TW202224684A - 抗過敏發酵物之活性成分及其應用 - Google Patents

Abstract

一種使用一活性成分於製備一用於抗過敏及／或輔助調整過敏體質之組成物的用途，其中該活性成分係以下式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者：

、

、

、及

Description

抗過敏發酵物之活性成分及其應用

本發明係關於式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者的應用，尤其是關於彼等於抗過敏及／或輔助調整過敏體質的應用：

（I）、

（II）、

（III）、及

（IV）。

所謂「過敏」，通常是指人體對於原本無害之物質產生過度反應的症狀，常見可能會引發過敏的物質（亦稱為「過敏原」）有花粉、塵埃、食物、黴菌、動物皮屑、蟲類、化學品等。當人體對前述過敏原產生過度反應時，B淋巴球會製造出大量的IgE，而IgE則會活化肥大細胞及嗜鹼性球，使得肥大細胞及嗜鹼性球釋放出大量的組織胺，產生一系列的免疫反應，導致氣喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性腸胃炎、異位性皮膚炎、及蕁麻疹等過敏性疾病，嚴重時甚至會引起過敏性休克，進而危及生命。

在台灣有高達1/3以上的人有過敏體質，在中國大陸更有二億人口有過敏體質，且過敏人口急速攀升中。目前臨床上用於抑制過敏反應之藥物包括抗組織胺、類固醇、去充血劑、肥大細胞穩定劑、白三烯素受體拮抗劑等，然而，大多數藥物都只能緩解部分症狀、且通常都具有副作用。以市面上常見的抗組織胺藥物為例，第一代抗組織胺藥物（例如：佩你安錠、希普利敏液、勝克敏液、特息敏錠）通常會引起嗜睡、注意力下降、口乾、便秘等副作用，而第二代抗組織胺藥物（例如：停敏膜衣錠、艾來錠、驅異樂膜衣錠）則因為是透過腎臟代謝，所以並不適合腎臟病患者使用。因此，業界仍致力於抗過敏之相關產品的研究。尤其，世界衛生組織（WTO）已將過敏列為21世紀重點研究和預防重點，更說明前述需求的迫切性。

本案發明人研究發現，本發明式（I）至式（IV）化合物可以有效地抑制組織胺產生以及抑制組織胺分泌，所以可用於抗過敏及／或輔助調整過敏體質。

因此，本發明之一目的，在於提供一種使用一活性成分於製備一用於抗過敏及／或輔助調整過敏體質之組成物的用途，其中該活性成分係以下式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者：

（I）、

（II）、

（III）、及

（IV）。

較佳地，本發明所提供的組成物係用於抑制組織胺產生及／或抑制組織胺分泌；更佳地，該組成物係用於抑制發炎反應。較佳地，該組成物係一醫藥組成物或食品組成物。其中，該食品組成物係用於輔助調整過敏體質，且係一健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品。該醫藥組成物係用於降低氣喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性腸胃炎、異位性皮膚炎、及／或蕁麻疹之發生率，或用於改善氣喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性腸胃炎、異位性皮膚炎、及／或蕁麻疹。較佳地，該醫藥組成物係呈現一經口服、經呼吸道、經皮、經肌肉或血液、或經黏膜投予之劑型。

以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所具體陳述者或後附申請專利範圍所界定者。

除非文中有另外說明，於本說明書中（尤其是在後述專利申請範圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「個體」係指人類或非人的哺乳動物（例如：狗、貓）。

已知組織胺與過敏及發炎反應息息相關，當人體內的組織胺分泌量上升時，大量的組織胺結合到呼吸道、腸胃道、皮膚及／或眼睛組織上的受體，並誘發一連串的過敏及發炎反應，進而造成眼睛、皮膚、呼吸道產生發紅、腫脹、搔癢等症狀，或是造成腸胃道不適。前述可參見例如：M V White之文獻，The role of histamine in allergic diseases，J Allergy Clin Immunol 1990 Oct; 86(4 Pt 2):599-605.、以及Alexandra Werner-Busse等人之文獻，The allergic emergency-management of severe allergic reactions，J Dtsch Dermatol Ges 2014 May;12(5):379-87.，該等文獻之全文併於此處以供參考。因此，若可有效抑制抗組織胺的分泌，即可達到抗過敏及／或輔助調整過敏體質的效果，可改善氣喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性腸胃炎、異位性皮膚炎、蕁麻疹等過敏性疾病的症狀且降低前述疾病的發生率。

蛹蟲草（ Cordyceps militaris）又稱為北冬蟲夏草，具有與冬蟲夏草類似之功效，可經由人工培養的方式繁殖，常被用做冬蟲夏草的替代品。砂仁（ Fructus Amomi）係多種薑科植物果實之合稱，常見的品種包含陽春砂（ Amomum villosum）、海南砂（ Amomum longiligulare）及縮砂（ Amomum xanthioides），已知砂仁可用於安胎等用途。紅棗（ Ziziphus jujubeMiller）為中草配方中常見的藥材，不論是新鮮的果實或乾燥後的果乾都具有相當好的療效，現代醫學亦證實紅棗具有改善貧血、咳嗽、神經衰弱、失眠、及高血壓的功效。蘋果（ Malus pumila）則含有大量的膳食纖維及維他命C，具有減肥、抗氧化等功效。

本案發明人研究發現，將蛹蟲草、砂仁、紅棗及蘋果混合、進行萃取後，在啤酒酵母菌、胚芽乳酸桿菌及醋酸菌菌株存在下對該萃取物進行發酵而提供一萃取發酵物，進一步經由純化、分離可以由前述萃取發酵物得到以下式（I）至式（IV）化合物，此等化合物具有抑制組織胺產生及抑制組織胺分泌的功效：

（I）、

（II）、

（III）、及

（IV）。

因此，本發明係關於一種使用式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者於製備一用於抗過敏及／或輔助調整過敏體質之組成物的用途。較佳地，該組成物可以是一醫藥組成物或食品組成物。

根據本發明所提供之醫藥組成物可用於全身性投藥或局部性投藥，且可透過各種藥物傳遞系統（drug delivery system，DDS）進行傳遞，合宜的藥物傳遞系統包括口服藥物傳遞系統（oral drug delivery system）、經皮藥物傳遞系統（transdermal drug delivery system）、注射藥物傳遞系統（injectable drug delivery system）、吸入性藥物傳遞系統（inhalation drug delivery system）、以及經黏膜藥物傳遞系統（transmucosal drug delivery system）等。舉例言之，但不以此為限，根據本發明所提供之醫藥組成物可以藉由微脂體（liposome）、微膠囊（microcapsule）、奈米微粒（nanoparticle）、微針（microneedle）等系統進行傳遞，以達到提高生物利用率、控制藥物釋放速度、針對病灶精準投藥、減少藥物副作用等效果。

根據本發明所提供之醫藥組成物係可呈現任何合宜的型式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈現對應之合宜劑型；舉例言之，但不以此為限，該醫藥組成物可以口服、經皮（例如貼片、軟膏等）、靜脈注射（包含點滴輸注及快速注射）、肌肉注射、皮下注射、動脈注射、腹腔注射、經呼吸道（例如噴劑、鼻滴劑等）、經黏膜（例如眼藥水、口溶錠等）之投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定，可選用醫藥上可接受之載劑以提供該醫藥組成物，其中，該載劑為熟悉製藥技術者所熟知，包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收促進劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。

以口服劑型為例，可利用任何合宜之方法，將該醫藥組成物以適於口服投藥的劑型提供，其中，適於口服之液態劑型包括糖漿劑、口服液、懸浮液、酏劑等，適於口服之固態劑型則包括粉劑、顆粒劑、口含錠、糖衣錠、腸溶錠、咀嚼錠、發泡錠、膜衣錠、膠囊劑、長效緩釋錠等。於根據本發明所提供之該醫藥組成物中可含有任何不會不利影響活性成分（即，式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者）之所欲效益的醫藥上可接受之載劑。舉例言之，但不以此為限，前述液態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子包括：水、食鹽水、葡萄糖（dextrose）、甘油、乙醇或其類似物、油（例如橄欖油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油、及胚芽油）、甘油、聚乙二醇、及前述之組合；前述固態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子則包括：纖維素、澱粉、高嶺土（kaolinite）、膨潤土（bentonite）、檸檬酸鈉、明膠、瓊脂、羧甲基纖維素、阿拉伯膠、海藻膠、單硬脂酸甘油酯（glyceryl monostearate）、硬脂酸鈣（calcium stearate）、及前述之組合。

亦可於適於經皮投藥之劑型中含有任何不會不利影響本發明活性成分（即，式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者）之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：水、礦物油、丙二醇、聚氧化乙烯、液體石蠟脂、去水山梨醇單硬脂酸酯、及聚山梨醇酯60。可利用任何合宜之方法，將該醫藥組成物以適於經皮投藥的劑型提供，例如以乳液、乳霜、油狀物、凝膠（例如水凝膠）、膏狀物（例如分散膏、軟膏）、洗劑、噴霧劑、及貼片（例如微針貼片）等形式提供，但不以此為限。

適於注射之針劑或點滴劑，則可於根據本發明所提供之醫藥組成物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液（如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液）、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該醫藥組成物。或者，可將該醫藥組成物製備成一注射前固體，並於投予至有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化，以提供所欲之注射劑。

有關經呼吸道投藥之醫藥組成物，視需要地，可使用任何合宜之方法將該醫藥組成物氣霧化，以利該醫藥組成物進入呼吸道中。舉例言之，但不以此為限，該醫藥組成物可經由霧化器（nebulizer）、或加壓容器而施用（例如鼻噴劑）。或者，可將該醫藥組成物製備成一鼻滴劑。

至於經黏膜投藥之醫藥組成物，則可於根據本發明所提供之醫藥組成物中含有一或多種穿透劑、界面活性劑、黏度調節劑、pH調節劑、防腐劑、穩定劑、滲透壓調節劑、以及其他載劑等成分，以眼藥水、眼藥膏、口溶錠、塞劑、鼻噴劑、鼻滴劑等劑型提供該醫藥組成物。

根據本發明所提供之食品組成物可為飲品、固態食品、或半固態食品，且可以健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品的形式提供。舉例言之，但不以此為限，該食品組成物可為乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、冰品、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、氣泡水、酒精飲料、運動飲料、營養飲料、嬰幼兒離乳食品等產品。較佳地，該食品組成物係以健康食品或保健食品的形式提供。

此外，視使用形式及需求而定，可於根據本發明所提供之食品組成物中含有任何適宜之食品添加物。舉例言之，可採用之食品添加物包括但不限於，防腐劑、殺菌劑、抗氧化劑、漂白劑、保色劑、膨脹劑、營養添加劑、著色劑、調味劑（例如：甜味劑）、黏稠劑、結著劑、食品工業用化學藥品、乳化劑、以及品質改良用、釀造用及食品製造用劑。

可於根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品的外包裝上標示建議使用量、使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下自行服用而無安全疑慮。

視需要地，亦可於根據本發明所提供之醫藥組成物或食品組成物中進一步含有合宜用量之添加物，例如可提高該組成物於使用時感受之調色劑、著色劑等，以及可改善該組成物的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。

根據本發明所提供之醫藥組成物或食品組成物可以視需要另外含一或多種其他活性成分（例如抗組織胺、類固醇、去充血劑、肥大細胞穩定劑、白三烯素受體拮抗劑、益生菌、維他命），以進一步加強該組成物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對本發明活性成分（即，式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者）之效益沒有不利的影響即可。

根據本發明所提供之醫藥組成物或食品組成物中係含有以該組成物之總重量計，至少約0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.003、0.0035、0.004、0.0045、0.005、0.0055、0.006、0.0065、0.007、0.0075、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100重量%之活性成分（即，式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者），且可自前述數值之任意二者選擇有用的範圍，例如：約0.0001重量%至約90重量%、約0.001重量%至約25重量%、約0.01重量%至約10重量%、約0.01重量%至約5重量%、約0.05重量%至約1重量%、及約0.05重量%至約0.5重量%。

根據本發明所提供之醫藥組成物或食品組成物係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用，端視投與個體之需求、年齡、體重、及健康況狀及施用目的而異。亦可視實際應用需求調整根據本發明所提供之醫藥組成物或食品組成物中活性成分（即，式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者）的含量，例如：調整至每日應服用或外用的量。

茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。

實施例

[ 製備實施例 ]

於以下製備實施例中，所使用的物料及器材如下： 1.     核磁共振光譜儀（Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer，NMR）：1D與2D光譜使用400MHz Varian 400 FT-NMR，以δ 表示化學位移（chemical shift），單位為ppm。 2.     質譜儀（Mass Spectrometer，MS）串聯質譜-二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜及ESI-MS/MS：使用Bruker amaZon SL system測定，單位為 m/z。 3.     中壓液相層析儀（Medium pressure liquid chromatography，MPLC）：CombiFlash® Rf+, Teledyne ISCO, Lincoln, NE。 4.     高效能液相層析儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）：高效液相層析儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）係Hitachi chromaster 5260系列；沖提溶劑輸送係Hitachi chromaster 5110；管柱恆溫裝置係Hitachi chromaster 5310；光二極體陣列偵測器（Diode Array Detector，DAD）係Hitachi chromaster 5430，偵測波長為250 nm。 5.     分析管柱：Luna® 5μm C18(2) 100 Å （250 x 10 mm, Phenomenex, USA）。 6.     管柱層析（Column Chromatography）填充材料： (1)   Sephadex LH-20（Pharmacia, Piscataway, NJ, USA）； (2)   Diaion HP 20（Mitsubishi Chemical Co., Japan）； (3)   Merck Kieselgel 60（40 63 um, Art. 9385）； (4)   Merck LiChroprep® RP-18（40 63 um, Art. 0250）。 7.     薄層色層分析（Thin Layer Chromatography）： (1) TLC aluminium sheets（Silica gel 60 F 254 , 0.25 mm, Merck, Germany）； (2) TLC aluminium sheets（RP 18 F 254 S 0.25 mm, Merck, Germany）。 8.     紫外光燈（UV Lamp）：UVP UVGL 25，波長為254 nm及 365 nm。 9.     溶劑（solvent）（採購自默克台灣）：正己烷（ n hexane ）、乙酸乙酯（ethyl acetate ）、正丁醇（n Butanol）、甲醇（methanol）、甲醇-d ₄（deuteration degree 99.5%）、硫酸溶液（H ₂SO ₄）。

A. 抗過敏萃取發酵物之製備

A-1.將紅棗（ Ziziphus jujubeMiller）、蘋果（ Malus pumila）、蛹蟲草（ Cordyceps Militaris）、陽春砂（ Amomum villosum）、以及水以1：1：1：1：40之重量比混合（即，水之重量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁之總重的10倍）後，在95°C下浸泡萃取1小時，得到一抗過敏萃取液。其後，在該萃取液冷卻至室溫之前，根據紅棗、蘋果、蛹蟲草、砂仁、及水之總重，添加10重量%之葡萄糖於萃取液中，得到一培養液（此時，培養液之pH值為5.4，糖度值為10.7°Bx）。

A-2.待培養液冷卻至室溫後，先添加相對於培養液為0.1重量%之啤酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae）BCRC20271於培養液中，進行發酵歷時1天，以形成第一初發酵液。再添加相對於培養液為0.05重量%之胚芽乳酸桿菌（ Lactobacillus helveticus）TCI357於第一初發酵液中，進行發酵歷時1天，以形成第二初發酵液。最後添加相對於培養液為5重量%之醋酸菌（ Acetobacter aceti）BCRC11688於第二初發酵液內，進行發酵歷時5天，以提供抗過敏萃取發酵液。前述各發酵階段皆於30°C下進行。抗過敏萃取發酵液之pH值為4.05，糖度值為2.0°Bx，表示大部分的糖份皆已反應。

B. 式（ I ）至式（ IV ）化合物之製備

B-1.取A-2所提供之抗過敏萃取發酵液（20公升），以乙酸乙酯與水（等比例1:1）作為溶劑，進行3次液相分配萃取，合併三次萃取所獲得之萃取液並進行減壓濃縮乾燥，得到一乙酸乙酯層萃取物（5.6g）及一水層萃取物。取該水層萃取物，以正丁醇與水（等比例1:1）作為溶劑，進行3次液相分配萃取，合併三次萃取所獲得之萃取液並進行減壓濃縮乾燥，得到一正丁醇層萃取物（27.2g）及一水層萃取物（143.0g）。

B-2.取B-1所提供之正丁醇層萃取物（27.2 g），以Diaion HP-20作為層析材料並以純水作為起始沖提液（爾後增加甲醇比例至100%甲醇）進行分離，得到3個劃分層（AAB-F1至AAB-F3）。取第2個分層（AAB-F2），以甲醇作為沖提液進行葡聚糖凝膠管柱層析（Sephadex LH-20 column chromatography），再經薄層層析片（TLC）點片合併，得到12個劃分層（AAB2-1至AAB2-12）。

B-3.取B-2所提供之AAB2-3，以甲醇與水（1:3）作為移動相進行RP-HPLC純化，得到式（I）化合物（4.9 mg）與式（II）化合物（1.6 mg）。以氫-核磁共振光譜（1H-NMR）與電噴灑離子化質譜（ESIMS）進行化學結構分析後，確認式（I）化合物為蟲草素（Cordycepin），式（II）化合物為焦麩胺酸（L-pyroglutamic）。

B-4.取B-2所提供之AAB2-9，以甲醇與水（33:67）作為移動相進行RP-HPLC純化，得到式（IV）化合物（1.6mg）。以氫-核磁共振光譜（1H-NMR）與電噴灑離子化質譜（ESIMS）進行化學結構分析後，確認式（IV）化合物為綠原酸（Chlorogenic acid）。

B-5.取B-2所提供之AAB2-11，以甲醇與水（1:4）作為移動相進行RP-HPLC純化，得到式（III）化合物（5.6mg）。以氫-核磁共振光譜（1H-NMR）與電噴灑離子化質譜（ESIMS）進行化學結構分析後，確認式（III）化合物為山柰酚-3-葡萄糖苷（Astragalin）。

式（I）至式（IV）化合物之化學結構式係如下表1所示，其NMR圖譜則分別示於圖1A至圖1D： 表1

化合物	化學結構式	化合物	化學結構式
I		II
III		IV

實施例 1 ：本發明化合物於抑制組織胺產生與分泌之效果

已知在人體中，組織胺主要係由肥大細胞與嗜鹼性球所分泌。適當之組織胺分泌可幫助人體預防感染，但過多或異常的組織胺會造成血管擴張、血壓下降、搔癢、腹瀉及嘔吐等過敏反應。為了解本發明式（I）至式（IV）化合物是否具有抑制組織胺產生或分泌的效果，本實施例係以DNP-HSA作為過敏誘發劑，並以嗜鹼性球RBL-2H3作為細胞模型進行實驗。

於本實施例中，所使用的物料及器材如下： 1.            RBL-2H3細胞（ATCC；Cat. CRL-2256） 2.            電動吸管（伯昂；Cat. 112108E） 3.            手動分注器（Sartorius；Cat. 725010，725020，725030，725050，725060） 4.            CO ₂培養箱（ASTEC；Cat. SCA-165DS） 5.            恆溫水浴槽（裕德；Cat. BH-130D） 6.            超純水製造系統（ELGA；Cat. Classic DI） 7.            血球計數盤（Marienfeld；Cat. AP-0650010） 8.            垂直式無菌無塵操作台（造鑫-台製；Cat. VCM-620） 9.            廢液吸引器（益達醫療-台製；Cat. DF-506K） 10.       倒立式顯微鏡搭載照相系統（ZEISS；Cat. Vert.A1） 11.       直立式快速消毒器（TOMIN；Cat. TM-329） 12.       Epoch ^TM微孔板分光光度計（BioTek） 13.       細胞培養液：Minimum essential medium（MEM）（Gibco；Cat. 11095080），加入15% FBS（Gibco；Cat. 10437-028）、1% 青黴素-鏈黴素（Gibco；Cat. 15140122）。 14.       10X DPBS（Gibco；Cat. 14200-075） 15.       台盼藍死細胞染色劑（Lonza；Cat. 17-942E） 16.       10X 胰蛋白酶（Gibco；Cat. 15400-054） 17.       Anti-DNP-IgE（monoclonal anti-dinitrophenyl antibody produced in mouse, IgGE isotype）（Sigma；Cat. D8406） 18.       DNP-HSA（dinitrophenyl-human serum albumin）（Biosearch；Cat. D-5059） 19.       用於組織胺的ELISA套組（ELISA kit for Histamine）（USCN；Cat. CEA927Ge）： (1)               標準品（Standard） (2)               標準品稀釋液（Standard diluent） (3)               偵測劑A（Detection reagent A） (4)               偵測劑B（Detection reagent B） (5)               檢驗稀釋液A（Assay diluent A） (6)               檢驗稀釋液B（Assay diluent B） (7)               TMB受質（TMB substrate） (8)               停止液（Stop solution） (9)               30X清洗緩衝液（Wash buffer） (10)             預塗覆之96孔盤 (11)             封盤膜（Plate sealer） (12)             使用說明書 20.       15 ml 離心管（Protech；Cat. CT-15-PL-TW） 21.       50 ml 離心管（Protech；Cat. CT-50-PL-TW） 22.       微量吸管尖（QSP；Cat. 112NXL-Q，TW110-N-Q，104-Q） 23.       10 ml 無菌塑膠吸管（SimplyTM；Cat. PC510-0200） 24.       6 孔細胞培養盤（SimplyTM；Cat. PC306-0050） 25.       巴斯特吸管（Kimble；Cat. M4230NO250SP4） 26.       1.5 ml 微量離心管（Biosigma；Cat. CL022B）

在進行實驗前，需先對ELISA套組進行以下處理： a.   將試劑回復至室溫； b.   以滅菌後的ddH2O將10X DPBS稀釋10倍，以提供1X DPBS； c.   以1X DPBS將10X胰蛋白酶稀釋10倍，以提供1X胰蛋白酶； d.   以無血清之MEM配置DNP-HSA，使其最終濃度為1微克／毫升（μg/ml）； e.   將20毫升之30X清洗緩衝液加入580毫升之ddH2O中，並混和均勻，以提供1X清洗緩衝液。 f.    分別以檢驗稀釋液A及檢驗稀釋液B將偵測劑A及偵測劑B稀釋100倍，以提供偵測劑A及偵測劑B的工作溶液。 g.   對標準品進行序列稀釋：以2毫升標準品稀釋液回溶標準品，靜置至少10分鐘使標準品充分溶解，以提供最終濃度為100奈克／毫升（ng/ml）之標準品儲備液。準備5個新的1.5毫升之微量離心管，於各離心管中分別加入600微升之標準品稀釋液，接著在第一管中加入300微升之標準品儲備液，混和均勻後再從第一管取300微升至第二管，依序稀釋至第4管，第5管則僅含有標準品稀釋液。經前述步驟，5個離心管中之混合液的標準品最終濃度分別為33.33奈克／毫升、11.11奈克／毫升、3.70奈克／毫升、1.23奈克／毫升、及0奈克／毫升。

將RBL-2H3細胞（1.5x10 ⁵個細胞／孔）接種於24孔培養盤（每孔含有500微升之培養基），並置於37˚C之CO ₂培養箱中培養過夜。接著，將細胞分成五組，再分別以如下培養液進行培養於37˚C下，歷時6小時： 1.     控制組：細胞培養液（共500微升）； 2.     第I組：含有100微莫耳濃度[製備實施例B-3]所提供之式（I）化合物的細胞培養液（共500微升）； 3.     第II組：含有100微莫耳濃度[製備實施例B-3]所提供之式（II）化合物的細胞培養液（共500微升）； 4.     第III組：含有100微莫耳濃度[製備實施例B-5]所提供之式（III）化合物的細胞培養液（共500微升）； 5.     第IV組：含有100微莫耳濃度[製備實施例B-4]所提供之式（IV）化合物的細胞培養液（共500微升）。

接著，對上述各組所提供之細胞進行以下處理：於各孔中加入最終濃度為0.2微克/毫升之Anti-DNP-IgE，並反應30分鐘。然後，將各孔中的液體移除，並加入500微升之DNP-HSA溶液，於37˚C下反應30分鐘，再收集各孔中的上清液備用。

於預塗覆之96孔盤的不同孔中加入50微升之經序列稀釋的標準品、控制組之上清液、以及第I組至第IV組之上清液，再立即於各孔中加入50微升之偵測劑A的工作溶液。輕輕搖晃96孔盤，再以封盤膜牢固蓋住，置於37˚C下反應1小時。接著，將96孔盤中的液體倒出，再於各孔中分別加入350微升之1X清洗緩衝液，靜置1至2分鐘後將液體倒出（前述清洗步驟係重複3次）。盡量移除各孔內的所有液體，再於各孔中加入100微升之偵測劑B的工作溶液，並以封盤膜蓋住96孔盤，置於37˚C下反應30分鐘。接著，將96孔盤中的液體倒出，再於各孔中加入350微升之1X清洗緩衝液，靜置1至2分鐘後將液體倒出（前述清洗步驟係重複5次）。盡量移除各孔內的所有液體，再於各孔中加入90微升之受質溶液，並蓋上新的封盤膜，置於37˚C反應10至20分鐘（需避光，且作用不可超過30分鐘）。於各孔中加入50微升之停止液，並輕拍96孔盤，使孔中的液體充分混合並變色。最後，以分光光度計測得O.D. 450值，並以「控制組」的結果為基準，計算其他各組的相對組織胺含量，結果示於圖2。前述數據係參考「用於組織胺的ELISA套組（ELISA kit for Histamine）（USCN；Cat. CEA927Ge）」中之使用說明書進行計算，並使用Excel軟體進行統計分析，以學生t（student’s t-test）檢驗是否達到統計學上的顯著性。

由圖2可知，相較於「控制組」，經本發明式（I）至式（IV）化合物處理後之第I至IV組的組織胺含量皆明顯降低。前述結果顯示，本發明式（I）至式（IV）化合物確實可有效抑制嗜鹼性球之組織胺產生及分泌、抑制發炎反應，故可用於抗過敏及／或輔助調整過敏體質，且可改善氣喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性腸胃炎、異位性皮膚炎、蕁麻疹等過敏性疾病及降低其發生率。

圖1A至圖1D所示分別為式（I）至式（IV）化合物之NMR圖譜；

圖2所示為以「控制組」為基準，「第I組」至「第IV組」之相對組織胺含量，其中「控制組」之嗜鹼性球係培養於不含本發明化合物之培養基，「第I組」至「第IV組」之嗜鹼性球則係分別培養於含有式（I）至式（IV）化合物之培養基（*係表示相較於控制組的p值＜0.05；**係表示相較於控制組的p值＜0.01）。

Claims (10)

1. 一種使用一活性成分於製備一用於抗過敏及／或輔助調整過敏體質之組成物的用途，其中該活性成分係以下式（I）至式（IV）化合物及其醫藥上可接受之鹽的至少一者：

   

   （I）、

   

   （II）、

   

   （III）、及

   

   （IV）。
2. 如請求項1之用途，其中該組成物係用於抑制組織胺產生及／或抑制組織胺分泌。
3. 如請求項1之用途，其中該組成物係用於抑制發炎反應。
4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該組成物係一醫藥組成物或食品組成物。
5. 如請求項4之用途，其中該食品組成物係用於輔助調整過敏體質。
6. 如請求項4之用途，其中該食品組成物係一健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品。
7. 如請求項4之用途，其中該醫藥組成物係用於降低以下之至少一者的發生率：氣喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性腸胃炎、異位性皮膚炎、及蕁麻疹。
8. 如請求項4之用途，其中該醫藥組成物係用於改善以下之至少一者：氣喘、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性腸胃炎、異位性皮膚炎、及蕁麻疹。
9. 如請求項7之用途，其中該醫藥組成物係呈一經口服、經呼吸道、經皮、經肌肉或血液、或經黏膜投予之劑型。
10. 如請求項8之用途，其中該醫藥組成物係呈一經口服、經呼吸道、經皮、經肌肉或血液、或經黏膜投予之劑型。

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