TW202313661A - 嵌合型氣體囊泡及其蛋白質表現系統 - Google Patents

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Abstract

本發明具體描述一種嵌合型氣體囊泡及其大腸桿菌表現系統；該嵌合型氣體囊泡包括二或二以上氣體囊泡肋蛋白，6至56個胺基酸長度之異源胜肽可以同框插入至重組肋蛋白中，其所產生之嵌合型氣體囊泡可以被廣泛的使用於各種應用中。

Description

嵌合型氣體囊泡及其蛋白質表現系統
本發明係關於一種嵌合型氣體囊泡及其應用。
氣體囊泡 (Gas vesicle)係蛋白質包覆之中空胞器，發現於藍綠菌(cyanobacteria)、土壤細菌(soil bacteria)、鹽桿菌(halobacteria)之細胞內，其對於周遭空氣具有擴散通透性，並提供細菌浮力以調整其於水體環境中的垂直運動，以利獲得陽光或氧氣。
氣體囊泡為圓柱形奈米結構，並具有錐形端點，其寬為40至250奈米、長為50至1000奈米。該些離散的蛋白質奈米粒子，其對於周遭空氣具有通透性，在生物工程方面具有相當多樣且巨大的應用潛力。在習知技術中，仰賴氣體囊泡對於浮力的正增加，聲波共振的生物影像學發展以及生物質生產的擴展已有具體的描述。此外，作為奈米級的生物粒子，其相當適合用於疫苗的載體設計。
按，世界專利公開號WO1990010071A1揭露了一種重組細胞與重組載體用於大腸桿菌中表現氣體囊泡蛋白質，並增進轉形細胞之漂浮性質。蘇力菌以色列亞種 ( Bacillus thuringiensis israelensis，Bti)相當適合作為特定雙翅目於幼蟲時期的生物防治媒介。當轉形有氣體囊泡基因時，蘇力菌以色列亞種處於水中的傾向下降並使其殺幼蟲(larvicidal)活性更加持久。其他合併有氣體囊泡基因的宿主則克服了在生物反應器中的沉積議題，其增進了有機廢物或醫療、農業產物的生物降解。
按，世界專利公開號WO2018043716A1，水島良太及渡邊朋信共同發表了一種將包括 gvpA及 gvpC在內的氣體囊泡基因導入真核細胞以表現氣體囊泡蛋白的方法；該些 gvpA及 gvpC基因係衍生自藍綠菌，並具有在哺乳類中表現的最佳化密碼子，其以跳躍子(transposon)載體搭載 gvpA及 gvpC基因並運送至哺乳類細胞中；該先前技術所揭露的方法更提供了一種建立穩定表現氣體囊泡之穩定細胞株或基因轉殖動物的套組。
按，美國專利公開號US20140234904A1，Stephen及Levi揭露了採集光合單細胞有機體及其生產氣體囊泡的方法；這些自組裝(self-assembling)的氣體囊泡蛋白形成錐狀絲(conical filaments)，其可阻斷水分子但仍允許空氣擴散通過；過量表現(overexpression)這些氣體囊泡增加了該些光合單細胞有機體的浮力，並有利於其採收，毋須經過離心、過濾或化學沉澱(chemical flocculation)。
Shapiro 等人 (Science 27 Sep 2019: Vol. 365, Issue 6460, pp. 1469-1475) 描述了一種分離及功能化氣體囊泡的具體方法；氣體囊泡的奈米結構以靶向官能基(moiety)及螢光改造，並利用超聲波及磁共振進行造影；該方法需要3至8天的時間來製備該些具基因編碼能力的奈米結構，且該些奈米結構令具有高靈敏度之多模態及非侵入性生物造影得以實現，並具有分子靶向之潛力。
按，PCT專利公開號WO2021041934A1，Jin等人揭示了一種基因工程蛋白酶敏感型氣體囊泡；該種氣體囊泡包括有GvpA或GvpB蛋白以及一個基因工程GvpC蛋白；蛋白酶辨認位插入該GvpC之中央區塊或附接於GvpC之N端或C端；該些基因工程氣體囊泡展現了自基線至崩解的非線性超聲波反應；蛋白酶結合至辨認位並致使基因工程GvpC的斷裂。接著，該些基因工程氣體囊泡隨著GvpC斷裂而崩解，偵測該些崩解有助於篩選基因工程蛋白酶敏感型氣體囊泡；該方法有效減少了崩解壓力分佈(collapse pressure profile)及蛋白酶降解，並且改良基因工程氣體囊泡於宿主細胞中的表現促使產生足量的蛋白產量；此外，用於檢測及傳感的超聲波亦呈現了增強的非線性行為。
按，美國專利公告號US5824309，DarSarma等人揭示了一種利用重組氣體囊泡生產蛋白疫苗的方法。衍生自病原體的外來抗原決定位插入 gvpA或 gvpC中以呈遞抗原 (antigen presenting)，於投予受試者時得誘發其免疫。無需佐劑，具有重組氣體囊泡的疫苗產生了壽命長的免疫球蛋白反應，例如IgG或IgM。於該專利中，古細菌 Halobacterium halobium培養作為基因工程氣體囊泡製備之宿主細胞。
主流的氣體囊泡研究以鹽桿菌、藍綠菌及巨大芽孢桿菌( Priestia megaterium或 Bacillus megaterium)。
在藍綠菌及鹽桿菌中，零脂質、堅固的蛋白質膜由該些蛋白質組成：GvpA蛋白質，其主要為70至85胺基酸之疏水性蛋白質，其形成了氣體囊泡的肋型基本結構，及作為次要組成的GvpC蛋白質，其具有200至450個胺基酸之親水性蛋白，如圖1所示，該些GvpC蛋白質位於氣體囊泡的外表面；GvpC被認為是支架(scaffold)結構蛋白質，係由於其增強了氣體囊泡結構；在土壤細菌巨大芽孢桿菌( P. megaterium)中，具有88個胺基酸的GvpB蛋白質，其為藍綠菌及鹽桿菌中GvpA之同源基因，被發現對於氣體囊泡的形成相當必要，並扮演如藍綠菌及鹽桿菌中GvpA的角色。如圖6所示，在巨大芽孢桿菌中的14基因 gvp操縱組中具有額外一套的gvpA基因，其為巨大芽孢桿菌之gvpB的同源基因，但其功能尚未確立。此外，於巨大芽孢桿菌中尚未發現GvpC的同源基因。
除了氣體囊泡主結構蛋白GvpA及氣體囊泡次結構蛋白GvpC，如圖1所示，針對鹽桿菌的氣體囊泡免疫墨點法偵測到另外五種氣體囊泡輔助蛋白質GvpJ、GvpM、GvpF、GvpG及GvpL。氣體囊泡輔助蛋白僅佔據了整體氣體囊泡蛋白質的極小一部分，並被假定位於氣體囊泡的錐形端點，並對於氣體囊泡曲度具有影響。在藍綠菌水華束絲藻( A. flos-aquae)中，GvpJ、GvpK及GvpL的同源基因已被鑑定出來，而在巨大芽孢桿菌中總共5個不同的輔助氣體囊泡蛋白都已被鑑定出來。
氣體囊泡蛋白質A (gas vesicle protein A，GvpA)作為氣體囊泡的主結構蛋白，其形成了氣體囊泡外殼的主體，約佔據其質量的97%。氣體囊泡外殼為2奈米厚且由單一層GvpA所組成；GvpA形成4.6奈米的「肋骨」，其與氣體囊泡之長軸近乎垂直；如圖4a所示，GvpA具有疏水性α-螺旋、β-摺板、 β-摺板及α-螺旋之核心胺基酸序列，以下稱為GvpA 核心序列(GvpA core sequence)。
GvpA蛋白質由 gvpA基因所編碼，並已在數十種微生物中完成了定序與鑑定；該些GvpA蛋白質序列具有高度同源性，尤其如圖4a所示之α-螺旋、 β-摺板、β-摺板及 α-螺旋核心序列，其中僅有N端及C端序列在不同物種中呈現不同態樣。
在一些藍綠菌中，發現有複數個相同拷貝之 gvpA基因；在鹽桿菌中，兩個具有些微差異的 gvpA基因拷貝於兩套 gvp操作組中被發現，其分別坐落在染色體及質體上(c-vac 及 p-vac)，以及在巨大芽孢桿菌的14基因 gvp操縱組上發現 ( gvpA及 gvpB)。
長久以來，於氣體囊泡研究領域中所公認者，在於每一個氣體囊泡中僅存在有一種肋蛋白質GvpA；在鹽桿菌 Halobacterium salinarum中，c-vac及p-vac分別坐落在染色體或質體上的不同基因叢(gene cluster)中；C-vac 及 p-vac的基因表現係由不同機制所主導，且因此每一次產生氣體囊泡時，其肋蛋白質GvpA係表現自c-vac 或 p-vac，但尚未發現有同時表現的情形；在巨大芽孢桿菌中， gvpA及 gvpB位於同樣的14基因 gvp操縱組上，而僅有gvpB為形成氣體囊泡所需要，gvpA所扮演的角色尚未釐清。
透過插入外源胜肽至GvpA之N端、C端或核心序列以改造GvpA已歷經許多嘗試；然而，GvpA蛋白質的剛性限制了改造GvpA的空間；DarSarma團隊揭示了，在 H . salinarum的GvpA之C端同框附接超過5個異源胺基酸將導致其無法形成氣體囊泡；其他針對N端或核心序列插入異源胺基酸的嘗試也都告失敗，這限制了氣體囊泡在諸般項目中的應用性，例如疫苗、生物標記等技術。
GvpC為次要的支撐結構蛋白質，並且發現於藍綠菌及鹽桿菌的氣體囊泡表面。以水華束絲藻 ( Anabaena flos-aquae， A. flos-aquae)為例，GvpC佔有約2.9%的氣體囊泡蛋白質，且其可於界面活性劑作用或鹽濃度的變化中自氣體囊泡表面脫附；作為支架蛋白質，GvpC通過與GvpA之間的蛋白質交互作用(protein-protein interaction)穩定了氣體囊泡結構；在 H . salinarum中，GvpC可附接高達398個異源胺基酸，這使得GvpC更適合應用於生物工程技術中，而該些具有基因工程改造GvpC的氣體囊泡又稱為氣體囊泡奈米顆粒(gas vesicle nanoparticles，GVNPs)。
然而，GvpC於氣體囊泡表面的貼附並不穩定，且GvpC/GvpA或GvpC/GV間的比例難以在實務上維持在穩定的水平；舉例來說，由鹽桿菌所生產的GVNP僅能在高鹽環境中維持穩定；在低鹽環境中，GVNPs的結構相當容易崩解，從而造成GvpC自奈米顆粒上脫附；是故，GVNPs的結構不穩定及GvpC自GVNP表面脫附的傾向都降低了GVNP作為抗原呈遞載體或超音波、核磁共振造影生物標記的可靠性。
另一方面，氣體囊泡在鹽桿菌中的生產週期長達3至4週，相當費時，因此GV或GVNP的生產成本在鹽桿菌中始終遠高於大腸桿菌表現系統；與此同時，也缺乏適用於鹽桿菌中的載體/宿主系統，以有效表現氣體囊泡並大量生產之。
是以，在嘗試克服前述限制的道路上，新型態的基因工程嵌合型氣體囊泡(chimeric gas vesicle，CGV)亟具必要性。
在氣體囊泡研究領域中，廣泛的認知中僅有一種蛋白質，也就是GvpA，形成氣體囊泡的肋結構。換言之，在一個氣體囊泡中，僅有一個種類的肋蛋白，例如藍綠菌、鹽桿菌及土壤細菌的GvpA，或巨大芽孢桿菌中的GvpA同源基因GvpB；於本發明中，揭示有一種嵌合型氣體囊泡，其具體牽涉了兩種或兩種以上的肋蛋白。
本發明所提供的嵌合型氣體囊泡具體帶來了多種優點，其有別習知的氣體囊泡或氣體囊泡奈米顆粒。舉例來說，先前技術在氣體囊泡中GvpA直接進行基因工程的嘗試，由於其本身的剛性素質，終告失敗，僅相當有限數量的異源胜肽能在不破壞氣體囊泡的前提下插入GvpA。本發明所提供的嵌合型氣體囊泡突破了此一限制，並使得氣體囊泡能更廣泛的應用於生物技術領域中。在鹽桿菌中，氣體囊泡奈米顆粒中基因改造的GvpC係透過蛋白質交互作用貼附於氣體囊泡表面，使得氣體囊泡奈米顆粒相當不穩定，並對於溫鹽條件相當敏感，其十分容易自氣體囊泡表面脫附下來。本發明所提供的嵌合型氣體囊泡中，安插於嵌合型氣體囊泡中異源胜肽係以共價鍵結的形式與肋蛋白結合，這有效的消除了異源胜肽自氣體囊泡表面脫附的議題，使其能更順利地由氣體囊泡呈遞。再者，本發明所提供的嵌合型氣體囊泡能在相當短的製程週期中完成製備，與在鹽桿菌生產的氣體囊泡奈米顆粒或藍綠菌生產的氣體囊泡相比，生產週期大幅度的縮短。嵌合型氣體囊泡相較於其他種類的氣體囊泡更為穩定；換言之，本發明所提供的嵌合型氣體囊泡，相較於習知的氣體囊泡具有較高的「臨界崩解壓力」；在一些案例中，該些嵌合型氣體囊泡在室溫下相當穩定，並可以維持達1個月，而在4℃的條件下更至少能穩定維持6個月並且不降解。
在氣體囊泡研究領域中，如圖1所示，廣泛的認知中僅有一種肋蛋白質，也就是GvpA，形成了氣體囊泡的肋結構(rib structure)；換言之，在一個氣體囊泡中，僅有一個種類的肋蛋白(rib protein)，例如藍綠菌、鹽桿菌及土壤細菌的GvpA，或巨大芽孢桿菌中的GvpA同源物GvpB。
於本發明之一實施態樣中提供一種嵌合型氣體囊泡，其包括至少二氣體囊泡肋蛋白，其中該肋蛋白係選自由一主肋蛋白及一次肋蛋白所組成之群組，其中該主肋蛋白異於該次肋蛋白之處為具有獨立形成一氣體囊泡之能力；較佳地，如圖2及圖3所示，該主肋蛋白及該次肋蛋白之間僅有小於95%之同源性，其中任一該氣體囊泡肋蛋白係衍生自巨大芽孢桿菌 ( P. megaterium)。
在一些示例中，該至少二氣體囊泡肋蛋白可以是二主肋蛋白、二次肋蛋白或一主肋蛋白及一次肋蛋白之組合；較佳地，該次肋蛋白於該主肋蛋白的存在下，形成一完整的嵌合型氣體囊泡，在此情形下該嵌合型氣體囊泡較為穩定。
在多個實施例中，該主肋蛋白及該次肋蛋白構成了該嵌合型氣體囊泡至少90%之乾重量。
在多個實施例中，該次肋蛋白包括一核心序列及一異源胜肽，其中該異源胜肽同框(in frame)插入於該核心序列之C端或N端；具體地，該核心序列之特徵在於一蛋白結構，其具有一第一α螺旋、一位於該第一α螺旋C端之第一β摺板、一位於該第一β摺板C端之第二β摺板、及一位於該第二β摺板C端之第二α螺旋；簡言之，該蛋白結構為一α螺旋-β摺板-β摺板-α螺旋之三級結構(tertiary structure)。
在較佳實施例中，該核心序列係選自由GvpA核心序列及GvpB核心序列所組成之群組。
在多個實施例中，該第一α螺旋包含SSSLAEVIDRILD 或SSGLAEVLDRVLD之胺基酸序列；該第一β摺板包含KGIVIDAFARVSL、KGIVIDAFARVSV、KGIVIDAWVRVSL、KGVVVDVWARISL或KGVVVDVWARVSL之胺基酸序列；該第二β摺板包含VGIEILTIEARVVI、VGIELLAIEARIVI 或 VGIEILTVEARVVA之胺基酸序列；該第二α-螺旋包含ASVDTWLRYAEXZ、ASVETYLKYAEXZ或ASVDTFLHYAEXZ之胺基酸序列；較佳地，該X胺基酸殘基為丙胺酸(Ala)或麩醯胺酸(Glu)，該Y胺基酸殘基為纈胺酸(Val)或異白胺酸(Ile)。
具體來說，該核心序列為GvpA蛋白或GvpB蛋白之疏水性區域；如圖4a所示，該核心序列為一三級蛋白質結構，其由4個依序為α螺旋-β摺板-β摺板-α螺旋之二級結構所組成；該GvpA蛋白或該GvpB蛋白衍生自藍綠菌、鹽桿菌或土壤細菌；較佳地，該土壤細菌為巨大芽孢桿菌( Priestia Megaterium)；該鹽桿菌為 Halobacterium salinarum；該藍綠菌為水華束絲藻( Anabaena flos-aquae)。
在一些較佳實施例中，該GvpA蛋白具有如SEQ ID NO.: 1之胺基酸序列；該GvpB蛋白具有如SEQ ID NO.: 2之胺基酸序列。
具體而言，該核心序列包括來自巨大芽孢桿菌之GvpA蛋白或GvpB蛋白之第9至61胺基酸，但並不以此為限；此外，所有的氣體囊泡肋蛋白均攜帶著該核心序列；再者，任何來自藍綠菌、鹽桿菌或土壤細菌之GvpA蛋白或GvpB蛋白之同源物 (homolog)，或任何同源於該核心序列之蛋白質序列，均可經由基因工程並擔任該次肋蛋白之角色。
須說明的是，前述二級結構係由線上提供之蛋白質二級結構預測程式Jpred 4所預測；如圖4a所示，形成α螺旋之區域以底線標記為H，而形成β摺板則標記為S。
圖4b所示為具有外源胜肽之次肋蛋白之序列比對圖，概略地顯示該次肋蛋白之設計，其中該外源胜肽係插入於該核心序列之C端。
在另一些實施例中，該外源胜肽具有至少6個胺基酸，且該外源胜肽係衍生自人工設計胜肽序列、受體、荷爾蒙、細胞激素、受器、抗體互補位、毒蛋白或螢光蛋白。
在一些較佳實施例中，該主肋蛋白為GvpB蛋白，該次肋蛋白為具有一外源胜肽之核心序列，其中該外源胜肽具有至少6個胺基酸，且該外源胜肽插入於該核心序列之C端或N端。
較佳地，該核心序列包括一截斷之肋蛋白，其保有源自巨大芽孢桿菌之GvpA或GvpB蛋白之第1(甲硫氨酸，Methionine)至第61(纈胺酸，Valine)個胺基酸殘基。
舉例來說，該外源胜肽可以插入在該核心序列之C端，其具有6至56個或更多之胺基酸殘基，而該核心序列為該氣體囊泡肋蛋白之截斷型(truncated)；該截斷之氣體囊泡肋蛋白及該外源胜肽共同形成了該次肋蛋白，其攜帶了一外源胜肽並可投入於多種生物科技領域的應用；然而，更長的外源胜肽將導致該嵌合型氣體囊泡不穩定並降低其產率。
在一些實施例中，該外源胜肽也可以是由二或二以上之外源蛋白所衍生；舉例來說，來自蛋白質A的20個胺基酸及來自蛋白質B的25個胺基酸共同形成長度為45個胺基酸之外源胜肽，其作為形成該次肋蛋白之插入物；較佳地，該外源胜肽係衍生自病原體之蛋白序列、抗體之變異區、荷爾蒙、細胞激素或受體。
在多個實施例中，該嵌合型氣體囊泡係表現於並純化自大腸桿菌( E. coli)。
在一個或多個實施例中，該嵌合型氣體囊泡進一步包括一組裝蛋白(assembly protein)，其中該組裝蛋白包括GvpP蛋白、GvpP蛋白或其組合；該組裝蛋白係衍生自巨大芽孢桿菌；該些組裝蛋白促進、加速或穩定該嵌合型氣體囊泡之形成；有了GvpP蛋白及GvpQ蛋白，該次肋蛋白可以更加均勻的分布在該嵌合型氣體囊泡的表面；在GvpP蛋白及GvpQ蛋白的輔助下形成之該些嵌合型氣體囊泡，相較於未受到GvpP蛋白及GvpQ蛋白輔助之嵌合型氣體囊泡更加穩定。
在一些特定的實施例中，該GvpP蛋白具有如SEQ ID NO.: 3之胺基酸序列；該GvpQ蛋白具有如SEQ ID NO.: 4之胺基酸序列。
在較佳實施例中，該嵌合型氣體囊泡更進一步包括至少一種輔助蛋白(accessory protein)選自由GvpR、GvpN、GvpF、GvpG、GvpL、GvpS、GvpK、GvpJ、GvpT及GvpU所組成之群組。
所謂「嵌合型氣體囊泡(chimeric gas vesicles，CGVs」意指該些氣體囊泡係由至少兩種具有不同蛋白質序列之Gvp肋蛋白所構成；相對地，其他公開文獻所描述之氣體囊泡僅涉及一種主要肋蛋白，即GvpA。
所謂「肋蛋白(rib protein)」意指該氣體囊泡蛋白形成該些氣體囊泡或嵌合型氣體囊泡之「肋骨」；一旦氣體囊泡成形，該肋蛋白就無法在不破壞該些氣體囊泡的前提下由氣體囊泡上卸除；該氣體囊泡肋蛋白形成大約4.6奈米的「肋骨」，其堆疊成陣列並與該氣體囊泡之長軸近乎垂直，並構成了該氣體囊泡壁的主要部分(97%)；如圖1所示，該些壁為2奈米厚且由單一層肋蛋白所構成；所有氣體囊泡肋蛋白具有一疏水性三級結構其具有4個二級結構：α螺旋、 β摺板、β摺板及α螺旋；如圖4a至4b所示，三級結構之蛋白序列被定義為「核心序列」。
所謂「主肋蛋白」意指來自藍綠菌、鹽桿菌及土壤細菌之GvpA蛋白，以及源自巨大芽孢桿菌之GvpB，或任何同源且功能相當於GvpA蛋白之Gvp蛋白，其可形成氣體囊泡之肋結構；該氣體囊泡主肋蛋白為一具「核心序列」之肋蛋白；會同微量之Gvp輔助結構蛋白諸如GvpF、 GvpG、GvpJ、GvpK、GvpL、GvpS，主肋蛋白形成了完整的氣體囊泡；該些主肋蛋白可以在不涉及其他肋蛋白的前提下就足以形成氣體囊泡；一旦氣體囊泡成形，該些主肋蛋白就無法在不破壞氣體囊泡的前提下自氣體囊泡上卸除；該些氣體囊泡主肋蛋白構成20至99.9%之氣體囊泡總蛋白，其被認為是主結構蛋白、主構成蛋白、肋蛋白等。
所謂「次肋蛋白」意指一種具有「核心序列」之肋蛋白，其僅於另一種肋蛋白存在時才會形成氣體囊泡；大多數的時候，另一種肋蛋白為氣體囊泡主肋蛋白，但它也可以是另一種具有不同蛋白質序列之氣體囊泡次肋蛋白；一旦嵌合型氣體囊泡成形，即無法在不破壞嵌合型氣體囊泡的前提下自嵌合型氣體囊泡上卸除；該些氣體囊泡次肋蛋白構成3至80%之氣體囊泡總蛋白。
天然的肋蛋白係於自然環境中所發現之氣體囊泡肋蛋白、GvpA或其同源物；截斷之肋蛋白係已移除部分胺基酸序列之天然氣體囊泡肋蛋白；該些重組肋蛋白為天然或截斷之氣體囊泡肋蛋白，其具有同框插入至C端、N端或中段之外源胜肽。
所謂「核心序列」意指GvpA或其同源物之疏水性區域，如圖4a至4b所示，其具有由4個二級結構所構成之三級結構：α螺旋、 β摺板、β摺板及α螺旋；該些「核心序列」橫跨了源自巨大芽孢桿菌GvpA或GvpB之第9 (絲氨酸，Serine) 至61 (纈胺酸，Valine)個胺基酸殘基；所有氣體囊泡肋蛋白均攜帶此核心序列。
另一方面，本發明提供一種蛋白質表現系統，用於表現該嵌合型氣體囊泡，其中該蛋白質表現系統包括其包括一第一聚核苷酸片段，其編碼有其中一種氣體囊泡肋蛋白，及一第二聚核苷酸片段，其編碼有另一種氣體囊泡肋蛋白；其中，該蛋白質表現系統可以是基於DNA的蛋白質表現系統或基於RNA的蛋白質表現系統。
在多個實施例中，該第一聚核苷酸片段編碼有該主肋蛋白；該第二聚核苷酸片段編碼有該次肋蛋白，其中，該第二聚核苷酸片段包括一編碼有核心序列之核心聚核苷酸片段，及一編碼有異源胜肽之異源聚核苷酸片段。
在一些較佳實施例中，該核心序列之特徵在於一三級結構，其包含一第一α螺旋； 一第一β摺板，其位於該第一α螺旋之C端；一第二β摺板，其位於該第一β摺板之C端；及一第二α螺旋，其位於該第二β摺板之C端；較佳地，該核心序列係選自由一GvpA核心序列及一GvpB核心序列所組成之群組。
具體來說，如圖4a所示，該核心序列係GvpA蛋白或GvpB蛋白之疏水性區域，其中該核心序列包含該GvpA蛋白或該GvpB蛋白之第9至61個胺基酸；較佳地，該核心序列為一蛋白質三級結構，其具有4個蛋白質二級結構，其依序排列如：α螺旋、 β摺板、β摺板及α螺旋，其中該GvpA蛋白或該GvpB蛋白係衍生自藍綠菌、鹽桿菌或土壤細菌；較佳地，該土壤細菌為巨大芽孢桿菌( P. Megaterium)；該鹽桿菌為 H. salinarum；該藍綠菌為水華束絲藻( A. flos-aquae)。
在一較佳實施例中，該第一聚核苷酸序列具有如SEQ ID NO.: 5或SEQ ID NO.: 6之核苷酸序列。
在多個實施例中，該外源胜肽具有至少6個胺基酸，其中該外源胜肽係衍生自一天然胜肽序列，其係選自由受體 (ligand)、荷爾蒙激素 (hormone)、細胞激素 (cytokine)、受器(receptor)、抗體之互補位(paratope of antibody)、毒蛋白質 (toxic protein)及螢光蛋白質(fluorescent protein)所構成之群組或一人工設計胜肽序列。
在一些實施例中，該蛋白質表現系統進一步包括一組裝聚核苷酸片段其編碼有一組裝蛋白，其中，該組裝蛋白包括GvpP蛋白、GvpQ蛋白或其組合；有了該組裝蛋白，該次肋蛋白可更加均勻的分布於該嵌合型氣體囊泡之表面；與具有該組裝蛋白輔助之嵌合型氣體囊泡相比，若少了GvpP蛋白或GvpQ蛋白，嵌合型氣體囊泡顯得較為不穩定且容易發生組裝錯誤或產量下降。
在一些特定的實施例中，該組裝聚核苷酸片段係衍生自巨大芽孢桿菌之 gvpP、 gvpQ或其組合；較佳地，該組裝聚核苷酸片段具有如SEQ ID NO.: 7 、 SEQ ID NO.: 8或SEQ ID NO.: 9之核苷酸序列。
在一些實施例中，該蛋白質表現系統更進一步包括一輔助聚核苷酸片段其編碼有至少一種輔助蛋白(accessory protein)選自由GvpR、GvpN、GvpF、GvpG、GvpL、GvpS、GvpK、GvpJ、GvpT及GvpU所組成之群組；在一些具體的實施例中，該輔助聚核苷酸片段具有如SEQ ID NO.: 10之核苷酸序列。
在一些實施例中，該蛋白質表現系統可以是在一宿主中被誘導表現該些氣體囊泡肋蛋白，其中該宿主包括古細菌細胞、原核生物細胞、或真核生物細胞；較佳地，該古細菌細胞為 H. salinarum，該原核生物細胞為大腸桿菌，該真核生物細胞為哺乳類細胞、酵母菌或昆蟲細胞；更佳地，該宿主為大腸桿菌。
如圖8a所示，該些氣體囊泡係純化自轉形有巨大芽孢桿菌基因之大腸桿菌，其具有 gvpB(編碼有一主肋蛋白)及 gvpRNFGLSKJTU；該些氣體囊泡基本上為小尺寸(40x40 nm)及一些大尺寸氣體囊泡 (40x200 nm)；在一些示例性的範例中，如圖8b所示，純化自轉形有巨大芽孢細菌基因之大腸桿菌之該嵌合型氣體囊泡，其具有 gvpA(編碼有重組次肋蛋白)、 gvpPQ(編碼有組裝蛋白)、 gvpB(編碼有主肋蛋白)以及 gvpRNFGLSKJTU；當有了該二種氣體囊泡肋蛋白以及組裝蛋白，該些嵌合型氣體囊泡具體呈現出大尺寸(40x200nm)；在上述例子中，該次肋蛋白為一長度為77個胺基酸之GvpA蛋白，其融合有長度17個胺基酸之外源胜肽。 表1
質體名稱 C 端刪除 (AA) 異源胜肽 (AA) GvpA 之 C 端保留序列 CGV 產量 (μg/ml 每培養物 )
pNL39 0 0 WLRYAEAVGLLTDKVEEEGLPGRTEERGAGLSF 10
pNL114 6 0 WLRYAEAVGLLTDKVEEEGLPGRTEER 10
pNL115 10 0 WLRYAEAVGLLTDKVEEEGLPGR 10
pNL119 13 0 WLRYAEAVGLLTDKVEEEGL 10
pNL118 16 0 WLRYAEAVGLLTDKVEE 10
pNL105 18 0 WLRYAEAVGLLTDKV 10
pNL106 19 0 WLRYAEAVGLLTDK 10
pNL107 20 0 WLRYAEAVGLLTD 10
pNL131 22 0 WLRYAEAVGLL 10
pNL132 24 0 WLRYAEAVG 10
pNL135 25 0 WLRYAEAV 10
pNL133 26 0 WLRYAEA N/A
pNL136 27 0 WLRYAE N/A
pNL134 28 0 WLRYA N/A
pNL151 25 47 WLRYAEAV + 47-AA 6至8
pNL148 25 48 WLRYAEAV + 48-AA 6至8
pNL149 25 49 WLRYAEAV + 49-AA 6至8
pNL150 25 50 WLRYAEAV + 50-AA 6至8
pNL162 25 53 WLRYAEAV + 53-AA 1至2
pNL163 25 56 WLRYAEAV + 56-AA 1至2
在一些實施例中，為了減少較長的異源胜肽所造成之影響，該些氣體囊泡肋蛋白所刪除(deletion)的胺基酸數目也須納入考量；在不影響嵌合型氣體囊泡組裝及成形的前提下，在GvpA之C端最多能刪除25個胺基酸，在GvpB之C端則最多能刪除達27個胺基酸；在一個示例中，GvpA可截斷的胜肽片段最大值及可插入之異源胜肽之最大值被定義了出來；如表1所示，在不破壞嵌合型氣體囊泡的前提下，自巨大芽孢桿菌GvpA可移除長達25個胺基酸，並且具有至少56個胺基酸之異源胜肽可以被插入該截斷GvpA之C端；除此之外，由表1可以理解到，當需要插入越短的異源胜肽時，亦可以在肋蛋白GvpA或GvpB的C端刪除越少的胺基酸。
在另一些實施例中，該蛋白質表現系統可通過二或二個以上不同的表現載體所實現，以使嵌合型氣體囊泡得以在宿主中表現；在一示例中，一編碼有GvpA、GvpP及GvpQ之聚核苷酸片段插入於一第一載體，而另一編碼有GvpB、GvpR、GvpN、GvpF、 GvpG、GvpL、GvpS、GvpK、GvpJ、GvpT 及GvpU之聚核苷酸片段插入於一第二載體；該第一載體及該第二載體共轉形入一宿主以生產該嵌合型氣體囊泡；較佳地，當宿主為大腸桿菌時，該些載體衍生自質體pST39及質體pLysS。
所謂「載體」意指一核酸分子，為了特定生物功能例如蛋白質表現或擴增目標基因之拷貝數量，所述載體包括了基因表現元件，以及基因工程元件(gene engineering elements)以攜帶目標之基因進入選擇之宿主。
在一較佳實施例中，如圖5所示，為了建構一 gvp操縱組系統，其包括有可據以表現該嵌合型氣體囊泡之單一操縱組，將該 gvpAPQ聚核苷酸片段或該 gvpBPQ聚核苷酸片段之3’端共價連結至該 gvpBRNFGLSKJTU聚核苷酸片段之5’端，以形成一 gvpAPQBRNFGLSKJTU聚核苷酸片段或一 gvpBPQBRNFGLSKJTU聚核苷酸片段。
如圖6所示，為了建立該 gvp操縱組系統，其具有可據以分別表現該主肋蛋白及該次肋蛋白之二操縱組，該第二聚核苷酸片段之3’端共價連結至該組裝聚核苷酸片段之5’端以形成一 gvpAPQ聚核苷酸片段或一 gvpBPQ聚核苷酸片段，或該第一聚核苷酸片段之3’端共價連結至該輔助聚核苷酸片段之5’端以形成一 gvpARNFGLSKJTU聚核苷酸片段或一 gvpBRNFGLSKJTU聚核苷酸片段。
具體地，一操縱子(operator)或一促進子(promoter)被設置於該 gvpAPQ聚核苷酸片段、該 gvpBPQ聚核苷酸片段、該 gvpBRNFGLSKJTU聚核苷酸片段、該 gvpAPQBRNFGLSKJTU聚核苷酸片段及該 gvpBPQBRNFGLSKJTU聚核苷酸片段之上游處，以使該 gvp操縱組系統可在誘導因子之操縱下合成嵌合型氣體囊泡組裝所需之蛋白質，該誘導因子可列舉如異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)、乳糖、甲基-β-D-硫代半乳糖苷、苯基-β-D-半乳糖或鄰硝基苯基-β-半乳糖苷 (ONPG)，但不限於此。
在一較佳實施例中，該 gvpAPQBRNFGLSKJTU聚核苷酸片段具有一長度為7053鹼基對之DNA序列，其編碼有GvpA、 GvpP、 GvpQ、 GvpB、 GvpR、 GvpN、 GvpF、 GvpG、 GvpL、 GvpS、 GvpK、 GvpJ、 GvpT及 GvpU，並可以插入合適之表現載體以實現嵌合型氣體囊泡之蛋白質表現；較佳地，該 gvpAPQBRNFGLSKJTU聚核苷酸片段具有如SEQ ID NO.: 11之核苷酸序列。
本發明之再一實施態樣為提供一種嵌合型氣體囊泡之生產方法，其中該嵌合型氣體囊泡具有融合了一異源胜肽之基因改造氣體囊泡次肋蛋白GvpA或GvpB，如圖9所示，該方法包括下列步驟：
(步驟S1) 質體構築：以聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR)及Gibson Assembly同框(in-frame)插入一編碼有長度6至56個胺基酸或更長之異源胜肽之DNA序列至基因改造之GvpA或GvpB蛋白之C端和/或N端以構築一質體，該GvpA或該GvpB係位於重組 gvp操縱組中，其衍生自巨大芽孢桿菌；
(步驟S2) 質體轉形：前述構築之質體轉形至大腸桿菌或其他合適之細菌宿主，其具有表現及生產嵌合型氣體囊泡之能力；
(步驟S3) 誘導表現：前述轉形株於適當之環境中培養至適合誘導表現蛋白質之最佳條件；前述轉形株以IPTG或其他誘導因子刺激表現該嵌合型氣體囊泡；
(步驟S4) 純化並量化該嵌合型氣體囊泡。
為了進一步確認該重組操縱組之序列，該方法進一步包括步驟如：
(步驟S1.1) 序列驗證：在該步驟S1之後，以DNA定序方式確認具有預期插入物之質體序列。
在一些實施例中，該步驟S1包括以PCR及Gibson Assembly插入一編碼有該次肋蛋白之DNA序列至一 gvp操縱組載體，以構築一嵌合型氣體囊泡表現質體，其中該次肋蛋白同框具有一長度至少6個胺基酸之異源胜肽。
於本發明之再一實施態樣中提供一激發免疫反應之方法，其包括投予CGV-Covid-19至一所需個體，如圖10所示，該方法包括步驟如：
(步驟A) 純化並量化於磷酸緩衝液(PBS)中之CGV-Covid-19疫苗；
(步驟B) 投予該CGV-Covid-19疫苗至該所需個體；及
(步驟C) 測定該所需個體之免疫反應。
在一特定之實施例中，CGV-Covid-19以鼻內投予之形式投予至該所需個體，其中該核心序列之C端插入有一長度為17個胺基酸之異源胜肽，其衍生自Covid-19病毒S蛋白，據此該嵌合型氣體囊泡遞呈了衍生自SARS-CoV-2棘蛋白之抗原決定部位；於此，連結酶免疫吸收測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)用以測定該CGV-Covid-19疫苗所激發之免疫反應，但測定方法並不限於此；該所需個體可列舉如人類、小鼠、犬類、豚類、猩猩或其他哺乳動物。
本發明所提供的嵌合型氣體囊泡可以應用於傳染性疾病之疫苗、癌症或其他疾病之治療型疫苗；該嵌合型氣體囊泡可以作為針對癌症、代謝型疾病或其他疾病之治療製劑，諸如攜帶荷爾蒙、細胞激素、受體或部分抗體變異區；它們亦可以作為超音波、MRI或其他造影技術之侵入性造影劑；簡言之，作為奈米微粒之該嵌合型氣體囊泡具有廣泛應用之潛在優勢。
實驗例1 質體構築及驗證 任何適用之大腸桿菌質體/宿主表現系統均可使用，例如pBB322衍生質體/BL21大腸桿菌株(New England Biolab)、pET28質體/BL21 (A1) 大腸桿菌株 (Thermo Fisher)或pST39質體/Rosetta大腸桿菌株(Millipore Sigma)。
質體以限制酶切開或以特定引子PCR擴增以產生相應的DNA片段；編碼有目標胜肽之DNA引子，可以為本領域具有普通技能者設計或自任何商業化引子供應商處購得。
前述DNA片段編碼有異源截斷之GvpA或GvpB蛋白以及目標胜肽，並有一DNA片段攜帶了其餘13個gvp基因：衍生自巨大芽孢桿菌之 gvpPQBRNFGLSKJTU，其為以適當之DNA引子PCR擴增而得；該些片段接著以Gibson Assembly (Thermo Fisher)接合起，並將該些Gibson Assembly混合物轉形至合適的大腸桿菌勝任細胞(competent cell)，接著任一具有本領域普通技能者均得分析並定序確認該些轉形株。
嵌合型氣體囊泡表現及生產
將具有正確DNA序列插入物之質體轉形至預期的大腸桿菌宿主中，並挑選單一菌落以接種至具有適當選殖抗生素之LB培養基中；以IPTG或其他誘導因子誘導嵌合型氣體囊泡表現，並以改良之實驗程序純化之，所述實驗程序包括以下步驟： a. 轉形之大腸桿菌培養達20至22小時後，以500g離心1至2小時； b. 沉澱物以磷酸緩衝液(Phosphate buffered saline，PBS)打散並以界面活性劑、溶菌酶(lysozyme)以及去氧核糖核酸分解脢(DNase)裂解之； c. 細胞裂解液(cell lysate)接著以500g離心5至30分鐘以使嵌合型氣體囊泡與細胞碎片分離；需注意的是，該些嵌合型氣體囊泡漂浮於裂解懸浮液之頂端； d. 以針頭移除細胞碎片及中清液(midnatant)； e. 將保存下來的嵌合型氣體囊泡打散於PBS中； f. 重複步驟c至步驟e十次，直至嵌合型氣體囊泡純度達99%； g. 以分光光度計(spectrophotometer，NanoDrop ND-1000，Thermo Scientific)測定嵌合型氣體囊泡於波長500之吸收度(OD 500)，以計算其最終濃度；需註明的是，嵌合型氣體囊泡1單位的OD 500相當於145ug/ml之蛋白質。
實驗例2 為了驗證本發明可成功插入源自一至多個外源蛋白(foreign proteins)之異源胜肽，在實驗例2中，將源自H1N1病毒之血球凝集素(hemagglutinin ，HA)之長度為20個胺基酸之胜肽及源自Covid-19病毒之棘蛋白接合成一長度為40個胺基酸之胜肽插入物；接著，將前述異源胜肽插入至14基因 gvp操縱組，其可以是在同一個或二個不同之質體上；將該個或該些個質體轉形(transformation)或共轉形(co-transformation)至大腸桿菌勝任細胞中以大量生產攜帶有二或二個以上異源胜肽之嵌合型氣體囊泡。
實驗例3 為了進一步驗證攜帶有多種異源胜肽之嵌合型氣體囊泡之蛋白質表現，依據實驗例1之方法步驟所生產之嵌合型氣體囊泡以西方點墨法(Western Dot Blot)以確認。
具有多種異源胜肽之嵌合型氣體囊泡樣本純化自大腸桿菌培養物，其轉形有相對應之質體構築；以rabbit anti-Covid-19 S protein 作為一級抗體並以goat anti-rabbit IgG-HRP作為二級抗體進行西方點墨染色。 表2
墨點編號 CGV 樣本 異源胜肽序列 S 蛋白序列
1 正控制組 Covid-19 S蛋白 S蛋白
2 pNL39 未插入異源胜肽序列之GvpA 無異源胜肽序列
3 pNL66 TGCVIAWNSNNLDS T430至S443
4 pNL67 NLDSKVGGNYNYLY N440至Y453
5 pNL68 NYLYRLFRKSNLKP N450 至P463
6 pNL69 NLKPFERDISTEIY N460 至 Y473
7 pNL70 TEIYQAGSTPCNGV T470 至V483
8 pNL71 CNGVEGFNCYFPLQ C480至 Q493
9 pNL72 FPLQSYGFQPTNGV F490至V503
10 pNL73 TNGVGYQPYRVVVL T500 至 S513
如圖7所示，代表嵌合型氣體囊泡的陽性墨點為墨點編號5至8，其顯示了Covid-19 S蛋白之抗原辨認部位位於第450至493之胺基酸殘基；在表2中，更細節表列了作為重組 gvp操縱組插入物之Covid-19 S蛋白序列，而Covid-19 S蛋白的抗原部位可以識別的分別有NYLYRLFRKSNLKP (N450至P463)、NLKPFERDISTEIY (N460至Y473) 、TEIYQAGSTPCNGV (T470至V483) 及CNGVEGFNCYFPLQ (C480至Q493)。
本發明所提供的嵌合型氣體囊泡(chimeric gas vesicles，CGVs)具有以下數種相較於習知氣體囊泡(gas vesicle, GV)及氣體囊泡奈米顆粒(gas vesicle nanoparticle, GVNP)之具體優勢。
舉例來說，由於GvpA的剛性，此前針對習知氣體囊泡中GvpA之直接的基因改造不容易成功；迄今，在不破壞氣體囊泡成型的前提下，僅有5個胺基酸長度的異源胜肽得以成功插入至GvpA的C端；本發明所揭示的嵌合型氣體囊泡具體克服了穩定性的限制，並開啟了嵌合型氣體囊泡於各種應用中的可能性；在過去鹽桿菌氣體囊泡的研究中，GVNP中藉由基因改造的GvpC僅透過蛋白質間交互作用附著於氣體囊泡表面，使其面臨溫鹽變化相當敏感且脆弱，GvpC容易由GVNP脫落，大大地降低了習知氣體囊泡的應用性；在嵌合型氣體囊泡中，該些異源胜肽可以插入天然GvpA、截斷型GvpA或其同源物，或以共價融合(covalently fused)之形式與之融合，以形成該些肋蛋白；作為肋狀結構的一部分，前述習知氣體囊泡所面臨的異源胜肽脫落問題得以獲得解決；對於工業或商業上的生產，製造嵌合型氣體囊泡的生產週期大幅度的縮短；在一些狀況下，生產週期可以縮短至2天以內，遠低於鹽桿菌中的GVNP或藍綠菌中的氣體囊泡之生產週期；嵌合型氣體囊泡相較於習知氣體囊泡更為穩定；由大腸桿菌表現來自於巨大芽孢桿菌之 gvp操縱組所生產之嵌合型氣體囊泡相較於任何已知的氣體囊泡都更為穩定；與習知的氣體囊泡相比較，本發明所提供的嵌合型氣體囊泡具有更高的「臨界崩潰壓力(critical collapse pressure」；在庫存方面，在某個實施例中的嵌合型氣體囊泡在室溫保存下維持其完整性至少長達1個月，並在4℃下長達6個月，且並未發生任何降解。基於嵌合型氣體囊泡所展現的上述特徵，本發明大幅度的增進了嵌合型氣體囊泡在未來的應用性。
除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。儘管在本發明的實施或測試中可以使用與本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料，但較佳的方法和材料如上所述。 本文通過引用整體併入所提及的所有刊物、專利申請、公開或公告之專利和其他參考文獻。在有衝突的情況下，以本說明書（包括定義）為準。 此外，材料、方法和示例僅是說明性的，並非旨在限制本發明所宣告之保護範疇。
步驟:S1至S4 步驟:S1.1
圖1為一卡通圖，用以說明已知之天然氣體囊泡結構。
圖2為一卡通圖，用以說明本發明所提供之嵌合型氣體囊泡。
圖3為一卡通圖，用以說明具有異源胜肽之嵌合型氣體囊泡。
圖4a說明了氣體囊泡肋蛋白質的序列比對結果。
圖4b說明了具有異源胜肽之重組次肋蛋白質之序列比對結果。
圖5至6呈現了嵌合型氣體囊泡 gvp操縱組之基因操作。
圖7為一西方墨點圖，用以確認嵌合型氣體囊泡攜帶有不同種類之異源胜肽。
圖8a為一氣體囊泡負染色之電子顯微鏡圖，比例尺為200奈米。
圖8b為一嵌合型氣體囊泡負染色之電子顯微鏡圖，比例尺為200奈米。
圖9為一流程圖，用以說明嵌合型氣體囊泡的製備流程。
圖10為一流程圖，用以說明所需個體投予以CGV-Covid-19疫苗後誘發免疫反應之情形。

Claims (20)

  1. 一種嵌合型氣體囊泡，其包括至少二氣體囊泡肋蛋白，其中該肋蛋白係選自由一主肋蛋白及一次肋蛋白所組成之群組，其中該主肋蛋白異於該次肋蛋白之處為具有獨立形成一氣體囊泡之能力。
  2. 如請求項1所述之嵌合型氣體囊泡，其中任一該氣體囊泡肋蛋白係衍生自巨大芽孢桿菌 ( P. megaterium)。
  3. 如請求項2所述之嵌合型氣體囊泡，其中該次肋蛋白包括一核心序列及一異源胜肽，其中該異源胜肽同框(in frame)插入於該核心序列之C端或N端。
  4. 如請求項3所述之嵌合型氣體囊泡，其中該核心序列包括一GvpA核心序列。
  5. 如請求項3所述之嵌合型氣體囊泡，其中該核心序列包括一GvpA蛋白之第9至61胺基酸殘基，該GvpA蛋白係衍生自巨大芽孢桿菌( P. megaterium)。
  6. 如請求項3所述之嵌合型氣體囊泡，其中該異源胜肽具有至少6個胺基酸。
  7. 如請求項4所述之嵌合型氣體囊泡，其中該異源胜肽係衍生自一天然胜肽序列係選自受質 (ligand)、荷爾蒙激素 (hormone)、細胞激素 (cytokine)、受器(receptor)、抗體之互補位(paratope of antibody)、毒蛋白質 (toxic protein)、螢光蛋白質(fluorescent protein)所構成群組或一人工設計胜肽序列。
  8. 如請求項1所述之嵌合型氣體囊泡，其係表現於並純化自大腸桿菌 ( E. coli)。
  9. 如請求項1所述之嵌合型氣體囊泡，其為至少一組裝蛋白輔助而組裝成形。
  10. 如請求項9所述之嵌合型氣體囊泡，其中該組裝蛋白包括GvpP蛋白、GvpQ蛋白或其組合。
  11. 如請求項9所述之嵌合型氣體囊泡，其中該主肋蛋白及該次肋蛋白構成至少90%該嵌合型氣體囊泡之乾重量。
  12. 一種蛋白質表現系統，其用於表現如請求項1所述之嵌合型氣體囊泡，其包括 一第一聚核苷酸片段，其編碼有其中一種氣體囊泡肋蛋白；及 一第二聚核苷酸片段，其編碼有另一種氣體囊泡肋蛋白。
  13. 如請求項12所述之蛋白質表現系統，其中，該第二聚核苷酸片段包括 一核心聚核苷酸片段，其編碼有一核心序列；及 一異源聚核苷酸片段，其編碼有一異源胜肽。
  14. 如請求項13所述之蛋白質表現系統，其中，該核心序列包括一GvpA核心序列。
  15. 如請求項13所述之蛋白質表現系統，其中，該核心序列包括一GvpA蛋白之第9至61胺基酸殘基，該GvpA蛋白係衍生自巨大芽孢桿菌( P. megaterium)。
  16. 如請求項13所述之蛋白質表現系統，其中該異源胜肽具有至少6個胺基酸。
  17. 如請求項13所述之蛋白質表現系統，其中該異源胜肽係衍生自一天然胜肽序列係選自由受質 (ligand)、荷爾蒙激素 (hormone)、細胞激素 (cytokine)、受器(receptor)、抗體之互補位(paratope of antibody)、毒蛋白質 (toxic protein)及螢光蛋白質(fluorescent protein)所構成之群組或一人工設計胜肽序列。
  18. 如請求項13所述之蛋白質表現系統，其進一步包括一組裝聚核苷酸片段，其編碼有一組裝蛋白。
  19. 如請求項13所述之蛋白質表現系統，其中該嵌合型氣體囊泡係表現於並純化自大腸桿菌 ( E. coli)。
  20. 一種嵌合型氣體囊泡，其表現於並純化自大腸桿菌 ( E. coli)，其包括至少二氣體囊泡肋蛋白，其中該肋蛋白係選自由主肋蛋白及次肋蛋白所組成之群組，其中該主肋蛋白異於該次肋蛋白之處為具有獨立形成一氣體囊泡之能力，且其中一種肋蛋白具有一核心序列，該核心序列之C端或N端同框插入有一異源胜肽。
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