TW202245847A - 用於標靶放射性同位素治療之免疫結合物 - Google Patents

用於標靶放射性同位素治療之免疫結合物 Download PDF

Info

Publication number
TW202245847A
TW202245847A TW111106108A TW111106108A TW202245847A TW 202245847 A TW202245847 A TW 202245847A TW 111106108 A TW111106108 A TW 111106108A TW 111106108 A TW111106108 A TW 111106108A TW 202245847 A TW202245847 A TW 202245847A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
immunoconjugate
heavy chain
antigen
cancer
amino acid
Prior art date
Application number
TW111106108A
Other languages
English (en)
Inventor
亞當 喬祺
麥可 雅伯瑞
拉傑 所羅門 維斯渥
亞歷山大 羅倫斯 曼德爾
Original Assignee
加拿大商雅博得樂醫療公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 加拿大商雅博得樂醫療公司 filed Critical 加拿大商雅博得樂醫療公司
Publication of TW202245847A publication Critical patent/TW202245847A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1018—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1084—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K51/1087—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin comprises domains from different animal species, e.g. chimeric immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A61K51/1096—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies radioimmunotoxins, i.e. conjugates being structurally as defined in A61K51/1093, and including a radioactive nucleus for use in radiotherapeutic applications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本文描述免疫結合物，其包含：a)抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)放射性同位素螯合劑；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。該等免疫結合物可用於遞送用於治療腫瘤或癌症之α及β發射體。

Description

用於標靶放射性同位素治療之免疫結合物
抗體(諸如IgG)對其抗原之強烈特異性使抗體成為治療之首要標靶平台；然而，IgG至少三週之典型血清半衰期不利於放射性同位素的遞送，包括諸如Ac-225之α-發射同位素及諸如Lu-177及Y-90之β-發射同位素，特定言之由於長期暴露及慢性脫靶毒性。工程化之較小抗體格式(例如單體scFv、僅重鏈抗體或單域抗體片段)的出現以更小格式(例如15至30 kDa)提供了全尺寸抗體(例如IgG(約150 kDa))之強烈特異性及短得多的血清半衰期(例如30分鐘至2小時)(Bates A, Power, C, Antibodies(Basel) 8:28 (2019))。令人遺憾的是，此等短半衰期由於較差的滯留及腫瘤攝取而無法提供足夠的時間用於進行有效標靶結合，此外，腎系統對此等小抗體格式之血漿清除可導致腎組織中之同位素累積及成問題的脫靶毒性。
225-Ac為α-發射放射性同位素中最具細胞毒性的一種，單次衰變事件可以藉由促使雙鏈DNA斷裂及隨後的細胞死亡來有效地破壞癌細胞。α-發射放射性同位素的效力使其作為細胞殺死劑具有吸引力，能夠克服對其他療法起反應所觀察到之後天抗性。然而，令人遺憾的是，由於活體內不同位置之衰變事件，在全身投藥及在目標組織相對於非目標組織中達成所需的劑量測定術方面仍然存在許多挑戰。應用α-發射放射性核種作為標靶治療之關鍵在於能夠調節活體內子核種的分佈以限制毒性。此又與母核種之產生時序、治療投藥時間、子核種之衰變路徑及半衰期、循環時間以及運載工具的生物分佈及藥物動力學有關。令人遺憾的是，α粒子的發射亦通常產生足夠大之反沖能，以將子核種與螯合劑解耦，且有可能將子核種與其標靶工具分離，從而導致隨後重新分配『自由(free)』子核種，可誘發多重毒性。參見例如Robertson A等人， Curr Radiopharm11: 156(2018)。因此，由225-Ac反衝子核種(例如213-Bi)引起之腎毒性迄今為止已成為225-Ac之治療使用的主要限制。(參見例如Jaggi J等人, Cancer Res. 65:4888 (2005))。
關於在治療劑中使用具有α-發射放射性同位素之抗體及抗體片段的另一個令人困惑的問題為，即使在治療之前，干預的放射性衰變亦可能特別損害抗體組分及標靶序列。在可將α-發射體標記之抗體片段投與患者之前，可以發生抗體片段的放射分解，從而減少標靶量(參見例如Larsen R，Bruland O， J Labeled Cmpd Radiopharm.36：1009-18 (1995))，且在治療劑量所需之更高比活性下，免疫反應性會隨著放射性化學品質迅速下降。Salako等人, J Nucl Med.39(4):667-670 (1998)。舉例而言，α-發射體釋放之高離子化密度在1,000戈雷(gray，Gy)或更高劑量下經由放射分解而使同位素標記之Fab片段的免疫反應性受損。類似地，在超過1,200 Gy之劑量下觀測到α-發射同位素標記之抗體的顯著放射分解(Zalutsky M等人, J Nucl Med. 42(10):1508-15 (2001))。因而，識別針對α-發射放射性同位素之適當標靶運載工具並不簡單。
此外，標靶之放射鏡遞送平台，包括α-發射及β-發射放射性同位素，亦存在其他問題，在設計此類平台時需要同時最佳化，例如免疫原性、特異性、組織穿透性、穩定性、易於製造及可接受的治療窗。
本發明係關於免疫結合物或放射性免疫結合物、包含其之組合物及使用此類免疫結合物及組合物之方法。本發明之免疫結合物及組合物具有許多用途，例如用於遞送放射性同位素以殺死目標細胞(例如表現放射性免疫結合物所結合之目標抗原的癌細胞)；用於偵測及表徵受試者內的惡性細胞(例如目標抗原表現)；以及用於診斷及治療多種疾病及病狀，諸如癌症、腫瘤及涉及表現抗原之細胞的其他生長異常。
本發明經由特定遞送平台組分之選擇及特定組合解決了活體內標靶遞送α粒子發射體中固有的許多挑戰。本發明之發射α粒子之放射性同位素-遞送平台與傳統IgG相比提供較短半衰期，但與較小單體抗體片段格式相比具有較長半衰期。這樣的半衰期允許減少由於α發射體導致之毒性，同時將抗體片段保持在體內足夠長的時間以發揮治療活性。舉例而言，本發明之發射α粒子之放射性同位素-遞送平台展現增強之腫瘤標靶及在諸如骨髓及腎臟之放射性敏感組織中之減少的累積。進一步且出人意料的是，本發明之發射α粒子之放射性同位素-遞送平台對具有不同抗原密度之腫瘤展現極佳腫瘤結合及標記特性，其可為一些免疫結合物之某些使用的限制。
在一個態樣中，本文描述一種免疫結合物，其包含：a)抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)螯合劑；其中免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。在某些實施例中，抗原結合區包含scFv多肽或VHH多肽。在某些實施例中，抗原結合區包含scFv多肽。在某些實施例中，抗原結合區包含VHH多肽。在某些實施例中，抗原結合區經人源化。在某些實施例中，抗原結合區特異性結合至HER2或DLL3。在某些實施例中，抗原結合區特異性結合至HER2。在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含：a)重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO: 21中所闡述之胺基酸序列；b)重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO: 22中所闡述之胺基酸序列；及c)重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO: 23中所闡述之胺基酸序列且結合至HER2。在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含與SEQ ID NO: 20中闡述之序列至少85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致且結合至HER2的序列。在某些實施例中，抗原結合區特異性結合至DLL3。在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含：a)重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO: 31中所闡述之胺基酸序列；b)重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列；及c)重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO: 33中所闡述之胺基酸序列且結合至DLL3。在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含與SEQ ID NO: 30中所闡述之序列至少85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致且結合至DLL3的序列。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白之CH2域、免疫球蛋白之CH3域或免疫球蛋白之CH2域及CH3域。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白之CH2及CH3域。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為人類免疫球蛋白重鏈恆定區。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為IgA、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為IgG1同型。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為IgG4同型。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能或改變該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能且改變該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化改變該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。在某些實施例中，降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能之一或多個胺基酸殘基的變化為降低補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用ADCP或其組合的變化。在某些實施例中，降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能之該一或多個胺基酸殘基的變化係選自由以下組成之清單：根據EU編號之(a) 297A、297Q、297G或297D，(b) 279F、279K或279L，(c) 228P，(d) 235A、235E、235G、235Q、235R或235S，(e) 237A、237E、237K、237N或237R，(f) 234A、234V或234F，(g) 233P，(h) 328A，(i) 327Q或327T，(j) 329A、329G、329Y或329R (k) 331S，(l) 236F或236R，(m) 238A、238E、238G、238H、238I、238V、238W或238Y，(n) 248A，(o) 254D、254E、254G、254H、254I、254N、254P、254Q、254T或254V，(p) 255N，(q) 256H、256K、256R或256V，(r) 264S，(s) 265H、265K、265S、265Y或265A，(t) 267G、267H、267I或267K，(u) 268K，(v) 269N或269Q，(w) 270A、270G、270M或270N，(x) 271T，(y) 272N，(z) 292E、292F、292G或292I，(aa) 293S，(bb) 301W，(cc) 304E，(dd) 311E、311G或311S，(ee) 316F，(ff) 328V，(gg) 330R，(hh) 339E或339L，(ii) 343I或343V，(jj) 373A、373G或373S，(kk) 376E、376W或376Y，(ll) 380D，(mm) 382D或382P，(nn) 385P，(oo) 424H、424M或424V，(pp) 434I，(qq) 438G，(rr) 439E、439H或439Q，(ss) 440A、440D、440E、440F、440M、440T或440V，(tt) K322A，(uu) L235E，(vv) L234A及L235A，(ww) L234A、L235A及G237A，(xx) L234A、L235A及P329G，(yy) L234F、L235E及P331S，(zz) L234A、L235E及G237A，(aaa) L234A、L235E、G237A及P331S，(bbb) L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S及P331S，(ccc) L234A、L235A及P329A，(ddd) G236R及L328R，(eee) G237A，(fff) F241A，(ggg) V264A，(hhh) D265A，(iii) D265A及N297A，(jjj) D265A及N297G，(kkk) D270A，(lll) A330L，(mmm) P331A或P331S或(nnn) E233P，(ooo) L234A、L235E、G237A、A330S及P331S或(ppp)(a)至(ppp)之任何組合。在某些實施例中，降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能之該一或多個胺基酸殘基的變化包含根據EU編號之L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。在某些實施例中，改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的胺基酸變化縮短該免疫結合物之血清半衰期。在某些實施例中，改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之251、252、253、254、255、288、309、310、312、385、386、388、400、415、433、435、436、439、447，及其組合。在某些實施例中，改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之253、254、310、435、436及其組合。在某些實施例中，改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之I253A、I253D、I253P、S254A、H310A、H310D、H310E、H310Q、H435A、H435Q、Y436A及其組合。在某些實施例中，改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之I253A、S254A、H310A、H435Q、Y436A及其組合。在某些實施例中，改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之I253A、H310A、H435Q及其組合。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期小於15天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期小於10天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期小於120小時。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期小於72小時。在某些實施例中，抗原結合區係藉由連接子胺基酸序列或人類IgG鉸鏈區與免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，抗原結合區係藉由人類IgG鉸鏈區與免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，螯合劑為放射性同位素螯合劑。在某些實施例中，螯合劑係選自由以下組成之清單：DOTA、DO3A、DOTAGA、DOTAGA酸酐、Py4Pa、Py4Pa-NCS、Crown、Macropa、Macropa-NCS、HEHA、CHXoctapa、Bispa、Noneunpa及其組合。在某些實施例中，螯合劑為DOTA。在某些實施例中，螯合劑為DOTAGA。在某些實施例中，螯合劑為Py4Pa。在某些實施例中，螯合劑直接與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，螯合劑係藉由連接子與抗原結合區或免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，連接子係選自：6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(MC)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(MP)、纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(ala-phe)、對-胺基苄氧基羰基(PAB)，以及由與如下連接子試劑結合產生的彼等：形成4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯之連接部分4-巰基戊酸(SPP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二醯亞胺酯(SPDB)、(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯(SIAB)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇聚合物(PEG n)及S-2-(4-異硫氰基苄基)(SCN)。在某些實施例中，連接子係選自：聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇聚合物(PEG)及S-2-(4-異硫氰基苄基)(SCN)。在某些實施例中，連接子為PEG 5。在某些實施例中，連接子為SCN。在某些實施例中，螯合劑為選自由以下組成之清單的連接子-螯合劑：FP-Ad-PEG5-DOTAGA、p-SCN-Bn-DOTA、p-SCN-Ph-Et-Py4Pa及TFP-Ad-PEG5-Ac-Py4Pa。在某些實施例中，螯合劑為TFP-Ad-PEG5-DOTAGA。在某些實施例中，螯合劑為p-SCN-Bn-DOTA。在某些實施例中，螯合劑為p-SCN-Ph-Et-Py4Pa。在某些實施例中，螯合劑為TFP-Ad-PEG5-Ac-Py4Pa。在某些實施例中，螯合劑以1: 1至8: 1之比率與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，螯合劑以1: 1至6: 1之比率與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，螯合劑以2: 1至6: 1之比率與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，免疫結合物進一步包含放射性同位素。在某些實施例中，放射性同位素為α發射體。在某些實施例中，放射性同位素為選自由以下組成之清單的α發射體：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。在某些實施例中，放射性同位素為225-Ac。在某些實施例中，放射性同位素為β發射體。在某些實施例中，放射性同位素為選自177-Lu、90-Y、67-Cu及153-Sm之β發射體。在某些實施例中，免疫結合物之分子量在60與100 kDa之間。在某些實施例中，免疫結合物之分子量在60與90 kDa之間。在某些實施例中，免疫結合物之分子量在65與90 kDa之間。在某些實施例中，免疫結合物之分子量在70與90 kDa之間。在某些實施例中，免疫結合物與另一免疫結合物形成二聚體。在某些實施例中，免疫結合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。在某些實施例中，免疫結合物經調配用於靜脈內投與。
本文亦描述一種製備免疫結合物的方法，包含使免疫結合物負載有放射性同位素。在某些實施例中，放射性同位素為α發射體。在某些實施例中，放射性同位素為選自由以下組成之清單的α發射體：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。在某些實施例中，放射性同位素為225-Ac。在某些實施例中，放射性同位素為β發射體。在某些實施例中，放射性同位素為選自177-Lu、90-Y、67-Cu及153-Sm之β發射體。在某些實施例中，放射性同位素為177-Lu。
本文亦描述一種治療個體之癌症或腫瘤的方法，包含向該個體投與免疫結合物，藉此治療該癌症或腫瘤。在某些實施例中，個體為人類個體。在某些實施例中，癌症或腫瘤為實體癌症或腫瘤。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含肺癌、乳癌、卵巢癌或神經內分泌癌。在某些實施例中，方法進一步包含向該個體投與0.5 µCi至30.0 µCi/公斤。在某些實施例中，癌症或腫瘤表現由免疫結合物特異性結合之抗原。
本文亦描述用於治療個體之癌症或腫瘤之方法中的免疫結合物。在某些實施例中，個體為人類個體。在某些實施例中，癌症或腫瘤為實體癌症或腫瘤。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含肺癌、乳癌、卵巢癌或神經內分泌癌。在某些實施例中，向個體投與0.5 µCi至30.0 µCi/公斤。在某些實施例中，癌症或腫瘤表現由免疫結合物特異性結合之抗原。
本文亦描述一種殺死個體之癌細胞的方法，其包含向該個體投與免疫結合物，藉此殺死癌細胞。在某些實施例中，個體為人類個體。在某些實施例中，癌細胞包含肺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞或神經內分泌癌細胞。在某些實施例中，方法向該個體投與0.1 µCi至30.0 µCi/公斤。在某些實施例中，方法包含向該個體投與10 mCi至75 mCi/平方公尺體表面積。在某些實施例中，癌細胞表現由免疫結合物特異性結合之抗原。
本文亦描述免疫結合物在殺死個體之癌細胞之方法中的用途。在某些實施例中，個體為人類個體。在某些實施例中，癌細胞包含肺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞或神經內分泌癌細胞。在某些實施例中，方法包含向該個體投與0.5 µCi至30.0 µCi/公斤。在某些實施例中，癌細胞表現由免疫結合物特異性結合之抗原。
本文亦描述一種將放射性同位素遞送至個體之癌細胞或腫瘤細胞的方法，其包含向該個體投與免疫結合物，藉此將該放射性同位素遞送至該癌細胞或腫瘤細胞。在某些實施例中，個體為人類個體。在某些實施例中，癌細胞或腫瘤細胞包含肺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞或神經內分泌癌細胞。在某些實施例中，方法包含向該個體投與0.5 µCi至30.0 µCi/公斤。在某些實施例中，癌細胞或腫瘤細胞表現由免疫結合物特異性結合之抗原。
本文亦描述用於將放射性同位素遞送至個體之癌細胞或腫瘤細胞的免疫結合物。在某些實施例中，個體為人類個體。在某些實施例中，癌細胞或腫瘤細胞包含肺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌或神經內分泌癌細胞。在某些實施例中，癌細胞或腫瘤細胞表現由免疫結合物特異性結合之抗原。
本文亦描述一種使個體中之腫瘤成像的方法，其包含向該個體投與免疫結合物。在某些實施例中，個體為人類個體。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含肺癌、乳癌、卵巢癌或神經內分泌癌。在某些實施例中，腫瘤表現由免疫結合物特異性結合之抗原。
本文亦描述用於使個體中之腫瘤成像之方法中的免疫結合物。在某些實施例中，個體為人類個體。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含肺癌、乳癌、卵巢癌或神經內分泌癌。在某些實施例中，腫瘤表現由免疫結合物特異性結合之抗原。
本文亦描述一種編碼免疫結合物之核酸。在某些實施例中，表現載體包含核酸。在某些實施例中，細胞包含核酸或表現載體。在某些實施例中，細胞為真核細胞。在某些實施例中，真核細胞為CHO細胞。
在一些實施例中，標的放射性同位素遞送平台具有足夠大之分子尺寸(例如，60 kDa至110 kDa)以實質上降低脫靶毒性，尤其腎損傷(例如，來自α發射同位素載物)，且相較於傳統IgG，其尺寸足夠小以增加組織穿透，維持目標特異性且增加目標組織中首次衰變事件的概率。相對於腎臟，此類尺寸提供了肝臟優先消除，從而使腎臟免受放射毒性的影響。
在一些實施例中，標的放射性同位素遞送平台適用於安全且有效地活體內標靶遞送α發射體，這部分藉由降低由具有超過5天之半衰期及/或低於60 kDa之分子量的平台引起之某些不利影響來達成。
在一些實施例中，標的放射性同位素遞送平台適用於安全且有效地活體內標靶遞送α發射體，這部分藉由其相較於其他可能之遞送平台展現出由於放射分解導致之標靶能力損失的減少來達成。
在一些實施例中，標的放射性同位素遞送平台適用於安全且有效地活體內標靶遞送α發射體，其部分藉由與使用抗體片段之其他可能遞送平台相比，在某些放射性標記過程(例如用某些螯合劑高溫螯合)所需之溫度下展現出增加的製造穩定性來達成。
在一個實施例中，本發明提供用於活體內遞送α-發射放射性同位素之免疫結合物。在一個實施例中，免疫結合物亦能夠活體內遞送其他原子。在一個實施例中，免疫結合物能夠活體內遞送成像金屬(例如111-In、89-Zr、64-Cu、68-Ga或134-Ce)。
在一個實施例中，免疫結合物包含抗體構築體及螯合劑，且分子量在60與110 kDa之間，較佳在60與100 kDa之間，較佳在60與90 kDa之間，較佳在65與90 kDa之間，較佳在70與90 kDa之間。螯合劑能夠螯合α-發射放射性同位素以使得該抗體構築體鍵聯至該α-發射放射性同位素。
免疫結合物中之變異恆定區中之至少一者具有至少一個FcRn結合突變。在一個較佳實施例中，免疫結合物之兩個變異恆定區中之每一者具有至少一個FcRn結合突變，該等FcRn結合突變相同或不同。
在一個實施例中，螯合劑包含DOTA或DOTA衍生物。在一個實施例中，螯合劑包含DOTAGA。在一個實施例中，螯合劑包含macropa或macropa衍生物。在一個實施例中，螯合劑包含Py4Pa或Py4Pa衍生物。在一個實施例中，螯合劑包含賽特羅卡林(siderocalin)或賽特羅卡林衍生物。
在一個實施例中，螯合劑包含放射性同位素螯合組分及允許與抗原結合臂共價鍵聯之官能基。在一個實施例中，官能基直接鍵聯至放射性同位素螯合組分。在一個實施例中，螯合劑進一步包含官能基與放射性同位素螯合組分之間的連接子。
在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含DOTA或DOTA衍生物。在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含DOTAGA。在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含macropa或macropa衍生物。在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含Py4Pa或Py4Pa衍生物。
在一個實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之放射性免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
在一個實施例中，本發明提供一種將α-發射放射性同位素在患者活體內遞送至癌細胞的方法，其包含向該患者投與本發明之放射性免疫結合物或醫藥組合物。在一個實施例中，患者為人類患者。
在一個實施例中，本發明提供一種抑制癌細胞生長之方法，其包含使癌細胞與本發明之放射性免疫結合物接觸。在一個實施例中，癌細胞在患者活體內。在一個實施例中，該方法涉及向患者投與本發明之醫藥組合物。在一個實施例中，患者為人類患者。
在一個實施例中，本發明提供一種殺死癌細胞之方法，其包含使癌細胞與本發明之放射性免疫結合物接觸。在一個實施例中，癌細胞在患者活體內。在一個實施例中，該方法涉及向患者投與本發明之醫藥組合物。在一個實施例中，患者為人類患者。
在一個實施例中，本發明提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包含向該患者投與本發明之放射性免疫結合物或醫藥組合物。在一個實施例中，患者為人類患者。
在一個實施例中，本發明提供一種標靶成像複合物，其包含本發明之免疫結合物且進一步包含成像金屬。在一個態樣中，本發明提供一種標靶成像複合物，其包含本發明之免疫結合物之抗體構築體且進一步包含成像金屬。在一個實施例中，成像金屬為放射性同位素。在一個實施例中，成像金屬係選自包含以下各者之群：111-In、89-Zr、64-Cu、68-Ga及134-Ce。在一個實施例中，成像金屬係選自由111-In、89-Zr、64-Cu、68-Ga及134-Ce組成之群。在一個實施例中，成像金屬為111-In。在一個實施例中，成像金屬係共價結合至免疫結合物或抗體構築體。在一個實施例中，成像金屬係與免疫結合物之螯合劑締合。在一個實施例中，本發明提供一種測定患者活體內癌細胞之位置的方法，其包含向該患者投與本發明之標靶成像複合物。在一個實施例中，患者為人類患者。
在一個實施例中，本發明提供一種用於製備本發明之放射性藥物之套組，其包含本發明之免疫結合物。在一個實施例中，本發明提供一種套組，其包含本發明之放射性免疫結合物。在一個實施例中，本發明提供一種用於製備本發明之醫藥組合物的套組，其包含本發明之免疫結合物。在一個實施例中，本發明提供一種用於製備本發明之醫藥組合物的套組，其包含本發明之放射性免疫結合物。在一個實施例中，本發明提供一種套組，其包含本發明之醫藥組合物。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物包含二聚域或模體。在一些其他實施例中，二聚域或模體處於鉸鏈區及/或變異恆定區中。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或醫藥組合物在人類血清中具有小於96小時之半衰期。在一些其他實施例中，在人類血清中之半衰期小於72小時。在一些其他實施例中，半衰期小於48、36、24及/或12小時。在一些實施例中，半衰期在4小時與8小時之間、在6小時與12小時之間、在8小時與16小時之間、在12小時與24小時之間或在24小時與48小時之間。
在一個態樣中，本發明提供包含本發明之免疫結合物的放射性免疫結合物，且進一步包含β粒子發射體，諸如177-Lu、90-Y、67-Cu或153-Sm。在一個態樣中，本發明提供一種包含此類放射性免疫結合物之醫藥組合物。
在一個態樣中，本發明提供一種放射性免疫結合物，其包含本發明之免疫結合物且進一步包含α粒子發射體以及β及/或γ粒子發射體。在一個態樣中，本發明提供一種包含此類放射性免疫結合物之醫藥組合物。
在一些實施例中，本發明之套組包括除本發明之免疫結合物、放射性免疫結合物或醫藥組合物以外的試劑或醫藥裝置。
在一些實施例中，本發明之套組為用於特異性偵測生物樣品中之抗原的免疫分析套組，其包含：(a)如本文所述的免疫結合物、放射性免疫結合物或標靶成像複合物及/或其組合物；及(b)用於偵測免疫結合物、放射性免疫結合物或標靶成像複合物之說明書。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼如本文所提供之抗原結合臂或其組分。在一個態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼本文中免疫結合物之抗原結合區。在一個態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼本文中之免疫結合物的VHH多肽。在一個態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼本文中免疫結合物之鉸鏈區。在一個態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼本文中免疫結合物之變異恆定區。在一個態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼本文中免疫結合物之VHH多肽及本文中免疫結合物之鉸鏈區。在一個態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼本文中免疫結合物之VHH多肽、本文中免疫結合物之鉸鏈區及本文中免疫結合物之變異恆定區。
在另一態樣中，本發明提供一種載體，其包含如本文所提供之核酸。在一些實施例中，該載體係表現載體。
在另一態樣中，本發明提供使用本發明之免疫結合物、放射性免疫結合物、標靶成像複合物或醫藥組合物之方法。在一些實施例中，本發明提供一種治療疾病、病症或病狀之方法，該方法包含向有需要之患者投與醫藥學上有效量之本文中之放射性免疫結合物或醫藥組合物。
在一些實施例中，本發明之方法包含向有需要之受試者投與本文所述之放射性免疫結合物或醫藥組合物中之任一者的步驟。對於一些其他實施例，該方法用於抑制癌細胞或腫瘤之生長及/或殺死癌細胞或腫瘤。
在一些實施例中，提供本文所述之免疫結合物或放射性免疫結合物的用途，用於製造供治療受試者之疾病、病症或病狀(諸如癌症)用的藥劑。
在另一態樣中，本發明提供一種製備本發明之放射性免疫結合物或醫藥組合物的製程，該方法包含用適當同位素(諸如α或β粒子發射體)放射性標記免疫結合物。
關於以下描述及所附申請專利範圍將更好地理解本發明之此等及其他特徵、態樣及優勢。本發明之前述元件可以自由地單獨組合或移除，以便製備本發明之其他實施例，下文中不作任何反對此類組合或移除的申明。
對相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年2月22日提交的美國臨時申請案第63/152,079號之權益，該臨時申請案以全文引用的方式併入本文中。
在下文中使用說明性非限制性實施例更充分地描述本發明。然而，本發明可以許多不同形式體現且不應被解釋為限於下文中所闡述的實施例。確切地說，提供此等實施例以使本發明透徹，且將對熟習此項技術者傳達本發明之範疇。為了使本發明可更易於理解，在下文對某些術語進行定義。其他定義可見於本發明之實施方式內。
特定言之，在實施例中，本發明經由特異性免疫結合物及放射性免疫結合物組分的選擇及特定組裝解決了在活體內標靶遞送放射性同位素中所固有的許多挑戰。本發明之放射性同位素-遞送平台與傳統IgG相比提供較短半衰期，但與較小單體抗體片段格式相比具有較長半衰期。在一些實施例中，標的放射性同位素遞送平台具有足夠大之分子尺寸(例如，60 kDa至110 kDa)以實質上降低脫靶毒性，尤其腎損傷(例如，來自α-或β-發射同位素載物)，且相較於傳統IgG，其尺寸足夠小以增加組織穿透，維持目標特異性且增加目標組織中首次衰變事件的概率。在一些實施例中，標的放射性同位素遞送平台適用於安全且有效地活體內標靶遞送放射性同位素(諸如α-或β-發射體)，這部分藉由降低由具有超過5天之半衰期及/或低於60 kDa之分子量的平台引起之某些不利影響來達成。在一些實施例中，標的放射性同位素遞送平台適用於安全且有效地活體內標靶遞送放射性同位素(諸如α-或β-發射體)，這部分藉由藉由其相較於其他可能之遞送平台展現出由於放射分解導致之標靶能力損失的減少來達成。在一些實施例中，標的放射性同位素遞送平台適用於安全且有效地活體內標靶遞送放射性同位素(諸如α-或β-發射體)，這部分藉由與使用抗體片段之其他可能的遞送平台相比，在某些放射性標記過程(例如用某些螯合劑高溫螯合)所需之溫度下展現出增加的製造穩定性來達成。 免疫結合物
在一個態樣中，本發明提供以高親和力特異性結合至目標抗原的免疫結合物。在一些實施例中，本發明提供一種特異性結合至癌細胞之細胞表面抗原之免疫結合物。在一些實施例中，免疫結合物包含三個、四個、五個、六個或更多個CDR或HVR(Kabat)。在一些實施例中，免疫結合物以特徵為K D≤1 μ M、＜100 nM、＜10 nM、＜1 nM、＜0.1 nM、＜0.01 nM或＜0.001 nM(例如10 -8或更低，例如10 -8M至10 -13M，例如10 -9M至10 -13M)之親和力結合特異性抗原及/或表位。
本文中所描述之免疫結合物可充當放射性同位素遞送平台。本文提供的放射性同位素遞送平台具有相對較短的半衰期(例如小於一週或兩週但大於兩小時至八小時)。
在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)抗原結合區；及b)免疫球蛋白重鏈恆定區。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)螯合劑。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)放射性同位素螯合劑。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)放射性同位素螯合劑；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。
在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a) VHH抗原結合區；及b)免疫球蛋白重鏈恆定區。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a) VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)螯合劑。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)放射性同位素螯合劑。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)放射性同位素螯合劑；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。
在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a) VHH抗原結合區；及b)免疫球蛋白Fc區。一起稱為aVHH-Fc。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白Fc區；及c)螯合劑。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白Fc區；及c)放射性同位素螯合劑。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白Fc區；及c)放射性同位素螯合劑；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。
在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a) VHH抗原結合區；及b)變異免疫球蛋白Fc區。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)VHH抗原結合區；b)變異免疫球蛋白Fc區；及c)螯合劑。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)VHH抗原結合區；b)變異免疫球蛋白Fc區；及c)放射性同位素螯合劑。在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含：a)VHH抗原結合區；b)變異免疫球蛋白Fc區；及c)放射性同位素螯合劑；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。在某些實施例中，變異免疫球蛋白Fc區包含一或多個胺基酸變化以減少免疫結合物之血清或血漿半衰期。
在一些實施例中，放射性同位素遞送平台具有大於約60 kDa之尺寸，以避免α發射同位素載物之某些毒性，諸如脫靶腎毒性。在一些實施例中，放射性同位素遞送平台具有小於約110 kDa之尺寸以便改良腫瘤穿透。在一些實施例中，放射性同位素遞送平台之尺寸在60與110 kDa之間，此係由於其兩個個別抗原結合臂之二聚結構，各抗原結合臂具有與鉸鏈區及野生型或變異恆定區融合之VHH多肽。在一些實施例中，變異恆定區相對於野生型Fc區具有特定胺基酸取代以便減少半衰期及/或消除Fc效應功能。
在一個實施例中，免疫結合物之抗體構築體由彼此間共價鍵聯的兩個抗原結合臂組成(例如經由締合之重鏈恆定區或免疫球蛋白鉸鏈區之間的二硫鍵)。抗原結合臂中之每一者獨立地由抗原結合區、鉸鏈區及變異恆定區組成。在各抗原結合臂內，臂之抗原結合區共價鍵聯至臂之鉸鏈區且臂之鉸鏈區共價鍵聯至臂之變異恆定區，使得鉸鏈區在抗原結合臂內插入抗原結合區與變異恆定區之間且藉此連接抗原結合區及變異恆定區。
在一較佳實施例中，免疫結合物中之兩個抗原結合區中之至少一者由一或兩個僅重鏈可變(VHH)多肽組成。在一較佳實施例中，兩個抗原結合區中之至少一者由一個VHH多肽組成。在一較佳實施例中，免疫結合物之兩個抗原結合區中之每一者由一種VHH多肽組成，該等VHH多肽相同或不同。
在一個實施例中，免疫結合物之抗原結合區結合至相同抗原。在一個實施例中，免疫結合物之抗原結合區結合至不同抗原。在一個實施例中，免疫結合物之抗原結合區相同。在一個實施例中，免疫結合物之抗原結合區不同。在一個實施例中，各抗原結合臂之抗原結合區由一或兩種VHH多肽組成。
在一個實施例中，一個抗原結合臂之抗原結合區由兩種VHH多肽組成，且另一個抗原結合臂之抗原結合區不包含VHH多肽。在一個實施例中，兩個抗原結合臂結合相同抗原。在一個實施例中，兩個抗原結合臂結合不同抗原。在一個實施例中，兩種VHH多肽相同。在一個實施例中，兩種VHH多肽不同。在一個實施例中，免疫結合物為雙特異性的。
在一個實施例中，一個抗原結合臂之抗原結合區由一種VHH多肽組成且另一個抗原結合臂之抗原結合區由兩種VHH多肽組成。在一個實施例中，兩個抗原結合臂結合相同抗原。在一個實施例中，兩個抗原結合臂結合不同抗原。在一個實施例中，三種VHH多肽相同。在一個實施例中，三種VHH多肽中之兩種相同且與第三VHH多肽不同。在一個實施例中，三種VHH多肽不同。在一個實施例中，免疫結合物為雙特異性的。
在一個實施例中，免疫結合物之各抗原結合臂之抗原結合區由一種VHH多肽組成。在一個實施例中，VHH多肽結合至相同抗原。在一個實施例中，VHH多肽結合至不同抗原。在一個實施例中，VHH多肽相同。在一個實施例中，VHH多肽不同。在一個實施例中，免疫結合物為雙特異性的。 抗原結合區
抗原結合區賦予免疫結合物特異性且可適當地包含小抗原結合多肽。此類小抗原結合多肽賦予優勢，諸如降低免疫結合物分子之總尺寸，允許腫瘤穿透及標記。小抗原結合多肽可能缺乏某些對於結合非必需的區域，諸如輕鏈恆定區、重鏈恆定區、CH1區或鉸鏈區。在某些實施例中，抗原結合區可能缺乏輕鏈可變區。在某些實施例中，小抗原結合區可具有10 kDa與40 kDa之間的分子量。
在一些實施例中，小抗原結合區具有約10 kDa至約40 kDa之分子量。在一些實施例中，小抗原結合區的分子量為約10 kDa至約15 kDa、約10 kDa至約20 kDa、約10 kDa至約25 kDa、約10 kDa至約30 kDa、約10 kDa至約35 kDa、約10 kDa至約40 kDa、約15 kDa至約20 kDa、約15 kDa至約25 kDa、約15 kDa至約30 kDa、約15 kDa至約35 kDa、約15 kDa至約40 kDa、約20 kDa至約25 kDa、約20 kDa至約30 kDa、約20 kDa至約35 kDa、約20 kDa至約40 kDa、約25 kDa至約30 kDa、約25 kDa至約35 kDa、約25 kDa至約40 kDa、約30 kDa至約35 kDa、約30 kDa至約40 kDa，或約35 kDa至約40 kDa。在一些實施例中，小抗原結合區的分子量為約10 kDa、約15 kDa、約20 kDa、約25 kDa、約30 kDa、約35 kDa，或約40 kDa。在一些實施例中，小抗原結合區的分子量為至少約10 kDa、約15 kDa、約20 kDa、約25 kDa、約30 kDa，或約35 kDa。在一些實施例中，小抗原結合區的分子量為至多約15 kDa、約20 kDa、約25 kDa、約30 kDa、約35 kDa，或約40 kDa。
抗原結合區可包含VHH多肽、scFv多肽或VNAR多肽。在某些實施例中，抗原結合區包含VHH多肽。在某些實施例中，抗原結合區包含ScFv多肽。在某些實施例中，抗原結合區包含VNAR多肽。在某些實施例中，抗原結合區經人源化。
抗原區可包含對由熟習此項技術者選擇之抗原的特異性以達成所需功能，諸如標靶適合於用所描述之免疫結合物或放射性免疫結合物治療的特定癌症、腫瘤或細胞類型。如本文中所描述，抗原結合區可為此項技術中已知之抗體之片段或格式。完整抗體可經工程化以符合本文所描述之各種小抗原結合區格式(例如scFv)。抗原結合區可特異性結合至腫瘤抗原(例如，在癌細胞中特異性表現或富集之抗原)。在某些實施例中，腫瘤抗原包含Her2、Trop2、CEA、NaPi2b、uPAR、CDCP1、MUC-1、MUC-16、CEACAM-5、MR-1、Fn14、MAGE-3、NY-ESO-1、EGFR、PDGFR、IGF1R、CSF-1R、PSMA、PSCA、STEAP-1、FAP、TEM8、5T4、VEGFR、NRP1、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD39、CD44、CD47、CD52、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD132、CD133、CD138、CD166、CD205、CD276、ROR1、ROR2、磷脂肌醇蛋白聚醣3(Glypican 3)、Trail受體2(DR5)、PD-L1、間皮素(Mesothein)、鈴蟾素(Bombesin)、EpCAM、DARPP、CSPG4、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、整合素αvβ1、整合素αvβ3、整合素αvβ5、整合素αvβ6、整合素α5β1、整合素α-3、整合素α-5、整合素β-6、連接素-4(Nectin-4)、Wnt活化抑制因子1、DLL3、運鐵蛋白受體、葉酸受體α、組織因子、BCMA、c-Met、LIV-1、AXL、AFP、ENPP3、CLDN6/9、DPEP3、RNF43、LRRC15、PTK7、P-鈣黏素(P-cadherin)、FLT3、EphA2、MTI-MMP、CXCR6、GD2，或斯莫森德(Smoothened)抗原(Smo)。在某些實施例中，腫瘤抗原包含人類表皮生長因子受體2(HER2)、δ樣配位體3(DLL3)、葉酸受體α(FOLR1)或Wnt活化抑制因子1(WAIF1)。在某些實施例中，腫瘤抗原包含HER2。在某些實施例中，腫瘤抗原包含DLL3。在某些實施例中，腫瘤抗原包含FOLR1。在某些實施例中，腫瘤抗原包含WAIF1。在某些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2。在某些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR。在某些實施例中，腫瘤抗原包含PSA。在某些實施例中，腫瘤抗原包含MUC-1。在某些實施例中，腫瘤抗原包含CEA。在某些實施例中，腫瘤抗原包含NY-ESO-1。
在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含與SEQ ID NO: 20中闡述之序列至少85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致且結合至HER2的序列。
在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含：a) CDR1，其包含SEQ ID NO: 21中所闡述之胺基酸序列；b) CDR2，其包含SEQ ID NO: 22中所闡述之胺基酸序列；及c) CDR3，其包含SEQ ID NO: 23中所闡述之胺基酸序列。
在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含與SEQ ID NO: 30中所闡述之序列至少85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致且結合至DLL3的序列。
在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含：a) CDR1，其包含SEQ ID NO: 31中所闡述之胺基酸序列；b) CDR2，其包含SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列；及c) CDR3，其包含SEQ ID NO: 33中所闡述之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物包含以合成方式工程化之抗體衍生物，諸如，例如包含以下的蛋白質或多肽：自主V H域((諸如來自駱駝科、鼠類或人類來源)，單域抗體域(sdAb)，源自駱駝科之重鏈抗體域(V HH片段或V H域片段)，源自駱駝科V HH片段或V H域片段之重鏈抗體域，源自軟骨魚之重鏈抗體域，免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)、V NAR片段、單鏈可變(scFv)片段，奈米抗體，包含V H域之「駱駝化(camelized)」或「駱駝化(camelised)」支架，由重鏈及C H1域組成的Fd片段，單鏈Fv-C H3微型抗體，Fc抗原結合域(Fcab)，scFv-Fc融合物，多聚化scFv片段(雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體)，二硫鍵穩定之抗體可變(Fv)片段(dsFv)，由V L、V H、C L及C H1域組成的二硫鍵穩定之抗原結合(Fab)片段，包含二硫鍵穩定之重鏈及輕鏈的scFv(sc-dsFvs)，二價奈米抗體，二價微型抗體，二價F(ab') 2片段(Fab二聚體)，雙特異性串聯V HH片段，雙特異性串聯scFv片段，雙特異性奈米抗體，雙特異性微型抗體以及保留互補位及目標抗原結合功能的上述之任何基因操控對應物。
在一些實施例中，免疫結合物為單價的。在其他實施例中，免疫結合物為多價的，諸如二價的。在一些其他實施例中，免疫結合物為二價及二聚的。在一些其他實施例中，二價免疫結合物均二聚的。
在一個態樣中，本發明提供抗體構築體(單獨或在免疫結合物、放射性免疫結合物或標靶成像複合物之上下文中，本發明中之每一者)，其包含VHH片段，該VHH片段包含有包含三個源自駱駝科之重鏈CDR的重鏈可變區，該三個重鏈CDR以特異性及高親和力結合至抗原。
在一些實施例中，抗體構築體、免疫結合物、放射性免疫結合物或標靶成像複合物特異性結合至細胞表面上所表現之抗原的至少一個細胞外部分。在一些實施例中，免疫結合物特異性結合至由目標細胞(諸如腫瘤細胞)所表現之抗原的至少一個細胞外部分。
在一些實施例中，本發明提供特異性結合至抗原之免疫結合物。在一些實施例中，免疫結合物包含有包含重鏈可變區(HVR-H)之抗體構築體，該重鏈可變區包含三個諸如源自駱駝科抗體或IgNAR的CDR：hCDR1、hCDR2及hCDR3。在一些實施例中，免疫結合物包含：(a)包含三個CDR：lCDR1、lCDR2及lCDR3之輕鏈可變區(HVR-L)；及(b)包含三個CDR：hCDR1、hCDR2及hCDR3之重鏈可變區(HVR-H)。在一些實施例中，抗體構築體為嵌合或人源化的。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物包含有包含抗原結合域之抗體構築體，該抗原結合域為抗體片段，包括但不限於例如Fv、Fab、Fab'、scFv、HcAb片段、VHH片段、sdAb片段、雙功能抗體或F(ab')2片段。在一些其他實施例中，本發明之免疫結合物包含兩種或更多種抗體片段之多聚體，諸如包含兩種抗體片段的均二聚體或雜二聚體，其各自能夠以特異性及高親和力結合至抗原且各自包含重鏈可變區(HVR-H)，該重鏈可變區包含三個CDR：hCDR1、hCDR2及hCDR3。 重鏈恆定區
本文中所描述之免疫結合物之抗原結合區可包含Fc或重鏈恆定區。抗原結合分子可藉由適合連接子或藉由IgG鉸鏈區直接與Fc或重鏈恆定區偶合。包括重鏈恆定區或Fc區賦予諸如以下之優勢：允許最佳化及調整血清半衰期，添加額外位點以結合螯合劑或細胞毒性劑，且允許使用標準製程及方法純化免疫結合物。重鏈恆定區之添加亦增加尺寸，其可使免疫結合物之分解代謝偏移及消除自腎臟轉移至肝臟。此可尤其賦予放射性免疫結合物安全優勢，因為腎臟比肝臟對輻射更敏感。可以對存在於負責結合新生兒Fc受體(FcRn)之重鏈恆定區中之殘基進行影響效應功能或血清半衰期的變化。與FcRn結合通常促成包含免疫球蛋白Fc之分子的半衰期增加，因此減少與FcRn結合可縮短包含Fc之分子的半衰期。FcRn結合之減少可賦予諸如縮短免疫結合物半衰期，及因此減少歸因於細胞毒性劑或放射性同位素之後續毒性的優勢。在某些實施例中，免疫球蛋白恆定區包含Fc區或由Fc區組成。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白之CH2域、免疫球蛋白之CH3域或免疫球蛋白之CH2域及CH3域。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白之CH2及CH3域。對於人類個體之治療或成像，免疫球蛋白重鏈恆定區可為人類的，防止或減少針對免疫結合物之內源性免疫反應。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為人類免疫球蛋白重鏈恆定區。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為IgA、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為IgG1同型。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為IgG4同型。
免疫球蛋白重鏈恆定區可為變異恆定區，該變異恆定區包含一或多個胺基酸殘基之變化，該變化賦予本文所描述之免疫結合物額外的效用及有利特性。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能或改變該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能或減少該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能且減少該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化減少該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。
免疫結合物之重鏈恆定區之變化可減低與重鏈恆定區相關之效應功能，諸如固定補體、促進吞噬作用或將其他免疫效應細胞(例如NK細胞)募集至重鏈恆定區之能力。在某些實施例中，降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能之一或多個胺基酸殘基的變化為降低補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用ADCP或其組合的變化。在某些實施例中，降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能之該一或多個胺基酸殘基的變化係選自由以下組成之清單：根據EU編號之(a) 297A、297Q、297G或297D，(b) 279F、279K或279L，(c) 228P，(d) 235A、235E、235G、235Q、235R或235S，(e) 237A、237E、237K、237N或237R，(f) 234A、234V或234F，(g) 233P，(h) 328A，(i) 327Q或327T，(j) 329A、329G、329Y或329R (k) 331S，(l) 236F或236R，(m) 238A、238E、238G、238H、238I、238V、238W或238Y，(n) 248A，(o) 254D、254E、254G、254H、254I、254N、254P、254Q、254T或254V，(p) 255N，(q) 256H、256K、256R或256V，(r) 264S，(s) 265H、265K、265S、265Y或265A，(t) 267G、267H、267I或267K，(u) 268K，(v) 269N或269Q，(w) 270A、270G、270M或270N，(x) 271T，(y) 272N，(z) 292E、292F、292G或292I，(aa) 293S，(bb) 301W，(cc) 304E，(dd) 311E、311G或311S，(ee) 316F，(ff) 328V，(gg) 330R，(hh) 339E或339L，(ii) 343I或343V，(jj) 373A、373G或373S，(kk) 376E、376W或376Y，(ll) 380D，(mm) 382D或382P，(nn) 385P，(oo) 424H、424M或424V，(pp) 434I，(qq) 438G，(rr) 439E、439H或439Q，(ss) 440A、440D、440E、440F、440M、440T或440V，(tt) K322A，(uu) L235E，(vv) L234A及L235A，(ww) L234A、L235A及G237A，(xx) L234A、L235A及P329G，(yy) L234F、L235E及P331S，(zz) L234A、L235E及G237A，(aaa) L234A、L235E、G237A及P331S，(bbb) L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S及P331S，(ccc) L234A、L235A及P329A，(ddd) G236R及L328R，(eee) G237A，(fff) F241A，(ggg) V264A，(hhh) D265A，(iii) D265A及N297A，(jjj) D265A及N297G，(kkk) D270A，(lll) A330L，(mmm) P331A或P331S或(nnn) E233P，(ooo) L234A、L235E、G237A、A330S及P331S或(ppp)(a)至(ooo)之任何組合。在某些實施例中，降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能之該一或多個胺基酸殘基的變化包含根據EU編號之L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
免疫結合物之重鏈恆定區之變化可縮短免疫結合物之血清半衰期。在某些實施例中，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的胺基酸變化縮短該免疫結合物之血清半衰期。在某些實施例中，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的變化為選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之251、252、253、254、255、288、309、310、312、385、386、388、400、415、433、435、436、439、447，及其組合。在某些實施例中，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之253、254、310、435、436及其組合。在某些實施例中，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之I253A、I253D、I253P、S254A、H310A、H310D、H310E、H310Q、H435A、H435Q、Y436A及其組合。在某些實施例中，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之I253A、S254A、H310A、H435Q、Y436A及其組合。在某些實施例中，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之I253A、H310A、H435Q及其組合。在某些實施例中，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之H310A、H435Q及其組合。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 1中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 1一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 1中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中重鏈恆定區包含根據EU編號之I253A取代。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 2中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 2一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 2中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中重鏈恆定區包含根據EU編號之S254A取代。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 3中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 3一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 3中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中重鏈恆定區包含根據EU編號之H310A取代。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 4中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 4一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 4中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中重鏈恆定區包含根據EU編號之H435Q取代。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 5中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 5一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 5中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中重鏈恆定區包含根據EU編號之Y436A取代。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 6中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 6一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 6中所闡述之序列序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中重鏈恆定區包含根據EU編號之H310A/H435Q取代。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 7中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 7一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 7中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中重鏈恆定區包含根據EU編號之L234A、L235E、G237A、A330S及P331S取代。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 8中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 8一致之序列，其中重鏈恆定區包含根據EU編號之L234A、L235E、G237A、H310A、A330S及P331S取代。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 9中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 9一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 9一致之序列，其中重鏈恆定區包含根據EU編號之L234A、L235E、G237A、H435Q、A330S及P331S取代。
在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 10中所闡述之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物之重鏈恆定區包含根據EU編號與SEQ ID NO: 10一致之序列。
在一個實施例中，兩個變異恆定區中之每一者具有至少一個FcRn結合突變。在一個實施例中，兩個變異恆定區中之每一者具有相同FcRn結合突變。在一個實施例中，兩個變異恆定區中之每一者具有不同FcRn結合突變。
在一個實施例中，免疫結合物中之變異恆定區中之至少一者具有至少一個FcRn結合突變。在一個較佳實施例中，免疫結合物之兩個變異恆定區中之每一者具有至少一個FcRn結合突變，該等FcRn結合突變相同或不同。
實現FcRn結合之變化可縮短免疫結合物之血清半衰期，因此允許熟習此項技術者選擇適合於特定成像或治療目標之半衰期。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約12小時至約120小時。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約12小時至約24小時、約12小時至約36小時、約12小時至約48小時、約12小時至約60小時、約12小時至約72小時、約12小時至約84小時、約12小時至約96小時、約12小時至約108小時、約12小時至約120小時、約24小時至約36小時、約24小時至約48小時、約24小時至約60小時、約24小時至約72小時、約24小時至約84小時、約24小時至約96小時、約24小時至約108小時、約24小時至約120小時、約36小時至約48小時、約36小時至約60小時、約36小時至約72小時、約36小時至約84小時、約36小時至約96小時、約36小時至約108小時、約36小時至約120小時、約48小時至約60小時、約48小時至約72小時、約48小時至約84小時、約48小時至約96小時、約48小時至約108小時、約48小時至約120小時、約60小時至約72小時、約60小時至約84小時、約60小時至約96小時、約60小時至約108小時、約60小時至約120小時、約72小時至約84小時、約72小時至約96小時、約72小時至約108小時、約72小時至約120小時、約84小時至約96小時、約84小時至約108小時、約84小時至約120小時、約96小時至約108小時、約96小時至約120小時，或約108小時至約120小時。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時、約108小時，或約120小時。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為至少約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時，或約108小時。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為至多約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時、約108小時，或約120小時。
在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約1天至約10天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約1天至約2天、約1天至約3天、約1天至約4天、約1天至約5天、約1天至約6天、約1天至約7天、約1天至約8天、約1天至約9天、約1天至約10天、約2天至約3天、約2天至約4天、約2天至約5天、約2天至約6天、約2天至約7天、約2天至約8天、約2天至約9天、約2天至約10天、約3天至約4天、約3天至約5天、約3天至約6天、約3天至約7天、約3天至約8天、約3天至約9天、約3天至約10天、約4天至約5天、約4天至約6天、約4天至約7天、約4天至約8天、約4天至約9天、約4天至約10天、約5天至約6天、約5天至約7天、約5天至約8天、約5天至約9天、約5天至約10天、約6天至約7天、約6天至約8天、約6天至約9天、約6天至約10天、約7天至約8天、約7天至約9天、約7天至約10天、約8天至約9天、約8天至約10天，或約9天至約10天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為至少約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天或約9天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為至多約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天，或約10天。
在某些實施例中，重鏈恆定區的分子量為約10 kDa至約25 kDa。在某些實施例中，重鏈恆定區的分子量為約10 kDa至約15 kDa、約10 kDa至約20 kDa、約10 kDa至約25 kDa、約15 kDa至約20 kDa、約15 kDa至約25 kDa，或約20 kDa至約25 kDa。在某些實施例中，重鏈恆定區的分子量為約10 kDa、約15 kDa、約20 kDa或約25 kDa。在某些實施例中，重鏈恆定區的分子量為至少約10 kDa、約15 kDa或約20 kDa。在某些實施例中，重鏈恆定區的分子量為至多約15 kDa、約20 kDa或約25 kDa。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物包含連接子或鉸鏈區，其為本發明中將抗原結合區連接至重鏈恆定區或變異恆定區的多肽。連接免疫球蛋白組分之天然存在及合成鉸鏈區為此項技術中所熟知且可用於本發明中。舉例而言，參見US 8,067,548及其中之參考文獻。
在一個實施例中，免疫結合物之鉸鏈區相同。在一個實施例中，免疫結合物之鉸鏈區不同。
抗原結合區及重鏈恆定區(具有或不具有改變之胺基酸序列)可藉由適合之鉸鏈或連接子序列來連接。在某些實施例中，抗原結合區係藉由連接子胺基酸序列或人類IgG鉸鏈區與免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。適當IgG鉸鏈區包含且包括IgG1或IgG4鉸鏈區。在某些實施例中，鉸鏈區為IgG1鉸鏈區。在某些實施例中，鉸鏈區為具有根據EU編號之C220S取代的IgG1鉸鏈區。適合鉸鏈區包括以下中所述之鉸鏈區：Wu等人, 「Multimerization of a chimeric anti-CD20 single-chain Fv-Fc fusion protein is mediated through variable domain exchange,」 Protein Engineering, Design and Selection, 第14卷,第12期,2001年12月,第1025-1033頁；Shu等人「Secretion of a single-gene-encoded immunoglobulin from myeloma cells.」 Proceedings of the National Academy of Sciences1993年9月, 90 (17) 7995-7999；Davis等人,「Abatacept binds to the Fc receptor CD64 but does not mediate complement-dependent cytotoxicity or antibody-dependent cellular cytotoxicity.」 J Rheumatol. 2007年11月;34(11):2204-10。適當鉸鏈亦可包括基於非IgG之多肽連接子。連接子胺基酸序列可主要包括以下胺基酸殘基：Gly、Ser、Ala或Thr。連接子肽的長度應足以連接兩個分子，連接方式使得兩個分子相對於彼此呈現正確構形，因此保留所需活性。在一個實施例中，連接子長度為約1至50個胺基酸，或長度為約1至30個胺基酸。在一個實施例中，可使用長度為1至20個胺基酸之連接子。適用連接子包括甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n及(GGGS)n，其中n為至少一之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及其他可撓性連接子。用於連接抗體片段或單鏈可變片段之例示性連接子可包括AAEPKSS、AAEPKSSDKTHTCPPCP、GGGG或GGGGDKTHTCPPCP。替代地，各種非蛋白性聚合物，包括但不限於聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇及聚丙二醇之共聚物可用作連接子，亦即可能用作連接子。
免疫結合物之總尺寸可使得其促進組織穿透、穩定性及/或清除。在某些實施例中，免疫結合物之分子量為約60 kDa至約120 kDa。在某些實施例中，免疫結合物之分子量為約60 kDa至約65 kDa、約60 kDa至約70 kDa、約60 kDa至約75 kDa、約60 kDa至約80 kDa、約60 kDa至約90 kDa、約60 kDa至約100 kDa、約60 kDa至約110 kDa、約60 kDa至約120 kDa、約65 kDa至約70 kDa、約65 kDa至約75 kDa、約65 kDa至約80 kDa、約65 kDa至約90 kDa、約65 kDa至約100 kDa、約65 kDa至約110 kDa、約65 kDa至約120 kDa、約70 kDa至約75 kDa、約70 kDa至約80 kDa、約70 kDa至約90 kDa、約70 kDa至約100 kDa、約70 kDa至約110 kDa、約70 kDa至約120 kDa、約75 kDa至約80 kDa、約75 kDa至約90 kDa、約75 kDa至約100 kDa、約75 kDa至約110 kDa、約75 kDa至約120 kDa、約80 kDa至約90 kDa、約80 kDa至約100 kDa、約80 kDa至約110 kDa、約80 kDa至約120 kDa、約90 kDa至約100 kDa、約90 kDa至約110 kDa、約90 kDa至約120 kDa、約100 kDa至約110 kDa、約100 kDa至約120 kDa，或約110 kDa至約120 kDa。在某些實施例中，免疫結合物之分子量為約60 kDa、約65 kDa、約70 kDa、約75 kDa、約80 kDa、約90 kDa、約100 kDa、約110 kDa，或約120 kDa。在某些實施例中，免疫結合物之分子量為至少約60 kDa、約65 kDa、約70 kDa、約75 kDa、約80 kDa、約90 kDa、約100 kDa，或約110 kDa。在某些實施例中，免疫結合物之分子量為至多約65 kDa、約70 kDa、約75 kDa、約80 kDa、約90 kDa、約100 kDa、約110 kDa，或約120 kDa。
在一些實施例中，免疫結合物之分子量大於60、70、75、80、82、83、85、86、87、88或89 kDa。在一些實施例中，免疫結合物之分子量小於110、100、95、93、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81或80 kDa。在一些實施例中，免疫結合物之分子量大於60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79 kDa且小於110、100、95、93、91或90 kDa。
本文中所描述之免疫結合物及/或重鏈恆定區變異體的尺寸允許本文中所包括之免疫結合物的安全概況或治療指數增加。此類安全概況可反映在諸如腎臟及骨髓之放射敏感性主要組織中之輻射累積的減少及/或在目標組織(亦即，腫瘤或癌組織)或更多諸如肝臟之放射耐受性器官中之放射累積的增加。
在某些實施例中，本發明之免疫結合物導致每次治療之總輻射暴露，如以戈雷(Gray，Gy)來量測。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於20 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於19 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於18 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於17 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於16 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於15 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於14 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於13 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於12 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於11 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於10 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於9 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於8 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將腎臟暴露於5 Gy或更低。
在某些實施例中，本發明之免疫結合物導致每次治療之總輻射暴露，如以戈雷(Gy)來量測。在某些實施例中，每次治療將骨髓暴露於4 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將骨髓暴露於3 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將骨髓暴露於2 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將骨髓暴露於1.5 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將骨髓暴露於1.0 Gy或更低。在某些實施例中，每次治療將骨髓暴露於0.5 Gy或更低。
在某些實施例中，當以每公克注入劑量百分比量測時，與腎臟相比，本發明之免疫結合物導致腫瘤中的輻射量增加。在某些實施例中，每公克腫瘤注入劑量百分比與每公克腎臟注入劑量百分比之比率大於2: 1、3: 1、4: 1、5: 1、6: 1、7: 1、8: 1、9: 1或10: 1。
在某些實施例中，當以每公克注入劑量百分比量測時，與血液相比，本發明之免疫結合物導致腫瘤中的輻射量增加。在某些實施例中，每公克腫瘤注入劑量百分比與每公克血液注入劑量百分比之比率大於2: 1、3: 1、4: 1、5: 1、6: 1、7: 1、8: 1、9: 1或10: 1。
在某些實施例中，當以每公克注入劑量百分比量測時，與骨髓相比，本發明之免疫結合物導致腫瘤中的輻射量增加。在某些實施例中，每公克腫瘤注入劑量百分比與每公克骨髓注入劑量百分比之比率大於2: 1、3: 1、4: 1、5: 1、6: 1、7: 1、8: 1、9: 1或10: 1。
在某些實施例中，當以每公克注入劑量來量測時，與腎臟相比，本發明之免疫結合物導致肝臟中的輻射量增加。在某些實施例中，每公克腫瘤注入劑量百分比與每公克骨髓注入劑量百分比之比率大於3: 1、4: 1、5: 1、6: 1、7: 1、8: 1、9: 1或10: 1。
在一些實施例中，本發明涵蓋包含一種包含Fc區之本發明免疫結合物的變異體，其中該變異體具有一些但並非所有效應功能，此使得其成為免疫結合物活體內半衰期至關重要而某些效應功能((諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用的所需候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保免疫結合物缺乏FcγγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於調節ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγγRIII，而單核細胞表現FcγγRI、FcγγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)之第464頁之表3中。評定所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於以下中：US 5,500,362 (參見例如Hellstrom, I .等人Proc Natl Acad Sci USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人, Proc Natl Acad Sci USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見Bruggemann, M.等人, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI)。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型中，諸如Clynes等人Proc Natl Acad Sci USA 95: 652-656 (1998)中所揭示之動物模型中活體內評定所關注分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合分析以確認免疫結合物不能結合Clq且因此缺乏CDC活性(參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA)。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人, Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(參見例如Petkova, S.B.等人, Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006))。
具有降低之效應功能的免疫結合物包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的免疫結合物(US 6,737,056)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩處或更多處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(US 7,332,581)。
免疫結合物可具有改變之效應功能，包含以下變化：根據EU編號之L234A、L235E、G237A、A330S及P331S，該等變化減少Fc受體結合。參見例如US 8,613,926或Andersson C, Wenander等人,「Rapid-onset clinical and mechanistic effects of anti-C5aR treatment in the mouse collagen-induced arthritis model.」 Clin Exp Immunol. 2014年7月;177(1):219-33。
描述具有改良或降低之與FcR之結合的某些免疫結合物變異體(參見例如US 6,737,056；WO 2004/056312；Shields等人, J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001))。
在一些實施例中，在Fc區中產生使得Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即改良或降低)之變化，例如如US 6,194,551、WO 1999/051642；Idusogie等人 J. Immunol.164: 4178-4184 (2000)中所描述。
半衰期增加且與負責母本IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)之結合改良的抗體(Guyer等人, J. Immunol. 117:587 (1976)；Kim等人, J. Immunol. 24:249 (1994))描述於US2005/0014934中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該一或多個取代改良Fc區與FcRn的結合。此類Fc變異體包括在以下Fc區殘基：434或435中之一或多者處具有取代之彼等變異體，例如Fc區殘基之取代N434A或R435A (US 7,371,826)。關於Fc區變異體之其他實例亦參見Duncan及Winter, Nature 322:738-40 (1988)；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 1994/029351。
為了增加抗體之血清半衰期，可以將救助受體結合表位併入抗體(尤其是抗體片段)中，如例如美國專利5,739,277中所述。如本文所用之術語「救助受體結合表位」係指負責增加IgG分子之活體內血清半衰期之IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區之表位。
如一般熟習此項技術者將認識到，本文之某些教示適用於本發明之抗體構築體、標靶成像複合物、免疫結合物及放射性免疫結合物，儘管本文中提及僅一種或兩種此類組合物(例如免疫結合物)作為非限制性實例。本發明包涵所有此類申請案。 螯合劑
如本文所述，螯合劑可與免疫結合物、抗原結合區/免疫球蛋白重鏈恆定區分子、VHH抗原結合區/免疫球蛋白重鏈恆定區分子(野生型或變異體)、VHH抗原結合區/免疫球蛋白Fc分子(野生型或變異體)偶合。螯合劑允許免疫結合物負載有適當放射性同位素，諸如β發射體或α發射體。螯合劑可藉由抗原結合區、重鏈恆定區、免疫球蛋白Fc區或其任何組合與免疫結合物偶合。此類偶合可適當地藉由共價附接至免疫結合物之一或多個胺基酸、抗原結合區、重鏈恆定區、免疫球蛋白Fc區或其任何組合來進行。
在一個實施例中，免疫結合物之螯合劑共價鍵聯至抗原結合區、重鏈恆定區、免疫球蛋白Fc區或其任何組合。在一個實施例中，螯合劑直接共價鍵聯至抗原結合區、重鏈恆定區、免疫球蛋白Fc區或其任何組合(例如不使用間隔子、延伸子或連接子)。在一個實施例中，螯合劑經由共價鍵聯至螯合劑且共價鍵聯至抗原結合臂的連接子共價鍵聯至抗原結合臂。在一個實施例中，連接子為親水性的(例如PEG鏈)。在一個實施例中，連接子為疏水性的(例如烷基或烯烴鏈)。螯合劑可如Sadiki,A.等人「Site-specific conjugation of native antibody.」 Antibody Therapeutics2020, 3, 271-284中所述鍵聯或偶合至免疫結合物。
在一些實施例中，免疫結合物經由螯合劑-連接子以導入特定胺基酸或聚醣殘基中之位點特異性方式連接而形成。在一些實施例中，位點特異性結合涉及用螯合劑-連接子對構架區中之特定離胺酸殘基進行定向官能化。在其他實施例中，此殘基可經不同反應性官能基官能化，接著在第二步驟中與螯合劑-連接子反應，得到免疫結合物。在一些實施例中，此反應性官能基為硫代丙酸酯。
在一些實施例中，非原生半胱胺酸殘基經工程化至抗體之構架中作為硫醇定向結合之位點，得到免疫結合物。在一些實施例中，其他非天然胺基酸或胺基酸序列經工程化至構架中以充當螯合劑-連接子或第二反應性基團之連接位點，接著結合螯合劑-連接子以得到免疫結合物。
在一些實施例中，含有交聯基團之非天然胺基酸經工程化至構架中以連接螯合劑-連接子。在一些實施例中，此非天然胺基酸含有疊氮基。
在一些實施例中，螯合劑-連接子經由轉麩醯胺酸酶之作用連接至麩醯胺酸殘基。在其他實施例中，第二反應性基團係藉由轉麩醯胺酸酶連接，接著添加螯合劑-連接子，得到免疫結合物。
在一些實施例中，經由糖苷酶作用用反應性官能基修飾一或多種N-聚糖來連接螯合劑-連接子，接著使螯合劑-連接子與該位點結合。在一些實施例中，經由β-半乳糖苷酶之作用修飾聚糖。在一些實施例中，聚糖經醣苷修飾，該糖苷含有疊氮基以連接適當官能化之螯合劑-連接子。
在一個實施例中，免疫結合物包含超過一種相同或不同的螯合劑。
在一個實施例中，具有超過一種螯合劑之免疫結合物具有超過一種螯合劑連接至相同抗原結合臂。
在一個實施例中，具有超過一種螯合劑且少於十一種螯合劑之免疫結合物具有超過兩種螯合劑、超過三種螯合劑、超過四種螯合劑、超過五種螯合劑、超過六種螯合劑、超過七種螯合劑、超過八種螯合劑或超過九種螯合劑。在一個實施例中，螯合劑相同。在一個實施例中，各抗原結合臂直接地或間接地鍵聯至超過一種螯合劑。
在一個實施例中，螯合劑包含放射性同位素螯合組分及允許共價附接至抗原結合臂之官能基。在一個實施例中，官能基直接連接至放射性同位素螯合組分。在一個實施例中，螯合劑進一步包含官能基與放射性同位素螯合組分之間的連接子。
在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含DOTA或DOTA衍生物。在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含DOTAGA。在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含macropa或macropa衍生物。在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含Py4Pa或Py4Pa衍生物。
在一較佳實施例中，免疫結合物之螯合劑不連接至免疫結合物之抗原結合臂中之抗原結合區。
在一個實施例中，免疫結合物之螯合劑與抗原結合臂非共價締合。在一較佳實施例中，螯合劑不與免疫結合物之抗原結合臂中的抗原結合區締合。
在一個實施例中，螯合劑包含DOTA或DOTA衍生物。在一個實施例中，螯合劑包含DOTAGA。在一個實施例中，螯合劑包含macropa或macropa衍生物。在一個實施例中，螯合劑包含Py4Pa或Py4Pa衍生物。在一個實施例中，螯合劑包含賽特羅卡林或賽特羅卡林衍生物。
在某些實施例中，本文描述與螯合劑偶合之免疫結合物。在某些實施例中，螯合劑為放射性同位素螯合劑。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑係選自由以下組成之清單：四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、α-(2-羧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTAGA)或(Py4Pa)。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑為DOTA。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑為DOTAGA。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑為Py4Pa。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑直接與該抗原結合區及/或該免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑係藉由連接子與抗原結合區或免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，連接子係選自：6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(MC)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(MP)、纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(ala-phe)、對-胺基苄氧基羰基(PAB)，以及由與如下連接子試劑結合產生的彼等：形成4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯之連接部分4-巰基戊酸(SPP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二醯亞胺酯(SPDB)、(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯(SIAB)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇聚合物(PEGn)及S-2-(4-異硫氰基苄基)(SCN)。在某些實施例中，連接子係選自：聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇聚合物(PEG)及S-2-(4-異硫氰基苄基)(SCN)。在某些實施例中，連接子為PEG5。在某些實施例中，連接子為SCN。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑為選自由以下組成之清單的連接子-螯合劑：FP-Ad-PEG5-DOTAGA、p-SCN-Bn-DOTA、p-SCN-Ph-Et-Py4Pa及TFP-Ad-PEG5-Ac-Py4Pa。
螯合劑可以一定蛋白質或抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區之比率結合。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑以1: 1至8: 1之比率與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑以1: 1至6: 1之比率與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑以2: 1至6: 1之比率與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物包含諸如使抗原結合臂與螯合劑(chelating agent)(可互換地，「螯合劑(chelator)」)或放射性同位素或與載物(例如細胞毒素)連接的連接子。連接子可包含一或多種連接子組分。在一些實施例中，本發明之免疫結合物經工程化以具有可供結合至螯合劑或連接子之末端離胺酸。
舉例而言，雙官能螯合劑用於使放射性同位素結合至本發明之放射性同位素遞送平台以形成本發明之免疫結合物。(參見例如Scheinberg D, McDevitt M, Curr Radiopharm4: 306-20 (2011))。此項技術中已知之雙官能螯合劑之實例包括DOTA、DTPA、DO3A-NHS、DOTAGA-NHS、DOTAGA-酸酐DOTAGA-TFP、p-SCN-Bn-DOTA、p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-Bn-CHX'A''-DTPA、p-SCN-Bn-TCMC、macropa-NCS、crown、p-SCN-Ph-Et-Py4Pa、3,2-HOPO及TCMC。
雙官能螯合劑之實例為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二伸乙三胺五乙酸(DTPA)及前述之相關類似物。此類螯合劑適用於配位金屬離子，如α-及β-發射放射性核種。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物之螯合劑係選自包含以下之群：雙官能螯合劑、DOTA、DO3A-NHS、DOTAGA-NHS、DOTAGA-酸酐DOTAGA-TFP、p-SCN-Bn-DOTA、p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-Bn-CHX-A''-DTPA、p-SCN-Bn-TCMC、macropa-NCS (Thiele NA等人Angew. Chem.國際版56:1 (2017))、crown (Yang H等人Chem. Eur.J. 26:11435 (2020))、P-SCN-Ph-Et-Py4Pa (Li L等人Bioconjugate Chem. ASAP (2020))、3,2-HOPO (Wickstroem K等人Int. J. Rad. Onc. Biol. Phys. 105:410 (2019)) (關於此等及其他雙官能螯合劑之評述，參見例如Price EW and Orvig C Chem. Soc. Rev., 2014, 43:260 (2014)及Brechbiel MW Q. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 52:166 (2008))。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物之螯合劑係選自由以下組成之群：雙官能螯合劑、DOTA、DO3A-NHS、DOTAGA-NHS、DOTAGA-酸酐DOTAGA-TFP、p-SCN-Bn-DOTA、p-SCN-Bn-DTPA、p-SCN-Bn-CHX-A''-DTPA、p-SCN-Bn-TCMC、macropa-NCS (Thiele NA等人Angew. Chem. 國際版56:1 (2017))、crown (Yang H等人Chem. Eur.J. 26:11435 (2020))、P-SCN-Ph-Et-Py4Pa (Li L等人Bioconjugate Chem. ASAP (2020))、3,2-HOPO (Wickstroem K等人Int. J. Rad. Onc. Biol. Phys. 105:410 (2019)) (關於此等及其他雙官能螯合劑之評述，參見例如Price EW and Orvig C Chem. Soc. Rev., 2014, 43:260 (2014)及Brechbiel MW Q. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 52:166 (2008))。
對於225-Ac免疫結合物，此項技術中已知多種非環狀及環狀配位體作為適合螯合劑(參見例如Davis I, 等人, Nucl Med Biol26: 581 (1999)；Chappell L, 等人, Bioconjug Chem11: 510 (2000)；Chappell, L, 等人, Nucl Med Biol30: 581 (2003)；McDevitt M, 等人, Appl Radiat Isot57: 841 (2002)；Gouin S, 等人, Org Biomol Chem3: 453 (2005)；Thiele N, 等人, Angew Chem Int Ed Engl56: 14712 (2017))。
在某些實施例中，螯合劑為適合於α發射體螯合之螯合劑。一些適用於α發射體之螯合劑描述於Yang等人「Harnessing α-Emitting Radionuclides for Therapy: Radiolabeling Method Review.」 J Nucl Med.2022年1月;63(1):5-13中。
在某些實施例中，適合於α發射體螯合之螯合劑係選自由以下組成之清單：DOTA 1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1 ,4,7,10-四乙酸；DO3A 1,4,7-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷；DOTAGA α-(2-羧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸；DOTAGA酸酐(2,2',2"-(10-(2,6-二側氧基四氫-2H-哌喃-3-基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1 ,4,7-三基)三乙酸；Py4Pa 6,6',6'',6'''-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))雙(氮烷三基))四(亞甲基))吡啶四甲酸；Py4Pa-NCS為6,6'-((((4-異硫氰基吡啶-2,6-二基)雙(亞甲基))雙((羧基甲基)氮烷二基))雙(亞甲基))吡啶二甲酸；Crown 2,2',2'',2'''-(1,10-二氧雜-4,7,13,16-四氮雜環十八烷-4,7,13,16-四基)四乙酸；Macropa 6,6'-((1,4,10,13-四氧雜-7,16-二氮雜環十八烷-7,16-二基)雙(亞甲基))吡啶二甲酸；Macropa-NCS 6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧雜-7,16-二氮雜環十八烷-7-基)甲基)-4-異硫氰基吡啶甲酸；HEHA 1,4,7,10,13,16-六氮雜環十六烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸；CHXoctapa 6,6'-[(1R,2R)-1,2-環己烷二基雙[[(羧基甲基)亞胺基]亞甲基]]雙[2-吡啶羧酸]；Bispa 3,7-二氮雜雙環[3.3.1]壬烷-1,5-二羧酸，7-[(6-羧基-2-吡啶基)甲基]-9-羥基-3-甲基-2,4-二-2-吡啶基-, 1,5-二甲酯；Noneunpa 6,6'-(((氧基雙(乙烷-2,1-二基))雙((羧基甲基)氮烷二基))雙(亞甲基))吡啶二甲酸；及其組合。
在某些實施例中，螯合劑為適合於β-或γ-發射體螯合之螯合劑。在某些實施例中，適合於β-或γ-發射體螯合之螯合劑係選自由以下組成之清單：DOTMA (1R,4R,7R,10R)-a, a', a", a"'-四甲基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸DOTAM (1,4,7,10-四(胺甲醯基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷)；DOTPA 1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四丙酸；DO3AM-乙酸(2-(4,7,10-三(2-胺基-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基)乙酸)；DOTP 1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四(亞甲基膦酸)；DOTMP 1,4,6,10-四氮雜環癸烷-1,4,7,10-四亞甲基膦酸；DOTA-4AMP 1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四(乙醯胺基-亞甲基膦酸)；CB-TE2A (1,4,8,11-四氮雜雙環[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸)；NOTA 1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸；NOTP 1,4,7-三氮雜環壬烷-1 ,4,7-tri(亞甲基膦酸)；TETPA 1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四丙酸；TETA 1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四乙酸；PEPA 1,4,7,10,13-五氮雜環十五烷-Ν,Ν',Ν'',Ν'",N""-五乙酸；H4Octapa Ν,Ν'-雙(6-羧基-2-吡啶基甲基)-乙二胺-N,N'-二乙酸；H2Dedpa 1,2-[[6-(羧基)-吡啶-2-基]-甲基胺基]乙烷；H6phospa Ν,Ν'- (亞甲基膦酸酯)-N,N'-[6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基]-甲基-1 ,2-二胺基乙烷；TTHA 三伸乙四胺-Ν,Ν,Ν',Ν'',Ν'",N"'-六乙酸；DO2P 四氮雜環十二烷二甲烷膦酸；HP-DO3A 羥基丙基四氮雜環十二烷三乙酸；EDTA乙二胺四乙酸；DTPA 二伸乙三胺五乙酸；DTPA-BMA 二伸乙三胺五乙酸-雙甲基醯胺；HOPO 八齒羥基吡啶酮；3,2,3-LI(HOPO) N,N'-(丁烷-1,4-二基)雙(1-羥基-N-(3-(1-羥基-6-側氧基-1,6-二氫吡啶-2-羧醯胺)丙基)-6-側氧基-1,6-二氫吡啶-2-羧醯胺)；3,2-HOPO N,N'-(((2-(4-胺基苄基)-3-((2-(3-羥基-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-羧醯胺)乙基)(2-(3-羥基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-羧醯胺)乙基)胺基)丙基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基))雙(3-羥基-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-羧醯胺)；Neunpa 6,6'-(((氮烷二基雙(乙烷-2,1-二基))雙((羧基甲基)氮烷二基))雙(亞甲基))吡啶二甲酸；Neunpa-NCS = 6,6'-(((((4-異硫氰基苯乙基)氮烷二基)雙(乙烷-2,1-二基))雙((羧基甲基)氮烷二基))雙(亞甲基))吡啶二甲酸；Octapa 6,6'-((乙烷-1,2-二基雙((羧基甲基)氮烷二基))雙(亞甲基))吡啶二甲酸；Octox 2,2'-(乙烷-1,2-二基雙(((8-羥基喹啉-2-基)甲基)氮烷二基))二乙酸；PyPa 6,6'-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))雙((羧基甲基)氮烷二基))雙(亞甲基))吡啶二甲酸；卟啉(Porphyrin) 21,22,23,24-四氮雜五環[16.2.1.13,6.18,11.113,16]二十四碳-1,3,5,7,9,11(23),12,14,16,18(21),19-十一烯；去鐵胺(Deferoxamine)30-胺基-3,14,25-三羥基-3,9,14,20,25-五氮雜三十烷-2,10,13,21,24-戊酮；DFO* N1-[5-(乙醯基羥基胺基)戊基]-N26-(5-胺基戊基)-N26,5,16-三羥基-4,12,15,23-四側氧基-5,11,16,22-四氮雜二十六烷二醯胺；及其組合。
或者或另外，可使用異硫氰酸酯連接子，諸如p-SCN-Bn-DOTA，涉及本發明之免疫結合物內之離胺酸殘基。
例示性連接子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(「MC」)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」或「vc」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對-胺基苄氧基羰基(「PAB」)，以及由與連接子試劑結合產生的彼等：形成4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯之連接部分4-巰基戊酸(「SPP」)、形成4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1甲酸N-丁二醯亞胺酯之連接部分4-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)甲基)環己烷甲酸(「SMCC」，在本文中亦稱作「MCC」)、形成4-(吡啶2-基二硫烷基)丁酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯之連接部分4-巰基戊酸(「SPDB」)、(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯(「SIAB」)、作為一或多個重複單元之伸乙基氧基-CH 2CH 2O-(「EO」、「PEO」或「PEG」)。其他連接子組分在此項技術中已知且一些描述於本文中。各種連接子組分為此項技術中已知，其中一些在下文中描述。
在某些實施例中，連接子為SCN。在某些實施例中，螯合劑為選自由以下組成之清單的連接子-螯合劑：FP-Ad-PEG5-DOTAGA、p-SCN-Bn-DOTA、p-SCN-Ph-Et-Py4Pa及TFP-Ad-PEG5-Ac-Py4Pa。在某些實施例中，螯合劑為TFP-Ad-PEG5-DOTAGA。在某些實施例中，螯合劑為p-SCN-Bn-DOTA。在某些實施例中，螯合劑為p-SCN-Ph-Et-Py4Pa。在某些實施例中，螯合劑為TFP-Ad-PEG5-Ac-Py4Pa。此類連接子展示於 圖 18中。
連接子可為有助於藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子(例如腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari等人, Cancer Research52: 127-31(1992)；美國專利第5,208,020號)。
在某些實施例中，連接子如下式(式I)中所示：
Figure 02_image001
其中A為延伸子單元，且a為0至1之整數；W為胺基酸單元，且w為0至12之整數；Y為間隔子單元，且y為0、1或2；且Ab、D及p如上文針對式I所定義。此類連接子之例示性實施例描述於US 20050238649中。
在一些實施例中，連接子組分可包含將免疫結合物連接至另一連接子組分或藥物部分之「延伸子單元」。例示性延伸子單元如下展示(其中波浪線指示與免疫結合物共價附接之位點)：
Figure 02_image003
Figure 02_image005
。
在一些實施例中，連接子可經由半胱胺酸橋接官能基(諸如ThioBridge®或DBM(二溴順丁烯二醯亞胺))與抗體結合。此等連接子可用以在還原及結合之後使鏈內二硫鍵再穩定(Bird M, 等人, Antibody-Drug Conjugates第113-129頁 (2019)及Behrens CR等人Mol. Pharmaceutics 12:3986 (2015))。例示性再橋接延伸子單元如下展示(其中波浪線指示與免疫結合物共價附接之位點)：
Figure 02_image007
在一些實施例中，連接子組分可包含胺基酸單元。在一些此類實施例中，胺基酸單元允許連接子藉由蛋白酶裂解，藉此在暴露於諸如溶酶體酶之細胞內蛋白酶時促進藥物自免疫結合物釋放(參見例如Doronina等人(2003) Nat.Biotechnol.21:778-4)。例示性胺基酸單元包括但不限於二肽、三肽、四肽及五肽。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)；苯丙胺酸-離胺酸(fk或phe-lys)；或N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。例示性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。胺基酸單元可包含天然存在之胺基酸殘基，以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。可以設計且最佳化胺基酸單元對特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D，或胞漿素蛋白酶)之酶促裂解的選擇性。
在一些實施例中，連接子組分可包含將免疫結合物直接或藉助於延伸子單元及/或胺基酸單元連接至藥物部分的「間隔子」單元。間隔子單元可為「自分解型」或「非自分解型」。「非自分解型」間隔子單元為在ADC酶促(例如蛋白分解)裂解時部分或所有間隔子單元仍然結合於藥物部分之間隔子單元。非自分解型間隔子單元之實例包括但不限於甘胺酸間隔子單元及甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。亦涵蓋對序列特異性酶促裂解敏感之肽間隔子之其他組合。例如，含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單元之ADC藉由腫瘤細胞相關蛋白酶進行酶促裂解，使得甘胺酸-甘胺酸-藥物部分自ADC之其餘部分釋放。在一個此類實施例中，甘胺酸-甘胺酸-藥物部分在腫瘤細胞中進行獨立水解步驟，因此自藥物部分裂解甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。
「自分解型」間隔子單元允許在無獨立水解步驟之情況下釋放藥物部分。在某些實施例中，連接子之間隔子單元包含對-胺基苄基單元。在一個此類實施例中，對-胺基苄醇經由醯胺鍵連接至胺基酸單元，且在苄醇與細胞毒性劑之間生成胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯或碳酸酯(參見例如Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents(2005) 15: 1087-103。在一個實施例中，間隔子單元為對-胺基苄氧基羰基(PAB)。在某些實施例中，對-胺基苄基單元之伸苯基部分經Qm取代，其中Q為C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；且m為在0-4範圍內之整數。自分解型間隔子單元之實例包括但不限於以電子學方式類似於對胺基苄醇(參見例如US 2005/0256030 A1)之芳族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等人(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett.9:2237)及鄰-或對-胺基苄基縮醛。可使用在醯胺鍵水解時經受環化之間隔子，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人, Chemistry Biology, 1995, 2, 223)、經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人, J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94: 5815)及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人, J. Org. Chem., 1990, 55: 5867)。在甘胺酸之a位置處經取代的含胺藥物之消除(Kingsbury等人， J. Med. Chem.,1984, 27:1447)亦為可用於ADC之自分解型間隔子的實例。
在一個實施例中，間隔子單元為如下文所描繪之分支鏈雙(羥甲基)苯乙烯(BHMS)單元，其可用於併入及釋放多種藥物。
Figure 02_image009
其中Q為-C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m為在0至4範圍內之整數；n為0或1；且p在1至約20範圍內。
在一些實施例中，免疫結合物包含連接子，諸如樹突型連接子，用於經由分支、多官能連接部分將超過一種藥物部分共價附接至抗體(Sun等人(2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters12:2213-5；Sun等人(2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry11:1761-8)。樹突狀連接子可增加藥物與抗體之莫耳比，亦即負載，其與ADC效力有關。因此，在半胱胺酸工程化抗體僅僅載有一個反應性半胱胺酸硫醇基的情況下，可經由樹突狀連接子連接多個藥物部分。
連接子組分及其組合之實例展示如下，其亦適用於上式：
Figure 02_image011
Val-Cit或VC
Figure 02_image013
MC-val-cit
Figure 02_image015
MC-val-cit-PAB
連接子之額外非限制性實例包括WO 2015095953中所描述之彼等。
包括延伸子、間隔子及胺基酸單元之連接子組分可藉由此項技術中已知之方法合成，諸如US 20050238649中所述之彼等方法。 f.本發明之免疫結合物之變化 放射性免疫結合物
在一個實施例中，本發明提供免疫結合物。在一個實施例中，在如此標記、鍵聯或負載有α-發射體時，免疫結合物能夠活體內遞送α-發射體。在一個實施例中，在如此標記、鍵聯或負載時，免疫結合物亦能夠活體內遞送其他放射性同位素(β-發射體及/或ɣ-發射體)及/或其他原子。在一個實施例中，在如此標記、鍵聯或負載時，免疫結合物能夠活體內遞送成像金屬(例如111-In、89-Zr、64-Cu、68-Ga或134-Ce)。
本發明之免疫結合物可負載有放射性同位素以實現治療或診斷作用。在某些實施例中，螯合劑可進一步包含放射性同位素。在某些實施例中，放射性同位素為α發射體。在某些實施例中，放射性同位素為選自由以下組成之清單的α發射體：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。在某些實施例中，放射性同位素為225-Ac。在某些實施例中，放射性同位素為β發射體。在某些實施例中，放射性同位素為選自177-Lu、90-Y、67-Cu及153-Sm之β發射體。
本文亦描述一種製備放射性免疫結合物的方法，其包含將本發明之免疫結合物負載或複合至放射性同位素。在某些實施例中，放射性同位素為α發射體。在某些實施例中，放射性同位素為選自由以下組成之清單的α發射體：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。在某些實施例中，放射性同位素為225-Ac。在某些實施例中，放射性同位素為β發射體。在某些實施例中，放射性同位素為選自177-Lu、90-Y、67-Cu及153-Sm之β發射體。
在一個態樣中，本發明提供一種放射性免疫結合物，其包含本發明之免疫結合物及α-發射放射性同位素。在一個實施例中，放射性免疫結合物之α-發射放射性同位素係選自包含以下之群：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。在一個實施例中，α-發射放射性同位素係選自由以下組成之群：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。在一個實施例中，放射性免疫結合物之α-發射放射性同位素為225-Ac。在一個實施例中，放射性免疫結合物之α-發射放射性同位素為223-Ra。在一個實施例中，放射性免疫結合物之α-發射放射性同位素為224-Ra。在一個實施例中，放射性免疫結合物之α-發射放射性同位素為227-Th。在一個實施例中，放射性免疫結合物之α-發射放射性同位素為212-Pb。在一個實施例中，放射性免疫結合物之α-發射放射性同位素為212-Bi。在一個實施例中，放射性免疫結合物之α-發射放射性同位素為213-Bi。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物與放射性同位素組合以提供本發明之放射性免疫結合物。在一些實施例中，放射性同位素為225-Ac、86-Y、90-Y、177-Lu、186-Re、188-Re、89-Sr、153-Sm、213-Bi、213-Po、212-Bi、223-Ra、224-Ra、227-Th、149-Tb、68-Ga、64-Cu、67-Cu、89-Zr、137-Cs、212-Pb或103-Pd。在一些實施例中，放射性同位素為α發射體，諸如225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。在一些實施例中，放射性同位素為β粒子發射體，諸如177-Lu、90-Y、67-Cu、153-Sm。在一些實施例中，放射性同位素為α粒子發射體與β及/或γ粒子發射體兩者。在一些實施例中，放射性同位素為β粒子發射體與γ粒子及/或光子發射體兩者。在一些實施例中，放射性免疫結合物經α-發射體與β-發射體二者標記、鍵聯或負載，且因此包含α-發射體與β-發射體兩者。在一些實施例中，選擇用於放射性成像之放射性同位素，諸如選自68-Ga、64-Cu、89-Zr、111-In、134-Ce中。
本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物除放射性同位素以外，可包含其他載物或有效負載，包括各種細胞毒性劑，諸如小分子化學治療劑、細胞毒性抗生素、烷基化劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑及/或微管蛋白抑制劑。舉例而言，本發明之免疫結合物可用於將非放射性同位素細胞毒素遞送至目標細胞。細胞毒性劑之非限制性實例包括氮丙啶(aziridine)、順鉑(cisplatin)、四𠯤(tetrazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、長春花生物鹼(vinca alkaloids)、紫杉烷(taxane)、喜樹鹼(camptothecin)、依託泊苷(etoposide)、小紅莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、替尼泊苷(teniposide)、新生黴素(novobiocin)、阿克拉黴素(aclarubicin)、蒽環黴素(anthracycline)、放射菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)、絲裂黴素(mitomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、艾達黴素(idarubicin)、海兔毒素(dolastatins)、美登素(maytansine)、多西他賽(docetaxel)、阿德力黴素(adriamycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、奧瑞他汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)、卡鉑、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(capecitabine)、絲裂黴素C、紫杉醇(paclitaxel)、1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(BCNU)、立複黴素(rifampicin)、順鉑、甲胺喋呤(methotrexate)及吉西他濱(gemcitabine)。
在一些實施例中，本發明之放射性免疫結合物包含選自包含以下之群的放射性同位素：225-Ac、86-Y、90-Y、177-Lu、186-Re、188-Re、89-Sr、153-Sm、213-Bi、213-Po、211-At、212-Bi、223-Ra、224-Ra、227-Th、149-Tb、68-Ga、64-Cu、67-Cu、89-Zr、137-Cs、212-Pb及103-Pd。
在一些實施例中，本發明之放射性免疫結合物包含選自由以下組成之群的放射性同位素：225-Ac、86-Y、90-Y、177-Lu、186-Re、188-Re、89-Sr、153-Sm、213-Bi、213-Po、211-At、212-Bi、223-Ra、224-Ra、227-Th、149-Tb、68-Ga、64-Cu、67-Cu、89-Zr、137-Cs、212-Pb及103-Pd。
在一些實施例中，放射性同位素為發射α-粒子的放射性同位素，包含225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi或213-Bi。
在一些實施例中，放射性同位素為選自由以下組成之群的發射α-粒子的放射性同位素：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。
免疫結合物、抗原結合區及重鏈可變區之其他實施例描述如下：
在一些實施例中，免疫結合物包含二聚域或模體。在一些其他實施例中，二聚域或模體處於變異恆定區、連接子或鉸鏈區中。
習此相關技藝之人士可使用此項技術中已知之做法及方法對本發明之多聚免疫結合物進行工程化。舉例而言，工程化半胱胺酸殘基可形成共價鍵，藉此使自發組裝之多聚結構穩定(參見例如Glockshuber R等人， Biochemistry29: 1362-7(1990))。舉例而言，在特定位置引入半胱胺酸殘基可用於產生二硫鍵穩定化結構，如Cys-雙功能抗體、scFv'多聚體、VHH多聚體、VNAR多聚體及IgNAR多聚體，諸如藉由添加以下胺基酸殘基：GGGGC及SGGGGC (Tai M等人, Biochemistry29: 8024-30 (1990)；Caron P等人, J Exp Med176: 1191-5 (1992)；Shopes B, J Immunol 148: 2918-22 (1992)；Adams G等人, Cancer Res53: 4026-34 (1993)；McCartney J等人, Protein Eng18: 301-14 (1994)；Perisic O等人, Structure2: 1217-26 (1994)；George A等人, Proc Natl Acad Sci USA92: 8358-62 (1995)；Tai M等人, Cancer Res (Suppl)55: 5983-9 (1995)；Olafsen T等人, Protein Eng Des Sel17: 21-7 (2004))。
或者，兩個或更多個多肽鏈可使用彼此自締合或多聚化之多肽域鍵聯在一起(參見例如US 6,329,507)。舉例而言，添加羧基末端多聚化域已用於構築包含諸如scFv、自主V H域、V HH、V NAR及IgNAR之免疫球蛋白域的多價蛋白質。習此相關技藝之人士已知的自締合域之實例包括免疫球蛋白恆定域(諸如旋鈕入孔(knobs-into-holes)、靜電轉向及IgG/IgA股交換)、免疫球蛋白Fab鏈(例如(Fab-scFv) 2及(Fab'scFv) 2)、免疫球蛋白Fc域(例如，(sc雙功能抗體-Fc) 2、(scFv-Fc) 2及scFv-Fc-scFv)、免疫球蛋白CHX域、免疫球蛋白CH1-3區、免疫球蛋白CH3域(例如，(sc雙功能抗體-CH3) 2、LD微型抗體及Flex-微型抗體)、免疫球蛋白CH4域、CHCL域、兩親螺旋束(例如，scFv-HLX)、螺旋-轉角-螺旋域(例如，scFv-dHlx)、包括白胺酸拉鏈及軟骨寡聚基質蛋白的捲曲螺旋結構(例如scZIP)、與A激酶錨定蛋白(AKAP)錨定域(AD)組合之cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)二聚化及對接域(DDD)(亦稱為「對接鎖定(dock-and-lock)」或「DNL」)、卵白素(streptavidin)、維羅毒素(verotoxin)B多聚化域、來自p53之四聚化區及barnase-barstar交互域(Pack P, Plückthun A, Biochemistry31: 1579-84 (1992)；Holliger P等人, Proc Natl Acad Sci USA90: 6444-8 (1993)；Kipriyanov S等人, Hum Antibodies Hybridomas6: 93-101 (1995)；de Kruif J, Logtenberg T, J Biol Chem271: 7630-4 (1996)；Hu S等人, Cancer Res56: 3055-61 (1996)；Kipriyanov S等人, Protein Eng9: 203-11 (1996)；Rheinnecker M等人, J Immunol157: 2989-97 (1996)；Tershkikh A等人, Proc Natl Acad Sci USA94: 1663-8 (1997)；Müller K等人, FEBS Lett422: 259-64 (1998)；Cloutier S等人, Mol Immunol37: 1067-77 (2000)；Li S等人, Cancer Immunol Immunother49: 243-52 (2000)；Schmiedl A等人, Protein Eng13: 725-34 (2000)；Schoonjans R等人, J Immunol165: 7050-7 (2000)；Borsi L等人, Int J Cancer102: 75-85 (2002)；Deyev S等人, Nat Biotechnol21: 1486-92 (2003)；Wong W, Scott J, Nat Rev Mol Cell Biol5: 959-70 (2004)；Zhang J等人, J Mol Biol335: 49-56 (2004)；Baillie G等人, FEBS Letters579: 3264-70 (2005)；Rossi E等人, Proc Natl Acad Sci USA103: 6841-6 (2006)；Simmons D等人, J Immunol Methods315: 171-84 (2006)；Braren I等人, Biotechnol Appl Biochem47: 205-14 (2007)；Chang C等人, Clin Cancer Res13: 5586-91s (2007)；Liu M等人, Biochem J406: 237-46 (2007)；Zhang J等人, Protein Expr Purif65: 77-82 (2009)；Bell A等人, Cancer Lett289: 81-90 (2010)；Iqbal U等人, Br J Pharmacol160: 1016-28 (2010)；Asano R等人, FEBS J280: 4816-26 (2013)；Gil D, Schrum A, Adv Biosci Biotechnol4: 73-84 (2013))。
習此相關技藝之人士可使用此項技術中已知之各種基於scFv之多肽相互作用來工程化本發明之多聚免疫結合物，諸如基於scFv之二聚、三聚、四聚複合物等。舉例而言，scFv中連接子之長度可影響基於非共價、多聚、多價結構之自發組裝。一般而言，十二個胺基酸或更少胺基酸之連接子，包括不存在任何連接子，經由有利於分子間域置換而非鏈內域配對，促進包含scFv之多肽或蛋白質多聚化成更高分子量物種(參見例如Dolezal O等人， Protein Eng16: 47-56(2003))。然而，根本不具有連接子之scFv或具有15個胺基酸殘基之例示性長度的連接子可能多聚化(Whitlow M等人, Protein Eng6: 989-95 (1993)；Desplancq D等人, Protein Eng7: 1027-33 (1994)；Whitlow M等人, Protein Eng7, 1017-26 (1994)；Alfthan K等人, Protein Eng8: 725-31 (1995))。習此相關技藝之人士可使用此項技術中已知及/或本文所述之技術鑑別所產生及/或純化的多聚結構。
在一些實施例中，考慮本文中所描述之免疫結合物之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良本發明之免疫結合物之結合親和力、穩定性及/或其他生物特性(例如改變半衰期或治療窗、降低免疫原性或增加製造的便利性)。免疫結合物之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼免疫結合物之核苷酸序列中，或藉由合成所需免疫結合物或多肽來製備。此類修飾包括例如免疫球蛋白域或多肽序列之融合；鉸鏈、連接子及/或螯合劑組分之取代；放射性同位素之取代。此類修飾包括例如免疫結合物之胺基酸序列內的殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行融合、缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合之特定結合親和力水準、特定K D水準及/或特定Koff水準。
本文提供抗原結合抗體片段及CDR組。此類片段可在N末端或C末端處截短，或例如當與全長天然抗體(例如全長駱駝科VHH IgG2或IgG3)相比時可能缺乏內部殘基。某些片段可能缺乏對於抗體之所需生物活性或減少本發明免疫結合物之總尺寸並非必需的胺基酸殘基或域。
在一些實施例中，藉由併入額外結構使本發明之免疫結合物之變異體變得更大。在一些實施例中，免疫結合物鍵聯至異源部分或易於偵測之部分。在一些其他實施例中，連接包含蛋白質融合。在一些其他實施例中，異源部分為細胞毒性劑。在一些實施例中，添加羧基末端離胺酸殘基以提供位點特異性連接位點。胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或超過一百個殘基之多肽範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包含具有N末端甲硫胺醯基殘基之免疫結合物。免疫結合物分子之其他插入變異體包括免疫結合物之N末端或C末端與酶(例如，對於ADEPT而言)或增加免疫結合物之血清半衰期之多肽的融合。
編碼本發明之免疫結合物之核酸可經修飾以產生嵌合或融合免疫結合物多肽，例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域(CH及CL序列)取代同源鼠類序列(美國專利第4,816,567號；及莫里森等人, Proc Natl Acad Sci USA81: 6851(1984))，或藉由使免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)之全部或部分編碼序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可能取代免疫結合物之恆定域，或用其取代免疫結合物之一個抗原組合位點的可變域以產生嵌合二價免疫結合物，該嵌合二價免疫結合物包含一個對抗原具有特異性之抗原組合位點及另一個對不同抗原具有特異性之抗原組合位點。
在本文所述之本發明中用作抗原結合域的抗體構築體之變異可例如使用例如美國專利第5,364,934號中所闡述之用於保守性及非保守性突變的任何技術及準則進行。變異可為編碼免疫結合物或多肽之一或多個密碼子的取代、缺失或插入，其導致與天然序列抗體或多肽相比胺基酸序列的變化。視情況，該變異係藉由在免疫結合物之一或多個域中用任何其他胺基酸取代至少一個胺基酸來進行。藉由比較免疫結合物之序列與同源已知蛋白質分子之序列且使高同源性區域中所產生的胺基酸序列變化之數目減至最小，可以找到確定可插入、取代或缺失何種胺基酸殘基而不會對所需活性產生不利影響之指導。胺基酸取代可為一個胺基酸經具有類似結構及/或化學特性之另一胺基酸置換的結果，諸如白胺酸經絲胺酸置換，亦即保守性胺基酸置換。插入或缺失可視情況在約1至5個胺基酸範圍內。允許發生之變異可藉由在序列中系統地進行胺基酸插入、缺失或取代且測試所得變異體之全長或成熟原生序列所展現的活性來確定。
在特定實施例中，所關注保守取代展示於表B及C中，包括在較佳取代之標題下。若此類取代導致生物活性變化，則引入表C中命名為例示性取代或如下文關於胺基酸類別進一步描述之更多實質性變化，且篩選產物。 表C 原始            例示性                               較佳 殘基 取代 取代Ala (A)       val；leu；ile                      val Arg (R)       lys；gln；asn                     lys Asn (N)       gln；his；lys；arg              gln Asp (D)       glu                                    glu Cys (C)       ser                                    ser Gln (Q)       asn                                   asn Glu (E)       asp                                   asp Gly (G)       pro；ala                            ala His (H)       asn；gln；lys；arg             arg Ile (I)          leu；val；met；ala；phe； 正白胺酸                            leu Leu (L)        正白胺酸；ile；val； met；ala；phe                    ile Lys (K)       arg；gln；asn                    arg Met (M)      leu；phe；ile                     leu Phe (F)        leu；val；ile；ala；tyr        leu Pro (P)        ala                                    ala Ser (S)        thr                                    thr Thr (T)        ser                                    ser Trp (W)       tyr；phe                            tyr Tyr (Y)       trp；phe；thr；ser              phe Val (V)       ile；leu；met；phe； ala；正白胺酸                    leu
本發明之免疫結合物之功能或免疫一致性的實質性修飾係藉由選擇取代來實現，該等取代在其對維持以下之影響方面明顯不同：(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如呈片狀或螺旋狀構形，(b)目標位點處的分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈之主體。基於常見側鏈特性將天然存在之殘基分組為： (1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile； (2)中性親水性：cys、ser、thr； (3)酸性：asp、glu； (4)鹼性：asn、gln、his、lys、arg； (5)影響鏈取向之殘基：gly、pro；及 (6)芳族：trp、tyr、phe。
非保守取代將引起此等類別中之一者之成員換成另一個類別。此類經取代之殘基亦可引入保守性取代位點中或更佳地引入其餘(非保守性)位點中。
可以使用此項技術中已知之方法產生變異，諸如寡核苷酸介導(定點)突變誘發、丙胺酸掃描及PCR突變誘發。可在經選殖DNA上進行定點突變誘發(Carter等人, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)；Zoller等人, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987))、匣突變誘發(Wells等人, Gene, 34:315 (1985))、限制選擇突變誘發(Wells等人, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986))或其他已知技術以產生編碼本發明之免疫結合物變異體的DNA分子。
在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之免疫結合物變異體。用於取代型突變誘發之所關注位點包括免疫球蛋白可變域以及免疫球蛋白恆定域內之HVR及FR。胺基酸取代可引入所關注免疫結合物中且篩選產物以獲得所需活性，例如改善/保留之抗原結合、降低/保留之免疫原性、改善/保留之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、改善/保留之補體依賴性細胞毒性(CDC)、改善/保留之目標抑制及/或改善/保留之抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(ADCP)。類似地，可以將胺基酸取代引入所關注免疫結合物中且篩選產物以降低或消除活性，例如ADCC、CDC、目標抑制及/或ADCP。
一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人源化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有修飾(例如改善)(例如親和力提高、免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。一種說明性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所描述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基發生突變，且在噬菌體上呈現變異抗體且根據特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
變化(例如取代)可於HVR中進行以例如提高免疫結合物親和力。此類變化可於HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程中經歷高頻率突變之密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008))及/或SDR (a-CDR)中進行，其中對所得變異體VH或VL測試結合親和力。藉由構築二級文庫及自二級文庫再選擇來達成親和力成熟已描述於Hoogenboom等人, Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編輯, Human Press, Totowa, NJ, (2001))。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)中之任一者將多樣性引入至所選用於成熟之可變基因中。隨後產生二級文庫。隨後篩選該文庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。另一種引入多樣性之方法涉及將若干HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)隨機分組之HVR引導方法。可特異性地鑑別抗原結合所涉及之HVR殘基，例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來鑑別。常常尤其以CDR-H3及CDR-L3為目標。
在一些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等變化實質上不降低免疫結合物結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守變化(例如如本文所提供之保守取代)。此類變化可在HVR「熱點」或SDR外。在上文所提供之變異型VH及VL序列之某些實施例中，各HVR不變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種適用於鑑別可針對突變誘發進行標靶之抗體殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham及Wells (1989) Science, 244:1081-1085所描述。在此方法中，鑑別一個殘基或一組目標殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且經中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以判定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。
或者或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構用於鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物包含含有人源化免疫球蛋白域之抗體構築體(用作本文中之抗原結合區)。
非人類(例如駱駝科、鼠類或兔)抗體之人源化形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)。人源化抗體包括人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之互補決定區(CDR)的殘基經來自具有所需特異性、親和力及能力之諸如駱駝科、小鼠、大鼠或兔之非人類物種(供體抗體)之CDR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架殘基經相應的非人類殘基置換。人源化抗體亦可包含在受體抗體中及在所輸入之CDR或構架序列中均不存在之殘基。一般而言，人源化抗體將包含實質上所有至少一個及典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區與非人類免疫球蛋白之彼等域相對應且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白一致序列之彼等區。人源化抗體亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(典型地為人類免疫球蛋白之恆定區)的至少一部分(Jones等人, Nature, 321:522-5 (1986)；Riechmann等人, Nature, 332:323-9 (1988)；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-6 (1992))。
用於人源化非人類抗體之方法為此項技術中熟知的。一般而言，人源化抗體具有一或多個自非人類來源引入至其中的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其典型地獲自「輸入」可變域。人源化可基本上遵循Winter及同事之方法(Jones等人, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人, Science, 239:1534-1536 (1988))，藉由用嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行。因此，此類「人源化」抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於完整人類可變域已經來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人源化抗體典型地為一些CDR殘基及可能一些FR殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代之人類抗體。
根據另一方法，可經由選擇修復的高變區在抗體人源化期間恢復抗原結合(參見例如2005年2月18日提交之美國申請案第11/061,841號)。該方法包括將非人類高變區併入受體構架上且進一步在一或多個高變區中引入一或多個胺基酸取代而不修飾受體構架序列。或者，一或多個胺基酸取代之引入可伴隨受體構架序列中之修飾。
不參與維持本發明之免疫結合物之恰當構形的任何半胱胺酸殘基一般可經絲胺酸取代，以改良分子之氧化穩定性及防止異常交聯。反之，可在本發明之免疫結合物中添加半胱胺酸鍵以改良其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段或VHH片段之抗體片段的情況下)。
在一些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程化免疫結合物，其中免疫結合物之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在一些實施例中，經取代之殘基存在於免疫結合物之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，藉此將反應性硫醇基安置於免疫結合物之可達位點處且可用於使免疫結合物與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合。在一些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之Al18(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如US 7,521,541中所述產生半胱胺酸工程化抗體。
瞭解胺基酸變化之習此相關技藝之人士可改變免疫結合物之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置或改變膜錨定特徵。
在一些實施例中，改變本文中所提供之免疫結合物以增加或減少免疫結合物糖基化之程度及/或改變糖基化模式。「改變天然糖基化模式」在本文中意欲指缺失在本發明親本免疫結合物中可見的一或多種碳水化合物部分(藉由移除潛在糖基化位點或藉由化學及/或酶方式使糖基化缺失)，及/或添加不存在於本發明之天然序列免疫結合物中之一或多個糖基化位點。另外，該片語包括天然蛋白質之糖基化的定性變化，其涉及所存在之各種碳水化合物部分之性質及比例的變化。
抗體及其他多肽之糖基化典型地為N-鍵聯或O-鍵聯的。N-鍵聯係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸，其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸，為用於將碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，在多肽中此等三肽序列中之任一者的存在產生潛在糖基化位點。O-鍵聯之糖基化係指糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥胺基酸，最通常是絲胺酸或蘇胺酸的連接，但亦可使用5-羥脯胺酸或5-羥離胺酸。
向免疫結合物中添加糖基化位點或使免疫結合物缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。藉由改變胺基酸序列從而使其含有上述三肽序列中之一或多者，來便利地向本發明之免疫結合物添加糖基化位點(用於N-鍵聯之糖基化位點)。亦可藉由向本發明原始免疫結合物之序列添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用該等殘基取代本發明原始免疫結合物之序列來產生變化(用於O-鍵聯之糖基化位點)。本發明之免疫結合物胺基酸序列可視情況經由DNA水準之變化而改變，尤其藉由使編碼本發明免疫結合物之DNA在預先選擇之鹼基處突變，使得產生將轉譯為所需胺基酸之密碼子。
在免疫結合物包含Fc區之情況下，可改變連接於其上之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體典型地包含一般藉由N-鍵連接至Fc區之CH2域之Asn297的分支鏈雙觸角寡糖(參見例如Wright等人, TIBTECH, 1997, 15:26-32(1997))。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明免疫結合物中之寡醣進行修飾以便產生具有某些改良特性之免疫結合物變異體。
增加本發明之免疫結合物上碳水化合物部分之數目的另一方式為藉由糖苷與多肽之化學或酶促偶合。此類方法描述於此項技術中，例如1987年9月11日公開之WO 87/05330及Aplin及Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem.,第259-306頁(1981)中。
移除存在於本發明之免疫結合物上之碳水化合物部分可以化學或酶促方式或藉由編碼充當糖基化目標之胺基酸殘基之密碼子的突變取代來實現。化學去糖基化技術為此項技術中已知的且藉由例如Hakimuddin等人, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)及藉由Edge等人, Anal. Biochem., 118:131 (1981)描述。多肽上之碳水化合物部分的酶促裂解可藉由使用如由Thotakura等人, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)所述之各種內醣苷酶及外醣苷酶來實現。
在一些實施例中，提供具有碳水化合物結構的抗體變異體，該碳水化合物結構缺乏連接(直接或間接)至Fc區之海藻糖。舉例而言，此類免疫結合物中之海藻糖量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%，或20%至40%。藉由計算糖鏈內位於Asn297之海藻糖相對於連接至Asn297之所有糖結構(例如複雜、雜合及高甘露糖結構)之總和的平均量來測定海藻糖的量，如藉由例如WO 2008/077546中所述的MALDI-TOF質譜法所量測。Asn297係指位於Fc區中約位置297 (Fc區殘基之EU編號)處的天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體之輕微序列變異，Asn297亦可位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，亦即位置294與300之間。此類海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能(參見例如US 2003/0157108；US 2004/0093621)。關於「去海藻糖基化」或「缺乏海藻糖」之抗體變異體的公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/01 15614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/01 10704；US 2004/01 10282；US 2004/0109865；WO 2003/0851 19；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031 140；Okazaki等人 J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人 Biotech. Bioeng.87:614 (2004)。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化的Lecl3 CHO細胞(Ripka等人 Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；WO 2004/056312，Adams等人 ,especially at Example 11)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因( FUT8)剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人, Biotechnol. Bioeng.,94(4):680-688 (2006)；WO2003/085107))。
免疫結合物變異體進一步具有平分寡醣，例如其中連接至抗體之Fc區的雙觸角寡醣係藉由GlcNAc平分。此類免疫結合物變異體可具有減少之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878；US 6,602,684；US 2005/0123546中。亦提供其中寡醣中之至少一個半乳糖殘基連接至Fc區之免疫結合物變異體。此類免疫結合物變異體可具有改良之CDC功能。該等抗體變異體描述於例如WO 1997/030087；WO 1998/058964；及WO 1999/022764中。 免疫結合物衍生物及其他修飾
本發明之免疫結合物之共價修飾包括於本發明之範疇內。一種共價修飾包括使本發明之免疫結合物之標靶胺基酸殘基與有機衍生劑反應，該有機衍生劑能夠與免疫結合物之所選側鏈或N末端或C末端殘基反應。用雙官能試劑衍生化適用於例如使本發明之免疫結合物與不溶於水之支撐基質或表面交聯以用於純化本發明之免疫結合物的方法，且反之亦然。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基丁二醯亞胺酯(例如與4-疊氮柳酸之酯)、同型雙官能醯亞胺酯(包括二丁二醯亞胺酯，諸如3,3'-二硫代雙(丙酸丁二醯亞胺酯))、雙官能順丁烯二醯亞胺(諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺基-1,8-辛烷)及諸如3-[(對疊氮苯基)二硫基]丙亞胺甲酯之試劑。
其他修飾包括分別將麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基去醯胺化為相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基，脯胺酸及離胺酸之羥基化，絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基的磷酸化，離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 第79-86頁 (1983))、N末端胺之乙醯化及任何C末端羧基之醯胺化。
在一些實施例中，本文中所提供之免疫結合物可經進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白質部分。適用於免疫結合物衍生化之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三㗁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或非分支鏈的。連接至免疫結合物之聚合物之數目可變化，且若連接超過一種聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括但不限於待改良免疫結合物之特殊特性或功能，免疫結合物衍生物是否將在規定條件下用於療法等考慮因素來確定。
本發明之PEG衍生之免疫結合物可包含含有一或多個-CH 2CH 2O-之連接子且可用於改變免疫結合物之生物分佈及藥物動力學。PEG可以聚合形式或離散寡聚物形式製備。此等聚合物之雙功能化型式可將免疫結合物與螯合劑連接及/或向整個分子提供額外的尺寸及/或溶解度。在一些實施例中，PEG衍生之免疫結合物與其未經衍生之親本分子相比展現降低之免疫原性。 產生本發明免疫結合物 之方法
本發明提供一種組合物，其包含根據任一以上實施例或本文中所描述的免疫結合物中的一或多者。在另一態樣中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼如本文所描述之放射性同位素遞送平台。本文亦提供編碼本發明免疫結合物之蛋白質組分的核酸、包含前述核酸之表現載體及包含前述表現載體之宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含如本文所提供之核酸及/或載體。在一些實施例中，本發明之宿主細胞經分離或經純化。在一些實施例中，本發明之宿主細胞係在細胞培養基中。本發明之核酸、表現載體及宿主細胞可用於產生包含本發明免疫結合物中之一或多者的組合物。在一些實施例中，宿主細胞為真核的。在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物。在一些實施例中，宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施例中，宿主細胞為原核的。在一些實施例中，宿主細胞為大腸桿菌( E. coli)。
以下描述了用於產生本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物的說明性技術，以根據本發明之方法使用。在一些實施例中，本發明提供一種用於製備本發明之免疫結合物的方法，該方法包含在適合於編碼放射性同位素遞送平台之表現載體之條件下培養如本文所提供之宿主細胞，及回收或純化該放射性同位素遞送平台。在一些實施例中，方法進一步包含用合適同位素(諸如α或β粒子發射體)放射性標記該放射性同位素遞送平台。 抗原結合域、免疫結合物及核酸之產生及鑑別
適用作本文中之抗原結合區的抗原結合域可在抗體中鑑別，其為單株抗體及/或多株抗體。編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序分離及定序。一旦分離，可將DNA置放於表現載體中，接著將表現載體轉染至並不另外產生抗體蛋白質之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中合成單株抗體 (參見例如Skerra等人, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)及Plückthun, Immunol Revs. 130:151-188 (1992))。
在一些實施例中，本發明免疫結合物之抗原結合域或其片段係藉由篩選含有噬菌體之噬菌體文庫來分離，該噬菌體文庫呈現與噬菌體鞘蛋白融合之抗體可變區(Fv、scFv或VHH)的各種片段。篩選此類噬菌體文庫以結合至所需目標抗原或表位。表現能夠結合至所需抗原的Fv片段、scFv或VHH之純系吸附至抗原且因此與文庫中之非結合純系分離。接著使結合純系自抗原溶離，且可藉由抗原吸附/溶離之其他循環來進一步富集。
在一些實施例中，可以自利用McCafferty等人, Nature,348:552-554 (1990)所述之技術產生的抗體噬菌體文庫中分離出抗體或其抗體片段。Clackson等人, Nature, 352:624-628 (1991)及Marks等人, J Mol Biol, 222:581-597 (1991)描述利用噬菌體文庫分別分離出鼠類及人類抗體。後續出版物描述藉由鏈改組來產生高親和力(nM範圍)人類抗體(Marks等人, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))以及組合性感染與活體內重組作為用於構築極大型噬菌體文庫之策略(Waterhouse等人, Nuc Acids Res, 21:2265-2266 (1993))。可變域可功能上呈現於噬菌體上，作為單鏈Fv(scFv)片段，其中VH及VL經由短的可撓性肽共價鍵聯；或作為Fab片段，其中Fab片段各自融合至恆定域且非共價相互作用，如Winter等人, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)中所描述。
VH及VL基因之譜系可分別藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖且在噬菌體文庫中隨機重組，可隨後關於抗原結合純系搜尋該等文庫，如Winter等人, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)中所描述。可自非免疫來源構築用於篩選之初始文庫以提供針對抗原之高親和力抗體(參見例如Griffiths等人, EMBO J, 12: 725-734(1993))。另一實例為如下以合成方式構築的初始文庫：自幹細胞選殖未重排V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高可變CDR3區且實現活體外重排，如Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)所述。
可藉由此項技術中已知的多種技術篩選文庫。舉例而言，目標抗原可用於塗佈吸附盤之孔、表現於貼附至吸附盤或用於細胞分選之宿主細胞上，或與生物素結合以用卵白素塗佈之珠粒捕獲，或用於任何其他淘選呈現文庫之方法中。可藉由使用長時間洗滌及單價噬菌體呈現(如Bass等人, Proteins, 8: 309-314 (1990)及WO 1992/09690中所描述)以及低抗原塗佈密度(如Marks等人, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)中所描述)來促進選擇具有慢解離動力學(及強結合親和力)之抗體。
篩選cDNA文庫之技術為此項技術中所熟知。可用經設計以鑑別所關注基因或由其編碼之蛋白質的探針(諸如至少約20至80個鹼基之寡核苷酸)篩選文庫。使用所選擇探針篩選cDNA或基因體文庫可使用標準程序進行，諸如Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述。分離編碼本發明免疫結合物之基因的替代方式為使用PCR方法(Sambrook等人，前述；Dieffenbach等人， PCR Primer:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995))。
編碼本發明免疫結合物之DNA可獲自cDNA文庫，該cDNA文庫由咸信具有本發明免疫結合物mRNA且以可偵測水準表現該mRNA的組織製備。因此，本發明人類免疫結合物DNA可便利地自由人類組織製備之cDNA文庫獲得。編碼本發明免疫結合物之基因亦可自基因體文庫或藉由已知合成程序(例如自動化核酸合成)獲得。對於一些實施例，所需編碼抗體之多核苷酸序列可自例如抗體產生細胞(諸如融合瘤細胞)中分離及定序。
此類文庫篩選方法中鑑別出之序列可與諸如GenBank之公共資料庫中或其他私人序列資料庫存放且可用的其他已知序列進行比較及比對。可使用此項技術中已知且如本文所述之方法測定分子之規定區域內或跨全長序列之序列一致性(在胺基酸或核苷酸層面上)。本發明之任何抗體CDR或重鏈可變片段可如下獲得：設計適合的抗原篩選程序來選擇所關注噬菌體純系，隨後使用得自所關注噬菌體純系的可變域及/或CDR序列及描述於Kabat等人,1991,前述中的適合恆定區(Fc)序列來構築抗體純系。 免疫結合物產生 ； 本發明之宿主細胞及表現載體
以下描述主要係關於藉由培養用含有編碼本發明免疫結合物之核酸之載體轉型或轉染之細胞產生本發明之抗體構築體。當然，考慮可以利用此項技術中已熟知的替代方法製備本發明之抗體構築體。舉例而言，適當胺基酸序列或其一部分可以藉由使用固相技術的直接肽合成來產生 (例如Stewart等人 , Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J, Am. Chem. Soc., 85: 2149-54 (1963))。活體外蛋白質合成可使用人工技術或自動化進行。自動化合成可例如使用Applied Biosystems肽合成儀(Foster City, CA)使用製造商說明書實現。本發明之免疫結合物的各種部分可以用化學方式分別合成且使用化學或酶促方法組合以產生所需本發明之免疫結合物。
可以使用重組方法及組合物(例如如美國專利第4,816,567號中所述)產生抗體構築體。在一個實施例中，提供編碼本文所描述之抗體的經分離核酸。此類核酸可編碼包含抗體之VH及/或包含VL胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)的胺基酸序列。在另一實施例中，提供包含此類核酸的一或多種載體(例如表現載體)。在另一個實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含(例如，已用以下轉型)：(1)包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體。在一些其他實施例中，宿主細胞包含：(1)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如YO、NSO、Sp20細胞)之真核細胞。在一個實施例中，提供一種製備本發明之免疫結合物的方法，其中該方法包含在適於表現抗體的條件下培養如本文所提供之包含編碼抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
對於重組產生本發明之免疫結合物，分離例如如上文所述之編碼抗體構築體之核酸且將其插入一或多個載體中以用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該核酸可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性地結合至編碼抗體重鏈及/或輕鏈之基因之寡核苷酸探針)容易地分離且定序。編碼本發明免疫結合物之胺基酸序列(包括序列變異體)的核酸分子可藉由習此相關技藝之人士已知的多種方法來製備。此等方法包括但不限於自天然來源(在天然存在之胺基酸序列變異體的情況下)分離或藉由寡核苷酸介導(或定點)之突變誘發、PCR突變誘發及卡匣突變誘發來製備抗體構築體之更早製備的變異體或非變異體型式。 用於免疫結合物產生之宿主細胞的操控
宿主細胞經本文所述之表現或選殖載體轉染或轉型以便產生本發明之免疫結合物，且在習知營養培養基中培養，該營養培養基經適當調節以便誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。可藉由熟習此項技術者在無不當實驗之情況下選擇培養條件，諸如培養基、溫度、pH及其類似條件。一般而言，用於使細胞培養物之產率最大化的原理、方案及實際技術可見於 Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler編(IRL Press, 1991)及Sambrook等人，前述。
適合用於選殖或表現編碼免疫結合物之核酸及載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，在不需要糖基化及Fc效應功能時尤其如此。對於細菌中抗體片段及多肽之表現，參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523；及Charlton, Methods in Molecular Biology, 第248卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 第245-254頁，其描述大腸桿菌中抗體片段之表現)。在表現之後，免疫結合物可以自細菌細胞糊狀物中以可溶性部分分離且其可進一步經純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為編碼免疫結合物的載體之適合選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已經「人源化」，從而使得產生之抗體具有部分或完全人類糖基化模式的真菌及酵母菌株。(參見例如Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)；Li等人, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006))。
用於表現糖基化免疫結合物之適合宿主細胞亦來源於多細胞生物體(例如無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多適用於與昆蟲細胞結合使用，尤其用於轉染草地黏蟲( Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主(參見例如US 5,959,177；US 6,040,498；US 6,420,548；US 7,125,978；及US 6,417,429。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用的哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40 (COS-7)轉型之猴腎CV1株；人類胚腎株(如例如在Graham等人, J. Gen Virol.36:59 (1977)中所述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse Sertoli cell) (如例如在Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MOCK；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell) (BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep 02)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如例如在Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)中所述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFK CHO細胞(Urlaub等人, Proc Natl Acad Sci USA77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NSO及Sp2/0。關於適用於免疫結合物產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ),第255-268頁(2003)。
真核細胞轉染及原核細胞轉型之方法為熟習此項技術者已知，其意謂將DNA引入宿主中以使得DNA作為染色體外或藉由染色體整合體為可複製的，例如CaCl2、CaPO4、脂質體介導之聚乙二醇(polyethylene-gycol)/DMSO及電穿孔。視所用宿主細胞而定，轉型係使用適於此類細胞之標準技術進行。如Sambrook等人, 前述中所述之採用氯化鈣的鈣處理或電穿孔通常用於原核生物。使用根癌土壤桿菌( Agrobacterium tumefaciens)之感染來轉型某些植物細胞，如藉由Shaw等人, Gene, 23:315 (1983)及1989年6月29日公開之WO 89/05859中所述。對於不含此類細胞壁之哺乳動物細胞，可使用Graham及van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)之磷酸鈣沈澱方法。哺乳動物細胞宿主系統轉染之一般態樣已描述於美國專利第4,399,216號。轉型至酵母中典型地係根據Van Solingen等人, J. Bact., 130:946(1977)及Hsiao等人, Proc Natl Acad Sci(USA), 76:3829 (1979)之方法進行。然而，亦可使用用於將DNA引入至細胞中之其他方法，諸如藉由細胞核顯微注射、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞之融合或聚陽離子(例如凝聚胺、聚鳥胺酸)。對於用於轉型哺乳動物細胞之各種技術，參見Keown等人, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及Mansour等人, Nature, 336:348-352 (1988)。 原核宿主細胞
適合之原核生物包括但不限於古細菌及真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科(Enterobacteriaceae)，諸如大腸桿菌。各種大腸桿菌菌株為公開可獲得的，諸如K12菌株MM294(ATCC 31,446)；X1776(ATCC 31,537)；W3110(ATCC 27,325)及K5 772(ATCC 53,635)。其他適合之原核宿主細胞包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門氏桿菌( Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌屬(Serratia)(例如黏質沙雷氏菌( Serratia marcescans))及志賀桿菌屬(Shigella)，以及桿菌屬(Bacilli)(諸如枯草桿菌( B. subtilis)及地衣芽孢桿菌( B. licheniformis)(例如，1989年4月12日公開之DD 266,710中所揭示的地衣芽孢桿菌41P))、假單胞菌屬(諸如綠膿桿菌( P. aeruginosa))、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、副球菌屬(Paracoccus)及鏈黴菌屬(Streptomyces)。此等實例為說明性而非限制性的。大腸桿菌菌株W3110為一種有利的宿主或親本宿主，因為其為重組DNA產物醱酵之常見宿主菌株。較佳地，宿主細胞分泌最少量之蛋白水解酶。舉例而言，菌株W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington，D.C.: American for Microbiology，1987),第1190-1219頁；ATCC寄存第27,325號)可經修飾以在編碼宿主內源性蛋白質之基因中產生基因突變，此類宿主之實例包括大腸桿菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大腸桿菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大腸桿菌W3110菌株27C7 (ATCC 55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr；大腸桿菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr；大腸桿菌W3110菌株40B4，其為具有非康黴素抗性degP缺失突變之菌株37D6；大腸桿菌W3110菌株33D3，其具有基因型W3110 ∆fhuA(∆tonA)ptr3 lac Iq lacL8 ∆ompT∆(nmpc-fepE)degP41 kanR(美國專利第5,639,635號)及1990年8月7日所發佈之美國專利第4,946,783號中所揭示之具有突變周質蛋白酶的大腸桿菌菌株。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294 (ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ 1776 (ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308 (ATCC 31,608)亦為適合的。此等實例為說明性而非限制性的。用於構築具有所定義之基因型的任一種以上提及之細菌之衍生物的方法在此項技術中已知且描述於例如Bass等人, Proteins, 8:309-314 (1990)中。考慮到複製子在細菌細胞中之可複製性，選擇適合的細菌通常為有必要的。舉例而言，當使用熟知質體(諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)供應複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌或沙門氏菌物種可以適當地用作宿主。宿主細胞典型地應分泌最少量的蛋白水解酶，且可期望將其他蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。或者，活體外選殖方法，例如PCR或其他核酸聚合酶反應，為適合的。
全長抗體、抗體片段及抗體融合蛋白可在細菌中產生，尤其在不需要糖基化及Fc效應功能時。全長抗體在循環中具有更大的半衰期。大腸桿菌中的生產更快且更有成本效益。關於細菌中抗體片段及多肽之表現，參見例如U.S. 5,648,237；U.S. 5,789,199及U.S. 5,840,523，其描述轉譯起始區(TIR)及用於最佳化表現及分泌之信號序列。在表現之後，免疫結合物自大腸桿菌細胞糊狀物中以可溶性部分分離且其可依據同型而定經由蛋白質A或G管柱純化。可類似於純化例如CHO細胞中表現之抗體的方法來進行最終純化。 真核宿主細胞
除原核生物以外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為編碼本發明免疫結合物之載體的適合選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為常用的低級真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981)；1985年5月2日公開之EP 139,383)；克魯維酵母(Kluyveromyces)宿主(美國專利第4,943,529號；Fleer等人, Bio/Technology, 9: 968-75 (1991))，諸如，例如乳酸克魯維酵母( K. lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等人, J. Bacteriol., 154(2):737-742 (1983))，脆壁克魯維酵母( K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亞克魯維酵母( K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，魏氏克魯維酵母( K.wickeramii) (ATCC 24,178)，沃爾第克魯維酵母( K.waltii) (ATCC 56,500)，果蠅克魯維酵母( K. drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等人, Bio/Technology, 8:135 (1990))，耐熱克魯維酵母( K.thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母( K. marxianus)；解脂耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母( Pichia pastoris) (EP 183,070；Sreekrishna等人, J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988))；念珠菌屬(Candida)；木黴屬( Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脈孢菌( Neurospora crassa) (Case等人, Proc Natl Acad Sci USA76:5259-5263 (1979))；施氏酵母(Schwanniomyces)，諸如西方施氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公開之EP 394,538)；及絲狀真菌，諸如紅黴菌(Neurospora)、青黴菌(Penicillium)、彎頸黴(Tolypocladium)(1991年1月10日公開之WO 91/00357)及麴菌(Aspergillus)宿主，諸如構巢麴菌( A. nidulans)(Ballance等人, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983)；Tilburn等人, Gene, 26:205-221 (1983)；Yelton等人, Proc Natl Acad Sci USA81: 1470-1474 (1984))及黑麴菌(A. niger)(Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985))。甲基營養型酵母在本文中為適合的且包括但不限於能夠在選自由漢森酵母屬(Hansenula)、念珠菌屬、克勒克酵母屬(Kloeckera)、畢赤酵母屬、酵母菌屬、圓酵母屬(Torulopsis)及紅酵母屬(Rhodotorula)組成之屬的生長於甲醇上之酵母。作為此類別之酵母之示例的特定物種之清單可見於C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)中。
用於表現本發明之糖基化免疫結合物之適合宿主細胞來源於多細胞生物體。無脊椎細胞之實例包括昆蟲細胞，諸如果蠅S2及夜蛾Sf9；以及植物細胞，諸如棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸草之細胞培養物。已鑑別來自諸如草地黏蟲( Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊( Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊( Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)之宿主的多種桿狀病毒株及變異體以及對應許可昆蟲宿主細胞。用於轉染之多種病毒株公開可用，例如苜蓿銀紋夜蛾( Autographa californica) NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且根據本發明此類病毒可用作本文中之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。
然而，脊椎動物細胞最受關注，且脊椎動物細胞於培養物(組織培養物)中之繁殖已成為常規程序。適用的哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎臟CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎株(經次選殖以便在懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人, J. Gen Virol. 36 : 59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 77: 4216 (1980))；小鼠塞特利氏細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝臟細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人, Annals N. Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤株(Hep G2)。
宿主細胞經本文所述之表現或選殖載體轉型以便產生本發明之免疫結合物，且在習知營養培養基中培養，該營養培養基經適當調節以便誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。 可複製載體之選擇及使用
為重組產生本發明之放射性同位素遞送平台，分離編碼該遞送平台之核酸(例如cDNA或基因體DNA)且插入可複製載體中用於進一步選殖(DNA擴增)或表現。編碼免疫結合物之DNA可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性地結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)容易地分離且定序。許多載體為可用的。載體之選擇部分地視待使用宿主細胞而定。通常，宿適合的主細胞具有原核或真核(通常哺乳動物)來源。
載體可例如呈質體、黏質體、病毒粒子或噬菌體形式。適當核酸序列可藉由多種程序插入至載體中。一般而言，使用此項技術中已知之技術將DNA插入至適當限制性核酸內切酶位點中。載體組分一般包括但不限於以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。構築含有此等組分中之一或多者之適合的載體採用熟習此項技術者已知之標準連接技術。
本發明之免疫結合物不僅可直接以重組方式產生，而且亦可以與異源多肽形成之融合多肽形式產生，該異源多肽為信號序列或在成熟蛋白或多肽之N末端處具有特異性裂解位點之其他多肽。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為插入載體中之編碼本發明免疫結合物之DNA的一部分。信號序列可為例如選自鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定性腸毒素II前導序列之群的原核信號序列。對於酵母分泌，信號序列可為例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列(包括酵母菌屬及克魯維酵母α因子前導序列，後者描述於美國專利第5,010,182號中)或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌( C. albicans)澱粉酶前導序列(1990年4月4日公開之EP 362,179)或1990年11月15日公開之WO 90/13646中所述之信號。在哺乳動物細胞表現中，哺乳動物信號序列可用於引導蛋白質分泌，諸如來自相同或相關物種之分泌性多肽的信號序列，以及病毒分泌性前導序列。 培養產生放射性同位素遞送平台之宿主細胞
用於產生本發明之免疫結合物的宿主細胞可在多種培養基及培養條件下培養。 原核宿主細胞培養
用於產生本發明多肽之原核細胞在此項技術中已知且適用於培養所選宿主細胞的培養基中生長。適合的培養基之實例包括魯利亞肉湯(Luria broth；LB)加必需的營養補充劑。在一些實施例中，培養基亦含有基於構築表現載體所選的選擇劑，以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將安比西林(ampicillin)添加至培養基中以用於表現安比西林抗性基因之細胞之生長。
除碳、氮及無機磷酸鹽源以外，亦可包括適合的濃度之任何必需補充劑，其係單獨或以與諸如複合氮源之其他補充劑或培養基之混合物形式引入。視情況地，培養基可含有一或多種選自由麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇組成之群之還原劑。
在適合的溫度下培養原核宿主細胞。對於大腸桿菌生長，較佳溫度例如在約20℃至約39℃，更佳在約25℃至約37℃範圍內，甚至更佳為約30℃。主要視宿主生物體而定，培養基之pH值可為約5至約9範圍內之任何pH值。對於大腸桿菌，pH較佳為約6.8至約7.4，且更佳約7.0。
若本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適用於活化啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一個態樣中，使用PhoA啟動子控制多肽之轉錄。因此，經轉型之宿主細胞在用於誘導的磷酸鹽限制性培養基中培養。在一些實施例中，磷酸鹽限制性培養基為C.R.A.P培養基(參見例如Simmons等人, J. Immunol. Methods(2002), 263:133-47)。根據所用載體構築體，可使用多種其他誘導劑，如此項技術中已知。
在一個實施例中，所表現之本發明多肽分泌至宿主細胞之周質中且自宿主細胞之周質中回收。蛋白質回收典型地涉及破壞微生物，通常藉由諸如滲壓衝擊、音波處理或溶胞之手段。在細胞破壞後，可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或完整細胞。可進一步例如藉由親和力樹脂層析純化蛋白質。或者，可將蛋白質轉運至培養基中且自其中分離。可自培養物移除細胞，且過濾且濃縮培養物上清液以進一步純化所產生之蛋白質。經表現之多肽可使用通常已知的方法(諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點分析法(Western blot assay))進一步分離及鑑別。
在本發明之一個態樣中，藉由醱酵方法大量產生免疫結合物。可使用各種大規模分批饋料醱酵程序來產生重組蛋白質。大規模醱酵具有至少1000公升容量，較佳約1,000至100,000公升容量。此等醱酵器使用攪拌器葉輪來分佈氧及營養物，尤其葡萄糖(一種較佳碳/能量來源)。小規模醱酵通常係指在體積容量不超過約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內的醱酵器中進行之醱酵。
在醱酵過程中，典型地在細胞已在適合的條件下生長至所需密度(例如約180-220之OD550)之後開始誘導蛋白質表現，在此階段，細胞處於早期固定相。根據所用載體構築體，可使用多種誘導劑，如此項技術中已知及上文所描述。在誘導之前，細胞可生長較短的時段。通常將細胞誘導約12-50小時，但可使用更長或更短的誘導時間。
為了改良本發明之多肽之產量及品質，可修改各種醱酵條件。舉例而言，為了改良所分泌之免疫結合物多肽之正確組裝及摺疊，可使用過表現伴隨蛋白(諸如Dsb蛋白質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及或DsbG)或FkpA(具有伴隨蛋白活性之肽基脯胺醯基順,反-異構酶))之其他載體使宿主原核細胞共轉型。已證明伴隨蛋白可促進細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白質之正確摺疊及溶解性。Chen等人(1999) J Bio Chem274: 19601-5；美國專利第6,083,715號；美國專利第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-5；Ramm及Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-13；Arie等人(2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
為了使經表現之異源蛋白質(尤其對蛋白水解敏感之異源蛋白質)的蛋白水解降至最低，本發明可使用某些蛋白水解酶缺失型宿主菌株。舉例而言，宿主細胞菌株可經修飾以在編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因中實現基因突變。可獲得一些蛋白酶缺失型大腸桿菌菌株且描述於例如Joly等人(1998),前述；美國專利第5,264,365號；美國專利第5,508,192號；Hara等人, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)中。
在一個實施例中，蛋白水解酶缺失且用過表現一或多種伴隨蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株用作本發明之表現系統中之宿主細胞。 真核宿主細胞培養物
市售培養基(諸如哈姆氏F10(Ham's F10) (Sigma)、最小必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM，Sigma))適用於培養宿主細胞。另外，在Ham等人, Meth. Enz.58:44 (1979)，Barnes等人, Anal. Biochem.102:255 (1980)，美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國再頒專利第30,985號中描述之任何培養基可用作宿主細胞之培養基。此等培養基中的任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(例如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN™藥物)、痕量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者將已知之合適濃度包括任何其他必需的增補劑。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為先前用於經選擇用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。 本發明之免疫球蛋白衍生結構之純化
本發明之免疫結合物之形式可自培養基或自宿主細胞溶解物中回收。若與膜結合，則其可使用適合之清潔劑溶液(例如Triton-X 100)或藉由酶促裂解自膜中釋放。在表現本發明之免疫結合物中所用之細胞可藉由各種物理或化學方式破壞，諸如凍融循環、音波處理、機械破壞或細胞溶解劑。
可能需要自重組細胞蛋白質或多肽中純化本發明之免疫結合物。以下程序為適合的純化程序之示例：藉由在離子交換管柱上分級分離；乙醇沈澱；逆相HPLC；二氧化矽層析或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沈澱；使用例如葡聚糖凝膠G-75之凝膠過濾；用以移除污染物(諸如IgG)之蛋白質A瓊脂糖管柱；及金屬螯合管柱以結合本發明之免疫結合物的經表位標記形式。可利用蛋白質純化之各種方法，且此類方法為此項技術中已知的且描述於例如Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)中。所選之純化步驟將視例如所使用之生產過程之性質及所產生的本發明之特定免疫結合物而定。
當使用重組技術時，免疫結合物可於細胞內、周質空間中產生或直接分泌於培養基中。若抗體在細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾移除微粒碎片(宿主細胞或溶解片段)。Carter等人, Bio/Technology10: 163-7 (1992)描述一種分離分泌至大腸桿菌之周質空間的抗體之程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯氟(PMSF)存在下經約30分鐘融化細胞漿料。可藉由離心來移除細胞碎片。在免疫結合物分泌至培養基中之情形下，通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此類表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。
可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和力層析來純化自細胞製備之免疫結合物組合物，其中親和力層析為較佳純化技術。蛋白質A作為親和力配位體之適合性視免疫結合物中存在之任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型而定。蛋白質A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人, J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983))。所有小鼠同型及人類γ3均推薦用蛋白質G (Guss等人, EMBO J.5:15671575 (1986))。親和力配位體所連接之基質最常為瓊脂糖，但其他基質為可用的。與瓊脂糖可達成者相比，機械穩定性基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允許較快流動速率及較短處理時間。在免疫結合物包含CH3域的情況下，Bakerbond ABX™樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)適用於純化。視所回收之免疫結合物而定，亦可使用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSE™層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
在任何初始純化步驟之後，可使用pH值在約2.5-4.5之間的溶離緩衝液且通常在低鹽濃度(例如約0-0.25 M鹽)下，使包含所關注免疫結合物及污染物之混合物經受低pH疏水相互作用層析。 免疫結合物 ( 包括抗體藥物結合物 (ADC))
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例或本文所述之本發明免疫結合物與異源部分或藥劑(諸如下文所述且包括如本文所述之任何額外外源材料)結合。
在一個實施例中，本發明提供包含本發明之抗體構築體與一或多種治療劑或放射性同位素結合的免疫結合物。
在一些實施例中，免疫結合物包含與放射性原子結合以形成放射性結合物之如本文所描述之抗體構築體。如本文所描述，多種放射性同位素可用於產生本發明的放射性結合物。
可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製得免疫結合物或抗體構築體之結合物，該等雙官能蛋白質偶合劑為諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺基酯(SPDP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺基酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯H)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人, Science238: 1098 (1987)中所述來製備。經碳14標記之1-異硫氰基苄基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為使放射性核苷酸與抗體結合之說明性螯合劑(參見例如WO 1994/11026)。連接子可為有助於細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含有二硫鍵之連接子(參見例如Chari等人, Cancer Res.52:127-131 (1992)；US 5,208,020)。
本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用交聯試劑製備之此類結合物，交聯試劑包括但不限於BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及SVSB ((4-乙烯基碸)苯甲酸丁二醯亞胺基酯)，該等交聯試劑市售可得(例如購自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.)。
如一般熟習此項技術者所認識到，某些上述方法亦適用於製備放射性免疫結合物及標靶成像複合物(儘管本文僅提及免疫結合物或抗體構築體)，且此類製備方法亦由本發明包涵。 使用螯合劑及 / 或連接子之免疫結合
用於使放射性同位素附連至免疫結合物或抗體構築體(亦即，用放射性同位素「標記」抗體)之方法為熟習此項技術者所熟知。某些此等方法描述於例如WO 2017/155937中。
雙官能螯合劑，諸如DOTA、DTPA及相關類似物適用於配位金屬離子，如α-及β-發射放射性核種。舉例而言，此等螯合分子可藉由在抗體構築體上之胺(例如離胺酸殘基之官能基)與DOTA/DTPA上之羧酸酯之間形成新的醯胺鍵來鍵聯至標靶分子。在肽合成之情況下，連接子添加之表徵及純化可為用於放射性同位素結合之抗體平台或免疫結合物的總體合成之一部分。
對於一些實施例，產生免疫結合物之方法涉及由Poty,S等人， Chem Commun.(Camb)54：2599(2018)所描述之點擊化學步驟。
對於一些實施例，肽可生物合成或可藉由化學胺基酸合成，使用適合胺基酸前驅體(涉及例如氟-19替代氫)來合成。在一些實施例中，放射性標記可併入至肽中。在一些實施例中，放射性標記可鍵聯至肽。IODOGEN方法(Fraker等人(1978) Biochem Biophys Res Commun.80: 49-57)可以用於併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)詳細描述其他方法。 本發明之免疫結合物之表徵
可藉由此項技術中已知之各種分析對本發明之免疫結合物進行針對其物理/化學特性及/或生物活性之鑑別、篩選或表徵。可藉由此項技術中已知之各種分析來表徵本發明之免疫結合物及抗體構築體的物理/化學特性及/或生物活性。可藉由一系列分析來表徵本發明之免疫結合物，包括但不限於多肽序列測定、胺基酸分析、非變性尺寸排除高壓液相層析(HPLC)、質譜法、離子交換層析及番木瓜蛋白酶消化。 抗原結合
可藉由此項技術中已知之方法，例如ELISA、西方墨點法等來測試本發明之免疫結合物的抗原結合活性。抗體之結合親和力可例如藉由描述於Munson等人, Anal Biochem., 107:220 (1980)中之史卡查分析(Scatchard analysis)來測定。此外，可使用此項技術中已知之方法來定量本發明免疫結合物之抗原結合能力，例如定量ELISA、定量西方墨點法、表面電漿子共振分析及/或史卡查分析。
在一個實施例中，使用用免疫結合物進行之經放射性標記之抗原ELISA來量測免疫結合物之K D。根據另一實施例，藉由使用表面電漿子共振分析，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000儀器(BIAcore, Inc.,Piscataway, N.J.)來量測K D，例如在25℃及10個反應單位下使用固定抗原CM5晶片。
在另一態樣中，結合競爭分析可用於鑑別競爭結合至相同抗原或其表位之免疫結合物。在一些實施例中，此類競爭抗體結合至本發明免疫結合物之相同表位(例如線性或構形表位) (參見例如Harlow及Lane(1988)Antibodies: A Laboratory Manual,第14章(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))。
可使用熟習此項技術者已知之方法鑑別或定位抗原內由本發明之免疫結合物所結合之的表位及/或接觸殘基。用於對抗體所結合之表位進行定位的詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」, Methods in Molecular Biology(第3版，Humana Press, Totowa, NJ)中。 本發明之醫藥組合物及調配物
如一般熟習此項技術者將認識到，本文中之某些教示內容適用於本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物，儘管具體本文提及一種類型之本發明，且此類應用完整包涵在本發明內。
在另一態樣中，本發明提供一種組合物，其包含本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物。本發明進一步提供醫藥組合物及調配物，其包含至少一種本發明之免疫結合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。在一些實施例中，醫藥調配物包含(1)本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物及(2)醫藥學上可接受之載劑。
免疫結合物或放射性免疫結合物以任何適於遞送至目標細胞/組織的形式調配。本發明之免疫結合物的醫藥調配物係藉由將具有所要純度之此類免疫結合物與一或多種視情況選用的醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑( Remington's Pharmaceutical Sciences第16版, Osol,A.編 (1980))以凍乾調配物或水溶液之形式混合來製備。醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及賦形劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒性，且包括但不限於：無菌水，緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；苯酚、丁基或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。
待用於活體內投與之醫藥調配物一般為無菌的。此容易藉由無菌過濾膜過濾來完成。
凍乾抗體調配物的實例描述於US 6,267,958中。抗體調配物水溶液包括US 6,171,586及WO 2006/044908中所描述之彼等抗體調配物水溶液，WO 2006/044908中所描述之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文中之醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外葡糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。
本文中之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充性活性的活性成分。此類活性成分宜以有效達成預期目的之量組合存在。
亦可將活性成分包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。該等技術揭示於 Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版, Osol,A.編(1980)中。
在一些實施例中，免疫結合物可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各種類型之脂質、磷脂及/或適用於遞送藥物至哺乳動物之界面活性劑構成的小囊泡。脂質體之組分通常配置為雙層形式，類似於生物膜之脂質配置。含有免疫結合物之脂質體係藉由此項技術中已知之方法製備，諸如Epstein等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwang等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；及1997年10月23日公開之WO1997/38731中所述之方法。特別適用之脂質體可藉由逆相蒸發法而利用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及經PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體經由孔隙尺寸限定的過濾器擠出，以產生具有所需直徑之脂質體。化學治療劑視情況包含於脂質體內(參見Gabizon等人, J. National Cancer Inst.81:1484(1989))。具有延長之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。 使用免疫結合物及放射性免疫結合物及其組合物之方法
在一個態樣中，本發明提供一種治療有需要之患者之疾病、病症或病狀的方法，該方法包含向有需要之受試者投與醫藥學上有效量之本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物。對於一些其他實施例，該方法用於抑制癌細胞或腫瘤之生長及/或殺死癌細胞或腫瘤。在另一態樣中，本發明提供本文所述之免疫結合物用於製備及/或製造供治療受試者之疾病、病症或病狀(諸如癌症)用之藥劑的用途。
本發明之醫藥組合物可以適於待治療(或預防)疾病之方式投與。儘管可藉由臨床試驗確定適當劑量，但投與數量及頻率將由諸如以下之因素決定：患者之病況，及患者之疾病的類型及嚴重度。
在一個實施例中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物可用於在患有與目標抗原表現及/或活性增加相關之病症的個體中結合目標抗原之方法中，該方法包含向該個體投與免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物以使得結合個體中之目標抗原。在一個實施例中，目標抗原為人類目標抗原，且個體為人類個體。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物可出於治療目的投與人類。此外，可將本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物投與表現目標抗原之非人類哺乳動物(免疫結合物或放射性免疫結合物(例如靈長類動物、豬、大鼠或小鼠)與該目標抗原交叉反應)用於獸醫學目的或作為人類疾病之動物模型。關於後者，此類動物模型可適用於評估本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物之治療功效(例如測試投與之劑量及時程)。
本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物(及任何額外治療劑或佐劑)可以藉由任何適合方式投與，包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內，及局部治療需要時，病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。另外，抗體宜藉由脈動輸注投與，特定言之，在抗體劑量遞減的情況下投與。部分視投藥為短期抑或長期而定，可藉由任何適合途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。
本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物以符合良好醫學實務的方式調配、給藥且投與。在此情形下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之病因、藥劑遞送部位、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。可根據已知方法向人類患者投與本發明之免疫結合物，諸如靜脈內投與，例如以食團形式或藉由經一段時間連續輸注，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、表面或吸入途徑。對於一些實施例，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物的靜脈內或皮下投藥係較佳的。
為了預防或治療疾病，投藥之劑量及模式將由醫師根據已知準則來選擇。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物之適當劑量將視以下而定：如上文所定義之欲治療的疾病類型、疾病的嚴重度及過程、本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物根據預防抑或治療目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物的反應，及主治醫師的判斷。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物適合一次性或經一系列治療向患者投與。較佳地，免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物係藉由靜脈內輸注或藉由皮下注射來投與。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1微克/公斤(µg/kg)至約50毫克/公斤(mg/kg)體重(例如約0.1至15 mg/kg/劑)之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物可為例如藉由一或多次分開投藥抑或藉由連續輸注向患者投與之初始候選劑量。給藥方案可包含投與約4 mg/kg之初始負載劑量，接著為約2 mg/kg之每週維持劑量的本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物。然而，其他給藥方案可為適用的。視上文所提及之因素而定，典型的每日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更大範圍內。對於經若干天或更長時間的重複投與而言，視病狀而定，持續治療直至出現對疾病症狀之所需抑制為止。療法之進展可容易地藉由習知方法及分析且基於醫師或熟習此項技術之其他人士已知的準則來監測。
劑量及投與時程可基於受試者之疾病水準或耐受性來選擇及調整，其可在治療過程期間加以監測。本發明結合物可每天一次、每週一次、每週多次但少於每天一次、每月多次但少於每天一次、每月多次但少於每週一次、每月一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次或間歇地投與以減輕或減緩疾病症狀。投與可以任何所揭示之時間間隔繼續，直至腫瘤或所治療癌症的症狀緩解。投與可在達成症狀緩解或減輕之後繼續，其中該緩解或減輕因該繼續投與而延長。
對於一些實施例，免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物之有效量可以單次劑量提供。
本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物可與習知及/或新穎治療方法或療法組合使用或以單一療法形式分別使用。在一些實施例中，本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物可與一或多種輻射敏化劑一起使用。此類敏化劑包括可增加癌細胞對輻射療法之敏感性的任何藥劑。在其他實施例中，本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物可與可加強放射療法之生物效應之新穎及/或習知藥劑組合使用。腫瘤之照射可引起多種生物學後果，可藉由將本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物與標靶相關途徑之藥劑組合來利用該等後果。在一些實施例中，此類藥劑可減少腫瘤血管生成，或抑制局部侵襲及癌轉移，或預防再生，或增強免疫反應，或解除對細胞能量的調節，或減少種群，或改變腫瘤代謝，或增加腫瘤損傷，或減少DNA修復。在某些實施例中，與本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物組合使用之藥劑可包含DDR抑制劑，例如PARP、ATR、Chk1或DNA-PK；或存活信號傳導抑制劑，例如mTOR、PI3k、NF-kB；或抗缺氧劑，例如HIF-1-α、CAP或UPR；或代謝抑制劑，例如MCT1、MCT4抑制劑；或免疫治療劑，例如抗CTLA4、抗PD-1；或生長因子信號轉導抑制劑，例如EGFR或MAPK抑制劑；或抗侵襲劑，例如激酶抑制劑、趨化因子抑制劑或整合素抑制劑；或抗血管生成劑，例如VEGF-抑制劑。
本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物可(i)抑制其所結合之細胞的生長或增殖；(ii)誘導其所結合之細胞的死亡；(iii)抑制其所結合之細胞的分層；(iv)抑制其所結合之細胞的轉移；或(v)抑制包含其所結合之細胞的腫瘤的血管形成。在此上下文中，「抑制細胞生長或增殖」意謂使細胞生長或增殖減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，且包括誘導細胞死亡。
舉例而言，抑制腫瘤細胞生長之免疫結合物為引起腫瘤細胞(例如癌細胞)之可量測生長抑制的免疫結合物。在一個實施例中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物能夠抑制展示免疫結合物或放射性免疫結合物所結合之抗原的癌細胞生長。較佳生長抑制性免疫結合物或放射性免疫結合物相較於適當對照抑制表現抗原之腫瘤細胞生長超過20%，較佳約20%至約50%，且甚至更佳超過50%(例如約50%至約100%)，對照典型地為未用所測試之免疫結合物或放射性免疫結合物處理的腫瘤細胞。
對於一些實施例，大多數投與受試者之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物典型地由無標記免疫結合物組成，其中少數為標記放射性免疫結合物。可使用已知方法調節標記放射性免疫結合物與無標記免疫結合物之比率。因此，根據本發明之某些態樣，免疫結合物/放射性免疫結合物以至多100 mg之總蛋白量來提供，諸如小於60 mg或5 mg至45 mg，或0.l µg/kg至l mg/kg患者重量之總蛋白量，諸如l µg/kg至l mg/kg患者重量，或l0 µg/kg至l mg/kg患者重量，或l00 µg/kg至l mg/kg患者重量，或0.l µg/kg至l00 µg/kg患者重量，或0.l µg/kg至50 µg/kg患者重量，或0.l µg/kg至l0 µg/kg患者重量，或0.l µg/kg至40 µg/kg患者重量，或l µg/kg至40 µg/kg患者重量，或0.1 mg/kg至1.0 mg/kg患者重量，諸如0.2 mg/kg患者重量至0.6 mg/kg患者重量。
在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物可以約0.5 mg/kg至約30 mg/kg投與。I在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物可投與約0.5 mg/kg至約1 mg/kg、約0.5 mg/kg至約2 mg/kg、約0.5 mg/kg至約5 mg/kg、約0.5 mg/kg至約10 mg/kg、約0.5 mg/kg至約3 mg/kg、約0.5 mg/kg至約4 mg/kg、約0.5 mg/kg至約5 mg/kg、約0.5 mg/kg至約10 mg/kg、約0.5 mg/kg至約20 mg/kg、約0.5 mg/kg至約30 mg/kg、約1 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約3 mg/kg、約1 mg/kg至約4 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg至約30 mg/kg、約2 mg/kg至約5 mg/kg、約2 mg/kg至約10 mg/kg、約2 mg/kg至約3 mg/kg、約2 mg/kg至約4 mg/kg、約2 mg/kg至約5 mg/kg、約2 mg/kg至約10 mg/kg、約2 mg/kg至約20 mg/kg、約2 mg/kg至約30 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約3 mg/kg、約5 mg/kg至約4 mg/kg、約5 mg/kg至約5 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約20 mg/kg、約5 mg/kg至約30 mg/kg、約10 mg/kg至約3 mg/kg、約10 mg/kg至約4 mg/kg、約10 mg/kg至約5 mg/kg、約10 mg/kg至約10 mg/kg、約10 mg/kg至約20 mg/kg、約10 mg/kg至約30 mg/kg、約3 mg/kg至約4 mg/kg、約3 mg/kg至約5 mg/kg、約3 mg/kg至約10 mg/kg、約3 mg/kg至約20 mg/kg、約3 mg/kg至約30 mg/kg、約4 mg/kg至約5 mg/kg、約4 mg/kg至約10 mg/kg、約4 mg/kg至約20 mg/kg、約4 mg/kg至約30 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約20 mg/kg、約5 mg/kg至約30 mg/kg、約10 mg/kg至約20 mg/kg、約10 mg/kg至約30 mg/kg，或約20 mg/kg至約30 mg/kg。在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物可以約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約20 mg/kg或約30 mg/kg投與。在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物可以投與至少約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg或約20 mg/kg。在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物可投與至多約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約20 mg/kg或約30 mg/kg。
在一些實施例中，方法包含投與有效量之包含225-Ac之放射性免疫結合物，有效量為0.01至0.1 mCi，或0.1 mCi至1.0 mCi，或1.0 mCi至2.0 mCi，或2.0 mCi至4.0 mCi。
在一些實施例中，該方法包含投與有效量的包含225-Ac之放射性免疫結合物，有效量為0.1 µCi/kg至2.0 µCi/kg受試者重量，或0.1 µCi/kg至1.0 µCi/kg受試者重量，或1.0 µCi/kg至3.0 µCi/kg受試者重量，或3.0 µCi/kg至10.0 µCi/kg受試者重量，或10.0 µCi/kg至20.0 µCi/kg受試者重量，或10.0 µCi/kg至30.0 µCi/kg受試者重量。
在某些實施例中，225-Ac之有效量為約0.1微居里至約20微居里。在某些實施例中，225-Ac之有效量為約0.1微居里至約0.2微居里、約0.1微居里至約0.5微居里、約0.1微居里至約1微居里、約0.1微居里至約2微居里、約0.1微居里至約3微居里、約0.1微居里至約4微居里、約0.1微居里至約5微居里、約0.1微居里至約10微居里、約0.1微居里至約20微居里、約0.2微居里至約0.5微居里、約0.2微居里至約1微居里、約0.2微居里至約2微居里、約0.2微居里至約3微居里、約0.2微居里至約4微居里、約0.2微居里至約5微居里、約0.2微居里至約10微居里、約0.2微居里至約20微居里、約0.5微居里至約1微居里、約0.5微居里至約2微居里、約0.5微居里至約3微居里、約0.5微居里至約4微居里、約0.5微居里至約5微居里、約0.5微居里至約10微居里、約0.5微居里至約20微居里、約1微居里至約2微居里、約1微居里至約3微居里、約1微居里至約4微居里、約1微居里至約5微居里、約1微居里至約10微居里、約1微居里至約20微居里、約2微居里至約3微居里、約2微居里至約4微居里、約2微居里至約5微居里、約2微居里至約10微居里、約2微居里至約20微居里、約3微居里至約4微居里、約3微居里至約5微居里、約3微居里至約10微居里、約3微居里至約20微居里、約4微居里至約5微居里、約4微居里至約10微居里、約4微居里至約20微居里、約5微居里至約10微居里、約5微居里至約20微居里，或約10微居里至約20微居里。在某些實施例中，225-Ac之有效量為約0.1微居里、約0.2微居里、約0.5微居里、約1微居里、約2微居里、約3微居里、約4微居里、約5微居里、約10微居里或約20微居里。在某些實施例中，225-Ac之有效量為至少約0.1微居里、約0.2微居里、約0.5微居里、約1微居里、約2微居里、約3微居里、約4微居里、約5微居里或約10微居里。在某些實施例中，225-Ac之有效量為至多約0.2微居里、約0.5微居里、約1微居里、約2微居里、約3微居里、約4微居里、約5微居里、約10微居里或約20微居里。根據其中放射性免疫結合物之放射性同位素為111-In之態樣，有效量低於例如15.0 mCi(亦即其中投與至受試者之111-In的量遞送低於15.0 mCi之全身輻射劑量)。
根據放射性免疫結合物之放射性同位素為111-In之態樣，有效量低於15.0 mCi、低於14.0 mCi、低於13.0 mCi、低於12.0 mCi、低於11.0 mCi、低於10.0 mCi.、低於9.0 mCi、低於8.0 mCi、低於7.0 mCi、低於6.0 mCi、低於5.0 mCi、低於4.0 mCi、低於3.5 mCi、低於3.0 mCi、低於2.5 mCi、低於2.0 mCi、低於1.5 mCi、低於1.0 mCi、低於0.5 mCi、低於0.4 mCi、低於0.3 mCi、低於0.2 mCi或低於0.1 mCi。
根據放射性免疫結合物之放射性同位素為111-In之態樣，有效量為0.1 mCi至1.0 mCi、0.1 mCi至2.0 mCi、1.0 mCi至2.0 mCi、1.0 mCi至3.0 mCi、1.0 mCi至4.0 mCi、1.0 mCi至5.0 mCi、1.0 mCi至10.0 mCi、1.0 mCi至15.0 mCi、1.0 mCi至20.0 mCi、2.0 mCi至3.0 mCi、3.0 mCi至4.0 mCi、4.0 mCi至5.0 mCi、5.0 mCi至10.0 mCi、5.0 mCi至15.0 mCi、5.0 mCi至20.0 mCi、6.0 mCi至14.0 mCi、7.0 mCi至13.0 mCi、8.0 mCi至12.0 mCi、9.0 mCi至11.0 mCi，或10.0 mCi至15.0 mCi。
根據放射性免疫結合物之放射性同位素為111-In之態樣，有效量為15.0 mCi、14.0 mCi、13.0 mCi、12.0 mCi、11.0 mCi、10.0 mCi、9.0 mCi、8.0 mCi、7.0 mCi、6.0 mCi、5.0 mCi、4.0 mCi、3.5 mCi、3.0 mCi、2.5 mCi、2.0 mCi、1.5 mCi、1.0 mCi、0.5 mCi、0.4 mCi、0.3 mCi、0.2 mCi，或0.1 mCi。
根據其中放射性免疫結合物之放射性同位素為225-Ac之態樣，有效量低於例如30.0 mCi(亦即其中投與至受試者之225-Ac的量遞送低於30.0 µCi/公斤受試者體重之輻射劑量)。
根據放射性免疫結合物之放射性同位素為225-Ac之態樣，有效量低於30 µCi/kg、25 µCi/kg、20 µCi/kg、17.5 µCi/kg、15.0 µCi/kg、12.5 µCi/kg、10.0 µCi/kg、9 µCi/kg、8 µCi/kg、7 µCi/kg、6 µCi/kg、5 µCi/kg、4.5 µCi/kg、4.0 µCi/kg、3.5 µCi/kg、3.0 µCi/kg、2.5 µCi/kg、2.0 µCi/kg、1.5 µCi/kg、1.0 µCi/kg、0.9 µCi/kg、0.8 µCi/kg、0.7 µCi/kg、0.6 µCi/kg、0.5 µCi/kg、0.4 µCi/kg、0.3 µCi/kg、0.2 µCi/kg、0.1 µCi/kg，或0.05 µCi/kg。
根據放射性免疫結合物之放射性同位素為225-Ac之態樣，有效量為0.05 µCi/kg至0 .1 µCi/kg、0 .1 µCi/kg至0.2 µCi/kg、0.2 µCi/kg至0.3 µCi/kg、0.3 µCi/kg至0.4 µCi/kg、0.4 µCi/kg至0.5 µCi/kg、0.5 µCi/kg至0.6 µCi/kg、0.6 µCi/kg至0.7 µCi/kg、0.7 µCi/kg至0.8 µCi/kg、0.8 µCi/kg至0.9 µCi/kg、0.9 µCi/kg至1.0 µCi/kg、1.0 µCi/kg至1.5 µCi/kg、1.5 µCi/kg至2.0 µCi/kg、2.0 µCi/kg至2.5 µCi/kg、2.5 µCi/kg至3.0 µCi/kg、3.0 µCi/kg至3.5 µCi/kg、3.5 µCi/kg至4.0 µCi/kg、4.0 µCi/kg至4.5 µCi/kg，或4.5 µCi/kg至5.0 µCi/kg。
根據放射性免疫結合物之放射性同位素為225-Ac之態樣，有效量為0.05 µCi/kg、0.1 µCi/kg、0.2 µCi/kg、0.3 µCi/kg、0.4 µCi/kg、0.5 µCi/kg、0.6 µCi/kg、0.7 µCi/kg、0.8 µCi/kg、0.9 µCi/kg、1.0 µCi/kg、1.5 µCi/kg、2.0 µCi/kg、2.5 µCi/kg、3.0 µCi/kg、3.5 µCi/kg、4.0 µCi/kg或4.5 µCi/kg、5.0 µCi/kg、6.0 µCi/kg、7.0 µCi/kg、8.0 µCi/kg、9.0 µCi/kg、10.0 µCi/kg、12.5 µCi/kg、15.0 µCi/kg、17.5 µCi/kg、20.0 µCi/kg、25 µCi/kg，或30 µCi/kg。
在放射性免疫結合物之放射性同位素為177-Lu的某些實施例中，有效量為0.1 uCi至100 mCi/平方公尺體表面積。
在放射性免疫結合物之放射性同位素為177-Lu的某些實施例中，有效量為1 mCi至100 mCi/平方公尺體表面積。在某些實施例中，有效量為約1/平方公尺至約100/平方公尺。在某些實施例中，有效量為約1/平方公尺至約5/平方公尺、約1/平方公尺至約10/平方公尺、約1/平方公尺至約15/平方公尺、約1/平方公尺至約20/平方公尺、約1/平方公尺至約25/平方公尺、約1/平方公尺至約75/平方公尺、約1/平方公尺至約100/平方公尺、約5/平方公尺至約10/平方公尺、約5/平方公尺至約15/平方公尺、約5/平方公尺至約20/平方公尺、約5/平方公尺至約25/平方公尺、約5/平方公尺至約75/平方公尺、約5/平方公尺至約100/平方公尺、約10/平方公尺至約15/平方公尺、約10/平方公尺至約20/平方公尺、約10/平方公尺至約25/平方公尺、約10/平方公尺至約75/平方公尺、約10/平方公尺至約100/平方公尺、約15/平方公尺至約20/平方公尺、約15/平方公尺至約25/平方公尺、約15/平方公尺至約75/平方公尺、約15/平方公尺至約100/平方公尺、約20/平方公尺至約25/平方公尺、約20/平方公尺至約75/平方公尺、約20/平方公尺至約100/平方公尺、約25/平方公尺至約75/平方公尺、約25/平方公尺至約100/平方公尺，或約75/平方公尺至約100/平方公尺。在某些實施例中，有效量為約1/平方公尺、約5/平方公尺、約10/平方公尺、約15/平方公尺、約20/平方公尺、約25/平方公尺、約75/平方公尺，或約100/平方公尺。在某些實施例中，有效量為至少約1/平方公尺、約5/平方公尺、約10/平方公尺、約15/平方公尺、約20/平方公尺、約25/平方公尺，或約75/平方公尺。在某些實施例中，有效量為至多約5/平方公尺、約10/平方公尺、約15/平方公尺、約20/平方公尺、約25/平方公尺、約75/平方公尺，或約100/平方公尺。
根據本發明之某些態樣，本發明之放射性免疫結合物的製劑或其組合物(例如醫藥組合物)可包含放射性標記部分(放射性免疫結合物)及未標記部分(免疫結合物)，其中標記:未標記之比率可為約1: 1000至1: 1。
此外，醫藥組合物可以針對特定患者定製之單次劑量組合物形式提供，亦即以患者特異性治療組合物形式提供，其中組合物中標記及未標記之免疫結合物(為了清楚起見，標記之免疫結合物與本文中之放射性免疫結合物相同)的量可至少視患者體重、身高、體表面積、年齡、性別及/或疾病狀態或健康狀況而定。因此，患者特異性治療組合物之總體積可提供於小瓶中，該小瓶經組態以在一個療程中完全向患者投與，使得在投與之後在小瓶中幾乎沒有剩餘組合物。
目前，取決於癌症之階段，癌症治療涉及以下療法中之一者或組合：手術移除癌組織、輻射療法及化學療法。使用本發明之放射性免疫結合物(可互換地，「經放射性標記之免疫結合物」)的療法在不耐受化學療法之毒性及副作用的老年患者中及在輻射療法之有效性有限的轉移性疾病中可能尤其合乎需要。對於一些實施例，使用本發明之放射性標記免疫結合物的療法適用於在疾病最初診斷後或在復發期間減緩表現目標抗原之癌症。
在一些實施例中，確定癌症是否適合於藉由本文所揭示之方法治療涉及偵測受試者中或來自受試者之樣品中目標抗原的存在。為測定癌症中之目標抗原表現，可使用各種偵測分析。在一個實施例中，藉由免疫組織化學(IHC)分析目標抗原過度表現。來自腫瘤生檢之石蠟包埋組織切片進行IHC分析且符合目標抗原染色強度準則。或者或另外，可對福馬林固定、石蠟包埋之腫瘤組織進行諸如INFORM®(由Ventana，AZ，U.S.A.出售)或PATHVISION®(Vysis，IL，U.S.A.)的FISH分析以確定腫瘤中目標抗原過度表現之程度(若存在)。
目標抗原過度表現或擴增可以使用活體內偵測分析來評估，例如藉由投與結合待偵測之分子且用可偵測標記(例如放射性同位素或螢光標記)標記的分子(諸如本發明之抗體構築體或免疫結合物)且外部掃描患者以定位標記。 2.使用本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物用於殺死細胞
本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物可用於例如活體外、離體及活體內方法中。在一個態樣中，本發明提供用於活體內或活體外抑制細胞生長或增殖之方法，該方法包含在允許本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物結合至目標抗原之條件下使細胞暴露於該免疫結合物或放射性免疫結合物。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物亦可(i)抑制其所結合之細胞的生長或增殖；(ii)誘導其所結合之細胞的死亡；(iii)抑制其所結合之細胞的分層；(iv)抑制其所結合之細胞的轉移；或(v)抑制包含其所結合之細胞的腫瘤的血管形成。
在一個態樣中，本發明提供一種殺死表現抗原之細胞的方法，該方法包含使該細胞與本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物(或其組合物)接觸。此方法可用於自混合細胞群例如殺死、消耗或消除表現目標抗原之細胞。此方法可用於自混合細胞群例如殺死、消耗或消除表現目標抗原之細胞作為純化其他細胞中之步驟。此方法可活體外或活體內，包括離體對初生患者細胞或組織組合物進行以製備此類用於移植之組合物。
在一個態樣中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物用於治療或預防細胞增殖性病症。在某些實施例中，細胞增殖性病症包含實體腫瘤癌症。實體腫瘤癌症為包含異常組織塊(例如，癌瘤及肉瘤)之癌症。在某些其他實施例中，細胞增殖性病症包含可互換使用之液體腫瘤癌症或血液癌症，諸如體液中存在之癌症，例如白血病及淋巴瘤。在某些實施例中，細胞增殖性病症與目標抗原增加的表現及/或活性相關。舉例而言，在某些實施例中，細胞增殖性病症與細胞表面上目標抗原之表現增加相關。在某些實施例中，細胞增殖性病症為腫瘤或癌症。在某些實施例中，細胞增殖性病症包含實體腫瘤癌症。實體腫瘤癌症為包含異常組織塊(例如，癌瘤及肉瘤)之癌症。在某些其他實施例中，細胞增殖性病症包含可互換使用之液體腫瘤癌症或血液癌症，諸如體液中存在之癌症，例如白血病及淋巴瘤。
在一個態樣中，本發明提供治療細胞增殖性病症的方法，包含向個體投與有效量的本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物。
除了直接殺死表現由本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物特異性結合的細胞表面抗原之目標細胞之外，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物視情況可以用於遞送額外載物至目標細胞附近或內部。遞送額外外源性材料可用於例如細胞毒性、細胞生長抑制、資訊收集及/或診斷功能。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物之非細胞毒性變異體，或視情況存在之毒性變異體可以用於遞送載物至表現目標抗原之細胞的內部及/或標記表現目標抗原之細胞的內部。載物之非限制性實例包括細胞毒性劑、偵測促進劑及小分子化學治療劑。 3.使用本發明之抗體構築體、免疫結合物、放射性免疫結合物及標靶成像複合物用於抗原偵測、活體內成像、診斷及預測
如本文所述，在一些實施例中，本發明之抗體構築體、免疫結合物、放射性免疫結合物及標靶成像複合物具有各種非治療應用。在一些實施例中，本發明之組合物可用於鑑別經預測會得益於特定治療方法或方式(諸如用本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物治療)的患者群體。在一些實施例中，本發明之組合物可適用於對表現目標抗原之癌症進行分期(例如藉由放射成像)或作為疾病惡化之預後指標。在一些實施例中，組合物亦適用於例如在ELISA或西方墨點法中活體外偵測及定量目標表位，以及對來自細胞或組織樣品之目標抗原進行純化或免疫沈澱。
對於一些實施例，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物用於偵測抗原之存在或含量的方法中，諸如在生物樣品中活體外偵測或使用成像技術活體內偵測。免疫結合物及放射性免疫結合物偵測可經由習此相關技藝之人士已知且如本文所述之不同技術來達成，例如IHC及PET成像。當本發明之免疫結合物或經放射性標記之免疫結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如99m-Tc或111-In。
本發明之經標記免疫結合物可用作生物醫學及分子成像之各種方法及技術的成像生物標記及探針，諸如：(i) MRI(磁共振成像)；(ii)微CT(電腦化斷層掃描)；(iii) SPECT(單光子發射電腦斷層掃描)；(iv) PET(正電子發射斷層掃描)Chen等人 Bioconjugate Chem.15: 41-9 (2004)；(v)生物發光；(vi)螢光；及(vii)超音波。免疫閃爍攝影術為一種成像程序，其中向動物或人類患者投與經放射性物質標記之抗體且拍攝抗體定位之身體部位的照片(US 6528624)。成像生物標記可以作為正常生物過程、致病過程或對治療性干預之藥理學反應的指標進行客觀量測且評估。
本發明之另一態樣為一種確定懷疑含有目標抗原之樣品中存在目標抗原的方法，其中該方法包含使樣品暴露於結合至目標抗原之免疫結合物及確定免疫結合物結合至樣品中之目標抗原，其中此類結合之存在指示樣品中存在目標抗原。視情況，樣品可含有懷疑表現目標抗原之細胞(其可為癌細胞)。該方法中所用之免疫結合物可視情況經可偵測地標記、連接至固體載體或其類似物。
本發明之另一實施例係針對一種診斷受試者中存在腫瘤之方法，其中該方法包含(a)使包含獲自哺乳動物之組織細胞的測試樣品與結合至目標抗原之免疫結合物接觸，及(b)偵測免疫結合物與測試樣品中之目標抗原之間複合物的形成，其中複合物的形成指示哺乳動物中存在腫瘤。視情況，免疫結合物可偵測地標記、連接至固體載體或其類似物，及/或自懷疑患有癌性腫瘤之個體獲得組織細胞之測試樣品。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物，包括包含前述及/或本文所提供之組合物，適用於偵測例如活體內或生物樣品中目標抗原之存在。本發明之免疫結合物可用於多種不同分析，包括但不限於ELISA、基於珠粒之免疫分析及質譜法。
在一些實施例中，本發明之免疫結合物適用於定量樣品中之目標抗原量。在一些實施例中，生物樣品可為生物流體，諸如全血或全血組分，包括紅血球、白血球、血小板、血清及血漿；腹水、玻璃體液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚液、汗液、黏液、腦脊髓液、尿及可含有所關注目標抗原之其他身體成分。在各個實施例中，樣品為來自任何動物之身體樣品。在一些實施例中，樣品來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品來自人類受試者。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品為生檢材料。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之生檢材料。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品為原生細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之原生細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或用結合相同目標抗原之治療性抗體治療的患者。
在一些實施例中，樣品來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品來自人類受試者，例如當在臨床樣品中量測抗原表現時。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或經療法/治療劑(例如標靶相同目標抗原之抗體療法)治療之患者。在一些實施例中，生物樣本為血清或血漿。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品為生檢材料。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之生檢材料。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品為原生細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之原生細胞培養材料。
在一些實施例中，提供包含『標記』免疫結合物的組合物。標記包括但不限於直接檢測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接檢測之部分(諸如酶或配位體)。例示性標記包括但不限於螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯基(dansyl)、傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；螢光素；2,3-二氫呔𠯤二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；J3-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸酯去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫來氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。
習知方法可用於使此等標記與蛋白質或多肽共價結合。舉例而言，偶合劑(諸如二醛、碳化二亞胺、二順丁烯二醯亞胺、雙醯亞胺酯、雙重氮化聯苯胺及其類似物)可用於用上述螢光、化學發光及酶標記來對本發明之免疫結合物或抗體構築體加標籤。(參見例如US 3,645,090(酶)；US 3,940,475(螢光測定)，Hunter等人, Nature, 144:945 (1962)；David等人, Biochemistry, 13:1014-1021 (1974)；Pain等人, J. Immunol. Methods, 40:219-230 (1981)；Nygren, J. Histochem and Cytochem, 30:407-412 (1982)。
此類標記(包括酶)與免疫結合物或抗體構築體之結合為一般熟習免疫分析技術者之標準操作程序。(參見例如O'Sullivan等人「Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay,」， Methods in Enzymology, J. Langone及H. Van Vunakis編, 第73卷 (Academic Press, New York, New York, 1981), 第147-166頁)。亦可使用適合的市售標記抗體。
在加入最後一個標記免疫結合物後，經由洗滌去除過量未結合標記免疫結合物，然後使用適於該標記的偵測方法量測所連接標記之量，且使量測到之量與生物樣品中所關注免疫結合物之量關聯來測定所結合的免疫結合物之量。舉例而言，在酶之情況下，所產生及量測到之顏色量將為存在之所關注免疫結合物之量的直接量度。特定言之，若HRP為標記，則可使用受質TMD，使用450奈米讀取波長及620或630奈米參考波長來偵測顏色。
在一個實例中，在自固定相洗滌針對未標記的免疫結合物之酶標記第二抗體之後，產生顏色或化學發光且藉由將固定捕捉試劑與酶受質一起培育來量測。接著，藉由與平行運行的所關注免疫結合物所產生之顏色或化學發光進行比較來計算所關注抗體之濃度。
在一些實施例中，方法涉及基於珠粒之免疫分析、ELISA分析或質譜技術。此類質譜儀之質量分析器包括但不限於四極桿(Q)、飛行時間(TOF)、離子阱、扇形磁場或傅立葉變換離子迴旋加速器共振(FT-ICR)或其組合。質譜儀之離子源應主要產生樣品分子離子或假分子離子，及某些可表徵碎片離子。此類離子源之實例包括大氣壓游離源，例如電噴灑游離(ESI)及大氣壓化學游離(APCI)及基質輔助雷射脫附游離(MALDI)。ESI及MALDI為游離蛋白質以進行小分子質譜分析的兩種最常用方法，諸如藉由液相層析質譜法(LC/MS)(Lee, M., LC/MS Applications in Drug Development(2002) J. Wiley & Sons, New York)。另一實例為表面增強雷射脫附游離(SELDI)。SELDI為一種基於表面之游離技術，使得可進行高產出量質譜法。典型地，使用SELDI分析蛋白質與其他生物分子之複雜混合物。SELDI採用化學反應表面，諸如「蛋白質晶片」與溶液中之分析物(例如蛋白質)相互作用。此類表面選擇性地與分析物相互作用且將分析物固定於表面上。因此，本發明之分析物可在晶片上部分純化且接著在質譜儀中快速分析。藉由在受質表面上之不同位點處提供多個反應部分，可增加產出量。
在另一態樣中，本發明提供一種用於偵測生物樣品中之抗原的方法，該方法包含：(a)使生物樣品與本文所述之免疫結合物接觸以使得形成免疫複合物；(b)偵測或量測與樣品結合之免疫結合物的含量。在一些實施例中，將免疫結合物固定至固體載體。在一些實施例中，固定之免疫結合物與生物素結合且與塗佈卵白素之微量滴定盤結合。 本發明之套組及製品
本發明之另一態樣為一種含有適用於治療、預防及/或診斷特徵為表現目標抗原之細胞(例如癌細胞)的疾病及病症之材料的製品。本發明的製品包含容器及處於容器上或容器隨附之標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納可有效治療、預防及/或診斷癌症病狀之組合物且可具有無菌接取口(例如容器可為靜脈注射溶液袋或具有皮下注射針可刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之免疫結合物。標籤或包裝插頁指示該組合物用於治療癌症。標籤或包裝插頁將進一步包含向癌症患者投與免疫結合物組合物之說明書。另外，製品可以進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。製品可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭及注射器。
在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包含本文中所描述之任一免疫結合物及額外試劑或醫藥裝置。在一些其他實施例中，套組包含如本文所提供之組合物(例如醫藥或診斷組合物)。本發明之另一態樣為一種適用於各種目的之套組，例如殺死表現目標抗原之細胞；用於偵測表現目標抗原之細胞；細胞中目標抗原的定量、純化或免疫沈澱。
在一些實施例中，本發明之套組為一種用於特異性偵測生物樣品中之抗原的免疫分析套組，其包含：(a)如本文所述之免疫結合物及/或其組合物；及(b)偵測該免疫結合物之說明書。本發明之目標抗原偵測分析可以套組形式提供。在一些實施例中，此類套組包含本發明之免疫結合物，或包含前述之組合物，諸如本文所述之組合物。套組可進一步包含用於捕捉試劑之固體載體，其可作為分離元件提供或捕捉試劑已固定至該固體載體。對於目標抗原之分離及純化，套組可含有與珠粒(例如瓊脂糖珠粒)偶合之本發明免疫結合物。本發明提供之套組含有用於例如在ELISA或西方墨點法中活體外偵測及/或定量目標抗原的抗體。在一些實施例中，捕捉試劑(例如本發明之免疫結合物)塗佈於固體材料上或連接至固體材料(例如珠粒、微量滴定盤或梳狀物)。可偵測抗體可為直接偵測到之標記抗體或藉由針對未標記抗體之標記抗體偵測到之未標記抗體，諸如在不同物種中產生的抗體。在標記為酶之情況下，套組通常將包括酶所需之受質及輔因子；在標記為螢光團的情況下，將包括提供可偵測發色團之染料前驅體；且在標記為生物素的情況下，將包括抗生物素蛋白，諸如抗生物素蛋白、卵白素或用MUG與HRP或β-半乳糖苷酶結合之卵白素。
如同本發明之製品一樣，本發明之套組包含容器及容器上或容器隨附之標籤或包裝插頁。容器容納包含至少一種本發明免疫結合物之組合物。可包括額外容器，其含有例如稀釋劑及緩衝劑、對照免疫結合物或抗體。標籤或包裝插頁可提供對組合物之描述以及對預期活體外或偵測用途之說明書。該套組典型地亦含有用於進行分析方法之添加劑，諸如穩定劑、洗滌及培育緩衝劑及其類似物。套組之組分將以預定比率提供，其中各種試劑之相對量適當地變化以提供在試劑溶液中實質上使分析之敏感性達到最大的濃度。特定言之，試劑可以通常凍乾之乾粉形式提供，包括賦形劑，該等賦形劑在溶解時將提供具有適當濃度的試劑溶液，以與待測試樣品組合。
本發明藉由以下包含前述結構及功能之免疫結合物的非限制性實例進一步說明，特定言之具有VHH多肽的平台，分子量在60與110kDa之間，血清半衰期小於96小時，其在一些實施例中，相對於其他抗體片段平台，在特定放射性標記過程所需的溫度期間展現出增強的穩定性，且在一些實施例中，與其他可能之遞送平台相比，由於放射分解，展現出標靶能力損失的減少。 本發明之特定經編號實施例 1.     一種用於活體內遞送α-發射放射性同位素之免疫結合物，其包含：a)由兩個抗原結合臂組成之抗體構築體，該等抗原結合臂中之每一者係獨立地由以下組成：(i)抗原結合區、(ii)鉸鏈區及(iii)變異恆定區；其中該抗原結合區共價鍵聯至該鉸鏈區且該鉸鏈區共價鍵聯至該變異恆定區，使得該鉸鏈區插入該抗原結合區與該變異恆定區之間且藉此連接該抗原結合區與該變異恆定區；其中該等抗原結合區中之至少一者由一或兩種僅重鏈可變(VHH)多肽組成；其中該等變異恆定區中之至少一者具有至少一個FcRn結合突變；且其中該等抗原結合臂彼此共價鍵聯；及b)螯合劑；其中該螯合劑能夠螯合α-發射放射性同位素以使得該抗體構築體鍵聯至該α-發射放射性同位素；且，其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa、60與100 kDa、60與90 kDa、65與90 kDa及/或70與90 kDa之間。 2.     如實施例1之免疫結合物，其中該等抗原結合區結合至相同抗原。 3.     如實施例1之免疫結合物，其中該等抗原結合區結合至不同抗原。 4.     如實施例1或2之免疫結合物，其中該等抗原結合區相同。 5.     如實施例1、2或3之免疫結合物，其中該等抗原結合區不同。 6.     如實施例1至5中任一例之免疫結合物，其中各抗原結合區由一或兩種VHH多肽組成。 7.     如實施例6之免疫結合物，其中各抗原結合區由一個VHH多肽組成。 8.     如實施例7之免疫結合物，其中該等VHH多肽結合至相同抗原。 9.     如實施例8之免疫結合物，其中該等VHH多肽相同。 10.   如實施例7之免疫結合物，其中該等VHH多肽結合至不同抗原。 11.   如實施例1至10中任一例之免疫結合物，其中該等變異恆定區相同。 12.   如實施例1至10中任一例之免疫結合物，其中該等變異恆定區不同。 13.   如實施例1至12中任一例之免疫結合物，其中該等鉸鏈區相同。 14.   如實施例1至12中任一例之免疫結合物，其中該等鉸鏈區不同。 15.   如實施例1至14中任一例之免疫結合物，其中該等變異恆定區中之至少一者由CH2域及CH3域組成，其中該CH2域及該CH3域為人類抗體域。 16.   如實施例15之免疫結合物，其中各變異恆定區由CH2域及CH3域組成，其中該CH2域及該CH3域為人類抗體域。 17.   如實施例1至16中任一例之免疫結合物，其中各變異恆定區具有至少一個FcRn結合突變。 18.   如實施例1或17中任一例之免疫結合物，其中至少一個該FcRn結合突變係選自由位置251、252、253、254、255、288、309、310、312、385、386、388、400、415、433、435、436、439及447組成之群。 19.   如實施例1至18中任一例之免疫結合物，其中至少一個該變異恆定區與IgG1相比具有降低之效應功能。 20.   如實施例1至19中任一例之免疫結合物，其中該免疫結合物之血清半衰期小於96小時、小於72小時、小於60小時、小於48小時、小於36小時、小於24小時或小於12小時。 21.   一種放射性免疫結合物，其包含如實施例1至20中任一例之免疫結合物及α-發射放射性同位素。 22.   如實施例21之放射性免疫結合物，其中該α-發射放射性同位素係選自由以下組成之群：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。 23.   如實施例22之放射性免疫結合物，其中該放射性同位素為225-Ac。 24.   一種醫藥組合物，其包含如實施例21至23中任一例之放射性免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。 25.   一種將α-發射放射性同位素在患者活體內遞送至癌細胞之方法，其包含向該患者投與如實施例24之醫藥組合物。 26.   一種抑制癌細胞生長之方法，其包含使該癌細胞與如實施例21至23中任一例之放射性免疫結合物接觸。 27.   一種殺死癌細胞之方法，其包含使該癌細胞與如實施例21至23中任一例之放射性免疫結合物接觸。 28.   如實施例26或27之方法，其中該癌細胞在患者活體內。 29.   一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包含向該患者投與如實施例24之醫藥組合物。 30.   如實施例25、28或29之方法，其中該患者為人類患者。 31.   一種套組，其包含如實施例1至20中任一例之免疫結合物或如實施例21至23中任一例之放射性免疫結合物或如實施例24之醫藥組合物。 32.   一種用於製備醫藥組合物之套組，其包含如實施例1至20中任一例之免疫結合物。 33.   一種用於製備醫藥組合物之套組，其包含如實施例21至23中任一例之放射性免疫結合物。 34.   一種用於活體內遞送α-發射放射性同位素之免疫結合物，其包含：a)由兩個抗原結合臂組成之抗體構築體，該等抗原結合臂中之每一者係獨立地由以下組成：(i)抗原結合區、(ii)鉸鏈區及(iii)變異恆定區；其中該抗原結合區共價鍵聯至該鉸鏈區且該鉸鏈區共價鍵聯至該變異恆定區，使得該鉸鏈區插入該抗原結合區與該變異恆定區之間且藉此連接該抗原結合區與該變異恆定區；其中該等抗原結合區中之每一者結合至相同抗原且由具有相同胺基酸序列之單一VHH多肽組成；其中該等變異恆定區具有相同胺基酸序列且該等變異恆定區中之每一者由CH2域及CH3域組成，其中該等變異恆定區中之每一者具有至少一個FcRn結合突變；其中該等鉸鏈區具有相同胺基酸序列；且其中該等抗原結合臂彼此共價鍵聯；及b)螯合劑；其中該螯合劑能夠螯合α-發射放射性同位素以使得該抗體構築體鍵聯至該α-發射放射性同位素；且，其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa、60與100 kDa、60與90 kDa、65與90 kDa及/或70與90 kDa之間。 35.   一種用於活體內遞送α-發射放射性同位素之免疫結合物，其包含：a)由兩個抗原結合臂組成之抗體構築體，該等抗原結合臂中之每一者係獨立地由以下組成：(i)抗原結合區、(ii)鉸鏈區及(iii)變異恆定區；其中該抗原結合區共價鍵聯至該鉸鏈區且該鉸鏈區共價鍵聯至該變異恆定區，使得該鉸鏈區插入該抗原結合區與該變異恆定區之間且藉此連接該抗原結合區與該變異恆定區；其中該等抗原結合區結合至不同抗原且由具有不同胺基酸序列之單一VHH多肽組成；其中該等變異恆定區具有相同胺基酸序列且該等變異恆定區中之每一者由CH2域及CH3域組成，其中該等變異恆定區中之每一者具有至少一個FcRn結合突變；其中該等鉸鏈區具有相同胺基酸序列；且其中該等抗原結合臂彼此共價鍵聯；及b)螯合劑；其中該螯合劑能夠螯合α-發射放射性同位素以使得該抗體構築體鍵聯至該α-發射放射性同位素；且，其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa、60與100 kDa、60與90 kDa、65與90 kDa及/或70與90 kDa之間。 36.    如實施例34或35之免疫結合物，其中該CH2域及該CH3域為人類抗體域。 37.   如實施例34或36中任一例之免疫結合物，其中至少一個該FcRn結合突變係選自由位置251、252、253、254、255、288、309、310、312、385、386、388、400、415、433、435、436、439及447組成之群。 38.   如實施例34至37中任一例之免疫結合物，其中該等變異恆定區與IgG1相比具有降低之效應功能。 39.   如實施例34至38中任一例之免疫結合物，其中該免疫結合物之血清半衰期小於96小時、小於72小時、小於60小時、小於48小時、小於36小時、小於24小時或小於12小時。 40.   一種放射性免疫結合物，其包含如實施例34至39中任一例之免疫結合物及α-發射放射性同位素。 41.   如實施例40之放射性免疫結合物，其中該α-發射放射性同位素係選自由以下組成之群：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。 42.   如實施例41之放射性免疫結合物，其中該放射性同位素為225-Ac。 43.   一種醫藥組合物，其包含如實施例40至42中任一例之放射性免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。 44.   一種將α-發射放射性同位素在患者活體內遞送至癌細胞之方法，其包含向該患者投與如實施例43之醫藥組合物。 45.   一種抑制癌細胞生長之方法，其包含使該癌細胞與如實施例40至42中任一例之放射性免疫結合物接觸。 46.   一種殺死癌細胞之方法，其包含使該癌細胞與如實施例40至42中任一例之放射性免疫結合物接觸。 47.   如實施例45或46之方法，其中該癌細胞在患者活體內。 48.   一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包含向該患者投與如實施例43之醫藥組合物。 49.   如實施例44、47或48之方法，其中該患者為人類患者。 50.   一種套組，其包含如實施例34至39中任一例之免疫結合物、如實施例40至42中任一例之放射性免疫結合物或如實施例43之醫藥組合物。 51.   一種用於製備醫藥組合物之套組，其包含如實施例34至39中任一例之免疫結合物。 52.   一種用於製備醫藥組合物之套組，其包含如實施例40至42中任一例之放射性免疫結合物。 53.   一種標靶成像複合物，其包含如實施例1至20中任一例或如實施例34至39中任一例之免疫結合物，進一步包含成像金屬。 54.   如實施例53之標靶成像複合物，其中該成像金屬為111-In。 55.   如實施例18或37之免疫結合物，其中至少一個FcRn結合突變係選自由以下位置組成之群：253、254、310、435及436。 56.   如實施例55之免疫結合物，其中至少一個FcRn結合突變係選自由以下組成之群：I253A、I253D、I253P、S254A、H310A、H310D、H310E、H310Q、H435A、H435Q及Y436A。 一些定義
在本說明書中，闡述某些特定細節以便提供對各個實施例之透徹理解。然而，熟習此項技術者將理解，所提供之實施例可在無此等細節的情況下實施。除非上下文另外要求，否則在通篇說明書及隨後申請專利範圍中，詞語「包含(comprise)」及其變化形式(諸如「包含(comprises/comprising)」)應視為開放的、包括性的含義，亦即「包括但不限於」。除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「所述(the)」包含複數個參考物。亦應注意，除非上下文明確規定，否則術語「或」一般以其包括「及/或」之含義而使用。另外，本文中所提供之標題僅為方便起見，而不解釋所主張之實施例之範疇或含義。
除非另外指明，否則本發明之實務將採用在此項技術內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術。此類技術充分解釋於以下文獻中，諸如「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第二版 (Sambrook等人, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」 (M. J. Gait, 編, 1984)；「Animal Cell Culture」 (R. I. Freshney, 編, 1987)；「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」 (F. M. Ausubel等人,編, 1987及定期更新)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis等人, 編, 1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」 (Perbal Bernard V., 1988)；「Phage Display: A Laboratory Manual」 (Barbas等人, 2001)。習此相關技藝之人士應能識別類似或等效於本文所描述之多種方法及材料，其可用於本發明之實務中。實際上，本發明決不限於所述方法及材料。出於本發明之目的，一些術語定義如下。
如說明書及隨附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外明確地規定，否則術語「一(a/an)」及「該(the)」包括單數及複數個參考物。
在整個本說明書中，術語「包括」用於意指「包括但不限於」。「包括」及「包括但不限於」可互換使用。
如本文所用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之相應值的常見誤差範圍。本文中對「約」一值或參數之提及包括(且描述)本身係關於彼值或參數之實施例。當在例如數值溫度、時間、量或濃度之數值名稱(包括範圍)之前使用時，術語「約」指示可能有±10%、±5%或±1%之變化的近似值。
術語「胺基酸殘基」或「胺基酸」包括參考併入蛋白質、多肽及/或肽中之胺基酸。術語「多肽」包括胺基酸或胺基酸殘基之任何聚合物。術語「多肽序列」係指物理上構成多肽之一系列胺基酸或胺基酸殘基。「蛋白質」為包含一或多個多肽或多肽「鏈」之大分子。「肽」為大小為2至20個胺基酸殘基之小型多肽。術語「胺基酸序列」係指一系列胺基酸或胺基酸殘基，取決於長度物理上構成肽或多肽。除非另外指明，否則本文揭示之多肽及蛋白質序列自左至右書寫，表示其自胺基末端至羧基末端之次序。
術語「胺基酸」、「胺基酸殘基」、「胺基酸序列」或多肽序列包括天然存在之胺基酸(包括L及D立體異構體(isosteriomer))，且除非另外限制，否則亦包括可以類似於常見天然胺基酸之方式起作用之天然胺基酸之已知類似物，諸如硒半胱胺酸、吡咯離胺酸、 N-甲醯基甲硫胺酸、γ-羧基麩胺酸、羥基脯胺酸羥嘌呤、焦麩胺酸及硒甲硫胺酸(參見例如Ho J等人, ACS Synth Biol5: 163-71 (2016); Wang Y, Tsao M, Chembiochem 17: 2234-9 (2016))。本文所提及之胺基酸藉由如下表A中之簡寫名稱描述：
如本文所用，術語「放射性同位素」包括但不限於α發射同位素(可互換地，α-發射同位素)、β發射同位素(可互換地，β-發射同位素)及/或γ發射同位素(可互換地，γ-發射同位素)，諸如以下中的任一者：86-Y、90-Y、177-Lu、186-Re、188-Re、89-Sr、153-Sm、225-Ac、213-Bi、213-Po、212-Bi、223-Ra、224-Ra、227-Th、149-Tb、68-Ga、64-Cu、67-Cu、89-Zr、137-Cs、212-Pb及103-Pd。
如本文所用，術語「放射性免疫結合物」係指分子複合物，其包含(1)本發明之免疫結合物及(2)放射性同位素。在一較佳實施例中，放射性同位素為α-發射放射性同位素。在另一實施例中，放射性同位素為β-發射放射性同位素。在另一實施例中，放射性同位素為ɣ-發射同位素。在另一實施例中，本發明提供包含α-發射及β-發射放射性同位素之放射性免疫結合物。術語「放射性結合物」在本文中可與術語「放射性免疫結合物」互換使用。在一個實施例中，放射性同位素與放射性免疫結合物之螯合劑締合。在一個實施例中，放射性同位素直接鍵聯至免疫結合物。
如本文所用，術語「免疫結合物」係指分子複合物，其包含至少一個來源於抗體之抗原結合區(例如可變區或互補決定區)，該抗原結合區進一步與至少一種非抗體來源分子，諸如螯合劑或細胞毒性劑偶合。非抗體來源分子可例如結合至抗原結合區之一或多個離胺酸或半胱胺酸殘基或結合至與抗原結合區偶合(藉由肽鍵或以其他方式)之恆定區。在一些實施例中，免疫結合物進一步包含螯合劑(chelating agent)(可互換地，「螯合劑(chelator)」)。在一個實施例中，免疫結合物包含直接或間接鍵聯至細胞毒性劑或放射性同位素之本發明之抗體構築體。
本文中所描述之免疫結合物及放射性免疫結合物包含抗原結合區。此等抗原結合區可來源於「抗體」。本文中術語「抗體」係在最廣泛的意義上使用且包括單株抗體，且包括完整抗體及其功能性(抗原結合)抗體片段，包括抗原結合片段(Fab)片段、F(ab') 2片段、Fab'片段、Fv片段、重組IgG (rIgG)片段、單鏈抗體片段，包括單鏈可變片段(sFv或scFv)，及單域抗體(例如sdAb、sdFv、奈米抗體)片段。該術語涵蓋免疫球蛋白之經基因工程化及/或以其他方式修飾之形式，諸如胞內抗體、肽體、嵌合抗體、完全人類抗體、人源化抗體，及異結合抗體、多特異性(例如雙特異性)抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體、串聯二scFv、串聯三scFv。除非另有說明，否則術語「抗體」應理解為涵蓋其功能性抗體片段。該術語亦涵蓋完整或全長抗體，包括任何種類或子類之抗體，包括IgG及其子類、IgM、IgE、IgA及IgD。抗體可包含人類IgG1恆定區。抗體可包含人類IgG4恆定區。
與「高變區」或「HVR」同義之術語「互補決定區」及「CDR」在此項技術中已知係指抗體可變區內之非連續胺基酸序列，其賦予抗原特異性及/或結合親和力。一般而言，各重鏈可變區中存在三個CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，且各輕鏈可變區中存在三個CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。「構架區」及「FR」在此項技術中已知係指重鏈及輕鏈之可變區的非CDR部分。一般而言，每一全長重鏈可變區中存在四個FR (FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4)，且每一全長輕鏈可變區中存在四個FR (FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4)。所給定CDR或FR之確切胺基酸序列邊界可容易使用多種熟知方案中之任一者確定，包括以下文獻中所述之方案：Kabat等人 (1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (「Kabat」 numbering scheme), Al-Lazikani等人, (1997) JMB273,927-948 (「Chothia」 numbering scheme)；MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), 「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,」 J. Mol. Biol. 262, 732-745.」 (「Contact」 numbering scheme)；Lefranc MP等人, 「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,」 Dev Comp Immunol, 2003年1月;27(1):55-77 (「IMGT」 numbering scheme)；Honegger A及Plückthun A, 「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,」 J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (「Aho」 numbering scheme)；及Whitelegg NR及Rees AR, 「WAM: an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB,」 Protein Eng.2000年12月;13(12):819-24 (「AbM」 numbering scheme。在某些實施例中，本文所描述之抗體之CDR可由選自Kabat、Chothia、IMGT、Aho、AbM或其組合之方法限定。
給定CDR或FR之邊界可視鑑別所用之方案而變化。舉例而言，Kabat方案係基於結構比對，而Chothia方案係基於結構資訊。Kabat與Chothia方案兩者之編號均基於最常見抗體區序列長度，其中在一些抗體中出現帶有插入字母(例如「30a」)之插入及缺失。兩種方案將某些插入及缺失(「插入缺失」)置於不同位置，產生不同編號。接觸方案係基於複合物晶體結構之分析且在多個方面與Chothia編號方案相似。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為V H及V L)通常具有類似結構，其中各域包含四個保守性構架區(FR)及三個CDR (參見例如Kindt等人, Kuby Immunology,第6版,W.H. Freeman and Co.,第91頁(2007))。單一V H或V L域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用來自結合特定抗原之抗體的V H或V L域分離結合該抗原之抗體以分別篩選互補V H或V L域之文庫(參見例如Portolano等人, J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人, Nature352:624-628 (1991))。
本文中所描述之免疫結合物之抗原結合區可經人源化。關於免疫結合物之「人源化」係指其中所有或實質上所有CDR胺基酸殘基均來源於非人類CDR且所有或實質上所有FR胺基酸殘基均來源於人類FR的抗原結合區。人源化免疫結合物視情況可包括來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。
所提供之免疫結合物為人類免疫結合物。「人類免疫結合物」為具有一抗原結合區的免疫結合物，該抗原結合區之胺基酸序列對應於由人類或人類細胞或利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列，包括人類抗體文庫之非人類來源所產生的抗體之胺基酸序列。該術語不包括包含非人類抗原結合區的非人類抗體之人源化形式，諸如其中所有或實質上所有CDR為非人類CDR之彼等抗體。
如本文所用，片語「抗原結合臂」係指單一多肽鏈，其包含「抗原結合區」、鉸鏈區及變異恆定區。其他元素(例如螯合劑；成像金屬)可直接或經由本發明之組合物中的一或多個連接子連接至抗原結合臂。本發明之免疫結合物包含共價鍵聯在一起的兩條抗原結合臂。在一個實施例中，抗原結合臂經由鉸鏈區鍵聯。在一個實施例中，抗原結合臂經由免疫球蛋白重鏈恆定區鍵聯。在一個實施例中，抗原結合臂經由變異恆定區鍵聯。在一個實施例中，抗原結合臂經由二硫鍵(例如經由鉸鏈區中之半胱胺酸殘基)鍵聯。
如本文所用，片語「抗原結合區」係指負責特異性結合至抗原之免疫結合物的區，此類區包含一或多個包含互補決定區、可變區及構架區之抗原結合域，其可如一般熟習此項技術者所知來源於抗體或其片段、在抗體或其片段上模型化或可以模仿抗體或其片段。在一個實施例中，抗原結合臂之「抗原結合區」含有一個或兩個抗原結合域。在一較佳實施例中，抗原結合臂之「抗原結合區」由單一抗原結合域組成，該抗原結合域較佳為VHH多肽。在一較佳實施例中，免疫結合物之兩個抗原結合臂之抗原結合區獨立地由單一抗原結合域組成，該抗原結合域較佳為VHH多肽，該等VHH多肽相同或不同。
如本文所用，術語「VHH多肽」涵蓋天然及合成組合物且係指構成如此項技術中已知之VHH片段的多肽，亦即構成僅單域重鏈可變域片段的多肽，或在結構及功能上類似VHH片段的多肽，因為此類結構在下文進一步描述且具有特異性結合抗原之能力，且兩者均為此項技術中所熟知。在較佳實施例中，VHH多肽包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含三個重鏈CDR；在一個實施例中，VHH多肽來源於駱駝科；在另一實施例中，VHH多肽來源於文庫；VHH多肽以特異性及高親和力結合至抗原。在一個較佳實施例中，VHH多肽為包含以下排列之單一重鏈可變域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。VHH多肽可例如作為活體內(例如在駱駝科中)產生之僅重鏈抗體之抗原結合片段獲得。VHH多肽亦可自合成文庫，例如噬菌體呈現文庫獲得。例如，參見McMahon等人, Nature Structural & Molecular Biology | VOL 25 | MARCH 2018 | 289-296 Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies；Moutel等人, eLife 2016;5:e16228 NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies。De Genst E, Saerens D, Muyldermans S, Conrath K. Antibody repertoire development in camelids. Dev Comp Immunol. 2006;30(1-2):187-98. doi: 10.1016/j.dci.2005.06.010. PMID: 16051357。Vincke C, Gutiérrez C, Wernery U, Devoogdt N, Hassanzadeh-Ghassabeh G, Muyldermans S. Generation of single domain antibody fragments derived from camelids and generation of manifold constructs. Methods Mol Biol. 2012;907:145-76. doi: 10.1007/978-1-61779-974-7_8. PMID: 22907350。Arbabi Ghahroudi M, Desmyter A, Wyns L, Hamers R, Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 1997年9月 15;414(3):521-6. doi: 10.1016/s0014-5793(97)01062-4. PMID: 9323027。
關於VHH人源化，參見例如Vincke C, Loris R, Saerens D, Martinez-Rodriguez S, Muyldermans S, Conrath K. General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold. J Biol Chem. 2009 Jan 30；284(5):3273-84. doi: 10.1074/jbc.M806889200. Epub 2008年11月14日. PMID: 19010777。
關於VHH穩定性，參見例如Kunz P, Flock T, Soler N, Zaiss M, Vincke C, Sterckx Y, Kastelic D, Muyldermans S, Hoheisel JD. Exploiting sequence and stability information for directing nanobody stability engineering. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017年9月；1861(9):2196-2205. doi: 10.1016/j.bbagen.2017.06.014. Epub 2017年6月20日. PMID: 28642127；PMCID: PMC5548252；Kunz P, Zinner K, Mücke N, Bartoschik T, Muyldermans S, Hoheisel JD. The structural basis of nanobody unfolding reversibility and thermoresistance. Sci Rep. 2018年5月21日;8(1):7934. doi: 10.1038/s41598-018-26338-z. PMID: 29784954；PMCID: PMC5962586。
本文中之「連接子」亦稱為「連接子序列」「間隔子」「繫栓序列」或其語法等效物。如本文中所提及之「連接子」連接兩個不同分子，其自身具有標靶結合、催化活性，或作為單獨的多肽天然表現及組裝或包含相同多肽之單獨域。舉例而言，兩個不同結合部分或重鏈/輕鏈對或抗原結合區及免疫球蛋白重鏈恆定區。許多策略可用於將分子共價鍵聯在一起。本文所描述之連接子可用於接合scFv分子中之輕鏈可變區及重鏈可變區；或可用於將scFv或其他抗原結合片段繫栓於抗體重鏈之N-末端或C-末端上。此等包括但不限於蛋白質或蛋白質域之N-末端與C-末端之間的多肽連接、經由二硫鍵之連接、及經由化學交聯試劑之連接。在此實施例之一個態樣中，連接子為藉由重組技術或肽合成產生之肽鍵。
「結合」所關注之抗原或表位的抗體為以與非特異性相互作用顯著不同之足夠親和力結合抗原或表位的抗體。特異性結合可例如藉由與對照分子之結合相比較測定分子之結合來量測，對照分子通常為結構類似但不具有結合活性的分子。
「特異性結合」係指抗體或免疫結合物以足夠的親和力結合抗原以使得該抗體適用作標靶該抗原之診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，抗體與無關蛋白質結合之程度小於該抗體與其抗原之結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析所量測。如本文所用，「抗原特異性」抗體或免疫結合物為以足夠特異性及親和力特異性結合至抗原以適用於標靶治療、標靶診斷或偵測來自受試者之生物樣品中之抗原的方法之抗體。在一些實施例中，結合至其標靶抗原之免疫結合物或抗體構築體或標靶成像複合物或放射性免疫結合物的解離常數(K D)為≤ 1 μ M，＜ 100 nM，＜ 10 nM，＜ 1 nM，＜ 0.1 nM，＜ 0.01 nM，或＜ 0.001 nM(例如10 -8M或更低，例如10 -8M至10 -13M，例如10 -9M至10 -13M)。在一些實施例中，本發明之免疫結合物或抗體構築體或標靶成像複合物或放射性免疫結合物結合至多種抗原，諸如在來自不同物種之同源物中保守的表位，諸如其中表位之胺基酸一致性在不同物種中不相同。
如本文所用，術語「變異恆定區」係指包含免疫球蛋白重鏈恆定區之一部分的多肽，該部分已自天然免疫球蛋白胺基酸序列，較佳在一至若干個胺基酸位置處修飾。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)中所述。出於各種目的對Fc區之修飾為此項技術中所熟知。例如，參見Kevin O. Saunders, Frontiers in Immunology,  2019年6月|第10卷|第1296章, 標題「Conceptual Approaches to Modulating Antibody Effector Functions and Circulation Half-Life」。
相對於參考多肽序列之序列一致性百分比(%)係在比對序列且引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比且不將任何保守性取代基視為序列一致性之一部分之後，與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的候選序列中之胺基酸殘基的百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以多種方式使用可用的電腦軟體達成。用於比對序列之適當參數能夠經測定，包括在經比較序列之全長上獲得最大比對所需要之演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.所著，且原始程式碼已與用戶文件一起遞交美國Copyright Office, Washington D.C., 20559，其中其在美國版權註冊號TXU510087下註冊。ALIGN-2程式可公開購自Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式經編譯可用於UNIX作業系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且並不變化。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A相對於、與或針對既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者其可表述為，既定胺基酸序列A具有或包含相對於、與或針對既定胺基酸序列B的胺基酸序列一致性一定%)如下計算：100乘以分數X/Y，其中X為在用序列比對程式ALIGN-2比對A與B時由該程式評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等的情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%不相等。除非另外特定陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值如剛剛前段中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或妨礙細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷)、小紅莓、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核分解酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段及/或變體；及本文中所描述之各種細胞毒性劑。
術語「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原或表位)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如，抗體與抗原或表位)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(K D)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所描述之彼等方法)來量測親和力。本文描述量測結合親和力之特定說明性實施例。
術語「拮抗劑」以最廣泛意義使用，且包括部分或完全阻斷、抑制或中和抗原之生物活性的任何分子。適合拮抗劑分子具體而言包括拮抗劑抗體或其抗體片段或衍生物。
「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體為抑制或降低其所結合之抗原或包含該抗原之蛋白質複合物之生物活性的抗體。較佳阻斷抗體或拮抗劑抗體實質上或完全抑制抗原或包含該抗原之蛋白質複合物的生物活性。
如本文所用，術語「腫瘤」係指所有瘤性細胞生長及增生(無論惡性或良性)，及所有癌前及癌細胞以及組織。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中之生理學病狀，其特徵典型地在於不受調控之細胞生長。「腫瘤」包含一或多種癌性細胞。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性疾病。此類癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌症(例如上皮鱗狀細胞癌)、皮膚癌、黑色素瘤、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌(「NSCLC」)、肺之腺癌及肺之鱗狀癌瘤)、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌之胃的或胃癌、胰臟癌(例如胰管腺癌)、神經膠母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌(例如高級別漿液性卵巢癌)、肝癌(例如肝細胞癌(HCC))、膀胱癌(例如尿道上皮膀胱癌)、睾丸(生殖細胞腫瘤)癌、肝癌、乳癌、腦癌(例如星形細胞瘤)、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎臟或腎癌(例如腎細胞癌、腎母細胞瘤或威爾姆氏瘤(Wilms' tumor))、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌以及頭頸癌。癌症之其他實例包括但不限於視網膜母細胞瘤、卵泡膜細胞瘤(thecoma)、卵巢男胚瘤(arrhenoblastoma)、肝癌、包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)之血液科惡性疾病、多發性骨髓瘤及急性血液科惡性疾病、子宮內膜癌或子宮癌、子宮內膜異位、纖維肉瘤、絨毛膜癌、唾液腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、食道癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、黑素瘤、皮膚癌、神經鞘瘤、寡樹突神經膠質瘤、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、成骨性肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、退行性星形細胞瘤、基底細胞癌(基底細胞上皮瘤)、膽管癌、小細胞膀胱癌、轉移性乳癌、轉移性結腸直腸癌、上皮卵巢癌、輸卵管癌、胃腺癌、多形性膠質母細胞瘤(GBM)、復發性多形性膠質母細胞瘤(GBM)、神經膠質瘤、神經膠質肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、復發性頭頸癌鱗狀細胞癌、惡性胸膜間皮瘤頭頸癌、霍奇金淋巴瘤、轉移性腎細胞癌、轉移性腎透明細胞癌、鱗狀非小細胞肺癌、肺鱗狀細胞癌、復發性或難治性小細胞肺癌、治療抗性黑色素瘤、轉移性黑色素瘤、梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)、神經內分泌癌、大細胞神經內分泌癌、神經內分泌腫瘤(NETS)、卵巢癌、乳頭狀癌、腹膜癌、神經內分泌前列腺癌、激素難治性前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、軟組織肉瘤及鱗狀細胞癌。
術語「轉移癌」意謂癌症狀態，其中原發組織的癌細胞藉由血管或淋巴管自原始部位傳輸至體內一或多個其他部位，在除原發組織以外之一或多個器官中形成一或多個繼發性腫瘤。一個重要的實例為轉移性乳癌。
術語「細胞增殖性病症」及「增殖性病症」係指與某種程度的異常細胞增殖相關之病症。在一個實施例中，細胞增殖性病症為癌症。
關於所主張之本發明，術語「締合之」、「締合」、「鍵聯之」或「鍵聯」係指接合、附接、連接或以其他方式偶合以形成單分子(或單分子複合物)的分子之兩種或更多種組分的狀態或藉由在兩種分子之間產生締合、鍵聯、附接及/或任何其他連接使兩種分子彼此締合以形成單分子(或單分子複合物)之操作。舉例而言，術語「鍵聯」可指藉由一或多個原子相互作用締合之兩種或更多種組分，使得形成單分子，且其中個別原子相互作用可為共價或非共價的。兩種組分之間的共價締合之非限制性實例包括肽鍵及半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵。兩個分子組分之間的非共價締合之非限制性實例包括離子鍵。
出於本發明之目的，術語「融合」係指藉由至少一個共價鍵(其為肽鍵)締合之兩種或更多種蛋白質組分，無論肽鍵是否涉及羧酸基之一個碳原子的參與抑或涉及另一碳原子，諸如α-碳、β-碳、γ-碳、σ-碳等。融合在一起之兩種蛋白質組分的非限制性實例包括例如經由肽鍵與多肽融合的胺基酸、肽或多肽，使得所得分子為單一連續多肽。出於本發明之目的，術語「融合」係指產生如上文所描述之融合分子的操作，諸如由基因區域之重組融合產生之融合蛋白，其在轉譯時產生單一蛋白質分子。
「雙特異性」抗體係指對至少兩個不同表位具有結合特異性的抗體，不管該複數個表位是否在同一分子中及/或部分重疊。在一些實施例中，本發明之雙特異性免疫結合物結合至本文所述之單一抗原之兩種不同表位。
如本文所用，術語「表現之」、「表現(expressing)」或「表現(expresses)」及其語法變化形式係指聚核苷酸或核酸轉譯成蛋白質。所表現之蛋白質可保留在細胞內，成為細胞表面膜之組分或分泌於細胞外空間中。
為了本發明之目的，當提及多肽或多肽區域時，片語「來源於」意謂該多肽或多肽區域包含最初在「親本」蛋白質中可見之高度相似的胺基酸序列且現在可以包含某些相對於原始多肽或多肽區域之胺基酸殘基添加、缺失、截短、重排或其他變化，只要「親本」分子之某種功能(例如抗原結合親和力)及結構實質上得到保存。熟習此項技術者將能夠使用此項技術中已知之技術(例如蛋白質序列比對軟體)鑑別多肽或多肽區域(例如VHH多肽、CDR、HVR、V H及/或V L)源自之親本分子(例如抗體序列)。
如本文所用，在至少一個細胞表面上表現細胞外目標生物分子或抗原之細胞為「目標陽性細胞」或「目標+細胞」，且為物理上偶合至指定細胞外目標生物分子之細胞。下文提供額外目標生物分子描述。如一般熟習此項技術者根據使用情形將認識到，「目標生物分子」、「目標抗原分子」、「目標抗原」、「所關注抗原」及語法變化形式及等效物在本文中可互換使用，且包括抗體結合之分子決定子。本文所述之免疫結合物可經由免疫結合物之抗原結合區或抗原結合臂結合此類抗原。
關於分子的細胞毒活性，術語「選擇性細胞毒性」係指生物分子目標陽性細胞群(例如標靶細胞類型)與非標靶旁觀者細胞群(例如，生物分子目標陰性細胞類型)之間的細胞毒性之相對含量，可以表示為標靶細胞類型之半最大細胞毒性濃度(CD 50)與非標靶細胞類型之CD 50的比，以提供細胞毒性選擇性之度量或指示殺死標靶細胞相對於未標靶細胞的優先性。
術語「醫藥組合物」或「醫藥調配物」係指呈便於准許其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含有對投與調配物之受試者具有不可接受毒性之額外組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中之除活性成分外對受試者無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括但不限於緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
「經分離」抗體或免疫結合物或放射性免疫結合物為已自其天然環境或人工生產之組分中分離出來的抗體或免疫結合物或放射性免疫結合物。在一些實施例中，抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細電泳法)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)所測定。用於評定組合物中之抗體純度的常規方法為習此相關技藝之人士所知，參見例如Flatman等人, J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。特定言之，待純化除去之不合需要之組分(污染物)為將干擾抗體之所需用途(諸如治療用途)的此類組分，且可尤其包括細菌因子、酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶解物。
「經分離」核酸係指已自其天然環境之組分中分離之核酸分子。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外位置或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已向其中引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「經轉型細胞」，其包括初生經轉型細胞及來源於其之後代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量可能與母細胞不完全相同，但可能含有突變。本文包括針對原始經轉型細胞篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變後代。
如本文所用，關於免疫結合物或其組合物(例如放射性免疫結合物、醫藥組合物或診斷組合物)，術語「投與」意謂經由適用於遞送免疫結合物或其組合物之任何已知方法向受試者身體遞送免疫結合物或其組合物。特定投與模式包括但不限於靜脈內、經皮、皮下、腹膜內及鞘內投與。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指以必要劑量且持續必要時段有效達成所需治療或預防結果之量。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指臨床介入以試圖改變所治療個體之自然病程，且可以為實現預防或在臨床病理學病程中進行。所需治療效果包括但不限於預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之放射性免疫結合物用於延遲疾病發生或減慢疾病進展。
「治療有效量」至少為實現特定病症之可量測的改善或預防特定病症所需之最小濃度。本文中之治療有效量可根據諸如患者之疾病狀態、年齡、性別及體重，及本發明之組合物在個體中引發所需反應之能力的因素而變化。治療有效量亦為治療有利作用超過本發明組合物之任何毒性或有害作用的量。
、多肽或蛋白質。如本文所用之術語「預測」及「預後」係可互換的。在某種意義上，用於預測或預後之方法係允許實施本發明之預測/預後方法的人選擇認為(通常在治療之前，但不一定)更有可能對本發明之免疫結合物或上述組合物(例如藥物組合物)治療產生反應的患者。
術語「偵測」以最廣泛的意義使用，以包括目標抗原分子之定性與定量量測兩者。在一個態樣中，如本文所描述之偵測方法用於僅僅鑑別生物樣品中所關注抗原的存在。在另一態樣中，該方法用於測試樣品中之所關注抗原是否以可偵測含量存在。在又一態樣中，該方法可用於對樣品中所關注抗原之量進行定量且進一步比較來自不同樣品之抗原含量。在另一態樣中，方法可在活體內使用以測定目標細胞之位置，例如使用本發明之標靶成像複合物。
術語「生物樣品」係指可含有所關注抗原之任何生物物質。生物樣品可為生物流體，諸如全血或全血組分，包括紅血球、白血球、血小板、血清及血漿；腹水、玻璃體液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚液、汗液、黏液、腦脊髓液及可能含有目標抗原之其他身體成分。在一些實施例中，樣品為來自任何動物之生物樣品。在一些實施例中，樣品來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品來自人類受試者。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品為生檢材料。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之生檢材料。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品為原生細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品為來自臨床患者之原生細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品來自臨床患者或用本發明組合物(例如放射性免疫結合物)治療，或用不同治療劑(諸如標靶所關注抗原之抗體-藥物結合物或β-照射或小分子治療劑)治療之患者。
術語「包裝插頁」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。
如本文所使用，術語「載體」係指這樣一種核酸分子，該核酸分子能夠傳播其所鍵聯之另一核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入其已引入之宿主細胞之基因體中的載體。某些載體能夠導引可操作地與其鍵聯之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。 實例
以下實例描述了大小在60與110 kDa之間的放射性同位素傳遞平台，與傳統IgG相比，其具有較短半衰期(例如4天或更短)，但與較小單體抗體片段格式相比，具有較長半衰期(例如大於10小時)。此外，本文提供之某些放射性同位素遞送平台展現活體外或活體內高穩定性、低免疫原性及適合治療窗。此等放射性同位素遞送平台較佳用於活體內標靶放射性同位素以治療疾病。此等放射性同位素遞送平台尤其適用於安全且有效地在受試者中標靶遞送α發射體，這藉由與具有超過4天之半衰期及/或低於60 kDa之分子量的抗體相比呈現降低之不利影響來達成。
在下文中，在某些片語中，「Fc部分」用於指代變異恆定域，且「鉸鏈」用於指代「鉸鏈區」，如一般熟習此項技術者將理解。 實 例 1. 抗 體 產 生
VHH-Fc質體係藉由將具有鉸鏈及Fc部分(人類IgG1 CH2-CH3)之VHH序列選殖至哺乳動物表現載體中來產生。在一些情況下，將突變引入Fc部分中。為產生重組VHH-Fc及其變異體，將質體轉染至HEK293.SUS細胞(ATUM或類似細胞)中。在分泌3至5天之後，藉由離心及無菌過濾清除細胞中之含抗體之上清液。使用Mab Select SuRe PCC管柱(GE,目錄號:11003495)純化抗體且緩衝交換至PBS,pH 7.0中。使用A280或BCA定量蛋白質。使用標準方案，藉由SDS-PAGE、毛細管電泳、HPLC-SEC及LC-MS測試抗體之純度。關於VHH多肽，參見例如McMahon等人, Nature Structural & Molecular Biology |第25卷|2018年3月|289-296 Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies；Moutel等人, eLife 2016;5:e16228 NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. De Genst E, Saerens D, Muyldermans S, Conrath K. Antibody repertoire development in camelids. Dev Comp Immunol. 2006;30(1-2):187-98. doi: 10.1016/j.dci.2005.06.010. PMID: 16051357。Vincke C, Gutiérrez C, Wernery U, Devoogdt N, Hassanzadeh-Ghassabeh G, Muyldermans S. Generation of single domain antibody fragments derived from camelids and generation of manifold constructs. Methods Mol Biol. 2012;907:145-76. doi: 10.1007/978-1-61779-974-7_8. PMID: 22907350。Arbabi Ghahroudi M, Desmyter A, Wyns L, Hamers R, Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 1997年9月15日;414(3):521-6. doi: 10.1016/s0014-5793(97)01062-4. PMID: 9323027。
關於VHH人源化，參見例如Vincke C, Loris R, Saerens D, Martinez-Rodriguez S, Muyldermans S, Conrath K. General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold. J Biol Chem. 2009年1月30日;284(5):3273-84. doi: 10.1074/jbc.M806889200. Epub 2008年11月14日. PMID: 19010777。
關於VHH穩定性，參見例如Kunz P, Flock T, Soler N, Zaiss M, Vincke C, Sterckx Y, Kastelic D, Muyldermans S, Hoheisel JD. Exploiting sequence and stability information for directing nanobody stability engineering. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017年9月;1861(9):2196-2205. doi: 10.1016/j.bbagen.2017.06.014. 電子版2017年6月20日. PMID: 28642127；PMCID: PMC5548252；Kunz P, Zinner K, Mücke N, Bartoschik T, Muyldermans S, Hoheisel JD. The structural basis of nanobody unfolding reversibility and thermoresistance. Sci Rep. 2018年5月21日;8(1):7934. doi: 10.1038/s41598-018-26338-z. PMID: 29784954；PMCID: PMC5962586。
使用VHH序列，諸如抗HER2純系2RS15d VHH(參見例如W02016/016021) (SEQ ID NO: 20)及抗DLL3純系hz10D9v7.251 VHH序列(參見例如W02020/07967) (SEQ ID NO: 30)工程化多個VHH-Fc原型及變異體，除非本文另外說明，否則所收集及展示之資料係使用此等純系之VHH抗原結合區獲得。
表 1- 構築體
VHH Fc名稱 FcRn突變體 Fc效應突變體 目標
H101 wt wt HER2
D102 wt wt DLL3
H105 I253A wt HER2
H106 S254A wt HER2
H107 H310A wt HER2
H108 H435Q wt HER2
H109 Y463A wt HER2
D111 I253A wt DLL3
D112 S254A wt DLL3
D113 H310A wt DLL3
D114 H435Q wt DLL3
D115 Y463A wt DLL3
H133 wt AEASS HER2
D134 wt AEASS DLL3
H135 H310A AEASS HER2
D136 H310A AEASS DLL3
H137 H435Q AEASS HER2
D138 H435Q AEASS DLL3
根據EU編號之變異體；AEASS= L234A、L235E、G237A、A330S及P331S
實例 2. 抗體結合特性 ： 用於目標蛋白及目標細胞之分析
根據標準方案，藉由ELISA評定VHH-Fc與目標可溶性蛋白-人類、鼠類及食蟹獼猴異種同源物的結合(視情況而定)。抗原係來自商業來源或藉由將已知抗原序列(Uniprot)選殖至帶有用於純化及偵測目的之HIS、FLAG或等效標籤的哺乳動物表現載體中來產生。包括市售可得的對照抗目標IgG。用50至100 μL各所關注的目標蛋白質以使塗佈最佳化之濃度塗佈培養盤(96孔maxisorp，Corning 3368)。以200至400 nM之起始濃度製備純化的VHH-Fc及hIgG1同型對照(Sigma，目錄號I5154)且按1:4向下滴定。初級抗體在室溫(RT)下培育1小時且洗滌後，添加0.2 μg/ml HRP標記之二級抗體且在室溫下培育1小時(山羊抗人類IgG-Fc-HRP Jackson，目錄號109-035-098)。使用50微升/孔TMB(Neogen，目錄號308177)偵測反應。用1 M HCl(50 μl)停止顯色。使用Spectromax盤讀取器在450 nm下量測光密度(OD)且使用SoftMaxPro處理資料。資料展示出抗目標VHH-Fc結合至人類、鼠類及食蟹獼猴目標蛋白。所使用之重組DLL3蛋白為人類DLL3.FLAG(Adipogen#AG-40B-0151，胺基酸27-466)或人類DLL3.HIS(abcam #ab255797，胺基酸27-492)或鼠類DLL3.HIS(IPA定製，胺基酸25-477)或食蟹獼猴DLL3.HIS (Acrobiosystems #，胺基酸27-490)。用於DLL3結合之對照抗體為洛伐妥珠單抗(Rovalpituzumab) (Creative Biolabs #TAB-216CL)。所使用之重組HER2蛋白為人類Her2.HIS (Sinobiologics, #10004-H08H)及鼠類HER2.HIS (Sinobiologics #50714-M08H)。用於HER2結合之對照抗體為曲妥珠單抗(Trastuzumab)(DIN:02240692，ROCHE)。 圖 1A及 圖 1B展示在ELISA中特異性結合至可溶性目標抗原之抗Her2及抗DLL3 VHH-Fc，測試了包含Fc區突變以降低效應功能及/或FcRn結合的額外VHH-Fc，但並不顯著影響與目標抗原之結合。
藉由流動式細胞測量術篩選VHH-Fc與一系列目標陽性癌細胞株的結合。除非另外指出，否則所有細胞株均來源於ATCC，且根據製造商說明及推薦培養基培養。所使用之HER2陽性細胞株為SKBR3(ATCC #HTB-30)及BT474(ATCC # HTB-20)及HEK293-6E(NRC)細胞。所測試之DLL3陽性細胞株包括SHP-77(ATCC CRl-2195)、NCI-H82(ATCC HTB-175)、NCI-H69(ATCC HTB-119)、HEK-DLL3 (Creative Biogene # CSC-RO0531)。所測試之HER2陰性細胞株包括SHP-77。所測試之DLL3陰性細胞株包括HCT-116(CCL-247)、BT-474及SKBR3。將以與ELISA相同之方式稀釋的初級抗體添加至細胞中且在冰上培育1小時。細胞用含1% FBS之PBS洗滌兩次，在450G下離心4分鐘且與2 μg/mL AlexaFluor 647結合之抗人類IgG(Jackson，目錄號109-605-098)或AlexaFluor 647結合之抗小鼠IgG(Jackson，目錄號115-605-164)與1:1000 DAPI(Biolegend，目錄號422801)一起在冰上培育30分鐘。在再洗滌兩次之後，將細胞再懸浮，且在iQue篩選器平台(screener platform)(Intellicyt)上藉由流動式細胞測量術進行分析，且根據標準方案用Forecyt處理資料。 圖 2A、 圖 2B及 圖 2C展示結合至目標陽性細胞株且展示該結合對目標陽性細胞具有特異性(亦即，經由與陰性對照細胞之結合進行比較)。其他實驗表明相比於野生型Fc，降低效應功能及/或FcRn結合之Fc突變不影響與癌細胞之結合。 實例 3. 內化分析
使用與pH敏感性染料結合之二級抗體測試表現目標之細胞對VHH-Fc之內化。根據製造商說明書，山羊抗人類(anti-hu)IgG-Fc二級抗體與pH敏感性pHAb染料(Promega目錄號G9845)進行胺結合。pHAb染料在pH＞7下具有低螢光或沒有螢光，但在抗體內化時在酸性環境中發螢光。目標陽性細胞及目標陰性細胞以1.0×10 6/mL塗鋪於96孔V底培養盤中。VHH-Fc及hIgG1同型對照在培養基中稀釋至75 nM。旋轉細胞以移除上清液，用所製備之初級抗體再懸浮且在冰上培育1小時。自細胞洗掉過量初級抗體且接著在冰上與pHAb標記之二級抗體一起培育30分鐘。接著洗掉過量二級抗體且將細胞再懸浮於培養基中。將一組樣品置放於37℃下之培育箱中以允許內化，另一組留在冰(0℃)上以作為僅結合之對照。在0至24小時範圍內之不同時間點對細胞取樣。細胞用DAPI染色且用iQue篩選器平台藉由流動式細胞測量術在572/28通道上讀數。VHH-Fc展示在目標陽性細胞上高於陰性對照(同型，緩衝液)之螢光。 圖 3A 及圖 3B展示H101及D102由SHP-77及HEK-DLL3細胞內化。 實例 4. 抗體熱穩定性測定
藉由差示掃描螢光測定法(DSF)使用Protein Thermo Shift Dye Kit TM(ThermoFisher，目錄號:4461146)測定VHH-Fc之變性溫度(Tm)。簡言之，每個反應共使用1 μg抗體。使用Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex即時PCR系統，以套組手冊中所述之推薦設置產生抗體之熔化曲線。隨後藉由使用ThermoFisher Protein Thermal Shift軟體(v.1.3)測定 表 1中之抗體的Tm。VHH-Fc之Tm1係藉由DSF測定。H101與D102兩者均展示67.5±0.1℃之良好熱穩定性。另外，測試在Fc區中包含突變以降低效應功能及/或FcRn結合之VHH-Fc的熱穩定性，且導致熱穩定性稍低(1至2℃)，但仍處於可接受範圍內。 實例 5. 受體密度測定
為測試免疫結合物結合相對於目標密度之功效，對目標陽性細胞株量測受體密度。使用抗體結合能力(Antibody Binding Capacity，ABC)分析來量測目標密度。用細胞解離緩衝液採集表現所關注目標之癌細胞以及陰性對照細胞株，以每孔約5×10 4個細胞接種於96孔V底培養盤中(Sarstedt 82.1583.001)。按照製造商說明書，使用QuantiBRITE PE珠粒(BD目錄號340495)及PE結合之抗人類IgG(Biolegend純系HP6017)測試細胞的受體表現。簡言之，在適合飽和濃度下基於前述實驗製備VHH-Fc及同型對照抗體。將抗體樣品稀釋液與一組細胞株一起在冰上培育1小時。細胞用1% FBS/1×PBS(FACS緩衝液)洗滌兩次，在400 G下離心4分鐘。細胞隨後與4 μg/mL小鼠PE結合之抗hu及DAPI(1: 1000)一起在冰上培育30分鐘。細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，在400 G下離心4分鐘且再懸浮於FACS緩衝液中。在iQue篩選器平台上量測PE通道上之螢光強度，且用ForeCyt軟體處理資料。隨後將由不同初級抗體產生之PE信號的量擬合至基於已知PE分子/Quantibrite珠粒樣品之標準曲線以測定每個細胞之抗體結合位點的數目。相對抗體結合位點與細胞表面上之抗原或受體的數目相關。 表 2展示出結合至一組癌細胞株之抗DLL3及抗HER2 VHH-Fc之受體密度數目且類似於文獻中報導之範圍。
表2-針對每種結合劑及細胞株估計之表位/細胞數目
      SHP-77 HEK-DLL3 BT474 H82 HEK293-6E HCT-116
抗 DLL3 Rova 969 1679 - 936 - -
D102 807 1734 - 794 - -
抗 HER2 Tmab 625 1575 356690 - 1969 2790
H101 572 1490 401604 - 1935 2604
實例 6. 抗體與目標蛋白之親和力
使用Octet Red96e(ForteBio)評定抗體親和力。用抗hIgG Fc(AHC)捕捉生物感測器(Fortebio目錄號18-5063)藉由生物層干涉術量測締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)及親和力常數(KD)。每個循環都在1,000 rpm之軌道振盪速度下進行。在動力學緩衝液(Fortebio，目錄號18-1105)中自適合起始濃度以1: 2滴定抗原。將一組AHC生物感測器浸漬於動力學緩衝液中，基線步驟為60秒。將抗目標VHH-Fc(5 μg/mL，在動力學緩衝液中)負載於生物感測器上240秒，隨後為30秒之第二基線步驟。將IgG捕獲之感測器浸漬於緩衝液中用於單一參考減除以補償捕獲IgG之天然解離。隨後將各生物感測器浸漬於相應濃度之目標蛋白(人類、鼠類或食蟹獼猴單體蛋白)中600秒，隨後在動力學緩衝液或最佳化條件中進行1800秒之解離時間。每一VHH-Fc使用一套新的AHC生物感測器。對於締合及解離步驟，藉由全局擬合1: 1模型分析資料(Octet軟體版本v11.0)。 表 3展示結合親和力資料。
表 3-H101及D102對靶蛋白之親和力
VHH-Fc 分析物 KD (nM)
D102 人類DLL3-Flag 0.472
D102 小鼠DLL3-His 8.75
H101 人類HER2-His 3.79
實例 7. FcRn 及 Fc 效應突變親和力測定
VHH-Fc之FcRn親和力通常可用於預測抗體血清清除之半衰期。(參見例如Datta-Mannan A等人「FcRn affinity-pharmacokinetic relationship of five human IgG4 antibodies engineered for improved in vitro FcRn binding properties in cynomolgus monkeys.」 Drug Metab Dispos. 2012年8月;40(8):1545-55)。簡言之，使用Octet RED96e (Fortebio)用SA生物感測器捕獲10 nM之生物素化hFcRn(Sino Biological，目錄號: CT071-H27H-B)。將hFcRN塗佈之生物感測器浸漬於具有一系列濃度測試抗體之磷酸鈉緩衝液(100 mM Na2HPO4，150 mM NaCl w/0.05% Tween-20，pH 6.0)中之樣品溶液中，且量測締合。藉由將生物感測器浸漬於無抗體之磷酸鈉緩衝液中來量測解離。使用Octet資料分析HT 11.0軟體測定KD值。2: 1(異質配位體)結合模型用於分析。 表 4展示FCRN對野生型VHH-Fc之親和力，及Fc中之特定突變對突變體之親和力的影響。FcRn親和力之變化在目標之間一致。具有Fc效應突變之構築體僅對FcRn親和力沒有影響。添加Fc效應突變至FcRn突變構築體不影響FcRn親和力。 表 4展示VHH-Fc及Fc變異體與FcRn之親和力。
表4a-FcRn VHH-Fc 及Fc 變異體與FcRn 之親和力
VHH.Fc FcRn突變體 KD (nM)
H101 wt 3.7
D102 wt 3.8
H105 I253A 弱
H106 S254A 13
H107 H310A 無結合
H108 H435Q 弱
H109 Y463A 13
H110 H310A/H435Q 無結合
D111 I253A 弱
D112 S254A 19
D113 H310A 無結合
D114 H435Q 弱
D115 Y463A 20
D116 H310A/H435Q 無結合
H133 wt 2.1
D134 wt 1.9
H135 H310A 無結合
D136 H310A 無結合
H137 H435Q 弱
D138 H435Q 弱
亦使用Octet Red96e平台藉由生物層干涉術測試VHH-Fc對FcγR之親和力。每個循環都在1,000 rpm之軌道振盪速度下進行。使用動力學緩衝液(PBS +0.1% BSA +0.02% Tween-20)使卵白素(SA)生物感測器(Sartorius 18-5019)復水10分鐘。接著將生物素化-FcγR(Acro Biosystems)裝載於SA生物感測器上40至100秒，稀釋於PBS中之濃度在1至5 µg/mL之間範圍內。VHH-Fc以1:2連續稀釋於樣品緩衝液(PBS + 0.02% Tween-20)中，起始濃度在5000 nM至37.5 nM之間。負載之生物感測器隨後與VHH-Fc締合60-120秒。量測樣品緩衝液中之VHH-Fc解離30至900秒。接著使用3次5 s再生緩衝液(150 mM NaCl，300 mM檸檬酸鈉)及5 s樣品緩衝液的循環移除結合之VHH-Fc。使用全局擬合1: 1朗格繆爾(Langmuir)結合模型(FcγRI)或穩態分析(Octet軟體版本HT v11.1)分析資料。
分析展示，對於併入如 表4b中所示之彼等突變之構築體，與FcγR之結合(由較高KD表示)減少。
表4b FcRn VHH-Fc 及Fc 變異體與Fc 受體之親和力
Fc 突變 Fc γ RI nM KD Fc γ RI Ia (H167) nM KD Fc γ RI Ia (R167) nM KD Fc γ RI Ib/c nM KD Fc γ RI IIa (F176) nM KD Fc γ RI IIa (V176) nM KD
曲妥珠單抗 wt 0.92 270 520 3700 630 110
H101 wt 1.01 340 160 450 1600 480
H133 AEASS - - 2300 弱 - -
H135 AEASS+ H310A - - 1200 弱 - -
H137 AEASS+ H435Q - - 1200 弱 - -
D102 wt 1.27 390 530 430 1200 730
D134 AEASS - 弱 460 1100 - -
D136 AEASS+ H310A - 弱 570 2200 - -
D138 AEASS+ H435Q    弱 520 770 - -
(-)指示未偵測到結合
實例 8. 使用 AC-SINS 之自締合研究
VHH-Fc的自締合傾向係藉由使用金奈米粒子(Au-NP) (Ted Pella，目錄號: 15705)之親和力捕獲自相互作用奈米粒子光譜法(AC-SINS)來確定。(PMID: 24492294, 30395473)簡言之，山羊IgG及山羊抗人類Fc IgG(1: 4莫耳比)係用於塗佈Au-NP。在96孔盤中一式四份地將結合之Au-NP與5 μg之各VHH-Fc混合。藉由Synergy Neo2盤讀取器量測波長掃描。藉由用PBS緩衝液之λmax減去每個反應之λmax來計算最大吸光度的差異(Δλmax)。使用二階多項式擬合、利用Excel中之Linest函數分析資料。分析中包括具有已知高ACSINS評分之對照抗體(高於文獻確定之IgG的11截止點)。 圖 4展示測試品及對照之ACSINS評分。 實例 9. 多反應性研究
藉由ELISA測定VHH-Fc針對帶負電生物分子的多反應性(如在Avery等人, 「Establishing in vitro in vivo correlations to screen monoclonal antibodies for physicochemical properties related to favorable human pharmacokinetics.」 MAbs. 2018年2月/3月;10(2):244-255中)。簡言之，ELISA培養盤塗佈有5 μg/mL人類胰島素(SigmaAlrich，目錄號:I9278)及10 μg/mL雙股DNA(SigmaAlrich，目錄號:D1626-250MG)隔夜。用ELISA緩衝液(PBS，1 mM EDTA，0.05% Tween-20，pH 7.4)阻斷培養盤。一式四份地將10 μg/mL測試VHH-Fc負載於培養盤上且培育2小時。接著添加與HRP結合之山羊抗人類Fc(0.01 ug/ml)且將盤培育1小時。用TMB產生信號且藉由Synergy Neo2盤讀取器量測A450吸光度。對於每種所測試抗體，信號用未經塗佈孔之信號標準化。 表 5展示與對照抗體相比之多反應性評分。
表 5- 多反應性分析評分
VHH.Fc 胰島素 dsDNA
H101 1.176 1.406
D102 2.311 2.248
H105 1.207   
H106 1.321 1.446
H107 1.306 1.678
H108 1.420 1.663
H109 1.244 1.579
H110 1.181 1.317
D111 2.202   
D112 3.461 2.970
D113 2.829 2.594
D114 3.161 3.015
D115 2.503 2.252
D116 2.446 2.302
甘特魯單抗(Gantenerumab) ＞10 ＞10
實例 10. Fc 變異體有效地縮短 VHH-Fc 半衰期
在某些情況下，縮短α發射體之藥物半衰期對於安全性及避免與治療相關之不想要的毒性至關重要。然而，抗體通常具有14天或更長之半衰期。因此，測試VHH-Fc變異體之半衰期以便觀測及量測半衰期之任何縮短。
將二十八(28)隻8週齡雄性B6.Cg-Fcgrt tm1DcrTg(FCGRT) 32Dcr/DcrJ(Tg32 hom, JAX族群號014565)小鼠分成7個小組，如表中所概述每組具有4隻小鼠。Tg32小鼠包含人源化FcRn，與非人類靈長類動物相比時，通常視為人類抗體藥物動力學的替代物。(參見例如Avery LB等人 「Utility of a human FcRn transgenic mouse model in drug discovery for early assessment and prediction of human pharmacokinetics of monoclonal antibodies.」 MAbs. 2016年八月-九月;8(6):1064-78)。在第0天，量測體重且以3 mg/kg及5 ml/kg向所有小鼠靜脈內投與測試品。每隔一段時間自各小鼠收集25 µL血液樣品。將血液樣品收集至1 µL K 3EDTA中，處理成血漿，在50%甘油/PBS中1/10稀釋，轉移至專門的96孔儲存盤中，且儲存在-20℃下。所有血漿樣品均經由選擇的hIgG ELISA進行評定，因為其對所有七種測試品都具有高靈敏度。
表 6-HER2 VHH-Fc 之藥物動力學參數概述
終末半衰期 清除 Cmax AUC 分佈體積
天數 mL/ 天 µg/mL µg- 天/mL mL
H105 1.12 152.1 63.9 841 137
sem 0.03 3.4 3.6 29 1
H106 7.10 19.8 53.5 2193 177
sem 0.31 0.8 0.4 29 3
H107 0.41 304.4 62.4 516 82
sem 0.01 15.0 4.3 22 3
H108 1.57 117.5 46.6 903 174
sem 0.10 6.6 0.7 40 6
H109 6.92 18.2 52.2 2519 152
sem 0.34 0.6 0.8 28 4
H101 6.91 28.7 57.0 1946 218
sem 0.77 5.2 1.6 231 35
曲妥珠單抗 14.54 5.9 59.0 4108 108
sem 1.12 0.5 2.3 109 2
如 表 6中觀測到，FcRn內引入突變通常能夠縮短抗HER2 VHH-Fc之半衰期。引起關注的是，與本領域中發表之結果相反，當包括於所測試之免疫結合物中時，並非所有Fc變異體都展示出半衰期的縮短，這與文獻中所見之先前發表之結果一致。(參見例如Burvenich IJ等人, 「Cross-species analysis of Fc engineered anti-Lewis-Y human IgG1 variants in human neonatal receptor transgenic mice reveal importance of S254 and Y436 in binding human neonatal Fc receptor.」 MAbs. 2016年五月-六月;8(4):775-86)。
表 7-DLL3 VHH-Fc 之藥物動力學概述
終末半衰期 清除
天數 mL / 天
D111 10.2 10.8
SEM 4.4 10.5
D112 14.2 7.8
SEM 3.2 1.0
D113 1.1 254.8
SEM 0.2 27.0
D114 2.5 46.9
SEM 0.1 3.6
D115 11.0 6.9
SEM 13.2 1.1
D102 13.3 10.3
SEM 3.3 3.8
曲妥珠單抗 18.4 3.7
SEM 5.9 0.9
如 表 7中觀測到，FcRn內引入突變通常能夠縮短抗DLL3 VHH-Fc之半衰期。類似於HER2結合免疫結合物且與發表之結果相反，並非所有Fc變異體都展示出半衰期的縮短，這與文獻中所見之先前發表之結果一致。 實例 11 . VHH-Fc 完整質量分析
在37℃下在用Endo-S酶(最終濃度為10 μg/mL)進行分析之前使結合物去糖基化1小時。 為了分析完整質量，將8 μL樣品注射於具有UPLC BEH200 SEC 1.7 µM 4.6 x150 mm管柱的Waters Acquity UPLC-Q-TOF上。此等樣品用含有0.1% TFA及0.1% FA(甲酸)之水/ACN(70/30，v/v)流動相以0.25 mL/min之流動速率溶離11分鐘。 實例 12 . 獲得雙官能螯合劑
若干螯合劑為習此相關技藝之人士已知，其經預官能化以用於抗體結合。p-SCN-Bn-DOTA( 1)可購自Macrocyclics(Plano, TX)。DOTA之其他連接子變異體可以按照以下通用程序自高級中間體DOTAGA-四(三級丁酯)( 2)(Macrocyclics，Plano，TX)產生。
此等程序中所用之其他試劑可購自Millipore Sigma、CombiBlocks、Chem-Impex及Broadpharm。除非指示，否則所有溶劑均獲自VWR且在沒有無水處理條件下按原樣使用。用具有C18逆相管柱及乙腈/水(+0.1%甲酸)梯度之Agilent HPLC-MS或Waters HPCS-MS取得質譜。使用具有適當尺寸之正相矽膠濾筒的Biotage IsoleraOne儀器進行急驟層析，在254 nm處收集溶離份。最終化合物藉由Agilent製備級HPLC使用乙腈/水(+0.1% TFA)梯度進行純化。NMR光譜用Bruker 400 MHz NMR儀器獲取且用MestReNova v.14處理。詳細NMR資料係使用手動模式下使用之多重峰分析功能進行編譯。
圖 5展示如下所述之包括編號(2)至(5)之化合物的PEG5-DOTA合成。化合物3係經由HATU偶合，隨後TFA脫除保護來製備。無需層析純化即可獲得。
合成化合物( 3) 4-({2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}胺甲醯基)-2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]丁酸；四(三氟乙酸)：將化合物2(100 mg，0.143 mmol)溶解於DMF(2 mL)中，添加HATU(65.1 mg，0.171 mmol)，接著添加DIPEA(0.099 mL，73.8 mg，0.57 mmol)。3分鐘後，將Boc-NH-PEG5-胺之溶液(65.1 mg，0.17 mmol)添加至反應物中。在攪拌10 min之後，HPLC展示反應完成。在1小時之後，用約5 mL NaHCO 3(飽和)淬滅反應物，接著添加5 mL水且用4×30 mL Et 2O萃取混合物。合併之有機物用飽和鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中濃縮，得到受保護之粗中間物，其純度良好。m/z實驗值= 1063.6 (M+H)。
將以上中間物直接溶解於DCM(5 mL)中且添加TFA(5 mL)。將反應物攪拌24 h，直至HPLC指示完全移除三級丁氧羰基(Boc)及三級丁酯為止。真空濃縮反應溶液且與25 mL DCM共蒸發2次。用Et 2O自DCM中沈澱殘餘物，接著用音波處理(15-30 min)充分濕磨剩餘的固體，得到呈灰白色粉末狀之標題化合物(128 mg，86%兩步)，其純度良好。 1H NMR (400 MHz, 氧化氘) δ 4.15 - 3.68 (m, 7H), 3.62 (d, J= 4.7 Hz, 2H), 3.59 - 3.49 (m, 20H), 3.47 (t, J= 5.5 Hz, 2H), 3.35 - 2.78 (m, 16H), 2.52 - 2.37 (m, 2H), 1.97 - 1.79 (m, 2H). m/z實驗值= 739.5 (M+H)。
合成化合物( 4) 雙(2,3,5,6-四氟苯基)己二酸酯：將己二酸(1.00 g，6.84 mmol)及EDC(3.28 g，17.1 mmol)溶解於20 mL DCM中且在冰浴中冷卻至0℃，接著添加2,3,5,6-四氟苯酚於20 mL DCM中之溶液。藉由TLC(R f= 0.5；75% DCM/己烷)觀測到轉化為產物。真空濃縮反應混合物且藉由急驟層析(0-100% DCM/己烷)純化，得到呈白色結晶粉末狀之標題化合物(2.48 g，82%)。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ 7.03 (tt, J= 9.9, 7.0 Hz, 2H), 3.00 - 2.63 (m, 4H), 1.95 (t, J= 3.3 Hz, 4H)。此化合物根據LCMS具有不良信號。
化合物( 5) -{[2-(2-{2-[6-側氧基-6-(2,3,5,6四氟苯氧基)己醯胺基]乙氧基}乙氧基)乙基]胺甲醯基}-2-[4,7,10-三(羧基甲基)1,4,7,10四氮雜環十二烷-1-基]丁酸：向化合物3(22.1 mg，0.017 mmol)於DMF(1.5 mL)中之溶液中添加己二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(4) (45.2 mg, 0.102 mmol)及三乙胺(0.0086 mL，6.2 mg，0.061 mmol)。藉由HPLC確認完全轉化為產物。攪拌2 h後，用DMSO(1.5 mL)稀釋反應物且藉由直接注射於具有15-50% MeCN/水+0.1%TFA梯度之製備型HPLC(Agilent，Hanover，CT)上來純化，得到呈白色粉末狀之標題化合物(10.6 mg，50%) (2×TFA鹽)。 1H NMR (400 MHz, 氧化氘) δ 7.20 (tt, J= 10.4, 7.2 Hz, 1H), 3.97 - 3.65 (m, 5H), 3.58 - 3.51 (m, 20H), 3.49 (q, J= 5.1 Hz, 2H), 3.43 - 3.32 (m, 6H), 3.26 (t, J= 5.3 Hz, 2H), 3.20 - 2.82 (m, 12H), 2.69 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.52 - 2.34 (m, 2H), 2.19 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 1.99 - 1.82 (m, 2H), 1.75 - 1.46 (m, 4H)。m/z實驗值= 1015.3 (M+H)。
圖 6展示如下所述之包括編號(6)至(10)之化合物的PEG5-Py4Pa合成。
合成化合物( 6) 6-[({[4-(苄基氧基)-6-{[雙({6-[(三級-丁氧基)羰基]吡啶-2-基}甲基)胺基]甲基}吡啶-2-基]甲基}({6-[(三級-丁氧基)羰基]吡啶-2-基}甲基)胺基)甲基]吡啶-2-甲酸三級丁酯。向1-[6-(胺基甲基)-4-(苄基氧基)吡啶-2-基]甲胺(0.65 g, 2.67 mmol) (可購自N. Delsuc,等人 Angew Chem.國際版 2007, 46, 214-217)於乙腈(50 mL)中之經攪拌溶液中添加DIPEA(1.40 mL，1.04 mg，8.01 mmol)及6-(溴甲基)吡啶-2-甲酸三級丁酯(4.36 g, 16.0 mmol) (可購自P. Coomba, 等人 Inorg. Chem. 2016, 55, 12531-12543)且將溶液加熱至回流。在16小時之後，使反應物冷卻且真空移除溶劑。將粗物質溶解於200 mL DCM中且用2×75 mL NaHCO 3( 飽和 )及2×75 mL飽和鹽水洗滌。DCM層接著經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮，得到棕色粗油狀物(950 mg)，其可不經進一步純化即用於下一步驟中。將上述中間物溶解於EtOH中，添加甲酸銨(297 mg，4.71 mmol)且用N 2吹掃燒瓶。添加10% Pd/C(250 mg，0.23 mmol)，隨後再用N 2吹掃，接著添加30% Pd/C(50 mg，0.14 mmol)。用N 2再吹掃後，將反應物加熱至50℃且攪拌6小時，其中藉由LCMS確定反應完成。反應混合物經由矽藻土過濾，洗滌3×50 mL MeOH，接著在真空中濃縮至乳黃色油狀物。粗物質藉由急驟層析使用Biotage Sfar胺基D濾筒及40-100% EtOAc/己烷隨後0-20% MeOH/DCM之梯度純化，得到呈黃色固體狀之標題化合物(278 mg，11%)。 1H NMR (400 MHz, 甲醇- d 4) δ 7.88 (dd, J= 7.7, 1.3 Hz, 4H), 7.82 (t, J= 7.7 Hz, 4H), 7.73 (dd, J= 7.7, 1.2 Hz, 4H), 6.41 (s, 2H), 4.00 (s, 8H), 3.94 (s, 4H), 1.61 (s, 36H)。m/z實驗值 = 918.4 (M+H)。
合成化合物( 7) N-[17-(2-溴乙醯胺基)-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1-基]胺基甲酸三級丁酯：將N-(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1-基)胺基甲酸三級丁酯(200 mg, 0.53 mmol)及DIPEA (0.146 mL, 109 mg, 0.84 mmol)於5 mL DCM中之溶液冷卻至0℃。經2分鐘逐滴添加2-溴乙醯溴(0.069 mL，159 mg，0.79 mmol)於5 mL DCM中冷卻至0℃之溶液。使反應物升溫至室溫，在90 min之後，HPLC展示完全轉化為產物。反應物經濃縮，分配於Et 2O與水之間，添加NaHCO 3( 飽和 )，接著用3×25 mL Et 2O萃取混合物。經合併之有機物用鹽水洗滌，經硫酸鈉脫水，過濾且真空濃縮。粗殘餘物與乙腈共蒸發一次以移除水。回收呈淺棕色油狀之標題化合物(261 mg，99%)。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ 3.90 (s, 2H), 3.75 - 3.64 (m, 18H), 3.61 (d, J= 4.5 Hz, 2H), 3.56 (t, J= 5.1 Hz, 2H), 3.52 (t, J= 5.2 Hz, 2H), 3.37 - 3.30 (m, 2H), 1.46 (s, 9H)。m/z實驗值= 523.2 (M+Na)。
合成化合物( 8) 6-({[(6-{[雙({6-[(三級-丁氧基)羰基]吡啶-2-基}甲基)胺基]甲基}-4-{[(17-{[(三級-丁氧基)羰基]胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1-基)胺甲醯基]甲氧基}吡啶-2-基)甲基] ({6-[(三級-丁氧基)羰基]吡啶-2-基}甲基)胺基}甲基)吡啶-2-甲酸三級丁酯。將化合物 6(100 mg，0.11 mmol)及化合物 7(81.9 mg，0.163 mmol)溶解於乙腈(acetonitirile)(5 mL)中，接著添加碳酸鉀(30.1 mg，0.218 mmol)且在60℃下攪拌反應物。24小時後，根據HPLC沒有起始物質剩餘。濃縮反應物且藉由急驟層析(Biotage胺基D濾筒，梯度0.2-15% MeOH/DCM)純化，得到呈黃色膜狀之標題化合物(106 mg，73%)。 1H NMR (400 MHz, 甲醇- d 4) δ 7.89 (d, J= 7.8 Hz, 4H), 7.83 (t, J= 7.7 Hz, 4H), 7.66 (d, J= 7.6 Hz, 4H), 6.95 (s, 2H), 4.66 (s, 2H), 4.04 (s, 8H), 3.92 (s, 4H), 3.75 - 3.55 (m, 20H), 3.53 - 3.43 (m, 2H), 3.30 - 3.13 (m, 2H), 1.52 (s, 36H), 1.43 (s, 9H)。m/z實驗值= 670.0 (M+2H/2)。
合成化合物( 9) 6-({[(4-{[(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1-基)胺甲醯基]甲氧基}-6-({雙[(6-羧基吡啶-2-基)甲基]胺基}甲基)吡啶-2-基)甲基][(6-羧基吡啶-2-基)甲基]胺基}甲基)吡啶-2-甲酸：將化合物8(125 mg，0.093 mmol)溶解於DCM(5 mL)中且添加TFA(5 mL)。18 h後，HPLC展示沒有起始物質或三級丁基中間物剩餘。在真空中濃縮反應物且與DCM共蒸發一次。用Et 2O音波濕磨粗油狀物2次，且藉由過濾收集，得到100 mg(64%，呈5×TFA鹽形式)呈淺棕色固體狀之標題化合物。 1H NMR (400 MHz, 甲醇- d 4) δ 8.04 (d, J= 7.7 Hz, 4H), 7.96 (t, J= 7.8 Hz, 4H), 7.66 (t, J= 8.4 Hz, 4H), 7.45 (s, 2H), 4.84 (s, 2H), 4.74 - 4.49 (m, 12H), 3.74 (t, J= 5.0 Hz, 2H), 3.71 - 3.63 (m, 14H), 3.60 (t, J= 5.3 Hz, 2H), 3.48 (t, J= 5.6 Hz, 2H), 3.20 - 3.12 (m, 2H)。m/z實驗值= 1014.3 (M+H)。
合成化合物( 10) 6-[({[6-({雙[(6-羧基吡啶-2-基)甲基]胺基}甲基)-4-[({17-[6-側氧基-6-(2,3,5,6-四氟苯氧基)己醯胺基]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1-基}胺甲醯基)甲氧基]吡啶-2-基]甲基}[(6-羧基吡啶-2-基)甲基]胺基)甲基]吡啶-2-甲酸。向化合物9(80 mg，0.079 mmol)於DMF(2.5 mL)中之溶液中添加己二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(4) (140 mg, 0.32 mmol)及三乙胺(0.027 mL，20 mg，0.197 mmol)。藉由HPLC確認完全轉化為產物。攪拌4 h後，用DMSO(1.5 mL)稀釋反應物且藉由直接注射於具有25-60% MeCN/水+0.1%TFA梯度之製備型HPLC(Agilent，Hanover，CT)上來純化，得到呈白色粉末狀之標題化合物(57.5 mg，56%) (3×TFA鹽)。 1H NMR (400 MHz, 氧化氘) δ 7.85 (t, J= 7.8 Hz, 4H), 7.78 (dd, J= 7.8, 1.2 Hz, 4H), 7.50 (dd, J= 7.8, 1.2 Hz, 4H), 7.11 (tt, J= 10.4, 7.2 Hz, 1H), 6.99 (s, 2H), 4.59 (s, 2H), 4.49 (s, 8H), 4.45 (s, 4H), 3.60 - 3.45 (m, 18H), 3.46 (t, J= 5.3 Hz, 2H), 3.36 (t, J= 5.3 Hz, 2H), 3.22 (t, J= 5.3 Hz, 2H), 2.59 (t, J= 6.7 Hz, 2H), 2.14 (t, J= 6.7 Hz, 2H), 1.61 - 1.46 (m, 4H)。m/z實驗值= 1290.3 (M+H)。
合成化合物(11) 6-[({[6-({雙[(6-羧基吡啶-2-基)甲基]胺基}甲基)-4-{2-[4-(氰基硫烷基)苯基]乙氧基}吡啶-2-基]甲基}[(6-羧基吡啶-2-基)甲基]胺基)甲基]吡啶-2-甲酸；雙(三氟乙酸)：藉由遵循L Li等人 Bioconjugate Chem.2021, 32, 1348-1363中之條件來製備標題化合物。光譜及LCMS資料與報告值匹配。 實例 13. VHH-Fc 蛋白與螯合劑 - 連接子之結合
結合可使用許多可用於製備IgG放射性結合物及IgG抗體-藥物結合物之方法進行。關於可適用的方法範圍之資訊，參見PW Howard Antibody-Drug Conjugates (ADCs)， Protein Therapeutics，第一版、第9章，第278-279頁(2017)。
對於典型基於離胺酸之結合，藉由Microsep Advance離心裝置(Pall 10K MWCO，目錄號: MCP010C41)或藉由Zeba管柱(ThermoFisher，目錄號: 87768)將VHH-Fc緩衝交換至0.1 M NaHCO 3，pH 8.5-9.5，隨後用Costar Spin-X離心管, 0.22 μm (Corning，目錄號: 8160)進行滅菌。藉由BCA分析定量經緩衝交換之抗體。將適當莫耳過量(5至20當量)之螯合劑-連接子(50 mM於DMSO中)添加至VHH-Fc(2 mg/mL最終濃度)且將反應物在Thermomixer中在25℃下培育2小時或隔夜。反應完成後，根據製造商的方案使樣品通過Zeba管柱(ThermoFisher，目錄號: 87770)以移除未使用的螯合劑-連接子且緩衝交換至PBS (pH 7.4) (LifeTechnologies，目錄號: 10010-023)。在4℃下儲存此VHH-Fc-螯合劑結合物(VFCC)直至分析及純化。 實例 14. 使用 SEC 進行 VHH-Fc- 螯合劑結合物( VFCC) 純化
為移除高分子量物種(HMWS)及低分子量物種(LMWS)，使用具有Cytiva HiLoad 16/600 Superdex 200pg管柱之AKTA Pure FPLC系統藉由SEC純化VHH-Fc。TBS緩衝液(50 mM Tris，150 mM NaCl，OmniTrace超水[VWR，目錄號: CAWX0003-2]), pH 7.6係用於SEC緩衝液。將含有完整VHH-Fc之部分合併在一起且使用Microsep Advance離心裝置(Pall 10k MWCO，目錄號: MCP010C41)進行濃縮。將經濃縮之樣品轉移至Ultrafree-MC GV離心過濾器，0.22 µm 0.5 mL (Millipore，目錄號: UFC30GV0S)中且以3,000×g旋轉3分鐘。 實例 15. 蛋白質定量
VHH-Fc蛋白質含量用西妥昔單抗(Cetuximab)(LIST/E: 094822, DIN 02271249, 2 mg/mL)標準化之Pierce BCA蛋白質分析套組(Thermo，目錄號:23225)進行定量。 實例 16. 螯合劑與 VHH-Fc 比 (CAR) 分析
螯合劑負載比，在此描述為CAR，可以經由適用於抗體結合物領域從業者的方法進行分析。關於在ADC之情況下此等方法之綜述，參見Wakankar等人， mAbs3: 161(2011)。藉由DG-SEC-MS分析各結合物之CAR。
經由實例11中所述之去糖基化及UPLC-Q-TOF程序分析結合物。在此情況下，質譜解卷積後獲得質量分佈，從而可以計算製劑之平均CAR。
經由實例11中所述之去糖基化及UPLC-Q-TOF程序分析結合物。在此情況下，質譜解卷積後獲得質量分佈，從而可以計算製劑之平均CAR。 實例 17. VHH-Fc 結合物與表現目標蛋白之細胞之結合
在一些情況下，結合可不利地影響VHH-Fc與目標蛋白之結合。因此類似於如上文所描述測試VHH-Fc結合物之結合。 表 8展示VHH-Fc螯合劑結合物之細胞結合資料。
表 8-VHH-Fc螯合劑結合物之 細胞結合資料
EC50 (nM)
對照 抗體 SHP-77 HCT-116 HEK-DLL3 HEK-293
洛伐妥珠單抗 0.11 - 0.06 -
曲妥珠單抗 - 1.16 1.06 0.69
hIgG1 - - - -
短連接子DOTA p-SCN-Bn-DOTA H101 (CAR 0) - 2.21 1.62 1.14
H101 (CAR 0.6) - 1.96 1.73 1.16
H101 (CAR 1.1) - 2.46 1.39 1.42
H101 (CAR 2.3) - 3.34 2.05 1.68
H101 (CAR 2.7) - 2.96 1.88 1.58
H101 (CAR 4.6) - 5.63 2.99 2.27
H101 (CAR 8.3) - 5.32 4.43 3.52
D102 (CAR 0) 0.53 ＞100 1.42 ＞10
D102 (CAR 0.9) 0.41 - 0.48 -
D102 (CAR 4.7) 0.38 - 0.56 -
長連接子DOTA TFP-Ad-PEG5-DOTA H101 (CAR 0) - 2.21 1.62 1.14
H101 (CAR 2.0) - 4.01 3.99 3.11
H101 (CAR 8.9) - 40.11 28.37 28.89
D102 (CAR 0) 0.53 ＞100 1.42 ＞10
D102 (CAR 2.7) 0.50 - 0.58 -
D102 (CAR 9.3) 0.60 - 0.91 -
H101=Her2抗原結合；D102=DLL3抗原結合；CAR=螯合劑與VHH比
如 表 8中所觀測，觀測到長DOTA連接子與短DOTA連接子之結合。亦如 表 8中所示，亦觀測到隨著螯合劑VHH-Fc比(CAR)增加之結合。 實例 18. 完整百分比分析
藉由HPLC-SEC建立完整免疫結合物百分比。將12 μL結合物添加至標準HPLC瓶中之玻璃瓶插入物中。將10 μL樣品注射至具有Wyatt Technology WTC-050S5 SN:0429 BN WBD129管柱的Agilent HPLC-SEC上，且用1×PBS(100%)以0.5 mL/min之流動速率溶離40分鐘。 實例 19 . 內毒素含量測定
根據製造商方案，使用和光鱟變形細胞溶菌液(Wako's Limulus Amebocyte Lysate)Pyrostar TMES-F單一測試(目錄號:WPESK-0015)進行內毒素測試。QC截止值係基於研究中每隻動物預計之最大注射劑量來設定，同時遵循適當動物照護及FDA指南。 實例 20. 用 In-111 進行放射性標記
40 µg之4種測試品中的之每一者在500 µL lo-bind埃彭道夫管中用0.1 M乙酸銨緩衝液稀釋至100 µL，添加18-25 μL(20-22 MBq)之[ 111In]InCl3且用滴管混合。在培育箱中在37℃下培育反應混合物1小時。接著將該等管轉移至4℃冰箱中。
放射性核種之併入係藉由在1.5×10 cm iTLC條帶之起點處點樣0.5 μL樣品來確定。隨後將條帶置放於含有2 mL流動相(25 mM EDTA，在pH 5，0.1 M乙酸鈉緩衝液中)之50 mL Falcon管中，直至溶劑到達條帶頂部。移出條帶且將其暴露於磷光體成像板，隨後在Cyclone磷光體成像器中對其進行掃描。所關注區域繪製在與蛋白質結合及未結合之In-111之遷移相對應的點上，且計算出每個區域之比例。
亦藉由SEC-HPLC分析放射性結合物：將對應於0.1-0.2 MBq之體積的樣品移液至500 μL lo-bind埃彭道夫管中且在電離室中量測放射性。將樣品吸入注射器中且注射至HPLC系統上。樣品用PBS溶離。收集來自系統之洗出液且量測放射性以測定管柱之回收率(對樣品管及注射器中剩餘之放射性進行校正)。
表 -9 In -111 放射性標記效率
螯合劑 - 連接子 抗體 合成後標記效率
嘗試1 嘗試2
P-SCN-Bn-DOTA H101 95.9% 96.5%
TFP-Ad-PEG5-DOTAGA 97.5% 97.7%
P-SCN-Bn-DOTA D102 97.5% 97.0%
TFP-Ad-PEG5-DOTAGA 98.1% 97.2%
實例 21. 使用 Ac-225 進行放射性標記
800 µg之4種測試品中的之每一者在500 µL lo-bind埃彭道夫管中用0.2 M乙酸銨緩衝液pH 6.5稀釋至200 µL，添加2 μL(400 kBq)之225-氯化錒且用滴管混合。在37℃下在培育箱中在Py4Pa結合物之情況下將反應混合物培育1小時，且在DOTA結合物之情況下培育2小時。接著將該等管轉移至4℃冰箱中。
併入係藉由在1.5×10 cm iTLC條帶之起點處點樣0.5 μL樣品且使其乾燥幾分鐘來量測。隨後將條帶置放於含有2 mL流動相(25 mM EDTA，在pH 5，0.1 M乙酸鈉緩衝液中)之50 mL Falcon管中，直至溶劑到達條帶頂部。移除條帶且使其平衡至少2小時，其後使其暴露於磷光體成像板，隨後在Cyclone磷光體成像器中對其進行掃描。所關注區域繪製在與蛋白質結合及未結合之Ac-225之遷移相對應的點上，且計算出每個區域之比例。
或者，可藉由HPLC-SEC分析樣品：DOTA結合物之HPLC使用BioSEP SEC 5 µm s3000 3007.88 mm管柱，在PBS溶離液中含有20%乙腈。Py4Pa結合物之HPLC使用Wyatt 050S5 5 µm 500 Å 7.8×300 mm管柱，在PBS溶離液中含有20%乙腈。
將50 μL各樣品吸入Hamilton注射器中且注射至HPLC系統上。在注射後10至30分鐘，手動將30秒之洗出液部分(0.25 mL)收集至計數管中。使各部分達到長期平衡24小時，隨後在γ計數器中量測。亦對5 μL各製劑樣品進行計數以使得能夠計算HPLC系統之回收率。藉由分別測定DOTA及Py4Pa結合物在18.5-22.5分鐘及19.5-23.5分鐘內峰下面積來測定放射化學純度，作為總計數之百分比。如 表 10中所示，所有螯合劑-連接子組合展示良好標記效率。
表 10-Ac-225 放射性標記效率
螯合劑-連接子 抗體 緊接在製備之後的iTLC標記效率
p-SCN-Bn-DOTA H101 92.0%
TFP-Ad-PEG5-DOTAGA 96.3%
TFP-Ad-PEG5-Py4Pa 93.1%
p-SCN-Ph-Et-Py4Pa 96.0%
p-SCN-Bn-DOTA D102 98.5%
TFP-Ad-PEG5-DOTAGA 99.5%
TFP-Ad-PEG5-Py4Pa 98.0%
p-SCN-Ph-Et-Py4Pa 100%
實例 22. VHH-Fc 放射性結合物之穩定性
針對 225Ac與 111In兩者測試經放射性標記之免疫結合物的穩定性。VHH-Fc螯合劑-結合物如上文所描述經放射性標記(In-111或Ac-225)。針對在PBS中之穩定性，接著將50 μL每個經標記測試品添加至200 μL PBS(含In-111)或200 μL PBS/抗壞血酸鹽(含Ac-225)中且儲存在4℃下。針對在血清中之穩定性，將50 μL每個經標記測試品添加至200 μL小鼠血清中且在37℃下培育。在不同時間點獲取等分試樣且使用如上文所描述之iTLC及/或HPLC-SEC分析放射化學純度。此等穩定性實驗之結果展示於下 表 11及 表 12中且指示放射性結合物在PBS與血清兩者中均穩定。
表 11- 經 In-111 標記之 Her2 及 DLL3 結合物的穩定性
根據 HPLC( iTLC ) 之放射化學純度 DLL3 (D102) HER2 (H101)
P-SCN-Bn-DOTA TFP-Ad-PEG5-DOTAGA P-SCN-Bn-DOTA TFP-Ad-PEG5-DOTAGA
PBS 1h 97.5% 98.1% 97.5% 98.4%
PBS 24h 89.1% 95.2% 96.5% 98.4%
血清 24h 94% (94%) 98% (94%) 97% 94%
血清 72h 92% (92%) 96% (94%) 100% (87%) 100% (84%)
血清 168h 92% (94%) 95% 95% (91%) 92%
TLC放射化學併入值呈現於圓括號中。除其中示出外，iTLC併入＞95%，
表 12- 經 Ac-225 標記之 Her2 及 DLL3 結合物的穩定性
根據 HPLC( iTLC ) 之放射化學純度 DLL3 (D102) HER2 (H101)
P-SCN-Bn-DOTA TFP-Ad-PEG5-DOTAGA TFP-Ad-PEG5-Py4Pa P-SCN-Ph-Et-Py4Pa P-SCN-Bn-DOTA TFP-Ad-PEG5-DOTAGA TFP-Ad-PEG5-Py4Pa P-SCN-Ph-Et-Py4Pa
PBS 1h 91% 92% 83% 82% 93% 93% 84% N/D
PBS 24h 92% 92% 83% 83% 93% 91% 82% 82%
血清 24h 88% (94%) 91% 78% 69% 91% 90% 75% 68%
血清 72h 89% (90%) 90% (94%) 73% 65% 89% (87%) 85% (94%) 74% 61%
血清 168h 81% (91%) 86% 71% 59% 85% (89%) 80% 70% 56%
TLC放射化學併入值呈現於圓括號中。除其中示出外，iTLC併入＞95%，
實例 23. VHH-Fc 放射性結合物之免疫反應性
免疫反應性部分(IRF)係經由SK Sharma等人在 Nucl.Med.Biol.2019, 71,32-38中所述之方法來確定。將樣品在PBS中在4℃下培育隔夜以用於分析且在活體內實驗之前，而將一些樣品在血清中在37℃下培育3天及7天作為替代穩定性量度。 珠塗
戴諾磁珠(Dynabead)及抗原(0.15 nmol/0.125 μg珠粒)在B/W緩衝液(25 μL/0.125 μg珠粒)中於室溫下在管旋轉器上培育30分鐘。埃彭道夫管以100×g旋轉15秒且置於磁架上3分鐘。移出上清液且用PBSF洗滌珠粒。接著將1 mg珠粒再懸浮於200 μL B/W緩衝液中且2 mg珠粒再懸浮於400 μL B/W緩衝液中。以相同方式製備對照珠粒，不同之處在於管中未添加抗原。 免疫反應性部分 (IRF) 分析
將上文所產生之適量珠粒(25 μL/0.125 mg珠粒)添加至用1 mL PBSF預洗滌之微量離心管中。將經放射性標記之VHH-Fc-結合物(10 ng)、阻斷抗體(block)(10或50 μg未結合抗體；必要時)及PBSF添加至各反應以達成350 μL之最終體積。樣品在室溫下在轉子上培育30分鐘。在此之後，將管以100×g離心15秒且置放於磁架上3分鐘。在γ計數器管中收集上清液。珠粒用400 μL PBSF洗滌兩次且收集於分開的γ計數器管中。珠粒最終再懸浮於500 μL PBSF中且轉移至γ計數器管中。用500 μL PBSF洗滌反應管且將此添加至含有珠粒之γ計數器管中。
如關於DLL3之 圖 7A中所示，所有連接子螯合劑組合展示出類似免疫反應性部分，指示基於特定連接子螯合劑組合的標記沒有偏差， 圖 7B展示出在PBS或血清中24小時之後，不存在由於免疫反應性部分中之Fc區突變產生之作用，及 圖 7C展示出經 225AC標記之抗DLL3 VHH-Fc(D102)之免疫反應性部分及在血清及血漿中之穩定性。 實例 24 . VHH-Fc 放射性免疫結合物之生物分佈 HER2+ BT474 腫瘤中隨時間推移之生物分佈及組織累積
成像(例如使用銦-111( 111In))提供收集藥物動力學及生物分佈資料之能力，該等資料可用於為治療計劃執行劑量測定術計算。(參見例如Sgouros G, Hobbs RF. 「Dosimetry for radiopharmaceutical therapy.」 Semin Nucl Med.2014年5月;44(3):172-8)。不受理論束縛，用成像標記觀察到之標靶的定量論證指示用能夠促使標靶細胞死亡之放射性標記(例如，α發射體)進行標靶的能力。 圖 8繪示了這樣的現象，該圖說明用成像同位素 111In標記之小鼠(頂部)，在表現少量抗原及大量抗原之腫瘤中展現出治療性同位素 225Ac的累積，在此實例中分別為表現DLL3之SHP77腫瘤及表現HER2之BT474腫瘤。
本研究之目的係觀測帶有BT-474腫瘤(乳癌細胞)之裸鼠中跨所選擇之測試品之經 111In放射性標記之SPECT/CT成像的生物分佈。在約4之CAR下測試以下物品： 111In-H101-短DOTA連接子(p-SCN-Bn-DOTA，SL)、 111In-H101-長DOTA連接子(TFP-Ad-PEG5-DOTAGA，LL)、 111In-H105-LL、 111In-H107-LL，及 111In-H108-LL。 圖 9A 、圖 9B及 圖 9C展示 111In-H101-SL、 111In-H101-LL及 111In-H108-LL隨時間推移之組織累積。 圖 9D展示在HER2+腫瘤模型中使用標靶DLL3之VHH-Fc的最小腫瘤累積，進一步表明標靶HER2之VHH-Fc之特異性。 圖 10A 、圖 10B及 圖 10C展示腫瘤:組織比。在各種情況下，腫瘤:組織比大於5，指示腫瘤累積增加及用於確定安全性之更好概況(例如相較於較低腫瘤:組織比)。 圖 11展示 111In-H101-LL、 111In-H105-LL、 111In-H107-LL及 111In-H108-LL在144小時之ID/g%。在各種情況下，VHH-Fc變異體展示對腫瘤組織之有利標靶。 圖 12展示VHH-Fc(H101)及VHH-Fc變異體(H105、H107及H108)之全身清除，其中VHH-Fc變異體展示增加之清除，此在考慮安全性及預防不想要的組織毒性時可進一步有利。在所有情況下，所有測試品都避免了顯著的腎臟累積，進一步表明有利之安全概況且避免不想要的組織毒性。 表 13特定展示 111In-H101-LL、 111In-H105-LL、 111In-H107-LL及 111In-H108-LL隨時間推移之腫瘤累積。
表13 ： 抗HER2 VHH-Fc 變異體之腫瘤累積( 平均ID/g% ；n=4)
      4 h 24 h 48 h 72 h 144 h
111In-H108-LL 平均值 4.7 12.2 14.4 12.7 13.7
SEM 0.6 1.8 2.1 0.9 2.2
111In-H101-LL 平均值 4.9 9.3 14.2 14.1 11.1
SEM 0.5 1.1 2.0 2.6 2.6
111In-H105-LL 平均值 4.9 7.1 9.0 9.4 9.0
SEM 1.1 2.0 1.9 2.2 1.8
111In-H107-LL 平均值 6.2 12.6 18.6 18.0 17.1
SEM 1.1 1.9 2.3 2.6 2.8
DLL3+ SHP-77 腫瘤中隨時間推移之生物分佈及組織累積
本研究之目的係觀測帶有SHP-77腫瘤之裸鼠中跨所選擇之測試品之 111In SPECT/CT的生物分佈。相比於HER2，DLL3一般以較低複本數存在於細胞表面上。因此，DLL3代表標靶低複本數目標蛋白之能力，而HER2代表安全地且有效地標靶高複本數目標蛋白之能力。測試以下物品： 111In-D102-長DOTA連接子(LL)、 111In-D111-LL、 111In-D113-LL及 111In-D114-LL。有趣的是，對於DLL3模型，觀測到與HER2模型類似的標靶概況及觀測結果，表明標靶高複本數及低複本數目標的能力。 圖 13展示 111In-D102-LL腫瘤:組織比且 圖 14展示 111In-D102-LL、 111In-D111-LL、 111In-D113-LL及 111In-D114-LL在144小時之ID/g%。如對於HER2所觀測到的，抗DLL3 VHH-Fc變異體展示對腫瘤組織之有利標靶。另外，肝累積指示增加之清除，此在考慮安全性及預防不想要的組織毒性時可進一步有利。在所有情況下，所有測試品都避免了顯著的腎臟累積，進一步表明有利之安全概況且避免不想要的組織毒性。 表 14特定地展示 111In-D102-LL、 111In-D111-LL、 111In-D113-LL及 111In-D114-LL隨時間推移之腫瘤累積。
表14 ： 抗DLL3 VHH-Fc 變異體之腫瘤累積(平均ID/g%；n = 4)
      4 h 24 h 48 h 72 h 144 h
111In-D102-LL 平均值 6.0 12.8 18.0 19.0 23.7
SEM 0.7 1.7 2.1 2.1 5.4
111In-D111-LL 平均值 5.5 12.8 16.6 16.8 15.9
SEM 1.4 1.1 2.0 2.3 2.9
111In-D113-LL 平均值 4.5 8.7 10.0 9.4 5.7
SEM 0.6 1.2 1.4 1.2 0.9
111In-D114-LL 平均值 5.1 10.9 14.6 15.8 13.2
SEM 0.5 0.9 1.6 2.4 3.1
綜合而言， 111In成像結果展示標靶高複本數與低複本數目標可藉由經放射性標記之VHH-Fc及VHH-Fc變異體來實現。此等結果進一步指示標靶腫瘤組織、避免非腫瘤組織及在某些情況下有效清除經放射性標記之VHH-Fc(例如具有降低FcRn親和力之突變的VHH-Fc)的有利安全性及特異性概況。 經 Ac-225 放射性標記之 VHH-Fc 之生物分佈及組織累積
此研究之目的係觀測(i)如上文所描述之BT-474腫瘤小鼠模型中經Ac-225放射性標記之HER2 VHH-Fc及(ii)如上文所描述之SHP-77腫瘤小鼠模型中經Ac-225放射性標記之DLL3 VHH-Fc的生物分佈。藉由γ計數實現腫瘤及正常組織中之離體放射性定量。
如本文所述，HER2模型代表在癌細胞上具有高受體密度之目標(例如約300,000個複本/細胞)。 圖 15A展示225Ac-H101-LL及225Ac-H108-LL在144小時之ID/g%。兩種測試品均展示有利的標靶概況，符合 111In成像資料。值得注意的是，利用與成像資料一致之有利腫瘤:組織比達成對腫瘤組織之特異性標靶。對於VHH-Fc變異體225Ac-H108-LL，在血液中偵測到放射性較低，指示VHH-Fc變異體之清除較快(與實例10中之結果一致)。225Ac-H108-LL亦顯示出較少的腎臟累積及較多的肝臟累積，指示經由肝臟途徑之清除增加及避免腎臟，此進一步支持具有FcRn突變之VHH-Fc的安全概況增加。225Ac-H108-LL之腫瘤累積較低可歸因於血清半衰期減少(亦即，清除較快)。 表 15進一步展示直至注射後第6天之腫瘤體積，其中在投與225Ac-H101-LL及225Ac-H108-LL之後腫瘤體積減少。 表 15表明注射了具有野生型Fc或FcRn突變之VHH免疫結合物之小鼠截至注射後第6天都看到腫瘤縮小。
表15 ： 抗HER2 VHH-Fc 處理之前及之後的腫瘤體積(平均mm 3；n = 5)
天 -15 -11 -8 -6 -4 -1 0 ( 給藥) 3 6
225 AC-H101-LL 平均值 57.4 66.5 51.9 54.7 65.6 73.9 74.4 31.3 47.0
SD 19 10 10 10 20 36 22 11 12
225 AC-H108-LL 平均值 46.4 56.5 67.9 63.2 67.3 62.6 78.1 46.2 51.2
SD 9 11 16 12 14 14 27 19 23
亦如本文中所描述，DLL3代表在癌細胞上具有低目標密度之目標(例如約3,000個複本/細胞)。 圖 15B展示225Ac-D102-LL及225Ac-D114-LL在144小時之ID/g%。兩種測試品均展示有利的標靶概況，符合 111Ln成像資料。另外，利用與成像資料一致之有利腫瘤:組織比達成腫瘤組織之特異性標靶。正如用抗HER2 VHH-Fc變異體觀察到的，對於VHH-Fc變異體225Ac-D114-LL，VHH-Fc變異體顯示出增加之清除及減少之腎臟暴露，這在考慮安全性及預防不想要的組織毒性時可能進一步有利。225Ac-D114-LL之腫瘤累積較低可歸因於血清半衰期減少(亦即，清除較快)。 實例 25. 與 VHH-Fc 放射性免疫結合物相關之低毒性
進行研究以確定負載有 225AC之VHH-Fc之耐受性。以四種不同的活性劑量(18.5 kBq, 12 kBq, 6 kBq, 2 kBq)將 225Ac-H101-447804(具有野生型Fc，TFP-Ad-PEG5-DOTAGA之抗HER2)或 225Ac-H107-447804(具有H310A Fc，TFP-Ad-PEG5-DOTAGA之抗HER2)靜脈內注射(IV)至未處理雌性無胸腺裸鼠之尾部靜脈中。根據注射當天量測到之體重調整活性劑量體積。每天監測所有動物之不良影響。所有動物一週記錄體重三次(偶爾兩次或四次)，直至在注射後23天研究結束。注射後23天處死所有動物。屍體經歷屍檢。記錄全血、脾及肝重量。 圖 16A、 圖 16B及 圖 16C展示所量測到之重量變化百分比( 16A)、肝臟質量( 16B)及脾臟質量( 16C)。高達740 kBq/kg之經 225Ac標記之抗體的所有劑量均具有良好耐受性且未觀測到輻射病之適應症。 實例 26. SHP77 異種移植小鼠中之功效測試
使用SHP77肺癌細胞株進行抗DLL3 VHH-Fc(WT及不同變異體)之功效研究。選擇八十(80)隻具有類似尺寸腫瘤之動物注射測試品。研究中之動物將分配至以下組中且將在尾部靜脈中用經標記之測試品進行單次食團靜脈內注射(IV)。每隻小鼠的目標註入體積為150 µL，a)第1組：IV注射媒劑(PBS)，n=8；b);第2組：IV注射V002(無放射性標記)，n=8；第3組：IV注射 225Ac-V002-447804-4，低劑量，n=8；第4組：IV注射 225Ac-V002-447804-4，高劑量，n=8；第5組：IV注射 225Ac-V014-447804-4，低劑量，n=8；第6組：IV注射 225Ac-V014-447804-4，高劑量，n=8；第7組：IV注射 177Lu-V002-447804-4，低劑量，n=8；第8組：IV注射 177Lu-V002-447804-4，高劑量，n=8；第9組：IV注射 177Lu-V014-447804-4，低劑量，n=8；第10組：IV注射 177Lu-V014-447804-4，高劑量，n=8。
兩種測試品之活性劑量為：a)Ac-225: 6 kBq/小鼠(低)，18.5 kBq/小鼠(高)；b)Lu-177: 350 kBq(低)，700 kBq(高)。
兩種測試品之質量劑量：基於活性劑量及比活性。a)對於Ac-225組：10 μg/小鼠(低)，31 μg/小鼠(高)；b)對於Lu-177組：10 μg(低)，20 μg(高)。
在給藥當天或在前一天對動物稱重且量測腫瘤(參考資料)。將每天監測所有動物之不良影響。對於具有不良影響之任何動物，將開始在福利評分表(附錄)上對受影響動物進行評分。在給藥後，將每天檢查小鼠，每週稱重兩次，且用測徑規進行腫瘤量測，每週三次，持續至多12週(但對於對照組1及2預期僅約4週)。     當達到10%或更大體重減輕時，將增加重量量測之頻率。將採集行動，諸如提供搗碎食品或凝膠食品。許可限制為重量減輕15%。若腫瘤超過限制(長度×寬度=144 mm 2)，則將在計劃的研究結束之前對動物實施安樂死。儘管出於清楚及理解起見已相當詳細地描述本發明，但習此相關技藝之人士藉由閱讀本發明將明確，在不脫離本發明之真實範疇之情況下可對形式及細節做出各種變化。舉例而言，上文所描述之所有技術及裝備可以各種組合使用。本申請案中引用的所有公開案、專利、專利申請案及/或其他文獻均出於所有目的以全文引用的方式併入本文中，引用的程度就如同個別地指示將各個別公開案、專利、專利申請案及/或其他文獻以引用的方式併入以用於所有目的一樣。 實例 27. 用 Lu-177 進行放射性標記
50 µg測試品(D102)在500 µL lo-bind埃彭道夫管中用0.1 M乙酸銨緩衝液pH 5.5稀釋至100 µL，添加在3.2 µL-3.5 µL之177-氯化鎦中之51 MBq且用滴管混合。反應混合物在培育箱中在37℃下培育3小時且在30 min及1、2及3 h下取樣用於iTLC分析。標記之結果展示於下表16中，且指示用177-鎦進行高效標記。
表16
測試品 在37℃下之培育時間
D102 30 min 60 min 2 hr 3 hr
TFP-Ad-PEG5-DOTAGA 99.0% 99.2% 99.2% 99.3%
在PBS/抗壞血酸鹽中稀釋且在4℃下儲存之後，如實例22中藉由iTLC分析來評定純度。
為了分析穩定性，將50 µL測試品添加至200 µL PBS/抗壞血酸鹽中且儲存在4℃下。在1至4小時及18至24小時之後藉由iTLC及SEC-HPLC分析樣品。結果展示於下 表 17中，且指示構築體之穩定性。
表17
測試品 培育時間
D102 1 hr 1 d
TFP-Ad-PEG5-DOTAGA 98.8% 98.6%
藉由上文實例23中所描述之IRF分析來分析Lu-177結合物且結果展示於 圖 17中。在此實例中，對照物為不負載抗原之珠粒。
雖然本文已展示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將明白，此等實施例僅藉助於實例提供。熟習此項技術者可在不背離本發明之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文所描述之本發明實施例之各種替代方案可用於實施本發明。
本說明書中所提及之所有公開案、專利申請案、頒予專利及其他文獻均以引用之方式併入本文中，該引用程度就如同已特定地且個別地將各個公開案、專利申請案、頒予專利或其他文獻以全文引用之方式併入一般。在以引用的方式併入之文本中所含之定義若與本發明中之定義矛盾，則將其排除在外。
Figure 02_image017
Figure 02_image019
Fc野生型 (SEQ ID NO: 10)
Figure 02_image021
圖 1A及 圖 1B展示抗HER2及抗DLL3 VHH-Fc構築體之結合。
圖 2A、 圖 2B及 圖 2C展示抗HER2及抗DLL3 VHH-Fc構築體與表現HER2及/或DLL3之細胞的結合。
圖 3A 及圖 3B展示抗HER2及抗DLL3 VHH-Fc構築體在表現HER2及DLL3之細胞中的內化。
圖 4展示抗HER2及抗DLL3 VHH-Fc構築體之自相互作用資料。
圖 5展示用於連接分子之化學合成的圖示。
圖 6展示用於連接分子之化學合成的圖示。
圖 7A 、圖 7B 及圖 7C展示不同VHH-Fc構築體之免疫反應性部分。
圖 8展示與 225Ac標記之VHH-Fc之生物分佈相比，使用 111In標記之VHH-Fc之成像之比較。
圖 9A 、圖 9B 、圖 9C 及圖 9D展示經標記之抗HER2 VHH-Fc構築體隨時間推移之生物分佈。
圖 10A 、圖 10B 及圖 10C展示經標記之抗HER2 VHH-Fc構築體之腫瘤:非腫瘤組織比率。
圖 11展示經標記之抗HER2 VHH-Fc構築體之生物分佈。
圖 12展示用 111In標記之VHH-Fc(H101)及VHH-Fc變異體(H105、H107及H108)的全身清除。
圖 13展示經標記之抗DLL3 VHH-Fc構築體隨時間推移之生物分佈。
圖 14展示經標記之抗DLL3 VHH-Fc構築體之生物分佈。
圖 15A及 圖 15B展示 225Ac標記之抗HER2( 15A)及抗DLL3( 15B)VHH-Fc構築體之生物分佈。
圖 16A、 圖 16B及 圖 16C展示使用 225Ac標記之抗HER2 VHH-Fc構築體進行之毒性研究的結果。
圖 17展示負載有 177Lu之不同 抗 DDL3VHH-Fc構築體之免疫反應性部分。
圖 18展示本文所述之某些連接子螯合劑之化學結構。

Claims (123)

  1. 一種免疫結合物，其包含：a)抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)螯合劑；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。
  2. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗原結合區包含scFv多肽或VHH多肽。
  3. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗原結合區包含scFv多肽。
  4. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗原結合區包含VHH多肽。
  5. 如請求項1至4中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區經人源化。
  6. 如請求項1至4中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區特異性結合至HER2或DLL3。
  7. 如請求項1至4中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區特異性結合至HER2。
  8. 如請求項1至4中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區包含：a)重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO: 21中所闡述之胺基酸序列；b)重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO: 22中所闡述之胺基酸序列；及c)重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO: 23中所闡述之胺基酸序列，且該抗原結合區結合至HER2。
  9. 如請求項1至4中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區包含與SEQ ID NO: 20中所闡述之序列至少85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列且該抗原結合區結合至HER2。
  10. 如請求項1至4中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區特異性結合至DLL3。
  11. 如請求項1至4中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區包含：a)重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO: 31中所闡述之胺基酸序列；b)重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO: 32中所闡述之胺基酸序列；及c)重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO: 33中所闡述之胺基酸序列，且該抗原結合區結合至DLL3。
  12. 如請求項1至4中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區包含與SEQ ID NO: 30中所闡述之序列至少85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列，且該抗原結合區結合至DLL3。
  13. 如請求項1至12中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白之CH2域、免疫球蛋白之CH3域，或免疫球蛋白之CH2及CH3域。
  14. 如請求項1至12中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白之CH2及CH3域。
  15. 如請求項1至14中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區為人類免疫球蛋白重鏈恆定區。
  16. 如請求項1至15中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區為IgA、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
  17. 如請求項1至15中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區為IgG1同型。
  18. 如請求項1至15中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區為IgG4同型。
  19. 如請求項1至18中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能或改變該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。
  20. 如請求項1至18中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能且改變該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。
  21. 如請求項1至18中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化降低免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能。
  22. 如請求項1至18中任一項之免疫結合物，其中該免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的變化，該變化改變該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。
  23. 如請求項19至22中任一項之免疫結合物，其中降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能之該一或多個胺基酸殘基的變化為降低補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用ADCP、或其組合的變化。
  24. 如請求項19至23中任一項之免疫結合物，其中降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能之該一或多個胺基酸殘基的變化係選自由以下組成之清單：根據EU編號之(a) 297A、297Q、297G或297D，(b) 279F、279K或279L，(c) 228P，(d) 235A、235E、235G、235Q、235R或235S，(e) 237A、237E、237K、237N或237R，(f) 234A、234V或234F，(g) 233P，(h) 328A，(i) 327Q或327T，(j) 329A、329G、329Y或329R (k) 331S，(l) 236F或236R，(m) 238A、238E、238G、238H、238I、238V、238W或238Y，(n) 248A，(o) 254D、254E、254G、254H、254I、254N、254P、254Q、254T或254V，(p) 255N，(q) 256H、256K、256R或256V，(r) 264S，(s) 265H、265K、265S、265Y或265A，(t) 267G、267H、267I或267K，(u) 268K，(v) 269N或269Q，(w) 270A、270G、270M或270N，(x) 271T，(y) 272N，(z) 292E、292F、292G或292I，(aa) 293S，(bb) 301W，(cc) 304E，(dd) 311E、311G或311S，(ee) 316F，(ff) 328V，(gg) 330R，(hh) 339E或339L，(ii) 343I或343V，(jj) 373A、373G或373S，(kk) 376E、376W或376Y，(ll) 380D，(mm) 382D或382P，(nn) 385P，(oo) 424H、424M或424V，(pp) 434I，(qq) 438G，(rr) 439E、439H或439Q，(ss) 440A、440D、440E、440F、440M、440T或440V，(tt) K322A，(uu) L235E，(vv) L234A及L235A，(ww) L234A、L235A及G237A，(xx) L234A、L235A及P329G，(yy) L234F、L235E及P331S，(zz) L234A、L235E及G237A，(aaa) L234A、L235E、G237A及P331S，(bbb) L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S及P331S，(ccc) L234A、L235A及P329A，(ddd) G236R及L328R，(eee) G237A，(fff) F241A，(ggg) V264A，(hhh) D265A，(iii) D265A及N297A，(jjj) D265A及N297G，(kkk) D270A，(lll) A330L，(mmm) P331A或P331S或(nnn) E233P，(ooo) L234A、L235E、G237A、A330S及P331S，或(ppp)(a)至(ppp)之任何組合。
  25. 如請求項19至22中任一項之免疫結合物，其中降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能之該一或多個胺基酸殘基的變化包含根據EU編號之L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
  26. 如請求項19至25中任一項之免疫結合物，其中改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的胺基酸變化縮短該免疫結合物之血清半衰期。
  27. 如請求項19至22中任一項之免疫結合物，其中改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之251、252、253、254、255、288、309、310、312、385、386、388、400、415、433、435、436、439、447，及其組合。
  28. 如請求項19至22中任一項之免疫結合物，其中改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之253、254、310、435、436及其組合。
  29. 如請求項19至22中任一項之免疫結合物，其中改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之I253A、I253D、I253P、S254A、H310A、H310D、H310E、H310Q、H435A、H435Q、Y436A及其組合。
  30. 如請求項19至22中任一項之免疫結合物，其中改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之I253A、S254A、H310A、H435Q、Y436A及其組合。
  31. 如請求項19至22中任一項之免疫結合物，其中改變該免疫結合物與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合的該一或多個胺基酸殘基的變化係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：根據EU編號之I253A、H310A、H435Q及其組合。
  32. 如請求項19至31中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物之血清半衰期小於15天。
  33. 如請求項19至31中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物之血清半衰期小於10天。
  34. 如請求項19至31中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物之血清半衰期小於120小時。
  35. 如請求項19至31中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物之血清半衰期小於72小時。
  36. 如請求項1至35中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區係藉由連接子胺基酸序列或人類IgG鉸鏈區與該免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。
  37. 如請求項1至36中任一項之免疫結合物，其中該抗原結合區係藉由人類IgG鉸鏈區與該免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。
  38. 如請求項1至37中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為放射性同位素螯合劑。
  39. 如請求項1至37中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為α發射體螯合劑。
  40. 如請求項1至37中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為β-或γ-發射體螯合劑。
  41. 如請求項1至38中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑係選自由以下組成之清單：DOTA、DO3A、DOTAGA、DOTAGA酸酐、Py4Pa、Py4Pa-NCS、Crown、Macropa、Macropa-NCS、HEHA、CHXoctapa、Bispa、Noneunpa、及其組合。
  42. 如請求項1至38中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑係選自由以下組成之清單：DOTMA、DOTPA、DO3AM-乙酸、DOTP、DOTMP、DOTA-4AMP、CB-TE2A、NOTA、NOTP、TETPA、TETA、PEPA、H4Octapa、H2Dedpa、DO2P、EDTA、DTPA-BMA、3,2,3-LI(HOPO)、3,2-HOPO、Neunpa、Neunpa-NCS、Octapa、PyPa、卟啉(Porphyrin)、去鐵胺(Deferoxamine)、DFO*、及其組合。
  43. 如請求項1至38中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為DOTA。
  44. 如請求項1至38中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為DOTAGA。
  45. 如請求項1至38中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為Py4Pa。
  46. 如請求項1至45中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑直接與該抗原結合區及/或該免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。
  47. 如請求項1至45中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑係藉由連接子與該抗原結合區及/或該免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。
  48. 如請求項47之免疫結合物，其中該連接子係選自：6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(MC)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(MP)、纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(ala-phe)、對-胺基苄氧基羰基(PAB)，以及彼等與如下連接子試劑結合產生者：形成4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯之連接部分4-巰基戊酸(SPP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二醯亞胺酯(SPDB)、(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯(SIAB)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇聚合物(PEG n)、及S-2-(4-異硫氰基苄基)(SCN)。
  49. 如請求項47之免疫結合物，其中該連接子係選自：聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇聚合物(PEG)及S-2-(4-異硫氰基苄基)(SCN)。
  50. 如請求項47之免疫結合物，其中該連接子為PEG 5。
  51. 如請求項47之免疫結合物，其中該連接子為SCN。
  52. 如請求項1至51中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑係選自由以下組成之清單的連接子-螯合劑：TFP-Ad-PEG5-DOTAGA、p-SCN-Bn-DOTA、p-SCN-Ph-Et-Py4Pa及TFP-Ad-PEG5-Ac-Py4Pa。
  53. 如請求項1至52中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為TFP-Ad-PEG5-DOTAGA。
  54. 如請求項1至52中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為p-SCN-Bn-DOTA。
  55. 如請求項1至52中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為p-SCN-Ph-Et-Py4Pa。
  56. 如請求項1至52中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑為TFP-Ad-PEG5-Ac-Py4Pa。
  57. 如請求項1至56中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑以1: 1至8: 1之比率，與該抗原結合區及/或該免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。
  58. 如請求項1至56中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑以1: 1至6: 1之比率，與該抗原結合區及/或該免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。
  59. 如請求項1至56中任一項之免疫結合物，其中該螯合劑以2: 1至6: 1之比率，與該抗原結合區及/或該免疫球蛋白重鏈恆定區偶合。
  60. 如請求項1至59中任一項之免疫結合物，其進一步包含放射性同位素。
  61. 如請求項60之免疫結合物，其中該放射性同位素為α發射體。
  62. 如請求項60之免疫結合物，其中該放射性同位素為選自由以下組成之清單的α發射體：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。
  63. 如請求項60之免疫結合物，其中該放射性同位素為225-Ac。
  64. 如請求項60之免疫結合物，其中該放射性同位素為β發射體。
  65. 如請求項60之免疫結合物，其中該放射性同位素為選自177-Lu、90-Y、67-Cu及153-Sm之β發射體。
  66. 如請求項1至65中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物之分子量在60與100 kDa之間。
  67. 如請求項1至65中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物之分子量在60與90 kDa之間。
  68. 如請求項1至65中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物之分子量在65與90 kDa之間。
  69. 如請求項1至65中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物之分子量在70與90 kDa之間。
  70. 如請求項1至69中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物與另一免疫結合物形成二聚體。
  71. 如請求項1至70中任一項之免疫結合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
  72. 如請求項1至71中任一項之免疫結合物，其經調配用於靜脈內投藥。
  73. 一種製備如請求項1至70中任一項之免疫結合物的方法，其包含在該免疫結合物上加載放射性同位素。
  74. 如請求項73之方法，其中該放射性同位素為α發射體。
  75. 如請求項73之方法，其中該放射性同位素為選自由以下組成之清單的α發射體：225-Ac、223-Ra、224-Ra、227-Th、212-Pb、212-Bi及213-Bi。
  76. 如請求項73之方法，其中該放射性同位素為225-Ac。
  77. 如請求項73之方法，其中該放射性同位素為β發射體。
  78. 如請求項73之方法，其中該放射性同位素為選自177-Lu、90-Y、67-Cu及153-Sm之β發射體。
  79. 如請求項73之方法，其中該放射性同位素為177-Lu。
  80. 一種治療個體之癌症或腫瘤的方法，其包含向該個體投與如請求項60至72中任一項之免疫結合物，藉此治療該癌症或該腫瘤。
  81. 如請求項80之方法，其中該個體為人類個體。
  82. 如請求項80或81之方法，其中該癌症或該腫瘤為實體癌症或腫瘤。
  83. 如請求項80或81之方法，其中該癌症或該腫瘤包含肺癌、乳癌、卵巢癌或神經內分泌癌。
  84. 如請求項80至82中任一項之方法，其包含向該個體投與0.5 µCi至30.0 µCi/公斤。
  85. 如請求項80至82中任一項之方法，其包含向該個體投與10 mCi至75 mCi/平方公尺體表面積。
  86. 如請求項80至85中任一項之方法，其中該癌症或腫瘤表現由該免疫結合物特異性結合之抗原。
  87. 如請求項60至72中任一項之免疫結合物，其用於治療個體之癌症或腫瘤的方法中。
  88. 如請求項87之用途，其中該個體為人類個體。
  89. 如請求項87或88之用途，其中該癌症或腫瘤為實體癌症或腫瘤。
  90. 如請求項87至89中任一項之用途，其中該癌症或該腫瘤包含肺癌、乳癌、卵巢癌或神經內分泌癌。
  91. 如請求項87至90中任一項之用途，其中向該個體投與0.5 µCi至30.0 µCi/公斤。
  92. 如請求項87至91中任一項之用途，其包含向該個體投與10 m Ci至75 mCi/平方公尺體表面積。
  93. 如請求項87至92中任一項之用途，其中該癌症或腫瘤表現由該免疫結合物特異性結合之抗原。
  94. 一種殺死個體之癌細胞的方法，其包含向該個體投與如請求項60至72中任一項之免疫結合物，藉此殺死該癌細胞。
  95. 如請求項94之方法，其中該個體為人類個體。
  96. 如請求項94或95之方法，其中該癌細胞包含肺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞或神經內分泌癌細胞。
  97. 如請求項94至96中任一項之方法，其中該癌細胞表現由該免疫結合物特異性結合之抗原。
  98. 如請求項60至72中任一項之免疫結合物，其用於殺死個體之癌細胞的方法中。
  99. 如請求項98之用途，其中該個體為人類個體。
  100. 如請求項98或99之用途，其中該癌細胞包含肺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞或神經內分泌癌細胞。
  101. 如請求項98至100中任一項之用途，其包含向該個體投與0.5 µCi至30.0 µCi/公斤。
  102. 如請求項98至101中任一項之用途，其中該癌細胞表現由該免疫結合物特異性結合之抗原。
  103. 一種將放射性同位素遞送至個體之癌細胞或腫瘤細胞的方法，其包含向該個體投與如請求項60至72中任一項之免疫結合物，藉此將該放射性同位素遞送至該癌細胞或該腫瘤細胞。
  104. 如請求項103之方法，其中該個體為人類個體。
  105. 如請求項103或104之方法，其中該癌細胞或腫瘤細胞包含肺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞或神經內分泌癌細胞。
  106. 如請求項103至105中任一項之方法，其中該癌細胞或腫瘤細胞表現由該免疫結合物特異性結合之抗原。
  107. 如請求項60至72中任一項之免疫結合物，其用於將放射性同位素遞送至個體之癌細胞或腫瘤細胞。
  108. 如請求項107之用途，其中該個體為人類個體。
  109. 如請求項107或108之用途，其中該癌細胞或腫瘤細胞包含肺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞或神經內分泌癌細胞。
  110. 如請求項107至109中任一項之用途，其中該癌細胞或該腫瘤細胞表現由該免疫結合物特異性結合之抗原。
  111. 一種使個體中之腫瘤成像的方法，其包含向該個體投與如請求項60至72中任一項之免疫結合物。
  112. 如請求項111之方法，其中該個體為人類個體。
  113. 如請求項111或112之方法，其中該腫瘤包含肺癌、乳癌、卵巢癌或神經內分泌癌。
  114. 如請求項111至113中任一項之方法，其中該腫瘤表現由該免疫結合物特異性結合之抗原。
  115. 如請求項60至72中任一項之免疫結合物，其用於使個體中之腫瘤成像的方法中。
  116. 如請求項115之用途，其中該個體為人類個體。
  117. 如請求項115或116之用途，其中該癌症或該腫瘤包含肺癌、乳癌、卵巢癌或神經內分泌癌。
  118. 如請求項115至117中任一項之用途，其中該腫瘤表現由該免疫結合物特異性結合之抗原。
  119. 一種核酸，其編碼如請求項1至36中任一項之免疫結合物。
  120. 一種表現載體，其包含如請求項119之核酸。
  121. 一種細胞，其包含如請求項119之核酸或如請求項120之表現載體。
  122. 如請求項121之細胞，其中該細胞為真核細胞。
  123. 如請求項122之細胞，其中該真核細胞為CHO細胞。
TW111106108A 2021-02-22 2022-02-18 用於標靶放射性同位素治療之免疫結合物 TW202245847A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163152079P 2021-02-22 2021-02-22
US63/152,079 2021-02-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202245847A true TW202245847A (zh) 2022-12-01

Family

ID=82932125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111106108A TW202245847A (zh) 2021-02-22 2022-02-18 用於標靶放射性同位素治療之免疫結合物

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP4294845A1 (zh)
JP (1) JP2024507554A (zh)
KR (1) KR20230159831A (zh)
CN (1) CN117321081A (zh)
AU (1) AU2022222471A1 (zh)
BR (1) BR112023016779A2 (zh)
CA (1) CA3208798A1 (zh)
IL (1) IL305334A (zh)
MX (1) MX2023009761A (zh)
TW (1) TW202245847A (zh)
WO (1) WO2022175750A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024044554A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Abdera Therapeutics Inc. Vhh antibody conjugates with heteroaryl chelators
WO2024044550A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Abdera Therapeutics Inc. Dll3 binding molecules and uses thereof
WO2024044551A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Abdera Therapeutics Inc. Multivalent immunoconjugates for targeted radioisotope therapy
WO2024044552A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Abdera Therapeutics Inc. Vhh antibody dota conjugates
WO2024044547A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Abdera Therapeutics Inc. Kidney targeting antibodies
WO2024044549A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Abdera Therapeutics Inc. Vhh antibody conjugates

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3325020B1 (en) * 2015-07-17 2022-01-12 Vrije Universiteit Brussel Radiolabelled antibody fragments for use in treating cancer
CA3115089A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020186328A1 (en) * 2019-03-20 2020-09-24 The University Of British Columbia Chelators and methods of making and using same

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024507554A (ja) 2024-02-20
WO2022175750A1 (en) 2022-08-25
AU2022222471A1 (en) 2023-09-28
CN117321081A (zh) 2023-12-29
EP4294845A1 (en) 2023-12-27
AU2022222471A9 (en) 2024-01-25
KR20230159831A (ko) 2023-11-22
MX2023009761A (es) 2023-11-14
BR112023016779A2 (pt) 2023-10-31
IL305334A (en) 2023-10-01
CA3208798A1 (en) 2022-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6872069B2 (ja) ＦｃＲＨ５に対するヒト化親和性成熟抗体及び使用方法
TW202245847A (zh) 用於標靶放射性同位素治療之免疫結合物
EP3089996B1 (en) Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
EP3089758B1 (en) Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
EP3262075B1 (en) Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same
KR20150030784A (ko) 공유 결합된 항원-항체 접합체
JP2021184714A (ja) 多重特異性抗体のスクリーニング方法
WO2020153467A1 (ja) 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体
JP2022516503A (ja) 活性化可能なマスクされた抗ｃｔｌａ４結合タンパク質
KR20240049342A (ko) 항-psma 항체 및 이의 용도
JP2021512613A (ja) 二重特異性抗原結合分子及びその使用方法
CN114641501A (zh) 抗vsig4抗体或抗原结合片段及其用途
US20240207462A1 (en) Immunoconjugates for targeted radioisotope therapy
KR20230037578A (ko) 암 세포에 결합하고 방사성 핵종을 상기 세포로 표적화하는 항체
CN116406377A (zh) 抗notch2抗体及其使用方法
WO2024044554A1 (en) Vhh antibody conjugates with heteroaryl chelators
WO2024044551A1 (en) Multivalent immunoconjugates for targeted radioisotope therapy
WO2024044552A1 (en) Vhh antibody dota conjugates
WO2024044549A1 (en) Vhh antibody conjugates
WO2024044550A1 (en) Dll3 binding molecules and uses thereof
JP2019518012A (ja) 修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法
WO2023012147A1 (en) Bispecific antibodies and methods of use
TW202241962A (zh) 分裂抗體及使用方法
TW202327660A (zh) 抗ｐｓｍａ放射接合物及其用途
TW202340251A (zh) 抗ｎｏｔｃｈ２抗體及結合物及其使用方法