TW202244274A - 人蔘土芽孢桿菌菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及新型人蔘土芽孢桿菌菌株及其用途，具體涉及人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株；包含上述菌株或其發酵物的化妝料組合物及其製備方法；包含上述菌株或其發酵物的醫藥外品組合物及其製備方法；包含上述菌株或其發酵物的藥學組合物及其製備方法；以及包含上述菌株或其發酵物的食品組合物及其製備方法。

Description

人蔘土芽孢桿菌菌株及其用途
本發明涉及人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株；包含上述菌株或其發酵物的化妝料組合物及其製備方法；包含上述菌株或其發酵物的醫藥外品組合物及其製備方法；包含上述菌株或其發酵物的藥學組合物及其製備方法；以及包含上述菌株或其發酵物的食品組合物及其製備方法。
最近備受矚目的微生物組(microbiome)是指特定環境中存在的微生物的集體基因組(collective genomes)或同一環境小生境(environmental niche)中發現的微生物本身，隨著新一代序列分析(Next Generation Sequencing; NGS)技術的出現，正得到積極研究。
微生物組研究主要由源於人體的菌或乳酸菌等組成，但最近作為很多功效物質和藥劑的基礎的植物的微生物組研究正在緩慢進行。
其中，山蔘是稀缺性高且功效也優異的代表性的藥用植物，隨著生長周期長、個體數量减少，正在考慮山蔘的可持續性和多種使用方向性。特別是，對源於山蔘的微生物組在山蔘內部中起何種作用的研究不完善，因此實情是需要對此進行研究。
另一方面，山蔘包含含有主要生理活性成分的皂苷成分，但其化學結構與其他植物中發現的皂苷不同，因此被特別命名為人蔘皂苷(ginsenoside)。
人蔘皂苷根據苷元(aglycone)結構而分為三種：原人蔘二醇類(Protopanaxadioltype)、原人蔘三醇類(Protopanaxatriol-type)和齊墩果酸類(Oleanolic acid-type)人蔘皂苷，這三組再次根據化合物結構中環的C-3、C-6和C-20位置的通過糖苷鍵(glycoside bond)附著的糖部位(sugar moieties, aglycones)的位置和數量而分為主要人蔘皂苷和稀有人蔘皂苷。
其中，主要人蔘皂苷占總皂苷的90%以上，由Rg1、Re、Rb1、Rc和Rb2等構成，但其尺寸較大，因此在生物體內的吸收率非常低。因此，這種主要人蔘皂苷為了在生物體試驗(in vivo test)中有效地表現出生理活性，需要進行去除糖(deglycosylated)的轉化過程。
另一方面，稀有人蔘皂苷由Rg2、Rg3、Rh1、Rh2和化合物K(compound K, C-K)、Gyp17、Rg3、C-Mc1、C-Mx1、F2等構成，並且隨著最近發表稀有人蔘皂苷的優異藥理功效相關的研究結果，實情是需要一種能够增加稀有人蔘皂苷的含量比例的方法。
作為用於生産微量的皂苷的稀有人蔘皂苷的方法，已經提出了化學分解方法(De Mayo等，canad. J. Chem., 43, 2033, 1965)、酶方法(Kitagawa等，Terahedron Letters, 30, 2283, 1974)等。與此相關，用能够進行生物轉化的具有特定氨基酸序列的人蔘皂苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)對人蔘中包含的主要人蔘皂苷進行酶處理的人蔘提取物被開發為炎症性疾病的治療用組合物，並且已知上述人蔘皂苷糖苷酶通過增加組合物的總人蔘皂苷中的次要皂苷含量來提高生理活性，從而可以提高抗氧化、抗炎症、抗老化功能性(韓國註冊專利10-2092839號)。
但是，如上所述的方法存在以下問題而在大量生産中仍然存在局限性：1)在製備工序上需經過多個步驟、2)在製備過程中目標成分消失、3)使用不適於食用的催化劑、4)表現出低産率，並且存在以下缺點：産品生産工序變得複雜，且效率性和經濟性不足。
在這些背景下，本發明人進行了源於山蔘的微生物組研究，發掘了山蔘內部的共生微生物中的改善皮膚狀態的效果優異且包含在山蔘中的源於山蔘的新型人蔘土芽孢桿菌菌株，從而完成了本發明。
要解决的課題
本發明的一個目的是提供一種人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株。
本發明的另一目的是提供一種包含上述菌株或其發酵物的化妝料組合物及其製備方法。
本發明的又一目的是提供一種包含上述菌株或其發酵物的醫藥外品組合物及其製備方法。
本發明的又一目的是提供一種包含上述菌株或其發酵物的藥學組合物及其製備方法。
本發明的又一目的是提供一種包含上述菌株或其發酵物的食品組合物及其製備方法。
課題的解决手段
如下對其進行具體描述。另一方面，本發明中公開的每個描述和實施方式還可以適用於每個不同的描述和實施方式。即，本發明中公開的多種要素的所有組合均屬本發明的範疇。另外，不能認為本發明的範疇由下面說明的具體敘述限制。
本發明起因於新證明了作為源於山蔘的微生物組的人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株具有優異的皮膚改善能力和人蔘皂苷生物轉化能力。
本發明的一個方面提供了一種以寄存編號KCTC 14462BP保藏的人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株。
在本發明中，術語“人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)”是革蘭氏陽性菌，被分類為形成內生孢子的細菌菌株，並且已知從韓國抱川市的人蔘田的土壤中分離出來(TEN等，J. Microbiol. Biotechnol., vol.16, no.10, pp. 1554-1560, 2006)。
在本發明中，術語“植物微生物組”是指與植物一起生活的微生物和基因組全部。已知上述植物微生物組在與植物緊密相互作用的同時促進生長，並培養病原菌、乾旱、低溫、高溫等外部應激抵抗性。最近，為了探索新的藥理活性物質，與植物的共生微生物相關的植物微生物組研究備受矚目。
本發明人利用上述植物微生物組研究開發出了屬於人蔘土芽孢桿菌的新型菌株，將其命名為人蔘土芽孢桿菌LGHNH，並將其以寄存編號KCTC 14462BP保藏。上述菌株是共生微生物，可以從山蔘中分離而獲得，但只要具有與保藏菌株人蔘土芽孢桿菌LGHNH相同的特性，則不限於此。
在本發明中，術語“山蔘”是植物分類學上屬於傘形目五加科的陰地性多年生草本植物，是包括人蔘、水蔘、白蔘、紅蔘、紅尾蔘、尾蔘、山養蔘、長腦蔘、尾蔘、原蔘和太極蔘等全部的最廣泛的概念。
具體地，“山蔘”、“人蔘”和“水蔘”是分類學上相同的物種，根據自然栽培或人工栽培而命名，並且在本發明中，作為相同的含義，可以不受限制地混合使用。在本發明中，上述人蔘可以不受限制地使用，只要其包含上述微生物即可，具體地，可以使用高麗蔘，但不特別限於此。另外，即使經過部分加工處理，如果包含本發明的微生物，則也不受限制地包含在上述人蔘中。
在本發明中，從山蔘中分離上述菌株的方法沒有特別限制，可以根據本技術領域或類似領域常用的方法分離具有與上述保藏菌株相同特性的菌株。
在一個具體例中，上述菌株可以具有人蔘皂苷生物轉化能力。
在本發明中，術語“人蔘皂苷(ginsenoside)”是指包含山蔘的主要生理活性成分的皂苷成分。在上述人蔘皂苷中，Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rf和Rd是占全部皂苷的90%以上的主要人蔘皂苷(major ginsenoside)，它們因大尺寸而在生物體內的吸收率非常低。
另一方面，稀有人蔘皂苷由Rg2、Rh1、Rg6、F2、Rk3、Rh4和Rg3等構成，最近發表有稀有人蔘皂苷的優異藥理功效相關的研究結果。因此，對將主要人蔘皂苷生物轉化為生理活性優異的稀有人蔘皂苷的方法的研究備受矚目。
在本說明書中，術語“生物轉化(bioconversion)”是指利用微生物所具有的酶功能從前體製備出所需産物的方法。上述生物轉化通過微生物發酵或酶處理等的生物學方法誘導物質的結構變化。由於上述變化，有效成分的含量增加或吸收率得到改善，並且生成新的功能成分。這種生物轉化技術不僅用於包括抗生素、類固醇的醫藥品和醫藥品原料物質的生産，而且廣泛用於氨基酸、維生素等的有用物質的生産。
在本發明的一個實施例中，確認了上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有將主要人蔘皂苷生物轉化為稀有人蔘皂苷的效果，確認了上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物通過將主要人蔘皂苷生物轉化來增加總人蔘皂苷中的稀有人蔘皂苷含量，從而可以提高生理活性(實施例3)。
在另一個具體例中，上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株可以具有選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的合組中的一種以上的特徵，但不限於此。
具體地，本發明人確認了源於山蔘的人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株或其發酵物具有優異的皮膚改善效果。
在本發明中，“改善”是指至少减少與狀態的緩解或治療相關的蔘數、例如症狀的程度的所有行為，並且可以包括選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的合組中的一種以上。
更具體地，確認了源於山蔘的人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株或其發酵物具有優異的保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障等的皮膚改善效果。
在本發明中，術語“保濕皮膚”是指通過向皮膚供給水分或阻斷水分的蒸發來保持皮膚的柔軟性並通過誘導均勻的角質脫落來保持光滑表面的所有作用，“乾燥”是指這種皮膚保濕不充分的狀態。具體地，皮膚保濕可能是由於玻尿酸生成的促進，但不限於此。
在本發明中，術語“玻尿酸”是一種糖胺聚糖(glycosaminoglycans)，是指葡萄糖醛酸和N-乙醯氨基葡萄糖殘基重複連接的鏈狀高分子多糖類物質。
在本發明的一個實施例中，確認了上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有優異的玻尿酸生成效果，確認了上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有優異的皮膚保濕效果(實施例4)。
在本發明中，術語“抗氧化”是指抑制或緩解皮膚的氧化。與此相反，“氧化(oxidation)”是指分子、原子或離子獲得氧或“失去”氫或電子。具體地，人體實現氧化促進物質(prooxidant)和氧化抑制物質(antioxidant)之間的平衡，但如果由於各種因素，這種平衡狀態失衡並且傾向於氧化促進側，則會誘發氧化應激(oxidative stress)，從而引起潜在的細胞損傷和病理性疾病。成為這種氧化應激的直接原因的活性氧物種(reactive oxygen species, ROS)是源於氧的自由基(free radicals)，不穩定且反應性高，因此容易與多種生物體物質發生反應並攻擊體內高分子，從而對細胞和組織造成不可逆的損傷，或者導致突變、細胞毒性和致癌等。另外，活性氮物種(reactive nitrogen species, RNS)在炎症反應時因巨噬細胞嗜中性粒細胞和其他免疫細胞的免疫反應而大量生成，此時ROS也一同生成。
在本發明的一個實施例中，基於上述抗氧化和自由基的關係，確認了本發明的新型人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有優異的自由基消除效果，從而確認了人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有抗氧化效果(實施例5)。
在本發明中，術語“抗老化”是指抑制或緩解皮膚的老化，並且如果老化得到改善(例如，預防、抑制、延遲老化等)，則不限於其程度等。具體地，抗老化可能是由於膠原蛋白合成的促進，但不限於此。術語“抗老化效果”可以是指皮膚皺紋改善效果、皮膚彈性改善效果；或皮膚皺紋改善或皮膚彈性改善引起的老化抑制或緩解效果，但不限於此。
在本發明中，術語“膠原蛋白(collagen)”是動物中發現的天然蛋白質(naturally occurring proteins)群，特別是存在於脊椎動物的皮膚和結締組織中。是結締組織的主要構成成分，是哺乳動物中最豐富的蛋白質，占全部生物體蛋白質的25%至35%。上述膠原蛋白以延長的纖維形式主要在肌腱(tendon)、韌帶(ligament)和皮膚等纖維組織中觀察到，並且在角膜(cornea)、軟骨、骨、血管、內臟(gut)和椎間盤(intervertebral disk)中也豐富。衆所周知，成纖維細胞(fibroblast)是生成膠原蛋白的細胞。如果皮膚老化或暴露於紫外線、熱等，則膠原蛋白合成能力降低並且膠原蛋白量迅速减少。如果膠原蛋白量减少，則無法保持肌肉的形態並且皮膚老化、皮膚彈性减弱以及産生皺紋。即，如果促進皮膚成纖維細胞的膠原蛋白的合成，則可以獲得預防或改善皮膚皺紋、改善皮膚彈性、再生皮膚、治癒傷口、修復和再生受損的皮膚組織；以及防止皮膚老化等的效果，但不限於此。
在本發明的一個實施例中，確認了本發明的新型人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有優異的膠原蛋白合成促進效果，從而確認了人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有抗老化效果(實施例6)。
在本發明中，術語“鎮靜皮膚”是指緩解並穩定紅斑或受刺激的皮膚部位等。例如，上述鎮靜皮膚可以减少經皮水分損失或緩解皮膚紅血絲，但不限於此。
在本發明中，術語“改善皮膚炎症”是指抑制或緩解從皮膚發病的炎症。具體地，“皮膚炎症”是在因物理刺激或化學物質、細菌等誘發皮膚損傷時作為用於防禦其的作用而開始的，並且涉及多種免疫細胞和炎症誘導細胞因子。另外，激活的巨噬細胞(macrophage)不僅産生炎症誘導細胞因子，而且過度産生一氧化氮(nitric oxide, NO)或前列腺素(prostagladin E2, PGE2)，從而進一步激活炎症過程。
在本發明的一個實施例中，確認了本發明的新型人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有抑制代表性的紅血絲誘發物質、作為炎症物質誘導皮膚刺激的一氧化氮(Nitric oxide; NO)生成的效果，從而確認了人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有皮膚鎮靜和炎症改善效果(實施例7)。
在本發明中，術語“皮膚有益菌”是指皮膚的常居菌中有助於皮膚(例如，緩解炎症、抑制有害菌生長等)的菌株。例如，上述有益菌可以是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、輕型鏈球菌(Streptococcus mitis)、滕黃微球菌(Micrococcus luteus)、約氏不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)等，具體地，可以是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，但不限於此。更具體地，上述有益菌可以是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，但不限於此。上述表皮葡萄球菌通過誘導從皮膚表皮細胞表達抗菌肽(Antimicrobial peptide, AMP)並增强皮膚再生效果來增强皮膚防禦能力；當處理表皮葡萄球菌分泌的成分PSM(Phenol soluble modulin)時，通過有害菌的細胞膜破壞(死滅)以及抑制生長來增强皮膚再生；表皮葡萄球菌分泌的成分丁酸抑制因紫外線誘導的炎症因子的表達，從而表現出皮膚鎮靜效果；當將活細菌塗佈於皮膚時，表現出增强皮膚水分量和抑制水分損失的效果；當將活細菌塗佈於皮膚時，可以使皮膚pH弱酸化，從而改善pH環境，並且具有上述有益菌表皮葡萄球菌的增强效果的物質對皮膚具有有益效果。
在本發明中，術語“增强皮膚有益菌”是指促進或改善前述的有益菌的生長。出於本發明的目的，上述有益菌的增强可以是表皮葡萄球菌的增强，但不限於此。在本發明的一個實施例中，確認了上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物增强表皮葡萄球菌，確認了上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有皮膚有益菌增强效果(實施例8)。
術語“改善皮膚膚色”是指改善皮膚暗沉的膚色。具體地，改善皮膚膚色可能是由於抗糖化，但不限於此。
在本發明中，術語“抗糖化”是指抑制隨著皮膚老化而累積在真皮層上部的糖化終産物的生成。與此相反，“糖化(glycation)”是指糖與血液一起沿著血管流動並與蛋白質結合生成AGEs(糖化終産物)而變性的現象。與糖結合而變性的細胞會失去彈性，從而導致皮膚彈性下降，並且糖化引起的AGEs的生成和積累引起蛋白質的褐變，從而可能出現皮膚膚色暗沉的現象。糖化通常是指在沒有酶蔘與的情况下發生的單糖(例如葡萄糖或果糖等)在蛋白質或脂肪上形成共價鍵的反應。糖化經過一系列的已知為阿馬道裏重排(Amadori rearrangement)、美拉德反應(Maillard Reaction)的複雜化學反應發生，其結果會生成糖化終産物(AGEs:Advanced glycation endproducts)。
在本發明的一個實施例中，利用具有相同糖化蛋白質的α-二酮的結構的1-苯基-1,2-丙二酮(PPD)確認了本發明的新型人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物的二羰基鍵分解效果，確認了具有優異的抗糖化效果，從而確認了人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有皮膚膚色改善效果(實施例9)。
在本發明中，術語“美白皮膚”是指通過抑制黑色素色素的合成，從而不僅使膚色提亮，而且改善由紫外線、激素或遺傳引起的黑斑或雀斑等的皮膚過色素沉著。
具體地，黑色素色素通過酪氨酸酶(Tyrosinase)從酪氨酸(Tyrosine)中生物合成。因此，當抑制酪氨酸酶活性時，可以抑制黑色素色素的生物合成。
在本發明的一個實施例中，確認了本發明的人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物抑制黑色素合成，從而確認了人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有皮膚美白效果(實施例10)。
在本發明中，術語“再生皮膚”是指皮膚組織對皮膚外部和內部原因引起的損傷的恢復過程。上述外部原因引起的損傷可以列舉紫外線、外部污染物質、創傷、外傷等，上述內部原因引起的損傷可以列舉應激等。
在本發明中，術語“傷口”是指涵蓋生物體受到的所有損傷，是指生物體受到損傷的狀態。
上述“治癒傷口”是指生物體的損傷得到恢復，並且治癒傷口的過程可以分為急性期、修復期和結疤狀態。急性期也稱為滲出期，是在組織破壞或異物混合的損傷部位為了去除它們而發生一系列反應的步驟，此時可能伴隨炎症反應和血液凝固反應。修復期也稱為增殖期，是血管新生、損傷的部位得到恢復的步驟，在此期間進行活躍的細胞增殖或作為一種結締組織的肉芽組織內的作為細胞間質的膠原蛋白或蛋白聚糖的活躍合成，從而使表皮細胞獲得操作性，並且進行分裂增殖，從而可以再生表皮組織。結疤步驟是細胞的增殖速度降低、膠原蛋白纖維交聯並且損傷部位的物理强度增大的步驟，最終，可以血管系統也萎縮，與周圍正常組織不同的組織位於損傷部位的方式進行。通過重複上述步驟，傷口可以得到治癒，但上述傷口治癒不限於恢復生物體的損傷的過程。
在本發明的一個實施例中，確認了本發明的新型人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物激活皮膚細胞，從而確認了上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有皮膚再生或傷口治癒效果(實施例11)。
在本發明中，術語“免疫活性”是指激活蔘與先天免疫的細胞。
在本發明中，術語“免疫”可以是指先天免疫，但不限於此。上述先天免疫是以非特異性方法防禦使得宿主免受感染的細胞或機制，是指立即作出反應而無需記憶特定的病原體的免疫系統。巨噬細胞和嗜中性粒細胞等吞噬細胞(phagocytes)、肥大細胞(mast cells)、嗜鹼性粒細胞(basophil)、嗜酸性粒細胞(eosinophil)、抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells, APCs)和自然殺傷細胞(natural killer cells, NK cells)、皮膚等屏障以及體內的抗生物質等在先天免疫中起著重要的作用。
上述先天免疫包括外部防禦。上述外部防禦是在病原體進入體內之前進行的防禦，外部防禦的代表性示例包括作為區分人體的內外的邊界的皮膚。皮膚其本身不僅是物理的防禦線，而且由於皮脂腺(sabaceous gland)等中分泌的油層還起到化學的防禦線的作用。除此之外，還包括不覆蓋皮膚的眼、鼻、嘴等的黏膜部位處包含溶菌酶(lysozyme)等的分泌物、用於防禦由食物進入的病原菌的强酸性的胃酸等。
另外，上述先天免疫包括內部防禦。上述內部防禦是在生物體內進行的防禦，作為代表性實例包括吞噬細胞。所有脊椎和無脊椎動物的吞噬細胞都具有稱為Toll樣受體(Toll-like receptor)的受體，因此可以識別抗原，如果抗原被識別，則會誘導歸結為TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12、IFN-β和多重IFN-α等的炎症細胞因子的誘導的細胞內信號傳遞路徑(intracellular signalling pathways)。
上述TNFα(Tumor necrosis factor-α, TNF- α)是參與免疫的代表性細胞因子之一，在免疫細胞調節中起著重要的作用。TNFα是體內致熱原，具有以下能力：誘導發熱、誘導細胞凋亡、通過白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)的生産誘發敗血症、誘導惡液質、誘發感染且抑制腫瘤生成和病毒複製。脂多糖類(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性細菌外膜的主要構成要素，是對哺乳類的免疫系統有重大影響的物質，還用作確認巨噬細胞的介導炎症反應的用途。通過脂多糖類引起的刺激，可以確認諸如巨噬細胞等免疫細胞的免疫反應，並且可以用作發掘即使在低刺激下也促進免疫反應的材料或在高刺激下抑制過度免疫反應的材料的手段。
在本發明的一個實施例中，確認了本發明的新型人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物增加TNF-α濃度，從而確認了上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有免疫活性效果(實施例12)。
在本發明中，術語“强化皮膚屏障”是指强化或改善皮膚屏障。
在本發明中，術語“皮膚屏障”可以是指角質形成細胞在角化過程中形成的屏障，但不限於此。上述皮膚屏障是在表皮細胞的保護作用中最核心的要素。表皮細胞(Epithemal cell)起到保護體內免受外界環境的多種刺激的屏障作用，同時防止皮膚出現過量的水分流失和乾燥。表皮細胞中存在於最外側的角質層(Stratum cormeum)由角質形成細胞分化而形成，並且由分化完成的角質細胞和圍繞其的脂質層構成。角質層是皮膚最外層組織和屏障，保護皮膚免受外部有害物質的侵害並防止水分的流出。角質層由進行角質化的角化細胞和填充其間的脂質組成，當受損時，會發生水分流失，並且有害物質容易滲透。角質細胞脂質膜受損的角質使由蛋白質組成的角質細胞膜暴露，因此能够進行蛋白質染色。
在本發明的一個實施例中，確認了本發明的新型人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物强化角質層，從而確認了上述人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株或其發酵物具有皮膚屏障强化效果(實施例13)。
本發明的另一方面提供了一種包含上述人蔘土芽孢桿菌(Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株或其發酵物的化妝料組合物。
上述LGHNH菌株如上所述。
在本發明中，術語“發酵物”是指發酵微生物的那些，發酵是指利用微生物本身所具有的酶來分解有機物的過程中不是腐爛反應的那些。發酵反應和腐爛反應根據相似的過程進行，但作為分解結果，如果産生有用物質，則稱為發酵，而産生臭味或有害物質，則稱為腐爛。
在本發明中，從上述菌株獲得發酵物的方法沒有特別限制，並且可以根據本技術領域或類似領域中常用的方法獲得。
在本發明中，獲得上述發酵物的方法可以通過在菌株的能量源的糖上處理上述分離的菌株並使其發酵來獲得，但上述發酵過程的溫度、發酵時間等沒有特別限制，並且可以根據發酵前體物質、發酵條件、要從發酵物獲得的物質的種類等進行多種選擇。
在本發明中，上述發酵過程具體地可以在20℃至45℃、更具體25℃至35℃、進一步具體27℃至33℃的溫度下進行，對於期間，可以具體地發酵1至14天、更具體1至3天、進一步具體1至2天的期間。
在本發明中，從上述菌株獲得的發酵物不僅可以包括發酵的物質本身，而且可以不受限制地包括包含由上述菌株産生的發酵物在內的所有種類的物質，例如，菌株和培養物共存的菌株的培養基、從上述培養基過濾菌株的發酵物、從上述培養基對菌株進行滅菌處理並將其過濾的發酵物、提取上述發酵物或包含其的培養基的提取物、稀釋上述發酵物或其提取物的稀釋液、乾燥上述發酵物或其提取物的乾燥物、收集並破碎上述菌株的菌體的溶解物等。
在一個具體例中，上述化妝料組合物可以是用於改善皮膚狀態，並且上述改善皮膚狀態為選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組中的一種以上的化妝料組合物，但不限於此。確認了包含上述菌株或其發酵物的組合物具有保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障，因此可以用作用於保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障的組合物(實施例4至13)。
術語，“改善皮膚狀態”、”保濕皮膚”、“抗氧化”、“抗老化”、“鎮靜皮膚”、“改善皮膚炎症”、“增强皮膚有益菌”、“改善皮膚膚色”、“美白皮膚”、“再生皮膚”、“治癒傷口”、“免疫活性”和“强化皮膚屏障”如上所述。
在本發明的化妝料組合物中，基於上述化妝料組合物的總重量，上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株或其發酵物的含量可以為0.001至90%，具體為0.01至30%，更具體為0.05至10%，進一步具體為0.05至0.15%，但不限於此。
本發明的上述化妝料組合物可以是選自由溶液、外用軟膏、霜、泡沫、營養化妝水、柔膚水、香水、面膜、柔軟水、乳液、妝前底乳、精華、皂、液體清潔料、入浴劑、防曬霜、防曬油、懸浮液、乳濁液、膏、凝膠、露、粉、皂、含有表面活性劑的清洗劑、油、粉末粉底、乳濁液粉底、蠟粉底、貼劑和噴霧組成的組中的劑型，但不限於此。
本發明的上述化妝料組合物可以進一步包含一種以上的一般皮膚化妝料中配入的化妝品學上可接受的載體，作為常規成分，可以適當地配入例如油分、水、表面活性劑、保濕劑、低級醇、增稠劑、螯合劑、色素、防腐劑、香料等，但不限於此。
本發明的化妝料組合物中包含的化妝品學上可接受的載體根據上述化妝料組合物的劑型而多種多樣。
當本發明的化妝料劑型為軟膏、膏、霜或凝膠時，作為載體成分，可以利用動物油、植物油、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍膠(tragacanth)、纖維素衍生物、聚乙二醇、矽酮、膨潤土、二氧化矽、滑石、氧化鋅等，但不限於此。這些可以單獨使用或兩種以上混合而使用。
當本發明的劑型為溶液或乳濁液時，作為載體成分，可以利用溶劑、溶解劑或乳濁劑等，例如可以利用水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油等，特別是可以利用棉籽油、花生油、玉米籽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脫水山梨醇的脂肪酸酯，但不限於此。這些可以單獨使用或兩種以上使用。
當本發明的劑型為懸浮液時，作為載體成分，可以利用諸如水、乙醇或丙二醇等液體稀釋劑、諸如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脫水山梨醇酯等懸浮劑、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂或黃蓍膠等，但不限於此。這些可以單獨使用或兩種以上混合而使用。
當本發明的劑型為皂時，作為載體成分，可以利用脂肪酸的鹼金屬鹽、脂肪酸半酯鹽、脂肪酸蛋白水解物、羥乙基磺酸鹽、羊毛脂衍生物、脂肪醇、植物油、甘油、糖等，但不限於此。這些可以單獨使用或兩種以上混合而使用。
當本發明的劑型為粉或噴霧時，作為載體成分，可以利用乳糖、滑石、二氧化矽、氫氧化鋁、矽酸鈣、聚醯胺粉或其混合物，特別是，當為噴霧時，可以附加地包含推進劑，例如氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚。
另一方面，本發明中記載的所有成分優選地可以在不超過化妝品安全標準等相關規定以及台灣化妝品安全規範中規定的最大使用值的範圍內包含在本發明的組合物中。
本發明的又一方面提供了一種包含上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株或其發酵物的醫藥外品組合物。
具體地，上述醫藥外品組合物可以是用於改善皮膚狀態，並且上述改善皮膚狀態為選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組中的一種以上的醫藥外品組合物，但不限於此。
上述“菌株”、“其發酵物”、”保濕皮膚”、“抗氧化”、“抗老化”、“鎮靜皮膚”、“改善皮膚炎症”、“增强皮膚有益菌”、“改善皮膚膚色”、“美白皮膚”、“再生皮膚”、“治癒傷口”、“免疫活性”和“强化皮膚屏障”如上所述。
在本發明中，術語“醫藥外品”可以選自由沐浴露、消毒清潔劑、清潔劑、厨房用清潔劑、清掃用清潔劑、牙膏、漱口劑、濕紙巾、洗劑、皂、洗手液、頭髮清潔劑、頭髮柔軟劑、加濕器填充劑、面膜、軟膏劑和過濾器填充劑組成的組，但不限於此。
本發明的醫藥外品組合物除了上述成分之外還可以根據需要進一步包含藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。上述藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑沒有限制，只要其不損害本發明的效果即可，例如可以包括填充劑、增量劑、黏合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、甜味劑、芳香劑、保存劑等。
本發明的藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的代表性實例可以列舉乳糖、葡萄糖(dextrose)、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、澱粉、明膠、甘油、阿拉伯膠、藻酸鹽、磷酸鈣、碳酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油、丙二醇、聚乙二醇、植物油、可注射的酯、維特普索(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐溫61、可可脂、肉實樹(Laurinum)等。
當將本發明的菌株或其發酵物用作醫藥外品時，可以進一步含有一種以上的表現出相同或相似功能的有效成分。例如，可以包含已知的保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障成分。如果包含附加的改善皺紋、美白皮膚、改善皮膚問題、保濕皮膚成分，則本發明的組合物的改善皺紋、美白皮膚、改善皮膚問題、保濕皮膚效果可以得到進一步提高。當添加上述成分時，可以考慮複合使用導致的皮膚安全性、劑型化的容易性、有效成分的穩定性。
本發明的醫藥外品組合物可以進一步包含選自由作為本領域已知的防止皮膚老化成分的視黃酸、TGF、源於動物胎盤的蛋白質、樺木酸(betulinic acid)和小球藻(chlorella)提取物；作為本領域已知的抗炎症成分的非甾體類的氟芬那酸、布洛芬、苄達明、吲哚美辛、潑尼松龍、地塞米松、尿囊素、甘菊藍(chamomile)、氫化可的松；以及它們的衍生物和各種植物提取物組成的組中的一種或兩種以上的成分。基於全部組合物的重量，附加成分的含量可以為0.0001重量%至10重量%，並且上述含量範圍可以根據皮膚安全性、本發明的菌株或發酵物的劑型化時的容易性等的條件來進行調節。
醫藥外品的製劑化方法、用量、利用方法、構成成分等可以從技術領域已知的常規技術進行適當選擇。
本發明的又一方面提供了一種包含上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株或其發酵物的藥學組合物。
具體地，上述藥學組合物可以是用於改善皮膚狀態的醫藥外品組合物，並且上述改善皮膚狀態為選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組中的一種以上，但不限於此。
上述“菌株”、“其發酵物”、”保濕皮膚”、“抗氧化”、“抗老化”、“鎮靜皮膚”、“改善皮膚炎症”、“增强皮膚有益菌”、“改善皮膚膚色”、“美白皮膚”、“再生皮膚”、“治癒傷口”、“免疫活性”和“强化皮膚屏障”如上所述。
本發明的藥學組合物可以進一步包含通常用於製備藥學組合物的藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，並且上述載體可以包括非天然性載體(non-naturally occuring carrier)。作為上述載體、賦形劑和稀釋劑，可以列舉乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。
另外，上述藥學組合物可以根據各自常規的方法劑型化為以下形式而使用：片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、懸浮劑、內容液劑、乳劑、糖漿劑、無菌水溶液、非水性溶劑、懸浮劑、乳劑、凍幹製劑、經皮吸收劑、凝膠劑、露劑、軟膏劑、霜劑、貼附劑、巴布劑、膏劑、噴霧、皮膚乳化液、皮膚懸浮液、經皮傳遞性貼劑、含有藥物的綳帶或栓劑。
具體地，在劑型化時，可以使用常用的填充劑、增重劑、黏合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑等的稀釋劑或賦形劑來製備。用於口服的固體製劑包括片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等，但不限於此。這些固體製劑可以通過混合至少一種以上的賦形劑(例如澱粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等)來製備。另外，除了簡單的賦形劑之外，還可以使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石。除了用於口服的液狀物、液體石蠟之外，還可以通過添加各種賦形劑(例如潤濕劑、甜味劑、芳香劑、保存劑等)來製備。用於非口服的製劑包括無菌水溶液、非水性溶劑、懸浮劑、乳劑、凍幹製劑和栓劑。作為非水性溶劑和懸浮劑，可以使用丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油等植物油、諸如油酸乙酯等可注射的酯等。作為栓劑的基劑，可以使用維特普索、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、肉實樹(Laurinum)、甘油明膠等。
在本發明的藥學組合物中，基於上述藥學組合物的總重量，上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株或其發酵物的含量可以為0.001至90%，具體為0.01至30%，更具體為0.05至10%，進一步具體為0.05至0.15%，但不限於此。
本發明的藥學組合物可以以藥學上有效的量投予。上述術語“藥學上有效的量”是指以可適用於醫學治療的合理的受益/風險比例治療疾病的充足的量，有效用量水平可以由個體種類和嚴重程度、年齡、性別、藥物的活性、對藥物的敏感度、投予時間、投予途徑和排出比例、治療期間、包含同時使用的藥物的要素和其他醫學領域衆所周知的要素來確定。例如，上述藥學組合物可以以每日0.01至500 mg/kg、具體10至100 mg/kg的用量投予，上述投予，每日可以投予一次或分多次來投予。
上述藥學組合物可以作為單獨的治療劑投予或與其他治療劑並用而投予，並且可以與常規治療劑依次或同時投予。而且可以單一或多重投予。考慮到全部上述要素，重要的是投予能够以最少的量獲得最大效果的量而沒有副作用，並且可以容易地由本領域技術人員確定。
另外，上述藥學組合物可以根據目標方法口服或非口服(例如，適用於靜脈內、皮下、腹腔內或局部)，投予量根據患者的狀態和體重、疾病的程度、藥物形式、投予路徑和時間而不同，但可以由本領域技術人員適當地選擇。
本發明的又一方面提供了一種包含上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株或其發酵物的食品組合物。
具體地，上述食品組合物可以是用於改善皮膚狀態，並且上述改善皮膚狀態為選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組中的一種以上的醫藥外品組合物，但不限於此。
上述“菌株”、“其發酵物”、”保濕皮膚”、“抗氧化”、“抗老化”、“鎮靜皮膚”、“改善皮膚炎症”、“增强皮膚有益菌”、“改善皮膚膚色”、“美白皮膚”、“再生皮膚”、“治癒傷口”、“免疫活性”和“强化皮膚屏障”如上所述。
本發明的術語“食品”有肉類、香腸、麵包、巧克力、糖果類、小吃類、餅乾類、披薩、方便面、其他面類、口香糖類、包含冰淇淋類的乳製品、各種湯、飲料、茶、口服液、酒精飲料、維生素複合物、健康功能食品和健康食品等，並且包括全部通常意義上的食品。
上述健康功能(性)食品(functional food)是與特定保健用食品(food for special health use, FoSHU)相同的術語，是指加工成使得供給營養之外而且有效地表現出生物體調節功能的醫學、醫療效果高的的食品。在此“功能(性)”是指對人體的結構和功能調節營養素或者對生理學作用等保健用途獲得有用的效果。本發明的食品可以通過本領域常用的方法製備，在上述製備時，可以通過添加本領域通常添加的原料和成分來製備。另外，上述食品的劑型只要被認為是食品的劑型就可以不受限制地製備。本發明的食品用組合物可以以多種形式的劑型製備，並且與一般藥品不同，以食品為原料，因而具有沒有因長期服用藥品而可能産生的副作用等的優點，具有優異的可携帶性使得本發明的食品可以作為用於增强免疫增强效果的輔助劑來攝入。
上述健康食品(health food)是指與一般食品相比具有積極的保持或增强健康的效果的食品，健康輔助食品(health supplement food)是指健康輔助目的的食品。根據情况，健康功能食品、健康食品、健康輔助食品的術語混用。
具體地，上述健康功能食品是將上述人蔘土芽孢桿菌(Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株或其發酵物添加到飲料、茶類、香辛料、口香糖、餅乾類等的食品材料中或者製備成膠囊化、粉末化、懸浮液等的食品，並且是指在攝取它們時會帶來健康上特定的效果，但與一般藥品不同，以食品為原料，因而具有沒有因長期服用藥品而可能産生的副作用的優點。
本發明的食品組合物可以日常攝取，因此可以期待高的免疫增强效果，因此非常有用。
上述組合物可以進一步包含生理學上可接受的載體，並且載體的種類沒有特別限制，並且可以使用本技術領域中常用的任何載體。
另外，上述組合物可以包含通常用於食品組合物中而可提高氣味、味道、視覺等的附加成分。例如，可以包含維生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、烟酸(niacin)、生物素(biotin)、葉酸(folate)、泛酸(panthotenic acid)等。另外，可以包含鋅(Zn)、鐵(Fe)、鈣(Ca)、鉻(Cr)、鎂(Mg)、錳(Mn)、銅(Cu)、鉻(Cr)等的礦物質。另外，可以包含賴氨酸、色氨酸、半胱氨酸、纈氨酸等的氨基酸。
另外，上述組合物可以包含防腐劑(山梨酸鉀、苯甲酸鈉、水楊酸、脫氫乙酸鈉等)、殺菌劑(漂白粉和高度漂白粉、次氯酸鈉等)、氧化防止劑(丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)等)、著色劑(焦油色素等)、成色劑(亞硝酸鈉、亞硝酸鈉等)、漂白劑(亞硫酸鈉)、調味料(MSG谷氨酸鈉等)、甜味料(甘素(dulcin)、甜蜜素(cyclamate)、糖精(saccharin)、鈉等)、香料(香蘭素、內酯類等)、膨脹劑(明礬、D-酒石酸氫鉀等)、强化劑、乳化劑、增稠劑(糊料)、皮膜劑、膠基礎劑、泡沫抑制劑、溶劑、改良劑等的食品添加物(food additives)。上述添加物可以根據食品的種類進行選擇並以適當的量使用。
可以將上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株或其發酵物直接添加或者與其他食品或食品成分一起使用，並且可以根據常規方法適當地使用。有效成分的混合量可以根據其使用目的(預防、健康或治療處理)適當地確定。一般來說，在製備食品或飲料時，相對於食品或飲料，本發明的食品組合物可以以50重量份以下、具體20重量份以下的量添加。然而，在以健康和衛生為目的而長期攝取時，可以包括上述範圍以下的含量，並且在安全性方面沒有任何問題，因此有效成分還可以以上述範圍以上的量使用。
作為本發明的食品組合物的一例，可以用作健康飲料組合物，並且在這種情况下，如常規飲料一樣，可以含有各種香味劑或天然碳水化合物等作為附加成分。上述天然碳水化合物可以是諸如葡萄糖、果糖等單糖；諸如麥芽糖、蔗糖等二糖；諸如糊精、環糊精等多糖；木糖醇、山梨醇、赤蘚糖醇等的糖醇。甜味劑可以使用諸如索馬甜、甜葉菊提取物等天然甜味劑；諸如糖精、阿斯巴甜等合成甜味劑等。上述天然碳水化合物的比例，每100 mL本發明的組合物通常為約0.01~0.04 g，具體為約0.02~0.03 g。
除了上述物質之外，健康飲料組合物還可以含有各種營養劑、維生素、電解質、風味劑、著色劑、果膠酸、果膠酸的鹽、藻酸、藻酸的鹽、有機酸、保護性膠體增稠劑、pH調節劑、穩定劑、防腐劑、甘油、醇或碳酸化劑等。此外，可以含有用於製備天然果汁、果汁飲料或蔬菜飲料的果肉。這些成分可以單獨或混合使用。這些添加劑的比例雖然不太重要，但一般在每100重量份本發明的組合物的0.01~0.1重量份的範圍內進行選擇。
在本發明的食品組合物中，基於上述食品組合物的總重量，上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株或其發酵物的含量可以為0.001至90%，具體為0.01至30%，更具體為0.05至10%，進一步具體為0.05至0.15%，但不限於此。
本發明的又一方面提供了一種改善皮膚狀態的方法，其包括將上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株或其發酵物塗布於個體的皮膚的步驟。
上述個體不受限制地包括包含老鼠、家畜、人等的哺乳動物，上述改善皮膚狀態可以是選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組中的一種以上，但不限於此。
上述“菌株”、“其發酵物”、”保濕皮膚”、“抗氧化”、“抗老化”、“鎮靜皮膚”、“改善皮膚炎症”、“增强皮膚有益菌”、“改善皮膚膚色”、“美白皮膚”、“再生皮膚”、“治癒傷口”、“免疫活性”和“强化皮膚屏障”如上所述。
本發明的又一方面提供了一種包含上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株或其發酵物的化妝料組合物的改善皮膚狀態用途。
上述改善皮膚狀態可以是選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組中的一種以上，但不限於此。
上述“菌株”、“其發酵物”、”保濕皮膚”、“抗氧化”、“抗老化”、“鎮靜皮膚”、“改善皮膚炎症”、“增强皮膚有益菌”、“改善皮膚膚色”、“美白皮膚”、“再生皮膚”、“治癒傷口”、“免疫活性”和“强化皮膚屏障”如上所述。
本發明的又一方面提供了一種包含上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株或其發酵物的醫藥外品組合物的改善皮膚狀態用途。
上述改善皮膚狀態可以是選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組中的一種以上，但不限於此。
上述“菌株”、“其發酵物”、”保濕皮膚”、“抗氧化”、“抗老化”、“鎮靜皮膚”、“改善皮膚炎症”、“增强皮膚有益菌”、“改善皮膚膚色”、“美白皮膚”、“再生皮膚”、“治癒傷口”、“免疫活性”和“强化皮膚屏障”如上所述。
本發明的又一方面提供了一種包含上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株或其發酵物的藥學組合物的改善皮膚狀態用途。
上述改善皮膚狀態可以是選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組中的一種以上，但不限於此。
上述“菌株”、“其發酵物”、”保濕皮膚”、“抗氧化”、“抗老化”、“鎮靜皮膚”、“改善皮膚炎症”、“增强皮膚有益菌”、“改善皮膚膚色”、“美白皮膚”、“再生皮膚”、“治癒傷口”、“免疫活性”和“强化皮膚屏障”如上所述。
本發明的又一方面提供了一種包含上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株或其發酵物的食品組合物的改善皮膚狀態用途。
上述改善皮膚狀態可以是選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組中的一種以上，但不限於此。
上述“菌株”、“其發酵物”、”保濕皮膚”、“抗氧化”、“抗老化”、“鎮靜皮膚”、“改善皮膚炎症”、“增强皮膚有益菌”、“改善皮膚膚色”、“美白皮膚”、“再生皮膚”、“治癒傷口”、“免疫活性”和“强化皮膚屏障”如上所述。
本發明的又一方面提供了一種化妝料組合物的製備方法，其包括使上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株發酵的步驟。
上述菌株、發酵和化妝料組合物如上所述。
具體地，上述製備方法的特徵在於，上述菌株源於山蔘，但不限於此。
本發明的化妝料組合物的製備方法可以從技術領域已知的常規技術進行適當選擇。
本發明的又一方面提供了一種醫藥外品組合物的製備方法，其包括使上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株發酵的步驟。
上述菌株、發酵和醫藥外品組合物如上所述。
具體地，上述製備方法的特徵在於，上述菌株源於山蔘，但不限於此。
本發明的醫藥外品組合物的製備方法可以從技術領域已知的常規技術進行適當選擇。
本發明的又一方面提供了一種藥學組合物的製備方法，其包括使上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH菌株發酵的步驟。
上述菌株、發酵和藥學組合物如上所述。
具體地，上述製備方法的特徵在於，上述菌株源於山蔘，但不限於此。
本發明的藥學組合物的製備方法可以從技術領域已知的常規技術進行適當選擇。
本發明的又一方面提供了一種食品組合物的製備方法，其包括使上述人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株發酵的步驟。
上述菌株、發酵和食品組合物如上所述。
具體地，上述製備方法的特徵在於，上述菌株源於山蔘，但不限於此。
本發明的食品組合物的製備方法可以從技術領域已知的常規技術進行適當選擇。
發明效果
包含本發明的菌株或其發酵物的組合物具有優異的保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障功效，因此可以有用地用作化妝料組合物、醫藥外品組合物等。另外，本發明的菌株具有通過將主要人蔘皂苷生物轉化來增加總人蔘皂苷中的稀有人蔘皂苷含量的優異功效，因此當用作上述組合物時，可以提高生理活性。
在下文中，通過實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例用於例示性地描述本發明，並且本發明的範圍不限於這些實施例。
實施例 1 ：發掘從山蔘 ( Panax ginseng) 分離的新型菌株
從山蔘( Panax ginseng)中分離出新型人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi)菌株。
具體地，採掘推測為30年以上的山蔘並去除土和異物，然後在70% EtOH溶液和NaOCl溶液中分別進行3次以上浸泡消毒。用滅菌的刀將山蔘切碎後，將其與稀釋液(為山蔘片重量的10倍)混合，並在商用R2A培養基(Difco)中培養數日。
對上述分離的菌株的下述16s rRNA序列進行NCBI blast分析的結果，確認了具有與現有菌株的一致度為97%的同一性，因此上述分離的菌株是與現有菌株不同的菌株。
LGHNH菌株的16s rRNA序列(序列號1)：
CAGGAAGGGCGGCCGCTATACGTGCAGTCGAGCGAACTGGATGAAGAGCGTTGCTTTTGATCAGTTAGCGGCGGACGCGCGTGGAGTAACACGTGGGTGAACCTGCCTGTAGAGACTAGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACGTGGATAAGTTTTCTCTCCGCATGGAGGGAGATTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTACAGATGGACCCGCGGGGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTATCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACCTCCCTAGAGATAGGGCCTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGAAAAACCGGAGGAAGGGGGGGATGACGTCAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACCACGTGCTAAATGGATGGTACAAAGGCTGCGAAACCGCGAGGTTAGCCATCCCTAAAACCTTTCCAGTTCGGATGCAGGCTGCACTCCCCTGCTGAATGTGGATTCTTATATCCCGGATAACTTCCCGGGAATATACTCGGGGCTTTAACCGCCCGA。
上述新型菌株被命名為人蔘土芽孢桿菌( Bacillus ginsengihumi) LGHNH，國際保藏在布達佩斯條約下的國際保藏機構的韓國菌種保藏中心(KCTC)中，並於2021年3月5日獲得了寄存編號KCTC 14462BP。
實施例 2 ：新型菌株發酵物的製備
在本實施例中，為了製備上述新型菌株的發酵物，將作為新型菌株的LGHNH菌的預培養和主培養實施1天至7天。對於預培養，將LGHNH菌接種在包含R2A培養基(DIFCO)的容器中，並在30℃下以150 rpm進行振蕩培養。之後，將預培養液接種在包含主培養基的容器中，並進行振蕩培養。
＜主培養基(pH 6.0)＞。
果糖(Fructose)20 g/L、酵母提取物10 g/L、K2HPO4 1.5 g/L。
之後，將主培養液離心而取得上清液的結果，獲得了上述LGHNH菌的培養液，並且將上述主培養液粉碎而獲得了上述LGHNH菌的粉碎物。上述培養液和粉碎物是由LGHNH菌分解有機化合物的結果而製得的，因此可以混用為發酵物。
實施例 3 ：評價新型菌株發酵物的人蔘皂苷生物轉化效果
為了驗證新型菌株的人蔘皂苷轉化能力，分析了放入人蔘提取物的培養基的發酵前、後人蔘皂苷含量。將5%人蔘提取物放入商用TSB(Tryptic soy broth, Difco)培養基中並經過0.22 μm過濾器，然後放入相同量的將作為新型菌株的LGHNH菌培養48小時而獲得的主培養物。隨後，在30℃下以150 rpm振盪培養14天，然後用水飽和的丁醇重複提取(上清液)兩次，並且减壓濃縮後溶解在MeOH中，從而進行HPLC分析。定量分析培養前、後試料的人蔘皂苷含量來確認了人蔘皂苷轉化能力。其結果示於下表1。
[表1]
人蔘皂苷 培養前(ppm) 培養後(ppm)
Re 68855 62350
Rg1 64805 60450
Rb1 58140 54175
Rc 30415 15040
Rb2 56815 38590
Rf 23920 21995
Rd 4155 3946
Rg2(R) 49 165
Rh1(S) 416 758
Rh1(R) 518 728
Rg4 24 67
Rg6 44 185
Rk3 - 47
Rh4 80 402
Rg3(S) 90 307
如上表1所示，與培養前相比，培養後的主要人蔘皂苷Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rf和Rd含量减少，稀有人蔘皂苷Rg2(R)、Rh1(S)、Rh1(R)、Rg4、Rg6、Rk3、Rh4和Rg3(S)增加。由此，確認了上述新型菌株具有將主要人蔘皂苷生物轉化為稀有人蔘皂苷的效果。
實施例 4 ：評價新型菌株發酵物的皮膚保濕效果
為了驗證新型菌株發酵物的皮膚保濕效果，利用源於人的成纖維細胞(Human Dermal Fibroblast)來確認了新型菌株發酵物的玻尿酸生成程度。成纖維細胞以DMEM(達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), Gibco)為基本培養基，添加10%FBS (胎牛血清(Fetal Bovine Serum))來進行培養。將實施例2中製備的新型菌株發酵物或陽性對照組試料稀釋至對應於表2的濃度並處理24小時，然後使用玻尿酸ELISA試劑盒(R&D Systems，目錄號DHYAL0)來測量了玻尿酸濃度。試料的玻尿酸生成率是通過計算與對照組(無血清培養基，含有0%FBS的DMEM)相比增加的比例來算出的。其結果示於下表2。
-陽性對照組：表皮生長因子(EGF, epidermal growth factor) 100 ng/mL。
[表2]
玻尿酸濃度(%) 未添加對照組 EGF 100 ng/mL LGHNH 發酵物0.1% LGHNH 發酵物1%
100 322.09 350.02 482.86
如上表2所示，確認了上述新型菌株發酵物與未添加對照組相比，玻尿酸生成率在發酵物0.1%和1%中分別為350.02%、482.86%，具有優異的玻尿酸生成效果。
由此，可以看出本發明的新型菌株發酵物對皮膚保濕表現出優異的效果。
實施例 5 ：評價新型菌株發酵物的抗氧化效果
為了驗證新型菌株發酵物的抗氧化效果，利用DPPH(2,2-二苯基-1-苦基苯肼(picrylhydrazyl)，Alfa Aesar，目錄號044150)來測量了新型菌株發酵物的自由基消除活性。實施例2中製備的新型菌株發酵物以50%為最大濃度在甲醇溶液中連續稀釋(serial dilution)。由此，製備了多種濃度的實驗組，並且作為陽性對照組使用了抗氧化劑抗壞血酸。製備1.5 mM標準DPPH甲醇溶液(0.06 mg/mL)，並以相同量放入每個試料中，然後在37℃下處理30分鐘。之後，通過在517 nm處測量吸光度以計算去除50%自由基所需的濃度(IC50)來算出。其結果示於下表3。
-陽性對照組：抗壞血酸0.1%
[表3]
自由基消除能力(IC50) 抗壞血酸 發酵物
7.50 ppm 8.38%
如上表3所示，確認了上述新型菌株發酵物具有自由基消除能力優異的自由基消除能力。
由此，可以看出本發明的新型菌株發酵物對抗氧化表現出優異的效果。
實施例 6 ：評價新型菌株發酵物的抗老化效果
為了驗證新型菌株發酵物的抗老化效果，利用皮膚成纖維細胞(fibroblasts)通過以下方法確認了第1型膠原蛋白合成促進效果。利用在商用DMEM中添加10%FBS的培養基，在48-孔板中以2~5 x 10 4細胞/㎖的濃度接種(seeding)，並培養成纖維細胞24小時。去除現有培養液，並將實施例2中製備的新型菌株發酵物或陽性對照組試料在無血清培養基中稀釋至對應於表4的濃度，並處理24小時。之後，獲得細胞培養液，並使用ELISA測定來測量了第1型膠原蛋白合成促進效果。合成的膠原蛋白利用人前膠原蛋白(Human Pro-Collagen)Iα1/COLIA1(R&D systems，目錄號DY6220-05)來進行數值化，試料的膠原蛋白合成率是通過計算與對照組(無血清培養基)相比增加的比例來算出的。其結果示於下表4。
-陽性對照組：TGF-β 5 ng/mL
[表4]
膠原蛋白濃度(%) 未添加 對照組 TGF-β 5 ng/mL LGHNH發酵物0.1% LGHNH發酵物0.5%
100 144.45 124.33 140.43
如上表4所示，確認了上述新型菌株發酵物與未處理組相比，膠原蛋白合成率在發酵物0.1%和0.5%中分別為124.33%、140.43%，具有與陽性對照組類似的水平，從而確認了具有優異的膠原蛋白合成促進效果。
由此，可以看出本發明的新型菌株發酵物對抗老化表現出優異的效果。
實施例 7 ：評價新型菌株發酵物的皮膚鎮靜和炎症改善效果 (NO 測定 )
為了驗證新型菌株發酵物的皮膚鎮靜和炎症改善效果，利用小鼠巨噬細胞系(mouse macrophage cell line)Raw 264.7細胞(ATCC，目錄號CRL-2788)測量了新型菌株發酵物的NO生成抑制效果。在商用DMEM中添加10%FBS並使其用作生長培養基，將Raw264.7細胞以1~2 x 10 5細胞/ml的濃度添加至24-孔組織培養板中，並在5%CO 2恆溫箱中培養一天。去除培養基並用無血清培養基饑餓(starvation)12小時，然後將實施例2中製備的新型菌株發酵物或陽性對照組試料稀釋至對應於表5的濃度，並預處理30分鐘。之後，處理500 ng/ml的LPS(Lipopolysaccharides，SIGMA，目錄號L43901)並培養18小時。培養後，取上清液並轉移至96-孔組織培養板，添加格裏斯試劑(GREISS reagent) (SIGMA，目錄號G4410)在室溫下反應15分鐘，然後利用ELISA reader(ELISA reader)在540 nm處測量吸光度。
之後，利用NO定量試劑盒如下評價了NO生成抑制能力，其結果示於表5。
-陽性對照組：L-NMMA 100 μM
-NO生成抑制能力(%)＝{1-(添加試料時NO生成量/未添加試料時NO生成量)}×100
[表5]
NO生成抑制能力(%) 未添加 對照組 L-NMMA 100 μM LGHNH發酵物0.1% LGHNH發酵物1.0%
0 65.7 25.9 39.40
如上表5所示，確認了新型菌株發酵物與未添加對照組相比，NO生成抑制能力在發酵物0.1%和1.0%中分別為25.9%、39.40%，與未添加對照組相比具有NO生成抑制能力，因此具有優異的皮膚鎮靜和炎症抑制效果。
實施例 8 ：評價新型菌株發酵物的體外益生元能力
為了評價新型菌株發酵物的體外益生元能力，比較了上述發酵物處理前後皮膚常居菌中的有益菌增强程度。選擇表皮葡萄球菌作為代表性有益菌，並比較上述發酵物處理前後有益菌的生長速度。
評價有益菌的生長速度
有益菌的生長速度通過如下方法評價。利用商用TSB(Tryptic soy broth, DFICO)培養基製備了滅菌液體培養基，並將表皮葡萄球菌甘油保存液接種在滅菌液體TSB培養基中，並在30-37℃下預培養6-18小時。這種預培養實施1-2次。之後，在滅菌液體TSB培養基中添加實施例2中製備的菌發酵物，接種上述預培養溶液，並在30-37℃下培養6-18小時。
培養後，測量剛接種後的吸光度(OD)和生長停滯期(stationary phase)時的吸光度，並將其值的比例(生長率)用作統計變數。通過比較處理上述發酵物的實驗組相對於未處理上述發酵物的對照組的生長率來判斷試料是否對菌的生長帶來有意義的效果。評價進行3-6次以上，算出多次的生長率的平均值、標准偏差等，然後通過t檢驗驗證有意義性。上述有益菌的生長速度評價結果示於下表6。
[表6]
表皮葡萄球菌生長率(%) 未添加對照組 發酵物5.0%
0 10.61
如上表6所示，確認了新型菌株發酵物與未添加對照組相比，有益菌生長率為10.61%，具有優異的有益菌增强效果。
實施例 9 ：評價新型菌株發酵物的皮膚膚色改善效果
為了驗證新型菌株發酵物的皮膚膚色改善效果，利用1-苯基-1,2-丙二酮(PPD, SIGMA)測量了糖化分解活性，並且利用了以下過程：如果1 M PPD中的二羰基鍵分解，則會生成1 M的苯甲酸。使用N-苯甲醯噻唑溴化物作為陽性對照組。首先，將0.1 M磷酸緩衝溶液(pH 7.4)和100%甲醇以1:1體積比混合來製備去糖化緩衝液(de-glycation buffer)，並製備10 mM PPD溶液。將實施例2中製備的新型菌株發酵物或陽性對照組試料在DMSO中稀釋至對應於表7的濃度來製備。將各試料5 μL、10 mM PPD溶液500 μL和去糖化緩衝液495 μL的混合物在37℃下反應24小時。為了結束反應，放入2 M的鹽酸(HCl)200 μL，然後以10,000 rpm離心2分鐘。僅獲得上清液，並使用比例為65:35的丙烯腈和0.1% H3PO4作為顯影溶劑，進行HPLC分析，並測量PPD的二羰基鍵分解而生成的苯甲酸(benzoic acid)的量。試料的分解率通過將生成的苯甲酸的量除以計算的苯甲酸的量(5 mM PPD = 苯甲酸610.65 ppm)來計算。其結果示於下表7。
-陽性對照組：N-苯甲醯噻唑溴化物(N-phenacylthiazolium bromide(N-PTB)) 200 ppm
[表7]
   N-PTB 200 ppm 發酵物0.1% 發酵物1.0%
生成的苯甲酸量(ppm) 35.33 25.55 35.00
分解率(%) 5.79 4.18 5.73
如上表7所示，確認了上述新型菌株發酵物的分解率在發酵物0.1%和1.0%中分別為4.18%、5.73%，具有與陽性對照組相似的水平，從而確認了具有優異的糖化分解活性效果。
由此，可以看出本發明的新型菌株發酵物對皮膚膚色改善表現出優異的效果。
實施例 10 ：評價新型菌株發酵物的美白效果 ( 黑色素試驗 )
為了驗證上述發酵物的美白效果，測量並比較了對黑色素細胞(Melanocyte)處理新型菌株發酵物時黑色素細胞內的黑色素(Melanin)色素的量减少的程度和酪氨酸酶活性(Tyrosinase activity)程度。
將MNT-1黑素瘤細胞(ATCC，目錄號CRL-3450)以1~2 x 10 5細胞/ml的濃度接種在包含10%FBS的DMEM培養基中，並培養24小時。將實施例2中製備的菌發酵物或陽性對照組試料稀釋至對應於表8的濃度，處理並培養72小時，然後回收細胞。以13,000 rpm離心1分鐘並去除上清液，然後在沉澱物(pellet)中添加0.5% triton X-100溶液300 μl以裂解(lysis)細胞。將其再次以13,000 rpm離心3分鐘，並分別回收沉澱物和上清液。對於細胞沉澱物，添加100 μl的0.5N NaOH，培養過夜(overnight incubation)以溶解黑色素，然後利用ELISA reader測量450 nm吸光度。為了測量酪氨酸酶活性，取100 μl上述回收的細胞裂解上清液，並向其中添加1mM L-DOPA(SIGMA)溶液，然後在37℃下反應1小時。對於反應液，利用ELISA reader來測量450 nm吸光度。
-陽性對照組：熊果苷(Arbutin) 200 μg/mL (Lim YJ et al., 2009, Arch Pharm Res.)
[表8]
   未添加 對照組 熊果苷200 μg/mL 發酵物0.1% 發酵物1.0%
黑色素含量(%) 100 77.65 93.05 89.78
酪氨酸酶活性(%) 100 56.19 91.73 57.10
如上表8所示，確認了本發明的新型菌株發酵物的黑色素含量與未添加對照組相比，在發酵物0.1%和1.0%中分別為93.05%、89.78%，黑色素含量顯著降低，並且確認了上述新型菌株發酵物的酪氨酸酶活性與未添加對照組相比為91.73%、57.10%，具有與陽性對照組類似的水平，從而確認了具有優異的黑色素生物合成抑制效果。
由此，確認了本發明的新型菌株發酵物對皮膚美白表現出優異的效果。
實施例 11 ：評價新型菌株發酵物的皮膚細胞活性效果
為了驗證新型菌株發酵物的皮膚細胞活性效果，利用人成纖維細胞培養(Human fibroblast culture)測量了新型菌株發酵物的細胞活性程度。將人成纖維細胞以5 x 10 3細胞/孔濃度接種在包含10%FBS的DMEM培養基中，並培養24小時。去除現有培養液後，將實施例2中製備的新型菌株發酵物或陽性對照組試料稀釋至對應於表9的濃度並處理48小時，然後放入CCK-8試劑盒(DOJINDO, Cell Counting Kit-8，目錄號CK04)內包含的試劑並培養4小時。之後，利用ELISA reader測量了450 nm吸光度。試料的細胞活性值通過將處理新型菌株發酵物的值與對照組(無血清培養基)值相比所獲得的值計算為%來算出。其結果示於下表9。
-陽性對照組：FBS 3% (胎牛血清(Fetal bovine serum))
[表9]
皮膚細胞活性(%) FBS 3% 發酵物0.1% 發酵物1.0%
124.77 126.31 129.54
如上表9所示，確認了上述新型菌株發酵物的皮膚細胞活性度在發酵物0.1%和1.0%中分別為26.31%、29.54%，具有比陽性對照組更高的皮膚細胞活性度，從而確認了表現出優異的皮膚細胞活性效果。
由此，可以看出本發明的新型菌株發酵物對皮膚再生或傷口治癒等表現出優異的效果。
實施例 12 ：評價新型菌株發酵物的免疫活性效果
為了驗證新型菌株發酵物的免疫活性效果，利用Raw 264.7(ATCC，目錄號CRL-2788)細胞測量了新型菌株發酵物的TNFα(腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α), TNF- α)濃度。將實施例2中製備的新型菌株發酵物試料按濃度稀釋，並與低濃度(1 ng/mL)和高濃度(1 μg/mL)的脂多糖類一起處理於小鼠巨噬細胞中，然後利用MOUSE TNF-ALPHA DUOSET KIT(R&D SYSTEMS，目錄號DY410-05)試劑盒通過ELISA分析TNF-α的濃度。試料的TNF-α濃度通過以下計算：在450 nm和570 nm處測量各孔的吸光度，然後將吸光度代入從標準溶液獲得的TNF-α濃度-吸光度標準曲線中。其結果示於圖1。
如圖1所示，確認了新型菌株發酵物0.1%在高濃度LPS處理條件下不影響TNF-α的分泌，但在低濃度LPS處理條件下促進TNF-α的分泌。
由此，可以看出本發明的新型菌株發酵物對於外部的弱刺激會激活免疫，但在過度刺激下不會誘發炎症。即，確認了本發明的新型菌株發酵物具有優異的免疫活性效果。
實施例 13 ：評價新型菌株發酵物的皮膚屏障强化效果
為了驗證新型菌株發酵物的皮膚屏障强化效果，測量了角質細胞脂質膜的染色程度。將微型猪弗朗茲細胞膜(Micropig Franz cell membrane) (Medi Kinetics)在室溫下解凍，然後一起放入分離緩衝液(2% SDS, 10 mM DTT, 5 mM EDTA)中，並在80℃的水中加熱5分鐘。將試管在空氣中冷却，以3000 rpm離心5分鐘，然後去除緩衝液而留下沉澱的角質。對於沉澱的角質，添加洗滌緩衝液(0.2% SDS, 10 mM DTT, 5mM EDTA)並以3000 rpm離心5分鐘，重複兩次，添加適量的磷酸緩衝生理鹽水(Phosphate-Buffered Saline, PBS)並保管。在保管的角質中，將實施例2中製備的新型菌株發酵物的試料按濃度稀釋並處理24小時，然後處理相當於9倍體積的Bradford蛋白質染色液。經過2小時後，通過顯微鏡獲取染色的角質的照片，並綜合判斷角質的染色與否來計算角質染色比例。其結果示於圖2。
如圖2所示，確認了新型菌株發酵物處理組與未處理對照組相比，角質的蛋白質染色比例减少。
由此，確認了本發明的新型菌株發酵物强化角質並表現出優異的皮膚屏障强化效果。
基於以上說明，本申請所屬技術領域的技術人員可以理解在沒有變更本申請的技術思想或者必要的特徵的情况下本申請還可以以其他具體方式實施。對此，應當理解，以上說明的實施例在所有的方面均為示例性的而非限制性的。本申請的範圍應被解釋為包括後述的請求項的意思以及範圍和從其等同概念導出的所有的變更或者變形的方式，而不僅僅包括上述的詳細描述。
無
[圖1] 是示出分析本申請發明的人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株的發酵液對TNF-α的濃度産生的影響的結果的圖。 [圖2] 是示出分析本申請發明的人蔘土芽孢桿菌LGHNH菌株的發酵液對角質染色比例産生的影響的結果的圖。
KR南韓　　韓國菌種保藏中心(KCTC)　　2021/03/05　　KCTC 14462BP
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (17)

  1. 一種人蔘土芽孢桿菌(Bacillus ginsengihumi)LGHNH菌株，其以寄存編號KCTC 14462BP進行保藏。
  2. 如請求項1所述的菌株，其中，該菌株具有人蔘皂苷生物轉化能力。
  3. 如請求項1所述的菌株，其中，該菌株具有選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組合中的一種以上的特徵。
  4. 如請求項1所述的菌株，其中，該菌株源於山蔘。
  5. 一種包含請求項1所述的菌株或其發酵物的化妝料組合物。
  6. 如請求項5所述的化妝料組合物，其中，該化妝料組合物用於改善皮膚狀態，該改善皮膚狀態是選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組合中的一種以上。
  7. 如請求項5所述的化妝料組合物，其中，該組合物激活皮膚細胞。
  8. 一種包含請求項1所述的菌株或其發酵物的醫藥外品組合物。
  9. 如請求項8所述的醫藥外品組合物，其中，該醫藥外品組合物用於改善皮膚狀態，該改善皮膚狀態是選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組合中的一種以上。
  10. 一種包含請求項1所述的菌株或其發酵物的藥學組合物。
  11. 如請求項10所述的藥學組合物，其中，該藥學組合物用於改善皮膚狀態，該改善皮膚狀態是選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組合中的一種以上。
  12. 一種包含請求項1所述的菌株或其發酵物的食品組合物。
  13. 如請求項12所述的食品組合物，其中，該食品組合物用於改善皮膚狀態，該改善皮膚狀態是選自由保濕皮膚、抗氧化、抗老化、鎮靜皮膚、改善皮膚炎症、增强皮膚有益菌、改善皮膚膚色、美白皮膚、再生皮膚、治癒傷口、免疫活性和强化皮膚屏障組成的組合中的一種以上。
  14. 一種化妝料組合物的製備方法，其包括使請求項1所述的菌株發酵的步驟。
  15. 一種醫藥外品組合物的製備方法，其包括使請求項1所述的菌株發酵的步驟。
  16. 一種藥學組合物的製備方法，其包括使請求項1所述的菌株發酵的步驟。
  17. 一種食品組合物的製備方法，其包括使請求項1所述的菌株發酵的步驟。
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