TW202246484A - 細胞培養用微載體及細胞之培養方法 - Google Patents

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羽根田聡
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日商積水化學工業股份有限公司
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Abstract

本發明提供一種細胞培養用微載體，其能夠抑制細胞培養過程中之微載體之破損，且能夠提高細胞之培養效率。 本發明之細胞培養用微載體具備基材粒子、及被覆上述基材粒子之外表面之被覆層，且斷裂點強度為1000 mN以上。

Description

細胞培養用微載體及細胞之培養方法
本發明係關於一種細胞培養用微載體。又，本發明係關於一種使用上述細胞培養用微載體之細胞培養方法。
於學術領域、藥物開發領域及再生醫學領域等之研究開發中，一直使用人類、小鼠、大鼠、豬、牛及猴子等之動物細胞。作為細胞培養方法，已知有使用微載體之方法。
一直以來，廣泛使用基材粒子經細胞外基質(ECM)被覆而成之微載體作為上述微載體。例如於下述專利文獻1中記載有一種微載體，其具有聚苯乙烯粒子、及配置於該聚苯乙烯粒子之外表面之玻連蛋白。
又，亦已知有一種基材粒子經合成樹脂被覆而成之微載體。例如於下述專利文獻2中記載有一種微載體，其具備聚苯乙烯粒子、及配置於該聚苯乙烯粒子之外表面之合成樹脂層。上述合成樹脂層中包含鍵結有肽之合成樹脂。 [先前技術文獻]  [專利文獻]
[專利文獻1]WO2011/017167A1  [專利文獻2]WO2011/017050A1
[發明所欲解決之問題]
如專利文獻1、2中所記載之先前之微載體係使用聚苯乙烯粒子等交聯度較小之樹脂粒子作為基材粒子。因此，先前之微載體在細胞之培養過程中可能會發生微載體破損。例如，先前之微載體存在以下情況，即在細胞之培養時微載體彼此碰撞，或者在培養基之更換作業時對微載體施加衝擊，而導致微載體缺失或破裂。此種微載體之破損尤其容易發生於使用大量培養裝置以幾百升以上之規模來培養細胞之過程中。
於微載體破損之情形時，難以將微載體之碎片與細胞加以分離，因此，例如可能導致該碎片混入至細胞製劑中。
又，較佳為細胞之培養效率較高。
本發明之目的在於提供一種能夠抑制細胞培養過程中之微載體之破損，且能夠提高細胞之培養效率之細胞培養用微載體。又，本發明之目的還在於提供一種使用上述細胞培養用微載體之細胞之培養方法。  [解決問題之技術手段]
根據本發明之較廣態樣，提供一種細胞培養用微載體(以下，有時簡寫為微載體)，其具備基材粒子、及被覆上述基材粒子之外表面之被覆層，且上述細胞培養用微載體之斷裂點強度為1000 mN以上。
於本發明之微載體之一特定態樣中，進行壓縮試驗時所獲得之壓縮位移曲線於負載700 mN以下時不具有反曲點。
於本發明之微載體之一特定態樣中，吸水率為10重量%以下。
於本發明之微載體之一特定態樣中，上述被覆層包含合成樹脂。
於本發明之微載體之一特定態樣中，上述合成樹脂具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架。
於本發明之微載體之一特定態樣中，上述被覆層包含肽部。
於本發明之微載體之一特定態樣中，上述基材粒子為樹脂粒子。
於本發明之微載體之一特定態樣中，上述基材粒子包含具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物。
於本發明之微載體之一特定態樣中，上述具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物為丙烯酸系樹脂、二乙烯苯聚合物、或二乙烯苯共聚物。
於本發明之微載體之一特定態樣中，比重為1.0 g/cm 3以上2.0 g/cm 3以下。
於本發明之微載體之一特定態樣中，平均粒徑為100 μm以上1500 μm以下。
於本發明之微載體之一特定態樣中，粒徑之CV值為10%以下。
根據本發明之較廣態樣，提供一種細胞之培養方法，其包括使細胞黏著於上述細胞培養用微載體之步驟。  [發明之效果]
本發明之細胞培養用微載體具備基材粒子、及被覆上述基材粒子之外表面之被覆層，且斷裂點強度為1000 mN以上。本發明之細胞培養用微載體具備上述構成，因此能夠抑制細胞培養過程中之微載體之破損，能夠提高細胞之培養效率。
以下，對本發明之詳情進行說明。
(細胞培養用微載體)  本發明之細胞培養用微載體(以下，有時簡寫為「微載體」)具備基材粒子、及被覆上述基材粒子之外表面之被覆層，且斷裂點強度為1000 mN以上。
本發明之微載體具備上述構成，因此能夠抑制細胞培養過程中之微載體之破損，能夠提高細胞之培養效率。
先前之微載體之強度相對較小。因此，先前之微載體存在下述情況，即在細胞之培養時微載體彼此碰撞，或者在培養基之更換作業時對微載體施加衝擊，而導致微載體缺失或破裂。此種微載體之破損尤其容易發生於使用大量培養裝置來培養細胞之過程中，因此難以將先前之微載體用於幾百升規模之細胞培養中。
相對於此，本發明之微載體之強度相對較大。因此，本發明之微載體即便在細胞之培養時微載體彼此碰撞，或者在培養基之更換作業時對微載體施加衝擊，亦不易導致微載體缺失或破裂。因此，本發明之微載體例如可將微載體碎片混入至細胞製劑中之風險抑制得較低。
又，本發明之微載體能夠提高細胞之培養效率。
本發明之微載體可適宜地用於幾十毫升規模之細胞培養至幾百升規模以上之細胞培養。
又，本發明之微載體無需使用細胞外基質(ECM)等天然高分子材料作為材料，因此價格低廉，批次間之不均較小，安全性優異。
就抑制細胞培養過程中之微載體之破損之觀點而言，上述微載體之斷裂點強度為1000 mN以上。即，上述微載體於未達1000 mN時不具有斷裂點強度。
上述微載體之斷裂點強度較佳為1100 mN以上，更佳為1200 mN以上，進而較佳為1500 mN以上。若上述斷裂點強度為上述下限以上，則可進一步有效地抑制細胞培養過程中之微載體之破損。再者，上述微載體之斷裂點強度之上限並無特別限定。上述微載體之斷裂點強度可為10000 mN以下。
上述微載體之斷裂點強度係對微載體進行壓縮時之斷裂點強度。上述微載體之斷裂點強度係進行下述壓縮試驗時之斷裂點強度。上述微載體之斷裂點強度可如下進行測定。
使用微小強度評價試驗裝置，利用圓柱(直徑500 μm，金剛石製)之平滑壓頭端面，在以下條件下進行微載體之壓縮試驗：於25℃下以0.3 N/秒施加最大試驗負載2000 mN。將微載體斷裂時之負載作為微載體之斷裂點強度。作為上述微小強度評價試驗裝置，例如使用島津製作所公司製造之「Micro Autograph MST-I」等。
上述微載體之斷裂點強度例如可藉由以下方式而變大，即，使用交聯度較大之樹脂作為基材粒子之材料，或者使用包含填料之基材粒子，或者使用具有柔軟之分子結構之樹脂作為基材粒子之材料。
上述微載體較佳為進行壓縮試驗時所獲得之壓縮位移曲線於負載700 mN以下時不具有反曲點。於該情形時，可進一步有效地抑制細胞培養過程中之微載體之破損。
再者，用以獲得上述壓縮位移曲線之上述壓縮試驗之條件與用以求出上述斷裂點強度之上述壓縮試驗之條件相同。上述壓縮位移曲線可藉由以下方式而獲得。
於上述微載體之壓縮試驗中，測定負載值(mN)及壓縮位移(μm)，製成表示壓縮位移(x軸)與負載值(y軸)之關係之壓縮位移曲線。將所獲得之壓縮位移曲線之切線之斜率從增加轉為減少之點作為反曲點。確認所獲得之壓縮位移曲線於負載700 mN以下是否具有反曲點。
再者，於對微載體進行壓縮時，壓縮位移曲線之切線之斜率呈增加趨勢，但當微載體產生裂痕時，壓縮位移曲線之切線之斜率呈轉為減少之趨勢。因此，在所獲得之壓縮位移曲線於負載700 mN以下時不具有反曲點之情形時，可進一步有效地抑制由微載體產生之碎片之混入。
上述微載體之吸水率較佳為10重量%以下，更佳為5重量%以下，進而較佳為1重量%以下。若上述吸水率為上述上限以下，則在細胞之黏著時，微載體之表面之狀態不易發生變化，因此可使細胞接種後之初始固著率之不均變小。又，若上述吸水率為上述上限以下，則在培養基中細胞不易自微載體剝離。再者，上述微載體之吸水率之下限並無特別限定。上述微載體之吸水率可為0重量%以上，亦可為0.001重量%以上。
上述微載體之吸水率可藉由以下方式進行測定。
準備已在100℃之烘箱內乾燥了8小時之微載體。將該微載體100.0 mg在溫度37℃及相對濕度95%RH之環境下放置24小時。測定放置後之微載體之重量。根據下述式算出微載體之吸水率。
吸水率(重量%)＝(W 2－W 1)/W 1×100 W 1：放置前之微載體之重量(mg) W 2：放置後之微載體之重量(mg)
作為使上述微載體之吸水率變小之方法，例如可例舉使用疏水性較大之材料來製作被覆層。
上述微載體之比重較佳為1.0 g/cm 3以上，更佳為1.05 g/cm 3以上，進而較佳為1.1 g/cm 3以上，並且，較佳為2.0 g/cm 3以下，更佳為1.5 g/cm 3以下，進而較佳為1.3 g/cm 3以下。若上述比重為上述下限以上，則可使微載體適宜地沈降，可提高回收效率。若上述比重為上述上限以下，則可提高基於攪拌葉之迴旋性。
上述微載體之比重係使用真比重計而測定。
上述微載體之平均粒徑較佳為100 μm以上，更佳為150 μm以上，進一步較佳為200 μm以上，進而較佳為250 μm以上，尤佳為300 μm以上，並且，較佳為1500 μm以下，更佳為1000 μm以下，進一步較佳為800 μm以下，進而較佳為700 μm以下，尤佳為500 μm以下。上述微載體之平均粒徑較佳為100 μm以上1500 μm以下，更佳為150 μm以上1000 μm以下，進一步較佳為200 μm以上800 μm以下，進而較佳為250 μm以上700 μm以下，尤佳為300 μm以上500 μm以下。若上述平均粒徑為上述下限以上，則可進一步提高細胞之培養效率。若上述平均粒徑為上述上限以下，則可於各微載體之表面上以更均勻之厚度形成細胞塊。又，若上述平均粒徑為上述上限以下，則可進一步增大可供細胞黏著之面積。先前之微載體之平均粒徑越大，越容易於細胞培養過程中發生微載體之破損，但本發明之微載體即便平均粒徑相對較大，亦可抑制細胞培養過程中之微載體之破損。
於上述微載體為真球狀之情形時，上述微載體之粒徑意指直徑，於上述微載體為真球狀以外之形狀之情形時，則意指將其假定為其當量體積真球時之直徑。
上述微載體之平均粒徑較佳為數量平均粒徑。上述微載體之平均粒徑係利用電子顯微鏡或光學顯微鏡來觀察任意50個微載體，算出各微載體之粒徑之平均值；或使用粒度分佈測定裝置而求出。於利用電子顯微鏡或光學顯微鏡進行觀察時，每個微載體之粒徑係作為以當量圓直徑計之粒徑而求出。於利用電子顯微鏡或光學顯微鏡進行觀察時，任意50個微載體之以當量圓直徑計之平均粒徑與以當量球直徑計之平均粒徑大致相等。於粒度分佈測定裝置中，每個微載體之粒徑係作為以當量球直徑計之粒徑而求出。上述微載體之平均粒徑較佳為使用粒度分佈測定裝置而算出。
上述微載體之粒徑之變異係數(CV值)較佳為10%以下，更佳為8%以下，進而較佳為5%以下，尤佳為3%以下。若上述變異係數(CV值)為上述上限以下，則可提高沈降速度之均勻性，可進一步提高細胞之培養效率。再者，上述微載體之粒徑之變異係數(CV值)可為0%以上，亦可為0.1%以上，亦可為0.5%以上，亦可為1%以上。上述微載體之粒徑之變異係數(CV值)可為0%以上10%以下，亦可為0.1%以上8%以下，亦可為0.1%以上5%以下，亦可為1%以上3%以下。
上述微載體之粒徑之變異係數(CV值)係藉由以下方式而算出。
CV值(%)＝(ρ/Dn)×100 ρ：微載體之粒徑之標準偏差 Dn：微載體之平均粒徑
作為使上述微載體之粒徑之變異係數(CV值)變小之方法，可例舉進行乾式分級之方法、及進行濕式分級之方法等。
上述微載體之形狀並無特別限定。上述微載體之形狀可為球狀，亦可為球狀以外之形狀，亦可為扁平狀等形狀。再者，球狀並不限定於真球狀，亦包含大致球狀，例如亦包含長徑比(長徑/短徑)為1.5以下之形狀。
以下，參照圖式對本發明進行具體說明。
圖1係模式性地表示本發明之一實施方式之細胞培養用微載體的剖視圖。
圖1所示之細胞培養用微載體1具備基材粒子2、及被覆基材粒子2之外表面之被覆層3。被覆層3配置於基材粒子2之表面上，且與基材粒子2之表面相接。被覆層3被覆基材粒子2之整個外表面。微載體1之斷裂點強度為1000 mN以上。
以下，對微載體之其他詳情進行說明。
再者，於本說明書中，「(甲基)丙烯酸酯」意指「丙烯酸酯」與「甲基丙烯酸酯」之一者或兩者，「(甲基)丙烯酸」意指「丙烯酸」與「甲基丙烯酸」之一者或兩者。
(基材粒子)  關於上述基材粒子之材料，只要微載體之斷裂點強度為1000 mN以上，該材料便無特別限定。上述基材粒子之材料可為有機材料，亦可為無機材料，亦可為有機材料與無機材料兩者。上述基材粒子可包含樹脂，亦可包含無機填料，亦可包含樹脂及無機填料，亦可不包含樹脂。上述基材粒子可為樹脂粒子，亦可為無機粒子。上述基材粒子較佳為包含樹脂。就進一步抑制細胞培養過程中之微載體之破損之觀點而言，上述基材粒子較佳為樹脂粒子。上述基材粒子之材料可僅使用一種，亦可併用兩種以上。上述樹脂可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
作為上述樹脂，可例舉：聚烯烴樹脂、丙烯酸系樹脂、聚碳酸酯、聚醯胺、酚甲醛樹脂、三聚氰胺甲醛樹脂、苯并胍胺甲醛樹脂、尿素甲醛樹脂、酚系樹脂、三聚氰胺樹脂、苯并胍胺樹脂、尿素樹脂、環氧樹脂、不飽和聚酯樹脂、飽和聚酯樹脂、聚對苯二甲酸乙二酯、聚碸、聚苯醚、聚縮醛、聚醯亞胺、聚醯胺醯亞胺、聚醚醚酮、聚醚碸、二乙烯苯聚合物、以及二乙烯苯共聚物等。
於上述基材粒子為樹脂粒子之情形時，在所存在之各種樹脂中，適宜使用能夠將微載體之斷裂點強度控制於1000 mN以上之樹脂。
上述樹脂較佳為具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物。上述基材粒子較佳為包含具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物。於該情形時，可良好地調整基材粒子之比重及強度，其結果為，可將微載體之比重調整至適宜之範圍內，又，可使微載體之斷裂點強度變大。
上述具有乙烯性不飽和基之單體較佳為具有2個該乙烯性不飽和基。上述基材粒子較佳為包含具有2個乙烯性不飽和基之單體之聚合物。於該情形時，可進一步良好地調整基材粒子之比重及強度，其結果為，可將微載體之比重調整至適宜之範圍內，又，可使微載體之斷裂點強度變大。
作為上述具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物，例如可例舉：丙烯酸系樹脂、二乙烯苯聚合物、及二乙烯苯共聚物等。上述具有乙烯性不飽和基之單體可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
上述具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物較佳為丙烯酸系樹脂、二乙烯苯聚合物、或二乙烯苯共聚物。於該情形時，可良好地調整基材粒子之比重及強度，其結果為，可將微載體之比重調整至適宜之範圍內，又，可使微載體之斷裂點強度變大。
於上述基材粒子包含上述具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物之情形時，上述具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物較佳為具有交聯結構。於該情形時，可良好地調整基材粒子之比重及強度，其結果為，可將微載體之比重調整至適宜之範圍內，又，可使微載體之斷裂點強度變大。
作為形成上述交聯結構之方法，例如可例舉以下方法。(1)使包含具有2個以上乙烯性不飽和基之單體之聚合性成分聚合之方法。(2)使具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物與交聯劑反應而形成交聯結構之方法。
於上述(1)之方法中，作為上述具有2個以上乙烯性不飽和基之單體，例如可例舉：二乙烯苯、多官能(甲基)丙烯酸酯、(異)氰尿酸三烯丙酯、偏苯三酸三烯丙酯、鄰苯二甲酸二烯丙酯、及二烯丙基丙烯醯胺等。上述具有2個以上乙烯性不飽和基之單體可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
又，於上述(1)之方法中，上述聚合性成分亦可包含具有乙烯性不飽和基之其他單體。作為上述具有乙烯性不飽和基之其他單體，例如可例舉：苯乙烯、單官能(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸、丙烯腈、氯乙烯等。上述具有乙烯性不飽和基之其他單體可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
作為藉由上述(1)之方法而獲得之聚合物，例如可例舉：二乙烯苯與苯乙烯之共聚物、及多官能(甲基)丙烯酸酯與單官能(甲基)丙烯酸酯之共聚物等。
作為上述(2)之方法，例如可例舉下述方法：使包含分子內具有乙烯性不飽和基及含活性氫之官能基之單體的聚合性成分聚合而獲得聚合物，繼而，使用交聯劑使聚合物間交聯。
作為上述含活性氫之官能基，例如可例舉：羥基、羧基、胺基、及酚基等。作為分子內具有乙烯性不飽和基及含活性氫之官能基之單體，例如可例舉：含羥基之(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸、及含胺基之(甲基)丙烯酸酯等。上述分子內具有乙烯性不飽和基及含活性氫之官能基之單體可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
作為上述交聯劑，只要能夠與上述含活性氫之官能基進行反應，便無特別限定，例如可例舉：多官能異氰酸酯化合物、多官能環氧化合物等。上述交聯劑可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
再者，只要所獲得之微載體之斷裂點強度為1000 mN以上，形成上述交聯結構之方法便不限於該等方法。
上述基材粒子例如可藉由使上述具有乙烯性不飽和基之單體聚合而獲得。作為上述聚合方法，並無特別限定，可例舉：自由基聚合、離子聚合、縮聚(縮合聚合、聚縮合)、加成縮合、活性聚合、及活性自由基聚合等公知之方法。又，作為其他聚合方法，可例舉在自由基聚合起始劑之存在下進行之懸浮聚合。
上述基材粒子亦可包含無機填料。例如藉由將無機填料與比重較小之樹脂加以併用，可使基材粒子及微載體之比重適宜地變大。
作為上述無機填料，可例舉：碳黑、玻璃填料、及金屬填料。上述無機填料可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
於上述基材粒子100重量%中，上述樹脂之含量較佳為80重量%以上，更佳為90重量%以上，進一步較佳為95重量%以上，進而較佳為97重量%以上，進而更佳為99重量%以上，最佳為100重量%(總量)。再者，於上述基材粒子100重量%中，上述樹脂之含量可為100重量%以下，亦可未達100重量%。
於上述基材粒子100重量%中，上述具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物之含量較佳為80重量%以上，更佳為90重量%以上，進一步較佳為95重量%以上，進而較佳為97重量%以上，進而更佳為99重量%以上，最佳為100重量%(總量)。再者，於上述基材粒子100重量%中，上述具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物之含量可為100重量%以下，亦可未達100重量%。
於上述基材粒子為上述無機粒子之情形時，作為該無機粒子，可例舉：石墨粒子、玻璃粒子及金屬粒子等。
上述基材粒子之比重較佳為1.0 g/cm 3以上，更佳為1.05 g/cm 3以上，進而較佳為1.1 g/cm 3以上，並且，較佳為2.0 g/cm 3以下，更佳為1.5 g/cm 3以下，進一步較佳為1.3 g/cm 3以下，進而較佳為1.2 g/cm 3以下，尤佳為1.15 g/cm 3以下。若上述比重為上述下限以上及上述上限以下，則可將微載體之比重調整至適宜之範圍內。
上述基材粒子之比重係使用真比重計而測定。
上述基材粒子之平均粒徑較佳為100 μm以上，更佳為150 μm以上，進一步較佳為200 μm以上，進而較佳為250 μm以上，尤佳為300 μm以上，並且，較佳為1500 μm以下，更佳為1000 μm以下，進一步較佳為800 μm以下，進而較佳為700 μm以下，尤佳為500 μm以下。上述基材粒子之平均粒徑較佳為100 μm以上1500 μm以下，更佳為150 μm以上1000 μm以下，進一步較佳為200 μm以上800 μm以下，進而較佳為250 μm以上700 μm以下，尤佳為300 μm以上500 μm以下。若上述平均粒徑為上述下限以上，則可進一步提高細胞之培養效率。若上述平均粒徑為上述上限以下，則可於各微載體之表面上以更均勻之厚度形成細胞塊。又，若上述平均粒徑為上述上限以下，則可進一步增大可供細胞黏著之面積。
於上述基材粒子為真球狀之情形時，上述基材粒子之粒徑意指直徑，於上述基材粒子為真球狀以外之形狀之情形時，則意指將其假定為其當量體積真球時之直徑。
上述基材粒子之平均粒徑較佳為數量平均粒徑。上述基材粒子之平均粒徑係利用電子顯微鏡或光學顯微鏡來觀察任意50個基材粒子，算出各基材粒子之粒徑之平均值；或使用粒度分佈測定裝置而求出。於利用電子顯微鏡或光學顯微鏡進行觀察時，每個基材粒子之粒徑係作為以當量圓直徑計之粒徑而求出。於利用電子顯微鏡或光學顯微鏡進行觀察時，任意50個基材粒子之以當量圓直徑計之平均粒徑與以當量球直徑計之平均粒徑大致相等。於粒度分佈測定裝置中，每個基材粒子之粒徑係作為以當量球直徑計之粒徑而求出。上述基材粒子之平均粒徑較佳為使用粒度分佈測定裝置而算出。
(被覆層) 上述微載體具備基材粒子、及被覆基材粒子之外表面之被覆層。上述被覆層係由與上述基材粒子之成分不同之成分所構成之層。作為構成上述被覆層之成分，可例舉肽、合成樹脂等。上述被覆層較佳為包含合成樹脂。上述合成樹脂可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
就提高微載體與細胞之黏著性之觀點、及將微載體之膨潤度維持得較低之觀點而言，上述合成樹脂較佳為具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架。於該情形時，上述合成樹脂可具有聚乙烯醇衍生物骨架，亦可具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架，亦可具有聚乙烯醇衍生物骨架及聚(甲基)丙烯酸酯骨架。
就提高微載體與細胞之黏著性之觀點而言，上述被覆層較佳為包含肽部，更佳為包含具有肽部(肽骨架)之合成樹脂。即，就提高微載體與細胞之黏著性之觀點而言，上述合成樹脂更佳為具有肽部。再者，關於上述被覆層包含肽部之形態，不僅包括被覆層包含具有肽部之合成樹脂之形態，還包括被覆層僅包含肽之形態。就進一步提高微載體與細胞之黏著性之觀點而言，上述合成樹脂較佳為具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架、及肽部。
於本說明書中，有時將「具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架、及肽部之樹脂」記為「含肽樹脂」。上述含肽樹脂(peptide-conjugated resin，結合有肽之樹脂)可具有聚乙烯醇衍生物骨架及肽部，亦可具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架及肽部，亦可具有聚乙烯醇衍生物骨架及聚(甲基)丙烯酸酯骨架及肽部。
於上述具有聚乙烯醇衍生物骨架之含肽樹脂中，上述聚乙烯醇衍生物骨架與上述肽部較佳為經由連接部而鍵結在一起。因此，上述具有聚乙烯醇衍生物骨架之含肽樹脂較佳為具有聚乙烯醇衍生物骨架、肽部、及連接部。
於上述具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架之含肽樹脂中，上述聚(甲基)丙烯酸酯骨架與上述肽部可經由連接部而鍵結在一起，亦可不經由連接部而直接鍵結在一起。上述具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架之含肽樹脂可具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架、肽部、及連接部。
＜聚乙烯醇衍生物骨架＞ 上述聚乙烯醇衍生物骨架係源自聚乙烯醇衍生物之骨架部分。上述聚乙烯醇衍生物係由聚乙烯醇衍生而來之化合物。就進一步提高微載體與細胞之黏著性之觀點而言，上述聚乙烯醇衍生物較佳為聚乙烯醇縮醛樹脂，上述聚乙烯醇衍生物骨架較佳為聚乙烯醇縮醛骨架。即，上述合成樹脂較佳為具有聚乙烯醇縮醛骨架、及上述肽部。上述聚乙烯醇衍生物及上述聚乙烯醇縮醛樹脂分別可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
上述聚乙烯醇衍生物骨架及上述聚乙烯醇縮醛骨架較佳為於側鏈具有縮醛基、羥基、及乙醯基。但是，上述聚乙烯醇衍生物骨架及上述聚乙烯醇縮醛骨架例如亦可不具有乙醯基。例如，聚乙烯醇衍生物骨架及聚乙烯醇縮醛骨架之所有乙醯基與上述連接基鍵結，因此上述聚乙烯醇衍生物骨架及上述聚乙烯醇縮醛骨架可不具有乙醯基。
聚乙烯醇縮醛樹脂可藉由利用醛使聚乙烯醇進行縮醛化而合成。
用於使聚乙烯醇進行縮醛化之上述醛並無特別限定。作為上述醛，例如可例舉碳數為1～10之醛。上述醛可具有鏈狀脂肪族基、環狀脂肪族基或芳香族基，亦可不具有。上述醛可為鏈狀醛，亦可為環狀醛。上述醛可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
就進一步提高微載體與細胞之黏著性之觀點而言，上述醛較佳為甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、或戊醛，更佳為丁醛。因此，上述聚乙烯醇縮醛樹脂更佳為聚乙烯醇縮丁醛樹脂，上述聚乙烯醇縮醛骨架更佳為聚乙烯醇縮丁醛骨架，上述合成樹脂更佳為具有聚乙烯醇縮丁醛骨架。
於上述合成樹脂中，上述聚乙烯醇衍生物骨架及上述聚乙烯醇縮醛骨架之縮醛化度(於聚乙烯醇縮丁醛樹脂之情形時為縮丁醛化度)較佳為40莫耳%以上，更佳為50莫耳%以上，並且，較佳為90莫耳%以下，更佳為85莫耳%以下。若上述縮醛化度為上述下限以上，則可進一步提高細胞之固著性，使細胞效率良好地增生。若上述縮醛化度為上述上限以下，則可使在溶劑中之溶解性變得良好。
於上述合成樹脂中，上述聚乙烯醇衍生物骨架及上述聚乙烯醇縮醛骨架之羥基之含有率(羥基量)較佳為15莫耳%以上，更佳為20莫耳%以上，並且，較佳為45莫耳%以下，更佳為30莫耳%以下，進而較佳為25莫耳%以下。
於上述合成樹脂中，上述聚乙烯醇衍生物骨架及上述聚乙烯醇縮醛骨架之乙醯化度(乙醯基量)較佳為1莫耳%以上，更佳為2莫耳%以上，並且，較佳為5莫耳%以下，更佳為4莫耳%以下。若上述乙醯化度為上述下限以上及上述上限以下，則可提高聚乙烯醇縮醛樹脂與連接基之反應效率。
上述聚乙烯醇衍生物骨架及上述聚乙烯醇縮醛骨架之縮醛化度、乙醯化度及羥基量可藉由 1H-NMR(核磁共振譜)進行測定。
＜聚(甲基)丙烯酸酯骨架＞ 上述聚(甲基)丙烯酸酯骨架係源自聚(甲基)丙烯酸酯之骨架部分。上述聚(甲基)丙烯酸酯係藉由使(甲基)丙烯酸酯聚合而獲得。上述聚(甲基)丙烯酸酯骨架具有源自(甲基)丙烯酸酯之骨架。上述聚(甲基)丙烯酸酯可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
作為上述(甲基)丙烯酸酯，可例舉：(甲基)丙烯酸烷基酯、(甲基)丙烯酸環狀烷基酯、(甲基)丙烯酸芳基酯、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯類、(甲基)丙烯酸磷酸膽鹼等。上述(甲基)丙烯酸酯可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
作為上述(甲基)丙烯酸烷基酯，可例舉：(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸正丙酯、(甲基)丙烯酸異丙酯、(甲基)丙烯酸正丁酯、(甲基)丙烯酸異丁酯、(甲基)丙烯酸第三丁酯、(甲基)丙烯酸正辛酯、(甲基)丙烯酸異辛酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸壬酯、(甲基)丙烯酸異壬酯、(甲基)丙烯酸癸酯、(甲基)丙烯酸異癸酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯、及(甲基)丙烯酸異十四烷基酯等。
上述(甲基)丙烯酸烷基酯亦可經碳數1～3之烷氧基及四氫呋喃甲基等取代基取代。作為此種(甲基)丙烯酸烷基酯之例，可例舉：丙烯酸甲氧基乙酯、丙烯酸四氫糠酯等。
作為上述(甲基)丙烯酸環狀烷基酯，可例舉：(甲基)丙烯酸環己酯、及(甲基)丙烯酸異𦯉基酯等。
作為上述(甲基)丙烯酸芳基酯，可例舉：(甲基)丙烯酸苯酯、及(甲基)丙烯酸苄酯等。
作為上述聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯類，例如可例舉：甲氧基-聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基-聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、羥基-聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、甲氧基-二乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基-二乙二醇(甲基)丙烯酸酯、羥基-二乙二醇(甲基)丙烯酸酯、甲氧基-三乙二醇(甲基)丙烯酸酯、乙氧基-三乙二醇(甲基)丙烯酸酯、及羥基-三乙二醇(甲基)丙烯酸酯等。
作為上述(甲基)丙烯酸磷酸膽鹼，可例舉2-(甲基)丙烯醯氧乙基磷酸膽鹼等。
上述合成樹脂較佳為具有源自下述式(A1)或下述式(A2)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物(A)之結構單元。上述聚(甲基)丙烯酸酯骨架較佳為具有源自下述式(A1)或下述式(A2)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物(A)之結構單元。藉此，可使被覆層之疏水性增強，因此，可進一步使微載體之吸水率變小。因此，可使細胞接種後之初始固著率之不均變小，又，使得於培養基中細胞不易自微載體剝離。上述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)可包含下述式(A1)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物，亦可包含下述式(A2)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物，亦可包含下述式(A1)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物、及下述式(A2)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物兩者。於上述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)包含下述式(A1)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物及下述式(A2)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物兩者之情形時，下述式(A1)中之R與下述式(A2)中之R可相同，亦可不同。上述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)可僅使用一種，亦可併用兩種以上。又，下述式(A1)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物及下述式(A2)所表示之(甲基)丙烯酸酯化合物可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
[化1]
Figure 02_image001
上述式(A1)中，R表示碳數為2以上18以下之烴基。
[化2]
Figure 02_image003
上述式(A2)中，R表示碳數為2以上18以下之烴基。
上述式(A1)中之R及上述式(A2)中之R分別可為脂肪族烴基，亦可為芳香族烴基。就使上述合成樹脂之溶解度變得良好之觀點而言，上述式(A1)中之R及上述式(A2)中之R分別較佳為脂肪族烴基。上述脂肪族烴基可為直鏈狀，亦可具有分支結構，亦可具有雙鍵，亦可不具有雙鍵。上述式(A1)中之R及上述式(A2)中之R分別可為烷基，亦可為伸烷基。
上述式(A1)中之R之碳數及上述式(A2)中之R之碳數分別較佳為4以上，更佳為6以上，進而較佳為8以上，尤佳為10以上，並且，較佳為16以下，更佳為14以下，最佳為12。若上述碳數為上述下限以上，則可進一步使合成樹脂之疏水性變大，因此，可進一步使微載體之吸水率變小。若上述碳數為上述上限以下，則可提高將被覆層之材料配置於基材粒子表面時之塗佈性。尤其是若上述碳數為12，則可更進一步使微載體之吸水率變小，且可更進一步提高塗佈性。
上述(甲基)丙烯酸烷基酯較佳為上述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)。
上述具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架之合成樹脂亦可具有源自(甲基)丙烯酸酯以外之單體之骨架。
作為上述(甲基)丙烯酸酯以外之單體，可例舉(甲基)丙烯醯胺類及乙烯系化合物等。上述(甲基)丙烯酸酯以外之單體可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
作為上述(甲基)丙烯醯胺類，可例舉：(甲基)丙烯醯胺、N-異丙基(甲基)丙烯醯胺、N-第三丁基(甲基)丙烯醯胺、N,N'-二甲基(甲基)丙烯醯胺、(3-(甲基)丙烯醯胺丙基)三甲基氯化銨、4-(甲基)丙烯醯𠰌啉、3-(甲基)丙烯醯基-2-㗁唑啶酮、N-[3-(二甲胺基)丙基](甲基)丙烯醯胺、N-(2-羥乙基)(甲基)丙烯醯胺、N-羥甲基(甲基)丙烯醯胺、及6-(甲基)丙烯醯胺己酸等。
作為上述乙烯系化合物，可例舉：乙烯、烯丙基胺、乙烯基吡咯啶酮、順丁烯二酸酐、順丁烯二醯亞胺、伊康酸、(甲基)丙烯酸、及乙烯胺等。
＜肽部＞ 上述肽部係源自肽之結構部分。上述肽部具有胺基酸序列。構成上述肽部之肽可為寡肽，亦可為多肽。上述肽可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
上述肽部之胺基酸殘基之數量較佳為3個以上，更佳為4個以上，進而較佳為5個以上，並且，較佳為10個以下，更佳為8個以下，進而較佳為6個以下。若上述胺基酸殘基之數量為上述下限以上及上述上限以下，則可進一步提高與接種後之細胞之黏著性，可進一步提高細胞之增生率。但，上述肽部之胺基酸殘基之數量可超過10個，亦可超過15個。
上述肽部較佳為具有細胞黏著性之胺基酸序列。再者，細胞黏著性之胺基酸序列係指藉由噬菌體展示法、瓊脂糖凝膠珠粒法、或層板塗佈法而確認到細胞黏著活性之胺基酸序列。作為上述噬菌體展示法，例如可使用「The Journal of Cell Biology, Volume 130, Number 5, September 1995 1189-1196」中所記載之方法。作為上述瓊脂糖凝膠珠粒法，例如可使用「蛋白質 核酸 酵素 Vol.45 No.15 (2000) 2477」中所記載之方法。作為上述層板塗佈法，例如可使用「蛋白質 核酸 酵素 Vol.45 No.15 (2000) 2477」中所記載之方法。
作為上述細胞黏著性之胺基酸序列，例如可例舉：RGD序列(Arg-Gly-Asp)、YIGSR序列(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)、PDSGR序列(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg)、HAV序列(His-Ala-Val)、ADT序列(Ala-Asp-Thr)、QAV序列(Gln-Ala-Val)、LDV序列(Leu-Asp-Val)、IDS序列(Ile-Asp-Ser)、REDV序列(Arg-Glu-Asp-Val)、IDAPS序列(Ile-Asp-Ala-Pro-Ser)、KQAGDV序列(Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)、及TDE序列(Thr-Asp-Glu)等。又，作為上述細胞黏著性之胺基酸序列，亦可例舉：「病態生理，第9卷 第7號，527～535頁，1990年」、及「大阪府立母子醫療中心雜誌，第8卷 第1號，58～66頁，1992年」中所記載之序列等。上述肽部可僅具有一種上述細胞黏著性之胺基酸序列，亦可具有兩種以上。
上述細胞黏著性之胺基酸序列較佳為具有上述細胞黏著性之胺基酸序列中之至少任一種，更佳為至少具有RGD序列、YIGSR序列、或PDSGR序列，進而較佳為至少具有下述式(1)所表示之RGD序列。於該情形時，可進一步提高與接種後之細胞之黏著性，可進一步提高細胞之增生率。
Arg-Gly-Asp-X ・・・式(1)
上述式(1)中，X表示Gly、Ala、Val、Ser、Thr、Phe、Met、Pro、或Asn。
上述肽部可為直鏈狀，亦可具有環狀肽骨架。就進一步提高細胞增生性之觀點而言，上述肽部較佳為具有環狀肽骨架。上述環狀肽骨架係指由複數個胺基酸所構成之環狀骨架。就進一步有效地發揮本發明之效果之觀點而言，上述環狀肽骨架較佳為由4個以上之胺基酸所構成，更佳為由5個以上之胺基酸所構成，並且，較佳為由10個以下之胺基酸所構成。
於上述含肽樹脂中，上述肽部之含有率較佳為0.1莫耳%以上，更佳為1莫耳%以上，進而較佳為5莫耳%以上，尤佳為10莫耳%以上，並且，較佳為60莫耳%以下，更佳為50莫耳%以下，進而較佳為35莫耳%以下，尤佳為25莫耳%以下。若上述肽部之含有率為上述下限以上，則可進一步提高與接種後之細胞之黏著性，可進一步提高細胞之增生率。又，若上述肽部之含有率為上述上限以下，則可抑制製造成本。再者，上述肽部之含有率(莫耳%)係指相對於構成含肽樹脂之各結構單元之物量總和的上述肽部之物量。
上述肽部之含有率例如可藉由NMR(nuclear magnetic resonance，核磁共振)、FT-IR(fourier transform infrared radiation，傅立葉轉換紅外線光譜)或LC-MS(liquid Chromatography-Mass Spectrometry，液相層析法-質譜聯用)進行測定。
＜連接部＞ 上述連接部係源自連接基之結構部分。上述連接部通常位於上述聚乙烯醇衍生物骨架或上述聚(甲基)丙烯酸酯骨架與上述肽部之間。上述聚乙烯醇衍生物骨架或上述聚(甲基)丙烯酸酯骨架與上述肽部經由上述連接部而鍵結在一起。上述連接部由連接基(交聯劑)形成。上述連接基可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
上述連接基較佳為具有能夠與上述肽進行鍵結之官能基之化合物，更佳為具有能夠與上述肽之羧基或胺基進行縮合之官能基之化合物。
作為能夠與上述肽之羧基或胺基進行縮合之官能基，可例舉：羧基、硫醇基、胺基、羥基及氰基等。
就良好地與肽反應之觀點而言，上述連接基較佳為具有羧基或胺基之化合物，更佳為具有羧基之化合物。
於獲得具有聚乙烯醇衍生物骨架之含肽樹脂之情形時，作為上述具有羧基之連接基，可例舉(甲基)丙烯酸及含羧基之丙烯醯胺等。藉由使用具有聚合性不飽和基之羧酸(羧酸單體)作為上述具有羧基之連接基，可於導入連接基時藉由接枝聚合使該羧酸單體聚合，因此可使能夠與肽反應之羧基之個數增多。
就使聚乙烯醇衍生物與肽良好地鍵結之觀點而言，上述連接基較佳為(甲基)丙烯酸，更佳為丙烯酸。
於獲得具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架之含肽樹脂之情形時，上述連接基較佳為具有能夠與(甲基)丙烯酸酯進行鍵結之官能基。作為上述能夠與(甲基)丙烯酸酯進行鍵結之官能基，可例舉：乙烯基、(甲基)丙烯醯基及烯丙基等。上述連接基更佳為具有(甲基)丙烯醯基作為上述能夠與(甲基)丙烯酸酯進行鍵結之官能基，較佳為具有羧基或胺基且具有(甲基)丙烯醯基之化合物。
於獲得具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架之含肽樹脂之情形時，作為上述連接基，可例舉：(甲基)丙烯酸、伊康酸、及丙烯醯胺等。
就使聚(甲基)丙烯酸酯與肽良好地鍵結之觀點而言，上述連接基較佳為(甲基)丙烯酸或伊康酸，更佳為(甲基)丙烯酸。
＜被覆層之其他詳情＞ 上述合成樹脂之重量平均分子量較佳為1萬以上，更佳為5萬以上，並且，較佳為120萬以下，更佳為60萬以下。若上述重量平均分子量為上述下限以上及上述上限以下，則可進一步有效地發揮本發明之效果。於上述重量平均分子量為上述上限以下之情形時，可進一步有效地提高培養細胞時之細胞之延展性。
再者，上述重量平均分子量例如可藉由以下方法進行測定。使上述合成樹脂溶解於四氫呋喃(THF)中而製備合成樹脂之0.2重量%溶液。繼而，使用凝膠滲透層析(GPC)測定裝置(APC系統，Waters公司製造)藉由以下測定條件進行評價。
管柱：HSPgel HR MB-M 6.0×150 mm 流量：0.5 mL/min 管柱溫度：40℃ 注入量：10 μL 檢測器：RI、PDA 標準試樣：聚苯乙烯
上述被覆層可僅包含具有上述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架之樹脂。上述被覆層亦可包含具有上述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架且不具有肽部之樹脂、及上述含肽樹脂。上述被覆層亦可包含不具有上述聚乙烯醇衍生物骨架及聚(甲基)丙烯酸酯骨架兩者之樹脂等其他成分。作為上述其他成分，可例舉：聚烯烴樹脂、聚醚樹脂、聚酯、環氧樹脂、聚醯胺樹脂、聚醯亞胺樹脂、聚胺基甲酸酯樹脂、聚碳酸酯樹脂、纖維素、及多肽等。上述其他成分可僅使用一種，亦可併用兩種以上。
上述被覆層可僅具有包含具有上述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架之樹脂之層(以下，有時記為「層X」)。上述被覆層亦可具有不包含具有上述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架之樹脂之層(以下，有時記為「層Y」)。上述被覆層亦可具有上述層X及上述層Y。於上述被覆層具有上述層X及上述層Y之情形時，上述被覆層較佳為上述層Y位於基材粒子側，且上述層X位於上述層Y之外側。於該情形時，可進一步提高微載體與細胞之黏著性。
上述含肽樹脂較佳為至少存在於上述微載體之外表面。上述微載體之最外層較佳為包含上述含肽樹脂之層。於該情形時，可進一步提高微載體與細胞之黏著性。
於上述被覆層100重量%中，上述合成樹脂之含量較佳為90重量%以上，更佳為95重量%以上，進而較佳為97.5重量%以上，尤佳為99重量%以上，最佳為100重量%(總量)。若上述合成樹脂之含量為上述下限以上，則可進一步有效地發揮本發明之效果。於上述被覆層100重量%中，上述合成樹脂之含量可為100重量%以下，亦可未達100重量%。
於上述被覆層100重量%中，具有上述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架之樹脂或上述含肽樹脂之含量較佳為90重量%以上，更佳為95重量%以上，進而較佳為97.5重量%以上，尤佳為99重量%以上，最佳為100重量%(總量)。若具有上述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架之樹脂或上述含肽樹脂之含量為上述下限以上，則可進一步有效地發揮本發明之效果。於上述被覆層100重量%中，具有上述聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架之樹脂或上述含肽樹脂之含量可為100重量%以下，亦可未達100重量%。
於上述基材粒子之總表面積100%中，由上述被覆層覆蓋之表面積(被覆率)較佳為50%以上，更佳為70%以上，進一步較佳為90%以上，進而較佳為95%以上，尤佳為99%以上，最佳為100%。若上述被覆率為上述下限以上，則可進一步有效地提高微載體與細胞之黏著性，又，可進一步有效地發揮本發明之效果。上述被覆率可為100%以下，亦可未達100%，亦可為99%以下。
上述被覆率係藉由以下方式而求出：利用電子顯微鏡或光學顯微鏡對微載體進行觀察，算出由被覆層覆蓋之表面積相對於基材粒子之投影面積的百分率。
上述被覆層之厚度較佳為10 nm以上，更佳為50 nm以上，並且，較佳為1000 nm以下，更佳為500 nm以下。若上述被覆層之厚度為上述下限以上及上述上限以下，則可進一步提高微載體與細胞之黏著性。又，若上述被覆層之厚度為上述下限以上及上述上限以下，則可進一步有效地發揮本發明之效果。
上述被覆層之厚度可藉由例如使用掃描式電子顯微鏡(SEM)對微載體之剖面進行觀察而測定。關於上述被覆層之厚度，較佳為算出被覆層之任意5處之厚度之平均值作為1個微載體之被覆層之厚度，更佳為算出整個被覆層之厚度之平均值作為1個微載體之被覆層之厚度。上述被覆層之厚度較佳為針對任意50個微載體，算出各微載體之被覆層之厚度之平均值，藉此求出上述被覆層之厚度。
作為獲得上述具有聚乙烯醇衍生物骨架之含肽樹脂之方法，例如可例舉以下方法。
使聚乙烯醇衍生物(例如聚乙烯醇縮醛樹脂)與連接基反應而獲得由聚乙烯醇縮醛樹脂與連接基鍵結而成之反應物。使所獲得之反應物與肽反應而獲得具有聚乙烯醇衍生物骨架(聚乙烯醇縮醛骨架)之含肽樹脂。
作為獲得上述具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架之含肽樹脂之方法，例如可例舉以下方法。
使包含(甲基)丙烯酸酯之單體聚合而獲得丙烯酸系樹脂。使所獲得之丙烯酸系樹脂、肽、及視需要而使用之連接基反應而獲得具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架之含肽樹脂。
作為獲得具有上述聚乙烯醇衍生物骨架及上述聚(甲基)丙烯酸酯骨架之含肽樹脂之方法，例如可例舉以下方法。
藉由以下(i)、(ii)或(iii)之方法而獲得具有聚乙烯醇衍生物骨架及聚(甲基)丙烯酸酯骨架之樹脂。(i)使用共聚有丙烯酸酯之聚乙烯醇來合成聚乙烯醇縮醛樹脂。(ii)使用聚乙烯醇、及共聚有丙烯酸酯之聚乙烯醇來合成聚乙烯醇縮醛樹脂。(iii)使聚乙烯醇縮醛樹脂與丙烯酸酯進行接枝共聚。使藉由上述(i)、(ii)或(iii)之方法所獲得之樹脂、肽、及視需要而使用之連接基反應，從而獲得具有上述聚乙烯醇衍生物骨架及上述聚(甲基)丙烯酸酯骨架之含肽樹脂。
作為於上述基材粒子之表面配置上述被覆層而獲得微載體之方法，例如可例舉以下之方法(1)及方法(2)等。
方法(1)：使藉由上述方法所獲得之含肽樹脂溶解於溶劑中，從而獲得含有含肽樹脂之液體。可將上述含有含肽樹脂之液體噴霧至基材粒子，或者將含浸至上述含有含肽樹脂之液體中之基材粒子加以分離，從而製作在基材粒子之外表面具備含有含肽樹脂之層(被覆層)的微載體。
方法(2)：準備具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架之樹脂(肽鍵結前之樹脂)。使該樹脂溶解於溶劑中而獲得含有樹脂之液體。將上述含有樹脂之液體噴霧至基材粒子，或者將含浸至上述含有樹脂之液體中之基材粒子加以分離，從而獲得下述粒子，該粒子在基材粒子之外表面上配置有包含具有聚乙烯醇衍生物或聚(甲基)丙烯酸酯之樹脂之層。對於所獲得之粒子，藉由上述方法使該層中所含之具有聚乙烯醇衍生物或聚(甲基)丙烯酸酯之樹脂、肽、及視需要而使用之連接基進行反應。藉此可製作下述微載體，該微載體在基材粒子之外表面具備包含具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架且不具有肽部之樹脂之層、及含有含肽樹脂之層作為被覆層。
(微載體之其他詳情) 上述微載體用於培養細胞。
作為上述細胞，可例舉人類、小鼠、大鼠、豬、牛及猴子等動物細胞。又，作為上述細胞，可例舉體細胞等，例如可例舉：幹細胞、前驅細胞及成熟細胞等。上述體細胞可為癌細胞。
作為上述幹細胞，可例舉：間葉系幹細胞(MSC)、iPS細胞(induced Pluripotent Stem Cell，誘導性多能幹細胞)、ES細胞(embryonic stem cell，胚胎幹細胞)、Muse細胞(Multi-lineage differentiating stress enduring cell，多系分化持續應激細胞)、胚胎癌性細胞、胚胎生殖幹細胞、及mGS細胞(Multipotent germline stem cell，多能性生殖幹細胞)等。
作為上述成熟細胞，可例舉：神經細胞、心肌細胞、梘網膜細胞及肝細胞等。
上述微載體較佳為用於細胞之三維培養。三維培養係指相對於在平板等平面上培養細胞之二維培養，在縱向上亦使其具有厚度而培養細胞之培養方法。
上述微載體較佳為用於無血清培養基培養。藉由上述微載體，即便是不包含餵養細胞及黏著蛋白質之無血清培養基培養，亦可提高細胞之黏著性，尤其可進一步提高細胞接種後之初始固著率。又，藉由上述微載體，即便是無血清培養基培養，亦可發揮本發明之效果。尤其於上述被覆層包含上述含肽樹脂之情形時，即便是無血清培養基培養，亦可有效地發揮可提高細胞之黏著性之效果及提高細胞接種後之初始固著率之效果。
上述微載體較佳為實質上不包含源自動物之原料。藉由不包含源自動物之原料，可提供一種安全性較高，且製造時品質之不均較少之微載體。再者，「實質上不包含源自動物之原料」意指微載體中之源自動物之原料為3重量%以下。於上述微載體中，微載體中之源自動物之原料較佳為1重量%以下，最佳為0重量%。即，上述微載體最佳為完全不含源自動物之原料。
(細胞培養方法) 可使用上述微載體來培養細胞。本發明之細胞培養方法係使用上述微載體之細胞培養方法。作為上述細胞，可例舉上述細胞。
上述細胞培養方法較佳為包括使細胞黏著於上述微載體之步驟。上述細胞亦可為細胞塊。上述細胞塊可藉由以下方式而獲得，即，向融合狀態之培養容器中添加細胞剝離劑，以移液之方式均勻地進行破碎處理。細胞剝離劑並無特別限定，較佳為乙二胺/磷酸緩衝溶液。細胞塊之大小較佳為50 μm～200 μm。
以下，列舉實施例及比較例來更詳細地說明本發明。本發明並不僅限於該等實施例。
再者，所獲得之樹脂中之結構單元之含有率係使合成樹脂溶解於DMSO-d6(二甲基亞碸)後，藉由 1H-NMR(核磁共振譜)而測定。
(實施例1) (1)基材粒子A之製作 將二乙烯苯(純度57%)800重量份、及苯乙烯200重量份加以混合而獲得混合液。向所獲得之混合液中添加過氧化苯甲醯20重量份，進行攪拌直至均勻地溶解，從而獲得單體混合液。將使分子量約1700之聚乙烯醇溶解於純水中所得之2重量%水溶液4000重量份添加至反應釜中。繼而，向反應釜中添加所獲得之單體混合液，並攪拌4小時，藉此調整粒徑，以使單體之液滴成為規定粒徑。繼而，於85℃之氮氣氛圍下進行9小時反應，進行單體液滴之聚合反應而獲得粒子。利用熱水、甲醇及丙酮各者將所獲得之粒子分別清洗幾次後，進行分級操作而獲得平均粒徑100 μm、粒徑之CV值1%之基材粒子A。基材粒子A係二乙烯苯共聚物(表中記為DVB)之樹脂粒子。
(2)聚乙烯醇縮醛樹脂之製作 向具備攪拌裝置之反應機中投入離子交換水2700 mL、平均聚合度1700、皂化度99莫耳%之聚乙烯醇300重量份，一面攪拌一面進行加熱溶解而獲得溶液。向所獲得之溶液中，以鹽酸濃度成為0.2重量%之方式添加35重量%鹽酸作為觸媒。繼而，將溫度調整至15℃，一面攪拌一面添加正丁醛22重量份。繼而，添加正丁醛148重量份，使白色粒子狀之聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂)析出。於析出後15分鐘後，以鹽酸濃度成為1.8重量%之方式添加35重量%鹽酸後，加熱至50℃，於50℃下保持2小時。繼而，冷卻溶液，並進行中和後，對聚乙烯醇縮丁醛樹脂進行水洗，使其乾燥而獲得聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂，平均聚合度1700，縮醛化度(縮丁醛化度)70莫耳%，羥基量27莫耳%，乙醯化度3莫耳%)。
(3)連接部之形成 使所獲得之聚乙烯醇縮醛樹脂99重量份、及丙烯酸(連接基)1重量份溶解於THF(四氫呋喃)300重量份中，於光自由基聚合起始劑之存在下照射紫外線使其反應20分鐘，使聚乙烯醇縮醛樹脂與丙烯酸進行接枝共聚，藉此形成了連接部。
(4)形成有連接部之聚乙烯醇縮醛樹脂被覆粒子之製作 使形成有連接部之聚乙烯醇縮醛樹脂1重量份溶解於丁醇19重量份中。向所獲得之溶液中添加1重量份之基材粒子A並進行攪拌後，進行過濾，利用純水進行清洗，於60℃下進行5小時真空乾燥，藉此獲得形成有連接部之聚乙烯醇縮醛樹脂被覆粒子。
(5)微載體之製作 準備具有Gly-Arg-Gly-Asp-Ser胺基酸序列之直鏈狀肽(胺基酸殘基數量5個)。將該肽1重量份、及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(縮合劑)1重量份，以該肽之最終濃度成為1 mM之方式添加至不含鈣及鎂兩者之磷酸鹽緩衝生理鹽水中而製作含肽液體。向所獲得之含肽液體20重量份中添加形成有連接部之聚乙烯醇縮醛樹脂被覆粒子1重量份，藉此使連接部之羧基、與肽之Gly之胺基進行脫水縮合。對所獲得之懸浮液進行過濾，利用純水進行清洗，於60℃下進行5小時真空乾燥，藉此獲得微載體。再者，表中，將藉由上述方法所獲得之具有聚乙烯醇衍生物骨架(聚乙烯醇縮醛骨架)之含肽樹脂記為樹脂X1。樹脂X1具有Gly-Arg-Gly-Asp-Ser胺基酸序列作為肽部。
(實施例2) (1)基材粒子B之製作 藉由與實施例1相同之方式進行聚合反應而獲得粒子。藉由對所獲得之粒子進行分級操作，而獲得平均粒徑200 μm、粒徑之CV值1%之基材粒子B。
(2)微載體之製作 除了使用所獲得之基材粒子B以外，藉由與實施例1相同之方式製作微載體。
(實施例3) (1)基材粒子C之製作 藉由與實施例1相同之方式進行聚合反應而獲得粒子。藉由對所獲得之粒子進行分級操作，而獲得平均粒徑300 μm、粒徑之CV值1%之基材粒子C。
(2)微載體之製作  除了使用所獲得之基材粒子C以外，藉由與實施例1相同之方式製作微載體。
(實施例4) (1)基材粒子D之製作 藉由與實施例1相同之方式進行聚合反應而獲得粒子。藉由對所獲得之粒子進行分級操作，而獲得平均粒徑400 μm、粒徑之CV值1%之基材粒子D。
(2)微載體之製作 除了使用所獲得之基材粒子D以外，藉由與實施例1相同之方式製作微載體。
(實施例5)  (1)基材粒子E之製作  將二乙烯苯之調配量自800重量份變更為30重量份，將苯乙烯之調配量自200重量份變更為970重量份，除此以外，藉由與實施例1相同之方式獲得粒子。藉由對所獲得之粒子進行分級操作，而獲得平均粒徑300 μm、粒徑之CV值5%之基材粒子E。基材粒子E係聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物(表中記為PS97%/DVB3%)之樹脂粒子。
(2)微載體之製作 除了使用所獲得之基材粒子E以外，藉由與實施例1相同之方式製作微載體。
(實施例6)  使用基材粒子C作為基材粒子。
(2)丙烯酸系樹脂之製作 使丙烯酸十二烷基酯10重量份、及丙烯酸2.7重量份溶解於四氫呋喃27重量份中而獲得丙烯酸系單體溶液。將使Irgacure184(BASF公司製造)0.0575重量份溶解於所獲得之丙烯酸系單體溶液中而獲得之液體塗佈於PET膜上。對於塗佈物，在25℃下使用UV輸送裝置(EYE GRAPHICS公司製造之「ECS301G1」)以累計光量2000 mJ/cm 2照射波長365 nm之光，藉此獲得(甲基)丙烯酸共聚物溶液。將所獲得之(甲基)丙烯酸共聚物溶液於80℃下進行3小時真空乾燥，從而獲得具有連接部之丙烯酸系樹脂。
(3)丙烯酸系樹脂被覆粒子之製作 使所獲得之丙烯酸系樹脂1重量份溶解於丁醇19重量份中。向該溶液中添加基材粒子1重量份並進行攪拌後，進行過濾，利用純水進行清洗，於60℃下進行5小時真空乾燥，藉此獲得丙烯酸系樹脂被覆粒子。
(4)微載體之製作 使用所獲得之丙烯酸系樹脂被覆粒子。又，準備具有Arg-Gly-Asp-Phe-Lys胺基酸序列之環狀肽(胺基酸殘基數量5個，藉由使Arg與Lys鍵結而形成環狀骨架，Phe為D體)作為肽。使用該肽，使丙烯酸系樹脂之源自丙烯酸之結構單元中之羧基、與肽之Lys之胺基進行脫水縮合，除此以外，藉由與實施例1相同之方式獲得微載體。再者，表中，將藉由上述方法所獲得之具有聚(甲基)丙烯酸酯骨架之含肽樹脂記為樹脂X2。樹脂X2具有Arg-Gly-Asp-Phe-Lys胺基酸序列(環狀肽骨架)作為肽部。
(實施例7)  (1)基材粒子F之製作  準備Micropearl GS-L300(積水化學工業公司製造，平均粒徑300 μm，粒徑之CV值7%，多官能丙烯酸系樹脂粒子)。藉由對該粒子進行分級操作，而獲得平均粒徑300 μm、粒徑之CV值1%之基材粒子F。材粒子F係丙烯酸系樹脂(表中記為ACR)之樹脂粒子。
(2)微載體之製作  除了使用所獲得之基材粒子F以外，藉由與實施例1相同之方式製作微載體。
(比較例1) (1)基材粒子G之製作 使用對康寧公司製造之「未處理微載體」(基材粒子為聚苯乙烯粒子，表中記為PS)進行分級操作，使粒徑之CV值成為1%而獲得者作為基材粒子G。
(2)微載體之製作  除了使用基材粒子G以外，藉由與實施例1相同之方式製作微載體。
(比較例2) 使用所獲得之基材粒子C本身作為微載體。
(評價) (1)基材粒子及微載體之比重 於乾燥狀態及氬氣氛圍下，使用真比重計(島津製作所公司製造之「AccuPyc II」)而測定所獲得之基材粒子及微載體之比重。
(2)微載體之平均粒徑及粒徑之變異係數(CV值) 利用掃描式電子顯微鏡來觀察所獲得之微載體。算出任意50個微載體之以當量圓直徑計之平均粒徑及粒徑之變異係數(CV值)。
(3)被覆層之厚度 利用掃描式電子顯微鏡來觀察所獲得之微載體之剖面。測定任意50個微載體各自之被覆層之厚度，將其平均值作為微載體之被覆層之厚度。
(4)微載體之斷裂點強度  藉由上述方法而測定所獲得之微載體之斷裂點強度。再者，使用島津製作所公司製造之「Micro Autograph MST-I」作為微小強度評價試驗裝置。再者，表中，「＞2000」意指微載體於2000 mN以下時不具有斷裂點強度，即微載體之斷裂點強度超過2000 mN。
(5)壓縮位移曲線之反曲點處之負載  對於所獲得之微載體，藉由上述方法進行壓縮試驗。測定此時之負載值(mN)及壓縮位移(μm)，製成表示壓縮位移(x軸)與負載值(y軸)之關係之壓縮位移曲線。求出所獲得之壓縮位移曲線之反曲點，算出該反曲點處之負載。再者，在壓縮位移曲線於負載700 mN以下時不具有反曲點之情形時，在表中以「-」表示。
(6)微載體之吸水率 使所獲得之微載體於100℃之烘箱中乾燥8小時。將該微載體稱量100.0 mg，於溫度37℃及相對濕度95%RH之環境下放置24小時。測定放置後之微載體之重量，根據下述式算出微載體之吸水率。
吸水率(重量%)＝(W 2－W 1)/W 1×100 W 1：放置前之微載體之重量(mg) W 2：放置後之微載體之重量(mg)
(7)細胞之培養評價(細胞數)  使用12孔板(康寧公司製造，平底未處理)作為培養板。又，準備以下液體培養基及ROCK(Rho相關激酶)特異性抑制劑。
STEMFIT培養基(Ajinomoto Healthy Supply公司製造) ROCK-抑制劑(Y27632)
向ϕ35 mm皿中添加已成為融合狀態之h-iPS細胞(human induced pluripotent stem cell，人誘導性多能幹細胞)201B7 3.8×10 4個、及0.5 mM乙二胺四乙酸/磷酸緩衝溶液1 mL，於室溫下靜置5分鐘。去除乙二胺四乙酸/磷酸緩衝溶液後，利用液體培養基1 mL進行移液，藉此獲得細胞懸浮液。向裝有所獲得之微載體(以表面積換算為60 cm 2)、及4 mL液體培養基之培養板中添加所獲得之細胞懸浮液總量。將該培養板設置於振盪機，於37℃、CO 2濃度5%、46 rpm之條件下進行振盪培養。
自振盪培養開始經過3天後，將上清液之液體培養基4 ml更換為新的液體培養基4 ml。自振盪培養開始經過5天後，自培養板去除上清液之液體培養基4 ml。繼而，向培養板添加TryPLE Express剝離液1.0 mL，進行移液操作而使其懸浮。將懸浮液連同微載體一起添加至細胞濾器中，使微載體與細胞懸浮液分離。使用細胞計數器(Chemometec公司製造之「NucleoCounter NC-3000」)求出所獲得之細胞懸浮液中所含之細胞數。
＜細胞之培養評價之判定基準＞  AA：細胞數為1.6×10 5個以上  A：細胞數為1.2×10 5個以上且未達1.6×10 5個  B：細胞數為3.8×10 4個以上且未達1.2×10 5個  C：細胞數未達3.8×10 4個
(8)微載體之破損  利用相位差顯微鏡來觀察上述「(7)細胞之培養評價」之評價後之微載體，確認微載體是否產生了破損。表中，於觀察到產生破損之微載體時記載為「有」，於未觀察到產生破損之微載體時記載為「無」。再者，於比較例1中，觀察到如圖2所示之已破損之微載體。
將詳情及結果示於下述表1、2。
[表1]
   實施例1 實施例2 實施例3 實施例4
基材粒子 基材粒子之種類 A B C D
樹脂之種類 DVB DVB DVB DVB
平均粒徑 μm 100 200 300 400
比重 g/cm 3 1.11 1.11 1.11 1.11
被覆層 樹脂之種類 樹脂X1 樹脂X1 樹脂X1 樹脂X1
厚度 nm 100 100 100 100
微載體 比重 g/cm 3 1.11 1.11 1.11 1.11
平均粒徑 μm 100 200 300 400
粒徑之CV值 % 1 1 1 1
斷裂點強度 mN ＞2000 ＞2000 ＞2000 ＞2000
壓縮位移曲線之反曲點處之負載 mN - - - -
吸水率 重量% 0.5 0.5 0.5 0.5
細胞之培養評價(細胞數)    A A AA AA
微載體之破損    無 無 無 無
[表2]
   實施例5 實施例6 實施例7 比較例1 比較例2
基材粒子 基材粒子之種類 E C F G C
樹脂之種類 PS97%/DVB3% DVB ACR PS DVB
平均粒徑 μm 300 300 300 200 300
比重 g/cm 3 1.10 1.11 1.19 1.02 1.11
被覆層 樹脂之種類 樹脂X1 樹脂X2 樹脂X1 樹脂X1 -
厚度 nm 100 100 100 100 -
微載體 比重 g/cm 3 1.10 1.11 1.19 1.02 1.11
平均粒徑 μm 300 300 300 200 300
粒徑之CV值 % 5 1 1 1 1
斷裂點強度 mN 1500 ＞2000 ＞2000 800 ＞2000
壓縮位移曲線之反曲點處之負載 mN - - - 500 -
吸水率 重量% 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
細胞培養評價(細胞數)    AA AA AA A C
微載體之破損    無 無 無 有 無
1:細胞培養用微載體 2:基材粒子 3:被覆層
圖1係模式性地表示本發明之一實施方式之細胞培養用微載體的剖視圖。 圖2係比較例1中觀察到之已破損微載體之照片。 

          <![CDATA[<110>  日商積水化學工業股份有限公司(SEKISUI CHEMICAL CO., LTD.)]]>
          <![CDATA[<120>  細胞培養用微載體及細胞之培養方法]]>
          <![CDATA[<130>  F3236TW]]>
          <![CDATA[<150>  JP 2021-015724]]>
          <![CDATA[<151>  2021-02-03]]>
          <![CDATA[<150>  JP 2021-141461]]>
          <![CDATA[<151>  2021-08-31]]>
          <![CDATA[<160>  15    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn第3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          Arg Gly Asp Gly 
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          Arg Gly Asp Ala 
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          Arg Gly Asp Val 
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          Arg Gly Asp Ser 
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          Arg Gly Asp Met 
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          Arg Gly Asp Pro 
          1               
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  細胞黏著肽]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Arg Gly Asp Asn 
          1               
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  細胞黏著肽]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Tyr Ile Gly Ser Arg 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  細胞黏著肽]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Pro Asp Ser Gly Arg 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  細胞黏著肽]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Arg Glu Asp Val 
          1               
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  細胞黏著肽]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Ile Asp Ala Pro Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  細胞黏著肽]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Lys Gln Ala Gly Asp Val 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  細胞黏著肽]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gly Arg Gly Asp Ser 
          1               5
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005

Claims (13)

  1. 一種細胞培養用微載體，其具備：  基材粒子、及  被覆上述基材粒子之外表面之被覆層，且  上述細胞培養用微載體之斷裂點強度為1000 mN以上。
  2. 如請求項1之細胞培養用微載體，其中進行壓縮試驗時所獲得之壓縮位移曲線於負載700 mN以下時不具有反曲點。
  3. 如請求項1或2之細胞培養用微載體，其吸水率為10重量%以下。
  4. 如請求項1或2之細胞培養用微載體，其中上述被覆層包含合成樹脂。
  5. 如請求項4之細胞培養用微載體，其中上述合成樹脂具有聚乙烯醇衍生物骨架或聚(甲基)丙烯酸酯骨架。
  6. 如請求項1或2之細胞培養用微載體，其中上述被覆層包含肽部。
  7. 如請求項1或2之細胞培養用微載體，其中上述基材粒子為樹脂粒子。
  8. 如請求項1或2之細胞培養用微載體，其中上述基材粒子包含具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物。
  9. 如請求項8之細胞培養用微載體，其中上述具有乙烯性不飽和基之單體之聚合物為丙烯酸系樹脂、二乙烯苯聚合物、或二乙烯苯共聚物。
  10. 如請求項1或2之細胞培養用微載體，其比重為1.0 g/cm 3以上2.0 g/cm 3以下。
  11. 如請求項1或2之細胞培養用微載體，其平均粒徑為100 μm以上1500 μm以下。
  12. 如請求項1或2之細胞培養用微載體，其粒徑之CV值為10%以下。
  13. 一種細胞之培養方法，其包括使細胞黏著於如請求項1至12中任一項之細胞培養用微載體之步驟。
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