所列举值的中间的值和范围。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是相同的。在本文公开的方法的其他实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量中的任何两个可以是相同的。在本文公开的方法的某些实施方案中，所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是不同的。所述发射β粒子的同位素的例子包括86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu或67Cu。所述发射α粒子的同位素的例子包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At或255Fm。
将所述抗GD2 SADA缀合物在一定条件下并在一定时间段内(例如，根据给药方案)施用，所述条件和时间段足以使其使肿瘤细胞饱和。在一些实施方案中，在施用所述抗GD2SADA缀合物后，从血流中清除未结合的抗GD2 SADA缀合物。在一些实施方案中，在可以足以允许清除未结合的抗GD2 SADA缀合物的时间段后施用所述放射性标记的DOTA半抗原。
可以在施用所述抗GD2 SADA缀合物后1.5至4天之间的任何时间施用所述放射性标记的DOTA半抗原。例如，在一些实施方案中，在施用所述抗GD2 SADA缀合物后36小时、48小时、96小时或其中的任何范围施用所述放射性标记的DOTA半抗原。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，所述受试者患有或被诊断为患有GD2相关癌症，如神经母细胞瘤、黑色素瘤、软组织肉瘤、脑肿瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌或梭形细胞肉瘤。
在本文公开的方法的任何以上实施方案中，所述DOTA半抗原选自DOTA、Proteus-DOTA、DOTA-Bn、DOTA-去铁胺、DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2、Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2、Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HS G)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2和Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与已经用抗DOTA×抗GD2 IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致所述受试者的肾细胞凋亡减少。在本文所述的方法的某些实施方案中，与已经用抗DOTA×抗GD2IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致在所述受试者中的免疫原性降低。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与已经用抗DOTA×抗GD2 IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致所述受试者的卵巢萎缩的严重程度降低。在本文公开的方法的一些实施方案中，与已经用抗DOTA×抗GD2 IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致所述受试者的缓解期延长。在本文所述的方法的任何前述实施方案中，所述抗DOTA×抗GD2 IgG-scFv-BsAb包含(a)包含分别地SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH)序列和轻链可变结构域(VL)序列的GD2特异性抗原结合结构域，以及(b)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的重链可变结构域(VH)序列和SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的轻链可变结构域(VL)序列的DOTA特异性抗原结合结构域。
在本文公开的方法的任何和所有实施方案中，与没有接受所述抗GD2 SADA缀合物的对照GD2相关癌症患者相比，所述抗GD2 SADA缀合物的施用导致所述受试者的肾细胞凋亡减少、卵巢萎缩的严重程度降低和/或缓解期延长。
毒性。最佳地，本文所述的抗GD2 SADA缀合物的有效量(例如，剂量)将提供治疗益处，而不会引起对受试者的实质性毒性。本文所述的抗GD2 SADA缀合物的毒性可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序来确定，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)来确定。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于制定对人无毒的剂量范围。本文所述的抗GD2 SADA缀合物的剂量在循环浓度的范围内，所述循环浓度包括具有很小或没有毒性的有效剂量。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径在此范围内变化。确切配方、施用途径和剂量可以由单独医生根据受试者的情况来选择。参见例如，Fingl等人,ThePharmacological Basis of Therapeutics,第1章(1975)。
药物组合物的配制品。根据本发明技术的方法，可以将抗GD2 SADA缀合物掺入适合于施用的药物组合物中。药物组合物通常包含重组或基本上纯化的抗GD2 SADA缀合物和药学上可接受的载体，呈适合于施用至受试者的形式。药学上可接受的载体部分地取决于所施用的特定组合物，以及取决于用于施用组合物的特定方法。因此，存在用于施用抗GD2SADA缀合物组合物的药物组合物的多种合适配制品(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA第18版,1990)。通常将药物组合物配制为无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品药品管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。
术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体，当它们指代组合物、载体、稀释剂和试剂时，可互换使用，并且表示所述材料能够被施用至受试者或施用至受试者上而不产生会禁止组合物的施用的程度的不希望的生理影响。例如，“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备通常是安全、无毒且期望的药物组合物中的赋形剂，并且包括对于兽用以及人药物用途可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下是气体。“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并具有所需药理特性的盐和酯。此类盐包括可以在存在于组合物中的酸性质子能够与无机或有机碱反应的情况下形成的盐。合适的无机盐包括与碱金属(例如，钠和钾)、镁、钙和铝形成的无机盐。合适的有机盐包括与有机碱形成的有机盐，所述有机碱如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。此类盐还包括与无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃磺酸和芳烃磺酸如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由存在于抗GD2 SADA缀合物中的羧基、磺酰氧基和膦酸氧基形成的酯，例如C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或者二盐或酯；并且类似地，在存在多于两个酸性基团的情况下，此类基团中的一些或全部可以被盐化或酯化。在本技术中命名的抗GD2 SADA缀合物可以按未盐化或未酯化形式存在，或按盐化和/或酯化形式存在，并且这种抗GD2 SADA缀合物的命名旨在包括初始(未盐化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯两者。另外，本发明技术的某些实施方案可以以多于一种立体异构体形式存在，并且这种抗GD2 SADA缀合物的命名旨在包括所有单一立体异构体以及此类立体异构体的所有混合物(无论是外消旋的还是其他形式)。本领域普通技术人员不难确定施用本发明技术的特定药物和组合物的适当时间安排、顺序和剂量。
此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物，如不挥发油。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或化合物与抗GD2 SADA缀合物不相容，否则考虑了其在组合物中的使用。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
配制本发明技术的药物组合物以与其预期的施用途径相容。本发明技术的抗GD2SADA缀合物组合物可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、皮内、透皮、直肠、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内或肌内途径，或者作为吸入剂来施用。可以将抗GD2 SADA缀合物任选地与在治疗各种GD2相关癌症方面至少部分有效的其他药剂组合施用。
用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物都必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。组合物在制造和储存条件下必须稳定，并且其保存必须可抵抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌化合物和抗真菌化合物(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将希望在组合物中包括等渗化合物，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的化合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将本发明技术的抗GD2 SADA缀合物以所需量掺入视需要具有以上所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将抗GD2 SADA缀合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上所列举成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。本发明技术的抗GD2 SADA缀合物可以以贮库型注射剂或植入制剂的形式施用，可以将所述形式以允许活性成分的持续或脉冲释放的方式配制。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将它们封装在明胶胶囊中或压成片剂。出于口服治疗性施用的目的，可以将抗GD2 SADA缀合物与赋形剂一起掺入，并且以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体来制备以用作漱口剂，其中流体载体中的化合物经口施用并漱口，并且被吐出或被吞下。可以包括药学上相容的结合化合物和/或辅助材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解化合物，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味化合物，如蔗糖或糖精；或调味化合物，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
对于通过吸入施用，从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体如二氧化碳)或者雾化器以气溶胶喷雾的形式递送抗GD2 SADA缀合物。
全身性施用也可以通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮施用，在配制品中使用适于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括(例如，对于经粘膜施用)洗涤剂、胆盐以及夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用，将抗GD2 SADA缀合物配制成如本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。
也可以将抗GD2 SADA缀合物制备为呈栓剂(例如，用常规栓剂基质如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式以供直肠递送的药物组合物。
在一个实施方案中，抗GD2 SADA缀合物是用将防止抗GD2 SADA缀合物从体内迅速消除的载体制备的，如控释配制品，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制品的方法对于本领域技术人员而言将是清楚的。材料也可以从AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据例如如在美国专利号4,522,811中描述的本领域技术人员已知的方法来制备。
C.试剂盒
本发明技术提供了用于GD2相关癌症的检测和/或PRIT相关治疗的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本发明技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，本文所述的任何抗GD2SADA缀合物)或其功能变体(例如，取代变体)。任选地，将本发明技术的试剂盒的上述组分包装在合适的容器中并进行标记以用于GD2相关癌症的诊断和/或基于放射免疫疗法的治疗。
在一个方面，试剂盒包含至少一种本发明技术的抗GD2 SADA缀合物(例如，抗DOTA双特异性抗原结合片段)、DOTA半抗原和用于在α放射免疫疗法或β放射免疫疗法(例如，PRIT)中使用所述缀合物、所述半抗原的说明书。合适的DOTA半抗原的例子包括但不限于DOTA、Proteus-DOTA、DOTA-Bn、DOTA-去铁胺、DOTA-Phe-Lys(HS G)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2、Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2、Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2和Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
试剂盒可以进一步包含一种或多种放射性核素。另外地或可替代地，在本发明技术的试剂盒的一些实施方案中，所述一种或多种放射性核素选自213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At和255Fm。另外地或可替代地，在某些实施方案中，所述一种或多种放射性核素选自86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th和64Cu。
上述组分可以作为水性(优选无菌)溶液或作为用于重构的冻干(优选无菌)配制品储存在单元容器或多剂量容器(例如，密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管)中。试剂盒可以进一步包含第二容器，其容纳有适合于将药物组合物稀释至更大体积的稀释剂。合适的稀释剂包括但不限于药物组合物的药学上可接受的赋形剂和盐水溶液。此外，试剂盒可以包含用于稀释药物组合物的说明书和/或用于施用药物组合物(无论稀释与否)的说明书。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)制成，并且可以具有无菌的进入口(例如，容器可以是静脉输液袋或带有可以被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒可以进一步包含更多容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。试剂盒可以进一步包括从商业和用户的角度来看合意的其他材料，包括用于一种或多种合适宿主的其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、培养基。试剂盒可以任选地包括通常包含在治疗性或诊断性产品的商业包装中的说明书，其含有关于例如关于使用此类治疗性或诊断性产品的适应证、用法、剂量、制造、施用、禁忌证和/或警告的信息。
试剂盒可用于检测免疫反应性GD2蛋白在生物样品中的存在，所述生物样品例如任何体液，包括但不限于例如血清、血浆、淋巴液、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液，并且包括体组织的活检样品。例如，试剂盒可以包含：一种或多种能够结合生物样品中的GD2蛋白的本发明技术的双特异性抗GD2 SADA缀合物；用于确定样品中的GD2蛋白的量的器件；以及用于将样品中的免疫反应性GD2蛋白的量与标准进行比较的器件。可以标记一种或多种抗GD2 SADA缀合物。可以将试剂盒组分(例如，试剂)包装在合适的容器中。试剂盒可以进一步包含用于使用试剂盒检测免疫反应性GD2蛋白的说明书。
试剂盒还可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以含有对照样品或一系列对照样品，可以对其进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒的每种组分可以封装在单独的容器内，并且所有不同的容器可以与用于解释使用试剂盒进行的测定的结果的说明书一起放在单个包装内。本发明技术的试剂盒可以在试剂盒容器上或试剂盒容器中含有书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中所含的试剂，例如用于在体外或体内检测GD2蛋白，或用于有需要的受试者的GD2相关癌症的基于PRIT的治疗方法。在某些实施方案中，可以根据本发明技术的方法使用试剂。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明技术，所述实施例不应当被解释为以任何方式进行限制。
实施例1：材料与方法
研究设计。为了鉴定SADA结构域对用于多步骤药物有效载荷递送的BsAb的影响，使用细胞系和患者源性异种移植物(PDX)模型两者在体外和体内表达并且表征了多种SADA-BsAb。
对于体内实验，样本量是基于在先前的研究中观察到的肿瘤进展和反应的变化来确定的(Cheal,S.M.等人,Eur J Nucl Med Mol Imaging 43,925-937(2016)；Cheal,S.M.等人,Mol Cancer Ther 13,1803-1812(2014)；Cheal,S.M.等人,J Nucl Med 58,1735-1742(2017)；Cheal,S.M.等人,Theranostics 8,5106-5125(2018)；Cheal,S.等人,Journalof Nuclear Medicine 59(2018))。跟踪小鼠直到肿瘤变得过大(>1,500mm3)，并且不排除任何数据。将来自相同治疗组的所有小鼠共同圈养在同一笼子里。将使用雌性小鼠的实验在肿瘤植入后但在它们的初始治疗前完全随机化。使用雄性小鼠的实验的笼子在肿瘤植入后且在治疗开始前已经随机化。没有进行治疗或实验测量的盲化。
动物研究。每周测量一次体重和肿瘤体积，并且每周至少评价三次小鼠的总体健康状况。通过卡尺使用以下公式计算肿瘤体积：[(L)x(W)x(W)x 0.5]，其中L为肿瘤的最长直径，并且W为垂直于L的直径。一旦肿瘤体积达到1.5-2.0cm3就处死小鼠。在这些实验的整个过程中，所治疗的小鼠未展示出超出正常限度的体重减轻、脱毛或虚弱。对雌性BALB/c裸小鼠(Envigo，Hsd:无胸腺裸-Foxn1nu 069(nu)/070(nu/+))以及雄性BALB/c DKO小鼠和雌性BALB/c DKO小鼠两者(Taconic，C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac，11503)进行辐射研究。使用雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠(NSG，Jackson Laboratory，005557)进行药代动力学研究。对雌性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratory，000664)进行免疫原性研究。裸小鼠和C57BL6/J小鼠是购买的，而DKO和NSG小鼠是在MSKCC动物设施中饲养的。
当裸小鼠8-10周龄大时，为它们皮下植入IMR32神经母细胞瘤细胞。在16天(肿瘤大约100-200mm3)后，将小鼠用BsAb(1.25nmol)和DOTA[177Lu](18.5MBq)每周静脉内治疗一次，各持续长达3周(3x-3x)。替代方案是将小鼠用BsAb每周治疗一次并用DOTA[177Lu]每周治疗3次，持续1周(1x-3x)或2周(2x-6x)。将外粒子束治疗的对照组小鼠用300cGy辐射辐照。
为DKO小鼠皮下植入消化的神经母细胞瘤或小细胞肺癌PDX肿瘤(将每种肿瘤传代到10只新小鼠中)。在植入后18-20天开始治疗。将小鼠用BsAb(1.25nmol)和Proteus[225Ac](37kBq)或DOTA[177Lu](55.5MBq)静脉内治疗。对于使用Proteus[225Ac]的研究，向小鼠给药一次BsAb以及一次有效载荷。对于使用DOTA[177Lu]的研究，向小鼠每周给药一次BsAb和有效载荷，持续3周。尽管活性相当，但两种Proteus[225Ac]制剂之间比活性的差异导致摩尔剂量不同(2.4nmol相比于700pmol)。三步IgG-PRIT遵循与两步SADA-PRIT相同的方案，包括在施用DOTA或Proteus有效载荷前4小时发生的另外的清除剂步骤。将25μg DOTA-树状聚合物清除剂(Cheal等人,Bioconjug Chem.31(3):501-506(2020))用于使用清除剂的所有实验。所有细胞系植入都以按体积计3:1的比率(基质胶与细胞)使用基质胶(Corning，354234)。眶后收集血浆，并且将其在-80℃下保存直到测定。使用HT5血液学分析仪(Heska)对新鲜收集的全血(EDTA中和的)进行治疗期间的CBC测量。使用GraphPad Prism 8绘制数据。
药代动力学分析。向NSG小鼠注射100μg P53-SADA-BsAb，并且在7天(30分钟-168小时)内连续放血。将血液加工成血浆并且冷冻，直到获得所有样品。通过ELISA确定BsAb的血浆浓度。简言之，对于每个板，将一半的孔在4℃下用神经节苷脂GD2包被过夜(EMDMillipore，345743，1μg/ml在90％乙醇中，20μl/孔)，并且将一半留空。将板用PBS洗涤，并且在室温下用补充有0.5％牛血清白蛋白(Sigma，A7906)的PBS封闭一小时。跨包被的孔和未包被的孔都一式两份地以1:100和1:200稀释度(>48小时)或1:2000和1:4000稀释度(0.5-24小时)添加血浆样品，并且在37℃下孵育2.5小时。将P53-SADA-BsAb用作标准曲线(100ng/ml至0.41ng/ml，3倍稀释度)。将样品在室温下使用小鼠抗HIS特异性二抗(Biorad，克隆AD1.1.10，MCA1396)检测一小时。然后将样品与缀合至辣根过氧化物酶(JacksonImmunoResearch，415-035-166)的大鼠抗小鼠检测抗体在4℃下一起孵育一小时。将显色反应用邻苯二胺(Sigma，P8287-100TAB，150ul/孔)显影并且用5N硫酸(30ul/孔)停止。使用带有Gen5软件(v2.09版本)的Biotek H1读板仪(Synergy)在490nm处读取板。使用拟合至线性回归的标准曲线计算蛋白质浓度。使用WinNonlin软件程序(Pharsight Corp.)通过血清浓度-时间数据的非隔室分析进行药代动力学分析。
还使用131I标记的SADA-BsAb确定血清清除率测量值。将SADA-BsAb使用预包被的IODOGEN管(Pierce)用131I(IBA Molecular或MSKCC)标记，如先前针对IgG-scFv-BsAb的放射性碘化所述(Cheal,S.M.等人,Mol Cancer Ther 13,1803-1812(2014))。通过SEC-HPLC验证131I-SADA-BsAb的纯度。向每只小鼠(裸的，无肿瘤)注射740kBq 131I-SADA-BsAb，并且连续放血(0.5至48小时)。在伽马计数器(PerkinElmer，Wallac Wizard 3自动伽马计数器)上对血液样品进行放射测定，并且使用GraphPad Prism 8进行绘制。
免疫原性分析。向C57BL/6J小鼠在第0天和第28天分别静脉内和腹膜内注射P53-SADA-BsAb或IgG-scFv-BsAb(0.5nmol)。将小鼠在第27天和第55天眶后放血。将血液加工成血浆并且在-80℃下冷冻，直到获得所有样品。通过ELISA确定各BsAb的血浆浓度。简言之，对于每个板，将一半的孔在4℃下用P53-SADA-BsAb或IgG-scFv-BsAb(10μg/ml在PBS中，50μl/孔)包被过夜，并且将另一半留空。此后，将板用PBS洗涤，并且在室温下用补充有0.5％牛血清白蛋白(Sigma，A7906)的PBS封闭一小时。跨包被的孔和未包被的孔都一式两份地以1:100和1:200稀释度添加血浆样品，并且在37℃下孵育2.5小时。使用小鼠抗HIS抗体(SADA-BsAb)或抗人IgG铰链(IgG-scFv-BsAb，Southern Biotech，克隆4E3，9052-01)单克隆抗体生成标准曲线。接下来，用缀合至辣根过氧化物酶(Jackson ImmunoResearch，115-005-003)的山羊抗小鼠抗体检测抗体检测样品。将显色反应用邻苯二胺(Sigma，P8287-100TAB，150ul/孔)显影并且用5N硫酸(30ul/孔)停止。使用带有Gen5软件(v2.09版本)的Biotek H1读板仪(Synergy)在490nm处读取板。使用拟合至线性回归的标准曲线估计蛋白质浓度。使用GraphPad Prism 8绘制数据。
用于毒理学评估的解剖和临床病理学。将小鼠通过二氧化碳窒息处死，并且立即解剖并固定于10％中性缓冲福尔马林中。在所有研究中将年龄匹配的同窝仔畜用作参考。将组织在乙醇和二甲苯中处理，并且在Leica ASP6025组织处理器中包埋在石蜡中。将石蜡块切成5微米，用苏木精和伊红(H&E)染色，并且通过两名通过职业认证的兽医病理学家进行组织病理学检查。(SM，AOM)。对以下组织进行处理和评价：心脏、肺、胸腺、肾脏、肝脏、胆囊、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、肠系膜淋巴结、唾液腺、下颌下淋巴结、子宫、宫颈、阴道、膀胱、脾脏、胰腺、肾上腺、卵巢、输卵管、气管、食管、甲状腺、甲状旁腺、皮肤(躯干、生殖器周围、头部)、乳腺、骨(股骨、胫骨、胸骨、椎骨、颅骨)、骨髓(股骨、胫骨、胸骨、椎骨)、膝关节、骨骼肌(后肢、脊柱)、神经(后肢、脊柱)、脊髓、口腔、牙齿、鼻腔、眼睛、哈氏腺、垂体、脑、耳朵。对于血清化学，将血液收集到含有血清分离器的管中并且离心。在AU 680化学分析仪(Beckman Coulter Inc，加利福尼亚州帕萨迪纳)上分析血清样品，并且确定以下分析物的浓度：碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、肌酸激酶、γ-谷氨酰转肽酶、白蛋白、总蛋白、球蛋白、总胆红素、血尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、钙、磷、氯、钾和钠。计算Na/K比、白蛋白/球蛋白比。对于血液学，将血液收集到含有EDTA的管中，并且在Procyte Dx(Idexx laboratories Inc.，缅因州威斯布鲁克)上进行自动全血细胞计数(CBC)，并通过血液涂片检查进行手动区分用于验证。为了进一步的肾脏分析，还将肾脏切片用如先前所述的TdT介导的dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)方法染色(Gavrieli,Y.等人,J Cell Biol 119,493-501(1992))，并且在Leica Bond RX自动染色器上使用Bond试剂(Leica Biosystems，伊利诺伊州布法罗格罗夫)进行针对裂解的半胱天冬酶3(CellSignaling Technology Inc.，目录号9661)的IHC。在柠檬酸盐缓冲液中进行热诱导的表位修复后，以1:250的浓度施加一抗，之后是聚合物检测系统(DS9800，Novocastra BondPolymer Refine Detection，Leica Biosystems)。色原为3,3二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)，并且将切片用苏木精复染。在带有UPlanFL 40x/0.75物镜的Olympus BX45显微镜(Olympus Corp.，日本东京)上在十个400倍视野中对TUNEL阳性细胞和CC-3免疫反应性细胞的总数进行计数。
PET/CT成像分析。为雌性裸小鼠在第0天植入皮下IMR32神经母细胞瘤异种移植物。在第16天，向小鼠静脉内施用BsAb(1.25nmol)。在第18天，向小鼠施用DOTA[86Y](3.7MBq，30pmol)。在第19天，在1.5％-2％异氟醚(Baxter Healthcare)的影响下的同时，将小鼠使用PET/CT(Siemens，Inveon PET/CT扫描仪)进行最少1x106次符合事件的成像。通常，收集30分钟PET数据，随后进行CT。用80kV电压和500μA获得全身CT扫描。用120s总扫描时间和145ms每帧曝光获得总共120个旋转步长，总共220°。将列表模式发射数据通过傅里叶重分箱(Fourier rebinning)整理为二维直方图，并且将图像使用2DOSEM算法(16个子集，四次迭代)重组为128×128×159(0.78×0.78×0.80mm)的矩阵。将图像数据归一化以校正PET响应的不均匀性、死区时间计数损失(dead-time count loss)、正电子分支比和相对于注射时间的物理衰减，但是没有应用衰减、散射或部分体积平均校正。将3只小鼠一起成像，并且在分析期间分开。
组织生物分布分析。为雌性裸小鼠在第0天植入皮下IMR32神经母细胞瘤异种移植物。在第16天，向小鼠静脉内施用BsAb(1.25nmol)。在第18天，向小鼠施用DOTA[177Lu](1.85至18.5MBq，10至100pmol)。在施用DOTA[177Lu]后2小时、24小时、48小时、72小时或120小时，将小鼠处死并且解剖。收集以下组织，并且在伽马闪烁计数器(PerkinElmer，WallacWizard 3自动伽马计数器)上计算残留辐射：血液、脑、脊柱、肿瘤、心脏、肺、肝脏、脾脏、胃、小肠、大肠、肾脏、肌肉、长骨和尾。
组织剂量测定分析。使用来自每种BsAb的组织生物分布结果对剂量测定估计值进行建模。对于每种组织，视情况而定使用Excel将未经衰减校正的时间-活性浓度数据拟合至单分量、二分量或更复杂的指数函数，并且进行分析积分以得出每施用活性的累计活性浓度(MBq-h/g/MBq)。使用非贯穿辐射的177Lu平衡剂量常数(8.49g-cGy/MBq-h)来估计肿瘤与肿瘤和选择的器官与器官自吸收剂量，假设仅177Luβ射线的局部吸收是完全的，并且忽略γ射线和非自身剂量的贡献。
蛋白质序列。抗GD2抗体使用来自hu3F8的VH和VL结构域(Cheung等人,Oncoimmunology 1,477-486(2012))。抗DOTA抗体使用来自huC825的VH和VL结构域。SADA结构域源自TP53、TP63、TP73或HNRPC或SNAP23基因的选择部分。IgG-scFv-BsAb蛋白使用含有N297A和K322A两种突变以分别消除Fc受体结合活性和补体结合活性的人IgG1框架。所有scFv结构域在VH与VL结构域之间都包括六个G4S1结构域，SADA-BsAb在两个scFv之间包括另外四个G4S1结构域，并且IgG-scFv-BsAb在CL与scFv结构域之间包括另外三个G4S1结构域。
蛋白质产生。根据制造商的说明书使用Expi293表达系统(Invitrogen，A14524)表达所有SADA-BsAb蛋白。简言之，将每种双特异性抗体(BsAb)的表达质粒扩增并且使用PureLinkTM HiPure Plasmid Filter Maxiprep试剂盒(Invitrogen，K210016)纯化，然后稀释并且与Expifectamine(Invitrogen)一起孵育20分钟，之后添加到细胞悬浮液中。使用先前开发的稳定表达细胞系(CHO-S)表达IgG-scFv-BsAb蛋白(Cheal,S.M.等人,Mol CancerTher 13,1803-1812(2014))。在两种情况下，将细胞在摇床培养物中孵育，直到细胞活力降低<70％(4-14天)。将基于IgG的蛋白质使用P920 AKTA FPLC(GE)用蛋白A柱纯化，并且用柠檬酸缓冲液[43mM柠檬酸(Sigma A104)，3mM柠檬酸钠(Sigma，S1804)]和柠檬酸钠溶液[25mM柠檬酸钠(Sigma)，150mM氯化钠(Fisher，S271)]的1:1(v/v)混合液洗脱。将SADA-BsAb蛋白使用预填充的Ni2+NTA柱(GE，11003399)纯化，并且使用250mM咪唑(Sigma，792527)洗脱。将所有蛋白质缓冲液交换到pH 8.2的柠檬酸钠溶液[25mM柠檬酸钠(Sigma)，150mM氯化钠(Fisher)]中过夜，随后通过SEC-HPLC(Shimadzu)进行分析以确定纯度。
射电金属标记。对于DOTA[86Y]，将S-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA，Macrocyclics，B-200，181065-46-3)与86Y硝酸盐(圣路易斯华盛顿大学的放射化学和成像实验室(Radiological Chemistry and Imaging Laboratory))在80℃下混合60分钟。将标记的DOTA通过穿过sepak柱(Waters)与游离的射电金属分离。对于DOTA[177Lu]，将DOTA与177LuCl3(Perkin Elmer)以37MBq与1.1mmol DOTA的比率在乙酸铵(pH5.6)中在85℃下一起孵育60分钟。对于Proteus[225Ac]，将225Ac硝酸盐(橡树岭国家实验室(Oak Ridge National Laboratory))与Proteus在60℃下混合30min。在孵育后，将样品使用用6mL无菌等渗生理盐水溶液(NSS)预平衡的Sephadex C-25柱(GE)纯化。
细胞和细胞系。IMR32细胞系获得自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)。将IMR32细胞用萤光素酶转染，之后用于所有测定。M14细胞系获得自加州大学洛杉矶分校，并且将其用萤光素酶转染，之后用于所有测定。通过STR验证IMR32和M14黑色素瘤细胞。将所有细胞系维持在补充有10％热灭活胎牛血清(VWR，96068-085)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma，G5792)和1％青霉素/链霉素(Corning，30-002-CI)的RPMI培养基(Corning，15-040-CM)中。神经母细胞瘤患者源性异种移植物(PDX)肿瘤由患者的手术样品(在协议NCT00588068中准许)建立。
细胞结合测量。通过流式细胞术测量BsAb的细胞结合。将M14黑色素瘤细胞与每种BsAb一起孵育，并且使用生物素化的DOTA[175Lu]和PE缀合的链霉亲和素蛋白(Sigma，S3402-1ML)两者进行检测。在MSKCC的有机合成核心(Organic Synthesis Core)生成生物素化的DOTA[175Lu]。所有孵育都在4℃下持续30分钟。将实验重复多次，图表表示单次代表性实验。使用BD FACSCalibur获得样品，并且通过FlowJo 10.5.3和GraphPad Prism 8进行分析。
亲和力测量。如先前所述使用SPR(GE，Biacore T200)评价结合动力学(Santich,B.H.等人,Sci Transl Med 12,(2020))。简言之，将SA芯片用生物素-GD2(ElicitylOligotech)包被。使每种BsAb的五步滴定系列流过它们，随后是两个空白循环和两个再生循环。使用双态反应模型用GE Biacore评价软件计算结合亲和力。使用GraphPad Prism 8绘制数据。
统计学分析。使用Prism软件8.4版本(GraphPad)进行所有统计学分析。通过ManWhitney检验(ADA滴度)、双因素方差分析(ANOVA)与随后的Tukey或Sidak校正(肿瘤反应)或对数秩(Mantel-Cox)检验(存活率分析)确定统计学显著性。对于所有统计学检验，使用P值<0.05来表示统计学显著性。所有误差条都表示标准差，除非在图例中另外说明。
实施例2：TP53和TP63可以使抗GD2x抗DOTABsAb稳定地四聚化
通过将小四聚化SADA结构域融合到人源化串联单链片段(scFv)BsAb来设计抗GD2/抗DOTA SADA-BsAb缀合物，其中一个scFv与肿瘤抗原神经节苷脂GD2结合，并且另一个scFv与DOTA(一种螯合镥的小分子有效载荷)结合。所得SADA-BsAb的自组装大小为约200kDa，并且分解大小为约50kDa(图1B)。基于以下几个标准选择候选SADA结构域：人源、非膜蛋白、自然四聚化并且分子大小低于15kDa。鉴定出六个候选序列，包括TP53、TP63和TP73(图14)。其中，四个作为SADA-BsAb表达足够好(>1mg/L)，并且在预期的四聚体大小下展示出高纯度(图1C，图15)。在这四个序列中，基于它们在37℃下优越的稳定性、高表达率和高纯度选择源自TP53和TP63的序列。
通过表面等离子体共振(SPR)和流式细胞术分析评价P53-SADA-BsAb和P63-SADA-BsAb的结合亲和力(图1D和1E，图16)。与用于三步IgG-PRIT的相应的抗GD2 x抗DOTA IgG-[L]-scFv格式化的BsAb(Cheal,S.M.等人,Mol Cancer Ther 13,1803-1812(2014))相比，SPR揭示了P53-SADA-BsAb和P63-SADA-BsAb两者的增强的GD2结合亲合力(KD)和更慢的解离(koff)(分别为1.2nM相比于4.6nM KD)。另外，流式细胞术证实了P53-SADA-BsAb和P63-SADA-BsAb可以使DOTA有效载荷(生物素化的DOTA[175Lu])与肿瘤细胞(GD2+神经母细胞瘤)以与IgG-scFv-BsAb相当的结合强度结合。
实施例3：SADA-BsAb迅速从体内清除而不损害肿瘤摄取
先前的研究已经表明单体或二聚体抗GD2串联scFv BsAb在小鼠中展现出非常短的终末半衰期(t1/2＝0.5小时)(Ahmed等人,Oncoimmunology 4,e989776(2015))，而抗GD2IgG或IgG-scFv-BsAb则长得多(t1/2＝72小时)(Santich,B.H.等人,Sci Transl Med12(2020))。相比之下，P53-SADA结构域和P63-SADA结构域两者都大大改变了BsAb单体的药代动力学(t1/2＝9小时)，同时也允许它们在48小时内从血液中完全清除(图2A，图17)。如图26所示，P53-SADA-BsAb水平在施用后24小时在血液中仍然可检测到，并且在48小时后基本上从血液中清除。
为了测量SADA在有效载荷递送上的实用性，采用使用DOTA[177Lu]作为细胞毒性有效载荷的多步骤靶向策略。方案开始于在携带皮下GD2+神经母细胞瘤异种移植物(IMR32)的无胸腺裸小鼠中进行的剂量递增研究。向小鼠给药P53-SADA-BsAb(1.25nmol)，随后在48小时后给药3.7、18.5或37MBq DOTA[177Lu](分别为20、100或200pmol)。有效载荷的肿瘤摄取揭示了与施用剂量的强线性相关性(斜率为0.45pmol/g/MBq，R2＝0.94)，同时在所有剂量水平下血液中的活性都保持较低(斜率<0.001，R2＝0.70)，导致有效载荷的剂量越高，肿瘤与血液比率越高(图2B，皮尔逊系数为0.9939)。肾脏摄取也随着施用剂量而增加，但是斜率浅得多(斜率＝0.04，R2＝0.77)。这些结果与先前的三步IgG-PRIT研究(Cheal,S.M.等人,Eur J Nucl Med Mol Imaging 43,925-937(2016))形成对比，在先前的研究中肿瘤摄取在约11pmol/g下趋于平稳，表明SADA-BsAb可以更有效地将DOTA有效载荷递送到肿瘤，并且对肾脏或血液的暴露极小。图24A-24B和图25A-25B显示肾脏摄取不受SADA-BsAb中6xHIS标签的存在或不存在的影响。
由使用相同模型的系列生物分布研究生成两步SADA-PRIT的有效载荷剂量测定估计值(图18)。在这里，P53-SADA-BsAb和P63-SADA-BsAb两者都在无清除剂的情况下施用，而IgG-scFv-BsAb遵循三步方案(采用清除剂)。虽然P53-SADA-BsAb和IgG-scFv-BsAb递送相当的辐射总剂量到肿瘤和肾脏，但与IgG-scFv-BsAb相比，P53-SADA-BsAb和P63-SADA-BsAb两者都递送大大降低的辐射剂量到血液(1.2-2.9cGy/MBq相比于8.1cGy/MBq，TI>100:1)和骨髓(1.1-1.8cGy/MBq相比于4.7cGy/MBq，TI>120:1)。根据这些估计值，预期P53-SADA-BsAb可从15MBq(405μCi)剂量的DOTA[177Lu]有效载荷安全递送5,000cGy吸收剂量到肿瘤，并且肾脏和血液分别仅接受191cGy和44cGy。
由于DOTA有效载荷可以用于治疗性应用和诊断性(治疗诊断性)应用两者，通过交换177Lu与86Y评价使用正电子发射断层扫描(PET)的P53-SADA-BsAb的定量有效载荷递送(图2C-2D)。在t＝0时向异种移植的裸小鼠给药P53-SADA-BsAb，随后在t＝48h给药DOTA[86Y]，并且在t＝66h通过PET/CT成像(图19)。为了进行比较，包括另外两组：给药(i)IgG-scFv-BsAb和DOTA[86Y]无清除剂(两步)或(ii)IgG-scFv-BsAb和DOTA[86Y]与清除剂(三步)的小鼠。由于高含量的残留循环BsAb，在无清除剂情况下施用的IgG-scFv-BsAb导致DOTA[86Y]有效载荷大量滞留在血液中。相比之下，在施用IgG-scFv-BsAb后包括清除剂改善了肿瘤对比，但也增加了肠道摄取，可能是由于肝胆清除。然而，用P53-SADA-BsAb进行治疗(不用清除剂)给出了最好的对比，展示出强烈的肿瘤摄取并且在任何其他器官中几乎没有可检测信号。
这些结果证实了本发明技术的SADA-BsAb可以有效地将有效载荷靶向肿瘤。因此，本发明技术的抗GD2 SADA缀合物可用于治疗性应用和诊断性(治疗诊断性)应用两者中。
实施例4：P53-SADA-BsAb的免疫原性明显低于IgG-scFv-BsAb
为了测试SADA-BsAb是否展现出降低的免疫原性，将有免疫能力的小鼠用P53-SADA-BsAb或IgG-scFv-BsAb免疫(第0天)并且激发(第28天)，并且测量血浆中的抗药物抗体(ADA)滴度(图3A-3B)。尽管它们具有较高的序列同源性，但在一次免疫和二次免疫后，用P53-SADA-BsAb免疫的小鼠都显示出显著低于用IgG-scFv-BsAb免疫的小鼠的ADA滴度(P＝0.008)。这些结果证明与IgG-scFv-BsAb相比，SADA-BsAb的免疫原性更低，至于ADA的出现，这通常见于基于IgG的疗法中。这种益处对临床转译至关重要，在临床转译中可能需要多剂量的抗体。
实施例5：SADA-BsAb安全递送β发射体有效载荷以消融已长成的神经母细胞瘤肿 瘤
使用与之前相同的异种移植物模型评价两步SADA-PRIT的抗肿瘤功能(图4A)。使用3x-3x方案治疗小鼠，其中每周，持续三周，一个剂量的BsAb(1.25nmol)之后是48小时后的一个剂量的DOTA[177Lu](18.5MBq，100pmol)。在两周内，所有治疗的肿瘤的大小都减小，并且在五周内，它们完全有反应(图4A-4C)，存活期显著延长(中值存活期>115d相比于对照组20d，P<0.0001)。在延长随访后，与P53-SADA-BsAb的70％(7/10)和P63-SADA-BsAb的50％(5/10)相比，100％的用IgG-scFv-BsAb治疗的小鼠(10/10)保持完全缓解。与在先前的实验中观察到的0％完全缓解率相比，用SADA-BsAb 3x-3x方案观察到的完全缓解率显著提高，在先前的实验中具有显著肿瘤负荷(>500mm3肿瘤体积)的小鼠接受单次250μg(1.25nmol)剂量的P53-SADA-BsAb(缺乏HIS标签)，随后在24小时后接受2mCi 177Lu-Bn-DOTA。
对两步SADA-PRIT探索了另外两种治疗方案，其中每个剂量的P63-SADA-BsAb之后是三个而不是一个剂量的DOTA[177Lu](图7A-7D)，持续一周(1x-3x，55.5MBq DOTA[177Lu]/小鼠)或两周(2x-6x，111MBq DOTA[177Lu]/小鼠)。在施用SADA-BsAb后48h施用第一剂量的DOTA[177Lu]，在第一剂量的DOTA[177Lu]后24小时施用第二剂量的DOTA[177Lu]，并且在第二剂量的DOTA[177Lu]后24小时施用第三剂量的DOTA[177Lu]。虽然所有治疗的肿瘤都完全有反应，但2x-6x方案展示出最佳的持久性(2x-6x的中值存活期>250d相比于1x-3x的中值存活期119d)，其表明更高剂量的有效载荷可以改善反应持久性。完全缓解率如下：1x-3x：60％缓解相比于2x-6x：20％缓解。
在短期(0-30天)和长期(3-8个月)的随访后，都通过活体观察(体重)、临床病理学(全血细胞计数、血清化学、血浆FLT3L细胞因子)和解剖病理学(肉眼尸检和组织病理学)确定起源于SADA-BsAb的治疗相关毒性(图8A-8C、9A-9C和10，图20)。总的来说，治疗后的毒性是轻度的或不存在。值得注意的是，在整个治疗过程中，小鼠没有显示出体重的减轻，并且治疗期间和治疗后的CBC都正常。另外，FLT3L(一种先前被证明与人类患者骨髓中的辐射损伤相关的细胞因子)的血清水平并没有随着治疗而变化。最后，血清化学未揭示肾脏或肝脏中的任何功能障碍，并且肾脏、肝脏、脾脏、骨髓、脑和脊柱的组织学分析未揭示治疗相关病状。考虑到在常规RIT中这些器官对辐射相关毒性的敏感性(Repetto-Llamazares,A.H.等人,PLoS One 9,e103070(2014)；Cheung,N.K.等人J Natl Cancer Inst 77,739-745(1986)；Subbiah,K.等人,J Nucl Med 44,437-445(2003))，以及神经节苷脂GD2在小鼠脑中的存在(Furukawa,K.等人,J Neurochem105,1057-1066(2008))，这是高度相关的。有趣的是，尽管在肾脏中没有观察到，但在用IgG-scFv-BsAb治疗的小鼠的肾上腺中观察到一些轻度增生和肥大(在第230天为3/3)。在任何其他小鼠中都未观察到这些肾上腺病状。然而，观察到两种临床上显著的治疗相关毒性：中度至显著的卵巢萎缩和轻度至中度的膀胱慢性膀胱炎(图4D，图7A-7D和图10)。
在十只小鼠中观察到卵巢萎缩：七只用IgG-scFv-BsAb 3x-3x治疗的小鼠(在110天有2/3，在155天有2/3，在230天有3/3)、一只用P53-SADA-BsAb 3x-3x治疗的小鼠(所检查的9只中有1只)以及两只使用2x-6x方案用P63-SADA-BsAb治疗的小鼠(所检查的2只中有2只)。值得注意的是，与任一组SADA-BsAb治疗小鼠相比，在IgG-scFv-BsAb治疗小鼠中这更频繁(7只小鼠相比于1-2只小鼠)并且严重程度更高，特别是在230天后分析的小鼠当中(3/3为4级)，这表明卵巢随着时间的推移而萎缩，而不是在辐射治疗后立即萎缩。与1x-3x或甚至3x-3x治疗的小鼠相比，此毒性在用2x-6x方案治疗的小鼠当中也更常见，这表明卵巢毒性可能是非特异性暴露于辐射的结果，起因于高施用剂量的177Lu，或作为来自治疗小鼠血池中长寿命的循环有效载荷的旁效应(即，DOTA与未充分清除的IgG-scFv-BsAb结合)。
在四只小鼠中观察到膀胱的慢性膀胱炎，特征在于轻度至中度的尿路上皮增生并且与炎症浸润和纤维化不定相关，以下每个治疗组当中有一只：IgG-scFv-BsAb 3x-3x(1/9)、P53-SADA-BsAb 3x-3x(1/9)、P63-SADA-BsAb 1x-3x(1/2)和P63-SADA-BsAb2x-6x(1/2)。对一种治疗缺乏特异性表明此毒性起源于已知会清除到尿液中的有效载荷本身。另外，只有少数治疗小鼠当中毒性的存在与177Lu在膀胱中停留的时间有关，如果不能完全避免的话可以使它可改善。这些毒性数据证实了SADA-BsAb用于治疗实体瘤的安全性和功效。值得注意的是，与三步IgG-PRIT相比，此方案不需要任何清除剂并且所引发的对非肿瘤组织的毒性似乎更少且强度更低。
实施例6：P53-SADA-BsAb消融已长成的神经母细胞瘤PDX肿瘤
基于在用另外剂量的DOTA[177Lu]治疗的小鼠中观察到的改善的肿瘤反应，评价使用3倍高剂量的DOTA[177Lu]有效载荷(55.5MBq/剂量，300pmol)的P53-SADA-BsAb的功效。在此模型中，将携带皮下GD2+患者源性异种移植物(PDX)肿瘤的Rag2-/-IL2rgc-/-双敲除(DKO)小鼠用P53-SADA-BsAb或IgG-scFv-BsAb治疗，使用与之前相同的3x-3x方案(图5A)。所有治疗组都展示出完全反应无复发(在两组中，5/5小鼠都被治愈)，而对照组展示出不受控制的肿瘤生长并且在30天内被处死(图5B，图11A)。
像之前一样评价治疗毒性，评估短期和长期治疗相关毒性的测量值(图11B，图12A-12B和图21)。与先前的模型一致，P53-SADA-BsAb和IgG-scFv-BsAb都未对肾脏、肝脏、骨髓、脾脏、脑或脊柱引发任何毒性。然而，几乎所有的小鼠都展示出膀胱的重度膀胱炎。由于这些小鼠接受比先前的模型多3倍的有效载荷(图4A-4D)，膀胱的增加的尿路上皮变性、增生和纤维化的频率和严重程度表明，此有效载荷量(6,600MBq/kg177Lu)接近膀胱的最大耐受剂量。
然而，重要的是要注意所有治疗的小鼠的血清化学在处死时都是正常的，并且小鼠在治疗期间或治疗后没有显示出明显的排尿功能障碍。这表明此毒性可能发展了许多周，这与患者的辐射诱导出血性膀胱炎的表型一致(Manikandan等人,.Indian J Urol 26,159-166(2010))。这些结果证明SADA-BsAb可用于向肿瘤递送极其大剂量的发射β的放射性同位素有效载荷而不产生肾脏、肝脏或骨髓毒性的方法中。
实施例7：P53-SADA-BsAb可以安全递送α粒子以消融已长成的神经母细胞瘤肿瘤
由于每次降解的能量释放更高并且双链DNA断裂的比率增加，放射免疫疗法的长期目标一直是安全递送α粒子到肿瘤。使用Proteus DOTA半抗原来用两步SADA-PRIT递送α发射体225Ac(Cheal,S.等人,Journal of Nuclear Medicine 59(2018))。由于α粒子有效载荷的放射生物学效应增加，将携带神经母细胞瘤PDX肿瘤的DKO小鼠仅用单剂量的SADA-BsAb(1.25nmol)治疗，随后在48小时后用单剂量的Proteus[225Ac](37kBq，2.4nmol)治疗。所有治疗组中的肿瘤都有反应(包括超过500mm3的一个)，而对照组显示出不受控制的肿瘤生长(图5C-5D，图11C)。
先前将α粒子有效载荷递送到肿瘤的尝试一直遇到了许多毒性，特别是对肾脏和骨髓(Jaggi,J.S.等人,J Am Soc Nephrol 16,2677-2689,(2005))。然而，用P53-SADA-BsAb和Proteus[225Ac]有效载荷进行治疗没有显示出任何可观察到的毒性(图11D，图13A-13B)。治疗后14天的CBC分析证明无骨髓抑制，并且在治疗后120天时血清化学值保持正常。另外，肝脏、脑、骨髓和脾脏组织的组织学检查没有显示出辐射损伤的证据(图22A)。
有趣的是，膀胱毒性完全不存在，这表明在早期实验中观察到的膀胱的膀胱炎来自于所使用的特定有效载荷(177Lu)，而不是靶向策略或BsAb。由于SADA-BsAb主要通过肾脏滤过清除，使用H&E、TUNEL染色和裂解的半胱天冬酶3(CC-3)免疫组织化学对来自治疗小鼠的肾脏的组织学变化进行彻底地分析。与本文所述的先前的发现一致，P53-SADA-BsAb没有引发任何可观察到的对肾脏的损伤，尽管一些用IgG-scFv-BsAb治疗的小鼠确实在肾小管中显示出TUNEL染色和CC-3免疫反应性的略微升高，可能是由于未充分清除的IgG-scFv-BsAb的循环。
在治疗后163、210和309天进一步评估P53-SADA-BsAb和Proteus[225Ac]有效载荷疗法的毒性。如图22B所示，在治疗后长达309天时，未观察到骨髓抑制以及对肝脏、脑、骨髓和脾脏组织的辐射损伤的证据。此外，相对于用IgG-scFv-BsAb治疗的动物，用P53-SADA-BsAb治疗的动物几乎全部显示出极少到轻度的肾脏的组织病理学异常。参见图22B。
这些结果证明本文公开的SADA-BsAb可以安全递送发射α粒子的高细胞毒性有效载荷。
实施例8：P53-SADA-BsAb可以消融已长成的小细胞肺癌PDX肿瘤
除了神经母细胞瘤外，神经节苷脂GD2还在广泛的人类肿瘤中表达。其中，小细胞肺癌(SCLC)可能是最难治疗的(5年存活率<5％)。由于SCLC先前已经被证明对辐射敏感(Carmichael,J.等人,Eur J Cancer Clin Oncol 25,527-534(1989))，使用DOTA[177Lu](图23)和Proteus[225Ac]有效载荷(图6A-6C)评价它对两步SADA-PRIT的反应。
为DKO小鼠植入SCLC PDX肿瘤(LX22)，并且用单周期的SADA-BsAb(1.25nmol)和Proteus[177Lu](37.5kBq，700pmol)进行治疗。图23A显示SADA-BsAb(SEQ ID NO:27)与DOTA[177Lu]有效载荷组合在SCLC患者源性异种移植物(PDX)治疗模型中诱导与IgG-scFv-BsAb相当的稳健的抗肿瘤反应。
为DKO小鼠植入SCLC PDX肿瘤(LX22)，并且用单周期的SADA-BsAb(1.25nmol)和Proteus[225Ac](37.5kBq，700pmol)进行治疗。尽管在治疗时它们的大小很大，但所有治疗的肿瘤都有反应(图6A-6C)。另外，除了一个肿瘤(它们当中最大的)外的所有肿瘤都完全且经久地缩小，而对照组中的肿瘤则迅速生长超过所允许的最大大小。这些结果证明即使是大肿块也可以用α粒子有效地治疗，尽管与β粒子相比路径长度更短。图23B-23C证明在SCLC患者源性异种移植物(PDX)治疗模型中SADA-BsAb与DOTA[225Ac]有效载荷组合也诱导剂量依赖性抗肿瘤反应。50μg/剂量抗GD2 SADA缀合物治疗组显示出低的持久性反应，而用250μg抗GD2 SADA缀合物给药的小鼠显示出近完全反应(10/10)。
这些结果证明本发明技术的SADA-BsAb可用于用细胞毒性有效载荷、特别是发射α的放射性同位素或发射β的放射性同位素治疗肿瘤的方法中。
等效内容
本发明技术并不受限于本申请中描述的特定实施方案，所述实施方案旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。如本领域技术人员将清楚的，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行许多修改和改变。本领域技术人员根据前述描述将清楚的，除了本文所列举的方法和设备外，在本发明技术范围内的功能上等效的方法和设备。此类修改和改变旨在落入本发明技术的范围内。应理解，本发明技术并不限于特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在是限制性的。
另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围都还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围都可以容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文论述的每个范围都可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员将理解的，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且涉及随后可以分解为如上所论述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。
将本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过引用以其整体而并入，包括所有图形和表格，并入程度使其不会与本说明书的明确教导内容不一致。

Claims (35)

1.一种用于在有需要的受试者中减少或减轻α放射免疫疗法相关毒性的方法，所述方法包括
向所述受试者施用有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽的抗DOTA双特异性抗原结合片段，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段被配置为定位于表达GD2的肿瘤；以及
向所述受试者施用有效量的包含发射α粒子的同位素的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原被配置为与所述抗DOTA双特异性抗原结合片段结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者已经接受或正在接受一个或多个周期的α放射免疫疗法。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述发射α粒子的同位素是213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At或255Fm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述α放射免疫疗法相关毒性是对选自脑、肾脏、膀胱、肝脏、骨髓和脾脏的一个或多个器官的毒性。
5.一种用于增加β放射免疫疗法在有需要的受试者中的功效的方法，所述方法包括
(a)向所述受试者施用有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽的抗DOTA双特异性抗原结合片段，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段被配置为定位于表达GD2的肿瘤；
(b)在施用所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约48小时向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗DOTA双特异性抗原结合片段结合；
(c)在施用所述第一剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；以及
(d)在施用所述第二剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。
6.根据权利要求5所述的方法，所述方法进一步包括将步骤(a)-(d)重复至少一个另外的循环。
7.一种用于增加β放射免疫疗法在有需要的受试者中的功效的方法，所述方法包括
(a)向所述受试者施用第一有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽的抗DOTA双特异性抗原结合片段，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段被配置为定位于表达GD2的肿瘤；
(b)在施用所述第一有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约48小时向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗DOTA双特异性抗原结合片段结合；
(c)在施用所述第一有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约7天向所述受试者施用第二有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段；
(d)在施用所述第二有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约48小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；
(e)在施用所述第二有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约7天向所述受试者施用第三有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段；以及
(f)在施用所述第三有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后48小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是不同的。
9.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述DOTA半抗原的第一剂量、第二剂量和第三剂量是相同的。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其中所述发射β粒子的同位素是86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu或67Cu。
11.一种用于治疗有需要的受试者的GD2相关癌症的方法，所述方法包括
(a)向所述受试者施用有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽的抗DOTA双特异性抗原结合片段，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段被配置为定位于表达GD2的肿瘤；
(b)在施用所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约48小时向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素或发射α粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗DOTA双特异性抗原结合片段结合；
(c)在施用所述第一剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；以及
(d)在施用所述第二剂量的所述DOTA半抗原后约24小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。
12.根据权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括将步骤(a)-(d)重复至少一个另外的循环。
13.一种用于治疗有需要的受试者的GD2相关癌症的方法，所述方法包括
(a)向所述受试者施用第一有效量的包含p53或p63的自组装分解(SADA)多肽的抗DOTA双特异性抗原结合片段，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段被配置为定位于表达GD2的肿瘤；
(b)在施用所述第一有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约48小时向所述受试者施用第一剂量的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原(i)包含发射β粒子的同位素或发射α粒子的同位素，并且(ii)被配置为与所述抗DOTA双特异性抗原结合片段结合；
(c)在施用所述第一有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约7天向所述受试者施用第二有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段；
(d)在施用所述第二有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约48小时向所述受试者施用第二剂量的所述DOTA半抗原；
(e)在施用所述第二有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后约7天向所述受试者施用第三有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段；以及
(f)在施用所述第三有效量的所述抗DOTA双特异性抗原结合片段后48小时向所述受试者施用第三剂量的所述DOTA半抗原。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述发射β粒子的同位素是86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu或67Cu。
15.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述发射α粒子的同位素是213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At或255Fm。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段包括包含分别地SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH)序列和轻链可变结构域(VL)序列的GD2特异性抗原结合结构域。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的重链可变结构域(VH)序列和SEQ ID NO:13或SEQID NO:18的轻链可变结构域(VL)序列的DOTA特异性抗原结合结构域。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中在所述GD2特异性抗原结合结构域中的所述VH结构域序列与所述VL结构域序列之间的肽内接头的序列是SEQ ID NO:19-21中的任一个。
19.根据权利要求17-18中任一项所述的方法，其中在所述DOTA特异性抗原结合结构域中的所述VH结构域序列与所述VL结构域序列之间的肽内接头的序列是SEQ ID NO:19-21中的任一个。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中在所述GD2特异性抗原结合结构域与所述DOTA特异性抗原结合结构域之间的肽内接头的序列是SEQ ID NO:19-21中的任一个。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：
i.SEQ ID NO:5的VL序列；
ii.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
iii.SEQ ID NO:1的VH序列；
iv.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
v.SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；
vi.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
vii.SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；
viii.包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及
ix.SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：
i.SEQ ID NO:5的VL序列；
ii.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
iii.SEQ ID NO:1的VH序列；
iv.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
v.SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；
vi.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
vii.SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；
viii.包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及
ix.SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
23.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：
i.SEQ ID NO:1的VH序列；
ii.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
iii.SEQ ID NO:5的VL序列；
iv.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
v.SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；
vi.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
vii.SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；
viii.包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及
ix.SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
24.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段包含第一多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包含：
i.SEQ ID NO:1的VH序列；
ii.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
iii.SEQ ID NO:5的VL序列；
iv.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
v.SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的VL序列；
vi.包含SEQ ID NO:19-21中任一个的氨基酸序列的柔性肽接头；
vii.SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17的VH序列；
viii.包含氨基酸序列TPLGDTTHT(SEQ ID NO:40)的柔性肽接头序列；以及
ix.SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的自组装分解(SADA)多肽序列。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述抗DOTA双特异性抗原结合片段的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22-35或38-39。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或被诊断为患有GD2相关癌症。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述GD2相关癌症是神经母细胞瘤、黑色素瘤、软组织肉瘤、脑肿瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌或视网膜母细胞瘤。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述软组织肉瘤是脂肪肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤或梭形细胞肉瘤。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述DOTA半抗原选自DOTA、Proteus-DOTA、DOTA-Bn、DOTA-去铁胺、DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2、Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOT A-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DO TA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2、Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Cy s-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2和Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中与已经用抗DOTA×抗GD2IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗DOTA双特异性抗原结合片段的施用导致所述受试者的肾细胞凋亡减少。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中与已经用抗DOTA×抗GD2IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗DOTA双特异性抗原结合片段的施用导致在所述受试者中的免疫原性降低。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中与已经用抗DOTA×抗GD2IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗DOTA双特异性抗原结合片段的施用导致所述受试者的卵巢萎缩的严重程度降低。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中与已经用抗DOTA×抗GD2IgG-scFv-BsAb治疗的GD2相关癌症患者相比，所述抗DOTA双特异性抗原结合片段的施用导致所述受试者的缓解期延长。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述抗DOTA×抗GD2IgG-scFv-BsAb包含(a)包含分别地SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的重链可变结构域(VH)序列和轻链可变结构域(VL)序列的GD2特异性抗原结合结构域，以及(b)包含SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:17的重链可变结构域(VH)序列和SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:18的轻链可变结构域(VL)序列的DOTA特异性抗原结合结构域。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中与不接受所述抗DOTA双特异性抗原结合片段的对照GD2相关癌症患者相比，所述抗DOTA双特异性抗原结合片段的施用导致所述受试者的肾细胞凋亡减少、卵巢萎缩的严重程度降低和/或缓解期延长。
CN202180059161.6A 2020-05-27 2021-05-26 抗gd2 sada缀合物及其用途 Pending CN116194133A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063030591P 2020-05-27 2020-05-27
US63/030,591 2020-05-27
PCT/US2021/034230 WO2021242848A1 (en) 2020-05-27 2021-05-26 Anti-gd2 sada conjugates and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116194133A true CN116194133A (zh) 2023-05-30

Family

ID=78722708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180059161.6A Pending CN116194133A (zh) 2020-05-27 2021-05-26 抗gd2 sada缀合物及其用途

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230235087A1 (zh)
EP (1) EP4157293A4 (zh)
JP (1) JP2023527385A (zh)
CN (1) CN116194133A (zh)
AU (1) AU2021280272A1 (zh)
CA (1) CA3180445A1 (zh)
WO (1) WO2021242848A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4448565A1 (en) 2021-12-15 2024-10-23 Y-Mabs Therapeutics, Inc. Scfv and antibodies with reduced multimerisation
WO2023110044A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 Y-Mabs Therapeutics, Inc. Formulations comprising a sada complex
WO2024026319A2 (en) * 2022-07-25 2024-02-01 Vironexis Biotherapeutics Inc. Adeno-associated virus vectors and methods of their use for reducing the risk of, treating, and preventing metastasis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060057062A1 (en) * 2004-09-10 2006-03-16 Trotter Dinko G Compositions and methods useful in pretargeted imaging
CN111050808A (zh) * 2017-07-06 2020-04-21 纪念斯隆-凯特林癌症中心 用于抗dota/抗肿瘤抗原双特异性抗体预靶向放射免疫治疗的dota-半抗原组合物
US20200155698A1 (en) * 2017-05-05 2020-05-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Modular self assembly disassembly (sada) technologies

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220259307A1 (en) * 2019-02-22 2022-08-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Cd33 antibodies and methods of using the same to treat cancer
EP3938400A4 (en) * 2019-03-11 2022-11-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center CD22 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
CA3149683A1 (en) * 2019-06-26 2020-12-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-cd33 antibodies for treating cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060057062A1 (en) * 2004-09-10 2006-03-16 Trotter Dinko G Compositions and methods useful in pretargeted imaging
US20200155698A1 (en) * 2017-05-05 2020-05-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Modular self assembly disassembly (sada) technologies
CN111050808A (zh) * 2017-07-06 2020-04-21 纪念斯隆-凯特林癌症中心 用于抗dota/抗肿瘤抗原双特异性抗体预靶向放射免疫治疗的dota-半抗原组合物

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021242848A1 (en) 2021-12-02
JP2023527385A (ja) 2023-06-28
EP4157293A1 (en) 2023-04-05
EP4157293A4 (en) 2024-07-31
AU2021280272A1 (en) 2023-01-19
CA3180445A1 (en) 2021-12-02
US20230235087A1 (en) 2023-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8491896B2 (en) Anti-pancreatic cancer antibodies
US9238084B2 (en) Anti-mucin antibodies for early detection and treatment of pancreatic cancer
ES2789573T3 (es) Anticuerpos multiespecíficos con afinidad por el antígeno A33 humano y el complejo metálico de DOTA
CN116194133A (zh) 抗gd2 sada缀合物及其用途
AU2009279503B2 (en) Anti-pancreatic cancer antibodies
US9089618B2 (en) Anti-mucin antibodies for early detection and treatment of pancreatic cancer
US9513293B2 (en) Detection of early-stage pancreatic adenocarcinoma
US20160347857A1 (en) Antibodies reactive with an epitope located in the n-terminal region of muc5ac comprising cysteine-rich subdomain 2 (cys2)
US20240293588A1 (en) Therapeutic conjugates
JP2022540385A (ja) 新生児ｆｃ受容体に対する低下した親和性を有する、ｐｓｍａに結合するための抗体
JP2022540384A (ja) 新生児ｆｃ受容体に対する低下した親和性を有する、ｃａｉｘに対する抗体
US8974784B2 (en) Anti-pancreatic cancer antibodies
EP2953977B1 (en) Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy
US20140255305A1 (en) Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy
US9599619B2 (en) Anti-pancreatic cancer antibodies
US20170137534A1 (en) Anti-Pancreatic Cancer Antibodies
KR20220148235A (ko) 최적화된 약물 접합을 위한 변형된 결합 폴리펩티드
CN116655793A (zh) Bcma特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法及应用
NZ615308A (en) Antibody-drug conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination