TW202325842A

TW202325842A - 培養表現ｒｏｒ１結合蛋白之細胞之方法

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Publication number: TW202325842A
Application number: TW111141232A
Authority: TW
Inventors: 蘇曼沃德娜拉; 維娜克莉娜莫蒂; 斯賓塞帕克; 揆尼王; 布萊斯薩瑟
Original assignee: 美商萊爾免疫藥物公司
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2023-07-01
Also published as: WO2023077026A1; US20230310605A1; EP4423145A1; IL312204A; CA3234822A1; KR20240109617A; AU2022376953A1

Abstract

本文揭示在包含至少約5 mM鉀離子之培養基中培養免疫細胞的方法，其中該培養基能夠增加該等免疫細胞之幹細胞性。在一些態樣中，使用本文所提供之方法培養的該等免疫細胞係經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，該等免疫細胞經投與至有需要之個體。

Description

培養表現ＲＯＲ１結合蛋白之細胞之方法

本揭示案係關於培養細胞、例如亞全能( pluripotent)、多能(multipotent)及/或免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等細胞已經修飾以具有例如與未經修飾之相應細胞相比增加水準之c-Jun蛋白，且包含編碼ROR1結合蛋白之外源聚核苷酸。在一些態樣中，本文所揭示之方法促進培養中之低分化細胞(less-differentiated cell)及/或未分化細胞的富集，同時保留其效應子活性。在一些態樣中，本文所提供之培養方法亦可幫助增加細胞中之相關蛋白質(例如，c-Jun)的表現。使用本文所揭示之方法培養的細胞可用於多種細胞療法，包括但不限於嵌合抗原受體(CAR)T細胞療法、TCR T細胞療法(包括新抗原定向T細胞療法)及TIL療法。

癌症免疫療法依賴於利用T細胞(免疫系統針對受感染及患病細胞的主要殺手)來攻擊且殺死腫瘤細胞。然而，免疫細胞靶向且殺死腫瘤細胞之能力因腫瘤微環境中存在的各種免疫反應抑制劑之存在而受到抑制。因此，雖然CAR T細胞在治療某些癌症方面已取得各種成功(例如，KYMRIAH™(司利弗明(tisagenlecleucel)，Novartis )及YESCARTA™(阿基崙賽(axicabtagene ciloleucel)，Kite/Gilead)已獲得FDA批准)，但挑戰依然存在。例如，CAR T細胞免疫療法之成功通常受到接受者體內CAR T擴增之程度限制，CAR T擴增通常需要大量細胞輸注。此外，已觀察到經轉移CAR T細胞之耗竭及持久性喪失，從而導致臨床療效喪失及潛在複發。

一種克服T細胞耗竭之方式係選擇性地投與具有低分化狀態之T細胞。例如，T記憶幹細胞(T _SCM)在投與之後在患者中持續之時期比高分化T中央記憶(T _CM)或T效應子記憶(T _EM)細胞更長，且與高分化細胞相比，T _SCM對腫瘤大小之影響更顯著且更長。然而，多種過繼細胞療法(ACT)細胞製劑包含在不同分化狀態下的免疫細胞之不明確混合物，其在根除實體腫瘤方面無效。為了治癒，需要具有增強之自我更新幹細胞/效應子特性之T細胞產品。因而，此項技術中仍需要自經分離之T細胞的混合群體中有效富集低分化及/或幼稚T細胞之方法。

本文提供一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之幹細胞性的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞(例如，人類免疫細胞)，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽。本文提供一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之產量的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞(例如，人類免疫細胞)，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽。本文提供一種製備用於免疫療法之免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之群體的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞(例如，人類免疫細胞)，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽。本文提供一種在離體或活體外培養期間增加用於免疫療法之免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之幹細胞性、同時增加免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之產量的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞(例如，人類免疫細胞)，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽。本文提供一種離體或活體外擴增幹細胞樣免疫細胞之群體的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽。

本文亦提供一種增加免疫細胞因應於抗原刺激而產生之細胞介素的方法，其中該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽。

在一些態樣中，該細胞介素包含IL-2。在一些態樣中，在培養之後，如與參考免疫細胞相比，因應於抗原刺激而產生之細胞介素增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更多。

本揭示案進一步提供一種增加免疫細胞因應於持久抗原刺激之效應子功能的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽。

在一些態樣中，如與參考免疫細胞相比，該等免疫細胞在至少一輪、至少兩輪或至少三輪額外之抗原刺激分析中保留效應子功能。在一些態樣中，效應子功能包含以下能力：(i)殺死腫瘤細胞，(ii)在進一步抗原刺激後產生細胞介素，或(iii) (i)及(ii)二者。在一些態樣中，該細胞介素包含IFN-γ。

在一些態樣中，在培養之後，如與參考免疫細胞相比，該等免疫細胞因應於持久抗原刺激之效應子功能增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更多。

本文提供一種改變一或多種標記物在免疫細胞上之表型表現的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽。

在一些態樣中，該一或多種標記物包含CD39、LAG3、PD1、TIGIT、TIM3或其組合。在一些態樣中，與參考免疫細胞相比，該一或多種標記物之表現減少至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。在一些態樣中，與參考免疫細胞相比，該一或多種標記物之表現減少至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍或至少約5倍。

在任何上述方法中，在一些態樣中，參考免疫細胞包含以下相應免疫細胞：(i)已經修飾以具有增加水準之c-Jun多肽且在不包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；(ii)未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽且在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；(iii)未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽且在不包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；或(iv) (i)至(iii)之任何組合。

在任何上述方法中，在一些態樣中，該等免疫細胞已經編碼嵌合多肽、c-Jun多肽或兩者之外源聚核苷酸修飾，使得在修飾之後，如與未經修飾之相應免疫細胞相比，該等免疫細胞具有增加水準之c-Jun多肽。在一些態樣中，c-Jun多肽對於免疫細胞為內源性的，且其中該等免疫細胞已經能夠增加內源c-Jun多肽之表現之轉錄活化子修飾。在一些態樣中，轉錄活化子連接至已經修飾以缺乏核酸內切酶活性之Cas蛋白。

本文亦提供一種離體或活體外製備用於免疫療法之免疫細胞的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中用編碼(i)c-Jun多肽及(ii)包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽之外源聚核苷酸修飾免疫細胞。本揭示案進一步提供一種離體或活體外製備用於免疫療法之免疫細胞的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中用：(i)能夠增加內源c-Jun多肽之表現之轉錄活化子；及(ii)編碼包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽之外源聚核苷酸修飾免疫細胞。在一些態樣中，轉錄活化子連接至已經修飾以缺乏核酸內切酶活性之Cas蛋白。

在一些態樣中，嵌合多肽包含嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，c-Jun多肽能夠預防或減少免疫細胞之耗竭。

本文提供一種在離體及活體外培養期間增加免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之幹細胞性的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞(例如，人類免疫細胞)，其中該等免疫細胞已經修飾以表現包含以下之嵌合多肽：(i)ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。本文提供一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之產量的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞(例如，人類免疫細胞)，其中該等免疫細胞已經修飾以表現包含以下之嵌合多肽：(i)ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。本文提供一種製備用於免疫療法之免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之群體的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞(例如，人類免疫細胞)，其中該等免疫細胞已經修飾以表現包含以下之嵌合多肽：(i)ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。本文提供一種在離體或活體外培養期間增加用於免疫療法之免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之幹細胞性、同時增加免疫細胞(例如，人類免疫細胞)之產量的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞(例如，人類免疫細胞)，其中該等免疫細胞已經修飾以表現包含以下之嵌合多肽：(i)ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。本文提供一種離體或活體外擴增幹細胞樣免疫細胞之群體的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以表現包含以下之嵌合多肽：(i) ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。

在任何上述方法中，在一些態樣中，免疫細胞進一步經編碼嵌合多肽之外源聚核苷酸修飾。

本文提供一種離體或活體外製備用於免疫療法之免疫細胞的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中用編碼嵌合多肽之外源聚核苷酸修飾免疫細胞，該嵌合多肽包含(i)ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。

在一些態樣中，上文所提供之方法中的任一者之嵌合多肽均包含嵌合抗原受體(CAR)。

在一些態樣中，上文所提供之方法中的任一者之免疫細胞均進一步過表現c-Jun多肽。在一些態樣中，該等免疫細胞已經編碼嵌合多肽、c-Jun多肽或兩者之外源聚核苷酸修飾，使得在修飾之後，如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，該等免疫細胞具有增加水準之c-Jun多肽。在一些態樣中，c-Jun多肽對於該等免疫細胞為內源性的且其中該等免疫細胞已經能夠增加內源c-Jun多肽之表現之轉錄活化子修飾。在一些態樣中，轉錄活化子連接至Cas蛋白，該Cas蛋白已經修飾以缺乏核酸內切酶活性。在一些態樣中，c-Jun多肽能夠預防或減少免疫細胞之耗竭。

在一些態樣中，c-Jun多肽包含與如SEQ ID NO: 13中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，c-Jun多肽由外源聚核苷酸編碼，該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中任一者所述之核苷酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 12所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 2中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 2中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列具有至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 4中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 5中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 6中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 7中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列具有至少55%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 9中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 10中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，c-Jun多肽及嵌合多肽係在同一序列(亦即，載體)上。在一些態樣中，c-Jun多肽及嵌合多肽係在不同序列(亦即，載體)上。

在一些態樣中，上文所提供之方法中的任一者之ROR1結合蛋白均包含特異性結合於ROR1之抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，ROR1結合蛋白與R12抗體特異性結合於相同之抗原決定基。在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含有包含R12抗體之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區(VH)及包含R12抗體之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區(VL)。在一些態樣中，VH CDR1包含如SEQ ID NO: 57中所述之胺基酸序列，VH CDR2包含如SEQ ID NO: 58中所述之胺基酸序列，且VH CDR3包含如SEQ ID NO: 59中所述之胺基酸序列。在一些態樣中，VL CDR1包含如SEQ ID NO: 61中所述之胺基酸序列，VL CDR2包含如SEQ ID NO: 62中所述之胺基酸序列，且VL CDR3包含如SEQ ID NO: 63中所述之胺基酸序列。在一些態樣中，ROR1結合蛋白之VH包含SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列且ROR1結合蛋白之VL包含SEQ ID NO: 60中所述之胺基酸序列。在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含與如SEQ ID NO: 83中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。

在任何上述方法中，在一些態樣中，嵌合多肽進一步包含跨膜(TM)結構域。在一些態樣中，TM結構域源自CD8a、CD2、CD4、CD28、CD45、PD1、CD152或其任何組合。在一些態樣中，TM結構域源自CD28。在一些態樣中，TM結構域包含與如SEQ ID NO: 75中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些態樣中，嵌合多肽進一步包含在ROR1結合蛋白與TM結構域之間的間隔子。在一些態樣中，間隔子源自免疫球蛋白鉸鏈區或CD8。在一些態樣中，間隔子包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列。在一些態樣中，間隔子進一步包含連接體。在一些態樣中，連接體包含GGGSG (SEQ ID NO: 40)。

在一些態樣中，嵌合多肽進一步包含細胞內信號傳導結構域。在一些態樣中，細胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ活化結構域、CD3δ活化結構域、CD3ε活化結構域、CD3η活化結構域、CD79A活化結構域、DAP 12活化結構域、FCER1G活化結構域、DAP10/CD28活化結構域、ZAP70活化結構域或其任何組合。在一些態樣中，細胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ活化結構域。在一些態樣中，CD3 ζ活化結構域包含與如SEQ ID NO: 84中所述之胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些態樣中，嵌合多肽進一步包含細胞內共刺激結構域。在一些態樣中，該細胞內共刺激結構域包含以下各物之共刺激結構域：介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1) 、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、Lck結合缺失之CD28(ICA)、OX40、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1 、LIGHT、NKG2C、PD-1、TILR2、TILR4、TILR7、TILR9、Fc受體γ鏈、Fc受體ε鏈、與CD83特異性結合之配位體或其任何組合。

在一些態樣中，細胞內共刺激結構域包含4-1BB共刺激結構域。在一些態樣中，4-1BB共刺激結構域包含與如SEQ ID NO: 76中所述之胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些態樣中，c-Jun多肽及ROR1結合蛋白藉由連接體連接。在一些態樣中，該連接體為可裂解連接體。在一些態樣中，該可裂解連接體包含P2A連接體、T2A連接體、F2A連接體、E2A連接體、弗林蛋白酶裂解位點或其任何組合。

在一些態樣中，嵌合多肽進一步包含經截短之EGF受體(EGFRt)。在一些態樣中，EGFRt包含與如SEQ ID NO: 24中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些態樣中，EGFRt藉由連接體連接至c-Jun多肽及/或ROR1結合蛋白。在一些態樣中，該連接體為可裂解連接體。在一些態樣中，該可裂解連接體包含P2A連接體、T2A連接體、F2A連接體、E2A連接體、弗林蛋白酶裂解位點或其任何組合。

在任何上述方法中，在一些態樣中，嵌合多肽進一步包含信號肽。在一些態樣中，信號肽源自hIgK。在一些態樣中，hIgK信號肽包含如SEQ ID NO: 54中所述之胺基酸序列。在一些態樣中，嵌合多肽包含與如SEQ ID NO: 54中所述之胺基酸序列具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。

在一些態樣中，嵌合多肽由外源聚核苷酸編碼，該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 86中所述之核苷酸序列具有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核苷酸序列。

在一些態樣中，上文所提供之方法中的任一者之外源聚核苷酸均包含載體。在一些態樣中，該外源聚核苷酸進一步包含骨髓增殖性肉瘤病毒增強子、缺失之陰性對照區、dl587rev引子結合位點取代(MND)啟動子、EF1a啟動子、泛素啟動子或其任何組合。在一些態樣中，MND啟動子包含與如SEQ ID NO: 92中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。

在任何上述方法中，在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約10 mM、高於約15 mM、高於約20 mM、高於約25 mM、高於約30 mM、高於約35 mM、高於約40 mM、高於約45 mM、高於約50 mM、高於約55 mM、高於約60 mM、高於約65 mM、高於約70 mM、高於約75 mM、高於約80 mM、高於約85 mM或高於約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度係選自由約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM及約80 mM組成之群。在一些態樣中，鉀離子之濃度係在約30 mM與約80 mM之間、約40 mM與約80 mM之間、約50 mM與80 mM之間、約60 mM與約80 mM之間、約70 mM與約80 mM之間、約40 mM與約70 mM之間、約50 mM與約70 mM之間、約60 mM與約70 mM之間、約40 mM與約60 mM之間、約50 mM與約60 mM之間或約40 mM與約50 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM、約60 mM或約70 mM。

在一些態樣中，該培養基進一步包含鈉離子。在一些態樣中，該培養基進一步包含NaCl。在一些態樣中，該培養基包含小於約140 mM、小於約130 mM、小於約120 mM、小於約110 mM、小於約100 mM、小於約90 mM、小於約80 mM、小於約70 mM、小於約60 mM、小於約50 mM或小於約40 mM NaCl。

在一些態樣中，該培養基為低張或等張的。

在一些態樣中，該培養基為低張的，且其中鉀離子濃度及鈉離子濃度之總和乘以2係小於280 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的，且其中鉀離子濃度及鈉離子濃度之總和乘以2係大於240 mM且小於280 mM。在一些態樣中，該培養基為等張的，且其中鉀離子濃度及鈉離子濃度之總和乘以2係大於或等於280 mM且小於300 mM。

在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM，且NaCl之濃度係小於約80 mM、小於約75 mM、小於約70 mM、小於約65 mM或小於約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM，且NaCl之濃度係小於約85 mM、小於約80 mM、小於約75 mM、小於約70 mM或小於約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM，且NaCl之濃度係小於約90 mM、小於約85 mM、小於約80 mM、小於約75 mM或小於約70 mM。

在一些態樣中，上文所提供之方法的免疫細胞包含T細胞、B細胞、調節性T細胞(Treg)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NKT)細胞或其任何組合。在一些態樣中，該等免疫細胞已在活體外或離體經工程改造。

在一些態樣中，該培養基進一步包含一或多種細胞介素。在一些態樣中，該一或多種細胞介素包含介白素-2(IL-2)、介白素-7(IL-7)、介白素-21(IL-21)、介白素-15(IL-15)或其任何組合。在一些態樣中，該一或多種細胞介素包含IL-2、IL-7及IL-15。

在一些態樣中，該培養基包含濃度為約50 IU/mL至約500 IU/mL之IL-2。在一些態樣中，IL-2之濃度為約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL。在一些態樣中，IL-2之濃度係在約100 IU/mL至約300 IU/mL之間。在一些態樣中，IL-2之濃度為約200 IU/mL。

在一些態樣中，該培養基包含濃度為約50 IU/mL至約500 IU/mL之IL-21。在一些態樣中，IL-21之濃度為約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL。在一些態樣中，IL-21之濃度係在約100 IU/mL至約300 IU/mL之間。在一些態樣中，IL-21之濃度為約200 IU/mL。

在一些態樣中，該培養基包含濃度為約500 IU/mL至約1,500 IU/mL之IL-7。在一些態樣中，IL-7之濃度為約500 IU/mL、約550 IU/mL、約600 IU/mL、約650 IU/mL、約700 IU/mL、約750 IU/mL、約800 IU/mL、約850 IU/mL、約900 IU/mL、約950 IU/mL、約1,000 IU/mL、約1,050 IU/mL、約1,100 IU/mL、約1,150 IU/mL、約1,200 IU/mL、約1,250 IU/mL、約1,300 IU/mL、約1,350 IU/mL、約1,400 IU/mL、約1,450 IU/mL或約1,500 IU/mL。在一些態樣中，IL-7之濃度為約1,000 IU/mL至約1,400 IU/mL。在一些態樣中，IL-7之濃度為約1,200 IU/mL。

在一些態樣中，該培養基包含濃度為約50 IU/mL至約500 IU/mL之IL-15。在一些態樣中，IL-15之濃度為約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL。在一些態樣中，IL-15之濃度係在約100 IU/mL至約300 IU/mL之間。在一些態樣中，IL-15之濃度為約200 IU/mL。

在一些態樣中，該培養基進一步包含細胞擴增劑。在一些態樣中，該細胞擴增劑包含GSK3B抑制劑、ACLY抑制劑、PI3K抑制劑、AKT抑制劑或其任何組合。在一些態樣中，PI3K抑制劑係選自羥基檸檬酸鹽、LY294002、匹替利司(pictilisib)、CAL101、IC87114或其任何組合。在一些態樣中，AKT抑制劑係選自MK2206、A443654、AKTi-VIII或其任何組合。

在一些態樣中，如與開始免疫細胞相比，與在不含高濃度之鉀離子的培養基中培養之免疫細胞及/或不含c-Jun多肽之免疫細胞相比，上文所提供之方法的培養基能夠在最終細胞產物中：a)增加低分化及/或未分化細胞之數目及/或百分率；b)增加轉導效率；c)增加幹細胞樣免疫細胞；d)增加活體內活力；e)增加細胞效能；f)防止細胞耗竭；或g)其任何組合。

在一些態樣中，該培養基進一步包含鈣離子、葡萄糖或兩者。

在一些態樣中，該培養基進一步包含葡萄糖，且其中葡萄糖之濃度係大於約10 mM。在一些態樣中，葡萄糖之濃度為約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約15 mM至約19 mM、約15 mM至約18 mM、約15 mM至約17 mM、約15 mM至約16 mM、約16 mM至約20 mM、約16 mM至約19 mM、約16 mM至約18 mM、約16 mM至約17 mM、約17 mM至約20 mM、約17 mM至約19 mM或約17 mM至約18 mM。在一些態樣中，葡萄糖之濃度為約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM或約25 mM。在一些態樣中，葡萄糖之濃度為約15.4 mM、約15.9 mM、約16.3 mM、約16.8 mM、約17.2 mM或約17.7 mM。

在一些態樣中，該培養基進一步包含鈣離子，且其中鈣離子之濃度係大於約0.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.4 mM至約2.8 mM、約0.4 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.0 mM、約1.0 mM至約2.0 mM、約1.1 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約2.0 mM、約1.3 mM至約2.0 mM、約1.4 mM至約2.0 mM、約1.5 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.8 mM、約1.7 mM至約2.0 mM、約1.8 mM至約2.0 mM、約1.2至約1.3 mM、約1.2至約1.4 mM、約1.2至約1.5 mM、約1.2至約1.6 mM、約1.2至約1.7 mM、約1.2至約1.8 mM、約1.3至約1.4 mM、約1.3至約1.5 mM、約1.3至約1.6 mM、約1.3至約1.7 mM、約1.3至約1.8 mM、約1.4至約1.5 mM、約1.4至約1.6 mM、約1.4至約1.7 mM、約1.4至約1.8 mM、約1.5至約1.6 mM、約1.5至約1.7 mM、約1.5至約1.8 mM、約1.6至約1.7 mM、約1.6至約1.8 mM或約1.7至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM、約2.0 mM、約2.1 mM、約2.2 mM、約2.3 mM、約2.4 mM、約2.5 mM、約2.6 mM、約2.7 mM、約2.8 mM、約2.9 mM或約3.0 mM。

在一些態樣中，該等免疫細胞在培養之後為CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+或TCF7+，或其任何組合。在一些態樣中，該等免疫細胞在醫藥組合物及醫藥學上可接受之載劑中經調配。

本文提供藉由本文所述之任何方法製備的免疫細胞(例如，人類免疫細胞)群體。

本文提供一種免疫細胞群體，該等免疫細胞能夠在活體內實現長期持久性，其中該等免疫細胞已：(i)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養，及(ii)經修飾以表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽。在一些態樣中，當投與至有需要之個體時，本文所述之免疫細胞群體能夠在該個體中持續至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月或至少約6個月。

本文亦提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之免疫細胞(例如，人類免疫細胞)群體及醫藥學上可接受之載劑。

本揭示案進一步提供一種治療有需要之個體的腫瘤之方法，其包括向該個體投與本文所提供之免疫細胞(例如，人類免疫細胞)群體或醫藥組合物中的任一者。在一些態樣中，腫瘤源自癌症，該癌症包含乳癌、頭頸部癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、胰臟癌、甲狀腺癌、食道癌、眼癌、胃癌、胃腸癌、卵巢癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其組合。在一些態樣中，腫瘤為實體腫瘤。

在一些態樣中，在投與之後，與參考腫瘤大小相比，腫瘤之大小(腫瘤大小)有所減少。在一些態樣中，參考腫瘤大小包含：(i)在投與之前的腫瘤大小，(ii)未接受投與(例如，接受經轉導且在不包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養之相應免疫細胞之投與)之相應個體的腫瘤大小，或(iii) (i)及(ii)兩者。在一些態樣中，與參考腫瘤大小相比，腫瘤大小減少至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。

在一些態樣中，在投與之後，與參考存活持續時間相比，該個體之存活持續時間增加。在一些態樣中，參考存活持續時間包含未接受投與(例如，接受經轉導且在不包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養之相應免疫細胞之投與)之相應個體的存活持續時間。在一些態樣中，與參考存活持續時間相比，存活持續時間增加至少約一週、至少約兩週、至少約三週、至少約一個月、至少約兩個月、至少約三個月、至少約四個月、至少約五個月、至少約六個月、至少約七個月、至少約八個月、至少約九個月、至少約10個月、至少約11個月或至少約一年。

在一些態樣中，本文所提供之治療腫瘤之方法進一步包括向該個體投與至少一種額外治療劑。在一些態樣中，該至少一種額外治療劑包含化學治療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法或其任何組合。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑包含抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗GITR抗體、抗TIM-3抗體或其任何組合。

本文亦提供一種組合物，其包含CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之群體，該等T細胞已經修飾以(a)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽，其中：(i)至少約20%之經修飾CD4+ T細胞對CCR7及CD45RA呈表面陽性；(ii)至少約20%之經修飾CD8+ T細胞對CCR7及CD45RA呈表面陽性；或(iii) (i)及(ii)兩者。

本文提供一種組合物，其包含CD4+ T細胞群體，該等T細胞已經修飾以(a)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽，其中至少約20%之經修飾CD4+ T細胞對CCR7及CD45RA呈表面陽性。本文提供一種組合物，其包含CD8+ T細胞群體，該等T細胞已經修飾以(a)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽，其中至少約20%之經修飾CD8+ T細胞對CCR7及CD45RA呈表面陽性。

本文亦提供一種組合物，其包含免疫細胞群體，該等免疫細胞已經修飾以(a)表現經工程改造之嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽，其中至少約4%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞。本揭示案之一些態樣係關於一種組合物，其包含免疫細胞群體，該等免疫細胞已經修飾以(a)表現經工程改造之嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽，其中約4%與約6%之間的細胞為前驅細胞耗竭T細胞。本文亦提供一種組合物，其包含免疫細胞群體，該等免疫細胞已經修飾以(a)表現經工程改造之嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之c-Jun多肽，其中至少約4%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞且至少約4%之細胞為幹細胞樣T細胞。

相關申請案之交叉引用

本PCT申請案主張2021年10月28日提出申請之美國臨時申請案第63/263,230號；2022年2月11日提出申請之美國臨時申請案第63/309,400號；及2022年5月6日提出申請之美國臨時申請案第63/339,347號的優先權權益；該等美國臨時申請案中每一者均以引用之方式整體併入本文中。經由EFS-WEB以電子方式提交之序列表之引用

本申請案中提交之以電子方式提交之序列表(名稱：4385_082PC03_Seqlisting_ST26.xml，大小： 123,699個位元組；及創建日期：2022年10月26日)的內容以引用之方式整體併入本文中。

細胞免疫療法之功效取決於多種因素，包括輸注至患者中之細胞產品的持久性、多能性及不對稱細胞分裂。用於細胞療法之細胞的培養及/或工程改造所用之培養基可深刻影響此等細胞之代謝、表觀遺傳及表型屬性，由此影響其治療潛力。

本揭示案係關於培養細胞之方法、藉由該等方法製備之細胞及/或用於該等細胞培養方法之組合物或套組。在一些態樣中，本揭示案提供產生用於過繼細胞療法(ACT)之免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))群體之方法，其中該等免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)具有低分化狀態且保留增殖能力。在一些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))具有低分化狀態且維持靶向且殺死腫瘤細胞之能力。在一些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))具有低分化狀態，保留增殖能力，且維持靶向且殺死腫瘤細胞之能力。在一些態樣中，如與根據習知方法(例如，在具有小於5 mM鉀離子之培養基中)培養的細胞相比，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))在ACT中具有增加之功效。在一些態樣中，如與根據習知方法(例如，在具有小於5 mM鉀離子之培養基中)培養的免疫細胞相比，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))在ACT中在投與至個體後具有增加之持久性。此類增加之持久性係指免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))在腫瘤微環境中浸潤且發揮作用之能力，抵抗或延遲耗竭發作之能力，以及幹細胞性的持久性以確保持續擴增及反應之耐久性。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))為幹細胞樣細胞。此類細胞能夠自更新、增殖及分化。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))為幹細胞樣細胞，其亦表現效應子樣標記物。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)為幹細胞樣細胞，其亦維持靶向且殺死腫瘤細胞之能力。

本揭示案之細胞培養方法能夠增加所培養細胞之多能性及/或亞全能性，或者當細胞正在用載體轉導時，能夠增加轉導效率。在一些態樣中，當培養細胞及/或將細胞用於活體內療法時，該等培養方法能夠減少及/或防止細胞耗竭。在一些態樣中，該等培養方法亦能夠增加活體內活力、活體內持久性、活體內效應子功能或其任何組合。在一些態樣中，本文所揭示之培養方法能夠富集寡株或多株腫瘤反應性幹細胞樣T細胞及/或CD8 ⁺TIL。在一些態樣中，本文所揭示之培養方法能夠保持源自癌症患者之TIL的純系多樣性。

在一些態樣中，本揭示案係關於培養細胞(例如，免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞))之方法，該等方法包括將細胞置於包含濃度為至少約5 mM(例如，高於5 mM)之鉀的代謝再編程培養基中，其中該培養基並非高張的，例如低張或等張。本揭示案之一些態樣係關於培養細胞(例如，免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞))之方法，該等方法包括將細胞置於包含濃度高於40 mM(例如約40-80 mM，例如約50 mM-80 mM)之鉀的培養基中。在一些態樣中，該等免疫細胞包含T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、天然殺手(NK)細胞、調節性T(T _reg)細胞或其任何組合。

本揭示案之一些態樣係關於一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))之產量、同時增加該等免疫細胞之幹細胞性的方法，其包括在包含濃度高於5 mM(例如，在40 mM與80 mM之間)的鉀離子及濃度在30 mM與100 mM之間的NaCl之代謝再編程培養基中培養該等細胞，其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。本揭示案之一些態樣係關於一種製備用於免疫療法之免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))群體的方法，其包括在包含濃度高於5 mM (例如，在40 mM與80 mM之間)的鉀離子及濃度在30 mM與100 mM之間的NaCl之培養基中培養該等細胞，其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。本揭示案之一些態樣係關於一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))之幹細胞性的方法，其包括在包含濃度高於5 mM(例如，在40 mM與80 mM之間)的鉀離子及濃度在30 mM與100 mM之間的NaCl之培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))，其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，該等免疫細胞為T細胞。

在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。在某些態樣中，該培養基進一步包含介白素(IL)-2、IL-21、IL-7、IL-15或其任何組合。在一些態樣中，該培養基包含IL-2、IL-7及IL-15。在一些態樣中，該培養基包含IL-2及IL-21。在一些態樣中，該培養基進一步包含鈉離子、鈣離子、葡萄糖或其任何組合。

如本文所述，在一些態樣中，與參考方法，其中：(i)該等免疫細胞係經修飾(例如，以過表現c-Jun)，但未在包含濃度高於5 mM之鉀的培養基中培養；(ii)該等免疫細胞未經修飾，但在包含濃度高於5 mM之鉀的培養基中培養；或(iii) (i)及(ii)兩者相比，在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中修飾免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)以(i)表現ROR1結合蛋白，及(ii)具有增加水準之c-Jun多肽(例如，用編碼c-Jun之外源核苷酸序列及/或能夠增加內源c-Jun多肽之表現的轉錄活化子)可進一步改良該等免疫細胞之一或多種特性。在本揭示案全文中提供此類方法之額外態樣。 I. 術語

為了可更容易地理解本揭示案，首先定義某些術語。如本申請案中所用，除非本文另外明確提供，否則以下術語中每一者均應具有下文所闡述之含義。額外定義在本申請案通篇中加以闡述。

在本揭示案通篇中，術語「一(a/an)」實體係指一或多個彼實體；例如，應理解「嵌合多肽」代表一或多種嵌合多肽。因而，術語「一(a/an)」、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。此外，使用「或」意謂清單中之組分的開放清單。例如，「其中X包含A或B」意謂X包含A，X包含B，X包含A及B，或X包含A或B及任何其他組分。

此外，「及/或」當在本文中使用時，應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中之每一者與另一者一起或不與另一者一起之情況。因此，如本文中諸如「A及/或B」之片語中所用，術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如諸如「A、B及/或C」之片語中所用，術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。

應理解，在本文中以語言「包含」描述態樣之任何情況下，亦提供以「由……組成」及/或「基本上由……組成」描述之其他類似態樣。

除非另有定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本揭示案相關領域之一般技術者通常所理解相同之含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology,第3版, 1999, Academic Press；及Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,修訂版, 2000, Oxford University Press向熟習此項技術者提供本揭示案中所用之許多術語之通用詞典。

單位、字首及符號係以其國際單位制( Système International de Unites，SI)接受之形式表示。除非另外明確規定，否則數值範圍包括界定該範圍之數字。

本文所用之縮寫在本揭示案通篇中加以定義。本揭示案之各個態樣更詳細地描述於以下子部分中。

術語「約」或「基本上包含」係指值或組成在如由熟習此項技術者所測定之特定值或組成之可接受之誤差範圍內，此將部分取決於量測或測定值或組成之方式，即量測系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含」可意謂根據此項技術中之實踐在1個或超過1個標準偏差內。或者，「約」或「基本上包含」可意謂高達10%之範圍(例如，除非另外規定或自上下文另外明顯可見(除非此類數字將超過可能值之100%)，否則在任一方向(大於或小於)上處於所陳述之參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小值以內之值的範圍)。例如，如本文所用，「約55 mM」包括49.5 mM至60.5 mM。另外，尤其對於生物系統或過程，該等術語可意指高達一個數量級或高達值之5倍。當本申請案及申請專利範圍中提供特定值或組成時，除非另有說明，否則「約」或「基本上包含」之含義應假設在彼特定值或組成之可接受誤差範圍內。

如本文所用，術語「大約」在應用於一或多個相關值時係指與所陳述之參考值相似的值。在一些態樣中，除非另外規定或自上下文另外明顯可見(除非此類數字將超過可能值之100%)，否則術語「大約」(如術語「約」)係指在任一方向(大於或小於)上處於所陳述之參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小值以內之值的範圍。

如本文所述，除非另有指示，否則任何濃度範圍、百分率範圍、比率範圍或整數範圍均應理解為包括在所陳述之範圍內的任何整數之值，及在適當時其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。

如本文所用，術語「對照培養基」、「習知培養基」或「參考培養基」係指與本文所揭示之代謝再編程培養基(MRM)相比的任何培養基。對照培養基可包含與代謝再編程培養基相同之組分，除了某些離子濃度，例如鉀離子。在一些態樣中，由對照培養基藉由調節如本文所述之一或多種離子濃度(例如，鉀離子濃度)來製備本文所述之代謝再編程培養基。在一些態樣中，對照培養基包含基礎培養基，例如CTS™ OPTMIZER™。在一些態樣中，對照培養基因此包含一或多種額外組分，包括但不限於胺基酸、葡萄糖、麩醯胺酸、T細胞刺激物、抗體、取代物等，該一或多種額外組分亦添加至代謝再編程培養基中，但對照培養基具有與代謝再編程培養基不同的某些離子濃度。除非另有指示，否則術語「培養基(media)」及「培養基(medium)」可互換使用。

如本文所用，術語「培養」係指離體及/或活體外細胞之受控生長。如本文所用，「培養」包括細胞(例如免疫細胞，例如一或多種本文所揭示之經工程改造之免疫細胞)在細胞擴增或細胞工程改造(例如，用用於表現CAR、TCR或TCRm之構築體進行轉導)期間的生長。在一些態樣中，經培養之細胞係獲自個體，例如人類個體/患者。在一些態樣中，經培養之細胞包含獲自人類個體/患者之免疫細胞。在一些態樣中，經培養之細胞包含一或多種本文所揭示之經工程改造之免疫細胞。在一些態樣中，經培養之細胞包含獲自人類個體/患者之T細胞或NK細胞。在一些態樣中，該等T細胞及/或NK細胞在培養之前經純化。在一些態樣中，該等T細胞及/或NK細胞為腫瘤浸潤T細胞及/或NK細胞。在一些態樣中，經培養之細胞包含一或多種本文所揭示之經工程改造之免疫細胞。

如本文所用，關於免疫細胞培養，術語「擴增(expand/expansion)」係指刺激或活化細胞且培養細胞之過程。在細胞經刺激或活化且經培養之後，擴增過程可導致所需細胞之比例或總數增加，例如在經培養之細胞群體中低分化免疫細胞之比例或總數增加。擴增不需要經培養之細胞群體中的所有細胞類型之數目均增加。更確切地，在一些態樣中，在擴增期間僅經培養之細胞群體中之細胞子集之數目增加，而其他細胞類型之數目可能未變化或可能減少。

如本文所用，術語「產量」係指根據培養方法或其一部分之細胞總數。在一些態樣中，術語「產量」係指特定細胞群體，例如T細胞群體中之幹細胞樣T細胞。產量可使用任何方法來確定，包括但不限於基於代表性樣品來估計產量。

如本文所用，術語「代謝再編程培養基(metabolic reprogramming media/metabolic reprogramming medium)」或「MRM」係指本揭示案之培養基，其中該培養基具有增加之鉀濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含濃度高於5 mM之鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含濃度高於40 mM之鉀離子。在一些態樣中，MRM包含濃度在約40 mM與約80 mM之間的鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、至少約75 mM、至少約80 mM、至少約85 mM、至少約90 mM、至少約95 mM或至少約100 mM之鉀離子濃度。在一些態樣中，MRM包含濃度為約40 mM之鉀離子。在一些態樣中，MRM包含濃度為約50 mM之鉀離子。在一些態樣中，MRM包含濃度為約60 mM之鉀離子。在一些態樣中，MRM包含濃度為約70 mM之鉀離子。在一些態樣中，MRM包含濃度為約80 mM之鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約40 mM至約80 mM NaCl、約40 mM至約90 mM KCl、約0.5 mM至約2.8 mM鈣及約10 mM至約24 mM葡萄糖。在一些態樣中，MRM包含約40 mM至約80 mM NaCl、約40 mM至約80 mM鉀離子、約0.5 mM至約2.8 mM鈣及約10 mM至約24 mM葡萄糖。在一些態樣中，MRM包含約55 mM至約90 mM NaCl及約40 mM至約80 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基進一步包含約250至約300 mOsmol之重量滲透濃度。

如本文所用，術語「高於」意謂大於但不等於。例如，「高於5 mM」意謂超過5 mM但不包括5 mM之任何量。

如本文所用，術語「張力」係指所計算的跨細胞膜之有效重量滲透濃度梯度，由鉀離子濃度及氯化鈉(NaCl)濃度之總和乘以2表示。張力可用溶液(例如培養基)之重量滲透濃度(mOsm/kg)或容積滲透濃度(mOsm/L)表述。重量滲透濃度及容積滲透濃度係每質量(重量滲透濃度)及每體積(容積滲透濃度)溶劑之溶質滲透濃度的量測值。如本文所用，等張培養基具有約280 mOsm/L(例如，([K+]+[NaCl])×2=280)之張力。

如本文所用，低張溶液具有小於280 mOsm/L (例如，([K+]+[NaCl])×2＜280)之張力。在一些態樣中，低張培養基具有至少約210 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，低張培養基具有至少約220 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，低張培養基具有至少約230 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，低張培養基具有至少約240 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，本文所述之低張培養基具有約250 mOsm/L之張力。

如本文所用，高張溶液具有大於300 mOsm/L (例如，([K+]+[NaCl])×2＞300)之張力。在一些態樣中，本文所述之高張培養基具有約320 mOsm/L之張力。在一些態樣中，藉由增加或降低鉀離子及NaCl之濃度來調節溶液(例如培養基)之張力。在一些態樣中，可藉由用一種溶質之減少抵消另一種溶質之增加來維持培養基之張力。例如，在不改變鈉離子濃度之情況下增加培養基中之鉀離子濃度可增加培養基之張力。然而，若增加鉀離子濃度且減少鈉離子濃度，則可維持原始培養基之張力。

如本文所用，術語「鉀」、「鉀離子」、「鉀陽離子」及「K+」可互換使用以指代元素鉀。元素鉀作為陽離子存在於溶液中。然而，一般熟習此項技術者將顯而易知，製備包含鉀離子之溶液之標準方式包括將含鉀鹽(例如KCl)稀釋至溶液中。因而，可將包含莫耳(M)濃度之鉀離子之溶液(例如培養基)描述為包含等莫耳(M)濃度之包含鉀之鹽。

如本文所用，術語「鈉離子」及「鈉陽離子」可互換使用以指代元素鈉。元素鈉作為單價陽離子存在於溶液中。然而，一般熟習此項技術者將顯而易知，製備包含鈉離子之溶液之標準方式包括將含鈉鹽(例如NaCl)稀釋至溶液中。因而，可將包含莫耳(M)濃度之鈉離子之溶液(例如培養基)描述為包含等莫耳(M)濃度之包含鈉之鹽。

如本文所用，術語「鈣離子」及「鈣陽離子」可互換使用以指代元素鈣。元素鈣作為二價陽離子存在於溶液中。然而，一般熟習此項技術者將顯而易知，製備包含鈣離子之溶液之標準方式包括將含鈣鹽(例如CaCl ₂)稀釋至溶液中。因而，可將包含莫耳(M)濃度之鈣離子的溶液(例如培養基)描述為包含等莫耳(M)濃度之包含鈣之鹽。

如本文所用，術語「免疫細胞」係指免疫系統之細胞。在一些態樣中，免疫細胞係選自T淋巴細胞(「T細胞」)、B淋巴細胞(「B細胞」)、天然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性球。如本文所用，細胞「群體」係指超過一個細胞(例如，複數個細胞)之集合。在一些態樣中，細胞群體包含超過一個免疫細胞，例如複數個免疫細胞。在一些態樣中，細胞群體係包含細胞之異質混合物，該混合物包含多種類型之細胞，例如免疫細胞及非免疫細胞之異質混合物。在一些態樣中，細胞群體包含複數個T細胞。

如本文所用，術語「參考免疫細胞」(或「參考細胞」)係指未經修飾及/或使用本文所提供之方法培養之細胞。例如，在一些態樣中，參考細胞包含未如本文所述經修飾(例如，用任何本文所提供之c-Jun核苷酸序列及/或轉錄活化子)之細胞(例如，相應免疫細胞)。在一些態樣中，參考細胞包含在本揭示案之培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)中培養的此類細胞(其未如本文所述經修飾)。在一些態樣中，參考細胞包含在未包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基(亦即，參考培養基)中培養的此類細胞(其未如本文所述經修飾)。在一些態樣中，參考細胞包含已如本文所述經修飾(例如，用任何本文所提供之c-Jun核苷酸序列及/或轉錄活化子)、但在參考培養基中培養的細胞。因此，除非另外指示，否則參考細胞可包含以下任一者：(1)未如本文所述經修飾之細胞(例如，相應免疫細胞)；(2)既未如本文所述經修飾、亦未在本揭示案之培養基中培養的細胞(例如，相應免疫細胞)；(3)未如本文所述經修飾、但在本發明之培養基中培養的細胞(例如，相應免疫細胞)；(4)已如本文所述經修飾、但在參考培養基中培養的細胞(例如，相應免疫細胞)；或(5) (1)至(4)之任何組合。至少基於本揭示案，熟習此項技術者應顯而易知在本文中使用時術語「參考細胞」之範圍。

如本文所用，術語「T細胞」及「T淋巴細胞」可互換且係指由胸腺產生或加工之任何淋巴細胞。T細胞之非限制性類別包括效應子T細胞及T輔助(Th)細胞(諸如CD4 ⁺或CD8 ⁺T細胞)。在一些態樣中，該T細胞為Th1細胞。在一些態樣中，該T細胞為Th2細胞。在一些態樣中，該T細胞為Tc17細胞。在一些態樣中，該T細胞為Th17細胞。在一些態樣中，該T細胞為T _reg細胞。在一些態樣中，該T細胞為腫瘤浸潤細胞(TIL)。

如本文所用，術語「記憶」T細胞係指先前已遇到其同源抗原且對該抗原作出反應(例如，活體內、活體外或離體)或已例如用抗CD3抗體刺激(例如，活體外或離體)之T細胞。免疫細胞在二次暴露後具有「記憶樣」表型，此類記憶T細胞可繁殖以產生比初始暴露期間更快且更強烈之免疫反應。在一些態樣中，記憶T細胞包含中央記憶T細胞(T _CM細胞)、效應子記憶T細胞(T _EM細胞)、組織駐留記憶T細胞(T _RM細胞)、幹細胞樣記憶T細胞(T _SCM細胞)或其任何組合。

如本文所用，術語「幹細胞樣記憶T細胞」、「T記憶幹細胞」或「T _SCM細胞」係指表現CD95、CD45RA、CCR7及CD62L且被賦予幹細胞樣自更新能力及重構記憶及效應子T細胞子集之整個範圍的多能能力之記憶T細胞。

如本文所用，術語「中央記憶T細胞」或「T _CM細胞」係指表現CD45RO、CCR7及CD62L之記憶T細胞。中央記憶T細胞通常發現於淋巴結內及外周循環中。

如本文所用，術語「效應子記憶T細胞」或「T _EM細胞」係指表現CD45RO但缺乏CCR7及CD62L表現之記憶T細胞。因為效應子記憶T細胞缺乏淋巴結歸巢受體(例如，CCR7及CD62L)，故此等細胞通常發現於外周循環中及非淋巴組織中。

如本文所用，術語「組織駐留記憶T細胞」或「T _RM細胞」係指不循環且保持駐留在諸如皮膚、肺及胃腸道之外周組織中的記憶T細胞。在一些態樣中，組織駐留記憶T細胞亦為效應子記憶T細胞。

如本文所用，術語「幼稚T細胞(naïve T cell)」或「T _N細胞」係指表現CD45RA、CCR7及CD62L但不表現CD95之T細胞。T _N細胞代表T細胞譜系中最高程度未分化之細胞。T _N細胞與抗原呈遞細胞(APC)之間的相互作用誘導T _N細胞分化為經活化T _EFF細胞以及免疫反應。

如本文所用，術語「幹細胞性」、「幹細胞樣(stem cell-like/stem-like)」或「低分化」係指表現與更幼稚表型一致之標記物的免疫細胞(例如T細胞、NK細胞或TIL)。例如，低分化T細胞可表現T _N或T _SCM細胞所特有之一或多種標記物。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」T細胞表現CD45RA、CCR7及CD62L。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」T細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L及TCF7。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」T細胞不表現CD45RO，或為CD45RO ^低。在一些態樣中，本文所揭示之方法促進具有低分化表型之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。不受任何特定機制之束縛，在一些態樣中，本文所揭示之方法阻斷、抑制或限制低分化免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)的分化，從而導致培養物中之幹細胞樣細胞之數目增加。例如，通常認為為了有效控制腫瘤，具有幹細胞樣記憶或中央記憶表型之低分化免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之過繼轉移為較佳的。參見Gattinoni, L.等人， J. Clin. Invest. 115:1616-1626 (2005)；Gattinoni, L.等人， Nat Med15(7):808-814 (2009)；Lynn, R.C.等人， Nature576(7786): 293-300 (2019)；Gattinoni, L.等人， Nat Rev12:671-684 (2012)；Klebanoff, C.等人， J. Immunother35(9):651-670 (2012)及Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-1297 (2011)。

幹細胞性之特徵在於自更新能力、多能性及增殖潛力之持久性。在一些態樣中，幹細胞性之特徵在於特定基因印記(gene signature)，例如多種基因之組合表現模式。在一些態樣中，可藉由轉錄體分析，例如使用本文所揭示之幹細胞性基因印記(參見例如實例6及7)來鑑別幹細胞樣細胞。在一些態樣中，基因印記包含選自以下之一或多種基因：ACTN1、DSC1、TSHZ2、MYB、LEF1、TIMD4、MAL、KRT73、SESN3、CDCA7L、LOC283174、TCF7、SLC16A10、LASS6、UBE2E2、IL7R、GCNT4、TAF4B、SULT1B1、SELP、KRT72、STXBP1、TCEA3、FCGBP、CXCR5、GPA33、NELL2、APBA2、SELL、VIPR1、FAM153B、PPFIBP2、FCER1G、GJB6、OCM2、GCET2、LRRN1、IL6ST、LRRC16A、IGSF9B、EFHA2、LOC129293、APP、PKIA、ZC3H12D、CHMP7、KIAA0748、SLC22A17、FLJ13197、NRCAM、C5orf13、GIPC3、WNT7A、FAM117B、BEND5、LGMN、FAM63A、FAM153B、ARHGEF11、RBM11、RIC3、LDLRAP1、PELI1、PTK2、KCTD12、LMO7、CEP68、SDK2、MCOLN3、ZNF238、EDAR、FAM153C、FAAH2、BCL9、C17orf48、MAP1D、ZSWIM1、SORBS3、IL4R、SERPINF1、C16orf45、SPTBN1、KCNQ1、LDHB、BZW2、NBEA、GAL3ST4、CRTC3、MAP3K1、HLA-DOA、RAB43、SGTB、CNN3、CWH43、KLHL3、PIM2、RGMB、C16orf74、AEBP1、SNORD115-11、SNORD115-11、GRAP及其任何組合(參見例如Gattinoni等人， Nature Medicine 17(10):1290-97(2011))。在一些態樣中，基因印記包含選自以下之一或多種基因：NOG、TIMD4、MYB、UBE2E2、FCER1G、HAVCR1、FCGBP、PPFIBP2、TPST1、ACTN1、IGF1R、KRT72、SLC16A10、GJB6、LRRN1、PRAGMIN、GIPC3、FLNB、ARRB1、SLC7A8、NUCB2、LRRC7、MYO15B、MAL、AEBP1、SDK2、BZW2、GAL3ST4、PITPNM2、ZNF496、FAM117B、C16orf74、TDRD6、TSPAN32、C18orf22、C3orf44、LOC129293、ZC3H12D、MLXIP、C7orf10、STXBP1、KCNQ1、FLJ13197、LDLRAP1、RAB43、RIN3、SLC22A17、AGBL3、TCEA3、NCRNA00185、FAM153B、FAM153C、VIPR1、MMP19、HBS1L、EEF2K、SNORA5C、UBASH3A、FLJ43390、RP6-213H19.1、INPP5A、PIM2、TNFRSF10D、SNRK、LOC100128288、PIGV、LOC100129858、SPTBN1、PROS1、MMP28、HES1、CACHD1、NSUN5C、LEF1、TTTY14、SNORA54、HSF2、C16orf67、NSUN5B、KIAA1257、NRG2、CAD、TARBP1、STRADB、MT1F、TMEM41B、PDHX、KDM6B、LOC100288322、UXS1、LGMN、NANOS2、PYGB、RASGRP2、C14orf80、XPO6、SLC24A6、FAM113A、MRM1、FBXW8、NDUFS2、KCTD12及其任何組合(參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-1297(2011))。在一些態樣中，基因印記包含選自以下之一或多種基因：SELL、CCR7、S1PR1、KLF3、TCF7、GPR183、SC5D、FAAH2、LTB、SESN3、MAL、TSHZ2、LEF1、AP3M2、SLC2A3、ICAM2、PLAC8、SCML1、IL7R、ABLIM1、RASGRP2、TRABD2A、SATB1、ALG13、ARID5A、BACH2、PABPC1、GPCPD1、NELL2、TAF4B、FCMR、ARRDC2、C1orf162、FAM177A1、ANKRD12、TXK、SORL1、AQP3、ADTRP、FXYD7、CD28、P2RY8、CRYBG1、TNFSF8、BEX2、PGAP1、PTGER4、MAML2、BEX3、PCSK1N、INPP4B、AC119396.1、CXCR5、LINC00402、CCR4、IL6R、ZBTB10、ITGA6、ARMH1、RILPL2、FOXP1、TESPA1、YPEL5、LPAR6、CMSS1、RIPOR2、ZNF331、EMP3、GIMAP7、WDR74、RIC3、CYSLTR1、ITGB1、CD5、SAMHD1、SERINC5及其任何組合(參見例如Caushi等人， Nature596: 126-132 (2021))。

如本文所用，術語「效應子樣」或「效應細胞樣」係指腫瘤細胞殺死能力及細胞介素多功能性，例如細胞產生發炎性細胞介素及/或細胞毒性分子之能力。在一些態樣中，效應子樣細胞之特徵在於該細胞所表現之特定標記物。在一些態樣中，彼等效應子樣標記物包含pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+中之一或多者。在一些態樣中，效應子樣標記物包含選自由以下組成之群的STAT標靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及其任何組合。在一些態樣中，藉由轉錄體分析來表徵效應子樣細胞。在一些態樣中，效應子樣標記物包含Kaech等人， Cell 111: 837-51(2002)；Tripathi等人， J. Immunology 185:2116-24(2010)；及/或Johnnidis等人， Science Immunology 6:eabe3702 (2021年1月15日)中所揭示之標記物，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。

在一些態樣中，使用Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10):1290-97 (2011)中所述之效應子相關基因集合來表徵效應子樣細胞。在一些態樣中，效應子樣細胞之基因印記包含選自以下之一或多種基因：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMI、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3,、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A,、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、KLRB1及其任何組合(參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10):1290-97 (2011))。

如本文中進一步描述(參見例如實例7)，在一些態樣中，可使用轉錄體分析藉由比較與T細胞活化(本文中亦稱為「TACT基因」)、T細胞前驅細胞耗竭(本文中亦稱為「TPE基因」)、T細胞終末耗竭(本文中亦稱為「TTE基因」)相關之基因的不同集合之上調及/或下調來評估細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之特徵。

在一些態樣中，使用Oliveira等人， Nature596: 119-125 (2021)中所述之TTE相關基因集合來表徵終末耗竭T細胞。在一些態樣中，TTE細胞之基因印記包含一或多種或所有選自以下之基因：KRT86、RDH10、ACP5、CXCR6、HMOX1、LAYN、CLIC3、HAVCR2、AC243829.4、PRF1、SLC2A8、CHST12、GALNT2、ENTPD1、LAG3、GZMB、PDCD1、CARD16、CTLA4、SLA2、CD27、RALA、VCAM1、SYNGR2、NKG7、LSP1、CCL5、RARRES3、CD7、CTSW、MTSS1、PTMS、BATF、KIR2DL4、AKAP5、CD38、RAB27A、GZMH、IGFLR1、ATP8B4、CD63、HOPX、TNFRSF18、ADGRG1、PLPP1、CSF1、TNFSF10、SNAP47、LINC01871、MYO1E、ZBED2、AHI1、ABI3、FASLG、TYMP、ZBTB38、CTSB、PLSCR1、AFAP1L2、ITGAE、TNS3、DUSP16、CASP1、CARS、DUSP5、IFIT1、SLC1A4、GOLIM4、RSAD2、DNPH1、NBL1、ACOT9、ABHD6、OAS1、SLC27A2、ZBP1、CD200R1、OAS3、CMPK2、TNFSF4、POLR1E、CADM1、HELZ2、SYTL2、AGPAT2、UBE2F、GIMAP6、ZBTB32、RIN3、PLEKHF1、CHPF、PACSIN2、ABCB1、SPATS2L、USP18、TMEM9、KLRC1、MPST。在一些態樣中，使用Oliveira等人， Nature596: 119-125(2021)中所述之TPE相關基因集合來表徵前驅細胞耗竭T細胞(TPE)。在一些態樣中，TPE細胞之基因印記包含一或多種或所有選自以下之基因：FXYD6、CAV1、GNG4、XCL1、CRTAM、CXCL13、GEM、XCL2、FXYD2、HLA-DRA、LANCL2、RASSF4、BAG3、HSPA1B、HLA-DQA1、HSPB1、FABP5、MS4A6A、SERPINH1、HLA-DPA1、HLA-DRB1、HSPA1A、RGS2、DRAIC、CD74、HSPD1、HSPA6、HSPE1、CD82、TOX、CD200、HLA-DPB1、NR4A2、VCAM1、BEX3、AIF1、DNAJA1、HSPH1、DNAJB1、HIPK2、LHFPL6、HLA-DMA、GK、TSHZ2、LPL、C16orf45、ZFAND2A、CD80、ETV1、NMB、DEDD2、CMC1、PON2、SEMA4A、ENC1、GRAMD1A、MYL6B、BCAT1、ARMH1、TIAM1、PIKFYVE、MRPL18、INPP5F、LMCD1、SESN3、CCDC6、KIAA1324、CHN1、ANKRD10、CD70、PRRG4、TNFSF4、CORO1B、DNAJB4、MAGEH1、ICAM1、GGT1、NINJ2、BLVRA、FAAH2、TOX2、SLK、CCDC141、ATF3、INPP1、FAM3C、GADD45G、APP、MAL、SIT1、DRAM1、CLECL1、MDFIC、PMCH、HLA-DMB、PHF6、AFAP1L2、BTN2A2、CCL4L2。在一些態樣中，使用Oliveira等人， Nature596: 119-125 (2021)中所述之TACT相關基因集合來表徵經活化T細胞(TACT)。在一些態樣中，經活化T細胞之基因印記包含一或多種或所有選自以下之基因：EGR1、HSPA6、FOS、HSPA1B、GADD45B、NR4A1、FOSB、ATF3、DNAJB1、DUSP1、JUNB、CD69、NR4A2、NFKBIA、PPP1R15A、KLF6、DNAJA1、JUN、SRSF7、SLC2A3、ZFP36L1、IER2、HSPA1A、EIF4A2、ID1、IFRD1、CCNL1、RSRP1、SERTAD1、DEDD2、KLF10、AL118516.1、KLF2、ZFAND2A、CLK1、RSRC2、IER3、BTG2、MYLIP、MAFF、CSRNP1、ID2、ZC3H12A、BAG3、SNHG12、TNF、DDIT4、SGK1、SNHG15、DNAJB4、NR4A3、NFKBID、SCML1、RASD1、ATF4、AREG、RASGEF1B、AC020916.1、DDIT3、SNHG8、CITED2、TXNIP、TOB1、PIM2、SOCS3、GADD45G、RGS16、TIPARP、NFKBIZ、CCL4、CD83、PPP1R10、CCL4L2、SESN2、CHMP1B、LEF1、CSKMT、HEXIM1、HSPA2、MRPL18、RBKS、CD55、ARRDC2、SC5D、FAM53C、ATP2B1-AS1、IFNG、MYC、TSC22D2、SERPINH1、LRIF1、ARRDC3、ILF3-DT、INTS6、ZNF10、PRMT9、ATM、SELL、AC243960.1。

如本文所用，術語「基礎」培養基係指補充有本文所揭示之一或多種額外元素，例如鉀、鈉、鈣、葡萄糖、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其任何組合之任何起始培養基。基礎培養基可為用於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之任何培養基。在一些態樣中，基礎培養基包含平衡鹽溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、克氏培養基(Click’s medium)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(Basal Medium Eagle，BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最低必需培養基(Glasgow Minimal Essential Medium，GMEM)、α最低必需培養基(α MEM)、Iscove改良杜氏培養基(IMDM)、M199、OPTMIZER™ Pro、OPTMIZER™ CTS™ T細胞擴增基礎培養基(ThermoFisher)、OPTMIZER™、OPTMIZER™ Complete、IMMUNOCULT™ XF (STEMCELL™ Technologies)、AIM V™、TEXMACS™培養基、PRIME-XV ^®T細胞CDM、X-VIVO™ 15(Lonza)、TRANSACT™ TIL擴增培養基或其任何組合。在一些態樣中，基礎培養基不含血清。在一些態樣中，基礎培養基包含PRIME-XV ^®T細胞CDM。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER™。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER™ Pro。在一些態樣中，基礎培養基進一步包含免疫細胞血清替代物(ICSR)。例如，在一些態樣中，基礎培養基包含補充有ICSR之OPTMIZER™ Complete、補充有ICSR之AIM V™、補充有ICSR之IMMUNOCULT™ XF、補充有ICSR之RPMI、補充有ICSR之TEXMACS™或其任何組合。在一些態樣中，合適之基礎培養基包括克氏培養基、OPTMIZER™ (CTS™)培養基、STEMLINE ^®T細胞擴增培養基(Sigma-Aldrich)、AIM V™培養基(CTS™)、TEXMACS™培養基(Miltenyi Biotech)、IMMUNOCULT™培養基(Stem Cell Technologies)、PRIME-XV® T細胞擴增XSFM(Irvine Scientific)、Iscoves培養基及/或RPMI-1640培養基。在一些態樣中，基礎培養基包含不含NaCl之CTS™ OPTMIZER™。在一些態樣中，除了NaCl以外，基礎培養基亦包含一或多種鈉鹽。

如本文所用，術語「細胞介素」係指由細胞釋放之小的分泌蛋白，其對細胞之間的相互作用及通訊具有特定影響。細胞介素之非限制性實例包括介白素(例如，介白素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-5、IL-6、IL-11、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IL-21及IL-23)、干擾素(IFN；例如，IFN-α、IFN-β及IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)家族成員及轉化生長因子(TGF)家族成員。本揭示案之一些態樣係關於在包含細胞介素之培養基中培養及/或擴增免疫細胞(例如T細胞及/或NK細胞或一或多種本文所揭示之經工程改造之免疫細胞)的方法。在一些態樣中，細胞介素為介白素。在一些態樣中，細胞介素包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其任何組合。IL-2(UniProtKB-P60568)係由T細胞因應抗原或有絲分裂刺激而產生。已知IL-2刺激T細胞增殖及對於免疫反應之調節至關重要之其他活性。IL-7(UniProtKB- P13232)係能夠刺激淋巴樣前驅細胞增殖之造血生長因子。咸信IL-7在B細胞成熟之某些階段期間在增殖中發揮作用。與IL-2一樣，IL-15(UniProtKB-P40933)係刺激T淋巴細胞增殖之細胞介素。IL-21(UniProtKB-Q9HBE4)係具有免疫調節活性之細胞介素。認為IL-21促進先天性與適應性免疫性之間之轉換且誘導B細胞中產生IgG1及IgG3。IL-21亦可與IL-15協同在天然殺手(NK)細胞之增殖及成熟中發揮作用，且IL-21可因應活化刺激而調節成熟B細胞及T細胞之增殖。與IL-15及IL-18協同，IL-15亦刺激T細胞及NK細胞中之干擾素γ產生，且IL-21亦可在T細胞介導之免疫反應期間抑制樹突狀細胞活化及成熟。

如本文所用，「投與」係指使用多種方法及遞送系統中的任一者將治療劑或包含治療劑之組合物物理引入至個體。本文所述之治療劑(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun多肽且如本文所述而培養之免疫細胞或免疫細胞群體)的不同投與途徑包括靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、脊髓或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。

如本文所用，片語「非經腸投與(parenteral administration)」意謂除腸及表面投與以外之投與模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病變內、腫瘤內、囊內、眶內、心內、皮內、經氣管、氣管內、肺、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、室內、玻璃體內、硬膜外及胸骨內注射及輸注，以及活體內電穿孔。

或者，本文所述之治療劑(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun多肽且如本文所述而培養之免疫細胞)可經由非-非經腸途徑投與，諸如表面、表皮或黏膜投與途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或經表面。亦可例如一次、複數次及/或經一或多個延長時期執行投與。

如本文所用，「細胞工程改造」或「細胞修飾」(包括其派生詞)係指細胞(例如，本文所揭示之免疫細胞)的靶向修飾。在一些態樣中，細胞工程改造包括病毒基因工程改造、非病毒基因工程改造、引入受體以允許腫瘤特異性靶向(例如，ROR1結合蛋白)、引入一或多種改良T細胞功能之內源基因、引入一或多種改良免疫細胞(例如T細胞)功能之合成基因(例如編碼c-Jun多肽之聚核苷酸，使得與未經修飾之相應細胞相比，該免疫細胞展現增加的c-Jun表現)或其任何組合。如本揭示案中別處進一步描述，在一些態樣中，細胞可經轉錄活化子(例如，基於CRISPR/Cas系統)工程改造或修飾，其中該轉錄活化子能夠誘導及/或增加相關蛋白質(例如，c-Jun)之內源性表現。

如本文所用，術語「抗原」係指任何天然或合成免疫原性物質，諸如蛋白質、肽或半抗原。如本文所用，術語「同源抗原」係指由免疫細胞(例如，T細胞)識別且由此誘導免疫細胞活化(例如觸發細胞內信號，該等信號誘導效應子功能，諸如細胞介素產生，及/或用於細胞增殖)之抗原。在一些態樣中，該抗原包含腫瘤抗原。在一些態樣中，該抗原包含新抗原。

「癌症」係指一大組之各種疾病，其特徵在於體內異常細胞之不受控生長。失調的細胞分裂及生長可形成惡性腫瘤，其侵入鄰近組織且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分。如本文所用，「癌症」包含原發性、轉移性及復發性癌症。除非另有指示，否則術語「癌症」及「腫瘤」可互換使用。

術語「血液惡性腫瘤」或「血液癌症」係指哺乳動物造血及淋巴組織之癌症以及腫瘤。血液惡性腫瘤之非限制性實例包括影響血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統之組織之彼等，包括急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CIVIL)、急性單核細胞白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤。血液惡性腫瘤亦稱作「液體腫瘤」。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤，以及其他血液惡性腫瘤。

如本文所用，「實體腫瘤」係指異常組織塊。實體腫瘤可為良性或惡性的。實體腫瘤之非限制性實例包括肉瘤、癌瘤及淋巴瘤，諸如肺、乳房、前列腺、結腸、直腸及膀胱之癌症。實體腫瘤之組織結構包括相互依賴之組織隔室，包括實質(癌細胞)及其中分散有癌細胞且可提供支持性微環境之支持性基質細胞。

在一些態樣中，癌症係選自腎上腺皮質癌、晚期癌症、肛門癌、再生障礙性貧血、膽管癌、膀胱癌、骨癌、骨轉移、腦腫瘤、腦癌、乳癌、兒童癌症、原發灶不明之癌症、Castleman病、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤文腫瘤家族(Ewing family of tumors)、眼癌、膽囊癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤、妊娠滋養細胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎細胞癌、喉及下咽癌、急性淋巴細胞白血病、急性骨髓白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓白血病、慢性骨髓單核細胞白血病、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺類癌腫瘤、皮膚淋巴瘤、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、鼻腔及鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、垂體腫瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、成人軟組織肉瘤、基底細胞及鱗狀細胞皮膚癌、黑色素瘤、小腸癌、胃癌、睪丸癌、喉癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮肉瘤、陰道癌、陰門癌、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)及由癌症治療引起之繼發性癌症。在一些態樣中，癌症係選自軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、黏液肉瘤、黏液樣/圓細胞脂肪肉瘤、骨肉瘤、艾伯內西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤(adipose sarcoma/ liposarcoma)、腺泡狀軟組織肉瘤、成釉細胞肉瘤、葡萄狀肉瘤、綠髓肉瘤、絨毛膜癌、胚胎肉瘤、威爾姆氏腫瘤肉瘤、子宮內膜肉瘤、間質肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、纖維母細胞肉瘤、巨細胞肉瘤、顆粒球性肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特發性多發性色素出血性肉瘤、B細胞免疫母細胞肉瘤、淋巴瘤、T細胞免疫母細胞肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤、庫普弗細胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間葉瘤肉瘤、骨旁肉瘤、網狀細胞肉瘤、勞斯肉瘤(Rous sarcoma)、漿液性肉瘤、滑膜肉瘤或毛細管擴張性肉瘤。在一些態樣中，癌症係選自肢端著色斑性黑色素瘤、無黑色素性黑色素瘤、良性青少年性黑色素瘤、克勞德曼氏黑色素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣性黑色素瘤、惡性黑色素瘤、轉移性黑色素瘤、結節性黑色素瘤、甲下黑色素瘤或淺表擴散性黑色素瘤。在一些態樣中，癌症係選自腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡狀癌(acinous carcinoma)、腺囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺瘤性癌、腎上腺皮質癌、濾泡癌、濾泡細胞癌、基底細胞癌(basal cell carcinoma/carcinoma basocellulare)、基底細胞樣癌、基底鱗狀細胞癌、細支氣管肺泡癌、細支氣管癌、支氣管癌、髓樣癌、膽管細胞癌、絨毛膜癌、膠樣癌、粉刺癌、子宮體癌、篩狀癌、鎧甲狀癌、癌瘡、圓柱狀癌(cylindrical carcinoma)、圓柱狀細胞癌(cylindrical cell carcinoma)、導管癌、硬癌、胚胎癌、腦樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮癌、外生性癌瘤、潰瘍性癌、纖維癌、膠樣癌(gelatiniform carcinoma)、膠質癌(gelatinous carcinoma)、巨細胞癌(giant cell carcinoma/ carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒層細胞癌、髮母質癌(hair-matrix carcinoma)、血樣癌、肝細胞癌、許特耳細胞癌(Hurthle cell carcinoma)、玻質狀癌、腎上腺樣癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮內癌、上皮內癌、克魯肯伯格氏癌(Krompecher's carcinoma)、庫爾契茨基細胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大細胞癌、扁豆狀癌(lenticular carcinoma/carcinoma lenticulare)、脂瘤樣癌、淋巴上皮癌、髓樣癌(carcinoma medullare/medullary carcinoma)、黑色素癌、軟癌(carcinoma molle)、黏液癌(mucinous carcinoma)、黏液狀癌(carcinoma muciparum)、黏液細胞癌、黏液表皮樣癌、黏液性癌(carcinoma mucosum/mucous carcinoma)、黏液瘤樣癌、鼻咽癌、燕麥細胞癌、骨化性癌、骨樣癌、乳頭狀癌、門脈周癌、未侵襲癌、棘細胞癌、糜爛性癌、腎臟腎細胞癌、貯備細胞癌(reserve cell carcinoma)、肉瘤樣癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印戒細胞癌、單純癌、小細胞癌、馬鈴薯狀癌、球狀細胞癌、梭形細胞癌、海綿樣癌、鱗癌、鱗狀細胞癌、繩捆癌(string carcinoma)、血管擴張性癌(carcinoma telangiectaticum/carcinoma telangiectodes)、移行細胞癌、小管癌(carcinoma tuberosum)、結節性癌、疣贅性癌(verrucous carcinoma)或絨毛狀癌。在一些態樣中，癌症係選自白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、小細胞肺腫瘤、原發性腦腫瘤、胃癌、結腸癌、惡性胰臟胰島素瘤、惡性類癌、膀胱癌、癌前皮膚病變、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、神經母細胞瘤、神經內分泌癌、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性血鈣過多、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、前列腺癌、米勒管癌(Müllerian cancer)、卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌或子宮乳頭狀漿液性癌。在一些態樣中，癌症係選自轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌、骨髓瘤、食道癌、滑膜肉瘤、胃癌、乳癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌或其任何組合。

如本文所用，術語「免疫反應」係指脊椎動物內針對外源劑之生物反應，該反應保護生物體抵抗此等劑及由其引起之疾病。免疫反應係由免疫系統細胞(例如，T淋巴細胞、B淋巴細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性球)及由此等細胞中之任一者或肝產生的可溶性巨分子(包括抗體、細胞介素及補體)之作用介導，該作用導致選擇性靶向、結合至、損害、破壞及/或自脊椎動物體內消除侵入性病原體、受病原體感染之細胞或組織、癌細胞或其他異常細胞，或在自體免疫或病理性發炎之情況下的正常人類細胞或組織。免疫反應包括例如活化或抑制T細胞，例如效應子T細胞或Th細胞，諸如CD4 ⁺或CD8 ⁺T細胞，或抑制Treg細胞。如本文所用，術語「T細胞」及「T淋巴細胞」可互換且係指由胸腺產生或加工之任何淋巴細胞。在一些態樣中，T細胞為CD4+ T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD8+ T細胞。在一些態樣中，T細胞為NKT細胞。

如本文所用，術語「抗腫瘤免疫反應」係指針對腫瘤抗原之免疫反應。

「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括但不限於脊椎動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬，及囓齒動物，諸如小鼠、大鼠及豚鼠。在一些態樣中，個體為人類。術語「個體(subject)」、「患者」、「個體(individual)」及「宿主」在本文中可互換使用。如本文所用，片語「有需要之個體」包括將受益於例如如本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun多肽且使用本文所提供之方法進行培養)的投與以控制腫瘤生長之個體，諸如哺乳動物個體。

術語「治療有效量」或「治療有效劑量」係指提供所需生物、治療及/或預防結果之劑(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun多肽且如本文所述而培養的免疫細胞)之量。該結果可為疾病之一或多種徵象、症狀或病因的減少、改善、緩和、減弱、延遲及/或減輕，或者生物系統之任何其他所需改變。關於實體腫瘤，有效量包含足以引起腫瘤皺縮及/或足以減小腫瘤生長速率(例如抑制腫瘤生長)或足以防止或延遲其他不希望細胞增殖之量。在一些態樣中，有效量係足以延遲腫瘤發展之量。在一些態樣中，有效量係足以防止或延遲腫瘤復發之量。有效量可在一或多次投與中經投與。

有效量之組合物(例如如本文所述之免疫細胞，例如經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun多肽且如本文所述而培養)可例如(i)減少癌細胞之數目；(ii)減少腫瘤大小；(iii)在某種程度上抑制、延遲、減慢且可停止癌細胞浸潤至周圍器官中；(iv)抑制(亦即，在某種程度上減慢且可停止腫瘤轉移)；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤之發生及/或復發；及/或(vii)在某種程度上減輕與癌症相關之一或多種症狀。

在一些態樣中，「治療有效量」係本文所揭示之組合物(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun多肽且如本文所述而培養之免疫細胞)的量，其在臨床上證明顯著減少癌症或減慢癌症之進展(消退)，諸如晚期實體腫瘤。本揭示案之治療劑(例如，經修飾且如本文所述而培養之免疫細胞)促進疾病消退的能力可使用熟練從業人員已知之多種方法來評估，諸如在人類個體中在臨床試驗期間，在預測人類功效之動物模型系統中，或藉由在活體外分析中分析該劑的活性。

關於治療之術語「有效」及「有效性」包括藥理學有效性及生理安全性。藥理學有效性係指本文所揭示之組合物(例如，經修飾且如本文所述而培養之免疫細胞)促進患者之癌症消退的能力。生理安全性係指由於投與本文所揭示之組合物(例如，經修飾且如本文所述而培養之免疫細胞)而在細胞、器官及/或生物體層面上引起的毒性水準或其他不利的生理效應(副作用)。

如本文所用，術語「嵌合抗原受體」及「CAR」係指一組多肽，典型地呈最簡單形式之兩種多肽，當在免疫效應子細胞中時，該等多肽向細胞提供對標靶細胞、典型地癌細胞之特異性，且產生細胞內信號。在一些態樣中，CAR至少包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞質信號傳導結構域(在本文中亦稱為「細胞內信號傳導結構域」)，包含源自如下文所定義之刺激分子及/或共刺激分子的功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，該組多肽係在同一多肽鏈中，例如構成嵌合融合蛋白。在一些態樣中，該組多肽彼此不連續，例如在不同多肽鏈中。在一些態樣中，該組多肽包括二聚化開關，當存在二聚化分子時，該二聚化開關可使多肽彼此偶合，例如可將抗原結合結構域偶合至細胞內信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR之刺激分子係與T細胞受體複合物相關之ζ鏈(例如CD3 ζ)。在一些態樣中，細胞質信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域(例如，CD3-ζ之初級信號傳導結構域)。在一些態樣中，細胞質信號傳導結構域進一步包含一或多個源自至少一種如下文所定義之共刺激分子的功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，共刺激分子係選自本文所述之共刺激分子，例如4-1BB(亦即，CD137)、CD27及/或CD28。

在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含源自刺激分子之功能性信號傳導結構域，其中抗原結合結構域及跨膜結構域藉由CAR間隔子連接。在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含經由CAR間隔子連接至跨膜結構域之抗原結合結構域以及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含一個源自共刺激分子之功能性信號傳導結構域及一個源自刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含經由CAR間隔子連接至跨膜結構域之抗原結合結構域以及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含兩個源自一或多種共刺激分子之功能性信號傳導結構域及一個源自刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含經由CAR間隔子連接至跨膜結構域之抗原結合結構域以及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含至少兩個源自一或多種共刺激分子之功能性信號傳導結構域及一個源自刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR在CAR之胺基末端(N末端)包含視情況選用之前導序列。在一些態樣中，CAR進一步包含在抗原結合結構域之N末端的前導序列，其中在CAR之細胞加工及定位至細胞膜期間，該前導序列視情況自抗原結合結構域(例如scFv)裂解。

嵌合抗原受體之抗原特異性細胞外結構域識別且特異性結合抗原，典型地惡性腫瘤之表面表現抗原。抗原特異性細胞外結構域特異性結合抗原，例如當其以介於約0.1 pM至約10 µM之間(例如約0.1 pM至約1 µM或約0.1 pM至約100 nM)之親和力常數或相互作用親和力(K _D)結合抗原時。用於確定相互作用親和力之方法係此項技術中已知的。適用於本揭示案之CAR之抗原特異性細胞外結構域可為任何抗原結合多肽，其中多種係此項技術中已知的。在一些態樣中，抗原結合結構域為單鏈Fv(scFv)。其他基於抗體之識別結構域，諸如cAb VHH(駱駝科動物抗體可變結構域)及其人類化形式、IgNAR VH(鯊魚抗體可變結構域)及其人類化形式、sdAb VH(單一結構域抗體可變結構域)及「駱駝化」抗體可變結構域亦適用於本揭示案之CAR。在一些態樣中，基於T細胞受體(TCR)之識別結構域，諸如單鏈TCR(scTv，亦即含有VαVβ之單鏈雙結構域TCR)亦適用於本揭示案之ROR1結合蛋白。

如本文所用，術語「T細胞受體」或「TCR」係指由2條不同的跨膜多肽鏈構成之異二聚體：α鏈及β鏈，各鏈由恆定區及可變區組成，該恆定區將鏈錨定於T細胞表面膜內部，該可變區識別且結合於由MHC呈遞之抗原。TCR複合物與6個多肽締合，形成2種異二聚體CD3γε及CD3δε，及1種均二聚體CD3 ζ，其合起來形成CD3複合物。T細胞受體工程改造之T細胞療法利用保留此等複合物之T細胞修飾來特異性靶向由特定腫瘤細胞表現之抗原。如本文所用，術語「TCR」包括天然存在之TCR及經工程改造之TCR。

如本文所用，「經工程改造之TCR」或「經工程改造之T細胞受體」係指T細胞受體(TCR)經工程改造，以所需親和力特異性結合於主要組織相容性複合物(MHC)/肽標靶抗原(例如，MHC/ROR1肽)，經選擇、選殖及/或隨後引入至免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)群體中。

「TCR模擬物」或「TCRm」係指包含抗原結合結構域(例如，源自抗體)之經工程改造之嵌合TCR類型，其識別包含肽及MHC-I分子兩者的抗原決定基，類似於T細胞上之TCR對此類複合物之識別。TCR模擬物進一步包含能夠募集至少一種TCR相關信號傳導分子之T細胞受體模塊(TCRM)。例示性TCR模擬物描述於例如美國專利第10,822,413號中，該專利以引用之方式整體併入本文中。

術語「核酸」、「核酸分子」、「核苷酸」、「核苷酸序列」及「聚核苷酸」可互換使用，且係指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；「RNA分子」)或去氧核糖核苷(去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷或去氧胞苷；「DNA分子」)之磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯類似物，諸如硫代磷酸酯及硫酯，其呈單股形式或雙股螺旋。單股核酸序列係指單股DNA(ssDNA)或單股RNA (ssRNA)。雙股DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA螺旋係可能的。術語核酸分子且詳言之DNA或RNA分子僅指該分子之一級及二級結構，且不將其限制為任何特定三級形式。因此，此術語包括尤其可見於線性或環狀DNA分子(例如限制性片段)、質體、超螺旋DNA及染色體中之雙股DNA。在討論特定雙股DNA分子之結構時，本文中可根據通常慣例描述序列，即僅沿非轉錄DNA股(亦即，具有與mRNA同源之序列的股)之5’至3’方向給出序列。「重組DNA分子」係已經歷分子生物學操作之DNA分子。DNA包括但不限於cDNA、基因體DNA、質體DNA、合成DNA及半合成DNA。本揭示案之「核酸組合物」包含一或多種如本文所述之核酸。如本文所述，在一些態樣中，本揭示案之聚核苷酸可包含編碼單一蛋白質之單一核苷酸序列(例如，經密碼子最佳化之c-Jun核苷酸序列) (「單順反子」)。在一些態樣中，本揭示案之聚核苷酸係多順反子的(亦即，包含兩個或更多個順反子)。在一些態樣中，多順反子聚核苷酸之每個順反子均可編碼本文所揭示之蛋白質(例如，c-Jun蛋白、ROR1結合蛋白或EGFRt)。在一些態樣中，每個順反子可彼此獨立地經轉譯。

除非另有說明，否則如本文所用，術語「多肽」涵蓋肽及蛋白質。多肽包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、前述各物之同系物、異種同源物、同種同源物、片段及其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單一多肽或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。其亦可包含單鏈或多鏈多肽。最常見地，在多鏈多肽中發現二硫鍵聯。術語多肽亦可應用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸的人工化學類似物。在一些態樣中，「肽」可為小於或等於50個胺基酸長，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。

如本文所用，術語多肽(例如c-Jun多肽)之「片段」係指多肽之胺基酸序列，其比天然存在之序列短、缺失N末端及/或C末端或與天然存在之多肽相比，缺失多肽之任何部分。因此，片段未必需要僅缺失N末端及/或C末端胺基酸。其中相對於天然存在之序列已缺失內部胺基酸之多肽亦被視為片段。

如本文所用，術語「功能片段」係指保留多肽功能之多肽片段。因此，在一些態樣中，Ig鉸鏈之功能片段保留將抗原結合結構域(例如，scFv)定位於距標靶抗原決定基(例如，腫瘤抗原)一定距離處之ROR1結合蛋白中的能力，使得抗原結合結構域(例如，scFv)可有效地與標靶抗原決定基(例如，腫瘤抗原)相互作用。同樣，在一些態樣中，c-Jun功能片段為如下片段，當在免疫細胞(例如，CAR T細胞)中表現時，該片段導致免疫細胞具有例如表現相應全長c-Jun之參考免疫細胞的活性之至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%。此類活性之非限制性實例進一步描述於本揭示案中之別處。

「重組」多肽或蛋白質係指經由重組DNA技術產生之多肽或蛋白質。出於本揭示案之目的，在經工程改造之宿主細胞中表現的重組產生之多肽及蛋白質被視為分離的，已藉由任何合適技術分離、分級分離或部分或實質上純化之原生或重組多肽亦是如此。由本文所揭示之聚核苷酸編碼的多肽(例如，ROR1結合蛋白、c-Jun及/或EGFRt)可使用此項技術中已知之方法重組產生。在一些態樣中，由本揭示案之聚核苷酸編碼的多肽(例如，ROR1結合蛋白、c-Jun及/或EGFRt)由細胞(例如T細胞)在用至少一種編碼本文所述之多肽的聚核苷酸或載體轉染之後產生。

如本文所用，「編碼區」、「編碼序列」或「可轉譯序列」係聚核苷酸之一部分，其由可轉譯成胺基酸之密碼子組成。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)典型地未轉譯成胺基酸，但其可被視為編碼區之一部分，而任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及其類似序列)並非編碼區之一部分。編碼區之邊界典型地由5'末端處之起始密碼子(編碼所得多肽之胺基末端)及3'末端處之轉譯終止密碼子(編碼所得多肽之羧基末端)確定。

術語「互補」及「互補性」係指兩種或更多種寡聚物(亦即，各自包含核鹼基序列)或寡聚物與標靶基因之間藉由Watson-Crick鹼基配對法則彼此相關。舉例而言，核鹼基序列「T-G-A(5'至3')」與核鹼基序列「A-C-T (3'至5')」互補。互補可為「部分」的，其中根據鹼基配對法則，既定核鹼基序列之少於所有核鹼基與另一核鹼基序列匹配。舉例而言，在一些態樣中，既定核鹼基序列與另一核鹼基序列之間的互補性可為約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。因此，在一些態樣中，術語「互補」係指與標靶核酸序列(例如，編碼c-Jun之核苷酸序列)至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%匹配或互補。或者，在既定核鹼基序列與另一核鹼基序列之間可存在「完全」或「完美」(100%)互補性以使實例繼續。在一些態樣中，核鹼基序列之間之互補程度對序列之間之雜交效率及強度具有顯著效應。

如本文所用，術語「表現」係指聚核苷酸產生基因產物(例如c-Jun多肽)之過程。其包括但不限於將聚核苷酸轉錄成信使RNA(mRNA)及將mRNA轉譯成多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸，例如藉由基因轉錄產生之信使RNA，或者由轉錄物轉譯之多肽。本文所述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如，聚腺苷酸化或剪接)之核酸，或具有轉譯後修飾(例如，甲基化、糖基化、添加脂質、與其他蛋白質亞單元締合或蛋白水解裂解)之多肽。

如本文所用，術語「一致性」係指聚合物分子之間(例如聚核苷酸分子之間)的總體單體保守。無任何額外限定詞之術語「一致」(例如，聚核苷酸A與聚核苷酸B一致)意味著聚核苷酸序列為100%一致(100%序列一致性)。將兩個序列描述為例如「70%一致」等效於將其描述為具有例如「70%序列一致性」。

舉例而言，可藉由比對兩個多肽或聚核苷酸序列來執行兩個序列之一致性百分比的計算，以實現最佳比較目的(例如，可在第一及第二多肽或聚核苷酸序列中之一者或兩者中引入間隙以實現最佳比對且出於比較目的，可忽略非一致序列)。在一些態樣中，出於比較目的而比對之序列的長度為參考序列之長度之至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或約100%。接著比較相應胺基酸位置處之胺基酸，或在聚核苷酸之情形下比較鹼基。

當第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置相同的胺基酸或核苷酸佔據時，則該等分子在彼位置處一致。兩個序列之間之一致性百分比隨該等序列所共享之一致位置的數目而變，其中考慮到間隙之數目及每個間隙之長度，需要引入該長度以實現兩個序列之最佳比對。可使用數學算法來完成序列之比較及兩個序列之間之一致性百分比的確定。

可用於比對不同序列(例如，聚核苷酸序列)之合適軟體程式可自各種來源獲得。一種確定序列一致性百分比之合適程式為bl2seq，其為BLAST程式套件之一部分，可自美國政府之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST網站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法來執行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他合適程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其為EMBOSS生物資訊學程式套件之一部分且亦可自European Bioinformatics Institute (EBI)在worldwideweb.ebi.ac.uk/ Tools/psa處獲得。

序列比對可使用此項技術中已知之方法，諸如MAFFT、Clustal(ClustalW、Clustal X或Clustal Omega) 、MUSCLE等進行。

單一聚核苷酸或多肽標靶序列內與聚核苷酸或多肽參考序列比對之不同區域可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意，序列一致性百分比之值四捨五入至小數點後一位。例如，將80.11、80.12、80.13及80.14向下四捨五入至80.1，而將80.15、80.16、80.17、80.18及80.19向上四捨五入至80.2。亦應注意，長度值將始終為整數。

在一些態樣中，第一胺基酸序列(或核酸序列)相對於第二胺基酸序列(或核酸序列)之一致性百分比(ID%)係計算為ID%=100 x (Y/Z)，其中Y係在第一及第二序列之比對(如藉由目視檢查或特定序列比對程式來比對)中作為一致匹配評分的胺基酸殘基(或核鹼基)之數目且Z係第二序列中的殘基之總數。若第一序列之長度比第二序列長，則第一序列相對於第二序列之一致性百分比將高於第二序列相對於第一序列之一致性百分比。

熟習此項技術者應理解，用於計算序列一致性百分比之序列比對的產生不限於僅由一級序列資料驅動之二元序列-序列比較。亦應理解，序列比對可藉由將序列資料與來自異類來源之資料，諸如結構資料 (例如，晶體學蛋白結構)、功能資料 (例如，突變之位置)或系統發生資料整合來產生。整合異類資料以產生多重序列比對之合適程式為T-Coffee，其可在worldwidewebtcoffee.org處獲得，且替代地可例如自EBI獲得。亦應瞭解，用於計算序列一致性百分比之最終比對可自動地或手動地進行。

如本文所用，術語「經分離」、「經純化」、「經提取」及其語法變化形式可互換使用，且係指已經歷一或多個純化過程之本揭示案之所需組合物的製劑狀態。在一些態樣中，如本文所用之分離或純化係自含有污染物之樣品中移除，包括部分移除(例如，一部分)本揭示案之組合物(例如，表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白的經修飾免疫細胞)之過程。

在一些態樣中，經分離之組合物不具有可偵測到的非所需活性，或替代地，非所需活性之水準或量係可接受之水準或量或低於可接受之水準或量。在一些態樣中，經分離之組合物所具有的本揭示案之所需組合物之量及/或濃度係可接受之量及/或濃度及/或活性，或高於可接受之量及/或濃度及/或活性。在一些態樣中，與獲得該組合物之起始材料相比，經分離之組合物係經富集。如與起始材料相比，此富集可為至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.9%、至少約99.99%、至少約99.999%、至少約99.9999%或大於99.9999%。

在一些態樣中，經分離之製劑實質上不含殘餘生物產物。在一些態樣中，經分離之製劑100%不含、至少約99%不含、至少約98%不含、至少約97%不含、至少約96%不含、至少約95%不含、至少約94%不含、至少約93%不含、至少約92%不含、至少約91%不含或至少約90%不含任何污染性生物物質。殘餘生物產物可包括非生物性材料(包括化學品)或不需要之核酸、蛋白質、脂質或代謝物。

如本文所用，術語「經連接」係指第一胺基酸序列或聚核苷酸序列分別共價或非共價接合至第二胺基酸序列或聚核苷酸序列。第一胺基酸或聚核苷酸序列可與第二胺基酸或聚核苷酸序列直接接合或併置，或替代地，插入序列可將第一序列共價接合至第二序列。術語「經連接」不僅意謂第一聚核苷酸序列與第二聚核苷酸序列在5’端或3’端融合，而且包括將整個第一聚核苷酸序列(或第二聚核苷酸序列)插入至第二聚核苷酸序列(或分別地，第一聚核苷酸序列)中之任兩個核苷酸中。第一聚核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接體連接至第二聚核苷酸序列。該連接體可為例如聚核苷酸。

個體之「治療」或「療法」(包括其任何語法派生詞)係指對個體執行之任何類型的介入或過程或向個體投與活性劑，目的在於逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或預防症狀、併發症、疾患之發作、進展、發展、嚴重性或復發，或與疾病相關之生物化學標記。在一些態樣中，該等術語係指在個體中誘導針對抗原之免疫反應。

如本文所用，術語「預防(prevent/ preventing)」及其變化形式係指部分或完全地延遲疾病、病症及/或疾患之發作；部分或完全地延遲特定疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀、特徵或臨床表現之發作；部分或完全地延遲特定疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀、特徵或表現之發作；部分或完全地延遲自特定疾病、病症及/或疾患進展；及/或降低發展與疾病、病症及/或疾患相關之病理的風險。在一些態樣中，經由預防性治療達成預防結果。

如本文所用，術語「啟動子」係指能夠控制編碼序列或功能性RNA之表現之DNA序列。通常，編碼序列位於啟動子序列之3'。啟動子可全部源自原生基因，或者由源自自然界中發現之不同啟動子的不同元件構成，或者甚至包含合成DNA區段。熟習此項技術者應理解，不同啟動子可指導基因在不同組織或細胞類型中，或在不同發育階段，或因應於不同環境或生理條件之表現。大多數時候導致基因在大多數細胞類型中表現之啟動子通常稱為「組成型啟動子」。導致基因在特定細胞類型中表現之啟動子通常稱為「細胞特異性啟動子」或「組織特異性啟動子」。導致基因在特定發育或細胞分化階段表現之啟動子通常稱為「發育特異性啟動子」或「細胞分化特異性啟動子」。在用誘導啟動子之劑、生物分子、化學品、配位體、光或其類似物暴露或處理細胞之後經誘導且導致基因表現之啟動子通常稱為「誘導型啟動子」或「可調節之啟動子」。進一步認識到，由於在大多數情況下尚未完全確定調節序列之確切邊界，不同長度之DNA片段可具有一致的啟動子活性。

如本文所用，術語「ug」及「uM」可分別與「μg」及「μΜ」互換使用。

本揭示案之各個態樣更詳細地描述於以下子部分中。 II. 本揭示案之方法 II.A. 代謝再編程培養基

本揭示案之一些態樣係關於在培養條件下(例如在培養基中)培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))的方法，其中該培養條件(例如，某些離子濃度、培養基張力、細胞介素及/或其任何組合)能夠減少、限制或防止免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))之分化，由此影響或改良其在細胞療法(例如過繼細胞療法)中之用途。在一些態樣中，在本文所揭示之代謝再編程培養基(MRM)中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))。在一些態樣中，如與使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的細胞相比，在MRM中培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))具有更高比例之幹細胞樣細胞。在一些態樣中，如與使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的細胞相比，在MRM中培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))具有更高比例之效應子樣細胞。在一些態樣中，如與使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的細胞相比，在MRM中培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))具有更高比例之幹細胞樣及效應子樣細胞。在一些態樣中，如與使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的細胞相比，在MRM中培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))具有更高增殖潛力。

本揭示案之一些態樣係關於製備免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))群體的方法，該等方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基(例如，本文所揭示之代謝再編程培養基)中培養該等細胞。本揭示案之一些態樣係關於製備T細胞群體之方法，該等方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基(例如，本文所揭示之代謝再編程培養基)中培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)。在一些態樣中，本揭示案提供製備免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))之方法，該等方法包括在包含濃度高於5 mM (例如高於40 mM，例如在40 mM與80 mM之間，例如在55 mM與70 mM之間)之鉀離子的培養基中培養該等細胞，該等方法能夠保持經培養細胞之幹細胞樣表型(例如，最小分化)。在一些態樣中，本揭示案提供製備T細胞之方法，該等方法包括在包含濃度高於5 mM (例如高於40 mM，例如在40 mM與80 mM之間，例如在55 mM與70 mM之間)之鉀離子的培養基中培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)，該等方法能夠保持經培養T細胞之幹細胞樣表型(例如，最小分化)。在一些態樣中，與在具有較低鉀濃度之培養基中生長的細胞相比，經培養細胞具有更具幹細胞樣表型(例如，低分化)。在一些態樣中，該培養基進一步包含介白素(IL)-2、IL-21、IL-7、IL-15或其任何組合。在一些態樣中，該培養基進一步包含鈉離子(例如，NaCl)、鈣離子、葡萄糖或其任何組合。

在一些態樣中，相對於使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的細胞群體，使用本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))群體展現增加之幹細胞樣細胞數目。在一些態樣中，相對於使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的T細胞群體，使用本文所揭示之方法培養的T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)群體展現增加之幹細胞樣T細胞數目。在一些態樣中，相對於起始免疫細胞群體(亦即，在培養之前)，該等免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))展現幹細胞樣細胞所特有之標記物的增加之表現。在一些態樣中，相對於起始T細胞群體(亦即，在培養之前)，該等T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)展現幹細胞樣細胞所特有之標記物的增加之表現。在一些態樣中，起始免疫細胞群體包含獲自人類個體之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，起始免疫細胞群體包含獲自人類個體之T細胞。在一些態樣中，起始免疫T細胞群體包含T _N細胞、T _SCM細胞、T _CM細胞、T _EM細胞或其任何組合。在一些態樣中，起始免疫細胞群體包含在如本文所述之修飾(例如，用編碼ROR1結合蛋白、c-Jun蛋白及/或EGFRt之聚核苷酸轉染)之前的T細胞。

可使用此項技術中已知之任何方法來量測增加之細胞多能性。在一些態樣中，相繼藉由抗體染色、閘控流式細胞術來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由自噬通量來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由葡萄糖攝取來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由脂肪酸攝取來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由粒線體生物質量來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由RNA定量/表現分析(例如微陣列、qPCR(taqman)、RNA-Seq.、單細胞RNA-Seq.或其任何組合)來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由與代謝分析(例如seahorse代謝分析、細胞外酸化速率分析(ECAR)；氧消耗速率分析(OCR)；備用呼吸量分析；及/或粒線體膜電位分析)相關之轉錄物來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，使用一或多種活體內或活體外功能分析(例如，分析細胞持久性、抗腫瘤能力、抗腫瘤清除、病毒清除、多能性、細胞介素釋放、細胞殺死或其任何組合)來量測幹細胞性。

在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))之分化狀態的特徵在於表現低分化細胞所特有之標記物的細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞之分化狀態的特徵在於表現低分化T細胞所特有之標記物的細胞之數目增加。在一些態樣中，幹細胞樣細胞之數目增加的特徵在於表現T _N及/或T _SCM細胞所特有之標記物的T細胞之數目增加。在一些態樣中，幹細胞樣T細胞之數目增加的特徵在於表現T _SCM細胞所特有之標記物的細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CD45RA之細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CCR7之細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CD62L之細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CD28之細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CD95之細胞之數目增加。在一些態樣中，細胞為CD45RO ^低。在一些態樣中，細胞不表現 CD45RO。在一些態樣中，細胞群體展現CD45RA ⁺及CCR7 ⁺細胞(例如，CD4+及/或CD8+ T細胞)之數目增加。在一些態樣中，細胞群體展現CD45RA ⁺、CCR7 ⁺及CD62L ⁺細胞之數目增加。在一些態樣中，細胞群體展現CD95 ⁺、CD45RA ⁺、CCR7 ⁺及CD62L ⁺細胞之數目增加。在一些態樣中，細胞群體展現表現TCF7之細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現CD45RA ⁺、CCR7 ⁺、CD62L ⁺及TCF7 ⁺細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現CD95 ⁺、CD45RA ⁺、CCR7 ⁺、CD62L ⁺及TCF7 ⁺細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現CD3 ⁺、CD45RA ⁺、CCR7 ⁺、CD62L ⁺及TCF7 ⁺細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現CD3 ⁺、CD95 ⁺、CD45RA ⁺、CCR7 ⁺、CD62L ⁺及TCF7 ⁺細胞之數目增加。在一些態樣中，細胞表現CD27。在一些態樣中，T細胞群體展現CD27 ⁺、CD3 ⁺、CD45RA ⁺、CCR7 ⁺、CD62L ⁺及TCF7 ⁺細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現CD27 ⁺、CD3 ⁺、CD95 ⁺、CD45RA ⁺、CCR7 ⁺、CD62L ⁺及TCF7 ⁺細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現CD39 ^-及CD69 ^-細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現TCF7 ⁺及CD39 ^-細胞之數目增加。在一些態樣中，細胞群體展現T _SCM細胞之數目增加。在一些態樣中，細胞群體展現T _N細胞之數目增加。在一些態樣中，細胞群體展現T _SCM及T _N細胞之數目增加。在一些態樣中，細胞群體展現幹細胞樣T細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞為CD4+細胞；在一些態樣中，T細胞為CD8+細胞。在一些態樣中，T細胞包含CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。

在一些態樣中，相對於用MRM培養之前的幹細胞樣細胞之數目，培養物中之幹細胞樣細胞的數目增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，相對於用MRM培養之前的幹細胞樣細胞之數目，培養物中之幹細胞樣細胞的數目增加至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍或至少約20倍。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD8 ⁺T細胞的總數之至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約10%或至少約15%。在一些態樣中，幹細胞樣T細胞(例如，CD45RA ⁺及CCR7 ⁺)構成至少約20%之CD8 ⁺T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD4 ⁺T細胞的總數之至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約10%或至少約15%。在一些態樣中，幹細胞樣T細胞(例如，CD45RA ⁺及CCR7 ⁺)構成至少約20%之CD4 ⁺T細胞。

如本文所述，在一些態樣中，本揭示案之方法可用於修飾T細胞(例如，CD8 ⁺T細胞及/或CD4 ⁺T細胞)以(a)表現ROR1結合蛋白(例如，抗ROR1 CAR)及(b)具有增加水準之c-Jun蛋白。因此，在一些態樣中，在培養之後，CD8 ⁺T細胞表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白且至少約20%之經修飾CD8 ⁺T細胞為幹細胞樣T細胞(例如，CD45RA ⁺及CCR7 ⁺)。在一些態樣中，在培養之後，CD4 ⁺T細胞表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白且至少約20%之經修飾CD4 ⁺T細胞為幹細胞樣T細胞(例如，CD45RA ⁺及CCR7 ⁺)。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白及增加水準之c-Jun蛋白)之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD8 ⁺T細胞的總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD4 ⁺T細胞的總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約40%為CD39 ^-/CD69 ^-T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%為CD39 ^-/CD69 ^-T細胞。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約70%為CD39 ^-/TCF7 ⁺T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%為CD39 ^-/TCF7 ⁺T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD4 ⁺T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD8 ⁺T細胞。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)之後，T細胞的總數之至少約10%至至少約70%為CD45RA ⁺及CCR7 ⁺T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%為CD45RA ⁺及CCR7 ⁺T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD4 ⁺T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD8 ⁺T細胞。在一些態樣中，T細胞包含CD4 ⁺T細胞及CD8 ⁺T細胞。

在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的本揭示案之免疫細胞(例如，經工程改造之免疫細胞(例如T細胞及/或NK細胞，經修飾以表現ROR1結合蛋白且增加水準之c-Jun蛋白))展現增加之轉導效率。

在一些態樣中，如與使用習知方法類似地轉導且培養之細胞(例如，在含有小於5 mM K ⁺之培養基中)相比，更大百分率之細胞在轉導之後表現例如編碼配位體結合蛋白之標靶轉殖基因，其中該等細胞係根據本文所揭示之方法進行培養。在某些態樣中，如與使用習知方法培養之類似轉導細胞(例如，在含有小於5 mM K ⁺之培養基中)相比，根據本文所揭示之方法培養的更大百分率之細胞在細胞之慢病毒轉導之後表現配位體結合蛋白。在一些態樣中，相對於使用習知方法培養之類似轉導細胞(例如，在含有小於5 mM K ⁺之培養基中)，轉導效率增加至少約1.5倍。在一些態樣中，相對於使用習知方法培養之類似轉導細胞(例如，在含有小於5 mM K ⁺之培養基中)，轉導效率增加至少約2倍。如本文所用，術語「轉導效率」係指：(i)可在一段確定時期內以物理方式引入至細胞中之材料(例如，外源聚核苷酸)的量；(ii)將既定量之材料以物理方式引入至細胞中所耗用的時間量；(iii)細胞群體吸收標靶材料(例如外源聚核苷酸，亦即轉殖基因)之水準(例如，表現該轉殖基因之細胞的百分率)；或(iv) (i)-(iii)之任何組合。在一些態樣中，藉由增加轉導效率，本文所提供之培養方法可允許將更大量之外源核苷酸序列引入至細胞中及/或減少引入既定量之外源核苷酸序列所需之時間量。不受任一理論束縛，在一些態樣中，此類效應可增加所編碼之蛋白質(例如，c-Jun多肽)在經修飾免疫細胞中之表現。

在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在根據本文所揭示之方法培養之前經轉導。在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在根據本文所揭示之方法培養之後經轉導。在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在轉導之前、期間及之後根據本文所揭示之方法，例如藉由使免疫細胞與APC-MS在包含至少5 mM鉀離子(例如高於5 mM，例如在約40 mM至約80 mM之間)之培養基中接觸來進行培養。

在某些態樣中，使用病毒載體來轉導免疫細胞。在一些態樣中，載體包含慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、牛痘載體、單純疱疹病毒載體及Epstein-Barr病毒載體。在一些態樣中，病毒載體包含逆轉錄病毒。在一些態樣中，病毒載體包含慢病毒。在一些態樣中，病毒載體包含AAV。

在一些態樣中，使用非病毒方法來轉導免疫細胞。在一些態樣中，非病毒方法包括使用轉位子。在一些態樣中，使用非病毒遞送方法允許免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之再編程，及將細胞直接輸注至個體中。在一些態樣中，可藉由使用CRISPR/Cas系統及基因體編輯替代方案，諸如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALEN)及大範圍核酸酶(meganucleases，MN)，將聚核苷酸插入至標靶細胞(例如T細胞)或宿主細胞(例如，用於重組表現所編碼蛋白質之細胞)之基因體中。

在一些態樣中，在過繼轉移根據本文所揭示之方法培養的視情況表現配位體結合蛋白之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白))後，如與使用習知方法培養的細胞(例如，在含有小於5 mM K ⁺之培養基中)相比，經轉移之細胞展現減少之細胞耗竭。在一些態樣中，在過繼轉移根據本文所揭示之方法培養的視情況表現配位體結合蛋白之T細胞(例如，經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白)後，如與使用習知方法培養的T細胞(例如，在含有小於5 mM K ⁺之培養基中)相比，經轉移之T細胞展現減少之細胞耗竭。

在一些態樣中，在過繼轉移根據本文所揭示之方法培養的細胞後，如與使用習知方法培養的細胞(例如，在含有小於5 mM K ⁺之培養基中)相比，經轉移之細胞在活體內持續一段更長時期。在一些態樣中，如與使用習知方法培養的細胞(例如，在含有小於5 mM K ⁺之培養基中)相比，經轉移之細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)具有更大活體內功效，例如腫瘤殺死活性。在一些態樣中，如與使用習知方法培養的細胞(例如，在含有小於5 mM K ⁺之培養基中)相比，需要更低劑量之根據本文所揭示之方法培養的細胞以在個體中引起反應，例如減少之腫瘤體積。

在一些態樣中，在自個體分離後立即根據本文所揭示之方法，例如在包含至少5 mM鉀離子(例如高於5 mM，例如在約40 mM至約80 mM之間)之培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在細胞擴增期間根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在細胞之工程改造期間，例如在用編碼轉殖基因(例如配位體結合蛋白)之構築體進行轉導期間，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在細胞之工程改造之後，例如在用編碼轉殖基因(例如配位體結合蛋白)之構築體進行轉導之後，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在擴增及工程改造之整個過程中根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在病毒基因工程改造之整個過程中根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在非病毒基因工程改造之整個過程中根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在將配位體結合蛋白引入至免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)以允許腫瘤特異性靶向(例如，CAR、TCR或TCR模擬物)期間，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在引入一或多種改良T細胞功能之內源基因(例如，c-Jun)的整個過程中，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在引入一或多種改良T細胞功能之合成基因(例如，編碼c-Jun蛋白之外源聚核苷酸，或編碼CAR、TCR、caTCR、CSR或TCR模擬物之外源聚核苷酸)的整個過程中，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。

在一些態樣中，根據本文所揭示之方法，例如在包含至少5 mM鉀離子(例如高於5 mM，例如在約40 mM至約80 mM之間)之培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，持續整個離體培養，例如自個體分離免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之時，通過生長、擴增、工程改造，且直至投與至需要過繼細胞療法之個體中。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法，例如在包含至少5 mM鉀離子(例如高於5 mM，例如在約40 mM至約80 mM之間)之培養基中培養T細胞，持續整個離體培養，例如自個體分離T細胞之時，通過生長、擴增、工程改造，且直至投與至需要過繼細胞療法之個體中。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，持續擴增之持續時間。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，直至活免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之總數為至少約10 ⁴、至少約5×10 ⁴、至少約10 ⁵、至少約5×10 ⁵、至少約10 ⁶、至少約5×10 ⁶、至少約1×10 ⁷、至少約5×10 ⁷、至少約1×10 ⁸、至少約5×10 ⁸、至少約1×10 ⁹、至少約5×10 ⁹、至少約1×10 ¹⁰、至少約5×10 ¹⁰、至少約1×10 ¹¹、至少約5×10 ¹¹、至少約1×10 ¹²或至少約5×10 ¹²個總細胞。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養T細胞，直至活T細胞之總數為至少約10 ⁴、至少約5×10 ⁴、至少約10 ⁵、至少約5×10 ⁵、至少約10 ⁶、至少約5×10 ⁶、至少約1×10 ⁷、至少約5×10 ⁷、至少約1×10 ⁸、至少約5×10 ⁸、至少約1×10 ⁹、至少約5×10 ⁹、至少約1×10 ¹⁰、至少約5×10 ¹⁰、至少約1×10 ¹¹、至少約5×10 ¹¹、至少約1×10 ¹²或至少約5×10 ¹²個總T細胞。

在一些態樣中，該培養基進一步包含細胞擴增劑。如本文所用，「細胞擴增劑」係指促進經培養細胞，例如免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之活體外及/或離體生長及增殖之劑，例如小分子、多肽或其任何組合。在一些態樣中，細胞擴增劑包含PI3K抑制劑。在一些態樣中，培養基進一步包含AKT抑制劑。在一些態樣中，培養基進一步包含PI3K抑制劑及AKT抑制劑。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含LY294002。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含IC87114。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含艾代拉利司(idelalisib)(參見例如Peterson等人， Blood Adv. 2(3):210-23(2018))。在一些態樣中，培養基進一步包含GSK3B抑制劑。在一些態樣中，GSK3B抑制劑包含TWS119。在一些態樣中，培養基進一步包含ACLY抑制劑。在一些態樣中，ACLY抑制劑包含羥基檸檬酸三鉀單水合物。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含羥基檸檬酸鹽。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含匹替利司(pictilisib)。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含CAL-101。在一些態樣中，AKT抑制劑包含MK2206、A443654或AKTi-VIII(CAS 612847-09-3)。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含粒線體燃料。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 mM、至少約0.5 mM、至少約1.0 mM、至少約5 mM或至少約10 mM O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 mM O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。

在一些態樣中，代謝再編程培養基進一步包含以下一或多者：(i)一或多種細胞擴增劑，(ii)鈉離子(例如，NaCl)，(iii)一或多種醣，(iv)鈣離子，及(v)一或多種細胞介素。 II.A.1. 鉀

本揭示案之一些態樣係關於在培養基(亦即，本文所揭示之代謝再編程培養基)中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，相對於對照培養基，該培養基包含增加之鉀離子濃度(例如，大於約5 mM、大於約40 mM、大於約45 mM、大於約50 mM、大於約55 mM、大於約60 mM、大於約65 mM或大於約70 mM)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5 mM至至少約100 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約90 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約40 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約40 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約40 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約40 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約60 mM鉀離子或至少約50 mM至至少約55 mM鉀離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5 mM、至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、至少約75 mM或至少約80 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約15 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約20 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約25 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約30 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約35 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約40 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約45 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約55 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約60 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約65 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約70 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約75 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約80 mM鉀離子。在一些態樣中，MRM包含在約40 mM至約80 mM之間的鉀離子(例如，在40-80 mM之間)。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含增加濃度之鉀離子，例如至少約5 mM鉀離子，且該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含濃度在約40 mM與約80 mM之間的鉀離子及濃度在約30 mM與約100 mM之間的NaCl，其中鉀離子及NaCl之總濃度係在約110 mM與約140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中之鉀離子之濃度為約5 mM至約100 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中之鉀離子之濃度為約5 mM至約100 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約5 mM至約90 mM、約5 mM至約80 mM、約5 mM至約70 mM、約5 mM至約60 mM或約5 mM至約50 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約5 mM至約90 mM、約5 mM至約80 mM、約5 mM至約70 mM、約5 mM至約60 mM或約5 mM至約50 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約25 mM至約100 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約25 mM至約100 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約25 mM至約90 mM、約25 mM至約80 mM、約25 mM至約70 mM、約25 mM至約60 mM或約25 mM至約50 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約25 mM至約90 mM、約25 mM至約80 mM、約25 mM至約70 mM、約25 mM至約60 mM或約25 mM至約50 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約40 mM至約100 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約40 mM至約100 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM、約40 mM至約85 mM、約40 mM至約80 mM、約40 mM至約75 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約65 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約55 mM或約40 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM、約40 mM至約85 mM、約40 mM至約80 mM、約40 mM至約75 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約65 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約55 mM或約40 mM至約50 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度係在約40 mM至約80 mM之間，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM、約50 mM至約85 mM、約50 mM至約80 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約60 mM或約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM、約50 mM至約85 mM、約50 mM至約80 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約60 mM或約50 mM至約55 mM，且其中該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 mM鉀離子及小於約90 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約50 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約115 mM、約50 mM至約110 mM、約50 mM至約105 mM、約50 mM至約100 mM、約50 mM至約95 mM、約50 mM至約90 mM、約50 mM至約85 mM、約50 mM至約80 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約60 mM或約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，培養基包含至少約50 mM至約120 mM鉀離子及小於約90 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約55 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約115 mM、約55 mM至約110 mM、約55 mM至約105 mM、約55 mM至約100 mM、約55 mM至約95 mM、約55 mM至約90 mM、約55 mM至約85 mM、約55 mM至約80 mM、約55 mM至約75 mM、約55 mM至約70 mM、約55 mM至約65 mM或約55 mM至約60 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約55 mM至約120 mM鉀離子及小於約85 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約60 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約115 mM、約60 mM至約110 mM、約60 mM至約105 mM、約60 mM至約100 mM、約60 mM至約95 mM、約60 mM至約90 mM、約60 mM至約85 mM、約60 mM至約80 mM、約60 mM至約75 mM、約60 mM至約70 mM或約60 mM至約65 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約60 mM至約120 mM鉀離子及小於約80 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約65 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約115 mM、約65 mM至約110 mM、約65 mM至約105 mM、約65 mM至約100 mM、約65 mM至約95 mM、約65 mM至約90 mM、約65 mM至約85 mM、約65 mM至約80 mM、約65 mM至約75 mM或約65 mM至約70 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約65 mM至約120 mM鉀離子及小於約75 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約70 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約115 mM、約70 mM至約110 mM、約70 mM至約105 mM、約70 mM至約100 mM、約70 mM至約95 mM、約70 mM至約90 mM、約70 mM至約85 mM、約70 mM至約80 mM或約70 mM至約75 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約70 mM至約120 mM鉀離子及小於約70 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約75 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約115 mM、約75 mM至約110 mM、約75 mM至約105 mM、約75 mM至約100 mM、約75 mM至約95 mM、約75 mM至約90 mM、約75 mM至約85 mM或約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約75 mM至約120 mM鉀離子及小於約65 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約80 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約115 mM、約80 mM至約110 mM、約80 mM至約105 mM、約80 mM至約100 mM、約80 mM至約95 mM、約80 mM至約90 mM或約80 mM至約85 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約80 mM至約120 mM鉀離子及小於約60 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約85 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約115 mM、約85 mM至約110 mM、約85 mM至約105 mM、約85 mM至約100 mM、約85 mM至約95 mM或約85 mM至約90 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約85 mM至約120 mM鉀離子及小於約65 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約90 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約115 mM、約90 mM至約110 mM、約90 mM至約105 mM、約90 mM至約100 mM或約90 mM至約95 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約90 mM至約120 mM鉀離子及小於約50 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約95 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約115 mM、約95 mM至約110 mM、約95 mM至約105 mM或約95 mM至約100 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約95 mM至約120 mM鉀離子及小於約55 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約100 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM至約115 mM、約100 mM至約110 mM或約100 mM至約105 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約100 mM至約120 mM鉀離子及小於約50 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約105 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM至約115 mM或約105 mM至約110 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約105 mM至約120 mM鉀離子及小於約35 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約110 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM至約115 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約110 mM至約120 mM鉀離子及小於約30 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約90 mM。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約90 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM，且NaCl之濃度為小於約90 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約90 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約80 mM，且NaCl之濃度為小於約80 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約70 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約80 mM，且NaCl之濃度為小於約70 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約60 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約55 mM，且NaCl之濃度為小於約90 mM至約85 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約60 mM，且NaCl之濃度為小於約85 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約65 mM，且NaCl之濃度為小於約80 mM至約75 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM，且NaCl之濃度為小於約75 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約75 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約75 mM，且NaCl之濃度為小於約70 mM至約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約80 mM，且NaCl之濃度為小於約65 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約85 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約85 mM，且NaCl之濃度為小於約60 mM至約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約55 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約95 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約95 mM，且NaCl之濃度為小於約50 mM至約45 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約100 mM，且NaCl之濃度為小於約45 mM至約40 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM至約105 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM至約105 mM，且NaCl之濃度為小於約40 mM至約35 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM至約110 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM至約110 mM，且NaCl之濃度為小於約35 mM至約30 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM至約115 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM至約115 mM，且NaCl之濃度為小於約30 mM至約25 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約115 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約115 mM至約120 mM，且NaCl之濃度為小於約25 mM至約20 mM。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。

在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約4 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約4 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約5 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約5 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約6 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約6 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約7 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約7 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約8 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約8 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約9 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約9 mM，其中該培養基為低張或等張的。

在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約10 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約10 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約11 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約11 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約12 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約12 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約13 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約13 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約14 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約14 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約15 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約15 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約16 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約16 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約17 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約17 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約18 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約18 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約19 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約19 mM，其中該培養基為低張或等張的。

在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約20 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約20 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約21 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約21 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約22 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約22 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約23 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約23 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約24 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約24 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約25 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約25 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約26 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約26 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約27 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約27 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約28 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約28 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約29 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約29 mM，其中該培養基為低張或等張的。

在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約30 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約30 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約31 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約31 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約32 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約32 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約33 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約33 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約34 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約34 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約35 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約35 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約36 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約36 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約37 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約37 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約38 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約38 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約39 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約39 mM，其中該培養基為低張或等張的。

在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約40 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約41 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約41 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約42 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約42 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約43 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約43 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約44 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約44 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約45 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約45 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約46 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約46 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約47 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約47 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約48 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約48 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約49 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約49 mM，其中該培養基為低張或等張的。

在一些態樣中，藉由將足量鉀鹽添加至培養基中來製備包含高濃度之鉀離子之代謝再編程培養基。在一些態樣中，鉀鹽之非限制性實例包括三氯一胺鉑酸鉀、水合五氯釕酸鉀、雙(草酸)鉑(II)酸鉀二水合物、硫酸氫鉀、硼氫化鉀、溴化鉀、碳酸鉀、氯化鉀、鉻酸鉀、重鉻酸鉀、氰化銀鉀、氰化亞金鉀、氟化鉀、氟硫酸鉀、六氯銥酸鉀、六氯鋨酸鉀、六氯鈀酸鉀、六氯鉑酸鉀、六氯錸酸鉀、六氰鉻酸鉀、六氰高鐵酸鉀、六氰釕(II)酸鉀水合物、六氟銻酸鉀、六氟鎳酸鉀、六氟磷酸鉀、六氟鈦酸鉀、六氟鋯酸鉀、六羥基銻酸鉀、六碘鉑酸鉀、六碘錸酸鉀、氫氧化鉀、碘酸鉀、碘化鉀、錳酸鉀、偏釩酸鉀、鉬酸鉀、硝酸鉀、亞硝基二磺酸鉀、鋨(VI)酸鉀二水合物、五氯亞硝醯基釕酸鉀、過氯酸鉀、過錸酸鉀、過釕酸鉀、過硫酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、焦磷酸鉀、硒氰酸鉀、硒氰酸鉀、錫酸鉀三水合物、硫酸鉀、碲酸鉀水合物、亞碲酸鉀、四硼酸鉀四水合物、四溴金酸鉀、四溴鈀酸鉀、四氯鈀酸鉀、四氯鉑酸鉀、四氰鈀酸鉀、四氰鉑酸鉀、四氟硼酸鉀、四硝基鉑酸鉀、連四硫酸鉀、對甲苯硫代磺酸鉀、羥基檸檬酸三鉀單水合物或其任何組合。在某些態樣中，鉀鹽包含氯化鉀(KCl)。在某些態樣中，鉀鹽包含葡萄糖酸鉀。在某些態樣中，鉀鹽包含檸檬酸鉀。在某些態樣中，鉀鹽包含羥基檸檬酸鉀。 II.A.2. 鈉

本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度為至少約5 mM (例如高於5 mM，例如在約40 mM與約80 mM之間)之鉀離子及(ii)濃度為小於約115 mM之鈉離子(例如，NaCl)的培養基中培養免疫細胞之方法。在一些態樣中，該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，藉由以包含較高濃度之鈉離子(例如，NaCl)的基礎培養基為起始物，且稀釋溶液以實現鈉離子(例如，NaCl)之標靶濃度來實現鈉(例如，NaCl)之標靶濃度。在一些態樣中，藉由添加一或多種鈉鹽(例如，更多NaCl)來實現鈉離子(例如，NaCl)之標靶濃度。鈉鹽之非限制性實例包括(偏)過碘酸鈉、酒石酸甲基砷酸二鈉水合物、疊氮化鈉、苄氧化鈉、溴化鈉、碳酸鈉、氯化鈉、鉻酸鈉、環己烷丁酸鈉、乙硫醇鈉、氟化鈉、氟磷酸鈉、甲酸鈉、六氯銥(III)酸鈉水合物、六氯銥(IV)酸鈉六水合物、六氯鉑(IV)酸鈉六水合物、六氯銠(III)酸鈉、六氟鋁酸鈉、六氟銻(V)酸鈉、六氟砷(V)酸鈉、六氟高鐵(III)酸鈉、六氟磷酸鈉、六氟矽酸鈉、六羥基鉑(IV)酸鈉、六偏磷酸鈉、二氟化氫鈉、硫酸氫鈉、氰胺一鈉、氫氧化鈉、碘化鈉、偏硼酸鈉四水合物、偏矽酸鈉九水合物、偏釩酸鈉、鉬酸鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉、草酸鈉、過硼酸鈉單水合物、過碳酸鈉、過氯酸鈉、過碘酸鈉、過錳酸鈉、過錸酸鈉、磷酸鈉、焦磷酸鈉、硒酸鈉、亞硒酸鈉、錫酸鈉、硫酸鈉、亞碲酸鈉、四硼酸鈉、四氯鋁酸鈉、四氯金(III)酸鈉、四氯鈀(II)酸鈉、四氯鉑(II)酸鈉、硫代磷酸鈉、硫代硫酸鈉、硫代硫酸鈉五水合物、氧氟化釔鈉、三偏磷酸三鈉或其任何組合。在一些態樣中，鈉鹽包含氯化鈉(NaCl)。在一些態樣中，鈉鹽包含葡萄糖酸鈉。在一些態樣中，鈉鹽包含碳酸氫鈉。在一些態樣中，鈉鹽包含羥基檸檬酸鈉。在一些態樣中，鈉鹽包含磷酸鈉。

在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鈉離子(例如，NaCl)之濃度係低於基礎培養基之濃度。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度隨著鉀離子之濃度增加而降低。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約25 mM至約115 mM。在一些態樣中，鈉(例如，NaCl)離子之濃度為約25 mM至約100 mM、約30 mM至約40 mM、約30 mM至約50 mM、約30 mM至約60 mM、約30 mM至約70 mM、約30 mM至約80 mM、約40 mM至約50 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約80 mM、約50 mM至約55 mM、約50 mM至約60 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約80 mM、約55 mM至約60 mM、約55 mM至約65 mM、約55 mM至約70 mM、約55 mM至約75 mM、約55 mM至約80 mM、約60 mM至約65 mM、約60 mM至約70 mM、約60 mM至約75 mM、約60 mM至約80 mM、約70 mM至約75 mM、約70 mM至約80 mM或約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約40 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約50 mM至約85 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約55 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約30 mM至約35 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約35 mM至約40 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約40 mM至約45 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約45 mM至約50 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約55 mM至約60 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約60 mM至約65 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約65 mM至約70 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約70 mM至約75 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約80 mM至約85 mM。

在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM或約90 mM。在某些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約40 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約45 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約50 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約55 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約55.6 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約59.3 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約60 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約63.9 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約65 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約67.6 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約70 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約72.2 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約75 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約76 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約80.5 mM。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約40 mM至約90 mM鉀離子及約40 mM至約80 mM鈉離子(例如，NaCl)。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約55 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約60 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約66 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約67 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約68 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約69 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約71 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約72 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約73 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約74 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及約80 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約80 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及約80 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約40 mM至約90 mM鉀離子及約30 mM至約109 mM NaCl，其中NaCl濃度(mM)係等於或低於(135 –鉀離子濃度，意味著135減去鉀離子濃度)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約40 mM鉀離子及小於或等於約95 mM NaCl(例如，約95 mM、約94 mM、約93 mM、約92 mM、約91 mM、約90 mM、約85 mM、約80 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約45 mM鉀離子及小於或等於約90 mM NaCl(例如，約90 mM、約89 mM、約88 mM、約87 mM、約86 mM、約85 mM、約80 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 mM鉀離子及小於或等於約85 mM NaCl(例如，約85 mM、約84 mM、約83 mM、約82 mM、約81 mM、約80 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約55 mM鉀離子及小於或等於約80 mM NaCl(例如，約80 mM、約79 mM、約78 mM、約77 mM、約76 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約60 mM鉀離子及小於或等於約75 mM NaCl(例如，約75 mM、約74 mM、約73 mM、約72 mM、約71 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及小於或等於約70 mM NaCl(例如，約70 mM、約69 mM、約68 mM、約67 mM、約66 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及小於或等於約70 mM NaCl(例如，約65 mM、約64 mM、約63 mM、約62 mM、約61 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及小於或等於約60 mM NaCl(例如，約60 mM、約59 mM、約58 mM、約57 mM、約56 mM、約55 mM、約50 mM、約45 mM或約40 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約80 mM鉀離子及小於或等於約55 mM NaCl(例如，約55 mM、約54 mM、約53 mM、約52 mM、約51 mM、約50 mM、約45 mM、約40 mM或約35 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約85 mM鉀離子及小於或等於約50 mM NaCl(例如，約50 mM、約49 mM、約48 mM、約47 mM、約46 mM、約45 mM、約40 mM、約35 mM或約30 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約90 mM鉀離子及小於或等於約45 mM NaCl(例如，約45 mM、約44 mM、約43 mM、約42 mM、約41 mM、約40 mM、約35 mM、約30 mM或約25 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約60 mM NaCl。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約61 mM NaCl。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約62 mM NaCl。

在一些態樣中，培養基包含約50 mM鉀離子及約75 mM NaCl。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。

本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約135 mM之NaCl的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法。本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約100 mM之NaCl的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法。本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度高於50 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約90 mM之NaCl的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法。本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度高於55 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約70 mM之NaCl的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法。本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度高於60 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約70 mM之NaCl的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法。本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度在約40 mM至約80 mM之間的鉀離子及(ii)濃度在約40 mM至約80 mM之間的NaCl之培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法。本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度在約40 mM至約80 mM之間的鉀離子及(ii)濃度在約55 mM至約90 mM之間的NaCl之培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法。 II.A.3. 張力

在本揭示案之一些態樣中，基於鉀離子及/或NaCl之濃度來調節代謝再編程培養基之張力(例如，(鉀離子濃度加NaCl濃度)×2)。在一些態樣中，代謝再編程培養基之張力係低於基礎培養基之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基之張力係高於基礎培養基之張力。在一些態樣中，培養基之張力與基礎培養基之張力相同。代謝再編程培養基之張力可藉由修飾培養基中之鉀離子及/或NaCl之濃度而受影響。在一些態樣中，增加之鉀離子濃度與NaCl濃度之增加或減少配對。在一些態樣中，此配對影響代謝再編程培養基之張力。在一些態樣中，鉀離子濃度增加，而NaCl濃度減少。

在一些態樣中，基於鉀離子及張力之功能來製備可用於本揭示案培養基之培養基。例如，在一些態樣中，若可用於本揭示案之培養基為低張的(例如，小於280 mOsm)且包含至少約50 mM鉀離子，則可基於下式來確定足以維持低張培養基之NaCl濃度：NaCl濃度=(所需張力(280)/2)-鉀離子濃度。(亦即，NaCl濃度(mM)係等於或低於(140-鉀離子濃度))。在一些態樣中，本文所揭示之低張培養基包含總濃度在110 mM與140 mM之間的鉀離子及NaCl。因此，對於低張培養基，可將鉀離子濃度設定於50 mM與90 mM之間的濃度下，且NaCl濃度可在90 mM與50 mM之間，或者更低，只要鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間即可。在一些態樣中，本文所揭示之低張培養基包含總濃度在115 mM與140 mM之間的鉀離子及NaCl。在一些態樣中，本文所揭示之低張培養基包含總濃度在120 mM與140 mM之間的鉀離子及NaCl。

在一些態樣中，代謝再編程培養基為等張的(在280 mOsm與300 mOsm之間)且包含濃度在約50 mM與70 mM之間的鉀離子。可基於下式再次計算相應之NaCl濃度：NaCl濃度=(所需張力/2)-鉀離子濃度。例如，若鉀濃度為50 mM且所需張力為300 mOsm，則NaCl濃度可為100 mM。

在一些態樣中，代謝再編程培養基為等張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±1 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±2 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±3 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±4 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±5 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±6 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±7 mOsm/L之張力。在一些態樣中，MRM具有280 mOsm/L±8 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±9 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±10 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約280 mOsm/L至約285 mOsm/L、約280 mOsm/L至約290 mOsm/L、約280 mOsm/L至約295 mOsm/L、約280 mOsm/L至約300 mOsm/L、約280 mOsm/L至約305 mOsm/L、約280 mOsm/L至約310 mOsm/L、約280 mOsm/L至約315 mOsm/L或約280 mOsm/L至小於320 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約285 mOsm/L、約290 mOsm/L、約295 mOsm/L、約300 mOsm/L、約305 mOsm/L、約310 mOsm/L或約315 mOsm/L之張力。

在一些態樣中，代謝再編程培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約280 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於280 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於275 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於275 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於270 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於270 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於265 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於265 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於260 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於265 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於265 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於260 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於255 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於255 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約250 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約250 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約245 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約245 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約240 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約240 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約235 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約235 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約230 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約230 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約225 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約225 mOsm/L之張力。在一些態樣中，張力係高於約220 mOsm/L；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約230 mOsm/L至約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約240 mOsm/L至約280 mOsm/L之張力。

在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約220 mOsm/L之重量滲透濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約215 mOsm/L之重量滲透濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約210 mOsm/L之重量滲透濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約205 mOsm/L之重量滲透濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約200 mOsm/L之重量滲透濃度。

在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約100 mOsm/L至約280 mOsm/L、約125 mOsm/L至約280 mOsm/L、約150 mOsm/L至約280 mOsm/L、約175 mOsm/L至約280 mOsm/L、約200 mOsm/L至約280 mOsm/L、約210 mOsm/L至約280 mOsm/L、約220 mOsm/L至約280 mOsm/L、約225 mOsm/L至約280 mOsm/L、約230 mOsm/L至約280 mOsm/L、約235 mOsm/L至約280 mOsm/L、約240 mOsm/L至約280 mOsm/L、約245 mOsm/L至約280 mOsm/L、約250 mOsm/L至約280 mOsm/L、約255 mOsm/L至約280 mOsm/L、約260 mOsm/L至約280 mOsm/L、約265 mOsm/L至約280 mOsm/L、約270 mOsm/L至約280 mOsm/L或約275 mOsm/L至約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約250 mOsm/L至約270 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約250 mOsm/L至約255 mOsm/L、約250 mOsm/L至約260 mOsm/L、約250 mOsm/L至約265 mOsm/L、約255 mOsm/L至約260 mOsm/L、約255 mOsm/L至約265 mOsm/L、約255 mOsm/L至約265 mOsm/L、約260 mOsm/L至約265 mOsm/L或約254 mOsm/L至約263 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約254 mOsm/L至約255 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約255 mOsm/L至約256 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約256 mOsm/L至約257 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約257 mOsm/L至約258 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約258 mOsm/L至約259 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約260 mOsm/L至約261 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約261 mOsm/L至約262 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約262 mOsm/L至約263 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約263 mOsm/L至約264 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約264 mOsm/L至約265 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約220 mOsm/L至約280 mOsm/L之張力。

在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約100 mOsm/L、約125 mOsm/L、約150 mOsm/L、約175 mOsm/L、約200 mOsm/L、約210 mOsm/L、約220 mOsm/L、約225 mOsm/L、約230 mOsm/L、約235 mOsm/L、約240 mOsm/L、約245 mOsm/L、約250 mOsm/L、約255 mOsm/L、約260 mOsm/L、約265 mOsm/L、約270 mOsm/L或約275 mOsm/L之張力。

在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約250 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約262.26 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約259.7 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約257.5 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約257.2 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約255.2 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約254.7之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約255 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子，(ii)濃度在約40 mM至約80 mM之間的NaCl，及(iii)約250-260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度在約40 mM至約80 mM之間的鉀離子，(ii)濃度在約40 mM至約80 mM之間的NaCl，及(iii)約250-260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度在約40 mM至約80 mM之間的鉀離子，(ii)濃度在約55 mM至約90 mM之間的NaCl，及(iii)約250-260 mOsm/L之張力。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 mM鉀離子及(i)約80.5 mM NaCl；(ii)約24 mM葡萄糖；及(iii)約2.8 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約40 mM鉀離子及(i)約88.9 mM NaCl；(ii)約24 mM葡萄糖；及(iii)約2.8 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約60 mM鉀離子及(i)約72.2 mM NaCl；(ii)約24 mM葡萄糖；及(iii)約2.8 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及(i)約63.9 mM NaCl；(ii)約24 mM葡萄糖；及(iii)約2.8 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約80 mM鉀離子及(i)約55.6 mM NaCl；(ii)約24 mM葡萄糖；及(iii)約2.8 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 mM鉀離子及(i)約80.5 mM NaCl；(ii)約17.7 mM葡萄糖；及(iii)約1.9 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 mM鉀離子及(i)約80.5 mM NaCl；(ii)約17.7 mM葡萄糖；及(iii)約1.8 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約55 mM鉀離子及(i)約76 mM NaCl；(ii)約17.2 mM葡萄糖；及(iii)約1.7 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約60 mM鉀離子及(i)約72.2 mM NaCl；(ii)約16.8 mM葡萄糖；及(iii)約1.6 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及(i)約67.6 mM NaCl；(ii)約16.3 mM葡萄糖；及(iii)約1.5 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及(i)約63.9 mM NaCl；(ii)約15.9 mM葡萄糖；及(iii)約1.4 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及(i)約59.3 mM NaCl；(ii)約15.4 mM葡萄糖；及(iii)約1.3 mM鈣離子。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約80 mM鉀離子及(i)約55.6 mM NaCl；(ii)約15 mM葡萄糖；及(iii)約1.2 mM鈣離子。

可在任何時刻將代謝再編程培養基之張力調節至例如本文所揭示之等張或低張狀態。在一些態樣中，在將細胞添加至代謝再編程培養基中之前，可將代謝再編程培養基之張力調節至例如本文所揭示之等張或低張狀態。在一些態樣中，在細胞工程改造之前，例如在用表現CAR、TCR或TCR模擬物之構築體進行轉導之前，在低張或等張培養基中培養細胞。在一些態樣中，在細胞工程改造期間，例如在用表現CAR、TCR或TCR模擬物之構築體進行轉導期間，在低張或等張培養基中培養細胞。在一些態樣中，在細胞工程改造之後，例如在用表現CAR、TCR或TCR模擬物之構築體進行轉導之後，在低張或等張培養基中培養細胞。在一些態樣中，在整個細胞擴增中在低張或等張培養基中培養細胞。 II.A.4. 醣

本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度為至少約5 mM(例如高於5 mM，例如在約40 mM與約80 mM之間)之鉀離子及(ii)醣的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法。在一些態樣中，該培養基為低張或等張的。

在一些態樣中，藉由以包含較高濃度之醣的基礎培養基為起始物，且稀釋溶液以實現醣之標靶濃度來實現標靶醣濃度。在一些態樣中，藉由添加醣來升高醣之濃度，直至實現所需濃度，從而實現醣之標靶濃度。在一些態樣中，醣為單醣、二醣或多醣。在一些態樣中，醣係選自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或其任何組合。在某些態樣中，醣為葡萄糖。在一些態樣中，培養基包含(i)濃度至少約5 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，培養基包含(i)濃度至少約5 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，培養基包含(i)濃度至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。在一些態樣中，培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，培養基包含(i)濃度高於50 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，培養基包含(i)濃度至少約40 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，培養基包含(i)濃度至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約30 mM至至少約100 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約30 mM至至少約100 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於50 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約40 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。

在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約24 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度係低於約4.29 g/L。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度係低於約24 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度超過約5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約5 mM至約20 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約20 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約10 mM至約5 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約15 mM至約19 mM、約15 mM至約18 mM、約15 mM至約17 mM、約15 mM至約16 mM、約16 mM至約20 mM、約16 mM至約19 mM、約16 mM至約18 mM、約16 mM至約17 mM、約17 mM至約20 mM、約17 mM至約19 mM或約17 mM至約18 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約5 mM至約20 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約20 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約15 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約14 mM至約14.5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約14.5 mM至約15 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約15 mM至約15.5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約15.5 mM至約16 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約16 mM至約16.5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約16.5 mM至約17 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約17 mM至約17.5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約17.5 mM至約18 mM。

在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mM、約10.5 mM、約11 mM、約11.5 mM、約12 mM、約12.5 mM、約13 mM、約13.5 mM、約14 mM、約14.5 mM、約15 mM、約15.5 mM、約16 mM、約16.5 mM、約17 mM、約17.5 mM、約18 mM、約18.5 mM、約19 mM、約19.5 mM、約20 mM、約20.5 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM或約25 mM。

在一些態樣中，可用於本揭示案之培養基包含(i)濃度高於5 mM(例如，在約40 mM至約80 mM之間)之鉀離子，(ii)濃度在約40 mM至約80 mM之間的NaCl，及(iii)葡萄糖。在一些態樣中，可用於本揭示案之培養基包含(i)濃度高於5 mM(例如，在約40 mM至約80 mM之間)之鉀離子，(ii)濃度在約40 mM至約80 mM之間的NaCl，(iii)葡萄糖，及(iv)約250-260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，可用於本揭示案之培養基包含(i)濃度高於5 mM (例如，在約40 mM至約80 mM之間)之鉀離子，(ii)濃度在約40 mM至約80 mM之間的NaCl，(iii)濃度在約10 mM至約24 mM之間的葡萄糖，及(iv)約250-260 mOsm/L之張力。 II.A.5. 鈣

本揭示案之一些態樣係關於在包含(i)濃度為至少約5 mM(例如高於5 mM，例如在約40 mM與約80 mM之間)之鉀離子及(ii)鈣離子的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法。在一些態樣中，該培養基為低張或等張的。

在一些態樣中，藉由以包含較高濃度之鈣離子的基礎培養基為起始物，且稀釋溶液以實現鈣離子之標靶濃度來實現標靶鈣濃度。在一些態樣中，藉由添加一或多種鈣鹽來提高鈣離子之濃度，從而實現標靶鈣濃度。鈣鹽之非限制性實例包括溴化鈣、碳酸鈣、氯化鈣、氰胺化鈣、氟化鈣、氫化鈣、氫氧化鈣、碘酸鈣、碘化鈣、硝酸鈣、亞硝酸鈣、草酸鈣、過氯酸鈣四水合物、磷酸二氫鈣、磷酸三鈣、硫酸鈣、硫氰酸鈣四水合物、羥基磷灰石或其任何組合。在一些態樣中，鈣鹽包含氯化鈣(CaCl ₂)。在一些態樣中，鈣鹽包含葡萄糖酸鈣。

在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於基礎培養基之濃度。在一些態樣中，鈣離子之濃度係高於基礎培養基之濃度。在一些態樣中，鈣離子之濃度超過約0.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約2.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約2.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約2.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.9 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.7 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.3 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.2 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.1 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.0 mM。

在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.4 mM至約2.8 mM、約0.4 mM至約2.7 mM、約0.4 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.0 mM、約1.0 mM至約2.0 mM、約1.1 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約2.0 mM、約1.3 mM至約2.0 mM、約1.4 mM至約2.0 mM、約1.5 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.0 mM、約1.7 mM至約2.0 mM、約1.8 mM至約2.0 mM、約0.8至約0.9 mM、約0.8至約1.0 mM、約0.8至約1.1 mM、約0.8至約1.2 mM、約0.8至約1.3 mM、約0.8至約1.4 mM、約0.8至約1.5 mM、約0.8至約1.6 mM、約0.8至約1.7 mM、約0.8至約1.8 mM、約0.8至約1.9 mM、約0.9至約1.0 mM、約0.9至約1.1 mM、約0.9至約1.2 mM、約0.9至約1.3 mM、約0.9至約1.4 mM、約0.9至約1.5 mM、約0.9至約1.6 mM、約0.9至約1.7 mM、約0.9至約1.8 mM、約0.9至約1.9 mM、約1.0至約1.1 mM、約1.0至約1.2 mM、約1.0至約1.3 mM、約1.0至約1.4 mM、約1.0至約1.5 mM、約1.0至約1.6 mM、約1.0至約1.7 mM、約1.0至約1.8 mM、約1.0至約1.9 mM、約1.1至約1.2 mM、約1.1至約1.3 mM、約1.1至約1.4 mM、約1.1至約1.5 mM、約1.1至約1.6 mM、約1.1至約1.7 mM、約1.1至約1.8 mM、約1.1至約1.9 mM、約1.2至約1.3 mM、約1.2至約1.4 mM、約1.2至約1.5 mM、約1.2至約1.6 mM、約1.2至約1.7 mM、約1.2至約1.8 mM、約1.2至約1.9 mM、約1.3至約1.4 mM、約1.3至約1.5 mM、約1.3至約1.6 mM、約1.3至約1.7 mM、約1.3至約1.8 mM、約1.3至約1.9 mM、約1.4至約1.5 mM、約1.4至約1.6 mM、約1.4至約1.7 mM、約1.4至約1.8 mM、約1.4至約1.9 mM、約1.5至約1.6 mM、約1.5至約1.7 mM、約1.5至約1.8 mM、約1.5至約1.9 mM、約1.6至約1.7 mM、約1.6至約1.8 mM、約1.6至約1.9 mM、約1.7至約1.8 mM、約1.7至約1.9 mM或約1.8至約1.9 mM。

在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.9 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.1 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.2 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM至約0.9 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.9 mM至約1.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM至約1.1 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.1 mM至約1.2 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.2 mM至約1.3 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.3 mM至約1.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.4 mM至約1.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.5 mM至約1.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.7 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.8 mM至約1.9 mM。

在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.6 mM、約0.7 mM、約0.8 mM、約0.9 mM、約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM或約2.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.7 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.9 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.1 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.2 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.3 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.7 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.9 mM。

在一些態樣中，可用於本揭示案之培養基包含：(i)濃度在約40 mM至約80 mM之間之鉀離子及(ii)濃度在約0.5 mM至約2.8 mM之間的鈣。在一些態樣中，培養基包含：(i)濃度在約40 mM至約80 mM之間之鉀離子，(ii)濃度在約40 mM至約80 mM之間的NaCl，及(iii)濃度在約0.5 mM至約2.8 mM之間的鈣。在一些態樣中，培養基包含：(i)濃度在約40 mM至約80 mM之間之鉀離子，(ii)濃度在約40 mM至約80 mM之間的NaCl，(iii)濃度在約10 mM至約24 mM之間的葡萄糖，及(iv)濃度在約0.5 mM至約2.8 mM之間的鈣。在一些態樣中，培養基包含：(i)濃度在約40 mM至約80 mM之間之鉀離子，(ii)濃度在約40 mM至約80 mM之間的NaCl，(iii)濃度在約10 mM至約24 mM之間的葡萄糖，(iv)濃度在約0.5 mM至約2.8 mM之間的鈣，及(v)約250-260 mOsm/L之張力。 II.A.6. 細胞介素

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含細胞介素。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。在一些態樣中，該培養基為高張的。在一些態樣中，細胞介素係選自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21及其任何組合。在一些態樣中，代謝再編程培養基不包含IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含IL-2及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含IL-2、IL-21及IL-15。

細胞介素可在任何時刻添加至培養基中。在一些態樣中，在將免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)添加至培養基中之前，將細胞介素添加至培養基中。在一些態樣中，在細胞工程改造之前，例如在用編碼配位體結合蛋白之構築體進行轉導之前，在包含(i)本文所揭示之濃度(例如高於5 mM，例如在約40 mM與約80 mM之間)之鉀及(ii)細胞介素的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在細胞工程改造期間，例如在用配位體結合蛋白進行轉導期間，在包含(i)本文所揭示之濃度(例如高於5 mM，例如在約40 mM與約80 mM之間)之鉀及(ii)細胞介素的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在細胞工程改造之後，例如在用編碼多肽配位體結合蛋白之構築體進行轉導之後，在包含(i)本文所揭示之濃度(例如高於5 mM，例如在約40 mM與約80 mM之間)之鉀及(ii)細胞介素的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在整個細胞擴增中，在包含(i)本文所揭示之濃度(例如高於5 mM，例如在約40 mM與約80 mM之間)之鉀及(ii)細胞介素的培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii)IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii)IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii)IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii)IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii)IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii)IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii)IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii)IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii)IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii)IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii)IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii)IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii)IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii)IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii)IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii)IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7及IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii)IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7及IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii)IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7及IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii)IL-2及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii)IL-2及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii)IL-2及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii)IL-7及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-7及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii)IL-7及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii)IL-15及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii)IL-15及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii)IL-15及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基為等張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基進一步包含NaCl，其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。

在一些態樣中，本文所述之代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)包含在約50 IU/mL至約500 IU/mL之間的IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL IL-2。

因此，在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約50 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約60 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約70 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約80 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約90 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約100 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約125 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約150 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約175 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約200 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約225 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約250 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約275 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約300 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約350 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約400 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約450 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約500 IU/mL IL-2。在一些態樣中，包含鉀離子及IL-2之代謝再編程培養基進一步包含濃度低於約115 nM之NaCl。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-2。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約2.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約3.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約4.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約6.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約7.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約8.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約9.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-2。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 ng/mL至約600 ng/mL、約50 ng/mL至約500 ng/mL、約50 ng/mL至約450 ng/mL、約50 ng/mL至約400 ng/mL、約50 ng/mL至約350 ng/mL、約50 ng/mL至約300 ng/mL、約100 ng/mL至約600 ng/mL、約100 ng/mL至約500 ng/mL、約100 ng/mL至約450 ng/mL、約100 ng/mL至約400 ng/mL、約100 ng/mL至約350 ng/mL、約100 ng/mL至約300 ng/mL、約200 ng/mL至約500 ng/mL、約200 ng/mL至約450 ng/mL、約200 ng/mL至約400 ng/mL、約200 ng/mL至約350 ng/mL、約200 ng/mL至約300 ng/mL、約250 ng/mL至約350 ng/mL、約300 ng/mL至約600 ng/mL、約300 ng/mL至約500 ng/mL、約300 ng/mL至約450 ng/mL、約300 ng/mL至約400 ng/mL、約300 ng/mL至約350 ng/mL、約250 ng/mL至約300 ng/mL或約275 ng/mL至約325 ng/mL IL-2。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 ng/mL、至少約60 ng/mL、至少約70 ng/mL、至少約80 ng/mL、至少約90 ng/mL、至少約100 ng/mL、至少約110 ng/mL、至少約120 ng/mL、至少約130 ng/mL、至少約140 ng/mL、至少約150 ng/mL、至少約160 ng/mL、至少約170 ng/mL、至少約180 ng/mL、至少約190 ng/mL、至少約200 ng/mL、至少約210 ng/mL、至少約220 ng/mL、至少約230 ng/mL、至少約240 ng/mL、至少約250 ng/mL、至少約260 ng/mL、至少約270 ng/mL、至少約280 ng/mL、至少約290 ng/mL、至少約300 ng/mL、至少約310 ng/mL、至少約320 ng/mL、至少約330 ng/mL、至少約340 ng/mL、至少約350 ng/mL、至少約360 ng/mL、至少約370 ng/mL、至少約380 ng/mL、至少約390 ng/mL、至少約400 ng/mL、至少約410 ng/mL、至少約420 ng/mL、至少約430 ng/mL、至少約440 ng/mL、至少約450 ng/mL、至少約460 ng/mL、至少約470 ng/mL、至少約480 ng/mL、至少約490 ng/mL、至少約500 ng/mL、至少約510 ng/mL、至少約520 ng/mL、至少約530 ng/mL、至少約540 ng/mL、至少約550 ng/mL、至少約560 ng/mL、至少約570 ng/mL、至少約580 ng/mL、至少約590 ng/mL或至少約600 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約60 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約70 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約73.6 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約75 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約80 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約90 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約100 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約200 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約400 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約500 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約600 ng/mL IL-2。

在一些態樣中，本文所述之代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)包含在約50 IU/mL至約500 IU/mL之間的IL-21。在一些態樣中，培養基包含約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL IL-21。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約50 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約60 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約70 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約80 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約90 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約100 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約125 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約150 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約175 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約200 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約225 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約250 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約275 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約300 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約350 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約400 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約450 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約500 IU/mL IL-21。在一些態樣中，包含鉀離子及IL-21之代謝再編程培養基進一步包含濃度低於約115 nM之NaCl。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-21。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約2.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約3.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約4.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約6.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約7.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約8.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約9.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約15 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約25 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約35 ng/mL IL-21。

在一些態樣中，本文所述之代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)包含在約500 IU/mL至約1,500 IU/mL之間的IL-7。在一些態樣中，培養基包含約500 IU/mL、約550 IU/mL、約600 IU/mL、約650 IU/mL、約700 IU/mL、約750 IU/mL、約800 IU/mL、約850 IU/mL、約900 IU/mL、約950 IU/mL、約1,000 IU/mL、約1,050 IU/mL、約1,100 IU/mL、約1,150 IU/mL、約1,200 IU/mL、約1,250 IU/mL、約1,300 IU/mL、約1,350 IU/mL、約1,400 IU/mL、約1,450 IU/mL或約1,500 IU/mL IL-7。

在一些態樣中，可用於本揭示案之代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約500 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約550 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約600 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約650 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約700 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約750 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約800 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約850 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約900 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約950 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,000 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,050 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,100 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,150 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,200 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,250 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,300 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,350 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,400 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,450 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,500 IU/mL IL-7。在一些態樣中，包含鉀離子及IL-7之代謝再編程培養基進一步包含濃度低於約115 nM之NaCl。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-7。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約2.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約3.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約4.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約6.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約7.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約8.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約9.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-7。

在一些態樣中，本文所述之代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)包含在約50 IU/mL至約500 IU/mL之間的IL-15。在一些態樣中，培養基包含約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL IL-15。

因此，在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約50 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約60 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約70 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約80 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約90 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約100 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約125 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約150 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約175 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約200 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約225 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約250 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約275 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約300 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約350 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約400 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約450 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約500 IU/mL IL-15。在一些態樣中，包含鉀離子及IL-15之代謝再編程培養基進一步包含濃度低於約115 nM之NaCl。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-15。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.2 ng/mL、至少約0.3 ng/mL、至少約0.4 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約0.6 ng/mL、至少約0.7 ng/mL、至少約0.8 ng/mL、至少約0.9 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約2.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約3.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約4.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約6.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約7.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約8.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約9.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基進一步包含NaCl，其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。

在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含超過40 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約45 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約55 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約60 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約65 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約70 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約75 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約80 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約85 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約90 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約70 mM鉀離子，(ii)約60 mM NaCl，(iii)約1.4 mM鈣，(iv)約16 mM葡萄糖，(v)約300 ng/mL IL-2，及(vi)約0.4 ng/mL IL-15。 II.A.7. 基礎培養基

在一些態樣中，基礎培養基包含平衡鹽溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最低必需培養基(GMEM)、α最低必需培養基(α MEM)、Iscove改良杜氏培養基(IMDM)、M199、OPTMIZER™ CTS™ T細胞擴增基礎培養基(ThermoFisher)、OPTMIZER™ Complete、IMMUNOCULT™ XF (STEMCELL™ Technologies)、 IMMUNOCULT™、AIM V、TEXMACS™培養基、 PRIME-XV ^®T細胞CDM、X-VIVO™ 15(Lonza)、 TRANSACT™ TIL擴增培養基或其任何組合。在一些態樣中，基礎培養基包含PRIME-XV T細胞CDM。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER™。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER™ Pro。在一些態樣中，基礎培養基不含血清。在一些態樣中，基礎培養基進一步包含免疫細胞血清替代物(ICSR)。例如，在一些態樣中，基礎培養基包含補充有ICSR之OPTMIZER™ Complete、補充有ICSR之AIM V、補充有ICSR之IMMUNOCULT ™ XF、補充有ICSR之RPMI、補充有ICSR之TEXMACS™或其任何組合。在特定態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER™ complete。

在一些態樣中，培養基(例如MRM)進一步包含約2.5%血清補充劑(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher)、2 mM L-麩醯胺酸、2 mM L-glutamax、MEM非必需胺基酸溶液、Pen-strep、20 µg/ml fungin™、丙酮酸鈉或其任何組合。在一些態樣中，培養基進一步包含O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，培養基進一步包含激酶抑制劑。

在一些態樣中，培養基進一步包含CD3促效劑。在一些態樣中，CD3促效劑為抗CD3抗體。在一些態樣中，抗CD3抗體包含OKT-3。

在一些態樣中，培養基進一步包含CD28促效劑。在一些態樣中，CD28促效劑為抗CD28抗體。在一些態樣中，培養基進一步包含CD27配位體(CD27L)。在一些態樣中，培養基進一步包含4-1BB配位體(4-1BBL)。

在一些態樣中，本揭示案包括包含本文所揭示之培養基的細胞培養物、包含本文所揭示之培養基的細胞袋或包含本文所揭示之培養基的生物反應器。 II.B. 細胞之來源及活化

本揭示案之免疫細胞(其可經修飾且使用本文所述之方法而培養，包括原代T細胞)可獲自多種組織來源，包括外周血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、胸膜積水、脾組織及/或腫瘤組織。可藉由熟知技術，例如FICOLL™分離及白血球分離術自其他血球分離白血球，包括PBMC。白血球分離術產品通常含有淋巴細胞(包括T及B細胞)、單核細胞、顆粒球及其他有核白血球。可進一步自其他白血球分離T細胞，例如藉由經由PERCOLL™梯度離心或藉由逆流離心淘析。可進一步藉由陽性或陰性選擇技術(例如，使用基於螢光或基於磁性之細胞分選)來分離T細胞之特定亞群，諸如CD3 ⁺、CD25 ⁺、CD28 ⁺、CD4 ⁺、CD8 ⁺、CD45RA ⁺、GITR ⁺及/或CD45RO ⁺T細胞。例如，可藉由用多種市售抗體結合之珠粒中的任一種，諸如Dynabeads®、CELLection™、DETACHaBEAD™(Thermo Fisher)或MACS®細胞分離產品(Miltenyi Biotec)培育，持續足以對所需T細胞進行陽性選擇或足以進行陰性選擇以移除不想要的細胞之一段時期來分離T細胞。

在一些情況下，在癌症治療之後直接自癌症患者獲得自體T細胞。據觀察，在某些癌症治療、尤其損害免疫系統之彼等治療之後，治療之後不久所收集的T細胞之品質可具有改良能力以進行離體擴增及/或在離體經工程改造之後進行植入。

無論在遺傳修飾(例如，使用任何本文所述之修飾方法)之前或之後，通常可使用如例如美國專利5,858,358；5,883,223；6,352,694；6,534,055；6,797,514 ；6,867,041；6,692,964；6,887,466；6,905,680； 6,905,681；6,905,874；7,067,318；7,144,575；7,172,869 ；7,175,843；7,232,566；7,572,631；及10,786,533中所述之方法來活化且擴增T細胞，該等美國專利中之每一者均明確地以引用之方式整體併入本文中。通常，可藉由與附著有刺激CD3/TCR複合物相關信號之劑及刺激T細胞表面上的共刺激分子之配位體之表面接觸而在活體外或離體擴增T細胞。在一些態樣中，諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段或者固定在表面上之抗CD3抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化劑(例如，苔蘚蟲素)以及鈣離子載體接觸，可刺激T細胞群體。為了共刺激在T細胞表面上之輔助分子，可使用結合該輔助分子之配位體。例如，可使T細胞群體在適合刺激T細胞增殖之條件下與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸。為了刺激CD4 ⁺T細胞或CD8 ⁺T細胞之增殖，可使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。在一些態樣中，使用例如DYNABEADS™或商業奈米粒子，例如 TRANSACT™(Miltenyi Biotech)或其他已知活化劑來活化且擴增T細胞。

在一些態樣中，本文所述之方法包括使人類免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞，經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白)與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基(例如，代謝再編程培養基)中接觸，如本文所述。可編程細胞信號傳導支架(PCS)之非限制性實例描述於WO2018/013797及Chung等人( Nature Biotechnology36(2): 160-169 (2018)中，該等文獻之內容以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，本揭示案之可編程細胞信號傳導支架包括第一層，其包括高表面積介孔二氧化矽微棒(MSR)；第二層，其包括塗覆該第一層之脂質；以及負載於該支架上之複數種功能分子。在一些態樣中，該等功能分子包括但不限於活化T細胞之刺激分子(T細胞活化分子)。在一些態樣中，刺激分子藉由銜接及/或叢集T細胞受體複合物之組分來活化T細胞。在一些態樣中，刺激分子包含抗CD3抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，功能分子包括一或多種與一或多種共刺激抗原特異性結合之共刺激分子。共刺激分子之代表性實例包括但不限於與CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27 (TNFRSF7)、GITR (CD357)及/或CD30 (TNFRSF8)特異性結合之分子。此類支架能夠模擬通常與抗原呈遞細胞(APC)相關之功能，這允許該等支架在標靶細胞上引發各種功能，例如引發T細胞之效應子功能。如本文所預期，在一些態樣中，該等支架經由存在於標靶細胞(例如，T細胞)中之細胞表面分子與由該等支架呈遞之各種功能分子之間的直接或間接相互作用來介導此等效應。在一些態樣中，支架經由支架自身之物理或化學特徵來調節標靶細胞(例如，T細胞)之存活、標靶細胞(例如，T細胞)之生長及/或標靶細胞(例如，T細胞)之功能。 II.C. 細胞

本揭示案亦提供一種經修飾細胞，如與參考細胞(例如，未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應細胞)相比，其表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun多肽。在一些態樣中，細胞未天然表現c-Jun蛋白，但已經修飾以表現c-Jun蛋白。在一些態樣中，細胞天然地能夠表現c-Jun蛋白，但已經修飾以增加內源c-Jun蛋白之表現。除非另有指示，否則「c-Jun過表現」(或其派生詞)包含兩種此類經修飾細胞。如本文所述，此項技術中已知之任何合適方法均可用於修飾本文所述之細胞。

在一些態樣中，可用於本揭示案之細胞已經修飾以包含編碼相關蛋白質之外源核苷酸序列，使得所編碼之蛋白質在該細胞中表現。如本文所述，在一些態樣中，在修飾之後，與參考細胞(例如，未經修飾為包含外源核苷酸序列之相應細胞)相比，所編碼之蛋白質的表現增加。在一些態樣中，本文所述之細胞已經修飾以包含多個編碼不同的相關蛋白質(例如，ROR1結合蛋白、c-Jun多肽及/或EGFRt)之外源核苷酸序列。在涉及多個外源核苷酸序列之情況下，在一些態樣中，多個外源核苷酸序列可為單一多順反子聚核苷酸之一部分。

在一些態樣中，本文所述之細胞已經轉錄活化子修飾，該轉錄活化子能夠誘導及/或增加相關蛋白質(例如，c-Jun)在該細胞中之內源表現。如本文所述，在一些態樣中，在修飾之後，與參考細胞(例如，未經轉錄活化子修飾之相應細胞)相比，該蛋白質之內源表現增加。如本文所用，術語「轉錄活化子」係指增加基因或基因集合之轉錄(例如，藉由結合至核酸序列之增強子或啟動子近端元件，且由此誘導其轉錄)之蛋白質。可與本揭示案一起使用之該等轉錄活化子之非限制性實例包括：基於轉錄活化子樣效應子(TALE)之轉錄活化子、基於鋅指蛋白(ZFP)之轉錄活化子、基於成簇規則間隔之短迴文重複序列(CRISPR)/CRISPR相關蛋白(Cas)系統之轉錄活化子或其組合。參見例如Kabadi等人， Methods69(2): 188-197 (2014年9月)，其以引用之方式整體併入本文中。

在一些態樣中，本文所述之細胞已用基於 CRISPR/Cas系統之轉錄活化子(例如CRISPR活化(CRISPRa))修飾。參見例如Nissim等人， Molecular Cell54: 1-13(2014年5月)，其以引用之方式整體併入本文中。CRISPRa係一種類型之CRISPR工具，其包含使用缺乏核酸內切酶活性、但保留結合至其指導RNA及標靶DNA核酸序列之能力的經修飾Cas蛋白。可與本揭示案一起使用之該等經修飾Cas蛋白之非限制性實例為此項技術中已知的。參見例如Pandelakis等人， Cell Systems10(1): 1-14 (2020年1月)，其以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，經修飾Cas蛋白包含經修飾之Cas9蛋白(在此項技術中亦稱為「dCas9」)。在一些態樣中，經修飾Cas蛋白包含經修飾之Cas12a蛋白。在一些態樣中，可用於本揭示案之經修飾Cas蛋白結合至指導聚核苷酸(例如，小指導RNA) (「經修飾Cas-指導複合物」)，其中該指導聚核苷酸包含與編碼相關蛋白質(例如，c-Jun)之核酸序列區域互補的識別序列。在一些態樣中，該指導聚核苷酸包含與編碼相關蛋白質之內源核酸序列之啟動子區域互補的識別序列。在一些態樣中，一或多種轉錄活化子連接至經修飾Cas-指導複合物(例如，經修飾Cas蛋白之N末端及/或C末端)，使得當將經修飾Cas-指導複合物引入細胞中時，一或多種轉錄活化子可結合至核酸序列之調節元件(例如，啟動子區域)，且由此誘導及/或增加所編碼蛋白質(例如，c-Jun)之表現。在一些態樣中，一或多種轉錄活化子可結合至內源基因之調節元件(例如，啟動子區域)，且由此誘導及/或增加所編碼蛋白質(例如，c-Jun)之表現。可使用的常見一般活化劑之非限制性說明性實例包括RNAP之ω亞單元、VP16、VP64及p65。參見例如Kabadi及Gersbach, Methods69: 188-197 (2014)，其以引用之方式整體併入本文中。

在一些態樣中，一或多種轉錄抑制物(例如，Kruppel相關盒結構域(KRAB))可連接至經修飾Cas-指導複合物(例如，經修飾Cas蛋白之N末端及/或C末端)，使得當引入細胞中時，一或多種轉錄抑制物可抑制或減少基因(例如，可干擾c-Jun表現之彼等基因(例如，Bach2))的轉錄。參見例如US20200030379A1及Yang等人， J Transl Med19:459 (2021)，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，可用於本揭示案之經修飾Cas蛋白可連接至一或多種轉錄活化子及一或多種轉錄抑制物。

不欲受任一理論束縛，在一些態樣中，使用此類經修飾Cas蛋白可允許相關基因之條件轉錄及表現。例如，在一些態樣中，細胞(例如，T細胞)係經修飾以包含配位體結合蛋白(例如，抗ROR1 CAR)，該配位體結合蛋白連接至蛋白酶(例如，煙草蝕刻病毒(TEV))及靶向c-Jun啟動子區域之單一指導RNA (sgRNA)。在一些態樣中，該細胞係經修飾以進一步包含用於活化T細胞之連接體(LAT)，該連接體與經由連接體(例如，TEV-可裂解連接體)連接至轉錄活化子(例如，dCas9-VP64-p65-Rta轉錄活化子(VPR))之經修飾Cas蛋白複合。在配位體結合蛋白之活化後，經修飾Cas蛋白經釋放用於細胞核定位，且有條件地且可逆地誘導c-Jun之表現。Yang等人， J Immunother Cancer9 (增刊2): A164 (2021)，其以引用之方式整體併入本文中。

如熟習此項技術者應明瞭，在一些態樣中，本文所述之細胞已使用多種方法之組合進行修飾。例如，在一些態樣中，細胞已經修飾以包含(i)編碼一或多種蛋白質(例如，ROR1結合蛋白及EGFRt)之外源核苷酸序列，及(ii)增加內源蛋白(例如，c-Jun)之表現的外源轉錄活化子(例如，CRISPRa)。在一些態樣中，細胞已經修飾以包含(i)編碼第一蛋白質(例如，ROR1結合蛋白)之外源核苷酸序列，及(ii)編碼第二蛋白質(例如，c-Jun蛋白)之外源核苷酸序列。在一些態樣中，經修飾細胞可進一步包含編碼第三蛋白質(例如，EGFRt)之外源核苷酸序列。如本文所述，在一些態樣中，編碼第一、第二及第三蛋白質之外源核苷酸序列可為單一多順反子載體之一部分。

除非另有指示，否則可使用此項技術中已知之任何合適方法將一或多個外源核苷酸序列及/或轉錄活化子引入細胞中。用於將一或多個外源核苷酸序列遞送至細胞之合適方法的非限制性實例包括：轉染(亦稱為轉化及轉導)、電穿孔、非病毒遞送、病毒轉導、脂質奈米粒子遞送及其組合。

在一些態樣中，自人類個體分離本揭示案之免疫細胞(其可使用本文所述之方法進行修飾及培養)，例如在活體外或離體培養之前。在一些態樣中，自人類個體分離免疫細胞以用於同種異體細胞療法。在一些態樣中，自人類個體分離免疫細胞以用於自體細胞療法。在一些態樣中，該等免疫細胞為T細胞(例如，CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞)。在一些態樣中，該等免疫細胞為NK細胞。在一些態樣中，該等免疫細胞為Treg。

在一些態樣中，細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在根據本文所揭示之方法培養之前經工程改造。在一些態樣中，細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在根據本文所揭示之方法培養之後經工程改造。在一些態樣中，細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在細胞工程改造之前、期間及之後根據本文所揭示之方法，例如在包含至少5 mM鉀離子(例如高於5 mM，例如在約40 mM至約80 mM之間)之低張或等張培養基中進行培養。在一些態樣中，細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係經工程改造以表現經工程改造之T細胞受體(TCR)。在某些態樣中，在本文所揭示之條件下，例如在包含至少約5 mM鉀離子之低張或等張培養基中培養細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)導致更高轉導效率。在一些態樣中，如與在包含4 mM或更少鉀離子之培養基中培養的細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)相比，根據本文所揭示之方法在包含至少約60 mM鉀離子之低張或等張培養基中培養的細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)中之轉導效率為至少約2倍高。在一些態樣中，如與在包含4 mM或更少鉀離子之培養基中培養的細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)相比，根據本文所揭示之方法在包含至少約65 mM鉀離子之低張或等張培養基中培養的細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)中之轉導效率為至少約2.5倍高。

如由本揭示案顯而易見，在一些態樣中，可用於本揭示案之免疫細胞(例如，經修飾且使用本文所提供之方法進行培養)包含此項技術中已知之任何合適免疫細胞。此外，如本揭示案中別處進一步描述，本揭示案之免疫細胞已經修飾，使得其不同於自然界中天然存在之相應免疫細胞。例如，本文所述之免疫細胞已經修飾以表現一或多種有助於賦予免疫細胞獨特特性之蛋白質。特定言之，在一些態樣中，與參考細胞(例如，未如本文所述經修飾之相應免疫細胞)相比，本文所提供之經修飾免疫細胞表現增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞亦表現未在該等免疫細胞中天然地表現之嵌合結合蛋白(例如，CAR)。如由本揭示案顯而易見，在一些態樣中，可藉由用編碼嵌合結合蛋白之外源聚核苷酸修飾細胞而在該細胞中表現該嵌合結合蛋白(例如，ROR1結合蛋白)。可由外源聚核苷酸編碼且因此在免疫細胞中表現之額外蛋白質在本揭示案中別處加以描述。下文提供與此類聚核苷酸有關之非限制性揭示內容。 II.C.1. ROR1 結合蛋白

如由本揭示案顯而易見，本文所述之細胞(例如免疫細胞，例如在MRM中培養)係經修飾以包含編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列。因此，在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾之相應細胞，諸如自然界中天然存在之彼等細胞)相比，本文所述之細胞已經修飾以表現ROR1結合蛋白(例如，藉由轉導該等細胞以包含編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列)。在一些態樣中，與參考細胞相比，ROR1結合蛋白之表現增加至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約12倍、至少約14倍、至少約16倍、至少約18倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。

如本文所用，術語「ROR1結合蛋白」係指可特異性結合至ROR1蛋白之任何蛋白質(例如，抗體或其抗原結合片段)，或其片段(例如，在腫瘤細胞或肽/MHC複合物上表現)。在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含抗體、經工程改造之抗體(諸如scFv)、CAR、經工程改造之TCR、TCR模擬物(例如，抗體-T細胞受體(abTCR)或嵌合抗體-T細胞受體(caTCR))或嵌合信號傳導受體(CSR)。在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含ROR1之天然配位體。關於此類ROR1結合蛋白之額外揭示內容進一步提供於下文。在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含抗體或其片段，其包含以下文獻中所述之2A2、R11及R12抗ROR1單株抗體之VH及/或VL序列：例如，Hudecek等人，Clin. Cancer Res. 19(12):3153-64 (2013)；Baskar等人，MAbs 4:349-61 (2012)；Yang等人，PLoS ONE 6:e21018(2011)； US 9,316,646 B2；及US 9,758,586 B2，其以引用之方式整體併入本文中。例如，在一些態樣中，ROR1結合蛋白能夠與抗ROR1抗體(例如，R12抗體)交叉競爭。R12抗體序列顯示於表14中。

在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含以下文獻中所揭示之任何抗ROR1結合蛋白(例如，抗ROR1抗體)之VH及/或VL序列(或一或多個CDR序列)：例如， WO2019225992A1(例如，AB4、A2F2、A2F3、BA6、CC9、C2E3、DG6、D2B12、A2F2 M1及BA6 M1；例如，SEQ ID NO: 43-58)；US20210317204A1(例如，SEQ ID NO: 45-59)；WO2022129622A1(例如，B1、B1G4、1E2、1E5、1B11、C3CP、2G5、1G12、G5CP、2F4、1G9、1H8、G11CP、D9CP、1B6、1F10、E6CP、F2CP、B6CP、1G1、A10CP、G3CP、G3CP G4、G3CP V15、1H8 G4、1H8 V15、C3CP G4、C3CP V15、P3A1 G1，包括變異體；參見表1及表2中之序列)；WO2022020388A1(例如，SEQ ID NO: 641-644及641-744)；US20200338210A1 (例如，m2A2、h2A2及Y31；SEQ ID NO: 1、2、9、10、36及37)；US20190153092A1(例如，2A2、hu2A2B、rbQ11、rbD4、rbQ12、huR12_4、huR12_7、huR12_11及huR12_16；SEQ ID NO: 7-14、21-28及35-44)；WO2021048564A2(例如，1D4、3F6、4E2、5D2、8B2、8B3及9G1；SEQ ID NO: 7、8、15、16、23、24、31、32、39、40、47、48、55及56)；WO2022029431A1(例如，SEQ ID NO: 5)；WO2017156479A1(例如，抗ROR1 CAR24 - SEQ ID NO: 146；SEQ ID NO: 7、8、15、16、23、24、31、32、39、40、47、48、55、56、63、64、71、72、79、80、87、88、95、96、103、104、111、112、119及120)；US20180147271A1(例如，SEQ ID NO: 7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207、215、223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352及360)；US10752684B2(例如，2A2、4A5、D10、G6、G3、H10、2A4及1C11；SEQ ID NO: 11、15、19、23、27、32、37、41、45、49、53、58、63、67、71及75)；US10759868B2(例如，H8、A1、A2及A3；SEQ ID NO: 11-18)；WO2021190629A1(例如，抗體#1、11、32、101、103、115、140及162)；US20200157174A1(例如，SEQ ID NO: 105、113、121、129、137、145、153、109、117、125、133、141、149及157)；US20200255521A1(例如，SEQ ID NO: 2-9)；US20170306018A1(例如，MAB1、MAB2、MAB3及MAB4；SEQ ID NO: 2、6及42-47)；WO2022042488A1(例如mAb004，包括人類化變異體；SEQ ID NO: 8-20)；WO2022026759A1(例如，SEQ ID NO: 450、454、458及462)；US20210155692A1(例如，I2A-3、I2A-4、I2A-6、I2-A8、I2-A12、I2-A20、I2-A25、I2-A26、I2-A27、I2-A30、I2-A32、I2-A33及I2-A37；表6中所提供之序列)；US11155615B2(例如，601-147、601-149、601-28、601-37、601-4、601-5、601-50、601-65、601-66、601-70、601-87及601-9；表6及表7中所提供之序列)； US10968275B2(例如，SEQ ID NO: 12-16)； US20210145882A1(例如，2A2、R12、R11、Y31、UC-961、D10及H10；SEQ ID NO: 1-45)；EP4039707A1(例如，PR000374；SEQ ID NO: 84及85)；WO2021115497A2 (例如，1015M2-H4；SEQ ID NO: 63及71)； WO2022048581A1(例如，SEQ ID NO: 93-134及186-197)；US20220195041A1(例如，SEQ ID NO: 156及166)；WO2021057822A1(例如，C3、G3及G6；SEQ ID NO: 1、5、15、19、29及33)；WO2022150831A1(例如，SEQ ID NO: 34-36及256-270)；US20210177902A1(例如，SEQ ID NO: 15-74)；US10889652B2(例如，純系83B、83、305、298、350、20、16、48、43、366、40、461、65、81及7；表3B中所提供之序列)；US20220168344A1(例如，SEQ ID NO: 152-157)；US10647768B2(例如，SEQ ID NO: 51及52)；WO2022152168A1 (例如，SEQ ID NO: 24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92及93)； WO2020026987A1(例如，SEQ ID NO: 17及22)；US20190153092A1(例如，SEQ ID NO: 9-44)；US20210139579A1(例如，SEQ ID NO: 20、21、4、5、8、9、22、23、2及3)；US10758556B2(例如，SEQ ID NO: 4及5)；US2021379194A1(例如，SEQ ID NO: 1、2、20及21)；US10618959B2(SEQ ID NO: 130-141)； WO2022084440A2(例如，SEQ ID NO: 212-214及221-223)；WO2022167460A1 (例如，SEQ ID NO: 7-12及20-29)；US9228023B2(例如，A1-A14；SEQ ID NO: 1-14、29-42、268及270)；WO2021202863A1(例如，SEQ ID NO: 3及4)；US2021277109A1(例如，226E12、323H7、324C7、323D10、324E2、324C6、338H4及330F11；SEQ ID NO: 4、8、12、16、20、24、28、32、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128及132)； US2019276540A1(例如，SEQ ID NO: 65、69及79)； US20200405759A1(例如，SEQ ID NO: 3-14)； US9938350B2(例如，SEQ ID NO: 1及2)；US11312787B2 (例如，SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及27-32)；US20190112380A1(例如，SEQ ID NO: 454、455、755及756)；EP3548055A2(例如，參見表6及表7中之例示性序列)；US20210137977A1(例如，SEQ ID NO: 9699、9637、9638及11145-11193)；WO2021188599A1 (例如，SEQ ID NO: 19065-19133)；US2021253729A1(例如，SEQ ID NO: 24-26)；US20220152214A1(例如，Ab1；SEQ ID NO: 3及4)；US20220227866A1(例如，Ab2、Ab3、Ab6、Ab7；SEQ ID NO: 72-75、100及103)； WO2021159029A1；WO2022011075A1； US20220133901A1；其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。

受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)係受體酪胺酸激酶樣孤兒受體(ROR)家族之成員。其亦稱為神經營業酪胺酸酶激酶受體相關1 (NTRKR1)。人類胺基酸及核酸序列可見於公開數據庫，諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot。例如，人類ROR1之同功型1及2前驅體之胺基酸序列分別可見於寄存編號NP_005003.2及NP_001077061.1處，且編碼該等序列之mRNA序列分別可見於寄存編號NM_005012.3及NM_001083592.1處。如本文所用，「ROR1」包括包含全長野生型ROR1之突變(例如，點突變、片段、插入、缺失及剪接變異體)之蛋白質。

ROR1已經描述為在包括三陰性乳癌(TNBC)及非小細胞肺癌(NSCLC)腺癌在內之各種癌症中過表現。Balakrishnan等人， Clin Cancer Res23: 3061-3071 (2017)。受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1陽性(ROR1 ⁺)實體腫瘤可由抗ROR1 CAR T細胞安全地靶向(Specht等人，2019 Cancer Res(79) (4增刊)P2-09-13)；然而，功效已部分地受到限制，因為在患有實體腫瘤惡性病之患者中輸注後，CAR T細胞展現耗竭或功能障礙。此外，實體腫瘤具有免疫抑制性障礙，該等障礙限制免疫療法(諸如CAR T細胞)之抗腫瘤活性(Newick 2016, Srivastava 2018, Martinez 2019)。 嵌合抗原受體 (CAR)

如本文所述，在一些態樣中，可用於本揭示案之ROR1結合蛋白包含CAR。因此，在一些態樣中，可使用本文所提供之方法進行培養的免疫細胞已經修飾以表現CAR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞為CD8+ T細胞且表現CAR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞為CD4+ T細胞且表現CAR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，該等免疫細胞包含CD8+ T細胞及CD4+ T細胞，其中CD8+ T細胞及CD4+ T細胞各自表現CAR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，本文所揭示之表現CAR之細胞為CAR T細胞，例如單CAR T細胞、基因體編輯之CAR T細胞、雙CAR T細胞或串聯CAR T細胞。此類CAR T細胞之實例提供於國際公開案第WO2020028400號中，該國際公開案以引用之方式整體併入本文中。

在一些態樣中，CAR (例如，其可與c-Jun蛋白組合表現)係經設計為標準CAR。在「標準CAR」中，不同組分(例如，細胞外靶向結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導/活化結構域)係經線性構築為單一融合蛋白。在一些態樣中，CAR係經設計為第一代CAR。「第一代」CAR由細胞外結合結構域、鉸鏈區、跨膜結構域及一或多個細胞內信號傳導結構域構成。所有第一代CAR均含有CD3ζ鏈結構域作為細胞內信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR係經設計為第二代CAR。「第二代」CAR另外含有共刺激結構域(例如，CD28或4-1BB)。在一些態樣中，CAR係經設計為第三代CAR。「第三代」CAR與第二代CAR相似，除了其含有多個共刺激結構域(例如，CD28-4-1BB或CD28-OX40)。在一些態樣中，CAR係經設計為第四代CAR。「第四代」CAR (亦稱為TRUCK或裝甲CAR)另外含有可進一步改良功能之額外因素。例如，在一些態樣中，第四代CAR另外含有細胞介素，該等細胞介素可在靶向腫瘤組織中之CAR信號傳導後釋放。在一些態樣中，第四代CAR包含一或多種額外元件，諸如歸巢及自殺基因，該等額外元件可幫助進一步調節CAR之活性。在一些態樣中，CAR係經設計為分裂CAR。在「分裂CAR」系統中，CAR之一或多種組分(例如，細胞外靶向結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導/活化結構域)分裂成兩個或更多個部分，使得其依賴於促進完整功能性受體組裝之多個輸入。在一些態樣中，CAR係經設計為可切換CAR。對於「可切換CAR」，CAR可在刺激物存在下(例如，瞬時地)接通(接通CAR)或斷開(斷開CAR)。可與本揭示案一起使用之CAR的額外實例描述於例如US 2020/0172879 A1及US 2019/0183932 A1中，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。 經工程改造之 T 細胞受體

在一些態樣中，可與本揭示案一起使用之ROR1結合蛋白包含經工程改造之T細胞受體(TCR) (此項技術中亦稱為「轉殖基因」TCR)。如本文所用，術語「經工程改造之TCR」或「經工程改造之T細胞受體」係指T細胞受體(TCR)經分離或經工程改造，以所需親和力特異性結合於主要組織相容性複合物(MHC)/肽標靶抗原，且經引入至免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)群體中。

因此，在一些態樣中，可使用本文所提供之方法進行培養的免疫細胞已經修飾以表現轉殖基因TCR及增加水準之c-Jun蛋白。例如，在一些態樣中，免疫細胞包含CD8+ T細胞且表現轉殖基因TCR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞包含CD4+ T細胞且表現轉殖基因TCR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞包含CD8+ T細胞及CD4+ T細胞，其中CD8+ T細胞及CD4+ T細胞各自包含轉殖基因TCR且表現增加水準之c-Jun蛋白。

TCR為T細胞表面上可見之分子，其負責將抗原片段識別為結合於主要組織相容性複合物(MHC)分子之肽。TCR係由兩條不同蛋白質鏈構成之異二聚體。在一些態樣中，TCR由α(alpha)鏈及β(beta)鏈(分別由 TRA及 TRB編碼)組成。在一些態樣中，TCR由γ及δ(γ/δ)鏈(分別由 TRG及 TRD編碼)組成。當TCR與由MHC分子呈遞之抗原肽(肽/MHC)銜接時，T淋巴細胞經由信號轉導經活化。在某些態樣中，本文所述之經工程改造之TCR包含通常由β鏈可變區之至少一部分及α鏈可變區之至少一部分構成的抗原結合結構域，其中該抗原結合結構域對ROR1肽/MHC複合物具特異性或特異性結合於ROR1肽/MHC複合物。

在某些實施例中，經工程改造之TCR為I類MHC限制性的。在另一實施例中，經工程改造之TCR為II類MHC限制性的。在某些實施例中，經工程改造之TCR識別ROR1肽:MHC複合物。在某些實施例中，經工程改造之TCR包含跨膜結構域及促進至少一種TCR相關信號傳導分子之募集的TCR結構域。在一些實施例中，經工程改造之TCR進一步包含一或多個TCR源性恆定結構域，例如CH1及CL。 T 細胞受體模擬物 (TCRm)

在一些態樣中，可用於修飾免疫細胞之ROR1結合蛋白包含T細胞受體模擬物(TCR模擬物)。如本文所用，術語「T細胞受體模擬物」或「TCR模擬物」係指已經工程改造以識別腫瘤抗原之抗體(或其片段)，其中腫瘤抗原在HLA分子之背景下呈現。如熟習此項技術者應明瞭，此等抗體可模擬TCR之特異性。TCR模擬物之非限制性實例提供於例如US 2009/0226474 A1； US 2019/0092876 A1；及Traneska等人， Front. Immunol.8 (1001):1-12 (2017)中，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，TCR模擬物包含(i)特異性結合至相關肽:MHC複合物之抗體部分，及(ii)能夠募集至少一種TCR相關信號傳導分子之T細胞受體模塊。在一些態樣中，TCR模擬物包含(i)特異性結合至相關肽:MHC複合物之抗體部分，及(ii)跨膜結構域、一或多個細胞內信號傳導結構域(例如，CD3ζ鏈結構域)及視情況選用之一或多個共刺激結構域(例如，CD28或4-1BB)。

因此，在一些態樣中，可使用本文所提供之方法進行培養的免疫細胞已經修飾以表現TCR模擬物及增加水準之c-Jun蛋白(例如，經一或多個編碼c-Jun蛋白及TCR模擬物之外源核苷酸序列轉導)。在一些態樣中，免疫細胞包含CD8+ T細胞且表現TCR模擬物及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞包含CD4+ T細胞且表現TCR模擬物及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞包含CD8+ T細胞及CD4+ T細胞，其中CD8+ T細胞及CD4+ T細胞各自表現TCR模擬物及增加水準之c-Jun蛋白。

在一些態樣中，TCR模擬物包含嵌合抗體-T細胞受體(caTCR)。如本文所用，「嵌合抗體-T細胞受體」或「caTCR」包含(i)特異性結合至相關抗原之抗體部分，及(ii)能夠募集至少一種TCR相關信號傳導分子之T細胞受體模塊。在一些態樣中，該抗體部分及該T細胞受體模塊融合在一起。關於可用於本揭示案之caTCR之額外揭示內容提供於例如US 10,822,413 B2；及Xu等人， Cell Discovery 4:62 (2018)中，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。

因此，在一些態樣中，可使用本文所提供之方法進行培養的免疫細胞已經修飾以表現caTCR及增加水準之c-Jun蛋白(例如，經一或多個編碼c-Jun多肽及caTCR之外源核苷酸序列轉導)。在一些態樣中，經修飾以表現caTCR及增加水準之c-Jun蛋白的免疫細胞係進一步經修飾以表現嵌合共刺激受體。在一些態樣中，本文所提供之免疫細胞(諸如T細胞)表現增加水準之c-Jun蛋白且包含：caTCR及嵌合共刺激受體，該嵌合共刺激受體包含：i)配位體結合模塊，其能夠與標靶配位體結合或相互作用；ii)跨膜模塊；及iii)能夠向免疫細胞提供共刺激信號之共刺激免疫細胞信號傳導模塊，其中該配位體結合模塊及該共刺激免疫細胞信號傳導模塊並非源自同一分子，且其中該嵌合共刺激受體缺乏功能性初級免疫細胞信號傳導結構域。在一些態樣中，該嵌合共刺激受體包含與腫瘤抗原結合之配位體結合模塊。例示性嵌合共刺激受體描述於例如US 10,822,413中，其以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，本文所述之免疫細胞包含CD8+ T細胞且表現caTCR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞包含CD4+ T細胞且表現caTCR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞包含CD8+ T細胞及CD4+ T細胞，其中CD8+ T細胞及CD4+ T細胞各自表現caTCR及增加水準之c-Jun蛋白。 嵌合信號傳導受體 (CSR)

在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含嵌合信號傳導受體(CSR)。「嵌合信號傳導受體」或「CSR」包含特異性結合至標靶配位體之配位體結合結構域及能夠將刺激信號提供至表現CSR之免疫細胞的共刺激信號傳導結構域。嵌合信號傳導受體可包含(1)細胞外結合結構域(例如，天然/經修飾之受體細胞外結構域、天然/經修飾之配位體細胞外結構域、scFv、奈米抗體、Fab、DARPin及親和體)，(2)跨膜結構域，及(3)細胞內信號傳導結構域(例如，活化轉錄因子，或募集及/或活化JAK/STAT、激酶、磷酸酶及泛素之結構域；SH3；SH2；及PDZ)。參見例如EP340793B1、US 2021/0253665 A1、US 10,822,413 B2及Xu等人， Cell Discovery4:62 (2018)，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。

在一些態樣中，可使用本文所提供之方法進行培養的免疫細胞(例如，經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白)表現嵌合信號傳導受體。在一些態樣中，免疫細胞包含CD8+ T細胞且表現CSR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞包含CD4+ T細胞且表現CSR及增加水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中，免疫細胞包含CD8+ T細胞及CD4+ T細胞，其中CD8+ T細胞及CD4+ T細胞各自表現CSR及增加水準之c-Jun蛋白。 抗原結合結構域

如本文所述，可用於本揭示案之ROR1結合蛋白(例如，CAR、TCR、caTCR、CSR或TCR模擬物)包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激結構域、細胞內信號傳導結構域或其組合。關於跨膜結構域、共刺激結構域及細胞內信號傳導結構域之額外揭示內容提供於本揭示案中別處。

如本揭示案中別處進一步描述，ROR-1結合蛋白(例如，CAR、TCR、caTCR、CSR或TCR模擬物)之抗原結合結構域可為能夠結合ROR1(包括其片段或變異體)之任何多肽。在一些態樣中，抗原結合結構域包含或源自Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、單鏈可變片段(scFv)、雙-scFv、(scFv)2、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、內抗體、二硫化物穩定之Fv蛋白(dsFv)、單抗體、奈米抗體以及源自抗體之抗原結合區，該抗體可特異性結合至相關蛋白質(例如，ROR1)、配位體(包括天然配位體)、受體、受體片段、肽適體或其組合。在一些態樣中，該抗原結合結構域為單鏈Fv(scFv)。 信號傳導 ( 細胞內 ) 、跨膜及共刺激結構域

在一些態樣中，本文所述之ROR1結合蛋白(例如，CAR、TCR、caTCR、CSR或TCR模擬物)包含細胞內信號傳導結構域，其在抗原與細胞外結構域結合後轉導效應子功能信號且指導表現ROR1結合蛋白之細胞(例如，T細胞)執行特殊功能。細胞內信號傳導結構域之非限制性實例包括源自以下各物之細胞內信號傳導結構域區：CD3 ζ、FcR γ、普通FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε Rib)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10、DAP12或其任何組合。在一些態樣中，該細胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ細胞內信號傳導結構域(例如SEQ ID NO: 90中所述之結構域)。

在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含本文所揭示之蛋白質之整個細胞內結構域。在一些態樣中，該細胞內結構域係經截短。細胞內結構域之經截短部分可用於替代完整鏈，只要其仍轉導效應子功能信號即可。因此，術語細胞內結構域意欲包括細胞內結構域中足以轉導效應子功能信號之任何經截短部分。

在一些態樣中，可用於本揭示案之ROR1結合蛋白(例如，CAR、TCR、caTCR、CSR或TCR模擬物)進一步包含跨膜結構域。在一些態樣中，ROR1結合蛋白之抗原結合結構域藉由跨膜結構域與細胞內結構域連接。在一些態樣中，ROR1結合蛋白之抗原結合結構域藉由連接體與跨膜結構域連接。在一些態樣中，在抗原結合結構域與跨膜結構域之間包括連接體可影響抗原結合結構域之撓性且由此改良ROR1結合蛋白之一或多種特性。

此項技術中已知之任何跨膜結構域均可用於本文所述之ROR1結合蛋白(例如，CAR、TCR、caTCR、CSR或TCR模擬物)。在一些態樣中，跨膜結構域為人工的(例如，經工程改造之跨膜結構域)。在一些態樣中，跨膜結構域源自天然存在之多肽。在一些態樣中，跨膜結構域包含來自天然存在之多肽的跨膜結構域。跨膜結構域之非限制性實例包括以下各物之跨膜結構域區：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C、CD19、CD8或其任何組合。在一些態樣中，該跨膜結構域包含CD28跨膜結構域(例如SEQ ID NO: 75中所述之結構域)。

如本文所述，在一些態樣中，可用於本揭示案之ROR1結合蛋白(例如，CAR、TCR、caTCR、CSR或TCR模擬物)包含一或多個共刺激結構域(例如，第二代及第三代CAR)。不欲受任一理論束縛，此等共刺激結構域可進一步改良經工程改造以表現ROR1結合蛋白(例如，與c-Jun多肽組合)之免疫細胞的擴增、活化、記憶、持久性及/或效應子功能。在一些態樣中，跨膜結構域融合至共刺激結構域，視情況地共刺激結構域融合至第二共刺激結構域，且共刺激結構域融合至信號傳導結構域，但不限於CD3ζ。共刺激結構域之非限制性實例包括介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10或其任何組合。在一些態樣中，該共刺激結構域包含4-1BB/CD137共刺激結構域(例如SEQ ID NO: 76中所述之結構域)。 c-Jun

如本文所述，在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，經修飾且使用本文所提供之方法進行培養)包含或能夠表現c-Jun蛋白。在免疫細胞能夠天然地表現c-Jun蛋白之情況下，在一些情形中，內源c-Jun蛋白之表現經誘導，由此導致該蛋白之增加或過表現。在細胞中誘導c-Jun蛋白之表現(或過表現)時，在一些態樣中，c-Jun蛋白係外源添加的。在一些態樣中，c-Jun蛋白在細胞中重組表現。例如，在一些態樣中，本文所述之細胞已經修飾或經工程改造(例如，遺傳地)以包含外源聚核苷酸，該外源聚核苷酸包含編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列(本文中亦稱為「c-Jun核苷酸序列」)，使得與參考細胞(例如，未經修飾為包含外源聚核苷酸之相應細胞)相比，經修飾細胞中之c-Jun蛋白表現增加。在一些態樣中，細胞已經轉錄活化子(例如基於CRISPR/Cas系統之轉錄活化子，例如CRISPRa)修飾，使得與參考細胞(例如，未經轉錄活化子修飾之相應細胞)相比，內源c-Jun蛋白之表現增加。

在一些態樣中，由於修飾(例如，引入外源引入之c-Jun核苷酸序列及/或轉錄活化子)，經工程改造之細胞過表現，亦即表現高於不具有此類修飾之相應細胞(「參考細胞」)的水準(例如，高至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%，或高至少約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍)之c-Jun蛋白。術語「表現增加水準[或量]之」、「過表現」或具有「……之增加表現」(及本文所用之片語的類似形式)可互換使用。

在一些態樣中，本文所述之經工程改造(或經修飾)細胞表現比參考細胞高至少約2-100倍、高約5-50倍、高約5-40倍、高約5-30倍、高約5-20倍、高約8-20倍或高約10-20倍之c-Jun蛋白。在一些態樣中，與參考細胞中之c-Jun蛋白表現相比，本文所述之經修飾細胞中的c-Jun蛋白表現增加至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約12倍、至少約14倍、至少約16倍、至少約18倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。

此外，如本文所述，在一些態樣中，本揭示案之培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)亦可幫助進一步增加經修飾細胞中的c-Jun蛋白(或任何其他相關蛋白質)表現。因此，在一些態樣中，當使用本文所提供之方法進行培養時，與參考細胞中之c-Jun蛋白表現相比，經修飾細胞中的c-Jun蛋白表現(例如，由編碼c-Jun蛋白之外源核苷酸序列及/或能夠增加內源c-Jun多肽之表現的轉錄活化子之引入引起)進一步增加至少0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約12倍、至少約14倍、至少約16倍、至少約18倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。因此，在一些態樣中，本文所提供之方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中用編碼ROR1結合蛋白及c-Jun多肽之外源聚核苷酸修飾免疫細胞(例如，T細胞)，其中在修飾之後，與參考細胞相比，c-Jun多肽在免疫細胞中之表現增加。在一些態樣中，該等免疫細胞可在單獨培養基中經外源聚核苷酸修飾，接著隨後轉移且在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養。

如本文所述，在一些態樣中，參考細胞可包含以下任一者：(i)未經修飾且未在培養基(亦即，不包含濃度高於5 mM之鉀離子，例如TCM)中培養之相應細胞；(ii)已經修飾但未在培養基中培養之相應細胞；(iii)未經修飾但在培養基中培養之相應細胞；或(iv) (i)、(ii)及(iii)之任何組合。

如由本揭示案顯而易見，在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，使用本文所提供之方法進行培養)已經修飾以表現一或多種額外轉殖基因以及增加量之c-Jun蛋白。例如，在一些態樣中，可用於本揭示案之免疫細胞已經修飾以包含：(i)編碼c-Jun多肽之第一外源核苷酸序列及(ii)編碼ROR1結合蛋白之第二外源核苷酸序列。在一些態樣中，第一及第二核苷酸序列為單一聚核苷酸(本文中稱為「多順反子聚核苷酸」)之一部分。此類多順反子聚核苷酸之非限制性實例在下文中進一步描述。如本文所述，在一些態樣中，免疫細胞之此類修飾(例如，以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun多肽)發生於包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中。在一些態樣中，該等免疫細胞在參考培養基(例如，不包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基)中經修飾，且接著在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養。在一些態樣中，T細胞可在修飾之前在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養。在一些態樣中，經修飾T細胞可在修飾之後進一步在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養。在一些態樣中，在修飾之前、期間及之後，該等免疫細胞在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養。

c-Jun係屬於活化子蛋白-1 (AP-1)家族之致癌轉錄因子。其與多種蛋白質(例如c-Fos)相互作用以形成調節多種細胞信號傳導路徑(包括細胞增殖及腫瘤進展)之二聚體複合物。因此，已在某些癌症中觀察到增加之c-Jun表現，且業內對開發c-Jun拮抗劑來治療此類癌症很感興趣。參見例如Brennan, A.等人， J Exp Clin Cancer Res39(1): 184 (2020年9月)。

在人類中，c-Jun蛋白係由 JUN基因編碼，該基因位於染色體1上(GenBank登錄號NC_000001.11之核苷酸58,780,791至58,784,047，負股取向)。 JUN基因及其編碼蛋白質之同義詞為已知的且包括「Jun原致癌基因、AP-1轉錄因子亞單元」、「v-Jun禽肉瘤病毒17致癌基因同源物」、「轉錄因子AP-1」、「Jun致癌基因」、「AP-1」、「Jun活化結構域結合蛋白」、「p39」及「增強子結合蛋白AP1」。野生型人類c-Jun蛋白序列之長度為331個胺基酸。野生型人類c-Jun之胺基酸及核酸序列分別提供於表1及表2中。

野生型人類c-Jun (UniProt標識符：P05412-1)蛋白序列之長度為331個胺基酸(SEQ ID NO: 13)。該等胺基酸及核酸序列分別顯示於表1及表2中。

在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞已經修飾以包含編碼野生型c-Jun蛋白之外源核苷酸序列，諸如SEQ ID NO: 12中所述之野生型核苷酸序列。或者，在一些態樣中，本文所述之免疫細胞係經修飾以包含編碼突變型c-Jun蛋白之外源核苷酸序列，其保留預防及/或減少免疫細胞耗竭的能力。在一些態樣中，可在本文所揭示之免疫細胞上表現的突變型c-Jun蛋白包含與野生型c-Jun(亦即，SEQ ID NO: 13)之C末端胺基酸殘基(例如C末端50個、75個、100個、150個、200個或250個或更多個殘基)、C末端部分(例如四分之一、三分之一或一半)或C末端結構域(例如ε、bZIP及其胺基酸C末端)至少約70%(例如，至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%)之序列一致性。在一些態樣中，使野生型c-Jun(亦即，SEQ ID NO: 13)之N末端胺基酸殘基(例如N末端50個、75個、100個或150個或更多個)、N末端部分(例如四分之一、三分之一或一半)或N末端結構域(例如δ、反式活化(transactivation)結構域及其胺基酸N末端)缺失、突變或以其他方式不活化。在一些態樣中，c-Jun為突變型人類c-Jun，視情況在其反式活化結構域或δ結構域中包含不活化突變。在一些態樣中，c-Jun突變體包含S63A及S73A突變。在一些態樣中，如與野生型c-Jun(SEQ ID NO: 13)相比，c-Jun突變體包含在殘基2與102之間的缺失。在一些態樣中，如與野生型c-Jun(SEQ ID NO: 13)相比，c-Jun突變體包含在殘基30與50之間的缺失。在一些態樣中，與野生型c-Jun(SEQ ID NO: 13)相比，突變型c-Jun包含(i)S63A及S73A突變，或(ii)在殘基2與102之間或在殘基30與50之間的缺失。可用於本揭示案之突變型c-Jun蛋白的非限制性實例提供於US 2019/0183932 A1及US 2017/0037376 A1中，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。

在一些態樣中，本文所述之免疫細胞已經修飾以包含編碼c-Jun多肽之外源核苷酸序列，其中該外源核苷酸序列與SEQ ID NO: 1至11中所述之任一核酸序列具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1至11中之任一者中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 2中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 2中所述之核酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 2中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 3中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 3中所述之核酸序列具有至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 3中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列具有至少約80%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 7中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列具有至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 9中所述之核苷酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，該外源核苷酸包含SEQ ID NO: 10中所述之核苷酸序列。

例示性c-Jun核苷酸序列提供於表3 (下文)中。

本文所揭示之c-Jun核苷酸序列可使用此項技術中已知之任何方法進行密碼子最佳化。例如，在一些態樣中，本文所揭示之c-Jun核苷酸序列的密碼子已經最佳化以與野生型核苷酸序列(例如，SEQ ID NO: 11)相比修改(例如，增加或減少)以下參數中之一或多者：(i)密碼子適應指數(亦即，密碼子使用偏好)；(ii)鳥嘌呤-胞嘧啶(GC)核苷酸含量；(iii)mRNA二級結構及不穩定模體；(iv)重複序列(例如正向重複、反向重複、dyad重複)；(v)限制酶識別位點；或(vi)其組合。

在一些態樣中，如與經野生型c-Jun核苷酸序列(例如，SEQ ID NO: 11)轉染之細胞中的相應表現相比，編碼本文所提供之c-Jun多肽的外源聚核苷酸在轉染、轉導或以其他方式引入免疫細胞(例如，人類免疫細胞)中時能夠增加經編碼c-Jun蛋白之表現。在一些態樣中，與經野生型c-Jun核苷酸序列(例如，SEQ ID NO: 11)轉染、轉導或以其他方式經遺傳修飾以進行表現之細胞中的相應表現相比，經修飾以包含外源聚核苷酸之免疫細胞中的c-Jun蛋白表現增加至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約12倍、至少約14倍、至少約16倍、至少約18倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。

雖然上文所提供之某些揭示內容一般係關於修飾免疫細胞以包含編碼c-Jun蛋白(野生型c-Jun或其變異體)之外源核苷酸序列，但熟習此項技術者應顯而易知，其他合適方法可用於誘導及/或增加細胞中之c-Jun蛋白表現(野生型或其變異體)。例如，如本文所述，在一些態樣中，可用轉錄活化子(例如，CRISPRa)增加內源c-Jun蛋白表現。除非另有指示，否則上文使用外源核苷酸序列提供之揭示內容同樣適用於其他誘導及/或增加本文所提供之細胞中的c-Jun蛋白表現之方法(例如轉錄活化因子，例如CRISPRa)。

在一些態樣中，增加之c-Jun蛋白表現可改良及/或增強經修飾免疫細胞(例如T細胞，諸如CD4+及/或CD8+ T細胞)之一或多種特性。此類特性之非限制性實例包括：耗竭抗性(例如，如藉由減少之耗竭標記物(諸如PD-1、CD39、TIM-3及/或LAG-3)表現；增加之持久性/存活；功能障礙狀態之開始的延遲；及/或增加之細胞介素產生所指示)、增加之擴增/增殖、增加之抗原敏感性、經改良之效應子功能(詳言之，重複抗原刺激後的經改良之效應子功能(例如，抗原刺激後之細胞介素產生、表現標靶抗原之細胞的溶解或兩者))或其組合。

可用於量測耗竭、細胞表型、持久性、細胞毒性及/或殺死、增殖、細胞介素產生/釋放及基因表現型態之分析為此項技術中已知的，且包括例如流式細胞術、細胞內細胞介素染色(ICS)、INCUCYTE ^®免疫細胞殺死分析、中尺度發現(Meso Scale Discovery，MSD)或類似分析、持續抗原刺激分析、批量及單細胞RNAseq(參見例如Fron Genet. 2020; 11:220；2019 Bioinformatics 35:i436-445；2019 Annual Review of Biomed. Data Sci. 2:139-173)、細胞毒性/殺死分析、ELISA、西方墨點以及其他標準分子及細胞生物學方法，諸如本文所述或如例如Current Protocols in Molecular Biology或Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons, Inc., 1999-2021)或別處所述。

在一些態樣中，增加之c-Jun蛋白表現會增加免疫細胞對耗竭之抗性。在一些態樣中，與參考細胞(例如，未經修飾為具有增加之c-Jun蛋白表現的相應細胞)相比，耗竭抗性增加至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約12倍、至少約14倍、至少約16倍、至少約18倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。

在一些態樣中，增加之c-Jun蛋白表現可減少耗竭細胞中之耗竭。在一些態樣中，與參考細胞(例如，未經修飾為具有增加之c-Jun蛋白表現的相應耗竭細胞)相比，增加之c-Jun蛋白表現可使耗竭減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%，如例如使用一或多種如本文所述之分析所量測。

在一些態樣中，增加之c-Jun蛋白表現會延遲細胞耗竭之開始。在一些態樣中，與參考細胞(例如，未經修飾為具有增加之c-Jun蛋白表現的相應細胞)相比，增加之c-Jun蛋白表現使耗竭之開始延遲至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%，如例如使用一或多種如本文所述之分析所量測。在一些態樣中，增加之c-Jun蛋白表現使耗竭之開始延遲至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天或至少約14天或更久。

因此，在一些態樣中，與參考細胞(例如，未經修飾為具有增加之c-Jun蛋白表現的相應細胞)相比，本文所述之細胞中的一或多種耗竭標記物(例如，TIGIT、PD-1、TIM-3及/或LAG-3)之表現減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，與參考細胞(例如，未經工程改造為過表現c-Jun之相應細胞)相比，本文所述之細胞中的一或多種耗竭標記物(例如，TIGIT、PD-1、TIM-3及/或LAG-3)之表現減少至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍或至少約100倍或更多。

在一些態樣中，免疫細胞群體(例如，經修飾且使用本文所提供之方法進行培養)之耗竭狀態可藉由量化免疫細胞群體內表現既定耗竭標記物(例如，TIGIT、PD-1、TIM-3及/或LAG-3)之細胞的量(例如，數目及/或百分率)來確定。例如，與未如本文所述經修飾之相應免疫細胞群體中的量相比，當免疫細胞群體經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白(例如，與ROR1結合蛋白組合)時，表現既定耗竭標記物之細胞的量(例如，數目及/或百分率)降低。因此，在一些態樣中，與未如本文所述經修飾之相應免疫細胞群體中的量相比，本文所述之經修飾免疫細胞群體中表現既定耗竭標記物之細胞的量減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，增加之c-Jun蛋白表現可增加免疫細胞之持久性/存活，例如當活體內投與至個體時。在一些態樣中，與參考細胞(例如，未經修飾為具有增加之c-Jun蛋白表現的相應細胞)相比，細胞之持久性/存活增加至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約12倍、至少約14倍、至少約16倍、至少約18倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。

在一些態樣中，與未如本文所述經修飾之相應免疫細胞群體中的量相比，本文所述之免疫細胞的持久性/存活增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

因此，在一些態樣中，本揭示案之免疫細胞係經修飾以：(i)表現ROR1結合蛋白(例如，抗ROR1 CAR)且(ii)具有增加水準之c-Jun多肽(例如，用編碼c-Jun多肽之外源核苷酸序列及/或能夠增加內源c-Jun表現之轉錄活化子)且在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養，使得在修飾及培養之後，與參考細胞相比，免疫細胞之持久性/存活增加。如本文所述，在一些態樣中，參考細胞包含以下相應免疫細胞：(i)未經修飾為過表現c-Jun、但在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；(ii)經修飾為過表現c-Jun、但未在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；或(iii) (i)及(ii)兩者。

在一些態樣中，增加之c-Jun蛋白表現可增加免疫細胞之擴增/增殖，例如在抗原刺激後。在一些態樣中，與參考細胞(例如，未經修飾為具有增加之c-Jun蛋白表現的相應細胞)相比，細胞之擴增/增殖增加至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約12倍、至少約14倍、至少約16倍、至少約18倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。

在一些態樣中，與未如本文所述經修飾之相應免疫細胞群體中的量相比，例如在抗原刺激後免疫細胞之擴增/增殖增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

因此，在一些態樣中，本揭示案之免疫細胞係經修飾以：(i)表現ROR1結合蛋白(例如，抗ROR1 CAR)且(ii)具有增加水準之c-Jun多肽(例如，用編碼c-Jun多肽之外源核苷酸序列及/或能夠增加內源c-Jun表現之轉錄活化子)且在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養，使得在修飾及培養之後，與參考細胞相比，免疫細胞之擴增/增殖增加。如本文所述，在一些態樣中，參考細胞包含以下相應免疫細胞：(i)未經修飾為過表現c-Jun、但在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；(ii)經修飾為過表現c-Jun、但未在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；或(iii) (i)及(ii)兩者。

在一些態樣中，增加之c-Jun蛋白表現可增加細胞的效應子功能，例如增加之細胞介素(例如，IFN-γ 、TNF-α及/或IL-2)產生、顆粒酶釋放及/或細胞毒性。在一些態樣中，效應子功能之增加係因應於持續抗原刺激。如本文所用，術語「持續抗原刺激」或「長期抗原刺激」係指免疫細胞(例如，T細胞)重複暴露於其同源抗原，使得該免疫細胞受到刺激或經活化。在一些態樣中，持續抗原刺激包括使免疫細胞(例如，T細胞)暴露於其同源抗原持續至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約1週、至少約2週、至少約3週、至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月或至少約1年。在一些態樣中，持續抗原刺激可為連續的。在一些態樣中，持續抗原刺激可包括多輪抗原刺激，其中每輪抗原刺激之後為一段時間之非抗原刺激。在一些態樣中，持續抗原刺激包括至少約2輪、至少約3輪、至少約4輪、至少約5輪或至少約6輪或更多輪之抗原刺激。如由本揭示案顯而易見且在此項技術中已知，免疫細胞之此類持續抗原刺激可導致免疫細胞耗竭。

在一些態樣中，與參考細胞(例如，未經修飾為具有增加之c-Jun蛋白表現的相應細胞)相比，細胞之效應子功能增加至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約12倍、至少約14倍、至少約16倍、至少約18倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。

在一些態樣中，與參考細胞相比，增加之c-Jun蛋白表現可使細胞之效應子功能增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

因此，在一些態樣中，本揭示案之免疫細胞係經修飾以：(i)表現ROR1結合蛋白(例如，抗ROR1 CAR)且(ii)具有增加水準之c-Jun多肽(例如，用編碼c-Jun多肽之外源核苷酸序列及/或能夠增加內源c-Jun表現之轉錄活化子)且在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養，使得在修飾及培養之後，與參考細胞相比，免疫細胞之效應子功能例如因應於持續抗原刺激而增加。如本文所述，在一些態樣中，參考細胞包含以下相應免疫細胞：(i)未經修飾為過表現c-Jun、但在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；(ii)經修飾為過表現c-Jun、但未在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；或(iii) (i)及(ii)兩者。

在一些態樣中，如與對照細胞(例如，未過表現c-Jun之細胞)相比，經修飾以表現增加水準之c-Jun (例如，如本文所述)的細胞保留效應子功能，例如增加之細胞介素(例如，IFN-γ、TNF-α及/或IL-2)產生、顆粒酶釋放及/或細胞毒性(例如，殺死相關標靶細胞之能力)，持續至少一輪、至少兩輪、至少三輪或更多額外輪之連續、長期或依序刺激分析(諸如實例3或例如Zhao等人，2015 Cancer Cell 28(4):415-428；Kunkele等人，2015 Cancer Immunology Research 3(4):368-379中所述之分析；該等文獻中每一者均以引用之方式整體併入本文中)。

在一些態樣中，如與在參考培養基中培養之相應免疫細胞相比，在本揭示案之代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)中培養的免疫細胞能夠在至少兩輪抗原刺激之後，在至少三輪抗原刺激之後，在至少四輪抗原刺激之後，在至少五輪抗原刺激之後，在至少六輪抗原刺激之後產生更高量之細胞介素(例如，IFN-γ及/或IL-2)。因此，在一些態樣中，本文提供一種增加免疫細胞因應於抗原刺激而產生之細胞介素的方法，其中該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞。如本文所述，在一些態樣中，該等免疫細胞已經修飾以與參考細胞(例如，未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞)相比包含ROR1結合蛋白(例如，抗ROR1 CAR)且具有增加水準之c-Jun多肽。

在一些態樣中，在培養之後，如與參考細胞(例如本文所述)相比，經修飾免疫細胞因應於抗原刺激而產生之細胞介素增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更多。在一些態樣中，在培養之後，如與參考細胞相比，經修飾免疫細胞因應於抗原刺激而產生之細胞介素增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。

T細胞中增加之c-Jun表現可藉由例如減輕或預防T細胞功能障礙(例如，T細胞耗竭)而幫助維持該等細胞之活性狀態。因此，增加本文所提供之細胞中的c-Jun蛋白表現之不同方法(例如，用編碼c-Jun多肽之外源聚核苷酸及/或能夠增加內源c-Jun表現之轉錄活化子修飾細胞)可用於工程改造免疫細胞(諸如T細胞)，該等免疫細胞接著對所需標靶細胞(例如，內源TCR之標靶或如本文所述之ROR1結合蛋白的標靶)展現持續、有效細胞毒性。如與未過表現c-Jun之T細胞相比，本文所揭示之經工程改造T細胞(其具有增加之c-Jun蛋白表現)展示極少的如上文所述之T細胞耗竭跡象。

此外，如由本揭示案顯而易見，在一些態樣中，當使用本文所提供之方法(例如，在包含濃度高於5 mM之鉀離子的代謝再編程培養基中)培養任何本文所提供之經修飾免疫細胞(例如，表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)時，上述特性中之一或多種進一步增強。例如，在一些態樣中，與參考細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白、但未在本文所述之代謝再編程培養基中培養，及/或在本文所述之代謝再編程培養基中培養、但未經修飾為表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)相比，本揭示案之免疫細胞(經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白且在代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)中培養)能夠展現以下一或多種：(i)增加之耗竭抗性(例如，如藉由減少之耗竭標記物(諸如PD-1、CD39、TIM-3及/或LAG-3)表現；增加之持久性/存活；功能障礙狀態之開始的延遲；及/或增加之細胞介素產生所指示)，(i)增加之擴增/增殖，(iii)增加之抗原敏感性，(iv)增加之效應子功能(尤其重複抗原刺激後)(例如，抗原刺激後之細胞介素產生、表現標靶抗原之細胞的溶解或兩者)，或(v)其任何組合。 II.C.2. 額外可轉譯序列

在一些態樣中，本文描述之免疫細胞(例如，經修飾且使用本文所提供之方法進行培養)可表現一或多種額外的相關蛋白質。例如，在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞進一步包含一或多個編碼額外的相關蛋白質之外源核苷酸序列。因此，在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞包含編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列，及一或多個編碼額外的相關蛋白質(例如，c-Jun及/或EGFRt)之額外外源核苷酸序列。此類額外可轉譯序列之非限制性實例描述於下文中。 經截短之 EGFR

在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞(例如，經修飾且使用本文所提供之方法進行培養)進一步包含編碼經截短之表皮生長因子受體(EGFRt)之外源核苷酸序列，使得EGFRt僅包含全長EGFR蛋白之部分序列(例如，SEQ ID NO: 19)。在一些態樣中，EGFRt包含EGFR細胞外結構域III及IV以及EGFR跨膜結構域，但缺乏EGFR細胞外結構域I及II以及EGFR細胞內序列。因此，在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞已經修飾以包含：(i)編碼c-Jun多肽之外源核苷酸序列，(ii)編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列，及(iii)編碼EGFRt之外源核苷酸序列。如本文所述，在一些態樣中，轉錄活化子(例如，CRISPRa)可用於增加內源c-Jun蛋白之表現。因此，在一些態樣中，本文所述之免疫細胞已經修飾以包含：(i)能夠增加內源c-Jun蛋白表現之轉錄活化子，(ii)編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列，及(iii)編碼EGFRt之外源核苷酸序列。在上述態樣中之每一者中，多個外源核苷酸序列中之一或多者可為單一多順反子聚核苷酸之一部分。

EGFR為180 kDa之單體醣蛋白，其包含大的細胞外區域、單跨跨膜結構域、細胞內近膜區、酪胺酸激酶結構域及C末端調節區。該細胞外區域包含四個結構域：結構域I及III為同源配位體結合結構域，結構域II及IV為富含半胱胺酸之結構域(Ferguson, Annu Rev Biophys. (2008)37:353-3)。除非另有指示，否則如本文所用之EGFR係指人類EGFR。歸因於選擇式剪接，存在至少四種已知之人類EGFR同功型。不同EGFR同功型之序列提供於表4 (下文)中。

在上述EGFR規範序列(亦即同功型1)中，各個EGFR結構域描述如下。該信號肽跨越胺基酸1-24。該細胞外序列跨越胺基酸25-645，其中結構域I、結構域II、結構域III及結構域IV分別跨越胺基酸25-188、189-333、334-504及505-645。該跨膜結構域跨越胺基酸646-668。該細胞內結構域跨越胺基酸669-1,210，其中該近膜結構域跨越胺基酸669-703且該酪胺酸激酶結構域跨越胺基酸704-1,210。

在一些態樣中，可用於本揭示案之EGFRt包含與SEQ ID NO: 19中所述之胺基酸序列具有至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。

在一些態樣中，可用於本揭示案之EGFRt包含與SEQ ID NO: 21中所述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，該EGFRt包含SEQ ID NO: 21中所述之胺基酸序列(參見表6)。在一些態樣中，可用於本揭示案之EGFRt包含與SEQ ID NO: 24中所述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，該EGFRt包含SEQ ID NO: 24中所述之胺基酸序列(參見表5)。

在一些態樣中，本文所述之EGFRt另外包含近膜結構域。如本文所用，術語「近膜結構域」係指細胞表面蛋白(例如，EGFR)中緊鄰跨膜結構域C末端之細胞內部分。不欲受任一理論束縛，在一些態樣中，近膜結構域之添加可增加由本揭示案之聚核苷酸編碼的蛋白質之表現。

在一些態樣中，該近膜結構域可為約1至約20個(例如，2-20、3-20、4-20、5-20、2-18、3-18、4-18或5-18個)胺基酸長。在一些態樣中，該近膜結構域可長於20個胺基酸。在一些態樣中，該近膜結構域之前1或多個(例如，前2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸為淨中性或淨正電荷序列(例如，精胺酸及離胺酸殘基之數目大於或等於天冬胺酸及麩胺酸殘基之數目)。在一些態樣中，彼等前面胺基酸含有超過約30% (例如，超過40%、50%、60%、70%、80%或90%)之親水性胺基酸。可用於本揭示案之近膜結構域的非限制性實例提供於表6(下文)中。

在一些態樣中，可用於本揭示案之近膜結構域可源自天然細胞表面蛋白之近膜區，諸如與磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)或磷脂醯肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)相互作用之人類受體酪胺酸激酶的近膜區(例如，前20個近膜胺基酸之全部或部分序列)(參見例如Hedger等人， Sci Rep.(2015) 5: 9198)。受體酪胺酸激酶之非限制性實例為ERBB1 (EGFR)、ERBB2 (HER2)、ERBB3 (HER3)、ERBB4 (HER4)、INSR、IGF1R、INSRR、PGFRA、PGFRB、KIT、CSF1R、FLT3、VGFR1、VGFR2、VGFR3、FGFR1 、FGFR2、FGFR3、FGFR4、PTK7、NTRK1、NTRK2、NTRK3、ROR1、ROR2、MUSK、MET、RON、UFO、TYRO3、MERTK、TIE1、TIE2、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHAA、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB6、RET、RYK、DDR1、DDR2、ROS1、LMTK1、LMTK2、LMTK3、LTK、ALK及STYK1。在一些態樣中，近膜結構域可包含一或多種突變(例如，取代或缺失)，該等突變移除已知經磷酸化之殘基以便規避由本揭示案之聚核苷酸編碼的蛋白質之任何非預期信號轉導能力。

在一些態樣中，該近膜結構域源自EGFR之近膜區。EGFR源性近膜結構域之非限制性實例包含表7 (下文)中提供之一序列。在一些態樣中，該近膜結構域包含胺基酸序列RRR。在一些態樣中，包含此類近膜結構域之EGFRt包含SEQ ID NO: 24中所述之序列。

如由本揭示案顯而易見，修飾本文所述之免疫細胞(例如，表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun多肽)以進一步包含編碼EGFRt之外源核苷酸序列會提供某些優勢。例如，在一些態樣中，EGFRt可充當殺死開關(kill switch)。在一些態樣中，當體內不再需要本文所述之經工程改造細胞時，可將醫藥級抗EGFR抗體(諸如西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)或耐妥珠單抗(necitumumab))投與至已接受經工程改造細胞之個體，由此移除經工程改造細胞，例如經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。 間隔子

在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，經修飾且使用本文所提供之方法進行培養)亦包含編碼間隔子之外源核苷酸序列。因此，在一些態樣中，本文所述之免疫細胞已經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白(例如，具有編碼c-Jun蛋白之外源核苷酸序列及/或能夠增加內源c-Jun蛋白表現之轉錄活化子)且包含：編碼c-Jun蛋白之外源核苷酸序列、編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列及編碼間隔子之外源核苷酸序列。在一些態樣中，免疫細胞已經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白且包含：編碼c-Jun蛋白之外源核苷酸序列、編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列、編碼EGFRt之外源核苷酸序列及編碼間隔子之外源核苷酸序列。在一些態樣中，該一或多個外源核苷酸序列為單一多順反子聚核苷酸之一部分。如本文所用，術語「間隔子」係指能夠使兩個間隔部分(例如，P2A連接體及ROR1結合蛋白)共價連接在一起之多肽序列。

在一些態樣中，間隔子源自免疫球蛋白(例如，源自鉸鏈區或環區)。在一些態樣中，該間隔子包含IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM鉸鏈區、其片段(單獨或由額外序列，例如CH1或CH2區序列加帽)，或來自IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM鉸鏈區之片段的組合(本文中稱為「鉸鏈區源性間隔子」)。在一些態樣中，該間隔子包含IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM恆定結構域環區、其片段(單獨或由例如來自相鄰β-股之額外序列加帽)，或來自IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE或IgM環區之片段的組合(本文中稱為「環區源性間隔子」)。在一些態樣中，該間隔子包含鉸鏈區源性間隔子、環區源性間隔子或兩者(例如，兩個或更多個連接之鉸鏈區源性間隔子及環區源性間隔子)。

因此，在一些態樣中，本文所述之聚核苷酸編碼包含以下各物之多肽：(i) c-Jun蛋白，(ii)第一連接體(例如，P2A連接體)，(iii)信號肽(例如，hIgκ)，(iv)抗原結合結構域(例如，scFv)，(v)第二連接體(例如，GGGSG；SEQ ID NO: 40)，(vi)間隔子(例如，IgG2鉸鏈源性間隔子)，(vii)跨膜結構域(例如，CD28)，(viii)共刺激結構域(例如，4-1BB)，(ix)細胞內信號傳導結構域(例如，CD3ζ)，(x)第三連接體(例如，P2A連接體)，及(xi) EGFRt。

在一些態樣中，可用於本揭示案之間隔子包含選自由以下組成之群的免疫球蛋白重鏈之子序列：人類IgA1(Uniprot: P01876，IGHA1_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定α 1；SEQ ID NO: 41)、人類IgA2(Uniprot P01877，IGHA2_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定α 2；SEQ ID NO: 42)、鼠科動物IgG2A(Uniprot P01665，GCAM_MOUSE，免疫球蛋白γ 2A鏈C區；SEQ ID NO: 43)、人類IgG1 (Uniprot P01857，IGHG1_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 1；SEQ ID NO: 44)、人類IgG2(Uniprot P01859，IGHG2_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 2；SEQ ID NO: 45)、人類IgG3(Uniprot P01860，IGHG3_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 3；SEQ ID NO: 46)、人類IgG4(Uniprot P01861，IGHG4，免疫球蛋白重鏈恆定γ 4；SEQ ID NO: 47)、人類IgD(Uniprot P01880，IGHD_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定δ；SEQ ID NO: 48)、人類IgE(Uniprot P01854，IGHE_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定ε；SEQ ID NO: 49)或IgM (Uniprot P01871，IGHM_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定μ；SEQ ID NO: 50)，其中該子序列包含CH1-CH2鉸鏈區或其部分。在一些態樣中，該子序列進一步包含CH1及/或CH2恆定結構域之相鄰部分。

在一些態樣中，間隔子包含選自由以下組成之群的免疫球蛋白重鏈之子序列：人類IgA1(Uniprot: P01876，IGHA1_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定α 1；SEQ ID NO: 41)、人類IgA2(Uniprot P01877，IGHA2_HUMAN ，免疫球蛋白重鏈恆定α 2；SEQ ID NO: 42)、鼠科動物IgG2A(Uniprot P01665，GCAM_MOUSE，免疫球蛋白γ 2A鏈C區；SEQ ID NO: 43)、人類IgG1(Uniprot P01857，IGHG1_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 1；SEQ ID NO: 44)、人類IgG2(Uniprot P01859，IGHG2_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 2；SEQ ID NO: 45)、人類IgG3(Uniprot P01860，IGHG3_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 3；SEQ ID NO: 46)、人類IgG4 (Uniprot P01861，IGHG4，免疫球蛋白重鏈恆定γ 4；SEQ ID NO: 47)、人類IgD(Uniprot P01880，IGHD_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定δ；SEQ ID NO: 48)、人類IgE(Uniprot P01854，IGHE_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定ε；SEQ ID NO: 49)或IgM(Uniprot P01871，IGHM_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定μ；SEQ ID NO: 50)，其中該子序列包含來自恆定結構域或其部分之環區。在一些態樣中，該子序列進一步包含β-股之相鄰部分。

在一些態樣中，可用於本揭示案之間隔子源自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些態樣中，該間隔子源自IgG2鉸鏈。在一些態樣中，IgG2鉸鏈源性間隔子包含SEQ ID NO: 51(KPCPPCKCP)之至少五個、六個或七個連續胺基酸。在一些態樣中，間隔子包含與SEQ ID NO: 51(KPCPPCKCP)中所述之序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列。在一些態樣中，該間隔子包含SEQ ID NO: 51(KPCPPCKCP)中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，該間隔子包含SEQ ID NO: 51(KPCPPCKCP)中所述之序列，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。在一些態樣中，胺基酸取代為保守胺基酸取代。在一些態樣中，胺基酸取代包含至少一個非保守胺基酸取代。

在一些態樣中，本揭示案之間隔子包含SEQ ID NO: 51中所述之序列，其中該間隔子序列進一步包含視情況選用之撓性連接體(例如，GGGSG(SEQ ID NO: 40)之連接體)。因此，在一些態樣中，本揭示案之間隔子包含間隔子序列(例如，SEQ ID NO: 51)及視情況選用之C末端或N末端撓性連接體。在一些態樣中，本文所揭示之任何視情況選用的撓性連接體(例如，富含gly/ser之連接體)均可附加至間隔子之C末端及/或N末端。 信號肽

如本文所述，在一些態樣中，本文所提供之免疫細胞已經修飾以進一步表現信號肽(例如，包含編碼信號肽之外源核苷酸序列)。信號肽可促進所編碼蛋白質之細胞表面表現且接著可隨後自成熟蛋白質中裂解。在一些態樣中，此類免疫細胞已經修飾以具有增加水準之c-Jun蛋白(例如，具有編碼c-Jun蛋白之外源核苷酸序列及/或能夠增加內源c-Jun蛋白表現之轉錄活化子)且包含：編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列及編碼信號肽之外源核苷酸序列。在一些態樣中，免疫細胞已經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白且包含：編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列、編碼EGFRt之外源核苷酸序列及編碼信號肽之外源核苷酸序列。在一些態樣中，免疫細胞已經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白且包含：編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列、編碼EGFRt之外源核苷酸序列、編碼間隔子之外源核苷酸序列及編碼信號肽之外源核苷酸序列。在一些態樣中，該一或多個外源核苷酸序列為單一多順反子聚核苷酸之一部分。

此項技術中已知之任何合適信號肽均可用於本揭示案。信號肽之非限制性實例提供於表8(下文)中。在一些態樣中，信號肽源自人類Ig κ。在一些態樣中，該信號肽包含與SEQ ID NO: 54 (MVLQTQVFISLLLWISGAYG)中所述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，該信號肽包含SEQ ID NO: 54 (MVLQTQVFISLLLWISGAYG)中所述之胺基酸序列。在一些態樣中，該信號肽源自GM-CSF。在一些態樣中，此類信號肽包含與SEQ ID NO: 53 (MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP)中所述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，該信號肽包含SEQ ID NO: 53(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP)中所述之胺基酸序列。

在一些態樣中，可用於修飾本文所述之免疫細胞的聚核苷酸包含單一信號肽(例如，SEQ ID NO: 53或54)。在一些態樣中，該聚核苷酸包含多個信號肽(例如，至少兩個、三個、四個或更多個)。在涉及多個信號肽之情況下，在一些態樣中，多個信號肽中之每一個均為不同的。在一些態樣中，多個信號肽中之兩個或更多個為相同的。 連接體

在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白且使用本文所提供之方法進行培養)已經修飾以另外包含編碼連接體之外源核苷酸序列。因此，在一些態樣中，本文所述之免疫細胞已經修飾以具有增加水準之c-Jun蛋白(例如，具有編碼c-Jun蛋白之外源核苷酸序列及/或能夠增加內源c-Jun蛋白表現之轉錄活化子)且包含：編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列及編碼連接體之外源核苷酸序列。在一些態樣中，該免疫細胞已經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白且包含：編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列、編碼EGFRt之外源核苷酸序列及編碼連接體之外源核苷酸序列。在一些態樣中，該免疫細胞已經修飾以表現增加水準之c-Jun蛋白且包含：編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列、編碼EGFRt之外源核苷酸序列、編碼間隔子之外源核苷酸序列及編碼連接體之外源核苷酸序列。在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有增加水準之c-Jun蛋白且包含：編碼ROR1結合蛋白之外源核苷酸序列、編碼EGFRt之外源核苷酸序列、編碼間隔子之外源核苷酸序列、編碼信號肽之外源核苷酸序列及編碼連接體之外源核苷酸序列。

在涉及多個外源核苷酸序列之情況下，在一些態樣中，該一或多個外源核苷酸序列為單一多順反子聚核苷酸之一部分。對於此類態樣，該連接體可在本文所述之聚核苷酸的任何不同組分之間。例如，在一些態樣中，聚核苷酸(例如，多順反子)包含：(i)編碼c-Jun多肽之第一外源核苷酸序列，(ii)編碼連接體之第二外源核苷酸序列，及(iii)編碼ROR1結合蛋白(例如，CAR、TCR、caTCR、CSR或TCR模擬物)之第三核苷酸序列，其中第二核苷酸序列係在第一與第三核苷酸序列之間，使得c-Jun蛋白藉由連接體與ROR1結合蛋白連接。在一些態樣中，本揭示案之聚核苷酸可包含多個編碼連接體之核苷酸序列(例如，至少兩個單獨核苷酸序列)。在一些態樣中，多個連接體為相同的。在一些態樣中，多個連接體為不同的。

在一些態樣中，該連接體為肽連接體。在一些態樣中，該連接體包含至少約1個胺基酸、至少約2個胺基酸、至少約3個胺基酸、至少約4個胺基酸、至少約5個胺基酸、至少約6個胺基酸、至少約7個胺基酸、至少約8個胺基酸、至少約9個胺基酸、至少約10個胺基酸、至少約11個胺基酸、至少約12個胺基酸、至少約13個胺基酸、至少約14個胺基酸、至少約15個胺基酸、至少約16個胺基酸、至少約17個胺基酸、至少約18個胺基酸、至少約19個胺基酸、至少約20個胺基酸、至少約25個胺基酸或至少約30個胺基酸。在一些態樣中，該連接體富含甘胺酸(例如，用於撓性)。在一些態樣中，該連接體包含絲胺酸及/或蘇胺酸(例如，用於溶解度)。在一些態樣中，該連接體為Gly/Ser連接體。

在一些態樣中，該甘胺酸/絲胺酸連接體係根據式[(Gly)n-Ser]m (SEQ ID NO: 77)，其中n為1至100之任何整數且m為1至100之任何整數。在一些態樣中，該甘胺酸/絲胺酸連接體係根據式[(Gly)x-(Ser)y]z(SEQ ID NO: 78)，其中x為1至4之整數，y為0或1，且z為1至50之整數。在一些態樣中，該Gly/Ser連接體包含序列Gn(SEQ ID NO: 79)，其中n可為1至100之整數。在一些態樣中，視情況選用之連接體可包含序列(GlyAla)n (SEQ ID NO: 80)，其中n係在1與100之間的整數。

在一些態樣中，視情況選用之連接體的序列為GGGG(SEQ ID NO: 81)。在一些態樣中，視情況選用之連接體的序列為GGGSG(SEQ ID NO: 82)。

在一些態樣中，視情況選用之連接體包含序列(GGGSG)n (SEQ ID NO: 64)。在一些態樣中，視情況選用之連接體包含序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 65)。在一些態樣中，視情況選用之連接體可包含序列(GGGS)n (SEQ ID NO: 66)。在一些態樣中，視情況選用之連接體可包含序列(GGS)n (SEQ ID NO: 67)。在此等情況中，n可為1至100之整數。在其他情況中，n可為1至20之整數，亦即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些態樣中，n為1至100之整數。

視情況選用之連接體的實例包括但不限於例如GSGSGS(SEQ ID NO: 68)、GGSGG(SEQ ID NO: 69)、SGGSGGS(SEQ ID NO: 70)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO: 71)、GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 72)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO: 73)或 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 74)。

在一些態樣中，視情況選用之連接體包含序列PGG。在一些態樣中，除甘胺酸及絲胺酸以外，視情況選用之連接體亦包含額外胺基酸。在一些態樣中，視情況選用之連接體包含1、2、3、4或5個非gly/非ser胺基酸。在一些態樣中，該Gly/Ser連接體包含至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少95%之甘胺酸或絲胺酸胺基酸。

在一些特定態樣中，視情況選用之連接體的長度在1與10個胺基酸之間。在一些態樣中，視情況選用之連接體的長度係在約5個與約10個胺基酸之間、在約10個與約20個胺基酸之間、在約20個與約30個胺基酸之間、在約30個與約40個胺基酸之間、在約40個與約50個胺基酸之間、在約50個與約60個胺基酸之間、在約60個與約70個胺基酸之間、在約70個與約80個胺基酸之間、在約80個與約90個胺基酸之間或在約90個與約100個胺基酸之間。

在一些態樣中，該連接體為不可裂解之連接體，使得該連接體及本文所提供之聚核苷酸的不同組分(例如，c-Jun蛋白及ROR1結合蛋白)係表現為單一多肽。在一些態樣中，該連接體為可裂解連接體。如本文所用，術語「可裂解連接體」係指包含裂解位點之連接體，使得在表現時可選擇性地裂解以產生兩種或更多種產物。在一些態樣中，該連接體係選自P2A連接體、T2A連接體、F2A連接體、E2A連接體、弗林蛋白酶裂解位點或其任何組合(參見下表9)。在一些態樣中，該連接體進一步包含GSG連接體序列。在一些態樣中，可用於本揭示案之連接體包含內部核糖體進入位點(IRES)，使得在轉譯期間產生由第一及第二基因編碼之單獨多肽。可用於本揭示案之連接體的額外描述提供於例如WO 2020/223625 A1及 US 2019/0276801 A1中，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。

在一些態樣中，該連接體包含P2A連接體。在一些態樣中，該連接體包含與SEQ ID NO: 14中所述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，該連接體包含SEQ ID NO: 14中所述之胺基酸序列。

在一些態樣中，該連接體包含T2A連接體。在一些態樣中，該連接體包含與SEQ ID NO: 15中所述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，該連接體包含SEQ ID NO: 15中所述之胺基酸序列。

在一些態樣中，該連接體包含F2A連接體。在一些態樣中，該連接體包含與SEQ ID NO: 16中所述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，該連接體包含SEQ ID NO: 16中所述之胺基酸序列。

在一些態樣中，該連接體包含E2A連接體。在一些態樣中，該連接體包含與SEQ ID NO: 17中所述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，該連接體包含SEQ ID NO: 17中所述之胺基酸序列。

在一些態樣中，該連接體包含有包含弗林蛋白酶裂解位點之胺基酸序列。在一些態樣中，該連接體包含與SEQ ID NO: 18中所述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，該連接體包含SEQ ID NO: 18中所述之胺基酸序列。

由以上揭示內容顯而易見，在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，經修飾且使用本文所提供之方法進行培養)包含外源聚核苷酸，該外源聚核苷酸包含(自5'至3')：(i)編碼c-Jun多肽之第一核苷酸序列，(ii)編碼第一連接體(例如，P2A連接體)之第二核苷酸序列，(iii)編碼第一信號肽(例如，hIgκ)之第三核苷酸序列，(iv)編碼ROR1結合蛋白(例如，scFv)之第四核苷酸序列，(v)編碼第二連接體(例如，GGGSG；SEQ ID NO: 40)之第五核苷酸序列，(vi)編碼間隔子(例如，IgG2鉸鏈源性間隔子)之第六核苷酸序列，(vii)編碼跨膜結構域(例如，CD28)之第七核苷酸序列，(viii)編碼共刺激結構域(例如，4-1BB)之第八核苷酸序列，(ix)編碼細胞內信號傳導結構域(例如，CD3ζ)之第九核苷酸序列，(x)編碼第三連接體(例如，P2A連接體)之第十核苷酸序列，(xi)編碼第二信號肽(例如，GMCSFRαSP)之第十一核苷酸序列，及(xii)編碼EGFRt之第十二核苷酸序列。 遞送載體

在一些態樣中，本文提供可用於修飾本文所述之免疫細胞(例如，使用本文所提供之方法進行培養)的載體(例如，表現載體)。在一些態樣中，本文所述之載體包含多個(例如，2、3或4個或更多個)聚核苷酸，其中該多個聚核苷酸各自編碼本文所述之蛋白質(例如，c-Jun蛋白、ROR1結合蛋白(例如CAR)或EGFRt)。因此，在一些態樣中，載體包含多順反子載體(例如，雙順反子載體或三順反子載體)。在一些態樣中，本文所述之聚核苷酸包含於同一載體上(例如，多順反子表現載體上)。在一些態樣中，編碼本文所述之蛋白質(例如，c-Jun蛋白、ROR1結合蛋白(例如CAR)或EGFRt)之聚核苷酸提供於一或多個單獨載體上。

如本文所述，此類載體可用於宿主細胞及靶向用於治療干預之細胞中之重組表現。如本文所用，術語「載體」意欲指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子；或包含此類能夠轉運另一核酸之核酸分子的實體。在一些態樣中，該載體為「質體」，其係指其中可接合額外DNA區段之環狀雙股DNA環。在一些態樣中，該載體為病毒載體，其中額外DNA區段可接合至病毒基因體中。某些載體或作為載體部分之聚核苷酸能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中後整合至宿主細胞之基因體中，且由此與宿主基因體一起複製。另外，某些載體能夠引導其可操作性連接之基因之表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體形式。在本揭示案中，「質體」及「載體」有時可互換使用，視上下文而定，此乃因質體係最常用之載體形式。然而，本文亦揭示其他形式之表現載體，諸如病毒載體(例如，慢病毒、複製缺陷型逆轉錄病毒、痘病毒、疱疹病毒、桿狀病毒、腺病毒及腺相關病毒)，其發揮等效功能。

在一些態樣中，載體包含本文所述之聚核苷酸(例如，編碼ROR1結合蛋白、c-Jun蛋白及/或EGFRt)及調節元件。例如，在一些態樣中，載體包含本文所述之聚核苷酸(例如，編碼ROR1結合蛋白、c-Jun蛋白及/或EGFRt)，該聚核苷酸可操作性連接至啟動子。在一些態樣中，該載體可包含多個啟動子(例如，至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或更多個)。例如，在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列可在第一啟動子之控制下，且編碼該聚核苷酸之一或多種額外組分(例如，ROR1結合蛋白)的核苷酸序列可在第二啟動子之控制下。在一些態樣中，多個啟動子中之每一者均為相同的。在一些態樣中，多個啟動子中之一或多者為不同的。

此項技術中已知之任何合適啟動子均可用於本揭示案。在一些態樣中，可用於本揭示案之啟動子包含哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成型或誘導型啟動子。在一些態樣中，用於本揭示案之啟動子包含至少一種組成型啟動子及至少一種誘導型啟動子，例如組織特異性啟動子。

組成型哺乳動物啟動子包括但不限於以下基因之啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子及其他組成型啟動子。組成型用於真核細胞中之例示性病毒啟動子包括例如來自巨細胞病毒(CMV)、猿病毒(例如，SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺乏病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒、巨細胞病毒、莫洛尼小鼠白血病病毒之長末端重複序列(LTR)及其他逆轉錄病毒的啟動子，以及單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子。如本文所述，在一些態樣中，可用於本揭示案之啟動子為誘導型啟動子。誘導型啟動子在誘導劑存在下表現。例如，金屬硫蛋白啟動子在某些金屬離子存在下經誘導以促進轉錄及轉譯。當存在多個誘導型啟動子時，其可由相同誘導劑分子或不同誘導劑誘導。

在一些態樣中，該啟動子包含骨髓增殖性肉瘤病毒增強子、缺失之陰性對照區、dl587rev引子結合位點取代之(MND)啟動子、EF1a啟動子或兩者。

在一些態樣中，可用於本揭示案之載體(例如，包含一或多個編碼c-Jun蛋白及/或配位體結合蛋白之核苷酸序列)進一步包含一或多種額外調節元件。調節元件之非限制性實例包括轉譯增強子元件(TEE)、轉譯起始序列、微小RNA結合位點或其種子、所連接核苷之3'尾區、富含AU之元件(ARE)、轉錄後控制調節劑、5' UTR、3' UTR、定位序列(例如，膜定位序列、細胞核定位序列、細胞核排斥序列或蛋白酶體靶向序列)、轉譯後修飾序列(例如，泛素化、磷酸化或去磷酸化)或其組合。

在一些態樣中，該載體可另外包含可轉位元件。因此，在一些態樣中，該載體包含本文所述之聚核苷酸(例如，編碼c-Jun蛋白及/或配位體結合蛋白)，該聚核苷酸側接至少兩個轉位子特異性反向末端重複序列(ITR)。在一些態樣中，轉位子特異性ITR係由DNA轉位子識別。在一些態樣中，轉位子特異性ITR係由逆轉錄轉位子識別。此項技術中已知之任何轉位子系統均可用於將核酸分子引入宿主細胞(例如，免疫細胞)之基因體中。在一些態樣中，該轉位子係選自hAT樣Tol2、睡美人(Sleeping Beauty，SB)、Frog Prince、piggyBac (PB)及其任何組合。在一些態樣中，該轉位子包含睡美人。在一些態樣中，該轉位子包含piggyBac。參見例如Zhao等人， Transl. Lung Cancer Res. 5(1):120-25(2016)，其以引用之方式整體併入本文中。

在一些態樣中，該載體為轉移載體。術語「轉移載體」係指包含經分離之核酸(例如，本文所述之聚核苷酸)且可用於將經分離之核酸遞送至細胞內部之物質組合物。多種載體為此項技術中已知的，包括但不限於線性聚核苷酸、與離子或兩親化合物相關之聚核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應解釋為進一步包括促進核酸轉移至細胞中之非質體且非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。病毒轉移載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體及其類似物。

在一些態樣中，該載體為表現載體。術語「表現載體」係指包含重組聚核苷酸之載體，該重組聚核苷酸包含與待表現之核苷酸序列可操作性連接之表現控制序列。表現載體包含足以用於表現之順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主細胞或在活體外表現系統中提供。表現載體包括此項技術中已知之所有彼等載體，包括併入重組聚核苷酸之黏接質體、質體(例如，裸露或含於脂質體中)及病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

在一些態樣中，該載體為病毒載體、哺乳動物載體或細菌載體。在一些態樣中，該載體係選自由以下組成之群：腺病毒載體、慢病毒、仙台病毒載體、桿狀病毒載體、Epstein Barr病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、雜合病毒載體及腺相關病毒(AAV)載體。

在一些態樣中，該腺病毒載體為第三代腺病毒載體。ADEASY™係迄今用於產生腺病毒載體構築體之最流行方法。該系統由兩種類型之質體組成：穿梭(或轉移)載體及腺病毒載體。將相關轉殖基因選殖至穿梭載體中，進行驗證，且用限制酶PmeI使其線性化。接著將此構築體轉化至ADEASIER-1細胞中，該等細胞係含有PADEASY™之BJ5183大腸桿菌細胞。PADEASY™係約33 Kb之腺病毒質體，其含有病毒產生所必需之腺病毒基因。穿梭載體及腺病毒質體具有匹配之左右同源臂，該等臂促進將轉殖基因同源重組至腺病毒質體中。吾人亦可用超螺旋PADEASY™及穿梭載體共轉化標準BJ5183，但此方法導致非重組腺病毒質體之較高背景。接著，驗證重組腺病毒質體之大小及適當限制性消化模式，以確定轉殖基因已插入腺病毒質體中，且未出現其他重組模式。一旦經驗證，即用PacI使重組質體線性化以產生側接ITR之線性dsDNA構築體。用該線性化構築體轉染293或911細胞，且可在約7-10天後收集病毒。除了此方法以外，在申請本申請案時此項技術中已知之用於產生腺病毒載體構築體之其他方法亦可用於實踐本文所揭示之方法。

在一些態樣中，該病毒載體為逆轉錄病毒載體，例如慢病毒載體(例如，第三代或第四代慢病毒載體)。術語「慢病毒」係指逆轉錄病毒科之一個屬。慢病毒在逆轉錄病毒中為獨一無二的，因為其能夠感染非分裂細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其係基因遞送載體的最有效方法之一。HIV、SIV及FIV為慢病毒之所有實例。術語「慢病毒載體」係指源自慢病毒基因體之至少一部分的載體，尤其包括如Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中所提供之自失活慢病毒載體。可用於臨床中之慢病毒載體的其他實例包括但不限於例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAX™載體系統及其類似物。亦可獲得非臨床類型之慢病毒載體且其將為熟習此項技術者已知的。

慢病毒載體通常在瞬時轉染系統中產生，其中細胞株經三個獨立質體表現系統轉染。此等系統包括轉移載體質體(HIV前病毒之部分)、包裝質體或構築體以及具有不同病毒之異源包膜基因( env)之質體。將該載體之三種質體組分放入包裝細胞中，接著將該包裝細胞插入HIV殼中。該載體之病毒部分含有插入序列，使得病毒不能在細胞系統內複製。當前第三代慢病毒載體僅編碼九種HIV-1蛋白中之三種(Gag、Pol、Rev)，該等HIV-1蛋白由單獨質體表現以避免重組介導之複製勝任病毒產生。在第四代慢病毒載體中，逆轉錄病毒基因體已進一步減少(參見例如TAKARA® LENTI-X™第四代包裝系統)。

在一些態樣中，非病毒方法可用於將本文所述之聚核苷酸(例如，編碼c-Jun蛋白及/或ROR1結合蛋白)遞送至免疫細胞中。在一些態樣中，非病毒方法包括使用轉位子。在一些態樣中，使用非病毒遞送方法允許細胞(例如，T細胞或NK細胞)之再編程，及將細胞直接輸注至個體中。在一些態樣中，可藉由使用CRISPR/Cas系統及基因體編輯替代方案，諸如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALEN)及大範圍核酸酶(MN)，將聚核苷酸插入至標靶細胞(例如，T細胞)或宿主細胞(例如，用於重組表現所編碼蛋白質之細胞)之基因體中。非病毒遞送系統亦包括電穿孔、細胞擠壓、奈米粒子(包括脂質奈米粒子)、金奈米粒子、聚合物奈米粒子。說明性非病毒遞送系統包括且描述於例如EbioMedicine 2021年5月; 67:103354中。

在一些態樣中，本文所揭示之載體(例如，慢病毒載體)包含有包含一或多個核苷酸序列之聚核苷酸，該等核苷酸序列編碼(i) c-Jun蛋白及(ii)抗原結合結構域(例如，抗ROR1 scFv)。在一些態樣中，該載體包含有包含一或多個核苷酸序列之聚核苷酸，該等核苷酸序列編碼(i)c-Jun蛋白，(ii)抗原結合結構域(例如，抗ROR1 scFv)，及(iii) EGFRt。在一些態樣中，該載體包含有包含一或多個核苷酸序列之聚核苷酸，該等核苷酸序列編碼(i)c-Jun蛋白，(ii)抗原結合結構域(例如，抗ROR1 scFv)，(iii)跨膜結構域(例如，CD28)，(iv)共刺激結構域(4-1BB)，(v)細胞內信號傳導結構域(CD3ζ)，及(vi) EGFRt。在一些態樣中，該一或多個核苷酸序列另外編碼連接體、間隔子、信號肽或其組合。例如，在一些態樣中，本文所述之載體包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含(自5'至3')：(i)編碼c-Jun蛋白之第一核苷酸序列，(ii)編碼第一連接體(例如，P2A連接體)之第二核苷酸序列，(iii)編碼第一信號肽(例如，hIgκ)之第三核苷酸序列，(iv)編碼抗原結合結構域(例如，抗ROR1 scFv)之第四核苷酸序列，(v)編碼第二連接體(例如，GGGSG；SEQ ID NO: 40)之第五核苷酸序列，(vi)編碼間隔子(例如，IgG2鉸鏈源性間隔子)之第六核苷酸序列，(vii)編碼跨膜結構域(例如，CD28)之第七核苷酸序列，(viii)編碼共刺激結構域(例如，4-1BB)之第八核苷酸序列，(ix)編碼細胞內信號傳導結構域(例如，CD3ζ)之第九核苷酸序列，(x)編碼第三連接體(例如，P2A連接體)之第十核苷酸序列，(xi)編碼第二信號肽(例如，GM-CSF)之第十一核苷酸序列，及(xii)編碼EGFRt之第十二核苷酸序列。

在一些態樣中，本文所揭示之聚核苷酸(例如，編碼c-Jun蛋白及/或配位體結合蛋白)為DNA(例如，DNA分子或其組合)、RNA(例如，RNA分子或其組合)或其任何組合。在一些態樣中，該等聚核苷酸係呈基因體或cDNA形式之單股或雙股RNA或DNA(例如，ssDNA或dsDNA)，或DNA-RNA雜合體，其中每一者均可包括經化學或生物化學修飾、非天然或衍生之核苷酸鹼基。如本文所述，此類核酸序列可包含可用於促進所編碼多肽之表現及/或純化的額外序列，包括但不限於polyA序列、經修飾Kozak序列以及編碼抗原決定基標籤、輸出信號及分泌信號、細胞核定位信號及質膜定位信號之序列。熟習此項技術者應顯而易知，基於本文中之教示，何種核苷酸序列將編碼本文所述之不同多肽(例如，ROR1結合蛋白、c-Jun蛋白及/或EGFRt)。 III. 本揭示案之組合物

本揭示案之某些態樣係關於一種細胞組合物，其包含根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)群體。本揭示案之某些態樣係關於一種包含免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)群體之細胞組合物，該等免疫細胞經修飾以表現與參考免疫細胞(例如，未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應細胞)相比增加水準之c-Jun多肽且根據本文所揭示之方法進行培養。如與根據習知方法(例如，在含有低於5 mM K ⁺之培養基中)培養的可比較細胞相比，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之代謝再編程培養基中培養的細胞群體具有增加之低分化細胞數目。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現幹細胞樣表型所特有之一或多種標記物的增加之表現。在一些態樣中，如與根據習知方法(例如，在含有低於5 mM K ⁺之培養基中)培養的可比較細胞相比，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之代謝再編程培養基中培養的細胞群體具有增加之效應子樣細胞數目。在一些態樣中，如與根據習知方法(例如，在含有低於5 mM K ⁺之培養基中)培養的可比較細胞相比，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之代謝再編程培養基中培養的細胞群體具有增加之幹細胞樣及效應子樣細胞數目。在一些態樣中，與根據習知方法培養之細胞相比，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現較大增殖潛力。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現增加之轉導效率。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞在移植於個體中之後展現增加之活體內活力。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現增加之細胞效能。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現減少之細胞耗竭。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞在移植於個體中之後展現增加之活體內持久性。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞在移植於個體中之後展現增加之活體內活性。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞在移植於個體中之後展現更持久之活體內反應。在一些態樣中，個體為人類。

在一些態樣中，細胞組合物中之至少約5%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約10%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約15%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約20%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約25%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約30%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約35%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約40%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約45%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約50%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約55%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約60%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約65%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約70%細胞具有幹細胞樣表型。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD8 ⁺T細胞的總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD4 ⁺T細胞的總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞(亦即，富含TPE基因印記之T細胞)的比例增加係在約1.5倍與約20倍之間。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞的比例增加係在約2倍與約10倍之間。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞的比例增加係在約2倍與約5倍之間。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約2倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約2.5倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約3倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約3.5倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約4倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約4.5倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約5倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約5.5倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約6倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約6.5倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約7倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約7.5倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約8倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約8.5倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約9倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約10倍。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，耗竭T細胞(例如，富含TTE基因印記之T細胞)的比例減少至少約1/4且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，耗竭T細胞之比例減少至少約1/3且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，耗竭T細胞之比例減少至少約1/2且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，耗竭T細胞之比例減少至少約3/4且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，幹細胞樣T細胞之比例增加至少約1.5倍且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，幹細胞樣T細胞之比例增加至少約2倍且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，幹細胞樣T細胞之比例增加至少約2.5倍且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，幹細胞樣T細胞之比例增加至少約3倍且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，幹細胞樣T細胞之比例增加至少約3.5倍且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，幹細胞樣T細胞之比例增加至少約4倍且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，幹細胞樣T細胞之比例增加至少約5倍且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞後，幹細胞樣T細胞之比例增加至少約6倍且前驅細胞耗竭T細胞之比例增加至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或至少約10倍。

在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之表現一或多種幹細胞樣標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，及增加百分率之表現一或多種TPE標記物的免疫細胞。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之表現至少兩種幹細胞樣標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，及增加百分率之表現一或多種TPE標記物的免疫細胞。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之表現至少三種幹細胞樣標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，及增加百分率之表現一或多種TPE標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之表現至少四種幹細胞樣標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，及增加百分率之表現一或多種TPE標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之表現一或多種幹細胞樣標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，及增加百分率之表現至少兩種TPE標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之表現一或多種幹細胞樣標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，及增加百分率之表現至少三種TPE標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之表現一或多種幹細胞樣標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，及增加百分率之表現至少四種TPE標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之表現一或多種幹細胞樣標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，及增加百分率之表現至少五種TPE標記物的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。

在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中在約4%與約10%之間的細胞為前驅細胞耗竭T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中在約4%與約9%之間的細胞為前驅細胞耗竭T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中在約4%與約8%之間的細胞為前驅細胞耗竭T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中在約4%與約7%之間的細胞為前驅細胞耗竭T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中在約4%與約6%之間的細胞為前驅細胞耗竭T細胞。

在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞且至少約4%之細胞為幹細胞樣T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞且至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為幹細胞樣T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞且至少約4%為幹細胞樣T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞且至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為幹細胞樣T細胞。

在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞且少於約20%之細胞為終末耗竭細胞(TTE)。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞且少於約20%、約19%、約18%、約17%、約16%或約15%之細胞為終末耗竭細胞(TTE)。

在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞，至少約4%之細胞為幹細胞樣T細胞且少於約20%之細胞為TTE。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞，至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為幹細胞樣T細胞且少於約20%之細胞為TTE。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞，至少約4%為幹細胞樣T細胞且少於約20%之細胞為TTE。在一些態樣中，本文中之細胞組合物包含免疫細胞群體，其中至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為前驅細胞耗竭T細胞，至少約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%之細胞為幹細胞樣T細胞且少於約20%之細胞為TTE。

在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約1.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約2.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約2.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約3.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約3.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約4.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約4.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約5.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約5.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約6.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約6.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約7.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約7.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約8.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約9.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約10倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約15倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約20倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約30倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約40倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約50倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約75倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約100倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約500倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約1000倍。

在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約70%為CD39 ^-/TCF7 ⁺T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%為CD39 ^-/TCF7 ⁺T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD4 ⁺T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD8 ⁺T細胞。

在一些態樣中，該細胞組合物包含免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞不表現CD45RO。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CCR7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD62L。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現TCF7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD3。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD27。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95及CD45RA。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA及CCR7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA及CCR7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA、CCR7及CD62L。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA、CCR7及CD62L。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L及TCF7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L及TCF7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27，且不表現CD45RO或為CD45RO ^低。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27，且不表現CD45RO或為CD45RO ^低。

在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞不表現CD39及CD69。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD8，且不表現CD39及CD69。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約40%為CD39 ^-/CD69 ^-T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%為CD39 ^-/CD69 ^-T細胞。

在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現(i)一或多種幹細胞樣標記物及(ii)一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現至少兩種幹細胞樣標記物及一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現至少三種幹細胞樣標記物及一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現至少四種幹細胞樣標記物及一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現一或多種幹細胞樣標記物及至少兩種效應子樣標記物。

在一些態樣中，幹細胞樣標記物係選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+ 、LEF1+、TCF7+及其任何組合。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含CD45RA+、CD62L+、CCR7+及TCF7+，或其任何組合。在一些態樣中，該細胞表現CD45RO ^低。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含本文中作為基因印記之一部分列出的一或多種基因(參見上文；參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-97 (2011)或Galletti等人，Nat Immunol 21, 1552-62 (2020))。

在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含在WNT信號傳導路徑中表現之基因。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含選自以下之一或多種基因：GNG2、PSMC3、PSMB10、PSMC5、PSMB8、PSMB9、AKT1、MYC、CLTB、PSME1、DVL2、PFN1、H2AFJ、LEF1、CTBP1、MOV10、HIST1H2BD、FZD3、ITPR3、PARD6A、LRP5、HIST2H4A、HIST2H3C、HIST1H2AD、HIST2H2BE、HIST3H2BB、DACT1及其任何組合。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含選自以下之一或多種基因：MYC、AKT1、LEF1及其任何組合。

在一些態樣中，效應子樣標記物係選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任何組合。在一些態樣中，效應子樣標記物包含選自由以下組成之群的STAT標靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及其任何組合。

在一些態樣中，效應子樣標記物為效應子記憶相關基因，該等基因包含選自以下之一或多種基因：TBCD、ARL4C、KLF6、LPGAT1、LPIN2、WDFY1、PCBP4、PIK343、FAS、LLGL2、PPP2R2B、TTC39C、GGA2、LRP8、PMAIP1、MVD、IL15RA、FHOD1、EML4、PEA15、PLEKHA5、WSB2、PAM、CD68、MSC、TLR3、S1PR5、KLRB1、CYTH3、RAB27B、SCD5及其任何組合。在一些態樣中，效應子樣標記物包含選自以下之一或多種基因：KLF6、FAS、KLRB1、TLR3及其任何組合。

在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD45RA+、STAT5+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD62L+、STAT5+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之TCF7+、STAT5+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+ 、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD45RA+、CD45RO-、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。

在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)包含選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及其任何組合之一或多種標記物以及選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任何組合之一或多種標記物。在一些態樣中，該免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)表現CD45RO ^低。在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)包含選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及其任何組合之一或多種標記物以及一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)包含一或多種幹細胞樣標記物以及選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任何組合之一或多種標記物。在一些態樣中，該免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)表現CD45RO ^低。

本揭示案之一些態樣係關於一種包含免疫細胞群體之細胞組合物，其中該免疫細胞群體包含(i)表現一或多種幹細胞樣標記物之第一免疫細胞亞群(例如幹細胞樣免疫細胞)及(ii)表現一或多種效應子樣標記物之第二免疫細胞亞群(例如效應子樣免疫細胞)，其中如與使用習知方法(例如，在具有小於5 mM鉀離子之培養基中)培養的免疫細胞群體相比，該免疫細胞群體包含較高百分率(亦即，幹細胞樣免疫細胞之數目/免疫細胞之總數)的表現一或多種幹細胞樣標記物之第一免疫細胞亞群。在一些態樣中，該等免疫細胞為T細胞。在一些態樣中，該等免疫細胞為NK細胞。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)產生此等細胞組合物。

在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)具有增加之表現(例如，更高百分率之表現GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT及/或NKG7之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞))，以及減少之表現(例如，更低百分率之表現IL-32之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞))。NKG7最高之細胞已顯示為較佳殺手(Malarkannan等人，2020 Nat. Immuno.)，而IL-32較高之細胞已顯示具有活化誘導之細胞死亡(Goda等人，2006 Int. Immunol)。在一些態樣中，具有較高GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT及/或NKG7表現之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係表現效應子樣標記物之CD8+ T細胞。在一些態樣中，具有較低IL-32表現之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係表現效應子樣標記物之CD8+ T細胞。

在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物(例如，用作療法之最終細胞產物的產量)包含至少約1×10 ⁵、5×10 ⁵、1×10 ⁶、5×10 ⁶、1×10 ⁷、5×10 ⁷、1×10 ⁸、5×10 ⁸、1×10 ⁹或5×10 ⁹個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約1×10 ³、5×10 ³、1×10 ⁴、5×10 ⁴、1×10 ⁵、5×10 ⁵、1×10 ⁶、5×10 ⁶、1×10 ⁷、5×10 ⁷、1×10 ⁸、5×10 ⁸、1×10 ⁹或5×10 ⁹個幹細胞樣細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約5×10 ⁹、6×10 ⁹、7×10 ⁹、8×10 ⁹、9×10 ⁹、1×10 ¹⁰、2×10 ¹⁰、3×10 ¹⁰、4×10 ¹⁰、5×10 ¹⁰、6×10 ¹⁰、7×10 ¹⁰、8×10 ¹⁰、9×10 ¹⁰、10×10 ¹⁰、11×10 ¹⁰、12×10 ¹⁰、13×10 ¹⁰、14×10 ¹⁰或15×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約1×10 ⁶個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約1×10 ⁶個幹細胞樣細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約1×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約2×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約3×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約4×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約5×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約6×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約7×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約8×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約9×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約10×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約11×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約12×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約13×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約14×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約15×10 ¹⁰個細胞。在一些態樣中，細胞產量代表CD3+細胞之總數。

在一些態樣中，截至在目前所揭示之培養基中培養至少約第10天，本文所揭示之方法產生包含至少約1×10 ¹⁰、至少約1.1×10 ¹⁰、至少約1.2×10 ¹⁰、至少約1.3×10 ¹⁰、至少約1.4×10 ¹⁰、至少約1.5×10 ¹⁰、至少約1.6×10 ¹⁰、至少約1.7×10 ¹⁰、至少約1.8×10 ¹⁰、至少約1.9×10 ¹⁰或至少約2.0×10 ¹⁰個細胞之組合物。在一些態樣中，截至在目前所揭示之培養基中培養至少約第10天，本文所揭示之方法產生包含至少約1.8×10 ¹⁰個細胞之組合物。

在一些態樣中，該細胞組合物包含至少約1 ×10 ¹⁰、至少約1.1×10 ¹⁰、至少約1.2×10 ¹⁰、至少約1.3×10 ¹⁰、至少約1.4×10 ¹⁰、至少約1.5×10 ¹⁰、至少約1.6×10 ¹⁰、至少約1.7×10 ¹⁰、至少約1.8×10 ¹⁰、至少約1.9×10 ¹⁰或至少約2.0×10 ¹⁰個幹細胞樣細胞。在一些態樣中，截至培養之至少約第10天，本文所揭示之方法產生包含至少約1×10 ¹⁰、至少約1.1×10 ¹⁰、至少約1.2×10 ¹⁰、至少約1.3×10 ¹⁰、至少約1.4×10 ¹⁰、至少約1.5×10 ¹⁰、至少約1.6×10 ¹⁰、至少約1.7×10 ¹⁰、至少約1.8×10 ¹⁰、至少約1.9×10 ¹⁰或至少約2.0×10 ¹⁰個幹細胞樣細胞之組合物。在一些態樣中，截至在目前所揭示之培養基中培養至少約第10天，本文所揭示之方法產生包含至少約1.8×10 ¹⁰個幹細胞樣細胞之組合物。

在一些態樣中，本文所揭示之方法產生包含至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%活力之免疫細胞之組合物。在一些態樣中，本文所揭示之方法產生包含至少約1.8×10 ¹⁰個具有至少約94%細胞活力之幹細胞樣細胞的組合物。 IV. 治療方法

本揭示案之一些態樣係關於投與本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)的方法。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體的疾病或病症之方法，其包括向該個體投與本文所述之免疫細胞。例如，在一些態樣中，本文揭示一種治療有需要之個體的疾病或病症之方法，其包括向該個體投與已經工程改造以表現ROR1結合蛋白(例如，CAR)且過表現c-Jun蛋白之免疫細胞。在一些態樣中，該疾病或疾患包含腫瘤(亦即，癌症)。在一些態樣中，該方法包括刺激T細胞介導之個體對標靶細胞群體或組織之免疫反應，包括投與本文所述之免疫細胞。在一些態樣中，標靶細胞群體包含腫瘤。在一些態樣中，該腫瘤為實體腫瘤。

在一些態樣中，與參考腫瘤體積相比，投與本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)會降低個體之腫瘤體積。在一些態樣中，參考腫瘤體積係投與之前個體之腫瘤體積。在一些態樣中，參考腫瘤體積係未接受投與之相應個體之腫瘤體積。在一些態樣中，與參考腫瘤體積相比，在投與之後，個體之腫瘤體積降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。

在一些態樣中，治療腫瘤包括降低個體之腫瘤重量。在一些態樣中，當投與至個體時，投與本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)可降低個體之腫瘤重量。在一些態樣中，與參考腫瘤重量相比，在投與之後，腫瘤重量降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，參考腫瘤重量係投與之前個體之腫瘤重量。在一些態樣中，參考腫瘤重量係未接受投與之相應個體之腫瘤重量。

在一些態樣中，將本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白(例如，抗ROR1 CAR)且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)投與至例如罹患腫瘤之個體可增加該個體之血液中的T細胞(例如，CD4 ⁺或CD8 ⁺)之數目及/或百分率。在一些態樣中，該等T細胞為經修飾免疫細胞。在一些態樣中，與參考(例如，未接受投與之個體或在投與之前同一個體中的相應值)相比，血液中之T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)的數目及/或百分率增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%或更多。在一些態樣中，與參考(例如，未接受投與之相應個體)相比，血液中之T細胞的數目及/或百分率增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍或更多。

在一些態樣中，將本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)投與至例如罹患腫瘤之個體可增加該個體之腫瘤及/或腫瘤微環境(TME)中的T細胞(例如，CD4 ⁺或CD8 ⁺)之數目及/或百分率。在一些態樣中，該等T細胞為經修飾免疫細胞。在一些態樣中，與參考(例如，未接受投與之個體或在投與之前同一個體中的相應值)相比，腫瘤及/或TME中之T細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白)的數目及/或百分率增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%或更多。在一些態樣中，與參考(例如，未接受投與之相應個體)相比，腫瘤及/或TME中之T細胞的數目及/或百分率增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍或更多。

在一些態樣中，相對於未接受投與(例如，用缺乏c-Jun蛋白表現之相應細胞治療)之相應個體的免疫反應持續時間，將本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)投與至例如罹患腫瘤之個體可增加個體的免疫反應持續時間。在一些態樣中，與參考(例如，未接受投與之相應個體)相比，免疫反應持續時間增加至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約75%、至少約100%、至少約150%、至少約200%、至少約300%、至少約400%、至少約500%或至少約1000%或更多。在一些態樣中，與參考(例如，未接受投與之相應個體)相比，免疫反應持續時間增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍或更多。在一些態樣中，如與參考(例如，未接受投與之相應個體)相比，免疫反應持續時間增加至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約1週、至少約2週、至少約3週、至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約1年、至少約2年、至少約3年、至少約4年或至少約5年。

如本文所述，本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)可用於治療多種癌症。可治療之癌症的非限制性實例包括腎上腺皮質癌、晚期癌症、肛門癌、再生障礙性貧血、膽管癌、膀胱癌、骨癌、骨轉移、腦腫瘤、腦癌、乳癌、兒童癌症、原發灶不明之癌症、Castleman病、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤文腫瘤家族、眼癌、膽囊癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤、妊娠滋養細胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、腎細胞癌、喉及下咽癌、急性淋巴細胞白血病、急性骨髓白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓白血病、慢性骨髓單核細胞白血病、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺類癌腫瘤、皮膚淋巴瘤、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、鼻腔及鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、垂體腫瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、成人軟組織肉瘤、基底細胞及鱗狀細胞皮膚癌、黑色素瘤、小腸癌、胃癌、睪丸癌、喉癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮肉瘤、陰道癌、陰門癌、華氏巨球蛋白血症、威爾姆氏腫瘤、由癌症治療引起之繼發性癌症及其組合。在一些態樣中，該癌症與實體腫瘤相關。

在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)與其他治療劑(例如，抗癌劑及/或免疫調節劑)組合使用。因此，在一些態樣中，一種治療本文所揭示之疾病或病症(例如，腫瘤)的方法包括投與本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)與一或多種額外治療劑的組合。此類劑可包括例如化學治療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術、輻射療法、共刺激分子活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法或其任何組合。

在一些態樣中，在投與額外治療劑之前或之後，將本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)投與至個體。在一些態樣中，與額外治療劑並行地，將本文所述之免疫細胞(經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)投與至個體。在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)及額外治療劑可作為醫藥學上可接受之載劑中的單一組合物並行地經投與。在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)及額外治療劑係作為獨立組合物並行地經投與。

在一些態樣中，在投與BCR-ABL/Src激酶抑制劑(諸如達沙替尼(dasatinib)或普納替尼(ponatinib))之前或之後，將本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)投與至個體。在一些態樣中，可投與達沙替尼或普納替尼來降低CAR-T細胞療法中有時可能出現之細胞毒性(例如，細胞介素風暴)。已知Src激酶在生理性T細胞活化中發揮重要作用。與此一致，達沙替尼已顯示以劑量依賴性方式顯著抑制抗原特異性生理性T細胞活化、增殖、細胞介素產生及脫粒(Schade等人，Blood 111:1366-77, 2008；Weichsel等人，Clin Cancer Res 14:2484-91, 2008)，且已顯示降低CAR-T細胞療法中之細胞毒性(參見例如US2021032363)。

在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)與標準照護治療(例如，手術、輻射及化學療法)組合使用。本文所述之方法亦可用作維持療法，例如意欲預防腫瘤發生或復發之療法。

在一些態樣中，本文所提供之免疫細胞(例如，經修飾以表現ROR1結合蛋白且具有增加水準之c-Jun蛋白，且使用本文所提供之方法進行培養)與一或多種抗癌劑組合使用，使得可靶向免疫路徑之多種元件。此類組合之非限制性實例包括：增強腫瘤抗原呈遞之療法(例如，樹突狀細胞疫苗、GM-CSF分泌細胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特(imiquimod))；抑制陰性免疫調節之療法，例如藉由抑制CTLA-4及/或PD1/PD-L1/PD-L2路徑及/或清除或阻斷Treg或其他免疫抑制細胞(例如骨髓源性抑制細胞)；刺激陽性免疫調節之療法，例如使用刺激CD-137、OX-40及/或CD40或GITR路徑及/或刺激T細胞效應子功能之促效劑；全身性增加抗腫瘤T細胞頻率之療法；清除或抑制Treg (諸如腫瘤中之Treg)之療法，例如使用CD25拮抗劑(例如達利珠單抗(daclizumab))或藉由離體抗CD25珠粒清除；影響腫瘤中之抑制骨髓細胞的功能之療法；增強腫瘤細胞之免疫原性之療法(例如蒽環)；過繼性T細胞或NK細胞轉移，包括經遺傳工程改造之細胞，例如經工程改造以表現嵌合抗原受體之細胞(CAR-T療法)；抑制代謝酶(諸如吲哚胺雙加氧酶(IDO)、雙加氧酶、精胺酸酶或一氧化氮合成酶)之療法；逆轉/防止T細胞無反應性或耗竭之療法；觸發腫瘤位點處之先天性免疫活化及/或發炎之療法；投與免疫刺激細胞介素；阻斷免疫阻抑性細胞介素；或其任何組合。

在一些態樣中，抗癌劑包含免疫檢查點抑制劑(亦即，阻斷通過特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。可用於本發明方法中之免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括CTLA-4拮抗劑(例如抗CTLA-4抗體)、PD-1拮抗劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體)、TIM-3拮抗劑(例如抗TIM-3抗體)或其組合。此類免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括以下：抗PD1抗體(例如尼沃魯單抗(nivolumab，OPDIVO ^®)、派姆單抗(pembrolizumab，KEYTRUDA ^®；MK-3475)、匹利珠單抗(pidilizumab，CT-011)、PDR001 、MEDI0680(AMP-514)、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091、SHR-1210及其組合)；抗PD-L1抗體(例如阿替珠單抗(atezolizumab，TECENTRIQ ^®；RG7446； MPDL3280A；RO5541267)、德瓦魯單抗(durvalumab，MEDI4736、IMFINZI ^®)、BMS-936559、阿維魯單抗 (avelumab，BAVENCIO ^®)、LY3300054、CX-072 (Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035、MDX-1105及其組合)；及抗CTLA-4抗體(例如伊匹單抗(ipilimumab，YERVOY ^®)、曲美木單抗(tremelimumab，替西莫單抗(ticilimumab)；CP-675,206)、AGEN-1884、ATOR-1015及其組合)。

在一些態樣中，抗癌劑包含免疫檢查點活化劑(亦即，促進通過特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。在一些態樣中，免疫檢查點活化劑包含OX40促效劑(例如抗OX40抗體)、LAG-3促效劑(例如抗LAG-3抗體)、4-1BB (CD137)促效劑(例如抗CD137抗體)、GITR促效劑(例如抗GITR抗體)、TIM3促效劑(例如抗TIM3抗體)或其組合。

除非另外指示，否則本揭示案之實踐將使用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉殖基因生物學、微生物學、重組DNA以及免疫學之習知技術，該等技術在此項技術之技能範圍內。此類技術在文獻中有充分說明。參見例如Sambrook等人編(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人編(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover編,(1985) DNA Cloning,第I卷及第II卷；Gait編(1984) Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人，美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編(1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編(1984) Transcription And Translation；Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press)(1986)；Perbal(1984) A Practical Guide To Molecular Cloning；論文Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller及Calos編(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人編，Methods In Enzymology,第154卷及第155卷；Mayer及Walker編，(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir及Blackwell編, (1986) Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1986)；Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications,第2版CRC Press (2007)以及Ausubel等人(1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)。

上文所引用之所有參考文獻以及本文所引用之所有參考文獻及胺基酸或核苷酸序列(例如，GenBank編號及/或Uniprot編號)均以引用之方式整體併入本文中。

以下實例係以說明方式而非限制方式提供。實例實例 1 ： CAR 轉導效率分析

為了評估代謝再編程培養基對CAR轉導效率之影響，在代謝再編程培養基(MRM)或T細胞條件培養基(亦即，TCM)中用抗ROR1 CAR構築體轉導人類CD4+及CD8+ T細胞。下文提供用於進行本實例之例示性方法。 培養基製備

向用作對照之T細胞條件培養基(TCM)補充免疫細胞血清替代物(Thermo Fisher)、2 mM L-麩醯胺酸(Gibco)、2 mM Glutamax(Gibco)、MEM非必需胺基酸溶液(Gibco)、丙酮酸鈉(Gibco)；IL-2，200 IU/mL；IL-7，1200 IU/ml；IL-15，200 IU/ml。

使用補充有不同濃度之鈉、鉀、葡萄糖及鈣的TCM來產生代謝再編程培養基(MRM)。最終濃度係在以下範圍內：NaCl(40-80 mM)、KCl(40-80 mM)、鈣(0.5-2.8 mM)、葡萄糖(10-24 mM)及重量滲透濃度(約250-260 mOsmol)。參見表 10 。 慢病毒載體 (LVV) 構築及慢病毒產生

產生包含以下組分之抗ROR1 CAR構築體：(i)抗ROR1 CAR (源於R12抗體) (本文中稱作「R12 CAR」) (SEQ ID NO: 83)，(ii)經截短之EGFR (「EGFRt」) (SEQ ID NO: 24)，及(iii)野生型c-Jun蛋白(SEQ ID NO: 13) (本文中稱作「c-Jun-R12 CAR」；SEQ ID NO: 86)。參見表14 (下文)。設計c-Jun-R12 CAR構築體，使得當在細胞(例如，T細胞)中轉導時，經轉導細胞將展現增加之c-Jun蛋白表現以及抗ROR1 CAR及EGFRt之表面表現。作為對照，亦產生包含經截短之CD19(「CD19t」)來替代c-Jun之相應抗ROR1 CAR構築體(本文中稱作「對照CD19t-R12 CAR」)。參見Terakura, S.等人， Blood119(1): 72-82 (2012)，其以引用之方式整體併入本文中。

用VSV-G包膜使慢病毒載體假型化，且藉由HEK293T細胞之瞬時轉染產生慢病毒載體。使半成品在2℃-8℃下保持不超過24小時，接著填充1 mL LVV等分試樣且儲存於-80℃下。使LVV等分試樣在冰上解凍，接著進行T細胞轉導。 T 細胞分離

自三個健康供體分離CD4+及CD8+ T細胞且使用供應商BloodWorks(Seattle, WA, USA)及AllCells (Alameda, CA, USA)進行冷凍。該等供應商自該等供體獲得且維持所有適當同意書。為了分離CD4+及CD8+ T細胞，經由血球分離術收集樣品，其中分別分離出CD4+及CD8+細胞，次序係首先陽性選擇CD8+ T細胞，隨後陽性選擇來自CD8選擇之流出物(flow-through)的CD4+ T細胞。以每個小瓶20E+06個細胞(AllCells)或50E+06個細胞(BloodWorks)冷凍經分離之CD4+或CD8+ T細胞。 細胞培養及轉導

使健康供體冷凍保存之人類CD4+及CD8+ T細胞(亦即，來自供應商)在適當培養基(亦即，TCM或MRM)中解凍且以1:1比率組合。使經組合之供體CD4+及CD8+ T細胞在300 x g下離心持續5分鐘且再懸浮於補充有IL-2、IL-7及IL-15之適當培養基(亦即，T細胞條件培養基或MRM)中。接著使用CD3/CD28 TRANSACT™ (Miltenyi Biotec Inc.)來活化T細胞。在TCM或MRM中活化24小時(亦即，第1天)之後，用包含抗ROR1 CAR構築體(亦即，「c-Jun-R12 CAR」及「對照CD19t-R12 CAR」)之上述LVV轉導T細胞。未轉導之T細胞用作對照。在轉導之後次日(亦即，第2天)，添加新鮮培養基(亦即，TCM或MRM)以稀釋TRANSACT™且終止T細胞活化。使經轉導T細胞進一步擴增持續另外五天(亦即，第7天)，且接著隨後進行分析或冷凍保存於液氮中以供長期儲存。 轉導效率分析

為了比較不同組之CAR轉導效率(參見表11)，使用流式細胞術來測定表現以下之CD4+及CD8+ T細胞的百分率：(i)c-Jun、抗ROR1 R12 scFv及包含SEQ ID NO: 24中所述之序列的EGFRt，或(ii)c-Jun、抗ROR1 R12 scFv及經截短之CD19。表 11. 實驗組

組號	描述
1	在TCM中培養之未轉導T細胞
2	用對照CD19t-R12 CAR轉導且在TCM中培養之T細胞
3	用c-Jun-R12 CAR轉導且在TCM中培養之T細胞
4	在MRM中培養之未轉導T細胞
5	用對照CD19t-R12 CAR轉導、在MRM中培養之T細胞
6	用c-Jun-R12 CAR轉導、在MRM中培養之T細胞

如圖1A-圖1C所示，在TCM及MRM組中以及在每個供體內，對照CD19t-R12 CAR與c-Jun-R12 CAR之間的轉導效率相當。同樣，如在TCM與MRM組之間，經轉導T細胞(亦即，表現EGFRt及R12 CAR兩者)之百分率相當。在每個供體內，亦未觀察到來自不同組之經轉導CD4+及CD8+ T細胞的百分率之顯著差異(參見圖2A-圖2C)。有趣的是，與來自TCM組之相應經轉導T細胞相比，來自MRM組的經c-Jun-R12 CAR轉導之T細胞表現顯著更高水準之c-Jun蛋白表現(參見圖3A-圖3C)。該增加之表現對c-Jun蛋白具特異性且對其他轉殖基因(亦即，R12 CAR及EGFRt)不具全域性。

此等結果表明本文所述之抗ROR1 CAR構築體能夠在兩種培養條件下以相似程度轉導至T細胞中。結果進一步表明代謝再編程培養基條件可能適用於選擇性地增加本文所提供之抗ROR1 CAR構築體的c-Jun蛋白表現。實例 2 ：幹細胞樣表型表現之分析

為了評估代謝再編程培養基對過表現c-Jun之經轉導T細胞之幹細胞樣特性的影響，用如實例1所述之抗ROR1 CAR構築體(亦即，c-Jun-R12 CAR或對照CD19t-R12 CAR)轉導人類CD4+及CD8+ T細胞。接著，在使細胞再擴增持續四至五天之後(亦即，第6天或第7天)，使用流式細胞術來評估經轉導T細胞之幹細胞性。

簡言之，首先用細胞染色緩衝液洗滌T細胞且在37℃下用抗CCR7進行染色持續15分鐘。接著，再次洗滌T細胞且接著將針對數種其他抗原(如下文所詳述)之抗體之主混合液添加至細胞中，且在室溫下在暗處培育持續25分鐘。接著用細胞染色緩衝液洗滌細胞且根據製造商之方案，用FOXP3染色套組(ebioscience)進行滲透。在固定之後，在室溫下在暗處用預稀釋之正常小鼠血清(Jackson ImmunoResearch-# 015-000-120)及正常兔血清(Jackson ImmunoResearch-# 011-000-120)封閉細胞持續15分鐘。接著在室溫下在暗處用TCF7及c-Jun之2x抗體混合液對細胞進行染色持續30分鐘。在徹底洗滌細胞之後，在Cytek Aurora Spectral流式細胞儀上藉由流式細胞術對其進行分析，且使用FlowJo軟體(TreeStar, Ashland, OR)進行分析。

以下係用於評估幹細胞性標記物之抗體的清單：CD8(Thermo-# 58-0088-42)、CD4(BD-# 612936)、CD27(BD-#612829)、CD3(Thermo-# 612896)、CD28 (Biolegend- #302936)、CD62L(BD-# 740301)、R12 Anti-Id (Genscript-#48F6H5E1)、EGFR(ΒioLegend-#98812)、CD45RO(BioLegend-# 566143)、CD39(BioLegend- #328236)、TCF7(Cell Signaling-# 9066S)、c-Jun(Cell Signaling-# 15683S)、CCR7(BD-#562381)、CD45RA(BD-#560673)、LAG-3(Thermo-# 67-2239-42)、TIM-3(Thermo-#78-3109-42)、TIGIT(Thermo-# 46-9500-42)、PD-1 (Thermo-# 25-2799-42)。特定言之，如本文所述，「幹細胞樣」細胞係定義為： CD45RO ^-CCR7 ⁺CD45RA ⁺CD62L ⁺CD27 ⁺CD28 ⁺TCF7 ⁺。

如圖4A-圖4C所示，與來自TCM組之細胞相比，在MRM中經抗ROR1 CAR構築體轉導之CD4+ T細胞關於其表型表現更具幹細胞樣。無論CD4+ T細胞係經c-Jun-R12 CAR抑或對照CD19t-R12 CAR轉導，這一般係正確的(參見圖4A-圖4C中之最後兩個條)。同樣，與在TCM中經轉導之相應細胞相比，在MRM中經轉導之CD8+ T細胞一般更具幹細胞樣(至少對於源於供體#1及#2之CD8+ T細胞；參見圖4D及圖4E)。然而，與CD4+ T細胞不同，如與對照CD19t-R12 CAR相比，當用c-Jun-R12 CAR轉導CD8+ T細胞時，觀察到幹細胞樣細胞之一致增加。因此，在CD8+ T細胞中，當在MRM中用c-Jun-R12 CAR轉導CD8+ T細胞時，觀察到最大百分率之幹細胞樣細胞。如圖4G-圖4I所示，與來自TCM組之細胞相比，在MRM中用抗ROR1 CAR構築體轉導之CD4+ T細胞含有更高比例的幼稚及幹細胞記憶T細胞(如由CCR7 ⁺及CD45RA ⁺表現所證明) (分別比較前兩個條及最後兩個條)。一般而言，如與對照抗ROR1 CAR相比，當CD4+ T細胞經c-Jun-抗ROR1 CAR轉導時，亦觀察到幼稚及幹細胞記憶T細胞之比例增加(將圖4G-圖4I中之第二個及第四個條與第一個及第三個條進行比較)。在CD8+ T細胞中觀察到類似結果(參見圖4J-圖4L)。因此，在CD4+ T細胞及CD8+ T細胞中，當在MRM中經c-Jun-抗ROR1 CAR轉導時，一般觀察到最大百分率之幼稚及幹細胞記憶T細胞。

此等結果突出顯示本文所述之代謝再編程培養基在產生低分化(亦即，更具幹細胞樣)之經轉導CD4+及CD8+ T細胞中的有用性。且，至少對於CD8+ T細胞，結果進一步表明，過表現諸如c-Jun之轉錄因子可進一步改良經轉導T細胞的幹細胞樣特性。實例 3 ：表型及功能分析

為了進一步評估MRM對抗ROR1 CAR T細胞之影響，用抗ROR1 CAR構築體轉導人類CD4+及CD8+ T細胞且如實例1所述進行擴增。在第6天或第7天，在表型上(例如表現不同表面標記物，諸如CD39、LAG3、PD1、TIGIT及TIM3)且在功能上(例如，在初級及/或長期抗原刺激之後的IL-2及/或IFN-γ產生以及活體外殺死)對經轉導之CD4+及CD8+ T細胞進行分析。 表型表現

使用Cytek Aurora Spectral流式細胞儀來評估表面標記物在經轉導之CD4+及CD8+ T細胞上的表現，且使用FlowJo軟體(TreeStar, Ashland, OR)進行分析。 細胞毒性及細胞介素分泌

使用活體外殺死分析來量測經轉導T細胞之細胞溶解活性。簡言之，以1:4、1:16、1:64及1:128之效應子:標靶比率共培養經轉導T細胞(「效應子」)與標靶腫瘤細胞(「標靶」)，且每6小時使用IncuCyte以4x放大率進行掃描(藉由追蹤代表標靶腫瘤細胞之紅核的數目來量測細胞溶解活性)。在共培養24小時之後，自不同條件收集上清液且在-80℃下進行冷凍以供稍後細胞介素分析。接著使含有細胞之培養板返回IncuCyte以供繼續週期掃描。

對於細胞介素分泌分析，使先前經冷凍之上清液解凍，且使用MesoScaleDiscovery(MSD)多路複用平台來評估某些細胞介素(例如IL-2及IFN-g)之水準，且根據製造商之方案在MSD Meso Sector S 600機器上進行量測。 連續再刺激分析

在此分析中，每三天或四天用A549 NLR標靶細胞連續再刺激經轉導之CD4+及CD8+ T細胞。以1:1之E:T比率接種該等T細胞，持續共計2至4輪刺激。在整個研究中維持3×10 ⁵個經轉導T細胞/mL之密度。為了設定每一輪刺激，用以下標記物對T細胞染色且使用流式細胞術進行分析以計算共培養物中存在的經轉導T細胞群體之比例：CD45、CD3、CD4、CD8、CAR及EGFRt (SEQ ID NO: 24)。保留每個樣品之等分試樣以供如上文所述之滴定Incucyte殺死分析。結果

如圖5A-圖5E、圖6A-圖6E及圖7A-圖7E所示，與在TCM中經轉導之相應細胞相比，在MRM中經抗ROR1 CAR構築體轉導之CD4+ T細胞之間觀察到多種表面標記物表現水準之顯著差異。關於CD8+ T細胞觀察到相似結果(參見圖5F-圖5J、圖6F-圖6J及圖7F-圖7J)，進一步證實在轉導期間存在之鉀濃度可對經轉導T細胞具有影響。

此外，除了表型差異以外，在經轉導T細胞中亦觀察到明顯功能差異。如圖8A-圖8C所示，在初級抗原刺激之後，與在TCM中經轉導且培養之相應細胞相比，在MRM中經轉導且培養之T細胞產生更高量之IL-2。且，如先前在實例1中所觀察，經轉導T細胞中之c-Jun蛋白表現增加亦導致更多IL-2分泌。例如，在TCM及MRM組中，與經對照CD19t-R12 CAR轉導之相應細胞相比，經c-Jun-R12 CAR轉導之T細胞在初次刺激之後產生更高水準之IL-2。因此，一般在經修飾以過表現c-Jun且在MRM中培養之T細胞中觀察到最大IL-2產生。

在連續/長期抗原刺激之後觀察到相似結果。如圖9A-圖9C所示，在最後一輪抗原刺激之後，與在TCM中經轉導且培養之相應細胞相比，在MRM中經轉導且培養之T細胞保持其產生IFN-γ之能力。又，與來自其他組之經轉導細胞相比，來自MRM組的經c-Jun-R12 CAR轉導之T細胞維持產生IFN-γ之能力要久得多。關於經轉導細胞在多次抗原刺激之後的細胞毒性，與來自TCM組之相應細胞相比，在MRM中經轉導且培養之T細胞維持其殺死腫瘤細胞之能力要久得多(圖10A-圖10E)。

總之，上述結果證實，在MRM中培養之經修飾以過表現c-Jun之CAR T細胞(例如，具有ROR1 CAR及c-Jun過表現)允許產生即使在長期抗原刺激之後仍保持功能的幹細胞樣經轉導T細胞。實例 4 ：活體內抗腫瘤功效之分析

為了評估上述抗ROR1 CAR T細胞(亦即，經轉導且在MRM中培養)是否在活體內具功能性，在小鼠動物模型中測試抗ROR1 CAR T細胞之抗腫瘤活性。簡言之，將腫瘤細胞(亦即，ROR1陽性H1975 NSCLC細胞株)經皮下植入具有MHC I及II類剔除之NOD scid gamma; NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠之側腹中。當腫瘤達到約125 mm ³時，經靜脈內對小鼠輸注以下各物之一：(i)在MRM中培養之模擬(非轉導)T細胞，(ii)經對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在MRM中培養之T細胞；及(3)經c-Jun-R12 CAR (亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在MRM中培養之T細胞。以兩種劑量之一將該等T細胞投與至小鼠：(a) 5×10 ⁶個CAR+ T細胞或(b) 2.5×10 ⁶個CAR+ T細胞。藉由量測腫瘤體積(使用測徑規)及存活來評估抗腫瘤活性，且藉由量測動物體重來評估治療相關毒性。

如圖11A及圖11B所示，經模擬T細胞或對照抗ROR1 CAR T細胞(亦即，未過表現c-Jun)處理之動物均無法控制腫瘤生長且最終死於腫瘤(參見圖11E及圖11F之存活數據)。相比之下，經過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(在兩種劑量下)處理之動物顯示顯著較大腫瘤控制且在整個實驗持續時間中存活(參見圖11A、圖11B、圖11E及圖11F)。另外，不存在治療相關毒性，因為經過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞處理之動物在整個實驗持續時間中維持其體重(參見圖11C及圖11D)。與經改良之抗腫瘤數據一致，經轉導且在MRM中培養的過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞亦在活體內展現長期持久性(圖12)。

此等結果確認較早活體外數據且證實本文所述之方法(例如，轉導且在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養)可用於產生有效腫瘤特異性T細胞。實例 5 ：臨床開發

將進行FIH、1期、單臂、開放標籤、劑量遞增及擴增、多中心研究，該研究經設計以評估過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞在患有ROR1陽性復發性及/或難治性TNBC及NSCLC之患者中的安全性、PK及抗腫瘤活性。該1期研究之主要目標係評估過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞在患有復發性/難治性TNBC及NSCLC之患者中的安全性及耐受性，且確定過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞之RP2D。該1期研究之次要目標係評估過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞的抗腫瘤活性，且評估過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞在外周血樣品中之PK(例如，擴增及持久性)。 所提出之 1 期設計

這將為單臂、開放標籤、劑量遞增及擴增、多中心研究，該研究經設計以評估過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞在患有復發性及/或難治性TNBC及NSCLC之患者中的安全性、PK及抗腫瘤活性。在劑量遞增階段期間，將僅登記TNBC參與者；在擴增階段期間，將登記TNBC及NSCLC研究群組。

藉由免疫組織化學發現呈ROR1陽性之參與者將有資格進行登記，其中TNBC參與者未通過包括檢查點抑制劑及白蛋白結合型紫杉醇(abraxane)在內的2線療法，或NSCLC參與者未通過包括患有EGFR ⁺及ALK ⁺疾病之彼等患者的靶向療法在內之2線療法，以及其他合格性準則。滿足所有合格性準則之參與者將登記在內且將經歷白細胞分離術以能實現產品生成。在成功產品製造後，參與者將進入治療階段且將接受1個治療週期。治療週期將包括用氟達拉濱及環磷醯胺進行淋巴細胞清除性化學療法持續3天，隨後IV投與在方案規定之劑量水準之一下的單一劑量之細胞產品。該細胞產品將在淋巴細胞清除性化學療法完成之後數天進行投與，除非在與醫療監測人員討論後，臨床或後勤情況需要將此時間安排修改至稍後日期。

在細胞產品投與後長達2年內，將對參與者之安全性、疾病狀態、額外抗癌療法及存活進行隨訪。所有接受過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞之參與者將被要求在此研究完成或停止時在贊助之長期隨訪(LTFU)研究中進行登記。實例 6 ：轉錄體分析

為了在基因層面上評估MRM對T細胞之影響，在連續抗原刺激分析之後對T細胞執行單細胞RNA-seq分析(參見例如實例3)。在抗原刺激之前，該等T細胞經(i) CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在對照培養基中進行培養(「對照ROR1 CAR」)，或經(ii) c-Jun-R12 CAR(亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在MRM中進行培養(「c-Jun ROR1 CAR」)。在連續刺激分析之各個時間點，提取RNA且評估富集幹細胞樣基因及T細胞終末耗竭(TTE)基因之T細胞簇。對於幹細胞樣基因，使用Caushi等人， Nature596: 126-132 (2021)中所述之基因集合。對於TTE基因，使用Oliveira等人， Nature596: 119-125(2021)中所述之基因集合。Caushi等人及Oliveira等人係以引用之方式整體併入本文中。對幹細胞樣簇之鑑定指示存在相對低分化CD8+ T細胞，且對TTE簇之鑑定指示存在耗竭/功能障礙CD8+ T細胞，尤其在連續抗原刺激之後。

如圖13A及圖13B所示，在對照培養基中培養之對照ROR1 CAR T細胞中，在連續抗原刺激之第7天及第10天，富集幹細胞樣基因集合之簇的比例仍較低，而富集TTE基因集合之簇的比例隨著進一步刺激而增加(例如，比較圖13B中之第7天及第10天)。此等結果指示在延長抗原刺激之後，在對照培養基中培養之對照ROR1 CAR T細胞分化程度更高且為耗竭/功能障礙的。相比之下，在連續抗原刺激之第7天及第10天，在MRM中培養的c-Jun ROR1 CAR T細胞具有顯著更高比例之幹細胞樣富集簇(參見圖13A)及減少之TTE富集簇比例(參見圖13B)，表明較高幹細胞樣群體之持續存在。

總之，上文所提供之結果進一步確認本文所述之經修飾免疫細胞(例如，經修飾以過表現c-Jun (例如，具有ROR1 CAR及c-Jun過表現)、在MRM中進行培養)之治療潛力。實例 7 ： MRM 及 c-Jun 過表現對抗 ROR1 CAR T 細胞之影響的額外轉錄體剖析

關於上文所提供之實例6，在過繼轉移至攜帶H1975異種移植腫瘤之NSG MHC dKO小鼠中之後，接著對本文所述之經轉導T細胞(例如，抗ROR1 CAR T細胞)執行單細胞RNA-seq分析。特定言之，當腫瘤達到約400 mm ³時，動物接受在MRM中培養(亦即，經轉導及擴增)之c-Jun ROR1 CAR T細胞(亦即，過表現c-Jun) (以下劑量之一：1e6、2.5e6及5e6個細胞/隻動物)或在MRM中培養之對照ROR1 CAR T細胞(亦即，未過表現c-Jun)(2.5e6個細胞/隻動物)的投與。在T細胞注射之後第13天，處死小鼠且根據製造商之方案，使用帶加熱器之gentleMACS™ Octo Dissociator及人類腫瘤解離套組(Miltenyi Biotec)來解離切除之腫瘤，其中酶混合物中之酶R的量降低至20%。處理解離之腫瘤細胞以用於FACS分選且對Live mCD45 ^-hCD45 ⁺T細胞執行單細胞RNA測序，該等T細胞自以2.5e6個細胞/隻動物(n=5)及5e6個細胞/隻動物(n=2)給藥之c-Jun ROR1 CAR T細胞及以2.5e6個細胞/隻動物(n=5)給藥之對照ROR1 CAR T細胞處理的動物中分選。

處理樣品，以使用藉由測序進行轉錄體及抗原決定基之細胞索引(CITE-Seq)分析進行單細胞RNA測序。CITE-Seq分析允許同時量測單細胞RNA及細胞表面蛋白。以用於FACS分選之螢光染料結合抗體、用於CITE-seq之針對細胞表面蛋白的DNA結合之Total-SeqC抗體以及用於細胞條形碼(cell barcoding)之獨特標籤抗體的混合物對細胞染色。將自所有帶獨特條形碼之樣品分選的活mCD45 ^-hCD45 ⁺T細胞匯集在一起且使用Chromium Next GEM單細胞5' v2試劑套組(10x Genomics)裝載至Chromium Next GEM晶片K中。在單細胞捕獲及溶解之後，合成且擴增cDNA，且將DNA結合至與細胞表面蛋白結合之抗體，最終根據製造商之方案(10x Genomics)生成5ʹ基因表現(GEX)及抗體源性標籤(ADT)文庫。使用NovaSeq 6000系統(Illumina)，對由Chromium Next GEM晶片K之多個通道製備的GEX及ADT文庫進行定量，匯集在一起，且測序。

使用10X Cell Ranger軟體6.1.2版(10X Genomics)來處理單細胞CITE-Seq數據，其中GRCh38(且添加對照R12載體序列及來自c-Jun ROR1 CAR載體之c-Jun序列)作為參考基因體及預設參數。使用Seurat套裝(Hao等人，2021 Cell,184(13):3573-3587)進一步處理細胞-基因矩陣。簡言之，首先過濾細胞(使用粒線體百分比之閾值、nCount_RNA、nFeature_RNA及hashtag doublet)，且接著藉由對利用CITE-Seq量測之CD8及CD4蛋白表現進行閘控來分離CD8 ⁺及CD4 ⁺T細胞。組合來自腫瘤治療之對照ROR1 CAR T細胞或c-Jun ROR1 CAR T細胞之CD8 ⁺T細胞以用於單細胞轉錄體分析。將過濾後之細胞-基因矩陣正規化且進行縮放，具有可變特徵選擇。藉由使用Seurat中之CellCycleScoring函數計算細胞週期階段評分(G2M.Score、S.Score)，且接著回歸細胞週期階段評分來校正細胞週期異質性之影響。自所選擇之特徵中排除與兩個細胞週期階段評分中之任一者相關的基因(其中Pearson相關係數大於0.3)，以進一步使細胞週期異質性之影響降至最低。亦自所選擇之特徵中排除粒線體、核糖體、TCR及IG複合物相關基因。接著，使用過濾後之特徵藉由RunPCA函數計算前50個PC。之後，使用藉由Seurat中之RunUMAP函數獲得的統一流形逼近及投影(Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP)將細胞映射至二維空間以進行可視化，其中每個點代表一個細胞。使細胞經受使用Seurat中之FindClusters函數的聚類分析，且使用FindSubCluster函數來細化聚類鑑定。CITE-Seq分析亦稱為單細胞RNA-Seq分析，因為該分析(UMAP，聚類)使用CD8 ⁺T細胞中之RNA表現，而不是蛋白質表現來完成。

單細胞聚類分析之詳情描述於前一段及更早實例中(參見例如實例6)。評估富集幹細胞樣基因、T細胞活化(Tact)基因、T細胞前驅細胞耗竭(TPE)基因及T細胞終末耗竭(TTE)基因之簇。對於幹細胞樣基因，使用Caushi等人， Nature596: 126-132 (2021)中所述之基因集合。對於Tact基因、TPE基因及TTE基因，使用Oliveira等人， Nature596: 119-125 (2021)中所述之基因集合。Caushi等人及Oliveira等人係以引用之方式整體併入本文中。Tact、TPE、TTE及幹細胞樣基因之非限制性實例提供於本揭示案中別處。對幹細胞樣簇之鑑定指示存在相對低分化CD8 ⁺T細胞，且對Tact簇之鑑定指示腫瘤中存在經活化CD8 ⁺T細胞。對TPE簇之鑑定指示存在前驅細胞耗竭CD8 ⁺T細胞，且對TTE簇之鑑定指示腫瘤中存在耗竭/功能障礙CD8 ⁺T細胞。

如圖14A-圖14E所示，與自經對照ROR1 CAR T細胞處理之腫瘤中分選的T細胞相比，自經c-Jun ROR1 CAR T細胞處理之腫瘤中分選之T細胞具有顯著降低比例的富集TTE基因集合之簇(圖14B)及顯著較高比例的富集TPE基因集合之簇(圖14C)。已知TPE細胞比TTE細胞更少耗竭，具有記憶相關轉錄物(TCF7、CCR7及IL7R)之表現，該等轉錄物有可能在活化後擴增且獲得與長期持久性相關之重振CD39記憶表型。[Oliveira等人， Nature596: 119-125(2021)]。TTE簇減少及TPE簇增加證明c-Jun過表現在對抗耗竭中之作用。有趣的是，自經c-Jun ROR1 CAR T細胞處理之腫瘤中分選的T細胞具有顯著更高比例之幹細胞樣富集簇(圖14D)，這表明幹細胞樣群體之存在及增加的持久性。在自經c-Jun ROR1 CAR T細胞處理之腫瘤中分選的T細胞中，T細胞活化富集簇之比例亦較高(圖14E)。

此等結果表明，與MRM增加幹細胞樣群體之作用相比，c-Jun之過表現提供附加益處，因此顯示MRM及c-Jun過表現之組合的益處。實例 8 ：在多種代謝再編程培養基中經轉導且培養之攜帶抗 ROR1 CAR 之免疫細胞的進一步表型及功能分析

為了進一步評估MRM對本文所述之經修飾細胞(例如，抗ROR1 CAR T細胞)之影響，如實例1中所述來製備數種具有不同濃度之鉀離子的MRM。特定言之，MRM之不同組分的最終濃度係在以下範圍內：NaCl(55-90 mM)、KCl(40-80 mM)及重量滲透濃度(約250-260 mOsmol) 。接著，用具有及不具有c-Jun之抗ROR1 CAR構築體轉導人類CD4+及CD8+ T細胞(自三個供體分離)且使用基本上如實例1中所述之不同MRM或TCM進行擴增。接著，如更早實例(例如，實例2及3)中所述，分析經轉導T細胞之各種特性，例如轉導效率、c-Jun表現、幹細胞樣表型表現及功能(例如，在初級及/或長期抗原刺激之後的IL-2及IFN-γ產生以及活體外殺死)。 結果：

與更早實例(參見例如實例1)類似，在轉導之後且在分析之前，在TCM中或在具有不同濃度之鉀離子(亦即，在40-80 mM)之間的不同MRM調配物中培養且擴增經轉導之細胞持續共計7天。

如圖15A-圖15C所示，且與先前描述之數據一致(參見例如圖3A-圖3C)，如與在TCM中經轉導且培養的相應T細胞相比，對於所測試之所有MRM，經c-Jun-R12 CAR構築體轉導且隨後在MRM中培養之T細胞具有較高c-Jun表現。在具有最高鉀濃度之MRM中觀察到c-Jun表現之最高增加。

關於經修飾細胞之幹細胞性，且再次與先前描述之數據一致(參見例如圖4A-圖4C)，與來自TCM組的細胞相比，在所有MRM調配物中經抗ROR1 CAR構築體轉導之CD4+ T細胞關於其表型表現更具幹細胞樣(參見例如圖16A-圖16C及下表12)。無論CD4+ T細胞係經c-Jun-R12 CAR抑或對照CD19t-R12 CAR轉導，這一般係正確的。與TCM培養之T細胞相比，MRM培養之細胞中的CD4+ T細胞之幹細胞性百分比最高，其中MRM鉀濃度對幹細胞性具有劑量依賴性影響(最高鉀濃度下之幹細胞性最高)。

同樣，與在TCM中經轉導之相應細胞相比，在MRM中經轉導之CD8+ T細胞一般更具幹細胞樣(參見圖17A-圖17C及表13)。與CD4+ T細胞不同，如與對照CD19t-R12 CAR相比，當用c-Jun-R12 CAR轉導CD8+ T細胞時，觀察到幹細胞樣細胞之一致增加。因此，在CD8+ T細胞中，當在MRM中在多種鉀濃度下用c-Jun-R12 CAR轉導CD8+ T細胞時，觀察到最大百分率之幹細胞樣細胞。如同CD4+ T細胞，觀察到MRM濃度對幹細胞性之劑量依賴性影響，其中在具有最高鉀濃度之MRM中觀察到最高幹細胞性。

為了評估在不同MRM中經轉導且培養之T細胞在抗原刺激之後產生細胞介素的能力，在以1:1及1:4之E:T與A549 NLR癌症細胞株共培養20至22小時之後，評估未轉導(模擬，數據未示)、具有c-Jun之ROR1 CAR(黑色正方形)及不具有c-Jun之ROR1 CAR(黑色圓圈) T細胞產物的IFNγ、IL-2及TNFα細胞介素分泌(在擴增第7天之後)。如圖18A-圖18I(1:1效應子:標靶比率)及圖19A-圖19I (1:4效應子:標靶比率)所示，如與經修飾且在TCM中進行培養之T細胞相比，來自MRM組的抗ROR1 CAR T細胞(具有及不具有c-Jun過表現)產生較高水準之IL2、TNFα(來自所有供體)及IFNγ(來自3個供體中之2個)。又，在具有最高鉀濃度之MRM中觀察到最高細胞介素產生。

為了評估經修飾細胞之細胞溶解能力，使用基本上如實例3中所述之活體外殺死分析。IncuCyte殺死分析係在96孔平底槽分析板中，使用來自連續再刺激分析之第0、7或14天的T細胞及NucLight Red(NLR)標靶細胞株A549以1:1及1:4之E:T比率建立的。使用IncuCyte殺死曲線之曲線下面積(AUC)(條愈低，細胞毒性愈高)來計算腫瘤活力百分率，該等IncuCyte殺死曲線獲自在以1:1及1:4之E:T比率與A549 NLR標靶細胞株共培養之後在連續再刺激分析之第0、7及14天(連續刺激(SS)1、3及5)在TCM或MRM(高至低)中培養的對照R12 CAR及c-Jun-R12 CAR T細胞產物。示出最後一輪刺激(168 h至300 h)之數據。

與上文剛描述之細胞介素數據一致，如與來自TCM組之彼等細胞相比，來自不同MRM組的抗ROR1 CAR T細胞一般展現增加之殺死。如圖20A-圖20D所示，在2輪抗原刺激之後，如與來自對照組之相應T細胞相比，在MRM中經轉導且隨後進行培養的T細胞中觀察到細胞溶解活性之極大改良。在過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞及未經修飾為過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞中均觀察到改良的細胞溶解活性。

總之，上述結果進一步確認本文所提供之培養方法的治療益處。更特定言之，上述結果進一步證明在包含濃度高於5 mM(例如，在40-80 mM之間)之鉀離子的培養基存在下修飾T細胞(例如，以表現配位體結合蛋白且具有增加之c-Jun蛋白表現水準)可極大地增加細胞之幹細胞性且即使在長期抗原刺激存在下亦允許細胞展現有效功能活性。

[ 圖 1A] 、[ 圖 1B]及[ 圖 1C]提供在TCM(亦即，對照培養基)及MRM中培養(或生長)之T細胞的抗ROR1(R12) CAR轉導效率之比較。該等T細胞(包括CD4+及CD8+ T細胞)源自不同供體：供體#1( 圖 1A)、供體#2( 圖 1B)及供體#3( 圖 1C)。不同轉導條件(或測試組)如下：(1)在TCM中培養之非轉導T細胞；(2)用對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM中培養之T細胞；(3)用c-Jun-R12 CAR(亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM中培養之T細胞；(4)在MRM中培養之非轉導T細胞；(5)用對照CD19t-R12 CAR轉導且在MRM中培養之T細胞；及(6)用c-Jun-R12 CAR轉導且在MRM中培養之T細胞。 [ 圖 2A] 、[ 圖 2B]及[ 圖 2C]顯示存在於來自不同測試組之總的經轉導T細胞群體內之CD4+(黑條)及CD8+ (白條) T細胞之百分率。該等不同測試組與圖1A-圖1C中所述之測試組相同。經轉導T細胞源自三個不同供體：供體#1 ( 圖 2A)、供體#2( 圖 2B)及供體#3( 圖 2C)。 [ 圖 3A] 、[ 圖 3B]及[ 圖 3C]顯示MRM對來自不同測試組之經轉導T細胞之c-Jun蛋白表現水準(顯示為中值螢光強度(MFI))的影響。該等不同測試組與圖1A-圖1C中所述之測試組相同。經轉導T細胞源自三個不同供體：供體#1 ( 圖 3A)、供體#2( 圖 3B)及供體#3( 圖 3C)。 [ 圖 4A] 、[ 圖 4B] 、[ 圖 4C] 、[ 圖 4D] 、[ 圖 4E]及[ 圖 4F]提供來自不同測試組之幹細胞樣經轉導CD4+ T細胞( 圖 4A 、圖 4B及圖 4C-三個不同供體)及CD8+ T細胞( 圖 4D 、圖 4E及圖 4F-來自三個不同供體)的百分率之比較。該等不同測試組。該等不同測試組與圖1A-圖1C中所述之測試組相同。如實例2中所解釋，幹細胞樣細胞係經鑑別為 CD45RO ^-CCR7 ⁺CD45RA ⁺CD62L ⁺CD27 ⁺CD28 ⁺TCF7 ⁺。 [ 圖 4G]、[ 圖 4H]、[ 圖 4I]、[ 圖 4J]、[ 圖 4K]及[ 圖 4L]顯示來自相同三個供體之幼稚及幹細胞記憶T細胞中的CD4+ T細胞( 圖 4G 、圖 4H 、圖 4I)及CD8+ T細胞( 圖 4J 、圖 4K 、圖 4L)之百分率。如實例2中所述，幼稚及幹細胞記憶T細胞係經鑑別為CCR7 ⁺CD45RA ⁺。 [ 圖 5A] 、[ 圖 5B] 、[ 圖 5C] 、[ 圖 5D] 、[ 圖 5E] 、[ 圖 5F] 、[ 圖 5G] 、[ 圖 5H] 、[ 圖 5I]及[ 圖 5J]提供來自不同測試組之經轉導T細胞(源於供體#1)上的多種表面標記物之表現之比較。該等不同測試組與圖1A-圖1C中所述之測試組相同。圖 5A 、圖 5B 、圖 5C 、圖 5D及圖 5E分別顯示表現CD39、LAG3、PD1、TIGIT及TIM3之抗ROR1(R12) CAR經轉導CD4+ T細胞之百分率。圖 5F 、圖 5G 、圖 5H 、圖 5I及圖 5J分別顯示表現CD39、LAG3、PD1、TIGIT及TIM3之抗ROR1 CAR經轉導CD8+ T細胞之百分率。 [ 圖 6A] 、[ 圖 6B] 、[ 圖 6C] 、[ 圖 6D] 、[ 圖 6E] 、[ 圖 6F] 、[ 圖 6G] 、[ 圖 6H] 、[ 圖 6I]及[ 圖 6J]提供來自不同測試組之經轉導T細胞(源自供體#2)上的多種表面標記物之表現之比較。該等不同測試組與圖1A-圖1C中所述之測試組相同。圖 6A 、圖 6B 、圖 6C 、圖 6D及圖 6E分別顯示表現CD39、LAG3、PD1、TIGIT及TIM3之抗ROR1(R12) CAR經轉導CD4+ T細胞之百分率。圖 6F 、圖 6G 、圖 6H 、圖 6I及圖 6J分別顯示表現CD39、LAG3、PD1、TIGIT及TIM3之抗ROR1 CAR經轉導CD8+ T細胞之百分率。 [ 圖 7A] 、[ 圖 7B] 、[ 圖 7C] 、[ 圖 7D] 、[ 圖 7E] 、[ 圖 7F] 、[ 圖 7G] 、[ 圖 7H] 、[ 圖 7I]及[ 圖 7J]提供來自不同測試組之經轉導T細胞(源自供體#3)上的多種表面標記物之表現之比較。該等不同測試組與圖1A-圖1C中所述之測試組相同。圖 7A 、圖 7B 、圖 7C 、圖 7D及圖 7E分別顯示表現CD39、LAG3、PD1、TIGIT及TIM3之抗ROR1(R12)CAR經轉導CD4+ T細胞之百分率。圖 7F 、圖 7G 、圖 7H 、圖 7I及圖 7J分別顯示表現CD39、LAG3、PD1、TIGIT及TIM3之抗ROR1 (R12) CAR經轉導CD8+ T細胞之百分率。 [ 圖 8A] 、[ 圖 8B]及[ 圖 8C]提供在初級抗原刺激之後在MRM或TCM中轉導且培養之T細胞的IL-2產生之比較。經轉導T細胞源自三個不同供體：供體#1( 圖 8A)、供體#2( 圖 8B)及供體#3( 圖 8C)。不同測試組如下：(1)用對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM中培養之T細胞(閉合圓)；(2)用c-Jun-R12 CAR(亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM中培養之T細胞(閉合正方形)；(3)用對照CD19t-R12 CAR轉導且在MRM中培養之T細胞(開口圓)；及(4)用c-Jun-R12 CAR轉導且在MRM中培養之T細胞(開口正方形)。x軸提供效應子:標靶(E:T)比率(亦即，經轉導T細胞:標靶腫瘤細胞之比率)。 [ 圖 9A] 、[ 圖 9B]及[ 圖 9C]提供在多輪抗原刺激之後在MRM或TCM中轉導且培養之T細胞的IFN-γ產生之比較。如實例3中進一步提供，當未達到再接種下一輪所需之經轉導T細胞的數目時，終止連續刺激分析：(i)針對供體#1之四輪抗原刺激( 圖 9A)，(ii)針對供體#2之三輪抗原刺激( 圖 9B)，及(iii)針對供體#3之兩輪抗原刺激( 圖 9C)。不同測試組如下：(1)用對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM中培養之T細胞(閉合圓)；(2)用c-Jun-R12 CAR(亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM中培養之T細胞(閉合正方形)；(3)用對照CD19t-R12 CAR轉導且在MRM中培養之T細胞(開口圓)；及(4)用c-Jun-R12 CAR轉導且在MRM中培養之T細胞(開口正方形)。x軸提供效應子:標靶(E:T)比率(亦即，經轉導T細胞:標靶腫瘤細胞之比率)。 [ 圖 10A] 、[ 圖 10B] 、[ 圖 10C] 、[ 圖 10D] 、[ 圖 10E]及[ 圖 10F]顯示在多輪抗原刺激之後經轉導CD8+ T細胞殺死標靶腫瘤細胞之能力。經轉導T細胞源自三個不同供體：供體#1( 圖 10B及圖 10E)、供體#2( 圖 10A及圖 10D)及供體#3( 圖 10C及圖 10F)。圖 10A 、圖 10B及圖 10C提供經對照CD19t-R12 CAR (亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)(黑條)或c-Jun-R12 CAR (亦即，具有c-Jun之R12 CAR)(白條)轉導且在對照培養基(亦即，TCM)中培養之CD8+ T細胞的結果。圖 10E 、圖 10F及圖 10G提供經對照CD19t-R12 CAR(黑條)或c-Jun-R12 CAR(白條)轉導且在MRM中培養之CD8+ T細胞的結果。x軸提供效應子:標靶(E:T)比率(亦即，經轉導T細胞:標靶腫瘤細胞之比率)。 [ 圖 11A] 、[ 圖 11B] 、[ 圖 11C] 、[ 圖 11D] 、[ 圖 11E]及[ 圖 11F]提供在投與如本文所述經轉導且在MRM中培養之T細胞之後的抗腫瘤效應之比較。用以下各物之一經靜脈內處理皮下植入人類ROR1陽性H1975 NSCLC細胞之小鼠：(i)在MRM中培養之模擬(非轉導)T細胞(「模擬- MRM」；圓形)，(ii)經對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在MRM中培養之T細胞(「對照R12 CAR-MRM」；正方形)；及(3)經c-Jun-R12 CAR (亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在MRM中培養之T細胞(「c-Jun-R12-CAR-MRM」；三角形)。以兩種劑量之一將該等T細胞投與至小鼠：(a)5×10 ⁶個細胞( 圖 11A 、圖 11C及圖 11E)或(b)2.5×10 ⁶個細胞( 圖 11B 、圖 11D及圖 11F)。在投與T細胞之後，在投與後各個時刻評估該等動物之腫瘤大小( 圖 11A及圖 11B)、體重( 圖 11C及圖 11D)及存活( 圖 11E及圖 11F)。 [ 圖 12A]及[ 圖 12B]顯示T細胞之持久性，該等T細胞如本文所述經轉導且在MRM中培養且經投與至具有MHC I及II類剔除的攜帶H1975腫瘤之NSG小鼠。如所示，該等動物接受以下各物之一的單一靜脈內投與：(i)在MRM中培養之模擬(非轉導)T細胞(「模擬-MRM」；圓形)，(ii)經對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在MRM中培養之T細胞(「對照R12 CAR- MRM」；正方形)；及(3)經c-Jun-R12 CAR(亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在MRM中培養之T細胞(「c-Jun-R12-CAR-MRM」；三角形)。以兩種劑量之一將該等T細胞投與至小鼠：(a)5×10 ⁶個細胞( 圖 12A)或(b)2.5×10 ⁶個細胞( 圖 12B)。接著，在投與後各個時刻，收集外周血且使用流式細胞術來定量每mL血液之T細胞(模擬)數目或CAR+ T細胞(對照及c-Jun R12組)數目。 [ 圖 13A]及[ 圖 13B]提供在連續抗原刺激之後抗ROR1 CAR T細胞之轉錄體譜。如實例6中進一步描述，一些抗ROR1 CAR T細胞係經修飾以過表現c-Jun蛋白及/或在MRM中培養。所顯示之不同測試組如下：(1)用對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在對照培養基中培養之T細胞(灰條)；及(2)用c-Jun-R12 CAR(亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在MRM中培養之T細胞(黑條)。圖 13A顯示在連續抗原刺激分析之第7天及第10天富集幹細胞樣基因之CD8 ⁺T細胞的比例。圖 13B顯示富集T細胞終末耗竭基因之CD8 ⁺T細胞的比例。 [ 圖 14A] 、[ 圖 14B] 、[ 圖 14C] 、[ 圖 14D]及[ 圖 14E]提供在過繼轉移至攜帶腫瘤之小鼠之後，抗ROR1 CAR T細胞(具有或不具有c-Jun過表現)之轉錄體譜。如實例7中進一步描述，用在MRM中培養之c-Jun ROR1 CAR T細胞(c-Jun R12 CAR MRM)或在MRM中培養之對照ROR1 CAR T細胞(對照R12 CAR MRM)處理攜帶腫瘤之小鼠。且接著，自腫瘤中分離出過繼轉移之經轉導T細胞，且執行單細胞RNA-seq分析。圖 14A提供來自兩個處理組之所有樣品之CD8 ⁺T細胞的UMAP。圖 14B顯示富集T細胞終末耗竭基因之CD8 ⁺T細胞的比例。圖 14C顯示富集T細胞前驅細胞耗竭基因之CD8 ⁺T細胞的比例。圖 14D顯示富集幹細胞樣基因之CD8 ⁺T細胞的比例。圖 14E顯示富集T細胞活化相關基因之CD8+ T細胞的比例。 [ 圖 15A] 、[ 圖 15B]及[ 圖 15C]為條形圖，顯示用ROR1 CAR轉導且在TCM或包含不同濃度之鉀離子的MRM中培養之T細胞中之c-Jun表現。如實例8中進一步描述，所測試之不同MRM的鉀離子濃度介於40-80 mM(亦即，低至高濃度)之間範圍內。不同轉導條件(或測試組)如下：(1)用對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM中培養之T細胞；(2)用c-Jun-R12 CAR (亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM中培養之T細胞；(3)用對照CD19t-R12 CAR轉導且在具有不同鉀濃度之MRM中培養的T細胞；及(4)用c-Jun-R12 CAR轉導且在具有不同鉀濃度之MRM中培養的T細胞。圖 15A 、圖 15B及圖 15C各自提供自三個獨立供體分離之T細胞的生物學重複實驗之c-Jun表現。 [ 圖 16A] 、[ 圖 16B]及[ 圖 16C]提供在TCM或包含濃度介於40-80 mM(亦即，低至高濃度)範圍內之鉀離子的MRM中轉導且培養之幹細胞樣CD4+ T細胞之百分率的比較。該等不同測試組與圖15A-圖15C中所述之彼等測試組相同。用細胞表面標記物 CD45RO ^-CCR7 ⁺CD45RA ⁺CD62L ⁺CD27 ⁺CD28 ⁺TCF7 ⁺鑑別該等幹細胞樣細胞。圖 16A 、圖 16B及圖 16C各自提供自三個獨立供體分離之T細胞的生物學重複實驗之結果。 [ 圖 17A] 、[ 圖 17B]及[ 圖 17C]提供在TCM或包含濃度介於40-80 mM(亦即，低至高濃度)範圍內之鉀離子的MRM中轉導且培養之幹細胞樣CD8+ T細胞之百分率的比較。該等不同測試組與圖15A-圖15C中所述之彼等測試組相同。用細胞表面標記物 CD45RO ^-CCR7 ⁺CD45RA ⁺CD62L ⁺CD27 ⁺CD28 ⁺TCF7 ⁺鑑別該等幹細胞樣細胞。圖17A、圖17B及圖17C各自提供自三個獨立供體分離之T細胞的生物學重複實驗之結果。 [ 圖 18A] 、[ 圖 18B] 、[ 圖 18C] 、[ 圖 18D] 、[ 圖 18E] 、[ 圖 18F] 、[ 圖 18G] 、[ 圖 18H]及[ 圖 18I]顯示在以1:1之效應子:標靶(E:T)比率進行初級抗原刺激之後，抗ROR1 CAR T細胞之IFN-γ(圖18A、圖18B及圖18C)、IL-2(圖18D、圖18E及圖18F)及TNF-α(圖18G、圖18H及圖18I)產生。如實例8中進一步描述，T細胞(自三個獨立供體分離)在TCM或包含濃度介於40-80 mM(亦即，低至高濃度)範圍內之鉀離子的MRM中轉導且培養。用以下各物轉導T細胞：(1)T細胞對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)(閉合圓)；或(2)c-Jun-R12 CAR(亦即，具有c-Jun之R12 CAR)(閉合正方形)。 [ 圖 19A] 、[ 圖 19B] 、[ 圖 19C] 、[ 圖 19D] 、[ 圖 19E] 、[ 圖 19F] 、[ 圖 19G] 、[ 圖 19H]及[ 圖 19I]顯示在以1:4之效應子:標靶(E:T)比率進行初級抗原刺激之後，抗ROR1 CAR T細胞之IFN-γ(圖19A、圖19B及圖19C)、IL-2(圖19D、圖19E及圖19F)及TNF-α(圖19G、圖19H及圖19I)產生。如實例8中進一步描述，T細胞(自三個獨立供體分離)在TCM或包含濃度介於40-80 mM(亦即，低至高濃度)範圍內之鉀離子的MRM中轉導且培養。用以下各物轉導T細胞：(1)T細胞對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)(閉合圓)；或(2)c-Jun-R12 CAR(亦即，具有c-Jun之R12 CAR)(閉合正方形)。 [ 圖 20A] 、[ 圖 20B] 、[ 圖 20C]及[ 圖 20D]顯示抗ROR1 CAR CD8+ T細胞(在TCM或包含不同濃度之鉀離子的MRM中轉導且培養)在多輪抗原刺激之後殺死標靶腫瘤細胞之能力。如實例8中進一步描述，用抗原以1:1(圖20A及圖20B)或1:4(圖20C及圖20D)之效應子:標靶(E:T)比率刺激經轉導T細胞。圖20A及圖20C提供用對照CD19t-R12 CAR(亦即，不具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM或包含濃度介於40-80 mM(亦即，低至高濃度)範圍內之鉀離子的MRM中培養之CD8+ T細胞之結果。圖20B及圖20D提供用c-Jun-R12-CAR (亦即，具有c-Jun之R12 CAR)轉導且在TCM或包含濃度介於40-80 mM(亦即，低至高濃度)範圍內之鉀離子的MRM中培養之CD8+ T細胞之結果。使用來自IncuCyte殺死曲線之曲線下面積(AUC)來計算腫瘤活力百分率(條愈低，細胞毒性愈高)。在圖20A-圖20D中之每一者中，僅腫瘤細胞及非轉導(「模擬」)T細胞用作對照。

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Claims

一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞之幹細胞性的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽。
一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞之產量的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽。
一種製備用於免疫療法之免疫細胞群體的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽。
一種在離體或活體外培養期間增加用於免疫療法之免疫細胞之幹細胞性、同時增加免疫細胞之產量的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽。
一種離體或活體外擴增幹細胞樣免疫細胞之群體的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽。
一種增加免疫細胞因應於抗原刺激而產生之細胞介素的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養該等免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽。
如請求項6之方法，其中該細胞介素包含IL-2。
如請求項6或7之方法，其中在該培養之後，如與參考免疫細胞相比，因應於該抗原刺激而產生之該細胞介素增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更多。
一種增加免疫細胞因應於持久抗原刺激之效應子功能的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽。
如請求項9之方法，其中如與參考免疫細胞相比，該等免疫細胞在至少一輪、至少兩輪或至少三輪額外之抗原刺激分析中保留效應子功能。
如請求項9或10之方法，其中該效應子功能包含以下能力：(i)殺死標靶細胞(例如，腫瘤細胞)，(ii)在進一步抗原刺激後產生細胞介素，或(iii) (i)及(ii)二者。
如請求項11之方法，其中該細胞介素包含IFN-γ。
如請求項9至12中任一項之方法，其中在該培養之後，如與參考免疫細胞相比，該等免疫細胞因應於持久抗原刺激之該效應子功能增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更多。
一種改變一或多種標記物在免疫細胞上之表型表現的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以(i)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(ii)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽。
如請求項14之方法，其中該一或多種標記物包含CD39、LAG3、PD1、TIGIT、TIM3或其組合。
如請求項14或15之方法，其中與參考免疫細胞相比，該一或多種標記物之表現減少至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。
如請求項14或15之方法，其中與參考免疫細胞相比，該一或多種標記物之表現增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍或至少約5倍。
如請求項8、10至13、16及17中任一項之方法，其中該等參考免疫細胞包含以下相應免疫細胞：(i)已經修飾以具有增加水準之該c-Jun多肽且在不包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；(ii)未經修飾為具有增加水準之該c-Jun多肽且在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；(iii)未經修飾為具有增加水準之該c-Jun多肽且在不包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養；或(iv) (i)至(iii)之任何組合。
如請求項1至18中任一項之方法，其中該等免疫細胞已經編碼該嵌合多肽、該c-Jun多肽或兩者之外源聚核苷酸修飾，使得在該修飾之後，如與相應免疫細胞相比，該等免疫細胞具有增加水準之該c-Jun多肽。
如請求項1至18中任一項之方法，其中該c-Jun多肽對於該等免疫細胞為內源性的，且其中該等免疫細胞已經能夠增加該內源c-Jun多肽之表現之轉錄活化子修飾。
如請求項20之方法，其中該轉錄活化子連接至Cas蛋白，該Cas蛋白已經修飾以缺乏核酸內切酶活性。
一種離體或活體外製備用於免疫療法之免疫細胞的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中用編碼(i) c-Jun多肽及(ii)包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽的外源聚核苷酸修飾免疫細胞。
一種離體或活體外製備用於免疫療法之免疫細胞的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中用：(i)能夠增加該內源c-Jun多肽之表現之轉錄活化子；及(ii)編碼包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽的外源聚核苷酸修飾免疫細胞。
如請求項23之方法，其中該轉錄活化子連接至Cas蛋白，該Cas蛋白已經修飾以缺乏核酸內切酶活性。
如請求項1至24中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含嵌合抗原受體(CAR)。
如請求項1至25中任一項之方法，其中該c-Jun多肽能夠預防或減少該等免疫細胞之耗竭。
一種在離體及活體外培養期間增加免疫細胞之幹細胞性的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以表現嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i) ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。
一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞之產量的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以表現嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i) ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。
一種製備用於免疫療法之免疫細胞群體的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以表現嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i) ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。
一種在離體或活體外培養擴增期間增加用於免疫療法之免疫細胞之幹細胞性、同時增加免疫細胞之產量的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以表現嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i) ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。
一種離體或活體外擴增幹細胞樣免疫細胞之群體的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養免疫細胞，其中該等免疫細胞已經修飾以表現嵌合多肽，該嵌合多肽包含(i) ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。
如請求項27至31中任一項之方法，該方法進一步包括用編碼該嵌合多肽之外源聚核苷酸修飾該等免疫細胞。
一種離體或活體外製備用於免疫療法之免疫細胞的方法，該方法包括在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中用編碼嵌合多肽之外源聚核苷酸修飾免疫細胞，該嵌合多肽包含(i) ROR1結合蛋白，(ii)包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列的間隔子，及(iii)跨膜結構域。
如請求項27至33中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含嵌合抗原受體(CAR)。
如請求項27至34中任一項之方法，其中該等免疫細胞進一步過表現c-Jun多肽。
如請求項35之方法，其中該等免疫細胞已經編碼該嵌合多肽、該c-Jun多肽或兩者之外源聚核苷酸修飾，使得在該修飾之後，如與未經修飾為具有增加水準之該c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，該等免疫細胞具有增加水準之該c-Jun多肽。
如請求項35之方法，其中該c-Jun多肽對於該等免疫細胞為內源性的，且其中該等免疫細胞已經能夠增加該內源c-Jun多肽之表現之轉錄活化子修飾。
如請求項37之方法，其中該轉錄活化子連接至Cas蛋白，該Cas蛋白已經修飾以缺乏核酸內切酶活性。
如請求項35至38中任一項之方法，其中該c-Jun多肽能夠預防或減少該等免疫細胞之耗竭。
如請求項1至26及35至39中任一項之方法，其中該c-Jun多肽包含與如SEQ ID NO: 13中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至26及35至40中任一項之方法，其中該c-Jun多肽由外源聚核苷酸編碼，該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中任一者所述之核苷酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 12中所述之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 1中所述之核酸序列具有至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項43之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 2中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項45之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 2中所述之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 4中所述之核酸序列具有至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項45之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 4中所述之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 5中所述之核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項49之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 5中所述之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 6中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項51之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 6中所述之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項53之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 7中所述之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項55之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 8中所述之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列具有至少55%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項57之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 9中所述之核苷酸序列。
如請求項41之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項59之方法，其中編碼該c-Jun多肽之該外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 10中所述之核苷酸序列。
如請求項1至26及35至60中任一項之方法，其中該c-Jun多肽及該嵌合多肽係在同一載體上。
如請求項1至26及35至60中任一項之方法，其中該c-Jun多肽及該嵌合多肽係在不同載體上。
如請求項1至62中任一項之方法，其中該ROR1結合蛋白包含特異性結合至ROR1之抗體或其抗原結合部分。
如請求項63之方法，其中該ROR1結合蛋白與R12抗體特異性結合至相同之抗原決定基。
如請求項63或64之方法，其中該ROR1結合蛋白包含有包含該R12抗體之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區(VH)及包含該R12抗體之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區(VL)。
如請求項65之方法，其中該VH CDR1包含如SEQ ID NO: 57中所述之胺基酸序列，VH CDR2包含如SEQ ID NO: 58中所述之胺基酸序列，且VH CDR3包含如SEQ ID NO: 59中所述之胺基酸序列。
如請求項65或66之方法，其中該VL CDR1包含如SEQ ID NO: 61中所述之胺基酸序列，VL CDR2包含如SEQ ID NO: 62中所述之胺基酸序列，且VL CDR3包含如SEQ ID NO: 63中所述之胺基酸序列。
如請求項65至67中任一項之方法，其中該ROR1結合蛋白之該VH包含SEQ ID NO: 56中所述之胺基酸序列且該ROR1結合蛋白之該VL包含如SEQ ID NO: 60中所述之胺基酸序列。
如請求項68之方法，其中該ROR1結合蛋白包含與如SEQ ID NO: 83中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至69中任一項之方法，其中該嵌合多肽進一步包含跨膜(TM)結構域。
如請求項70之方法，其中該TM結構域源自CD8a、CD2、CD4、CD28、CD45、PD1、CD152或其任何組合。
如請求項71之方法，其中該TM結構域源自CD28。
如請求項72之方法，其中該TM結構域包含與如SEQ ID NO: 75中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項70至73中任一項之方法，其中該嵌合多肽進一步包含在該ROR1結合蛋白與該TM結構域之間的間隔子。
如請求項74之方法，其中該間隔子源自免疫球蛋白鉸鏈區或CD8。
如請求項74之方法，其中該間隔子包含如SEQ ID NO: 51中所述之胺基酸序列。
如請求項74至76中任一項之方法，其中該間隔子進一步包含連接體。
如請求項77之方法，其中該連接體包含GGGSG (SEQ ID NO: 40)。
如請求項1至78中任一項之方法，其中該嵌合多肽進一步包含細胞內信號傳導結構域。
如請求項79之方法，其中該細胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ活化結構域、CD3δ活化結構域、CD3ε活化結構域、CD3η活化結構域、CD79A活化結構域、DAP 12活化結構域、FCER1G活化結構域、DAP10/CD28活化結構域、ZAP70活化結構域或其任何組合。
如請求項80之方法，其中該細胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ活化結構域。
如請求項81之方法，其中該CD3 ζ活化結構域包含與如SEQ ID NO: 84中所述之胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約100%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至82中任一項之方法，其中該嵌合多肽進一步包含細胞內共刺激結構域。
如請求項83之方法，其中該細胞內共刺激結構域包含以下各物之共刺激結構域：介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、Lck結合缺失之CD28(ICA)、OX40、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、PD-1、TILR2、TILR4、TILR7、TILR9、Fc受體γ鏈、Fc受體ε鏈、與CD83特異性結合之配位體或其任何組合。
如請求項83之方法，其中該細胞內共刺激結構域包含4-1BB共刺激結構域。
如請求項84之方法，其中該4-1BB共刺激結構域包含與如SEQ ID NO: 76中所述之胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約100%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至26及35至86中任一項之方法，其中該c-Jun多肽及該ROR1結合蛋白藉由連接體連接。
如請求項87之方法，其中該連接體為可裂解連接體。
如請求項88之方法，其中該可裂解連接體包含P2A連接體、T2A連接體、F2A連接體、E2A連接體、弗林蛋白酶裂解位點或其任何組合。
如請求項1至89中任一項之方法，其中該嵌合多肽進一步包含經截短之EGF受體(EGFRt)。
如請求項90之方法，其中該EGFRt包含與如SEQ ID NO: 24中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項90或91之方法，其中該EGFRt藉由連接體與該c-Jun多肽及/或該ROR1結合蛋白連接。
如請求項92之方法，其中該連接體為可裂解連接體。
如請求項93之方法，其中該可裂解連接體包含P2A連接體、T2A連接體、F2A連接體、E2A連接體、弗林蛋白酶裂解位點或其任何組合。
如請求項1至94中任一項之方法，其中該嵌合多肽進一步包含信號肽。
如請求項95之方法，其中該信號肽源自hIgK。
如請求項96之方法，其中該hIgK信號肽包含如SEQ ID NO: 54中所述之胺基酸序列。
如請求項1至97中任一項之方法，其中該嵌合多肽包含與如SEQ ID NO: 54中所述之胺基酸序列具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至98中任一項之方法，其中該嵌合多肽由外源聚核苷酸編碼，該外源聚核苷酸包含與如SEQ ID NO: 86中所述之核苷酸序列具有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項99之方法，其中該外源聚核苷酸包含載體。
如請求項99或100之方法，其中該外源聚核苷酸進一步包含骨髓增殖性肉瘤病毒增強子、缺失之陰性對照區、dl587rev引子結合位點取代(MND)啟動子、EF1a啟動子、泛素啟動子或其任何組合。
如請求項101之方法，其中該MND啟動子包含與如SEQ ID NO: 92中所述之胺基酸序列具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至102中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度高於約10 mM、高於約15 mM、高於約20 mM、高於約25 mM、高於約30 mM、高於約35 mM、高於約40 mM、高於約45 mM、高於約50 mM、高於約55 mM、高於約60 mM、高於約65 mM、高於約70 mM、高於約75 mM、高於約80 mM、高於約85 mM或高於約90 mM。
如請求項1至102中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度係選自由約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM及約80 mM組成之群。
如請求項1至102中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度係在約30 mM與約80 mM之間、約40 mM與約80 mM之間、約50 mM與80 mM之間、約60 mM與約80 mM之間、約70 mM與約80 mM之間、約40 mM與約70 mM之間、約50 mM與約70 mM之間、約60 mM與約70 mM之間、約40 mM與約60 mM之間、約50 mM與約60 mM之間或約40 mM與約50 mM之間。
如請求項1至102中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度為約50 mM、約60 mM或約70 mM。
如請求項1至106中任一項之方法，其中該培養基進一步包含鈉離子。
如請求項1至107中任一項之方法，其中該培養基進一步包含NaCl。
如請求項1至108中任一項之方法，其中該培養基包含小於約140 mM、小於約130 mM、小於約120 mM、小於約110 mM、小於約100 mM、小於約90 mM、小於約80 mM、小於約70 mM、小於約60 mM、小於約50 mM或小於約40 mM NaCl。
如請求項1至109中任一項之方法，其中該培養基為低張或等張的。
如請求項107至110中任一項之方法，其中該培養基為低張的，且其中該鉀離子濃度及該鈉離子濃度之總和乘以2係小於280 mM。
如請求項107至110中任一項之方法，其中該培養基為低張的，且其中該鉀離子濃度及該鈉離子濃度之總和乘以2係大於240 mM且小於280 mM。
如請求項107至110中任一項之方法，其中該培養基為等張的，且其中該鉀離子濃度及該鈉離子濃度之總和乘以2係大於或等於280 mM且小於300 mM。
如請求項108至113中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度為約60 mM，且該NaCl之濃度係小於約80 mM、小於約75 mM、小於約70 mM、小於約65 mM或小於約60 mM。
如請求項108至113中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度為約55 mM，且該NaCl之濃度係小於約85 mM、小於約80 mM、小於約75 mM、小於約70 mM或小於約65 mM。
如請求項108至113中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度為約50 mM，且該NaCl之濃度係小於約90 mM、小於約85 mM、小於約80 mM、小於約75 mM或小於約70 mM。
如請求項1至116中任一項之方法，其中該等免疫細胞包含T細胞、B細胞、調節性T細胞(Treg)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NKT)細胞或其任何組合。
如請求項1至117中任一項之方法，其中該等免疫細胞已在活體外或離體經工程改造。
如請求項1至118中任一項之方法，其中該培養基進一步包含一或多種細胞介素。
如請求項119之方法，其中該一或多種細胞介素包含介白素-2(IL-2)、介白素-7(IL-7)、介白素-21(IL-21)、介白素-15(IL-15)或其任何組合。
如請求項120之方法，其中該一或多種細胞介素包含IL-2、IL-7及IL-15。
如請求項119或121之方法，其中該培養基包含濃度為約50 IU/mL至約500 IU/mL之IL-2。
如請求項122之方法，其中該IL-2之濃度為約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL。
如請求項122或123之方法，其中該IL-2之濃度係在約100 IU/mL至約300 IU/mL之間。
如請求項122至124中任一項之方法，其中該IL-2之濃度為約200 IU/mL。
如請求項120及122至125中任一項之方法，其中該培養基包含濃度為約50 IU/mL至約500 IU/mL之IL-21。
如請求項126之方法，其中該IL-21之濃度為約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL。
如請求項126或127之方法，其中該IL-21之濃度係在約100 IU/mL至約300 IU/mL之間。
如請求項126至128中任一項之方法，其中該IL-21之濃度為約200 IU/mL。
如請求項120至129中任一項之方法，其中該培養基包含濃度為約500 IU/mL至約1,500 IU/mL之IL-7。
如請求項130之方法，其中該IL-7之濃度為約500 IU/mL、約550 IU/mL、約600 IU/mL、約650 IU/mL、約700 IU/mL、約750 IU/mL、約800 IU/mL、約850 IU/mL、約900 IU/mL、約950 IU/mL、約1,000 IU/mL、約1,050 IU/mL、約1,100 IU/mL、約1,150 IU/mL、約1,200 IU/mL、約1,250 IU/mL、約1,300 IU/mL、約1,350 IU/mL、約1,400 IU/mL、約1,450 IU/mL或約1,500 IU/mL。
如請求項130或131之方法，其中該IL-7之濃度為約1,000 IU/mL至約1,400 IU/mL。
如請求項130至132中任一項之方法，其中該IL-7之濃度為約1,200 IU/mL。
如請求項130至133中任一項之方法，其中該培養基包含濃度為約50 IU/mL至約500 IU/mL之IL-15。
如請求項134之方法，其中該IL-15之濃度為約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL。
如請求項134或135之方法，其中該IL-15之濃度係在約100 IU/mL至約300 IU/mL之間。
如請求項134至136中任一項之方法，其中該IL-15之濃度為約200 IU/mL。
如請求項1至137中任一項之方法，其中該培養基進一步包含細胞擴增劑。
如請求項138之方法，其中該細胞擴增劑包含GSK3B抑制劑、ACLY抑制劑、PI3K抑制劑、AKT抑制劑或其任何組合。
如請求項139之方法，其中該PI3K抑制劑係選自羥基檸檬酸鹽、LY294002、匹替利司(pictilisib)、CAL101、IC87114或其任何組合。
如請求項139之方法，其中該AKT抑制劑係選自MK2206、A443654、AKTi-VIII或其任何組合。
如請求項1至141中任一項之方法，其中如與開始免疫細胞相比，與在不含該高濃度之鉀離子的培養基中培養之免疫細胞及/或不含該c-Jun多肽之免疫細胞相比，該培養基能夠在最終細胞產物中： a. 增加低分化及/或未分化細胞之數目及/或百分率； b. 增加轉導效率； c. 增加幹細胞樣免疫細胞； d. 增加活體內活力； e. 增加細胞效能； f. 防止細胞耗竭；或 g. 其任何組合。
如請求項1至142中任一項之方法，其中該培養基進一步包含鈣離子、葡萄糖或兩者。
如請求項143之方法，其中該培養基進一步包含葡萄糖，且其中葡萄糖之濃度係大於約10 mM。
如請求項144之方法，其中該葡萄糖之濃度為約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約15 mM至約19 mM、約15 mM至約18 mM、約15 mM至約17 mM、約15 mM至約16 mM、約16 mM至約20 mM、約16 mM至約19 mM、約16 mM至約18 mM、約16 mM至約17 mM、約17 mM至約20 mM、約17 mM至約19 mM或約17 mM至約18 mM。
如請求項144之方法，其中該葡萄糖之濃度為約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM或約25 mM。
如請求項144之方法，其中該葡萄糖之濃度為約15.4 mM、約15.9 mM、約16.3 mM、約16.8 mM、約17.2 mM或約17.7 mM。
如請求項143至147中任一項之方法，其中該培養基進一步包含鈣離子，且其中鈣離子之濃度係大於約0.4 mM。
如請求項148之方法，其中該鈣離子之濃度為約0.4 mM至約2.8 mM、約0.4 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.0 mM、約1.0 mM至約2.0 mM、約1.1 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約2.0 mM、約1.3 mM至約2.0 mM、約1.4 mM至約2.0 mM、約1.5 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.8 mM、約1.7 mM至約2.0 mM、約1.8 mM至約2.0 mM、約1.2至約1.3 mM、約1.2至約1.4 mM、約1.2至約1.5 mM、約1.2至約1.6 mM、約1.2至約1.7 mM、約1.2至約1.8 mM、約1.3至約1.4 mM、約1.3至約1.5 mM、約1.3至約1.6 mM、約1.3至約1.7 mM、約1.3至約1.8 mM、約1.4至約1.5 mM、約1.4至約1.6 mM、約1.4至約1.7 mM、約1.4至約1.8 mM、約1.5至約1.6 mM、約1.5至約1.7 mM、約1.5至約1.8 mM、約1.6至約1.7 mM、約1.6至約1.8 mM或約1.7至約1.8 mM。
如請求項148之方法，其中該鈣離子之濃度為約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM、約2.0 mM、約2.1 mM、約2.2 mM、約2.3 mM、約2.4 mM、約2.5 mM、約2.6 mM、約2.7 mM、約2.8 mM、約2.9 mM或約3.0 mM。
如請求項1至150中任一項之方法，其中該等免疫細胞在該培養之後為CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+或TCF7+，或其任何組合。
如請求項1至151中任一項之方法，其中該等免疫細胞在醫藥組合物及醫藥學上可接受之載劑中調配。
一種免疫細胞群體，其藉由如請求項1至152中任一項之方法加以製備。
一種免疫細胞群體，該等免疫細胞能夠在活體內實現長期持久性，其中該等免疫細胞已：(i)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養，及(ii)經修飾以表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽。
如請求項154之免疫細胞群體，當投與至有需要之個體時，該等免疫細胞能夠在該個體中持續至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月或至少約6個月。
一種醫藥組合物，其包含如請求項153至155中任一項之免疫細胞群體及醫藥學上可接受之載劑。
一種治療有需要之個體的腫瘤之方法，該方法包括向該個體投與如請求項153至155中任一項之免疫細胞群體或如請求項156之醫藥組合物。
如請求項157之方法，其中該腫瘤源自癌症，該癌症包含乳癌、頭頸部癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、胰臟癌、甲狀腺癌、食道癌、眼癌、胃(stomach/gastric)癌、胃腸癌、卵巢癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其組合。
如請求項157或158之方法，其中該腫瘤為實體腫瘤。
如請求項156至159中任一項之方法，其中在該投與之後，與參考腫瘤大小相比，該腫瘤的大小(腫瘤大小)有所減少。
如請求項160之方法，其中該參考腫瘤大小包含：(i)在該投與之前的腫瘤大小，(ii)未接受該投與(例如，接受經轉導且在不包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養之相應免疫細胞之投與)之相應個體的腫瘤大小，或(iii) (i)及(ii)兩者。
如請求項160或161之方法，其中與該參考腫瘤大小相比，該腫瘤大小減少至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。
如請求項157至162中任一項之方法，其中在該投與之後，與參考存活持續時間相比，該個體之存活持續時間增加。
如請求項163之方法，其中該參考存活持續時間包含未接受該投與(例如，接受經轉導且在不包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中培養之相應免疫細胞之投與)之相應個體的存活持續時間。
如請求項163或164之方法，其中與該參考存活持續時間相比，該存活持續時間增加至少約一週、至少約兩週、至少約三週、至少約一個月、至少約兩個月、至少約三個月、至少約四個月、至少約五個月、至少約六個月、至少約七個月、至少約八個月、至少約九個月、至少約10個月、至少約11個月或至少約一年。
如請求項157至165中任一項之方法，該方法進一步包括向該個體投與至少一種額外治療劑。
如請求項166之方法，其中該至少一種額外治療劑包含化學治療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法或其任何組合。
如請求項167之方法，其中該免疫檢查點抑制劑包含抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗GITR抗體、抗TIM-3抗體或其任何組合。
一種組合物，其包含CD4+ T細胞及CD8+ T細胞群體，該等T細胞已經修飾以(a)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽，其中：(i)至少約20%之該等經修飾CD4+ T細胞對CCR7及CD45RA呈表面陽性；(ii)至少約20%之該等經修飾CD8+ T細胞對CCR7及CD45RA呈表面陽性；或(iii) (i)及(ii)兩者。
一種組合物，其包含CD4+ T細胞群體，該等T細胞已經修飾以(a)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽，其中至少約20%之該等經修飾CD4+ T細胞對CCR7及CD45RA呈表面陽性。
一種組合物，其包含CD8+ T細胞群體，該等T細胞已經修飾以(a)表現包含ROR1結合蛋白之嵌合多肽且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽，其中至少約20%之該等經修飾CD8+ T細胞對CCR7及CD45RA呈表面陽性。
一種組合物，其包含免疫細胞群體，該等免疫細胞已經修飾以(a)表現經工程改造之嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽，其中至少約4%之該等細胞為前驅細胞耗竭T細胞。
一種組合物，其包含免疫細胞群體，該等免疫細胞已經修飾以(a)表現經工程改造之嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽，其中在約4%與約6%之間的該等細胞為前驅細胞耗竭T細胞。
一種組合物，其包含免疫細胞群體，該等免疫細胞已經修飾以(a)表現經工程改造之嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)且(b)如與未經修飾為具有增加水準之c-Jun多肽的相應免疫細胞相比，具有增加水準之該c-Jun多肽，其中至少約4%之該等細胞為前驅細胞耗竭T細胞且至少約4%之該等細胞為幹細胞樣T細胞。