KR102327601B1 - 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 병풀나물(굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 조성물 에 관한 것이다. 이에 의하여, 본 발명의 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 조성물은 병풀나물의 새로운 품종인 "굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE)"을 재료로 사용하여 인체에 무해하고, 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 나타내는 효과가 있다.

Description

병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 조성물{COMPOSITION FOR ANTI-ATOPIC, ANTI-OXIDANT OR ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY COMPRISING Centella asiatica AS AN EFFECTIVE INGREDIENT}

본 발명은 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 병풀 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 화장료, 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염은 만성 염증성 피부질환으로 발병 원인에 대해서는 여러 가설이 제시되고 있으나 확실한 원인은 밝혀지지 않고 있으며 유전학적, 면역학적 요인, 이상 약물반응, 미생물 등이 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 최근 아토피 피부염의 발병 기전연구와 관련하여 다양한 면역 작동 세포들의 잠재적인 역할과 관련된 많은 연구가 이루어지고 있다.

인간의 혈액에 존재하는 림프구(lymphocyte), 단핵구(monocyte), 비만세포(mast cell)등은 다양한 면역 반응을 통해 외부로부터 침입하는 세균, 독소, 진균, 바이러스, 이물질 등에 대한 방어기전을 만들어 인체의 항상성을 유지하는데, 아토피 피부염에서 피부병변은 주로 T 세포매개 과정이 발병기전의 핵심역할을 하지만 IgE-관련 항원제시세포, T 세포 활성화, 비만세포 탈과립, 각질세포, 호산구 그리고 즉시형 및 세포성 면역반응 등의 복잡한 상호작용의 결과로 진행된다. 특히 T 세포의 아형중 보조세포군 T helper cell이 아토피 피부염에 직접적으로 관련한다는 사실은 잘 알려져 있다. Th1 cell이 생산하는 Th type1 cytokine은 Th1 cell의 분화를 유도하지만 한편 Th2 cell의 증식과 분화는 억제한다. 반대로 Th2 cell이 생산하는 Th type2 cytokine은 Th2 cell의 증식과 분화를 유도하는 반면 Th1 세포의 분화를 억제한다고 알려져있다. 이와 같은 상호견제를 통해 세포군의 균형을 유지하게 되고 이 균형이 깨어지면 Th1/Th2 불균형으로 인해 여러 가지 면역질환이 유발된다. 즉, 아토피 피부염과 같은 알레르기 질환도 Th2 cell 기능의 증가와 Th1 cell 기능의 감소로 유발된다는 보고가 있다.

병풀나물은 가장자리에 톱니를 두른 작은 부채 모양의 잎에 흰색 또는 연보라색의 꽃을 피우는 미나리과 식물이다. 인도에서는 상처를 입은 호랑이가 병풀나풀이 많이 난 곳에서 뒹굴어 치료하는 것을 보고 호랑이풀이라고 부르며 오래 전부터 약으로 활용해 왔다.

한국등록특허 제 2019-0081126호

본 발명의 목적은 천연재료로 인체에 무해하고, 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 나타내는 병풀나물의 새로운 품종인 "굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE)"의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면,

굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 조성물이 제공된다.

상기 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물은 물, 탄소수 1-4의 알코올, 또는 이들의 혼합용매에 의해 추출된 것일 수 있다.

상기 분획물은 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물의 헥산 및 에틸아세테이트 혼합용매의 분획물일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 유래의 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 조성물이 제공된다.

[화학식 1]

본 발명의 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 조성물은 병풀나물의 새로운 품종인 "굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE)"을 재료로 사용하여 인체에 무해하고, 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 나타내는 효과가 있다.

도 1은 실시예 1의 분획물에 대한 FAB-MS 분석 결과이다.
도 2는 실시예 1의 분획물에 대한 NMR 분석 결과이다.
도 3은 실험예 1의 세포독성 평가 결과이다.
도 4는 실험예 2의 염증이 유발된 각질세포(HaCaT)에서 항염증 효과 분석 결과이다.
도 5는 실험예 3의 총 폴리페놀 함량 측정 결과이다.
도 6은 실험예 3의 ABTS 소거 활성, DPPH 소거 활성 측정 결과이다.
도 7은 실험예 4에 따른 귀 두께 변화 관찰 결과이다.
도 8은 실험예 4에 따른 림프절 무게 측정 결과이다.
도 9는 실험예 4에 따른 귀 조직 슬라리스의 hematoxylin-eosin (H&E) 염색된 광학 현미경 이미지이다.
도 10은 실험예 4에 따른 귀 조직 슬라리스의 toluidine blue로 염색된 광학 현미경 이미지이다.
도 11은 실험예 4에 따른 귀 조직의 표피(epiderma)와 진피(derma)의 두께를 측정한 결과이다.
도 12은 실험예 4에 따른 비만세포(Mast cell)의 수를 측정한 결과이다.
도 13은 Real-time PCR에 의한 염증관련 사이토카인 검정 결과이다.
도 14는 웨스턴 블롯에 의한 TNF-α, COX-2, MAC-1, IL-6 관련 인자 변화의 측정 결과이다.
도 15는 웨스턴 블롯에 의한 NF-κB와 MAPK 관련 인자 변화의 측정 결과이다.
도 16은 굿 타이거 케어(Good Tiger care) 품종 등록 관련 공문이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 조성물은 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함한다.

상기 추출물을 추출하는 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 저급알코올로는 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올을 들 수 있다.

상기 추출용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 60 내지 80%의 에탄올 수용액으로 추출된 추출물이 바람직하다.

바람직하게는 상기 분획물은 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물의 헥산 및 에틸아세테이트 혼합용매의 분획물일 수 있다. 이때, 상기 혼합용매는 헥산:에틸아세테이트는 100:20 내지 100:30의 부피피로 혼합된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 병풀나물을 언급하면서 사용되는 용어 '추출물'은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 병풀나물 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 병풀나물 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 병풀나물 추출물은 광의로는 병풀나물을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 병풀나물 가공물, 예컨대, 병풀나물 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 병풀나물로 실험을 진행하긴 하였으나, 병풀나물 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.

한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 이란 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 이란 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 이란 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명은 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어서 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담제를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는 세안용 클렌징, 로션, 크림, 마사지 크림, 아이크림, 에센스, 젤, 팩, 스프레이, 파우더, 선크림 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 식물성유, 왁스, 전분, 셀룰로오스, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 산화아연 등이 이용될 수 있고, 제형이 파우더 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실리케이트 등의 파우더가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 글리세린, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 프로필렌글라이콜, 부틸렌글라이콜, 1,2-헥산디올, 글리세롤 지방족 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 프로필렌글라이콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록사이드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다. 또한 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세치오네이트, 메칠타우레이트, 사르코시네이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세라이드, 식물성유 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 하기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항아토피, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 아토피 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약 또는 식품의 제조를 위한 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물을 투여하는 것을 포함하는 아토피의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

[실시예]

실시예 1: 굿 타이거 케어(Good Tiger care) 분획물 제조

실시예 1에서 사용한 병풀나물은 식물신품종 보호법 제32조에 따라 등록된 굿 타이거 케어(Good Tiger care) 품종이다. 도 16은 관련된 품종등록공문이다.

에탄올 추출물은 센텔라병풀농원(충북 충주시)에서 제공받은 굿 타이거 케어(Good Tiger care) 품종의 병풀나물 가루와 에탄올(99%)을 1:10 비율로 섞은 후, shaking incubator를 이용해 20℃/100 rpm으로 22시간 동안 shaking 후 fiter paper에 여과한 다음 evaporator를 이용하여 40℃에서 농축 후 speed vacuum에 3일간 건조했다. 물 추출물은 에탄올 추출물의 잔사와 1차 증류수를 1:10 비율로 섞은 후 autoclave를 이용해, 70℃에 90분간 고온고압멸균하고 filter paper에 여과 후 15㎖씩 나눠 동결건조기에 3일간 건조했다.

에탄올 추출물에서 silica gel(25g, 70~230 mesh, columm chromatography용, Merck, Germany)을 이용하여 ethyl acetate로 columm (1.5×30 cm)에 충전한 후, hexane, hexane:ethyl acetate=80:20(v/v), hexane:ethyl acetate=70:30(v/v), hexane:ethyl acetate=50:50(v/v), methanol 로 층을 나누어 분획하였다. 이 중에서 80:20 분획 층에서 항산화 및 항염증 활성을 확인하였다. 그 이후 활성이 가장 좋은 fraction 80:20(v/v)을 TLC(Thin Layer Chromatography)에서 다시 분리하였다. TLC분리 전개용매는 hexane-ethyl acetate(3:1(v/v))로 전개하였고, 1~4 fraction 으로 나누어 활성을 확인하였음 HPLC에서 분리 정제를 확인하였으며, HPLC 분리 조건은 아래의 표 1에 정리한 바와 같다.

Column	Waters sunfire C18 5μm, 4.6X250mm Column
Oven temp.	25℃
Detector	UV/VIS
Wavelength	220nm
Solvent	acetonitrile : water 50 : 50
Run time	30 min
Injection vol.	20 μL
Flow rate	1.0 ㎖/min

또한, FAB-MS(Fast atom bombardment mass spectrometry)에 따른 분획물의 구조 분석 결과를 도 1에 나타내었으며, NMR 분석 결과를 도 2에 나타내었다. 이에 따르면, 분획물에서 하기 화학식 1로 표시되는3-cyano-4-1-phenyl-2(1H)thiopyrid-3-yl)-6-phenyl-2(1H)-pyridone이 확인되었다.

[화학식 1]

실시예 2: 굿 타이거 케어(Good Tiger care) 에탄올 추출물 제조

실시예 1의 에탄올 추출물을 분획하지 않고 사용하였다.

[생체 외 실험]

실험예 1: 세포독성 평가

실시예 1의 분획물의 세포 독성을 확인하기 위해, 인간각질세포(HaCaT cell)에서의 세포독성을 측정하였다. HaCaT cell은 96 well plate에 well 당 1 × 10⁵개의 농도로 분주한 다음 세포 배양조건에서 24시간 배양했다. DMSO에 용해시킨 에탄올 추출물을 농도별로(10~1000㎍/㎖)로 분주하여 24시간 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 5㎎/㎖의 MTT용액을 각 well 당 20㎕씩 처리하여 4시간 동안 반응 시킨 후, 검액 및 배지를 제거하고 DMSO 200㎖로 용해시켜서 540㎚에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이에 따르면, HaCaT cell에서 실시예 1의 분획물은 500㎍/㎖ 농도까지 독성을 나타내지 않았다.

실험예 2: 염증이 유발된 각질세포(HaCaT)에서 항염증 효과 분석

피부각질세포주인 HaCaT 세포주를 cell plate에 1×10⁵ cells/㎖로 분주하고, 굿 타이거 케어 에탄올 추출물을 농도별로(100㎍/㎖, 300㎍/㎖, 500㎍/㎖) 1시간 전처리하였다. 염증 유도제인 TNF-α(10ng/㎖), IFN-γ(10ng/㎖)를 사용하여 염증 유도 및 세포 자극 후 배양했고, 배양한 세포를 RIPA 완충액으로 균질화하고 원심 분리하여, 소 혈청 알부민 (BSA)을 기준으로 Bio-Rad 단백질 키트를 사용하여 총 단백질 함량을 측정하였다. 단백질 샘플을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel로 전기 영동하고, polyvinylidene fluoride membranes에 옮기고 Tween- 20을 함유하는 트리스 완충 식염수 (TBS) 중의 5% BSA로 차단시킨 후, 적절한 특정 일차 항체(IL-6, COX-2)를 4℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 후에 secondary goat anti-rabbit IgG (H+L) horseradish peroxidase (HRP) conj㎍ate or goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conj㎍ate와 함께 상온에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 항원-항체 복합체는 향상된 화학 발광을 사용하여 가시화하여, C-DiGit Blot Scanner (Li-COR, Lincoln, NE, USA)를 사용하여 블로팅 된 멤브레인의 농도 측정 분석을 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

이에 따르면, COX-2와 IL-6 두 가지 인자 모두 실시예 1의 분획물의 농도에 따라 감소하였다. COX-2의 경우, IFN-γ(10ng/㎖)와 TNF-α(10ng/㎖)로 유발한 유발군은 CON군에 188% 증가했고, 실시예 1의 분획물의 100㎍/㎖에서 168%, 300㎍/㎖에서 116% 증가했다. 반면에 굿 타이거 케어나물 에탄올 추출물 500㎍/㎖ 농도에서는 64%로 감소하였다. 이와 비슷한 경향으로 IL-6는 IFN-γ(10ng/㎖)와 TNF-α(10ng/㎖)로 유발한 유발군은 CON군에 172% 증가했고, 굿 타이거 케어 에탄올 추출물의 100㎍/㎖에서 149% 증가했다. 반면에 굿 타이거 케어 에탄올 추출물 300㎍/㎖ 농도에서 71%, 500㎍/㎖ 농도에서는 46%로 감소하였다.

실험예 3: 항산화 효과 분석

실시예 1에 따라 제조된 굿 타이거 케어(Good Tiger care) 80:20 분획물의 갈산의 표준 곡선 (R2 = 0.9959)을 사용하여 269.76 mg GAE/100 g의 총 폴리페놀 함량을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이에 따르면, 실시예 1의 굿 타이거 케어 분획물의 총 플라보노이드 함량은 (+)-카테킨 수화물 (R2 = 0.9965)의 표준 곡선을 사용하여 462.42 mg CHE/100 g인 것으로 나타났다.

　 또한, ABTS 소거 활성, DPPH 소거 활성을 수행하여 실시예 1의 굿 타이거 케어 분획물의 항산화 활성을 조사하고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이에 따르면, 실시예 1의 굿 타이거 케어 분획물 (100, 300 및 500 ㎍/㎖)의 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성은 농도 의존적이었다. ABTS 라디칼 소거 활성은 300 및 500 ㎍/㎖처리군에서 급격히 증가하였다.

또한, DPPH 라디칼 소거 활성은 300 및 500 ㎍/㎖ 농도의 처리군이 100 ㎍/㎖의 농도와 비교했을 때 각각 32.12%, 32.35% 향상되었다. 이와 같은 결과는 강력한 항산화제는 굿 타이거 케어의 주요 성분인 Madecassoside, Madecassic acid, Asiaticoside, Asiatic acid의 농도에 의해 결정된다는 것을 시사한다.

[실험예: 생체 내 실험]

실험에 사용된 마우스모델은 BALB/c 마우스를 사용했고, 실험은 6개군으로 분류하여 정상군(CON, n=8), 아토피유도군(AD, n=8), 양성대조군(AD+Der, n=8), 국소노출 실시예 1의 분획물(AD+CA_S, n=8), 국소노출 실시예 2의 에탄올 추출물군(AD+CA, n=8), 국소노출 에탄올 추출물 단독군(CA, n=8)으로 구분하였다. AD군은 오일에 용해시킨 0.5% 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB)를 마우스 모델의 등과 귀에 매일 반복적으로 국소 노출시킴으로써 atopic dermatitis(AD)를 유도하였다. AD+Der군은 아토피 유도 모델 마우스를 대상으로 dermatop을 1mg/㎖의 농도로 주 3회 2주간 국소 노출시켰다. AD+CA_S군은 아토피 유도 후, 실시예 1의 분획물을 10mg/㎖의 농도로 주 3회 2주간 국소노출 방식 처리했고, AD+CA군은 아토피 유도 후, 실시예 2의 에탄올 추출물을 10mg/㎖의 농도로 주 3회 2주간 국소노출 방식 처리하였다. 마지막으로 CA군은 AD를 유도하지 않고 단독으로 에탄올 추출물을 10mg/㎖의 농도로 주3회 2주간 경구투여 방식으로 처리하였다. AD 유도군들은 실험 4일 전에 1% DNCB를 등과 귀에 발라 감작을 일으키고 실험을 수행하였다.

실험예 4: 아토피 증상의 관찰과 림프절무게 측정

상기 실험군들의 마우스 귀 피부 조직의 두께의 변화를 2주 동안 관찰 및 측정하였다. 귀 두께(ear swelling)는 dial thickness ga㎍e (Kori Seiki MFG, Co., Japan)를 사용하여 측정하였고, 실험 종료일에 마우스를 희생시킨 다음 림프절을 꺼내어 무게를 측정하였다.

실험 후의 마우스 귀의 사진(a)과 귀의 두께를 비교한 그래프(b)를 도 7에 나타내었다. 이에 따르면, 실험 진행 14일째 되는 날의 귀두께의 변화를 측정하였다. AD군은 CON군에 비해 242% 증가하였고, AD+Der군은 AD군에 비해 158%, AD+CA군은 174%, AD+CA_S군은 196% 증가하였다. CA군의 귀 두께는 CON군의 97%로 차이는 미미했다.

또한, 실험 후의 림프절의 사진(a)과 무게를 비교한 그래프(b)를 도 8에 나타내었다. 이에 따르면, AD군의 림프절의 무게는 CON군에 비해 939% 증가했고, AD+Der군은 398%, AD+CA군은 755%, AD+CA_S군은 871% 증가한 것으로 나타났다. CA군은 CON군의 95%로 차이는 미미하였다.

실험예 5: 아토피 모델 마우스의 귀 조직의 조직병리학적 변인 및 Mast cell의 관련성 검정

귀 조직의 조직학적 변화를 관찰하기 위해 귀조직을 잘라 10% formaldehyde 용액으로 24시간 동안 고정시킨 후 parraffin으로 포매하여 4㎛ 두께로 block을 만들었다. 절단된 슬라이스를 hematoxylin-eosin (H&E)와 toluidine blue로 염색한 후, 100배 확대율로 광학 현미경을 사용하여 검사 및 이미지화하여 표피와 진피의 두께와 비만세포(Mast cell)의 수를 측정하였다.

귀 조직 슬라이스의 hematoxylin-eosin (H&E) 염색된 광학 현미경 이미지를 도 9에 나타내었고, toluidine blue로 염색된 광학 현미경 이미지를 도 10에 나타내었다. 또한, 귀 조직의 표피(epiderma)와 진피(derma)의 두께를 측정한 결과를 도 11에 나타내었고, 비만세포의 수를 측정한 결과를 도 12에 나타내었다.

이에 따르면 표피(epiderma)의 경우, AD군은 CON군의 406% 증가하였고, AD+Der군은 CON군에 비해 195%, AD+CA_S군은 150%, AD+CA군은 208% 증가하였다. CA군은 CON군의 86%로 미미한 차이를 보였다.

또한, 진피(derma)의 경우, AD군은 CON군의 450% 증가하였고, AD+Der군은 CON군에 비해 188%, AD+CA_S군은 162%, AD+CA군은 198% 증가하였다. CA군은 CON군의 130% 증가하였다.

Mast cell 수의 경우, CON군 12.8±1.6, AD군 75±13.5, AD_Der군 22.2±5.5, AD+CA_S군 17±3.8, AD+CA군 26.2±2.9, CA군 9.8±3.1로 약물 처리한 그룹들은 AD군에 비교했을 때 큰 감소율을 나타냈다.

실험예 6: Real-time PCR에 의한 염증관련 사이토카인 검정

제조업체의 프로토콜에 따라 TRIzol을 사용하여 아토피 유도 모델 마우스 귀 조직으로부터 총 RNA를 단리하였다. 12.5 ㎕의 SYBR Premix Ex Taq (Takara, Tokyo, Japan) 및 2 ㎕의 cDNA를 주형으로 사용하여 최종 볼륨 25 ㎕를 만든 뒤 Real-time PCR을 3 회 수행하였다. PCR에 사용된 primer는 하기 표 2에 명시하였다. PCR 증폭은 혼합물을 95℃에서 15 분 동안 인큐베이팅한 후, 40회의 증폭 단계 동안 인큐베이션 하였다. 변성은 95

에서 30초 동안 수행되었다; annealing은 58~62℃의 전이 온도 범위에서 사이클 당 0.5℃씩 증가하면서 수행되었다; extention은 72℃에서 30초 동안 진행되었고, 각 사이클 후 72℃에서 형광 검출로 측정하였다. 최종 사이클 후, 모든 샘플의 융점 분석은 연속적인 형광 검출로 65~95℃의 범위 내에서 수행되었다. 표적 유전자 mRNA 수준을 하기 식을 사용하여 GAPDH 수준으로 표준화하였다: 상대 mRNA 발현 = 2^{_(ΔCt of target gene _ ΔCt of GAPDH)}, 여기서 Ct는 역치 사이클 값이다. 각각의 샘플에서, 분석된 유전자의 발현 수준을 GAPDH의 발현 수준으로 표준화하고 상대 mRNA 수준으로 제시하였다.

name	Forward	Reverse
GAPDH	5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'	5'-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3'
TNF-α	5'-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3'	5'-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3'
IL-10	5'-TCAGCTGTGTCTGGGCCACT-3'	5'-TTATGAGTAGGGACAGGAAGCCTCA-3'
IL-5	5'-ACAGGAGAAGGGACGCCAT-3'	5'-GAAGCCGTACAGACGAGCTCA-3'
IL-17	5'-TCCCCTCTGTCATCTGGGAAG-3'	5'-CTCGACCCTGAAAGTGAAGG-3'
iNOS	5'-GGAATGGAGACTGTCCCAGCA-3'	5'-GTCATGAGCAAAGGCGCAGA-3'

이에 따른 Real-time PCR에 의한 염증관련 사이토카인 검정 결과를 도 13에 나타내었다. 이에 따르면, TNF-α는 모든 실험군이 AD군에 비해 큰 감소량을 보여줬다. AD+Der군은 AD군의 34%, AD+CA_S군은 AD군의 17%, AD+CA군은 AD군의 7%의 수치로 유의적인 감소량을 보였다. 또한 IL-5와 iNOS 인자가 비슷한 경향을 보여줬다.

IL-5는 AD+Der군은 AD군의 33%, AD+CA_S군은 AD군의 17%, AD+CA군은 AD군의 8%로 측정되었고, iNOS는 AD+Der군은 AD군의 30%, AD+CA_S군은 AD군의 34%, AD+CA군은 AD군의 12%로 측정되었다.

IL-10의 경우 AD+CA_S군이 AD+Der군보다 더 높은 수치가 측정되었다. AD+Der군은 AD군의 20%로 측정되었고, AD+CA_S군은 AD군의 27%로 AD+Der군보다 약 7% 더 높은 수치가 측정되었다. AD+CA군은 AD군의 14%였다.

IL-17의 경우 다른 인자들에 비해서 변화가 크진 않았지만 AD군을 제외한 모든 군들이 AD군의 수치보다 낮게 나왔다. AD+Der군은 AD군의 81%, AD+CA_S군은 AD군의 91%, AD+CA군은 AD군의 84%으로 나타났다.

실험예 7: 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의한 항염증인자 변화 측정

아토피 유도 모델 마우스 귀조직을 RIPA 완충액으로 균질화하고 원심 분리 후, 소 혈청 알부민 (BSA)을 기준으로 Bio-Rad 단백질 키트를 사용하여 총 단백질 함량을 측정하였다. 단백질 샘플을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel로 전기 영동하고, polyvinylidene fluoride membranes에 옮기고 Tween- 20을 함유하는 트리스 완충 식염수 (TBS) 중의 5 % BSA로 차단시킨 후, 적절한 특정 일차 항체 (TNF-α, COX-2, MAC-1, IL-6, NF-κB, P-P38, P-ERK)를 처리하였다. 이어서 secondary goat anti-rabbit IgG (H+L) horseradish peroxidase (HRP) conjugate or goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate 함께 4시간 동안 인큐베이션 후에, 항원 - 항체 복합체는 향상된 화학 발광을 사용하여 가시화하였다. C-DiGit Blot Scanner (Li-COR, Lincoln, NE, USA)를 사용하여 블로팅된 멤브레인의 농도 측정하였다.

이에 따른 TNF-α, COX-2, MAC-1, IL-6 관련 인자 변화 측정 결과를 도 14에 나타내었다. 이에 따르면, 항염증 인자는 모두 AD군이 가장 높은 수치를 나타내었다. 먼저 TNF-α의 경우, AD군은 CON군에 비해 22.9배 증가하였고, AD+Der군은 11.3배, AD+CA_S군은 8.4배, AD+CA군은 14배 증가하였다. COX-2의 경우 AD군은 CON군에 비해 6배 증가하였고, AD+Der군은 3.5배, AD+CA_S군은 2배, AD+CA군은 3.4배 증가하였다. MAC-1인자에서는 AD군은 CON군에 비해 8.3배 증가하였고, AD+Der군은 5.8배, AD+CA_S군은 5.5배, AD+CA군은 5.3배 증가하였다. IL-6의 경우 AD군은 CON군에 비해 5.2배 증가하였고, AD+Der군은 1.8배, AD+CA_S군은 1.4배, AD+CA군은 1.4배 증가하였다.

또한, NF-

B와 MAPK관련 인자 변화 측정 결과를 도 15에 나타내었다. 이에 따르면, NF-κB의 경우, CON군과 AD군의 수치 차이가 0.01로 미미한 차이를 보였지만 AD+Der군, AD+CA_S군, AD+CA군은 각각 AD군에 비해 2.2배, 2.1배, 2.0배 증가하였고 CA단독군의 NF-κB 수치는 3.2배 증가하였다. 이에 반해, P-P38의 경우 AD군의 수치가 1.1로 가장 높았고, AD+Der군, AD+CA_S군, AD+CA군은 각각 AD군에 비해 0.49배, 0.68, 0.57배 감소하였다. 또한, P-ERK인자는 NF-κB와 비슷하게 CON군과 AD군의 수치 차이가 0.003으로 미미하였고, 0.81로 AD+Der군의 수치가 높았다. AD+CA_S군과 AD+CA군은 각각 0.04, 0.14의 수치를 보였다.

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

<110> centella farm <120> COMPOSITION FOR ANTI-ATOPIC, ANTI-OXIDANT OR ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY COMPRISING Centella asiatica AS AN EFFECTIVE INGREDIENT <130> HPC-9136 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward <400> 1 catggccttc cgtgttccta 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse <400> 2 tgtcatcata cttggcaggt ttct 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a Forward <400> 3 aagcctgtag cccacgtcgt a 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a Reverse <400> 4 ggcaccacta gttggttgtc tttg 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 Forward <400> 5 tcagctgtgt ctgggccact 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 Reverse <400> 6 ttatgagtag ggacaggaag cctca 25 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-5 Forward <400> 7 acaggagaag ggacgccat 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-5 Reverse <400> 8 gaagccgtac agacgagctc a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 Forward <400> 9 tcccctctgt catctgggaa g 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 Reverse <400> 10 ctcgaccctg aaagtgaagg 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS Forward <400> 11 ggaatggaga ctgtcccagc a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS Reverse <400> 12 gtcatgagca aaggcgcaga 20

Claims (4)

1. 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물은 탄소수 1-4의 알코올에 의해 추출된 것이고,
   상기 분획물은 헥산 및 에틸아세테이트 혼합용매의 분획물이고,
   상기 분획물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항아토피, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 굿 타이거 케어(GOOD TIGER CARE) 품종의 병풀나물 추출물은 탄소수 1-4의 알코올에 의해 추출된 것이고,
   상기 분획물은 헥산 및 에틸아세테이트 혼합용매의 분획물이고,
   상기 분획물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   [화학식 1]
   

   
3. 삭제
4. 삭제

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