TW202246509A - 仿真病毒及其製備方法 - Google Patents
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Abstract
本發明是關於一種針對冠狀病毒的新穎仿真病毒及其製備方法。本發明所提供的仿真病毒之外部結構蛋白包含S蛋白、E蛋白及M蛋白，相比於僅包含S蛋白的仿真病毒，SEM仿真病毒對於受體有更強結合能力且更加接近真實冠狀病毒之生物特性。
Description
本發明是關於一種新穎的仿真病毒顆粒及其生產方法，特別是關於一種針對冠狀病毒的仿真病毒及其製備。
進行病毒結合或感染宿主的評估試驗時，若不涉及病毒複製，可顯著地降低生物安全風險。仿真病毒 (pseudotyped virus)是一種眾所周知的病毒學方法，根據需要將特定病毒片段包裹在非自結構蛋白中以實現上述目的。
冠狀病毒結構蛋白中的S蛋白(spike protein)對於病毒感染能力至關重大，包含負責與受體結合的N端S1次單元及促進病毒與宿主膜融合的C端S2次單元。S1次單元的受體結合結構域 (receptor-binding domain, RBD)藉由識別細胞表面上的特定受體來決定細胞趨向性，例如人類血管收縮素轉化酶2 (human angiotensin-converting enzyme II, hACE2)，因此將S蛋白組裝於包膜上的仿真病毒，廣泛地應用在冠狀病毒相關研究。
然而一些研究指出，在S蛋白上需要額外的刪除才能使仿真病毒產生足夠的感染性 (Hu et. al.,
Genes Dis. 2020, 7, 551-557.Johnson et. al.,
J. Virol. 2020, 94, e01062-20.)，這樣的修改也導致了仿真病毒偏離真實冠狀病毒的生物特性。因此，如何在仿真病毒系統中表現全長S蛋白，又能具備更高的受體蛋白結合能力以及更強的感染性，為本技術領域尚須解決的問題之一。
於是，本發明一方面提供一種質體 (plasmid)，其編碼包含：一冠狀病毒之E蛋白 (envelope protein)；及一冠狀病毒之M蛋白 (membrane protein)。
在一些實施例中，其編碼進一步包含一連接肽，位於該E蛋白及該M蛋白之間。
在一些實施例中，其中該連接肽為微小核糖核酸病毒 (Picornavirus)之2A肽。
在一些較佳實施例中，該質體包含如SEQ ID NO: 01所示之序列。
另一方面，本發明亦提供一種生產仿真病毒顆粒之細胞，其特徵在於該細胞引入以下質體：編碼包含冠狀病毒之E蛋白及M蛋白之質體；一S質體，其編碼包含一冠狀病毒之S蛋白 (spike protein)；及一包裝 (packaging)質體。
在一些實施例中，上述細胞進一步包含：一報導質體，其編碼包含一報導基因。
在一些較佳實施例中，上述報導基因選自
luc、
gfp、
yfp、
rfp及
LacZ。
在一些實施例中，上述冠狀病毒選自SARS-CoV病毒、SARS-CoV-2病毒及MERS-CoV病毒。
在一些實施例中，上述包裝質體源自慢病毒 (Lentivirus)、水泡性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus)。
在一些較佳實施例中，該細胞為一動物細胞。
另一方面，本發明亦提供一種仿真病毒顆粒，係從上述細胞的培養物中生成或收集而得。
本發明之又一方面，係提供一種生產仿真病毒組成物之方法，包含：於培養上述細胞時加入一弗林蛋白酶抑制劑 (furin protease inhibitor)，並收集所產生之仿真病毒顆粒。
在一些實施例中，所述的弗林蛋白酶抑制劑包含一RVKR多肽。
在一些較佳實施例中，進一步包含：降低該仿真病毒組成物之弗林蛋白酶抑制劑之活性。
在一些實施例中，上述的降低該仿真病毒組成物之弗林蛋白酶抑制劑之活性，包含自該仿真病毒組成物中除去該弗林蛋白酶抑制劑。
透過參考本發明下述中各種實施例的詳細描述，可更容易理解本發明，另外，除非專利範圍中另有具體說明，否則本發明之內容不限於具體的製備方法、載體或製劑。此外，本發明中所用的術語僅用於描述特定實施例之目的，並非用於加以限制。
於說明書與專利範圍中所使用的單數形式如“一”與“該”亦包含其複數形式，因此，除非於上下文中另有注釋，否則單數術語應包含其複數，而複數術語應包含其單數。
術語「質體 (plasmid)」，意指一種在細胞的染色體或核區DNA之外，能夠自主複製的DNA分子。人工質體被廣泛用作分子選殖中的載體，用於驅動宿主內重組DNA序列的複製。
術語「包裝 (packaging) 質體」，意指一種負責表現病毒RNA包裝所需蛋白質的質體，典型的包裝質體包含
Gag、
Pol、
Rev、
Tat等基因。
術語「報導基因(reporter gene)」，意指一類在細胞、組織/器官或個體處於特定情況下會表達並使得他們產生易於檢測的性狀的基因，常用的報導基因有
luc、
gfp、
yfp、
rfp及
LacZ等。
本說明書的數據以「平均值± SD」來表示。兩個組別間的差異藉由雙尾學生t檢驗 (two-tailed Student’s t test) 來比較，p ＜ 0.05 被認為具有統計學意義。
現今大多數的冠狀病毒之仿真病毒製劑僅含有S蛋白，並且如同先前技術中所述，為了使該仿真病毒具有足夠的感染能力，還需要對S蛋白做某些修改，例如特定序列的刪除，造成這樣的仿真病毒的擬真程度下降。本發明為解決上述問題，採用全長S蛋白，並同時引入了E及M結構蛋白後，發現能增加病毒顆粒的感染性。關於本發明所達到之具體功效，將透過以下實施例來說明。
實施例
實施例1 冠狀病毒結構蛋白E-2A-M質體的構建
真正的冠狀病毒之外套膜除了S蛋白，尚包含了E及M蛋白。為了探索冠狀病毒的E及M蛋白對於S蛋白功能的影響，以SARS-CoV-2病毒為例，藉由引入微小核糖核酸病毒 (Picornavirus) 之2A肽切割序列，設計了一個共表現E及M的雙基因表現卡匣 (bicistronic expression cassette)，並進行了密碼子優化，所有蛋白皆未帶有額外的序列標記以避免不必要的影響。
藉由COVID-19的恢復期血漿，在以S質體或E-2A-M質體轉染的細胞中，可分別檢測到S及M蛋白（圖1）。結果顯示，S蛋白以兩種蛋白質形式存在，分別為單體（180-200 kDa）及寡聚體（可能是三聚體）形式的全長S蛋白，M蛋白的分子量約為25 kDa， E蛋白則未檢測到，可能原因是抗原性較差。
實施例2 仿真病毒顆粒的製備
仿真病毒顆粒的組裝可選用常規的包裝系統，例如慢病毒(
Lentivirus)、水疱性口炎病毒 (
Vesicular stomatitis Indiana virus)等。如圖2所示，製備基於慢病毒載體的仿真病毒顆粒，分別為包覆有S蛋白及E-2A-M（以下稱SEM）以及僅有S蛋白包覆（以下稱S-alone），宿主細胞可選用動物細胞，培養時可進一步添加一弗林蛋白酶抑制劑，例如RVKR。
慢病毒載體 pLKO_AS3w.bsd 來自國家 RNAi 核心設施（中央研究院）。含有螢火蟲冷光素酶報導基因的 pLKOAS3W-hyg+FLuc來自林宜玲博士（中央研究院生物醫學研究所）。HA-GFP/pLKO_as3w.puro 已描述於文獻(Yu, C.Y et. al.,
PLoS Pathog. 2012, 8, e1002780.)。經密碼子優化基因合成的 SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (QHD43416.1) 的野生型 S 蛋白來自劉士任博士（國家衛生研究院）。SARS-CoV-2 S蛋白的 cDNA以引子5'-CGGGGTACCACCATGTTCGTGTTTCTGGTCCTG-3' 及 5'-ATGATGACCGGTTCAGGCGTAATCGGGGAC-3'藉由PCR擴增，並選殖到帶有C端HA標記的pcDNA3.1載體(SARS-CoV-2 S-HA/pcDNA3.1)。
製備流程如下：在添加或不添加RVKR-cmk (ALX-260-022-M005, Enzo Life Sciences)的情況下，以 Lipofectamine 2000 (11668 500, Invitrogen)、包裝質體pCMVΔR8.91（0.9 微克）、報導質體 pLKOAS3W-hyg+FLuc（1微克），及編碼前述結構蛋白的質體（0.1微克）共轉染 293T/17 細胞。在轉染後 24、36 及 48 小時後可透過低速離心去除細胞碎片，於上清液中收集病毒顆粒，接著在 4°C 下用低蛋白質結合的 0.45μm 孔徑過濾器 (SLHPR33RS, Merck Millipore) 過濾。仿真病毒顆粒的定量可使用靶向WPRE的引子 (5'-TGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAAC-3' 及 5'-GGAAAGGAGCTGACAGGTGGTG3')藉由RT-qPCR測量病毒基因組RNA濃度。含有 WPRE 序列的質體 pLKOAS3W-hyg+FLuc 用於在 qPCR 測定中建立 10 倍序列稀釋標準曲線。
病毒顆粒蛋白的分析顯示（圖3），在S-alone病毒顆粒中可檢測到對應於全長 S 蛋白的條帶（黑色箭頭處），並且在弗林蛋白酶抑制劑RVKR 存在下，可增加此蛋白的含量。出乎意料的是，在SEM 病毒顆粒中的全長 S 蛋白含量顯著增加，並且除了被弗林蛋白酶切割的 S蛋白（白色箭頭處）之外，還含有一個較小尺寸的條帶（灰色箭頭），它最有可能是 S 蛋白之已激活(priming)的S2'片段產物。穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)的影像顯示，在 SEM 的病毒顆粒表面上可以看到冠狀尖峰，但在 S-alone病毒顆粒表面上則無（圖4）。
實施例3 hACE2細胞的製備
人類血管收縮素轉化酶2 (human angiotensin-converting enzyme II, hACE2)為使用引子5'-CGGGGTACCACCATGTTCGTGTTTCTGGTCCTG-3' 及 5'-ATGATGACCGGTTCAGGCGTAATCGGGGAC-3'藉由PCR從人類 293T/17 細胞 cDNA 中擴增取得。在含有 5% 胎牛血清 (FBS) 的 RPMI 培養基(SH30027.01, HyClone, Logan, UT, USA) 中培養BHK-21 幼齡倉鼠腎細胞。以含有 hACE2 的慢病毒載體穩定轉導 BHK-21 細胞，並用 100 μM 的blasticidin (#antbl,InvivoGen,San Diego,CA,USA）篩選以獲得 BHK-hACE2 細胞。293T/17 人類胚胎腎細胞在含有 10% FBS 的 DMEM 培養基(SH30022.02, HyClone) 中培養。
細胞在室溫下以 4% 多聚甲醛在磷酸鹽緩衝鹽水（PBS;BF203-5L,Protech Technology,Taipei,Taiwan）中固定 30 分鐘。先以脫脂牛奶阻斷細胞表面非特異性結合，再用抗 hACE2 (1:1000) 抗體及 Alexa Fluor 488 偶聯的抗兔抗體 (1:1000; A11008, Invitrogen, Rockford, IL, USA) 進行表面染色。DAPI 的核複染劑(0.25 ng/mL;D1306,Thermo Fisher Scientific,Eugene,OR,USA)於攝影前使用螢光顯微鏡(Olympus IX73) 進行。
圖5A、5B顯示，hACE2 可穩定地表達在倉鼠細胞株 BHK-hACE2 中。在圖6中，VSV-G 蛋白包被的病毒顆粒作為對照，可同時感染了表達及未表達 hACE2 的 BHK-21 細胞，然而S-alone病毒顆粒不會感染 BHK-21 細胞，但能夠以劑量依賴性方式感染 BHK-hACE2 細胞。
實施例4 仿真病毒顆粒的感染性
將BHK-hACE2 細胞與仿真病毒顆粒在 4°C 下培養 3 小時，接著用冰冷的 PBS 沖洗2次以洗去未結合的仿真病毒顆粒。使用 RNeasy Mini Kit (74106, Qiagen, Hilden, Germany)提取與細胞結合的仿真病毒顆粒的基因組 RNA，再以 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (4368814, Applied Biosystems) 將 1 微克總 RNA 用於逆轉錄為 cDNA。RT-qPCR 用特定的引物組測量病毒基因組和細胞肌動蛋白的 RNA（5'-CGACGCAGGTGTCGCAGG-3' 及 5'-GGCGATCTTTCCGCCCTT-3' 用於病毒顆粒中的報告基因；5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3' 及 5'-GCCGCACCATTGGTCTTCTC-3' 用於細胞肌動蛋白）。2X SYBR Green MASTER Mix (4385612, Applied Biosystems) 用於 qPCR 分析。透過以細胞肌動蛋白的m RNA數作為校正基準，計算相對結合活性。
另一方面，BHK-hACE2 細胞在感染含有FLuc報導基因的仿真病毒後48小時後，以具有 GLOMAX Multi+ 微孔板多模式讀取器 (Promega) 的冷光素酶檢測系統 (E1501, Promega, Madison, WI, USA) 來檢測冷光素酶活性。
又一方面，BHK-hACE2 細胞在感染含有 GFP 報導基因的仿真病毒後 72 小時後以 PBS-EDTA 分離。洗滌細胞並重懸於含 0.1% NaN
3及 2% FBS 的 PBS 中。通過 BD FACSCalibur 和 FlowJo VX 軟體揭示和分析表達 GFP 的細胞。
以上實驗的結果顯示，儘管 S-alone與SEM 病毒粒子在效價上等效（圖7a），但病毒RNA計量顯示 SEM 比 S-alone仿真病毒顆粒與 BHK-hACE2 細胞的結合力更強（圖7b），冷光素酶活性測定也顯示SEM 比 S- alone病毒顆粒對BHK-hACE2 細胞的感染力更強（圖7c）。藉由含有 GFP 的 S-alone或 SEM病毒顆粒感染 BHK-hACE2 細胞也顯示，SEM 病毒顯著感染了更多的細胞（21.3% 對 2.86%；圖7d、7e）。
本發明所產出之SEM仿真病毒具備冠狀病毒之S、E、M外殼結構蛋白，其結構組成貼近真實病毒，且操作上與真實病毒相比具備相對安全性。其應用範圍至少可涉及：評估疫苗候選者產生抗體之效力、治療型抗體對於病毒效價中和效果測試、研究冠狀病毒進入宿主細胞之機制、藥物抗冠狀病毒感染之效果、作用及機制。
根據以上演示，本領域具通常知識者可輕易的了解本發明的必要特徵，並在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，對本發明進行各種的改變與修改，以適用於各式的用途與情況，因此，其他的實施例也應落入本發明的專利範圍中。
無
圖1 以S-alone或 E-2A-M 轉染 BHK-21 细胞，並使用恢復期的人類血漿藉由西方墨點法 (WB) 分析細胞裂解物。黑色箭頭，S蛋白單體；灰色三角形，S蛋白寡聚體；白色三角形，M蛋白。
圖2 仿真病毒顆粒製備的示意圖。將 SARS-CoV-2 S 蛋白的質體加上慢病毒包裝質體及報導質體（FLuc，螢火蟲冷光素酶；GFP，綠色螢光蛋白）轉染到帶有或不帶有 E-2A-M 構建體的 293T/17 細胞中。
圖3 使用抗HA抗體以WB分析存在 (+) 或不存在 (-) 抑制劑下所製備的仿真病毒顆粒。SARS-CoV-2 S 蛋白帶有 C 端 HA 標記； RVKR，弗林蛋白酶抑制劑(10 μM)；黑色箭頭，全長 S蛋白；白色箭頭，弗林蛋白酶裂解之 S蛋白；灰色箭頭，已激活(priming)的 S2'片段。
圖4 單獨包覆S (S) 或包覆S、E及M (SEM) 的仿真病毒顆粒的穿透式電子顯微鏡分析。
圖5 穩定表現 hACE2 的 BHK-21 細胞膜在沒有被透化的情況下被固定，然後以(a)免疫螢光測定進行分析，及(b)用指定的抗體進行WB分析。
圖6 以 VSV G 或 SARS-CoV-2 S蛋白包裹並攜帶 FLuc 報導基因的仿真病毒感染表現 hACE2 的 BHK-21 細胞或其原始細胞。
圖7 SARS-CoV-2 E 和 M 蛋白提高了仿真病毒顆粒的感染性：(a) 以靶向病毒體RNA 基因數的 qRT-PCR 測量 S-alone 及 SEM 仿真病毒效價。 (b)BHK-hACE2 細胞與 S-alone 或 SEM 仿真病毒在 4°C 下培養 3 小時，然後洗滌。藉由分析與細胞表面結合的病毒顆粒的RNA基因數，估計病毒結合活性。(c) BHK-hACE2 細胞被含有 FLuc 報導基因的 S-alone或SEM 仿真病毒感染後48小時，測量其冷光素酶活性。 (d, e)BHK-hACE2 細胞被含有 GFP 報導基因的 S-alone (d) 或 SEM (e) 仿真病毒感染，藉由螢光顯微鏡（上圖）及流式細胞儀（下圖）揭示感染的細胞。
無
SEQUENCE LISTING
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Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr Tyr Pro Tyr Asp Val
1265 1270 1275
Pro Asp Tyr Ala
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atgttcgtgt ttctggtcct gctgcctctg gtctcctctc agtgcgtgaa tctgacaacc 60
cgaactcagc tgccacccgc ctatactaat tccttcaccc ggggcgtgta ctatcctgac 120
aaggtgttta gaagctccgt gctgcactct acacaggatc tgtttctgcc attctttagc 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca atggcacaaa gcggttcgac 240
aatcccgtgc tgccttttaa cgatggcgtg tacttcgcct ctaccgagaa gagcaacatc 300
atcagaggct ggatctttgg caccacactg gactccaaga cacagtctct gctgatcgtg 360
aacaatgcca ccaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttttgtaa tgatcccttc 420
ctgggcgtgt actatcacaa gaacaataag agctggatgg agtccgagtt tagagtgtat 480
tctagcgcca acaattgcac atttgagtac gtgtcccagc ctttcctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg gcaatttcaa gaacctgagg gagttcgtgt ttaagaatat cgatggctac 600
ttcaagatct actctaagca cacccccatc aacctggtgc gcgacctgcc tcagggcttc 660
agcgccctgg agccactggt ggatctgcct atcggcatca acatcacccg gtttcagaca 720
ctgctggccc tgcacagaag ctacctgaca cccggcgact cctctagcgg atggaccgca 780
ggagctgccg cctactatgt gggctatctg cagcctagga ccttcctgct gaagtacaac 840
gagaatggca ccatcacaga cgccgtggat tgcgccctgg atcctctgag cgagacaaag 900
tgtacactga agtcctttac cgtggagaag ggcatctatc agacatccaa tttcagggtg 960
cagccaaccg agtctatcgt gcgctttcct aatatcacaa acctgtgccc atttggcgag 1020
gtgttcaacg caaccaggtt cgccagcgtg tacgcatgga ataggaagcg catctctaac 1080
tgcgtggccg actatagcgt gctgtacaac tccgcctctt tcagcacctt taagtgctat 1140
ggcgtgtccc ccacaaagct gaatgacctg tgctttacca acgtgtacgc cgattctttc 1200
gtgatcaggg gcgacgaggt gcgccagatc gcacctggac agacaggcaa gatcgccgac 1260
tacaattata agctgccaga cgatttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaat 1320
ctggattcca aagtgggcgg caactacaat tatctgtacc ggctgtttag aaagagcaat 1380
ctgaagccct tcgagaggga catctctaca gagatctacc aggccggcag caccccttgc 1440
aatggcgtgg agggctttaa ctgttatttc ccactgcagt cctacggctt ccagcccaca 1500
aacggcgtgg gctatcagcc ttaccgcgtg gtggtgctga gctttgagct gctgcacgca 1560
ccagcaacag tgtgcggacc caagaagtcc accaatctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctgac cggaacaggc gtgctgaccg agtccaacaa gaagttcctg 1680
ccatttcagc agttcggcag ggacatcgca gataccacag acgccgtgcg cgacccacag 1740
accctggaga tcctggatat cacaccctgc tctttcggcg gcgtgagcgt gatcacacca 1800
ggaaccaata caagcaacca ggtggccgtg ctgtatcagg acgtgaattg taccgaggtg 1860
cctgtggcca tccacgccga tcagctgacc ccaacatggc gggtgtacag caccggctcc 1920
aacgtgttcc agacaagagc aggatgcctg atcggagcag agcacgtgaa caattcctat 1980
gagtgcgaca tcccaatcgg cgccggcatc tgtgcctctt accagaccca gacaaactct 2040
ccaaggagag cacggagcgt ggcctcccag tctatcatcg cctataccat gtccctgggc 2100
gccgagaatt ctgtggccta ctctaacaat agcatcgcca tcccaaccaa cttcacaatc 2160
tctgtgacca cagagatcct gcccgtgtcc atgaccaaga catctgtgga ctgcacaatg 2220
tatatctgtg gcgattctac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg cagcttttgt 2280
acccagctga atagagccct gacaggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacacaggag 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag acccccccta tcaaggactt tggcggcttc 2400
aacttcagcc agatcctgcc tgatccatcc aagccctcta agcggagctt tatcgaggac 2460
ctgctgttca acaaggtgac cctggccgat gccggcttca tcaagcagta tggcgattgc 2520
ctgggcgaca tcgcagcacg ggacctgatc tgtgcccaga agtttaatgg cctgaccgtg 2580
ctgccacccc tgctgacaga tgagatgatc gcacagtaca caagcgccct gctggccgga 2640
accatcacat ccggatggac cttcggcgca ggagccgccc tgcagatccc ttttgccatg 2700
cagatggcct ataggttcaa cggcatcggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaatcagtt taactccgcc atcggcaaga tccaggacag cctgtcctct 2820
acagcctccg ccctgggcaa gctgcaggat gtggtgaatc agaacgccca ggccctgaat 2880
accctggtga agcagctgag ctccaacttc ggcgccatct ctagcgtgct gaatgatatc 2940
ctgagcaggc tggacaaggt ggaggcagag gtgcagatcg accggctgat cacaggcaga 3000
ctgcagtctc tgcagaccta tgtgacacag cagctgatca gggcagcaga gatcagggcc 3060
agcgccaatc tggcagcaac caagatgtcc gagtgcgtgc tgggccagtc taagagagtg 3120
gacttttgtg gcaagggcta tcacctgatg tccttccctc agtctgcccc acacggcgtg 3180
gtgtttctgc acgtgaccta cgtgcccgcc caggagaaga acttcaccac agcccctgcc 3240
atctgccacg atggcaaggc ccactttcca agggagggcg tgttcgtgtc caacggcacc 3300
cactggtttg tgacacagcg caatttctac gagccccaga tcatcaccac agacaataca 3360
ttcgtgtctg gcaactgtga cgtggtcatc ggcatcgtga acaataccgt gtatgatcca 3420
ctgcagcccg agctggacag ctttaaggag gagctggata agtacttcaa gaatcacacc 3480
tcccccgacg tggatctggg cgacatcagc ggcatcaatg cctccgtggt gaacatccag 3540
aaggagatcg accgcctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagtccct gatcgatctg 3600
caggagctgg gcaagtatga gcagtacatc aagtggcctt ggtacatctg gctgggcttc 3660
atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgtat gacatcctgc 3720
tgttcttgcc tgaagggctg ctgtagctgt ggctcctgct gtaagtttga tgaggacgat 3780
agcgagccag tgctgaaagg agtcaaactg cattacacct acccctatga tgtccccgat 3840
tacgcc 3846
<![CDATA[<210> 3]]>
<![CDATA[<211> 75]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> Homo sapiens]]>
<![CDATA[<400> 3]]>
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
1 5 10 15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
20 25 30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
35 40 45
Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
50 55 60
Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val
65 70 75
<![CDATA[<210> 4]]>
<![CDATA[<211> 225]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> Homo sapiens]]>
<![CDATA[<400> 4]]>
atgtacagct tcgtgtccga ggagaccggc acactgatcg tgaacagcgt gctgctgttc 60
ctggcctttg tggtgttcct gctggtgaca ctggcaatcc tgaccgccct gaggctgtgc 120
gcctattgct gtaacatcgt gaatgtgagc ctggtgaagc catccttcta cgtgtattct 180
cgggtgaaga acctgaatag ctccagagtg ccagacctgc tggtg 225
<![CDATA[<210> 5]]>
<![CDATA[<211> 222]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> Homo sapiens]]>
<![CDATA[<400> 5]]>
Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile
20 25 30
Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile
35 40 45
Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys
50 55 60
Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile
65 70 75 80
Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe
85 90 95
Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe
100 105 110
Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile
115 120 125
Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile
130 135 140
Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp
145 150 155 160
Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu
165 170 175
Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly
180 185 190
Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr
195 200 205
Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
210 215 220
<![CDATA[<210> 6]]>
<![CDATA[<211> 666]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> Homo sapiens]]>
<![CDATA[<400> 6]]>
atggccgata gcaacggcac catcacagtg gaggagctga agaagctgct ggagcagtgg 60
aacctggtca tcggcttcct gtttctgacc tggatctgtc tgctgcagtt tgcctacgcc 120
aaccggaata gattcctgta tatcatcaag ctgatctttc tgtggctgct gtggccagtg 180
acactggcct gcttcgtgct ggccgccgtg tacaggatca attggatcac cggaggaatc 240
gcaatcgcaa tggcatgtct ggtgggcctg atgtggctga gctatttcat cgcctccttt 300
cgcctgttcg ccaggacacg ctctatgtgg agctttaacc cagagaccaa tatcctgctg 360
aacgtgccac tgcacggaac catcctgaca aggcctctgc tggagagcga gctggtcatc 420
ggagccgtga tcctgagggg acacctgagg atcgcaggac accacctggg cagatgcgac 480
atcaaggatc tgcccaagga gatcaccgtg gccacatcca ggaccctgtc ttactataag 540
ctgggagcat cccagagggt ggcaggcgat tccggatttg cagcctactc tcggtataga 600
atcggcaatt acaagctgaa caccgaccac tctagctcct ctgataacat cgccctgctg 660
gtgcag 666
<![CDATA[<210> 7]]>
<![CDATA[<211> 22]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人造序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 2A]]>
<![CDATA[<400> 7]]>
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<![CDATA[<210> 8]]>
<![CDATA[<211> 66]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人造序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 2A]]>
<![CDATA[<400> 8]]>
ggatctggag caacaaactt cagcctgctg aagcaggcag gcgacgtgga ggagaatcct 60
ggaccc 66
<![CDATA[<210> 9]]>
<![CDATA[<211> 323]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人造序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> E-2A-M]]>
<![CDATA[<400> 9]]>
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
1 5 10 15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
20 25 30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
35 40 45
Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
50 55 60
Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val His Val Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gly Pro Pro Arg Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu
100 105 110
Glu Leu Lys Lys Leu Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu
115 120 125
Phe Leu Thr Trp Ile Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn
130 135 140
Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro
145 150 155 160
Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp
165 170 175
Ile Thr Gly Gly Ile Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met
180 185 190
Trp Leu Ser Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg
195 200 205
Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro
210 215 220
Leu His Gly Thr Ile Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val
225 230 235 240
Ile Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His
245 250 255
Leu Gly Arg Cys Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala
260 265 270
Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val
275 280 285
Ala Gly Asp Ser Gly Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn
290 295 300
Tyr Lys Leu Asn Thr Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu
305 310 315 320
Leu Val Gln
<![CDATA[<210> 10]]>
<![CDATA[<211> 969]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人造序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> E-2A-M]]>
<![CDATA[<400> 10]]>
atgtacagct tcgtgtccga ggagaccggc acactgatcg tgaacagcgt gctgctgttc 60
ctggcctttg tggtgttcct gctggtgaca ctggcaatcc tgaccgccct gaggctgtgc 120
gcctattgct gtaacatcgt gaatgtgagc ctggtgaagc catccttcta cgtgtattct 180
cgggtgaaga acctgaatag ctccagagtg ccagacctgc tggtgcacgt gggatctgga 240
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tggaacctgg tcatcggctt cctgtttctg acctggatct gtctgctgca gtttgcctac 420
gccaaccgga atagattcct gtatatcatc aagctgatct ttctgtggct gctgtggcca 480
gtgacactgg cctgcttcgt gctggccgcc gtgtacagga tcaattggat caccggagga 540
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tttcgcctgt tcgccaggac acgctctatg tggagcttta acccagagac caatatcctg 660
ctgaacgtgc cactgcacgg aaccatcctg acaaggcctc tgctggagag cgagctggtc 720
atcggagccg tgatcctgag gggacacctg aggatcgcag gacaccacct gggcagatgc 780
gacatcaagg atctgcccaa ggagatcacc gtggccacat ccaggaccct gtcttactat 840
aagctgggag catcccagag ggtggcaggc gattccggat ttgcagccta ctctcggtat 900
agaatcggca attacaagct gaacaccgac cactctagct cctctgataa catcgccctg 960
ctggtgcag 969
Claims (17)
- 一種質體 (plasmid)，其編碼包含： (1) 一冠狀病毒之E蛋白 (envelope protein)；及 (2) 一冠狀病毒之M蛋白 (membrane protein)。
- 如請求項1之質體，其編碼進一步包含一連接肽，位於該E蛋白及該M蛋白之間。
- 如請求項2之質體，其中該連接肽為微小核糖核酸病毒 (Picornavirus)之2A肽。
- 如請求項3之質體，其編碼包含如序列編號9所示之序列。
- 一種生產仿真病毒顆粒之細胞，其特徵在於該細胞引入以下質體： (1) 如請求項1之質體； (2) 一S質體，其編碼包含一冠狀病毒之 S 蛋白 (spike protein)；及 (3) 一包裝 (packaging)質體。
- 如請求項5之細胞，其進一步包含：一報導質體，其編碼包含一報導基因。
- 如請求項5之細胞，其中該報導基因選自 Fluc、 gfp、 yfp及 rfp。
- 如請求項5之細胞，其中該冠狀病毒選自 SARS-CoV 病毒、SARS-CoV-2 病毒及 MERS-CoV 病毒。
- 如請求項5之細胞，其中該包裝質體源自慢病毒 (Lentivirus)、水泡性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus)。
- 如請求項5之細胞，該細胞為一動物細胞。
- 一種仿真病毒顆粒，係從如請求項5之細胞之培養物中生成或收集而得。
- 一種製備仿真病毒組成物之方法，包含： (1) 於培養如請求項5之細胞時降低其弗林蛋白酶 (furin protease) 活性；及 (2) 收集細胞培養物所產生之仿真病毒顆粒以得到該仿真病毒組成物。
- 如請求項12之方法，其中「降低其弗林蛋白酶活性」，選自：去除弗林蛋白酶、抑制弗林蛋白酶。
- 如請求項12之方法，其中「降低其弗林蛋白酶活性」為加入一弗林蛋白酶抑制劑。
- 如請求項14之方法，其中該弗林蛋白酶抑制劑包含一RVKR多肽。
- 如請求項14之方法，其進一步包含：降低該仿真病毒組成物之弗林蛋白酶抑制劑之活性。
- 如請求項16之方法，其中降低該仿真病毒組成物之弗林蛋白酶抑制劑之活性，包含：自該仿真病毒組成物中除去該弗林蛋白酶抑制劑。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163161105P | 2021-03-15 | 2021-03-15 | |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=85793731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW111109437A TW202246509A (zh) | 2021-03-15 | 2022-03-15 | 仿真病毒及其製備方法 |
Country Status (1)
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-
2022
- 2022-03-15 TW TW111109437A patent/TW202246509A/zh unknown
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