TW202214683A - 結合b型肝炎病毒表面抗原的抗體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明屬於抗體技術領域,提供了一種與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)特異性結合的抗體或其抗原結合片段,包含該抗體或抗原結合片段的藥物組合物及其用途。另外,本發明還提供了編碼該抗體的核酸分子、包含該核酸分子的載體和宿主細胞,以及製備該抗體的方法。
Description
本發明屬於抗體技術領域,涉及一種結合B型肝炎病毒表面抗原的抗體,以及該抗體在治療與B型肝炎病毒感染相關的疾病中的用途。
B型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行,但不同地區HBV 感染的流行強度差異很大。據世界衛生組織報導,全球約20億人曾感染HBV,其中2.4億人為慢性HBV感染者,每年約有65萬人死於HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌(HCC)。全球肝硬化和HCC 患者中,由HBV感染引起的比例分別為30%和45%。我國肝硬化和HCC患者中,由HBV感染引起的比例分別為60%和80%。我國是慢性B型肝炎的人口大國,流調顯示目前尚有超過7%的人為B型肝炎病毒感染者,總人數接近1億人。截至2015年底,只有9%的B型肝炎病毒感染者得到了檢測和診斷;在診斷為B型肝炎病毒感染的患者中,僅有8%接受了治療(中國肝炎防治基金會數據)。他們不僅需要長期甚至終身治療,為家庭、社會帶來巨大負擔,而且還有發展成肝硬化、肝癌的危險。據測算,我國有2800萬慢性B型肝炎患者,每年新增近百萬肝硬化病人和約30萬肝癌病人。按照慢性肝炎患者5%的就診率和肝硬化、肝癌患者95%的就診率推算,我國每年用於治療B型肝炎相關的直接醫療費用達到800億元-1200億元。
B型肝炎患者經抗病毒治療後,雖可降低體內病毒載量,延緩嚴重疾病進程,但很多人不能完全清除B型肝炎病毒。B型肝炎患者需要長期服藥,患者經濟負擔嚴重。根據中國疾控動態公布的數據顯示,慢性肝炎患者的年平均診療費用占家庭年均總收入的56.24%,代償性肝硬化占81.53%,失代償性肝硬化占157.21%,肝癌占96.76%。沉重的經濟負擔造成很多患者或者放棄治療或者導致家庭因病返貧。此外,從近十餘年肝病的診療費用演變過程看,肝病的診療費用呈現逐年遞增勢態,每年增幅10%~20%左右,個人承擔部分也隨之增加。
研究顯示B型肝炎患者血液中大量存在的由HBsAg組成的亞病毒顆粒是抑制免疫系統使感染肝細胞無法清除的主要原因。依靠某種技術降低血液中HBsAg水平10-100倍,可激活人體自身的T細胞免疫,使得機體自身免疫系統可開始有效殺傷被感染肝細胞。因此有效降低血液中的HBsAg水平不但是B型肝炎重要的治癒標準之一,更是治療B型肝炎清除被感染細胞的前提。
最新的臨床研究結果顯示,經過核苷酸類似物治療清除病毒DNA的患者,如果HBsAg低於某個水平(如HBsAg <1500 IU/mL),其干擾素清除HBsAg的幾率可超過50%,遠大於我們通常認為的干擾素治癒率只有5-10%的比例。
但由於目前缺少有效降低HBsAg的藥物,絕大部分患者(超過90%)HBsAg水平均超過這個指標,導致干擾素無法治愈這些病人(這就是干擾素治愈率只有5-10%的原因)。這些新的臨床證據對降低HBsAg的治療方法有了更現實更迫切的需要。
目前研究發現降低B型肝炎病毒表面抗原主要有3種途徑:抑制HBsAg的表達(siRNA)、阻止HBsAg從細胞釋放(NAPs)、HBsAg抗體。
確定了用抗體技術降低HBsAg水平的研究方向,經過篩選我們已經獲得了多株抗體,體外研究表明本發明抗體可特異性結合HBsAg,動物模型研究結果顯示可有效降低HBsAg水平。
本發明要求享有2020年07月9日提交的中國申請202010659026.2,以及2020年7月10日提交的中國申請202010659828.3的優先權權益,其全部內容通過引用合併於此。
本發明的目的之一在於提供與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)特異性結合的抗體或其抗原結合片段。體外抗原親和力體外試驗證明了本申請的抗體具有特異性結合HBsAg的能力。而體內試驗進一步證明了本申請的抗體可以作為B型肝炎病毒(HBV)的中和抗體,有效降低HBsAg水平,抑制HBV增殖。
具體地,本發明涉及:
1、一種特異性結合B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變區(VH)序列和輕鏈可變區(VL)序列,其中:
所述重鏈可變區包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:
HCDR1: X1YX3FX5X6X7Y(SEQ ID NO:33),
HCDR2: X11NX13X14X15X16X17X18(SEQ ID NO:34),
HCDR3:ARDX21WX23X24X25X26DX28YGMDX33(SEQ ID NO:35);
所述輕鏈可變區包含如下所示的CDR氨基酸序列:
LCDR1: X34X35X36SX38X39(SEQ ID NO:36),
LCDR2:X40X41X42(SEQ ID NO:37),
LCDR3:QQSYSTPLX51(SEQ ID NO:38);
其中,X1、X3、X5、X6、X7、X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33、X34、X35、X36、X38、X39、X40、X41、X42、X51各選自任一種氨基酸。
2、項1的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中:
X1選自G或A,X3選自T、A或S,X5選自T、A或I,X6選自G、A、Y或D,X7選自Y或A,X11選自I或A,X13選自P或A,X14選自N、A或Y,X15選自S、A或N,X16選自G或A,X17選自G或A,X18選自T或A,X21選自L、V或A,X23選自N、Q或A,X24選自D、Q或A,X25選自D、G或A,X26選自V、G或A,X28選自Y或A,X33選自V或A,X34選自Q或A,X35選自S或A,X36選自I、A或V,X38選自T、A或S,X39選自Y或A,X40選自A、G、D、T或S,X41選自A或S,X42選自A或S,X51選自T或A。
3、項2的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中:
HCDR1中X1、X3、X5、X6和X7依次選自下述的任一種組合:
G、T、T、G、Y;A、T、T、G、Y;G、A、T、G、Y;G、T、A、G、Y;G、T、T、A、Y;G、T、T、G、A;G、S、I、G、Y;G、T、T、D、Y;G、T、T、Y、Y;
HCDR2中X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18依次選自下述的任一種組合:I、P、N、S、G、G、T;A、P、N、S、G、G、T;I、A、N、S、G、G、T;I、P、A、S、G、G、T;I、P、N、A、G、G、T;I、P、N、S、A、G、T;I、P、N、S、G、A、T;I、P、N、S、G、G、A;I、P、Y、N、G、G、T;
HCDR3中X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33依次選自下述的任一種組合:L、N、D、D、V、Y、V;A、N、D、D、V、Y、V;L、A、D、D、V、Y、V;L、N、A、D、V、Y、V;L、N、D、A、V、Y、V;L、N、D、D、A、Y、V;L、N、D、D、V、A、V;L、N、D、D、V、Y、A;V、Q、Q、G、G、Y、V;
LCDR1中X34、X35、X36、X38、X39依次選自下述的任一種組合:
Q、S、I、T、Y;A、S、I、T、Y;Q、A、I、T、Y;Q、S、A、T、Y;Q、S、I、A、Y;Q、S、I、T、A;Q、S、I、S、Y;Q、S、V、S、Y;
LCDR2中X40、X41、X42依次選自下述的任一種組合:
A、A、S;S、A、S;A、S、S;A、A、A;G、A、S;D、A、S;T、A、S;且,
LCDR3中的X51選自:T或A
4、項3的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中X1、X3、X5、X6、X7、X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33依次選自下表1中的任一種組合:
表1
抗體名稱 | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 |
021/005/062/079/095/096 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
083 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為Y,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為V,X23為Q,X24為Q,X25為G,X26為G,X28為Y,X33為V |
021-M1 | X1是A,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M3 | X1是G,X3為A,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M5 | X1是G,X3為T,X5為A,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M6 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為A,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M7 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為A | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M11 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為A,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M13 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為A,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M14 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為A,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M15 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為A、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M16 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為A,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M17 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為A,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M18 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為A | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M21 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為A,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M23 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為A,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M24 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為A,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M25 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為A,X26為V,X28為Y,X33為V |
021-M26 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為A,X28為Y,X33為V |
021-M28 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為A,X33為V |
021-M33 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為A |
088 | X1是G,X3為S,X5為I,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為Y,X15為N、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
090/091/093 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為D,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V |
5、項3或4的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中X34、X35、X36、X38、X39、X40、X41、X42、X51依次選自下表2中的任一種組合:
表2
抗體名稱 | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 |
021/083 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M34 | X34為A,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M35 | X34為Q,X35為A,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M36 | X34為Q,X35為S,X36為A,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M38 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為A,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M39 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為A | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M40 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為S,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M41 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為S,X42為S | X51為T |
021-M42 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為A | X51為T |
021-M51 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為A |
005/062/079/088/095 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為S,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
090 | X34為Q,X35為S,X36為V,X38為S,X39為Y | X40為G,X41為A,X42為S | X51為T |
091 | X34為Q,X35為S,X36為V,X38為S,X39為Y | X40為D,X41為A,X42為S | X51為T |
093 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為S,X39為Y | X40為D,X41為A,X42為S | X51為T |
096 | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為S,X39為Y | X40為T,X41為A,X42為S | X51為T |
6、項3的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中X1、X3、X5、X6、X7、X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33、X34、X35、X36、X38、X39、X40、X41、X42、X51依次選自下表3中的任一種組合:
表3
抗體 | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 |
021 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M1 | X1為A,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M3 | X1為G,X3為A,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M5 | X1為G,X3為T,X5為A,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M6 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為A,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M7 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為A | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M11 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為A,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M13 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為A,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M14 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為A,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M15 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為A、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I, X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M16 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為A,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M17 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為A,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I, X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M18 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為A | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M21 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為A,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M23 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為A,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M24 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為A,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M25 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為A,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M26 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為A,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M28 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為A,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M33 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為A | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M34 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為A,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M35 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為A,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M36 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為A,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M38 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為A,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M39 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為A | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M40 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為S,X41為A,X42為S | X51為T |
021-M41 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為S,X42為S | X51為T |
021-M42 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為A | X51為T |
021-M51 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為A |
005/062/079/095 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為S,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
083 | X1為G,X3為T,X5為T,X6為Y,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為V,X23為Q,X24為Q,X25為G,X26為G,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為T,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
088 | X1是G,X3為S,X5為I,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為Y,X15為N、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為S,X39為Y | X40為A,X41為A,X42為S | X51為T |
090 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為D,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為V,X38為S,X39為Y | X40為G,X41為A,X42為S | X51為T |
091 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為D,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為V,X38為S,X39為Y | X40為D,X41為A,X42為S | X51為T |
093 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為D,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為S,X39為Y | X40為D,X41為A,X42為S | X51為T |
096 | X1是G,X3為T,X5為T,X6為G,X7為Y | X11為I,X13為P,X14為N,X15為S、X16為G,X17為G,X18為T | X21為L,X23為N,X24為D,X25為D,X26為V,X28為Y,X33為V | X34為Q,X35為S,X36為I,X38為S,X39為Y | X40為T,X41為A,X42為S | X51為T |
在一些實施方案中,在所述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段中,所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:25所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:20所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:24所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:25所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:18所示的HCDR1,如SEQ ID NO:22所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:27所示的LCDR1;如SEQ ID NO:29所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:27所示的LCDR1;如SEQ ID NO:30所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:30所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:31所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3。
7、項1至6中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,包含人類通用框架區(FR)。在一些實施方案中,所述VH包含人類亞組III通用框架區(FR)。在一些實施方案中,所述VL包含人類亞組κI通用框架。在一些實施方案中,包含人類通用框架區(FR)和在人類通用框架區(FR)基礎上的一個或多個氨基酸取代。
在一些實施方案中,所述框架區為人類通用框架區,並且包含一個或多個(例如1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3個)氨基酸取代。在一些實施方案中,所述框架區為人類通用框架區或與人類通用框架區具有70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%同一性。在本發明的一些示例性實施方案中,所述VH包含如下所示的FR氨基酸序列:
HFR1:Z1Z2Z3LZ4Z5SGAEVKKPGASZ6KVSCKAS(SEQ ID NO:39)
HFR2:Z7HWVRQAPGQGZ8EWMGW(SEQ ID NO:40)
HFR3:NYAQKFQGRVTZ9TZ10DZ11SZ12STAYMELSZ13LRSZ14DTAVYYC(SEQ ID NO:41)
HFR4:WGZ15GTZ16VTVSS(SEQ ID NO:42)
VL包含如下所示的FR氨基酸序列:
LFR1:Z17Z18Z19LTQSPZ20Z21LSZ22SZ23GZ24RZ25TZ26Z27CRAS(SEQ ID NO:43)
LFR2:LZ28WYQQKPGZ29APZ30LLIZ31(SEQ ID NO:44)
LFR3:Z32Z33Z34Z35GZ36PZ37RFSGSGSGTZ38FTLTIZ39SLZ40Z41Z42DZ43ATYYC(SEQ ID NO:45)
LFR4:FGZ44GTZ45Z46Z47IKR(SEQ ID NO:46)
其中,Z1-Z47各選自任一種氨基酸。
8、項7的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中,
Z1選自Q或E,Z2選自V或I,Z3選自Q或T,Z4選自V或K,Z5選自E或Q,Z6選自V或M,Z7選自M、I或L,Z8選自L或P,Z9為M或I,Z10為R或A,Z11為T或K,Z12為I或T,Z13為R或S,Z14為D或E,Z15選自K或Q,Z16選自L或M,Z17選自D或E,Z18選自I或T,Z19選自Q、T或V,Z20選自S、A或G,Z21選自S或T,Z22選自A或L,Z23選自V或P,Z24選自D或E,Z25選自V或A,Z26選自I或L,Z27選自T或S,Z28選自N或A,Z29選自K或Q,Z30選自K、Q或R,Z31選自Y或S,Z32選自S或N,Z33選自L或R,Z34選自Q或A,Z35選自S或T,Z36選自V或I,Z37選自S或A,Z38選自D或E,Z39為S或R,Z40選自Q或E,Z41選自P或S,Z42選自E或G,Z43選自F或L,Z44選自G、Q或P,Z45選自K或R,Z46選自V或L,Z47選自D或E。
9、項8的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中:
HFR1中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6依次選自下述的任一種組合:Q、V、Q、V、E、V;E、V、Q、V、Q、V;E、V、Q、V、E、V;Q、I、T、K、E、V;E、V、Q、V、Q、M;
HFR2中Z7、Z8依次選自下述的任一種組合:M、L;L、L;I、P;
HFR3中Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14的組合為:M、R、T、I、R、D;或I,A,K,T,S,E
HFR4中Z15、Z16依次選自下述的任一組合:K、L;Q、M;Q、L;或K、M;
10、項8或9的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中:
LFR1中Z17、Z18、Z19、Z20、Z21、Z22、Z23、Z24、Z25、Z26、Z27依次選自下述的任一種組合:D、I、Q、S、S、A、V、D、V、I、T;E、I、V、G、T、L、P、E、A、L、S;E、I、V、A、T、L、P、E、A、L、S;E、T、T、S、T、A、V、D、V、I、T;
LFR2中Z28、Z29、Z30、Z31依次選自下述的任一種組合:N、K、K、Y;A、Q、R、Y;N、K、K、S;N、K、Q、Y;
LFR3中Z32、Z33、Z34、Z35、Z36、Z37、Z38、Z39、Z40、Z41、Z42、Z43依次選自下述的任一種組合:S、L、Q、S、V、S、D、S、Q、P、E、F;S、R、A、T、I、A、E、S、Q、S、E、F;N、R、A、T、I、A、D、S、E、P、E、F;S、L、Q、S、V、S、E、R、Q、P、E、F;S、L、Q、S、V、S、D、S、Q、P、G、L;
LFR4中Z44、Z45、Z46、Z47依次選自下述的任一種組合:G、K、V、D;G、K、L、E;P、K、V、E;G、K、V、E;Q、R、L、E;
11、項10的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中Z1-Z16依次選自下表4的任一種組合:
表4
抗體 | HFR1 | HFR2 | HFR3 | HFR4 |
021/079 | Z1為Q,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為E,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為L |
005/095/096 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為Q,Z16為M |
062 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為E,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為Q,Z16為L |
083 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為I,Z10為A,Z11為K,Z12為T,Z13為S,Z14為E | Z15為K,Z16為L |
088 | Z1為Q,Z2為I,Z3為T,Z4為K,Z5為E,Z6為V | Z7為L,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為L |
090/091/093 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為M | Z7為I,Z8為P | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為M |
12、項8至11中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中Z17-Z47依次選自下表5的任一種組合:
表5
抗體 | LFR1 | LFR2 | LFR3 | LFR4 |
021/083 | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為V,Z47為D |
005/062/079/088 | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為L,Z47為E |
090 | Z17為E,Z18為I,Z19為V, Z20為G,Z21為T, Z22為L,Z23為P,Z24為E, Z25為A,Z26為L,Z27為S | Z28為A,Z29為Q, Z30為R,Z31為Y | Z32為S,Z33為R,Z34為A,Z35為T, Z36為I,Z37為A, Z38為E,Z39為S, Z40為Q,Z41為S,Z42為E,Z43為F | Z44為P,Z45為K,Z46為V,Z47為E |
091 | Z17為E,Z18為I,Z19為V, Z20為A,Z21為T, Z22為L,Z23為P,Z24為E, Z25為A,Z26為L,Z27為S | Z28為A,Z29為Q, Z30為R,Z31為Y | Z32為N,Z33為R,Z34為A,Z35為T, Z36為I,Z37為A, Z38為D,Z39為S, Z40為E,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為V,Z47為D |
093 | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為E,Z39為R, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為L,Z47為E |
095 | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為S | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為G,Z43為L | Z44為G,Z45為K,Z46為V,Z47為E |
096 | Z17為E,Z18為T,Z19為T, Z20為S,Z21為T, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為Q,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為Q,Z45為R,Z46為L,Z47為E |
13、項8的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,Z1-Z47依次選自下表6中的任一種組合:
表6
抗體 | HFR1 | HFR2 | HFR3 | HFR4 | LFR1 | LFR2 | LFR3 | LFR4 |
021 | Z1為Q,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為E,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為L | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為V,Z47為D |
005 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為Q,Z16為M | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為L,Z47為E |
062 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為E,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為Q,Z16為L | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為L,Z47為E |
079 | Z1為Q,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為E,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為L | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為L,Z47為E |
083 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為I,Z10為A,Z11為K,Z12為T,Z13為S,Z14為E | Z15為K,Z16為L | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為V,Z47為D |
088 | Z1為Q,Z2為I,Z3為T,Z4為K,Z5為E,Z6為V | Z7為L,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為L | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為L,Z47為E |
090 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為M | Z7為I,Z8為P | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為M | Z17為E,Z18為I,Z19為V, Z20為G,Z21為T, Z22為L,Z23為P,Z24為E, Z25為A,Z26為L,Z27為S | Z28為A,Z29為Q, Z30為R,Z31為Y | Z32為S,Z33為R,Z34為A,Z35為T, Z36為I,Z37為A, Z38為E,Z39為S, Z40為Q,Z41為S,Z42為E,Z43為F | Z44為P,Z45為K,Z46為V,Z47為E |
091 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為M | Z7為I,Z8為P | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為M | Z17為E,Z18為I,Z19為V, Z20為A,Z21為T, Z22為L,Z23為P,Z24為E, Z25為A,Z26為L,Z27為S | Z28為A,Z29為Q, Z30為R,Z31為Y | Z32為N,Z33為R,Z34為A,Z35為T, Z36為I,Z37為A, Z38為D,Z39為S, Z40為E,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為V,Z47為D |
093 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為M | Z7為I,Z8為P | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為M | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為E,Z39為R, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為L,Z47為E |
095 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為Q,Z16為M | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為S | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為G,Z43為L | Z44為G,Z45為K,Z46為V,Z47為E |
096 | Z1為E,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為Q,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為Q,Z16為M | Z17為E,Z18為T,Z19為T, Z20為S,Z21為T, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為Q,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為Q,Z45為R,Z46為L,Z47為E |
14、項1的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中VH序列選自選自SEQ ID NO:1-6中的任一序列,或與SEQ ID NO:1-6中的任一序列具有至少80%、85%、90%、95%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
15、項1或14的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中VL序列選自SEQ ID NO:7-13中的任一序列,或與SEQ ID NO:7-13中的任一序列具有至少80%、85%、90%、95%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
16、項1至15任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中VH序列與VL序列選自如下任一組:
SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6與SEQ ID NO:7、與上述VH序列或VL序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
17、項1至16中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其選自:Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、Fv、Fd、dAb、雙體抗體(diabody)、或多體抗體(multibody)。
18、項1至17中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體為全人源抗體、人源化抗體、鼠源抗體、嵌合抗體或奈米抗體。
19、項1至18中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其進一步包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區,其中,所述重鏈恆定區選自IgG的重鏈恆定區,所述輕鏈恆定區選自κ鏈或λ鏈。
20、項19的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中重鏈恆定區為人IgG1的重鏈恆定區。在一些實施方案中,所述重鏈恆定區包含如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列,或包含與SEQ ID NO:14具有70%或以上序列同一性的氨基酸序列(例如75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列)。
21、項19或20的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中輕鏈恆定區源自人κ鏈。在一些實施方案中,所述輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列,或包含與SEQ ID NO:15具有70%或以上序列同一性的氨基酸序列(例如75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列)。
22、項1至21中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其為單特異性抗體、雙特異性抗體、或多特異性抗體。
23、一種分離的核酸分子,其包含編碼項1至22中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列。
24、一種構建體,其包含項中的核酸分子,所述構建體選自:質粒、噬菌粒、病毒載體、或線性核酸。
25、一種病毒、噬菌體或細胞,其表達項1-22中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,或包含項23中的核酸或項24中的構建體。
26、一種藥物組合物,其包含:項1至22中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、項23中的核酸、項24中的構建體、或項25中的病毒、噬菌體或細胞。
27、一種試劑盒,其包含:項1至22中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、項23中的核酸、項24中的構建體、或項25中的病毒、噬菌體或細胞。
28、一種治療或預防B型肝炎病毒(HBV)感染,或緩解B型肝炎症狀的方法,其包含向患者施用有效量的項26中的藥物組合物。
29、一種檢測HBV的方法,包括使項1至22中任一項的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、項23中的核酸、項24中的構建體、或項25中的病毒、噬菌體與來自受試者的體液接觸。
30、項29的方法,其中所述體液為受試者的血漿或血清。
本發明旨在提供一種全新的可與B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)特異性結合的抗體或其抗原結合片段,其通過所述結合降低患者血液中HBsAg的表達水平,激活人體自身的T細胞免疫,使得機體自身免疫系統得以開始有效殺傷被感染的肝細胞,抑制HBV增殖。通過所述特異性結合的抗體或其抗原結合片段,本申請為HBV的防治提供了新的選項和思路,同時為HBV的檢測和診斷提供了新的工具。
定義
如本文所用,術語“抗體”也稱為“免疫球蛋白”,涵蓋具有天然抗體結構特徵的抗體和具有不同於天然抗體的結構特徵但表現出對抗原分子的結合特異性的抗體樣分子。術語抗體旨在包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段,即含有抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)或亞型(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和 IgA2)。
在本文中,抗體的“抗原結合片段”可以通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶促切割或化學切割產生。抗原結合片段尤其包括Fab、Fab’、F(ab’)2、FV、dAb和互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、單結構域抗體、嵌合抗體、雙體抗體和這樣的多肽,其至少含有免疫球蛋白足以賦予該多肽特異性抗原結合的部分。本文所述的抗原抗體片段實例包括但不限於:(i)具有VL、CL、VH和CH1結構域的Fab片段;(ii)Fab’片段,即在CH1結構域的C末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段;(iii)具有VH和CH1結構域的Fd片段;(iv)具有VH和CH1結構域以及在CH1結構域的C-末端的一個或多個半胱氨酸殘基的Fd’片段;(v)具有抗體單臂的VL和VH結構域的Fv片段;(vi)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等,Nature 341,544-546(1989));(vii)分離的CDR區;(viii)F(ab’)2片段,包含在鉸鏈區通過二硫鍵橋接的兩個Fab’片段的二價片段;(ix)單鏈抗體分子(例如,單鏈Fv;scFv) (Bird等,Science 242:423-426(1988);和Huston等,PNAS(USA)85:5879-5883(1988));(x)具有兩個抗原結合位點的“雙抗體”,其包含與同一多肽鏈中的輕鏈可變區(VL)連接的重鏈可變區(VH)(參見,例如,EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等,Pr℃.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993));(xi)“線性抗體”,其包含一對串聯Fd區段(VH-CH1-VH-CH1),所述Fd區段與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等,Protein Eng .8(10):1057-1062(1995);和美國專利No.5,641,870)。
術語“重鏈”(“CH”)、“輕鏈”(“CL”)、“輕鏈可變區”(“VL”)、“重鏈可變區”(“VH”)、“框架區”(“FR”)是指天然存在的免疫球蛋白中的結構域和合成(例如重組)結合蛋白(例如人源化抗體)的相應結構域。天然存在的免疫球蛋白(例如 IgG)的基本結構單元是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體。每條鏈的氨基末端(“N”)部分包括主要負責抗原識別的約100至110個或更多個氨基酸的可變區。羧基末端(每條鏈的“C”部分定義了一個恆定區,輕鏈具有單個恆定區,重鏈通常具有三個恆定區和一個鉸鏈區。因此,天然存在的輕鏈結構IgG分子為N'-VL-CL-C',IgG重鏈結構為N'-VH-CH1-H-CH2-CH3-C'(其中H為鉸鏈區)。IgG分子的可變區包含互補決定區(CDR),其負責識別與接觸抗原,非CDR片段,即框架區(FR),框架區維持可變區結構並決定 CDR 環的位置。因此,VL和VH域具有結構N'-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C'。在本申請中,VH的3個CDR分別稱為HCDR1、HCDR2、和HCDR3;VH的4個框架區分別稱為HFR1、HFR2、HFR3、HFR4;VL的3個CDR分別稱為LCDR1、LCDR2、和LCDR3;VL的4個框架區分別稱為LFR1、LFR2、LFR3、LFR4。
在本申請中,所述CDR和FR根據ImMunoGeneTics(IMGT)編號系統(參見, 例如, Lefranc M. P. The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T-cell receptors, and Ig-like domains. The immunologist 7, 132-136,1999 (1999)))進行確定。
在本文中,術語“奈米抗體”,即僅由抗體重鏈的可變區組成的單域抗體。由於其相對分子尺寸為奈米級,故被稱為奈米抗體。奈米抗體能像正常抗體一樣與抗原緊密結合,但不像單鏈抗體那樣容易相互粘連聚集成塊。術語“單域抗體”是由一個可變區或一個僅協助靶標結合的工程化的恆定結構域組成的獨立的抗原結合單元。術語“雙體抗體”是scFv 的二聚體,兩個 scFv 片段通過 VH 和 VL 結構域的鏈間配對(交叉配對)共表達形成雙體抗體。同樣的,由多條scFv形成的多聚體稱為多體抗體。例如,由三條scFv形成的三體抗體,由四條scFv形成的四體抗體等。其中,各scFv可以具有相同的抗原特異性,也可以具有不同的抗原特異性。
如本文所用,“單特異性抗體”、“雙特異性抗體”和“多特異性抗體”分別指可以與一個、兩個和多個不同抗原或同一抗原的一個、兩個和多個不同抗原表位相結合的單個抗體分子。
如本文所用,術語“嵌合抗體”是指組合有來自不同物種的抗體片段的抗體。具體的,例如來自一個物種(例如小鼠)的一種單克隆抗體,其Fc恆定區經由DNA重組技術替換為來自一個物種(例如人)的Fc恆定區。參見例如專利申請PCT/US86/02269;EP/173,494。
如本文所用,術語“人源化抗體”是指包含人免疫球蛋白框架區和來自非人(例如小鼠、大鼠、兔或合成)免疫球蛋白的一個或多個CDR的抗體。除CDR以外,人源化抗體中的所有其他部分與天然人免疫球蛋白序列的相應部分基本相同。通過基因工程構建人源化抗體的方法參見例如專利申請US/5,585,089。
如本文所用,術語“全人源抗體”旨在包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。本技術的全人源抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如,通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。然而,如本文所用,術語“全人源抗體”不旨在包括其中源自另一哺乳動物物種(例如兔)的種系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗體。因此,如本文所用,術語“全人源抗體”是指其蛋白質分子的幾乎各個部分(例如,CDR、FR、CL、HC結構域(例如,CH1、CH2、CH3)、鉸鏈、VL、VH )在人體中幾乎無免疫原性,其相對於人天然免疫球蛋白只有很小的序列變化或變異。因此,全人源抗體不同於嵌合或人源化抗體。需要指出的是,全人源抗體可由能夠表達功能重排的人免疫球蛋白(例如重鏈和/或輕鏈)基因的非人動物或原核或真核細胞產生。
如本文所用,術語“特異性結合”是指由抗原決定簇和抗體分子可變區空間構象決定的以高親和力互補結合的特性。這種高親和力決定了所述抗體分子一旦與所述抗原結合,便可發揮其相應的生理功能,例如,在本申請的一些實施例中,所述抗體結合並幫助清除所述抗原的功能。
“人類通用框架”為代表在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常存在的氨基酸殘基的框架。一般而言,人類免疫球蛋白VL或VH序列選自於可變域序列的亞組。一般而言,序列亞組為如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5 版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亞組。在一些實施方案中,對於VL而言,所述亞組為如Kabat等人(同上)描述的亞組κI。在一些實施方案中,對於VH而言,所述亞組為如Kabat等人(同上)描述的亞組III。
兩氨基酸序列或核苷酸序列間的“同源性”或“同一性”指兩序列間氨基酸殘基或核苷酸殘基完全相同的百分數。如果待相互比較的兩序列長度有別,則序列“同源性”或“同一性”優選是指較短序列中與較長序列氨基酸殘基或核苷酸殘基完全相同的核苷酸殘基的百分數。序列同一性可以通過使用本領域常用的序列分析軟件,諸如Wisconsin序列分析包等常規確定。
本申請中,術語“多核苷酸”或“核酸”、“核酸分子”可互換使用,包括但不限於DNA、RNA、cDNA(互補DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖體RNA)、shRNA(小髮夾RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微小RNA)、基因組DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA。
如本文所用,“構建體”是指通過其可以將多核苷酸序列(例如外來基因)引入宿主細胞中,以轉化宿主並促進引入序列的表達(例如轉錄和翻譯)的載體,包括質粒、噬菌粒、病毒載體等。
如本文所用,術語“噬菌粒”是絲狀噬菌體衍生的載體,其基本成分主要包括質粒的複製起點、選擇標記、基因間隔區(IG區),通常還包含負鏈和正鏈的包裝序列和複製起點、噬菌體外殼蛋白的基因、限制性內切酶識別位點、啓動子和編碼信號肽的DNA片段。此外,噬菌粒還可以包含一個分子標簽,以方便篩選基於噬菌粒的文庫。噬菌粒無法獨立完成子代噬菌體顆粒的組裝,完成其生命周期所需的其他結構和功能蛋白質由輔助噬菌體提供。而輔助噬菌體是一種自身DNA複製效率極低的絲狀噬菌體突變型,因此輔助噬菌體與噬菌粒包裝形成的噬菌體共同感染宿主菌時,可包裝大量含有噬菌粒的噬菌體,而僅包裝少量輔助噬菌體。
如本文所用,“質粒”是指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體(或擬核)以外的DNA分子,存在於細胞質或細胞核中,具有自主複製能力,使其在子代細胞中也能保持恆定的拷貝數,並表達所攜帶的遺傳信息。
如本文所用,“病毒載體”是指以病毒為基礎的基因載體,是一種經過基因工程改造的病毒基因組,其可攜帶外源基因和相關基因元件,並被包裝成病毒顆粒,通過病毒侵染將其攜帶的外源基因導入細胞中。
除非本文另外定義,否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。
抗體或其抗原結合片段
一方面,本申請提供了一種特異性結合B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗體或其抗原結合片段。通常本申請的抗體包含重鏈可變區(VH)序列和輕鏈可變區(VL)序列,其中:
所述重鏈可變區包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列通式:
HCDR1: X1YX3FX5X6X7Y(SEQ ID NO:33),
HCDR2: X11NX13X14X15X16X17X18(SEQ ID NO:34),
HCDR3:ARDX21WX23X24X25X26DX28YGMDX33(SEQ ID NO:35);
所述輕鏈可變區包含如下所示的CDR氨基酸序列:
LCDR1: X34X35X36SX38X39(SEQ ID NO:36),
LCDR2:X40X41X42(SEQ ID NO:37),
LCDR3:QQSYSTPLX51(SEQ ID NO:38);
其中,X1、X3、X5、X6、X7、X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33、X34、X35、X36、X38、X39、X40、X41、X42、X51均可選自任一種氨基酸。所述任一種氨基酸可以為20種天然氨基酸中的任一種,也可為人工合成或改造的氨基酸。
其中HCDR1、HCDR2、HCDR3表示重鏈可變區中的三個CDR,且其從重鏈可變區的N’端到C’端依次排列。同樣LCDR1、LCDR2、LCDR3表示輕鏈可變區中的三個CDR,且其從輕鏈可變區的N’端到C’端依次排列。
本申請的實施例中,挑選了部分氨基酸對所述通式提供的CDR進行檢測,包括:當X1為G或A時,X3為T、A或S時,X5為T、A或I時,X6為G、A、Y或D時,X7為Y或A時,X11為I或A時,X13為P或A時,X14為N、A或Y時,X15為S、A或N時,X16為G或A時,X17為G或A時,X18為T或A時,X21為L、A、或V時,X23為N、Q或A時,X24為D、Q或A時,X25為D、G或A時,X26為V、G或A時,X28為Y或A時,X33為V或A時,X34為Q或A時,X35為S或A時,X36為I、A或V時,X38為T、A或S時,X39為Y或A時,X40為A、G、D、T或S時,X41為A或S時,X42為A或S時,X51為T或A時。其檢測結果證實包含所述通式的本申請的抗體可特異性結合HBsAg。
本領域技術人員應當知曉,所述通式中各Xn(其中n代表通式中各X的整數角標)的各個取值均可互相組合。例如,在一些實施方案中,HCDR1中X1、X3、X5、X6和X7依次選自下述的任一種組合:G、T、T、G、Y;A、T、T、G、Y;G、A、T、G、Y;G、T、A、G、Y;G、T、T、A、Y;G、T、T、G、A;G、S、I、G、Y;G、T、T、D、Y;G、T、T、Y、Y。在一些特定的實施方案中,HCDR1選自GYTFTGYY(SEQ ID NO:17); GYSFIGYY(SEQ ID NO:18);GYTFTDYY(SEQ ID NO:19);GYTFTYYY(SEQ ID NO:20)。
HCDR2中X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18依次選自下述的任一種組合:I、P、N、S、G、G、T;A、P、N、S、G、G、T;I、A、N、S、G、G、T;I、P、A、S、G、G、T;I、P、N、A、G、G、T;I、P、N、S、A、G、T;I、P、N、S、G、A、T;I、P、N、S、G、G、A;I、P、Y、N、G、G、T。在一些特定的實施方案中,HCDR2選自INPNSGGT(SEQ ID NO:21);INPYNGGT(SEQ ID NO:22)。
HCDR3中X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33依次選自下述的任一種組合:L、N、D、D、V、Y、V;A、N、D、D、V、Y、V;L、A、D、D、V、Y、V;L、N、A、D、V、Y、V;L、N、D、A、V、Y、V;L、N、D、D、A、Y、V;L、N、D、D、V、A、V;L、N、D、D、V、Y、A;V、Q、Q、G、G、Y、V。在一些特定的實施方案中,HCDR3為ARDLWNDDVDYYGMDV(SEQ ID NO:23)或ARDVWQQGGYYYYMDV(SEQ ID NO:24)。
LCDR1中X34、X35、X36、X38、X39依次選自下述的任一種組合:Q、S、I、T、Y;A、S、I、T、Y;Q、A、I、T、Y;Q、S、A、T、Y;Q、S、I、A、Y;Q、S、I、T、A;Q、S、I、S、Y;Q、S、V、S、Y。在一些特定的實施方案中,LCDR1選自QSISTY(SEQ ID NO:25);QSISSY(SEQ ID NO:26);QSVSSY(SEQ ID NO:27)。
LCDR2中X40、X41、X42依次選自下述的任一種組合:A、A、S;S、A、S;A、S、S;A、A、A;G、A、S;D、A、S;T、A、S;在一些特定的實施方案中,LCDR2選自AAS(SEQ ID NO:28);GAS(SEQ ID NO:29);DAS(SEQ ID NO:30);TAS(SEQ ID NO:31)。
LCDR3中的X51選自:T或A。在一些特定的實施方案中,LCDR3為QQSYSTPLT(SEQ ID NO:32)。
在一些實施方案中,所述VH包含:
如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3;或
如SEQ ID NO:20所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:24所示的HCDR3;或
如SEQ ID NO:18所示的HCDR1,如SEQ ID NO:22所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3;或
如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3。
在一些實施方案中,所述VL包含:
如SEQ ID NO:25所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
如SEQ ID NO:27所示的LCDR1;如SEQ ID NO:29所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
如SEQ ID NO:27所示的LCDR1;如SEQ ID NO:30所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:30所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:31所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3。
在一些實施方案中,所述特異性結合B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變區(VH)序列和輕鏈可變區(VL)序列,其中:
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:25所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:20所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:24所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:25所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:18所示的HCDR1,如SEQ ID NO:22所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:27所示的LCDR1;如SEQ ID NO:29所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:27所示的LCDR1;如SEQ ID NO:30所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:30所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或
所述VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:31所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;
其中任選一種組合後,便可根據上述通式確定一組CDR的具體序列。HCDR1、HCDR2、HCDR3的具體序列又可進一步組成具體的重鏈CDR組合,例如前述表1中的組合。同樣的,LCDR1、LCDR2、LCDR3的具體序列又可進一步組成具體的輕鏈CDR組合,例如前述表2中的組合。HCDR的組以及LCDR的組亦可進行隨機組合。例如,在一些特定的實施方案中,輕鏈與重鏈的CDR組合如前述表3中所示。
此外,在一些實施方案中,所述特異性結合HBsAg的抗體在各CDR區的兩側還包含框架區(FR),所述框架區為人類通用框架區,或者是包含至少一個氨基酸取代、缺失或插入的人類通用框架區。在一個示例性的方案中,VH包含如下所示的FR氨基酸序列:
HFR1:Z1Z2Z3LZ4Z5SGAEVKKPGASZ6KVSCKAS(SEQ ID NO:39)
HFR2:Z7HWVRQAPGQGZ8EWMGW(SEQ ID NO:40)
HFR3:NYAQKFQGRVTZ9TZ10DZ11SZ12STAYMELSZ13LRSZ14DTAVYYC(SEQ ID NO:41)
HFR4:WGZ15GTZ16VTVSS(SEQ ID NO:42)
VL包含如下所示的FR氨基酸序列:
LFR1:Z17Z18Z19LTQSPZ20Z21LSZ22SZ23GZ24RZ25TZ26Z27CRAS(SEQ ID NO:43)
LFR2:LZ28WYQQKPGZ29APZ30LLIZ31(SEQ ID NO:44)
LFR3:Z32Z33Z34Z35GZ36PZ37RFSGSGSGTZ38FTLTIZ39SLZ40Z41Z42DZ43ATYYC(SEQ ID NO:45)
LFR4:FGZ44GTZ45Z46Z47IKR(SEQ ID NO:46)其中,Z1-Z47各選自任一種氨基酸。所述任一種氨基酸可以為20種天然氨基酸中的任一種,也可為人工合成或改造的氨基酸。
其中HFR1、HFR2、HFR3、HFR4表示重鏈可變區中的4個FR,且其從重鏈可變區的N’端到C’端依次排列。同樣LFR1、LFR2、LFR3、LFR4表示輕鏈可變區中的4個FR,且其從輕鏈可變區的N’端到C’端依次排列。
在本申請的實施例中,挑選了部分氨基酸以構成具體的FR序列,通過與前述CDR進行隨機匹配,以檢測所述FR氨基酸序列的通式對CDR構象的支持作用,所選擇的氨基酸包括,例如:
Z1選自Q或E,Z2選自V或I,Z3選自Q或T,Z4選自V或K,Z5選自E或Q,Z6選自V或M,Z7選自M、I或L,Z8選自L或P,Z9為M或I,Z10為R或A,Z11為T或K,Z12為I或T,Z13為R或S,Z14為D或E,Z15選自K或Q,Z16選自L或M,Z17選自D或E,Z18選自I或T,Z19選自Q、T或V,Z20選自S、A或G,Z21選自S或T,Z22選自A或L,Z23選自V或P,Z24選自D或E,Z25選自V或A,Z26選自I或L,Z27選自T或S,Z28選自N或A,Z29選自K或Q,Z30選自K、Q或R,Z31選自Y或S,Z32選自S或N,Z33選自L或R,Z34選自Q或A,Z35選自S或T,Z36選自V或I,Z37選自S或A,Z38選自D或E,Z39為S或R,Z40選自Q或E,Z41選自P或S,Z42選自E或G,Z43選自F或L,Z44選自G、Q或P,Z45選自K或R,Z46選自V或L,Z47選自D或E。
在一些實施方案中,HFR1中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6依次選自下述的任一種組合:Q、V、Q、V、E、V;E、V、Q、V、Q、V;E、V、Q、V、E、V;Q、I、T、K、E、V;E、V、Q、V、Q、M; HFR2中Z7、Z8依次選自下述的任一種組合:M、L;L、L;I、P;HFR3中Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14的組合為:M、R、T、I、R、D;或I,A,K,T,S,E;HFR4中Z15、Z16的組合為:K、L;Q、M;Q、L;或K、M。在一些實施方案中,所述LFR1中Z17、Z18、Z19、Z20、Z21、Z22、Z23、Z24、Z25、Z26、Z27依次選自下述的任一種組合:D、I、Q、S、S、A、V、D、V、I、T;E、I、V、G、T、L、P、E、A、L、S;E、I、V、A、T、L、P、E、A、L、S;E、T、T、S、T、A、V、D、V、I、T。在一些實施方案中,LFR2中Z28、Z29、Z30、Z31依次選自下述的任一種組合:N、K、K、Y;A、Q、R、Y;N、K、K、S;N、K、Q、Y。在一些實施方案中,LFR3中Z32、Z33、Z34、Z35、Z36、Z37、Z38、Z39、Z40、Z41、Z42、Z43依次選自下述的任一種組合:S、L、Q、S、V、S、D、S、Q、P、E、F;S、R、A、T、I、A、E、S、Q、S、E、F;N、R、A、T、I、A、D、S、E、P、E、F;S、L、Q、S、V、S、E、R、Q、P、E、F;S、L、Q、S、V、S、D、S、Q、P、G、L。在一些實施方案中,LFR4中Z44、Z45、Z46、Z47依次選自下述的任一種組合:G、K、V、D;G、K、L、E;P、K、V、E;G、K、V、E;Q、R、L、E。
在一些實施方案中,重鏈可變區中FR的可變參數Zn(其中n代表通式中各Z的整數角標)依次可以選自前述表4的任一種組合。同理,輕鏈可變區中FR的可變參數Zn依次可以選自前述表5的任一種組合。在一些實施方案中,輕鏈與重鏈的CDR組合如前述表6中所示。
這裏需要明確的是,本申請中所有表格,例如表1至表6,其每一行單元格中的所有參數取值(例如Zn的參數取值或Xn的參數取值)組成一個或一種組合。
在一些具體的實施方案中,VH序列選自:SEQ ID NO:1-6。在一些具體的實施方案中VL序列選自:SEQ ID NO:7-13。在一些具體的實施方案中所述抗體的VH序列選自:SEQ ID NO:1-6且所述VL序列選自SEQ ID NO:7-13。在一些具體的實施方案中,VH序列與VL序列選自如下任一組: SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6與SEQ ID NO:7。
然而本領域技術人員應當知曉,並非所有的抗體或其抗原結合片段均包含完整的重鏈可變區和輕鏈可變區。並且,在很多情况下,僅包含抗體抗原結合片段的蛋白分子,依然具有特異性結合和/或中和抗原的能力。在一些實施方案中,所述抗體可以僅包含抗體的VH和/或VL,例如dAb,只含有輕鏈可變區的單域抗體,奈米抗體等。在一些實施方案中,所述抗體或其抗原結合片段可以不含恆定區,例如scFv,其包含前述HCDR和LCDR。在一些實施方案中,所述抗體或其抗原結合片段選自Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、Fd、雙體抗體(diabody)、或多體抗體(multibody)。其中所述雙體抗體及多體抗體包含所述一個、兩個或多個前述scFv,並且可以包括其它特異性結合HBsAg或其它抗原的scFv。在一些實施方案中,所述抗體為單特異性抗體、雙特異性抗體、或多特異性抗體。此外,作為本申請所述抗體的抗原結合片段,本申請公開的各種CDR、所述CDR的組合、以及包含所述CDR(例如HCDR3和/或LCDR3等)且保有對HBsAg特異性識別能力的抗體或抗體結合片段也涵蓋在本申請的保護範圍中。
在一些實施方案中,本申請所述抗體為全人源抗體、人源化抗體、鼠源抗體、嵌合抗體或奈米抗體。
在一些實施方案中,本申請所述的抗體進一步包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區。在一些實施方案中,所述重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區源自天然免疫球蛋白,例如所述重鏈恆定區可源自,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY,或亞型,例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和 IgA2。輕鏈恆定區可選自κ鏈或λ鏈。在一些具體的實施方案中,所述重鏈恆定區為人IgG1的重鏈恆定區,包含如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列,或包含與SEQ ID NO:14具有70%或以上序列同一性,例如與SEQ ID NO:14具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些具體的實施方案中,所述輕鏈恆定區源自κ鏈,包含如SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列,或包含與SEQ ID NO:15具有70%或以上序列同一性的氨基酸序列,例如與SEQ ID NO:15具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。
核酸、構建體、病毒、噬菌體或細胞
一方面,本申請還提供了一種分離的核酸分子,其包含編碼前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列。在一些實施方案中,所述核酸分子為RNA或DNA分子。在一些實施方案中,所述核酸為單鏈或雙鏈。在一些實施方案中,所述核酸為線狀或環狀。所述核酸可以由細胞合成,亦可由化學合成。在一些實施方案中,所述核酸為經過化學修飾的核酸分子。
一方面,本申請還提供了一種構建體,其包含前述核酸分子,所述構建體選自:質粒、噬菌粒、病毒載體、或線性核酸。本申請還提供了一種構建體的組合物,包含前述構建體,其中組合物中的各構建體可以分別包含編碼前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段的核酸分子的一個部分。例如,一種構建體的組合物,所述構建體為質粒,且所述構建體的組合物包含分別包含編碼前述抗體分子重鏈和輕鏈的質粒。
一方面,本申請還提供了一種病毒、噬菌體或細胞,其表達或含有前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,或包含前述核酸、前述構建體或前述構建體的組合物。所述病毒選自例如AAV、慢病毒等。所述噬菌體選自例如λ噬菌、T噬菌體、M13噬菌體、f1噬菌體、fd噬菌體等。所述細胞可選自,例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、細菌、真菌等。
此外,本申請還包括將核酸、構建體、病毒、噬菌體或細胞用於生產所述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段的用途。
藥物組合物及療法
本申請還提供了一種藥物組合物,其包含前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、前述核酸、前述構建體、或前述病毒、噬菌體或細胞。在一些實施方案中,所述藥物組合物進一步包含適當含量的藥學上可接受的輔料。這些製劑納入配方是為了改善遞送和耐受性等。在所有藥劑化學家熟知的藥典:雷氏藥學大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,Easton,PA)中可找到大量適當的配方。在本文中,藥學上可接受的輔料指無毒的填充劑、穩定劑、稀釋劑、載體、溶劑或其他製劑輔料。其中,稀釋劑、賦形劑,如微晶纖維素、甘露醇等;填充劑,如澱粉、蔗糖等;粘合劑,如澱粉、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和/或聚乙烯吡咯烷酮;崩解劑,如碳酸鈣和/或碳酸氫鈉;吸收促進劑,如季銨化合物;表面活性劑,如十六烷醇;載體、溶劑,如水、生理鹽水、高嶺土、皂粘土等;潤滑劑,如滑石粉、硬脂酸鈣/鎂、聚乙二醇等。另外,本發明的藥物組合物優選為注射劑。
在本發明的一些實施方案中,本發明藥物組合物中的抗體或其抗原結合片段以1mg/ml至1000mg/ml的濃度存在,優選以10mg/ml至1000mg/ml的濃度存在,更優選以50mg/ml至500mg/ml的濃度存在,更優選以100mg/ml至300mg/ml的濃度存在。
本發明的藥物組合物優選具有3.0至9.0的pH。其中,可進一步包含緩衝系統、防腐劑、表面張力劑、螯合劑、穩定劑和表面活性劑。在本發明的一個實施方案中,本發明的藥物組合物是含水製劑。這種製劑通常是溶液或懸浮。本發明的具體實施方案中,該藥物組合物是穩定的含水溶液。在本發明的另一個具體實施方案中中,該藥物組合物是一種凍乾製劑,在使用前醫師或患者加入溶劑和/或稀釋液溶解所述凍乾製劑。
一方面,本申請還提供了一種治療HBV感染的方法,其包含向患者施用合適劑量的前述藥物組合物。所述合適劑量隨受試者年齡和體型大小、目標疾病、症狀、施用途徑等不同而調整。當本發明的藥物組合物為包含前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段用來治療成人的各種與B型肝炎病毒感染相關的病症和疾病時,可採用靜脈施用所述藥物組合物,通常單劑按每公斤體重計約0.01至約20mg抗體給藥,例如約0.1至約15、約1至約10,約3至約10mg/kg體重(mpk),約12mpk體重。根據病症的嚴重性,可對治療的頻度和持續時間進行調整。例如每周對患者施用一次。
已知有各種藥物遞送系統可用來施用本發明的藥物組合物,例如包裹在脂質體、微顆粒、微膠囊中的膠囊化,能夠表達變異病毒的重組細胞,受體介導的胞吞作用(參閱如Wu等人(1987),J.Biol.Chem.262:4429-4432)等。給予藥物的方法包括但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜,和口腔等途徑。該藥物組合物可採用任何方便的途徑施用,如通過灌注或靜脈團注、上皮和粘膜層(如口腔粘膜、直腸和小腸粘膜)吸收,並可與其它生物活性藥劑一起施用。施用方式可為全身性或局部性施用。
該藥物組合物也可通過液囊遞送,尤其是通過脂質體液囊遞送(參閱 Langer (1990) Science249:1527-1533;Treat等人(1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez Berestein and Fidler (編著),Liss,New York,第353-365頁;Lopez-Berestein,同上,第317-327 頁)。
在某些情况下,該藥物組合物可以通過受控釋放系統遞送。在一個實施方案中,可使用泵(參閱Langer,如上;Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed. Eng.14:201)。在另一個實施方案中,可採用聚合物材料(參閱Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(編著),CRC Pres., Boca Raton,Florida(1974)。關於其它受控釋放系統的討論見Langer(1990) Science249:1527-1533。
所述藥物組合物可以單獨施用亦可聯合施用,並使通過降低B型肝炎病毒表面抗原的載量而使患者症狀得到改善。在一些實施方案中,所述施用為聯合施用,其中HBsAg抗體或其抗原結合片段與一種或多種治療藥劑(或稱第二種治療藥劑)聯合施用。共同給藥和聯合治療並不限於同時給藥,而是還包括在涉及給予患者至少一種其它治療藥劑的療程中至少給予一次抗HBsAg抗體或或其抗原結合片段的治療方案。第二種治療藥劑可能為另一種HBV治療藥物,如另一種抗體/抗體片段,或可溶的細胞因子受體(如干擾素、細胞介素、胸腺法新等)、核苷類似物(替諾福韋、恩替卡韋、阿德福韋等)。
本發明還包括本文所述的任何抗HBsAg抗體或抗原結合片段在製備治療疾病或症狀的藥物中的應用,其中的疾病或症狀是通過降低人體內HBsAg水平而得到改善的。
試劑、試劑盒、檢測方法
一方面,本申請提供了一種包含前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、前述核酸的互補鏈或所述互補鏈的片段、或前述構建體、病毒、噬菌體或細胞。在一些實施方案中,所述試劑進一步包含標記分子。在一些實施方案中,述標記分子可選自:辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等酶標記分子,熒光蛋白分子,熒光素分子,生物素分子,同位素等顯影劑。在一些實施方案中,所述標記分子與所述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、前述核酸的互補鏈或所述互補鏈的片段、或前述構建體、病毒、噬菌體或細胞耦合,形成複合物。
另一方面,本申請還提供了一種試劑盒。在一些實施方案中,所述試劑盒包含前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中,所述試劑盒包含前述核酸、所述核酸片段,或所述核酸的互補鏈或所述互補鏈的片段。在一些實施方案中,所述試劑盒包含前述構建體、病毒、噬菌體或細胞。在一些實施方案中,所述試劑盒包含前述試劑。在一些實施方案中,所述試劑盒是體外檢測試劑盒。在一些實施方案中,所述試劑盒是免疫檢測試劑盒,例如ELISA試劑盒或免疫組化試劑盒,其包含前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中,所述試劑盒是體內無創診斷試劑盒,其包含前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,且所述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段與標記分子形成複合物。在一些實施方案中,所述體內無創診斷試劑盒,可用於選自以下的顯像方法:放射免疫顯像或靶向超聲造影。當用於放射免疫顯像時,所述標記分子為放射性核素。當用於靶向超聲造影時,所述標記分子為超聲造影劑。
此外,本申請還提供了一種使用前述特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、前述試劑或試劑盒檢測HBV、診斷HBV感染或判斷HBV相關疾病進程的方法。
以上詳細描述了本發明的優選實施方式,但是,本發明並不限於此。在本發明的技術構思範圍內,可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型,包括各個技術特徵以任何其它的合適方式進行組合,這些簡單變型和組合同樣應當視為本發明所公開的內容,均屬於本發明的保護範圍。
應當理解,以上描述以及隨後的實施例旨在說明而不是限制本發明的範圍。在本發明範圍內的其他方面,優點和修改對於本發明所屬領域的技術人員將是顯而易見的。基於本發明的實施例,本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬於本發明保護的範圍。
實施例
實施例1:HBsAg抗體表達載體的構建
將HindIII酶切位點、Kozak序列、分泌信號肽基因和HBsAg抗體重鏈編碼基因(包括VH氨基酸序列的編碼基因和人源IgG1的恆定區編碼基因)、終止碼和EcoRI編碼基因依次串聯融合,並使用化學合成的方式獲得基因片段。通過EcoRI和HindIII位點,將上述片段插入真核表達質粒pCDNA 3.1(+)(購自Invitrogen Corportation,貨號V790-20)中並測序驗證,得到用於HBsAg抗體重鏈的表達質粒pCDNA3.1(+)-DH。
將HindIII酶切位點、Kozak序列、分泌信號肽基因和HBsAg輕鏈編碼基因(包括VL氨基酸序列的編碼基因和κ鏈恆定區的編碼基因)、終止碼和EcoRI編碼基因依次串聯融合,並使用化學合成的方式獲得基因片段。通過EcoRI和HindIII位點,將上述片段插入真核表達質粒pCDNA 3.1(+)中並測序驗證,得到用於抗體輕鏈的表達質粒pCDNA3.1(+)-DL。
其中,VH的氨基酸序列為:Z
1Z
2Z
3LZ
4Z
5SGAEVKKPGASZ
6KVSCKAS
X
1YX
3FX
5X
6X
7Y
Z
7HWVRQAPGQGZ
8EWMGW
X
11NX
13X
14X
15X
16X
17X
18 NYAQKFQGRVTZ
9TZ
10DZ
11SZ
12STAYMELSZ
13LRSZ
14DTAVYYC
ARDX
21WX
23X
24X
25X
26DX
28YGMDX
33 WGZ
15GTZ
16VTVSS(SEQ ID NO:47);
VL的氨基酸序列為:Z
17Z
18Z
19LTQSPZ
20Z
21LSZ
22SZ
23GZ
24RZ
25TZ
26Z
27CRAS
X
34X
35X
36SX
38X
39 LZ
28WYQQKPGZ
29APZ
30LLIZ
31 X
40X
41X
42 Z
32Z
33Z
34Z
35GZ
36PZ
37RFSGSGSGTZ
38FTLTIZ
39SLZ
40Z
41Z
42DZ
43ATYYC
QQSYSTPLX
51 FGZ
44GTZ
45Z
46Z
47IKR(SEQ ID NO:48);
其中下劃線部分為CDR,無下劃線部分為FR,Xn和Zn(n指代任一整數角標)可選自任意氨基酸。
本申請實施例中測試的HBsAg抗體中,編號分別為021、021-M1、021-M3、021-M5、021-M6、021-M7、021-M11、021-M13、021-M14、021-M15、021-M16、021-M17、021-M18、021-M21、021-M23、021-M24、021-M25、021-M26、021-M28、021-M33、021-M34、021-M35、021-M36、021-M38、021-M39、021-M40、021-M41、021-M42、021-M51的抗體,其Zn和Xn的取值分別如下表7(Zn)和發明概述中的表3(Xn)所示:
表7:
FR | HFR1 | HFR2 | HFR3 | HFR4 | LFR1 | LFR2 | LFR3 | LFR4 |
Zn取值 | Z1為Q,Z2為V,Z3為Q,Z4為V,Z5為E,Z6為V | Z7為M,Z8為L | Z9為M,Z10為R,Z11為T,Z12為I,Z13為R,Z14為D | Z15為K,Z16為L | Z17為D,Z18為I,Z19為Q, Z20為S,Z21為S, Z22為A,Z23為V,Z24為D, Z25為V,Z26為I,Z27為T | Z28為N,Z29為K, Z30為K,Z31為Y | Z32為S,Z33為L,Z34為Q,Z35為S, Z36為V,Z37為S, Z38為D,Z39為S, Z40為Q,Z41為P,Z42為E,Z43為F | Z44為G,Z45為K,Z46為V,Z47為D |
編號分別為005、062、079、083、088、090、091、093、095、096的抗體,其Xn和Zn的取值分別如發明概述中的表3(Xn)和表6(Zn)所示。其具體的VH和VL序列分別為:
VH序列:
021及079:QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGKGTLVTVSS (SEQ ID NO:1)
005、095、096:EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:2)
062:EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:3)
088:QITLKESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFIGYYLHWVRQAPGQGLEWMGWINPYNGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGKGTLVTVSS (SEQ ID NO:4)
090、091、093:EVQLVQSGAEVKKPGASMKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGPEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGKGTMVTVSS (SEQ ID NO:5)
083:EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDVWQQGGYYYYMDVWGKGTLVTVSS (SEQ ID NO:6)
VL序列:
021、083:DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKR (SEQ ID NO:7)
005、062、079、088:DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:8)
090:EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFATYYCQQSYSTPLTFGPGTKVEIKR (SEQ ID NO:9)
091:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKR (SEQ ID NO:10)
093:DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTIRSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:11)
095:DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLISAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPGDLATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:12)
096:ETTLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPQLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTRLEIKR (SEQ ID NO:13)
其中,上述抗體VH和VL與CDR序列的對應關係如下表8所示:
抗體名稱 | VH | HCDR | VL | LCDR | ||
021 | SEQ ID NO:1 | HCDR1 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:7 | LCDR1 | SEQ ID NO:25 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:28 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
005 | SEQ ID NO:2 | HCDR1 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:8 | LCDR1 | SEQ ID NO:26 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:28 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
062 | SEQ ID NO:3 | HCDR1 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:8 | LCDR1 | SEQ ID NO:26 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:28 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
079 | SEQ ID NO:1 | HCDR1 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:8 | LCDR1 | SEQ ID NO:26 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:28 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
083 | SEQ ID NO:6 | HCDR1 | SEQ ID NO:20 | SEQ ID NO:7 | LCDR1 | SEQ ID NO:25 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:28 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:24 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
088 | SEQ ID NO:4 | HCDR1 | SEQ ID NO:18 | SEQ ID NO:8 | LCDR1 | SEQ ID NO:26 |
HCDR2 | SEQ ID NO:22 | LCDR2 | SEQ ID NO:28 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
090 | SEQ ID NO:5 | HCDR1 | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:9 | LCDR1 | SEQ ID NO:27 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:29 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
091 | SEQ ID NO:5 | HCDR1 | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:10 | LCDR1 | SEQ ID NO:27 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:30 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
093 | SEQ ID NO:5 | HCDR1 | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:11 | LCDR1 | SEQ ID NO:26 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:30 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
095 | SEQ ID NO:2 | HCDR1 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:12 | LCDR1 | SEQ ID NO:26 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:28 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 | |||
096 | SEQ ID NO:2 | HCDR1 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:13 | LCDR1 | SEQ ID NO:26 |
HCDR2 | SEQ ID NO:21 | LCDR2 | SEQ ID NO:31 | |||
HCDR3 | SEQ ID NO:23 | LCDR3 | SEQ ID NO:32 |
實施例2:抗HBsAg抗體的表達和純化
使用實施例1所述的表達質粒pCDNA3.1(+)-DH和pCDNA3.1(+)-DL,通過真核表達細胞FreeStyle™ 293-F Cells(Invitrogen Corporation, R790-07)表達目的抗體。按照FreeStyle™ 293 ExpressionSystem操作手册,在質粒轉染前一天將細胞密度調整至1x10
6個/毫升。在質粒轉染當天,將質粒按照重鏈與輕鏈對應的關係組合(即同一編號抗體的輕鏈與抗體重鏈組合)後,與轉染試劑混合,加入細胞培養基中。37℃,8% CO
2持續培養5-7天后,收集細胞培養上清進行抗體純化。
表達上清用0.22μM濾膜過濾,利用Mabpurix親和層析柱(購自Sepax公司,65008)從表達上清中捕獲表達抗體,用平衡緩衝液(120mM Tris+100mM NaCl, pH7. 5)平衡層析柱後,過親和層析柱,用洗脫緩衝液(0.15M冰醋酸,pH2.8)洗脫。純化後的抗體進行SDS PAGE、SEC檢測,純度在95%以上。
可以看出,實施例所用抗體中各Xn和各Zn選用的氨基酸各不相同,因此這些抗體可用於測試上述VH及VL序列通式在Xn和/或Zn參數取值改變時,導致的抗體特異性結合抗原的親和力的變化。
實施例3:抗原結合親和力測定
HBsAg蛋白(20µg/ml,由申請人自行分離,其包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)包被酶標板,100µl/孔,貼封板膜,於4℃過夜,並用洗滌液PBST(0.5‰吐溫的PBS)洗板3次, 10% 牛血清白蛋白溶液(使用洗滌液PBST配置)進行封閉,置以200µl/孔加至酶標板內,37℃ 孵育2小時。以洗滌液PBST(0.5‰吐溫的PBS)洗板3次,100µl/孔加入梯度稀釋的待測抗體(20、4、0.8、0.16、0.032、0.064、0.00128、0.00256mg/mL共8個梯度),並設置系統空白對照,於37℃ 孵育2小時。使用洗滌液PBST(0.5‰吐溫的PBS)洗板3次,加入二抗(1:10000稀釋,Jackson ImmunoResearch),以100µl/孔加至酶標板內,37℃ 孵育1小時。最後,使用洗滌液PBST(0.5‰吐溫的PBS)洗板5次,以100µl/孔加入TMB顯色液,置室溫避光反應20〜40分鐘,加入等體積終止液終止顯色反應,使用酶標儀在波長450mn處測定吸光度(OD值),當與抗原結合的OD值大於0.1時,通常認為抗體在該相應濃度下可檢測到結合。
MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYIHHHHHH(SEQ ID NO:16)
測定儀HBsAg抗原結合活性,以酶標儀在波長450mn處測定吸光度(OD值)表示,各抗體稀釋濃度均為20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、0.000256μg/mL共8個濃度梯度,每個抗體均檢測到OD值小於0.05(通常認為是相當於空白板,沒有結合活性),當抗體與抗原結合的OD值大於0.1時,通常認為抗體在該相應濃度下可檢測到結合,抗體021在0.16μg/mL濃度下其與抗原結合的OD值大於0.1,以抗體021為基準,將其活性定義為“++++”等級,取其它抗體在稀釋濃度為4μg/mL的相應OD值與021抗體在4μg/mL的相應OD值的比值,當比值大於1.1時,將其活性定義為“+++++”等級,當比值介於0.8至1.1之間時,將其活性定義為“++++”等級,當比值介於0.6至0.8時,將其活性定義為“+++”等級 ,當比值介於0.4至0.6時,將其活性定義為“++”等級,當比值介於0.2至0.4時,將其活性定義為“+”等級,當比值小於0.2時,認為沒有結合活性。
經測試,各測試抗體的親和力如下表9所示:
表9
抗體 | OD值 | 抗體 | OD值 | 抗體 | OD值 | 抗體 | OD值 |
021 | ++++ | 021-M16 | ++++ | 021-M34 | ++++ | 005 | ++++ |
021-M1 | ++++ | 021-M17 | ++++ | 021-M35 | ++++ | 062 | ++ |
021-M3 | ++++ | 021-M18 | ++++ | 021-M36 | ++ | 079 | +++++ |
021-M5 | ++++ | 021-M21 | ++ | 021-M38 | +++++ | 083 | +++++ |
021-M6 | ++++ | 021-M23 | ++++++ | 021-M39 | ++ | 088 | +++++ |
021-M7 | +++ | 021-M24 | +++ | 021-M40 | +++++ | 090 | ++++ |
021-M11 | +++ | 021-M25 | +++ | 021-M41 | ++++ | 091 | ++++ |
021-M13 | +++ | 021-M26 | ++++ | 021-M42 | +++ | 093 | +++++ |
021-M14 | ++++ | 021-M28 | ++++ | 021-M51 | ++ | 095 | +++++ |
021-M15 | ++++ | 021-M33 | ++++ | 096 | +++++ |
該結果表明本申請的抗體具有良好的特異性結合HBsAg的能力。
021、021-M1、021-M3、021-M5、021-M6、021-M7、021-M11、021-M13、021-M14、021-M15、021-M16、021-M17、021-M18、021-M21、021-M23、021-M24、021-M25、021-M26、021-M28、021-M33、021-M34、021-M35、021-M36、021-M38、021-M39、021-M40、021-M41、021-M42、021-M51具有相同的FR區域,但各CDR中Xn位置處選取的氨基酸不相同,說明本申請提供的抗體在CDR區特定位置上的氨基酸替換仍然能夠使抗體保持特異性識別HBsAg的能力。
而對於編號分別為005、062、079、083、088、090、091、093、095、096的抗體,其在具有本申請所述的CDR,和不同FR區的情况下,可特異性識別HBsAg,進一步證明了本申請所述CDR特異性識別並結合HBsAg抗原的能力。此外,我們也為所述CDR區匹配了合適的FR,在Zn取值不同的情况下,所述FR可依然維持本申請抗體CDR構象,使所述抗體特異性識別HBsAg。
實施例4 體內藥效試驗
本實驗中,抗體的恆定區選用鼠源IgG1。
動物:
雄性C57BL/6 小鼠,5周齡,無特定病原體,購於上海斯萊克實驗動物有限公司,並飼養於獨立通風籠盒中。小鼠的飼養及使用藥明康德IACUC批准的實驗方案(IACUC #: ID01-013-2020v1.0)。小鼠度過4天的環境適應期後注射AAV/HBV病毒(即包含D型HBV全套基因組的AAV重組病毒rAAV8-1.3HBV,在本文中“AAV/HBV病毒”與“rAAV8-1.3HBV”可互換使用)
溶劑:PBS。
受試化合物:抗體005,抗體062,抗體079,抗體083,劑量:12mpk。
重組rAAV8-1.3HBV: rAAV8-1.3HBV(D型,ayw)由藥明康德提供,批號為awy1-P4-200102,1×1012病毒基因組(v.g.)/mL。實驗前用無菌PBS稀釋至5×1011v.g./mL。每隻小鼠注射200μL,即每隻小鼠注射1×1011v.g.。
試驗方法:
AAV/HBV小鼠模型建立
AAV/HBV注射. rAAV8-1.3HBV在注射前預先用無菌PBS配製成濃度為1×1011v.g. /200µL溶液。32隻小鼠經尾靜脈注射200µL rAAV8-1.3HBV溶液。
分組前採血.病毒注射後第14、21和35天,所有感染的小鼠通過頜下靜脈採血~100 µL用於收集血漿。採集的靜脈血用K2-EDTA抗凝,在4 °C,7000g/min條件下離心10分鐘並收集血漿。血漿通過qPCR檢測HBV DNA,通過ELISA檢測HBsAg。血漿樣本保存於-80 °C直到送至藥明康德生物部體外實驗室檢測相關項目。
第一次給藥記為第0天,感染後第45天即第0天。根據病毒注射後第14、21和35天採集的血漿HBV DNA和HBsAg水平對小鼠進行分組,從20隻小鼠中挑選16隻正式實驗用的小鼠,隨機分為五組,標記為第一組到第五組,第一組小鼠數量為4,其餘組小鼠數量為3。所有小鼠通過尾靜脈注射PBS或測試抗體,12mpk,給藥一次。所有小鼠給藥前稱量體重。
採血:
給藥後第-1、1、3、5、7、10、14和17天,所有小鼠通過頜下靜脈採血,收集血漿,用於檢測HBV DNA和HBsAg。
實驗終點:測試部分:給藥後第22天測試組所有小鼠安樂死。
體重記錄:體內實驗過程中,每天觀察小鼠狀態,並在感染當天,給藥和採血當天記錄小鼠體重。
樣品保存和轉移. 所有血漿樣品置於-80℃保存,並用乾冰轉移至藥明康德生物部體外實驗室進行相應檢測。
定量PCR檢測小鼠血漿中HBV DNA含量. 提取血漿中DNA,實驗步驟參照QIAamp 96 DNA Blood Kit說明書。定量PCR檢測小鼠血漿中HBV DNA的含量。方法簡述如下:
配製qPCR反應混合液(Taqman Universal Master Mix (2X)),加入樣品和標準品,進行PCR反應。反應條件:95 ℃,10 分鐘;95 ℃,15 秒,60 ℃,1 分鐘,40個循環。
ELISA檢測小鼠血漿中HBsAg的含量. 實驗步驟參照HBsAg ELISA(安圖生物,CL 0310)試劑盒說明書。方法簡述如下:將血漿樣品稀釋2、10、20或600倍,加入包被板中,與酶結合物共同溫育(37 ℃,60分鐘),重複洗板5次,加入發光底物,室溫避光反應10分鐘,用酶標儀檢測發光強度。
(抗體005、072、079及083,劑量12 mpk)在AAV/HBV小鼠模型中對HBV複製的抑制活性通過檢測小鼠血漿中HBV DNA含量和HBsAg的表達來進行評價結果如圖1及圖2所示。
結果如下:
1)受試化合物對AAV/HBV小鼠血漿HBV DNA的影響
溶劑組(組1 PBS)小鼠血漿HBV DNA含量在實驗中保持相對穩定,在5.31–5.74 log10 copy/μL 間波動(波動不超過0.43 log10 copy/μL),與溶劑組相比,治療組組2(抗體005,12 mpk)小鼠血漿HBV DNA在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.69 log10 copy/μL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第10天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA為5.65 log10 copy/μL;治療組組3(抗體062,12 mpk)小鼠血漿HBV DNA在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.81 log10 copy/μL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第10天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA為5.45 log10 copy/μL;治療組組4(抗體079,12 mpk)小鼠血漿HBV DNA在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.68 log10 copy/μL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第10天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA為5.59 log10 copy/μL;治療組組5(抗體083,12 mpk)小鼠血漿HBV DNA在給藥後第1天即顯著降低,平均降低0.78 log10 copy/μL(p<0.01),到第3天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA為5.36 log10 copy/μL。
2)受試化合物對AAV/HBV小鼠血漿HBsAg的影響
溶劑組(組1)小鼠血漿HBsAg含量在實驗中保持相對穩定,在4.65–5.27 log10 IU/mL間波動(波動不超過0.62 log10 IU/mL);與溶劑組相比,治療組組2(抗體005,12 mpk)小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.73 log10 IU/mL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第10天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBsAg為4.87 log10 IU/mL;治療組組3(抗體062,12 mpk)小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.95 log10 IU/mL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第10天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBsAg為4.78 log10 IU/mL;治療組組4(抗體079,12 mpk)小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.80 log10 IU/mL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第10天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBsAg為4.79 log10 IU/mL;治療組組5(抗體083,12 mpk)小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天即顯著降低,平均降低1.10 log10 IU/mL(p<0.01),到第3天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBsAg為4.93 log10 IU/mL。
實施例5 抗體005、021、062及088體內活性測定
實驗方案同實施例4,分5組,每組小鼠4隻,所用IgG1為鼠源IgG1。測試結果顯示於圖3及圖4中。具體結果如下:
1)各組小鼠血漿HBV DNA的含量。
溶劑組(組1)小鼠血漿HBV DNA含量在實驗中保持相對穩定,在5.21–6.06 log10 copy/μL 間波動(波動不超過0.85 log10 copy/μL);與溶劑組相比,治療組組2(抗體005,12 mpk)小鼠血漿HBV DNA在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.43 log10 copy/μL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第10天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA為5.49 log10 copy/μL;治療組組3(抗體021,12 mpk)小鼠血漿HBV DNA在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.44 log10 copy/μL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第14天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA為5.81 log10 copy/μL;治療組組4(抗體062,12 mpk)小鼠血漿HBV DNA在給藥後第1天均顯著降低,平均降低2.51 log10 copy/μL(p<0.01),隨後均呈現逐步回升趨勢,在第10升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA為5.55 log10 copy/μL;治療組組5(抗體088,12 mpk)小鼠血漿HBV DNA在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.17 log10 copy/μL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第7天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA為5.59 log10 copy/μL。
2)各組小鼠血漿HBsAg的含量。
溶劑組(組1)小鼠血漿HBsAg含量在實驗中保持相對穩定,在4.74–5.11 log10 IU/mL間波動(波動不超過0.37 log10 IU/mL);與溶劑組相比,治療組組2(抗體005m,12 mpk)小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.74 log10 IU/mL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第10天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBsAg為4.75 log10 IU/mL;治療組組3(抗體021,12 mpk)小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.38 log10 IU/mL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第17天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBsAg為4.98 log10 IU/mL;治療組組4(抗體062,12 mpk)小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天均顯著降低,分別平均降低2.41和2.60 log10 IU/mL(p<0.01),隨後均呈現逐步回升趨勢,在第14升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBsAg為4.95 log10 IU/mL;治療組組5(抗體088,12 mpk)小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天即顯著降低,平均降低2.19 log10 IU/mL(p<0.01),隨後呈現逐步回升趨勢,到第5天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBsAg為5.14 log10 IU/mL。
實施例6 抗體021 090-097體內實驗
實驗方法同實施例4,模型小鼠分8組,每組4隻,所用IgG1均為人源IgG1。即所述抗體的重鏈及輕鏈恆定區如下所示:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:14)
及
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:15)
除組8為腹腔注射抗體021(劑量12mpk)以外,其餘各組小鼠均通過尾靜脈注射PBS或測試抗體(抗體021,抗體090,抗體091,抗體093,抗體095,抗體096,12 mpk),各組均給藥一次,溶劑組注射給與等量PBS。測試結果如圖5和圖6所示。具體如下:
溶劑組(組1)小鼠血漿HBV DNA和HBsAg含量在實驗中保持相對穩定,分別在4.36–4.80 log10 copy/μL和4.44–4.70 log10 IU/mL間波動(波動不超過0.44 log10 copy/μL和0.26 log10 IU/mL);與溶劑組相比,治療組組2(抗體090,12 mpk,IV)小鼠血漿HBV DNA和HBsAg在給藥後第1天均顯著降低,分別平均降低1.33 log10 copy/μL(p<0.01)和0.81 log10 IU/mL(p<0.01),隨後均呈現逐步回升趨勢,分別到第11天和第14天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA和HBsAg分別為4.80 log10 copy/μL和4.66 log10 IU/mL;治療組組3(抗體091,12 mpk,IV)小鼠血漿HBV DNA和HBsAg在給藥後第1天均顯著降低,分別平均降低1.12 log10 copy/μL(p<0.01)和0.93 log10 IU/mL(p<0.01),隨後均呈現逐步回升趨勢,分別到第7天和第11天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA和HBsAg分別為4.57 log10 copy/μL和4.88 log10 IU/mL;治療組組4(抗體093,12 mpk,IV)小鼠血漿HBV DNA和HBsAg在給藥後第1天均顯著降低,分別平均降低1.19 log10 copy/μL(p<0.01)和1.46 log10 IU/mL(p<0.01),隨後均呈現逐步回升趨勢,分別到第7天和第11天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA和HBsAg分別為4.52 log10 copy/μL和4.90 log10 IU/mL;治療組組5(抗體021,12 mpk,IV)小鼠血漿HBV DNA和HBsAg在給藥後第1天均顯著降低,分別平均降低1.93 log10 copy/μL(p<0.01)和1.23 log10 IU/mL(p<0.01),隨後均呈現逐步回升趨勢,分別到第18天和第11天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA和HBsAg分別為4.20 log10 copy/μL和4.59 log10 IU/mL;治療組組6(抗體095,12 mpk,IV)小鼠血漿HBV DNA和HBsAg在給藥後第1天均顯著降低,分別平均降低2.04 log10 copy/μL(p<0.01)和1.76 log10 IU/mL(p<0.01),隨後均呈現逐步回升趨勢,到第11天均升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBV DNA和HBsAg分別為4.66 log10 copy/μL和4.59 log10 IU/mL;治療組組7(抗體096,12 mpk,IV)小鼠血漿HBV DNA和HBsAg在給藥後第1天均顯著降低,分別平均降低1.64 log10 copy/μL(p<0.01)和1.22 log10 IU/mL(p<0.01),隨後均呈現逐步回升趨勢,小鼠血漿HBV DNA到第7天升接近溶劑組的水平,隨後輕微波動並保持到實驗終點,此時實驗終點即給藥第18天小鼠血漿HBV DNA為3.83 log10 copy/μL。小鼠血漿HBsAg到第11天升至溶劑組水平,此時小鼠血漿HBsAg為4.62 log10 IU/mL;與第-3天相比,治療組組8(抗體021,12 mpk,IP)小鼠血漿HBV DNA含量在給藥後第1天下降了0.60 log10 copy/μL,到第5天下降至LLOQ(量化下限)水平,隨後在第11天恢復至第-3天水平,並在第11-18天在2.73-3.14 log10 copy/μL間波動(波動不超過0.41 log10 copy/μL)。小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天即顯著降低,平均降低0.82 log10 IU/mL,最大降低發生在第5天,平均降低1.22 log10 IU/mL,隨後在第11天恢復至第-3天水平,此時小鼠血漿HBsAg為3.94 log10 IU/mL。
綜上所述,從實施例4-6結果顯示,所有本發明中的抗體,包括親和力僅為++的062均可作為HBV的中和抗體,顯著抑制HBV的增殖和降低HBsAg的表達。
實施例7:多次給藥實驗
AAV/HBV小鼠模型建立同實施例4
模型小鼠分兩組,分別為陽性對照組及抗體005組(採用鼠源IgG1),每組4隻,第一次給藥計為第0天,以後每隔7天給藥一次,給藥7次,尾靜脈注射給藥,劑量為12mpk,陽性對照組給予10mL/kg的PBS溶液。
給藥後第-25、-18、-11、-4、1、3、5、7、10、14、17、21、24、28、31、35、38、42、45、49和52天,所有小鼠通過頜下靜脈採血,收集血漿,用於檢測HBV DNA和HBsAg。
結果表明,小鼠血漿HBsAg在給藥後第1天顯著降低,平均降低1.61 log10 IU/mL(p<0.01),至第三天最低,平均降低約1.73 log10 IU/mL(p<0.01),在連續給藥期間,從第0至52天,小鼠血漿HBsAg水平始終維持在低水平。該結果證明了本申請的抗體在長期使用的過程中,依然可以保持對HBV的良好抗性和治療效果。並且,不超過每周一次的注射便可長期抑制病毒增殖。
無
[圖1] 顯示選用鼠源IgG1恆定區的005、062、079及083抗體尾靜脈注射後對AAV/HBV小鼠血漿HBV DNA的影響。
[圖2] 顯示選用鼠源IgG1恆定區的005、062、079及083抗體尾靜脈注射後對AAV/HBV小鼠血漿HBsAg的影響。
[圖3] 顯示選用鼠源IgG1恆定區的005、021、062及088抗體尾靜脈注射後對AAV/HBV小鼠血漿HBV DNA的影響。
[圖4] 顯示選用鼠源IgG1恆定區的005、021、062及088抗體尾靜脈注射後對AAV/HBV小鼠血漿HBsAg的影響。
[圖5] 顯示選用人源IgG1恆定區的021、090、091及093抗體尾靜脈注射,以及選用人源IgG1恆定區的021腹腔注射後分別對AAV/HBV小鼠血漿HBV DNA的影響。
[圖6] 顯示選用人源IgG1恆定區的021、090、091及093抗體尾靜脈注射,以及選用人源IgG1恆定區的021腹腔注射後分別對AAV/HBV小鼠血漿HBsAg的影響。
[圖7] 顯示選用人源IgG1恆定區的021、095及096抗體尾靜脈注射,以及選用人源IgG1恆定區的021腹腔注射後分別對AAV/HBV小鼠血漿HBV DNA的影響。
[圖8] 顯示選用人源IgG1恆定區的021、095及096抗體尾靜脈注射,以及選用鼠源IgG1恆定區的021腹腔注射後分別對AAV/HBV小鼠血漿HBsAg的影響。
[圖9] 顯示對小鼠連續施用本申請的抗體對AAV/HBV小鼠血漿HBsAg的影響。
Claims (20)
- 一種特異性結合B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變區(VH)序列和輕鏈可變區(VL)序列,其中: 該重鏈可變區包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列: HCDR1: X1YX3FX5X6X7Y(SEQ ID NO:33), HCDR2: X11NX13X14X15X16X17X18(SEQ ID NO:34),及 HCDR3:ARDX21WX23X24X25X26DX28YGMDX33(SEQ ID NO:35);以及 該輕鏈可變區包含如下所示的CDR氨基酸序列: LCDR1: X34X35X36SX38X39(SEQ ID NO:36), LCDR2:X40X41X42(SEQ ID NO:37),及 LCDR3:QQSYSTPLX51(SEQ ID NO:38); 其中: X1選自G或A,X3選自T、A或S,X5選自T、A或I,X6選自G、A、Y或D,X7選自Y或A,X11選自I或A,X13選自P或A,X14選自N、A或Y,X15選自S、A或N,X16選自G或A,X17選自G或A,X18選自T或A,X21選自L、V或A,X23選自N、Q或A,X24選自D、Q或A,X25選自D、G或A,X26選自V、G或A,X28選自Y或A,X33選自V或A,X34選自Q或A,X35選自S或A,X36選自I、A或V,X38選自T、A或S,X39選自Y或A,X40選自A、G、D、T或S,X41選自A或S,X42選自A或S,X51選自T或A。
- 如請求項1所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中,該VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且該VL包含如SEQ ID NO:25所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或 該VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或 該VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:20所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:24所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:25所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或 該VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:18所示的HCDR1,如SEQ ID NO:22所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:28所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或 該VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:27所示的LCDR1;如SEQ ID NO:29所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或 該VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:27所示的LCDR1;如SEQ ID NO:30所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或 該VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:19所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且所述VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:30所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3;或 該VH包含如下所示的互補決定區(CDR)氨基酸序列:如SEQ ID NO:17所示的HCDR1,如SEQ ID NO:21所示的HCDR2,如SEQ ID NO:23所示的HCDR3,且該VL包含如SEQ ID NO:26所示的LCDR1;如SEQ ID NO:31所示的LCDR2,如SEQ ID NO:32所示的LCDR3。
- 如請求項1或2所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,包含人類通用框架區(FR)。
- 如請求項1至請求項3中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中, 該VH包含如下所示的FR氨基酸序列: HFR1:Z1Z2Z3LZ4Z5SGAEVKKPGASZ6KVSCKAS(SEQ ID NO:39), HFR2:Z7HWVRQAPGQGZ8EWMGW(SEQ ID NO:40), HFR3:NYAQKFQGRVTZ9TZ10DZ11SZ12STAYMELSZ13LRSZ14DTAVYYC(SEQ ID NO:41),及 HFR4:WGZ15GTZ16VTVSS(SEQ ID NO:42),以及 VL包含如下所示的FR氨基酸序列: LFR1:Z17Z18Z19LTQSPZ20Z21LSZ22SZ23GZ24RZ25TZ26Z27CRAS(SEQ ID NO:43), LFR2:LZ28WYQQKPGZ29APZ30LLIZ31(SEQ ID NO:44), LFR3:Z32Z33Z34Z35GZ36PZ37RFSGSGSGTZ38FTLTIZ39SLZ40Z41Z42DZ43ATYYC(SEQ ID NO:45),及 LFR4:FGZ44GTZ45Z46Z47IKR(SEQ ID NO:46), 其中, Z1選自Q或E,Z2選自V或I,Z3選自Q或T,Z4選自V或K,Z5選自E或Q,Z6選自V或M,Z7選自M、I或L,Z8選自L或P,Z9為M或I,Z10為R或A,Z11為T或K,Z12為I或T,Z13為R或S,Z14為D或E,Z15選自K或Q,Z16選自L或M,Z17選自D或E,Z18選自I或T,Z19選自Q、T或V,Z20選自S、A或G,Z21選自S或T,Z22選自A或L,Z23選自V或P,Z24選自D或E,Z25選自V或A,Z26選自I或L,Z27選自T或S,Z28選自N或A,Z29選自K或Q,Z30選自K、Q或R,Z31選自Y或S,Z32選自S或N,Z33選自L或R,Z34選自Q或A,Z35選自S或T,Z36選自V或I,Z37選自S或A,Z38選自D或E,Z39為S或R,Z40選自Q或E,Z41選自P或S,Z42選自E或G,Z43選自F或L,Z44選自G、Q或P,Z45選自K或R,Z46選自V或L,Z47選自D或E。
- 如請求項1至請求項4中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中該VH序列選自SEQ ID NO:1-6中的任一序列,或與SEQ ID NO:1-6中的任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
- 如請求項1至請求項5中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中該VL序列選自SEQ ID NO:7-13中的任一序列,或與該SEQ ID NO:7-13中的任一序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
- 如請求項1至請求項6中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中該VH序列與該VL序列選自如下任一組的序列:SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:5與SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6與SEQ ID NO:7、與該VH序列或該VL序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
- 如請求項1至請求項7中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其選自:Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、Fv、Fd、dAb、雙體抗體(diabody)、或多體抗體(multibody)。
- 如請求項1至請求項8中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體為全人源抗體、人源化抗體、鼠源抗體、嵌合抗體或奈米抗體。
- 如請求項1至請求項9中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其為單特異性抗體、雙特異性抗體、或多特異性抗體。
- 如請求項1至請求項10中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,其進一步包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區,其中,該重鏈恆定區選自IgG的重鏈恆定區,該輕鏈恆定區選自κ鏈或λ鏈。
- 一種分離的核酸分子,其包含編碼如請求項1至請求項11中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列。
- 一種構建體,其包含請求項12中所述的核酸分子。
- 如請求項13所述的構建體,其選自:質粒、噬菌粒、病毒載體、或線性核酸。
- 一種病毒、噬菌體或細胞,其表達如請求項1至請求項11中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段,或包含請求項12中的核酸或請求項13或14中的構建體。
- 一種藥物組合物,其包含:請求項1至請求項11中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、請求項12中的核酸、請求項13或114中的構建體、或請求項15中的病毒、噬菌體或細胞。
- 一種試劑盒,其包含:請求項1至請求項11中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、請求項12中的核酸、請求項13或14中的構建體、或請求項15中的病毒、噬菌體或細胞。
- 一種治療或預防B型肝炎病毒(HBV)感染,或緩解B型肝炎症狀的方法,其包含向患者施用有效量的請求項16中的藥物組合物。
- 一種檢測HBV的方法,包括使請求項1至請求項11中任一項所述的特異性結合HBsAg的抗體或其抗原結合片段、請求項12中的核酸、請求項13或請求項14中的構建體、或請求項15中的病毒、噬菌體或細胞與來自受試者的體液接觸。
- 如請求項19所述的方法,其中該來自受試者的體液為受試者的血漿或血清。
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