TW202214291A - 膠囊化胰島 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種經改良之膠囊化胰島。 一種核心經5層膜被覆之製劑，前述核心包含胰島；且前述5層膜之由內側起算第1、第3、及第5層膜包含海藻酸，由內側起算第2及第4層膜包含聚鳥胺酸。

Description

膠囊化胰島
此申請案係揭示一種關於膠囊化胰島之技術。
胰島移植是一種對人體負擔較少的糖尿病治療手段，但是為了使胰島在移植後長期存活，強力的免疫抑制是必須的，且是在醫療環境實施對移植患者投予免疫抑制劑。然而，因為免疫抑制劑之投予有副作用等的風險，因此一直在研議藉由微小之微膠囊化形成免疫隔離以將多數胰島移植至腹腔內的方法，這個方法雖然不需要免疫抑制或是能夠逐漸減少投予量，但目前並未收獲足夠的治療成果。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：WO2001/052871 非專利文獻
非專利文獻1：METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 137, 575-580, 1988 非專利文獻2：TRANSPLANTATION, Vol. 53, 1180-1183, No. 6, June 1992 非專利文獻3：Bioartificial Pancreas, Vol., 98, No. 6, 1996, 1417-1422 非專利文獻4：Drug Delivery System, Vol., 12, No. 2, 1997 非專利文獻5：JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS, 2013 VOL., 101B, ISSUE 2, 258-268
發明欲解決之課題 本發明課題之一係提供一種經改良之膠囊化胰島。
用以解決課題之手段 提供包含下述之發明以作為解決此課題之解決手段。 項1.一種核心經5層膜被覆之製劑， 前述核心包含胰島；且 前述5層膜之由內側起算第1、第3、及第5層膜包含海藻酸，由內側起算第2及第4層膜包含聚鳥胺酸 項2.如項1之製劑，該製劑之平均直徑為400μm以上。 項3.如項1或2之製劑，該製劑之平均直徑為400μm以上且500μm以下。 項4.如項1至3中任一項之製劑，其係糖尿病治療用。 項5.如項1至4中任一項之製劑，其中胰島為取自出生後1至3週之幼豬的胰島。 項6.一種如項1至5中任一項之製劑之製造方法，該製造方法包含下述步驟： 步驟(a)，調製含有胰島之海藻酸鈉溶液A； 步驟(b)，將該海藻酸鈉溶液A滴入二價陽離子溶液中，並回收已凝膠化之粒子； 步驟(c)，將在步驟(b)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液A中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(d)，將在步驟(c)回收的粒子添加於海藻酸鈉溶液B中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(e)，將在步驟(d)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液B中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(f)，將在步驟(e)回收的粒子添加於海藻酸鈉溶液C中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(g)，將在步驟(f)回收的粒子添加於檸檬酸鈉溶液中，攪拌預定時間，然後回收粒子。 項7.如項6之方法，其中聚L-鳥胺酸溶液A的聚L-鳥胺酸濃度為0.05w/v%以上且小於1w/v%。 項8.如項6或7之方法，其中於步驟(d)中，係將在步驟(c)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液A’中，攪拌預定時間，然後予以回收後，添加於海藻酸鈉溶液B中。
發明效果 可提供對於糖尿病之治療有效的手段。
用以實施發明之形態 本發明之製劑宜為核心經5層膜被覆之製劑，並且，前述核心包含胰島，前述5層膜之由內側起算第1、第3、及第5層膜包含海藻酸，由內側起算第2及第4層膜包含聚鳥胺酸。如此的製劑能夠更長期地將血糖值維持在適切的範圍。在一實施形態中，製劑亦可覆有多於5層的膜(例如6層膜、7層膜、8層膜、9層膜、或10層膜)。所謂覆有五層膜之製劑，可意指藉由如後所述包含5個形成膜之步驟的方法調製出之製劑。
胰島的種類可任擇，並無特別限制。胰島宜包含產生胰島素之β細胞、含有升糖素之α細胞、分泌體抑素之delta細胞及含有胰多肽之細胞(PP細胞)。胰島宜大部分為產生胰島素之β細胞。胰島之來源可根據目的選擇，但以人、豬、小鼠、大鼠、猴或狗為佳。在一實施形態中，胰島之來源宜為豬，且以幼豬(例如，出生後3日~4週或出生後7日~3週)之胰島為佳。胰島可藉由任意採用該技術領域周知之方法來取得。例如，可宜採用一種使用Liberase為消化酵素的方法(T.J.Cavanagh et al.Transplantation Proceedings,30,367(1998))。
胰島的大小以50μm以上且400μm以下為佳，又以50μm以上且350μm以下為更佳。胰島的大小可使用顯微鏡的測微器來測量。胰島宜以含有10%以上之β細胞為特性。β細胞的比率上限並無特別限制，例如為80%。
所謂膜包含海藻酸，意指膜主要由海藻酸所構成。所謂膜包含聚鳥胺酸，意指膜主要由聚鳥胺酸所構成。
製劑宜在1個膠囊中含有1~5個胰島。
構成海藻酸膜的海藻酸之種類並無特別限制。構成聚鳥胺酸膜的聚鳥胺酸之種類並無特別限制。
以抑制纖維化之觀點來看，製劑之平均直徑以400μm以上為佳，又以420μm以上為更佳。平均直徑之上限並無特別限制，例如可設定為700μm以下、600μm以下、或500μm以下。平均直徑可由後述實施例採用的測定方法測定。
上述製劑對糖尿病的治療有用。糖尿病的種類並無特別限制，例如可舉第一型糖尿病。在其他方面，不論患者不易控制血糖的原因為何，上述製劑對其治療皆有用。
胰島之製造方法可任擇。在一實施形態中，胰島以包含下述步驟(a)~(g)為佳： 步驟(a)，調製含有胰島之海藻酸鈉溶液A； 步驟(b)，將該海藻酸鈉溶液A滴入二價陽離子溶液中，並回收已凝膠化之粒子； 步驟(c)，將在步驟(b)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液A中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(d)，將在步驟(c)回收的粒子添加於海藻酸鈉溶液B中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(e)，將在步驟(d)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液B中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(f)，將在步驟(e)回收的粒子添加於海藻酸鈉溶液C中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(g)，將在步驟(f)回收的粒子添加於檸檬酸鈉溶液中，攪拌預定時間，然後回收粒子。
海藻酸鈉溶液A的海藻酸鈉濃度並無特別限制，例如以1w/v%以上且3w/v%以下為佳。
就使膠囊化後的胰島之糖反應性良好之觀點來看，海藻酸鈉溶液A宜以10000IEQ/mL以上之濃度含有胰島。在此，IEQ意指以直徑150μm為基準的胰島數。胰島濃度以11,000IEQ/mL以上、或12,000IEQ/mL以上為佳。胰島濃度上限並無特別限制，例如可設為30,000IEQ/mL以下、25,000IEQ/mL以下。
海藻酸鈉溶液A只要能調製成以上述濃度含有胰島，則不限制其具體的調製方法。例如，在生理食鹽水中溶解適量海藻酸鈉，並於其中適量添加胰島，然後根據需要進行攪拌，即可製得海藻酸鈉溶液A。
關於在步驟(b)使用的二價陽離子溶液，只要在其中滴入海藻酸鈉溶液A後可得到包裹胰島之凝膠化粒子(膠囊)，則未有限制。構成此種二價陽離子溶液的二價陽離子，可舉能使二價金屬離子在水溶液中游離之鹽(例如，氯化鈣、乳酸鈣、氯化鋇及氯化鍶等)。在一實施形態中，較佳的鹽為氯化鈣，較佳的二價陽離子溶液為氯化鈣溶液。
二價陽離子溶液的二價陽離子濃度並無特別限制，例如可設定在50~500mM範圍內。
關於將海藻酸鈉溶液A滴入二價陽離子溶液中的形式，只要可得到包裹胰島之凝膠化粒子則未有限制。在一實施形態中，宜將海藻酸鈉溶液A通過適當大小之針頭滴入二價陽離子溶液中。
凝膠化粒子的回收可藉由任何方式實施，例如，使形成有凝膠化粒子的二價陽離子溶液靜置一定時間後去除上清液，或是重複進行前述動作。
關於在步驟(c)使用的聚L-鳥胺酸溶液A，只要是可將在步驟(b)中形成的凝膠化粒子包覆者，則無特別限制。例如，可藉由將聚L-鳥胺酸溶解於生理食鹽水來調製。
聚L-鳥胺酸溶液A的聚L-鳥胺酸濃度並無特別限制，就將製劑(膠囊)之平均直徑控制在50μm以上且400μm以下之觀點來看，以0.05w/v%以上且小於1w/v%為佳。在一實施形態中，聚L-鳥胺酸溶液A的聚L-鳥胺酸濃度以0.9w/v%以下或0.8w/v%以下為佳。
步驟(c)中所謂的「將在步驟(b)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液A中」，也包含將聚L-鳥胺酸溶液A添加於在步驟(b)回收的凝膠化粒子中的態樣。步驟(c)的攪拌速度及時間可任擇，例如以1分鐘~20分鐘為佳。
在步驟(c)中凝膠化粒子的回收形式可任擇，例如，可將聚L-鳥胺酸溶液A靜置一定時間後，去除上清液以回收凝膠化粒子。回收的凝膠化粒子宜具有海藻酸所形成之凝膠化層的表面經聚L-鳥胺酸包覆之構造。
關於在步驟(d)使用的海藻酸鈉溶液B，其可與在步驟(a)使用的海藻酸鈉溶液A為相同濃度亦可為不同濃度。在一實施形態中，關於海藻酸鈉溶液B之海藻酸鈉濃度，就包覆操作之容易性的觀點來看，宜小於海藻酸鈉溶液A之海藻酸鈉濃度。例如，海藻酸鈉溶液A之海藻酸鈉濃度為1w/v%以上且3w/v%以下的狀況下，海藻酸鈉溶液B之海藻酸鈉濃度以0.1w/v%以上且0.3w/v%以下為佳。
步驟(d)中所謂的「將在步驟(c)回收的粒子添加於海藻酸鈉溶液B中」，也包含將海藻酸鈉溶液B添加於在步驟(c)回收的凝膠化粒子中的態樣。步驟(d)的攪拌速度及時間可任擇，例如以攪拌1分鐘~15分鐘為佳。
在步驟(d)中凝膠化粒子的回收形式可任擇，例如，可將海藻酸鈉溶液B靜置一定時間後，去除上清液以回收凝膠化粒子。回收的凝膠化粒子宜為海藻酸所形成之凝膠化層的表面經聚L-鳥胺酸包覆，且在其上還具有海藻酸所形成之凝膠化層。
在一實施形態中，將在步驟(c)回收的粒子添加於海藻酸鈉溶液B中之前，宜先添加於聚L-鳥胺酸溶液A’中，攪拌預定時間，然後回收粒子，將其添加於步驟(d)的海藻酸鈉溶液B中。此處的聚L-鳥胺酸溶液A’可與聚L-鳥胺酸溶液A為相同濃度或為不同濃度。在一實施形態中，聚L-鳥胺酸溶液B之聚L-鳥胺酸濃度宜小於聚L-鳥胺酸溶液A之聚L-鳥胺酸濃度。例如，聚L-鳥胺酸溶液A’之聚L-鳥胺酸濃度以0.01w/v%以上且小於0.05w/v%為佳。
步驟(e)及步驟(f)基本上為步驟(c)及步驟(d)的重複。聚L-鳥胺酸溶液B的聚L-鳥胺酸濃度並無特別限制，但以0.01w/v%以上且小於0.05w/v%為佳。
步驟(e)中所謂的「將在步驟(d)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液B中」，也包含將聚L-鳥胺酸溶液B添加於在步驟(d)回收的凝膠化粒子中的態樣。步驟(e)的攪拌速度及時間可任擇，例如以1分鐘~20分鐘為佳。
在步驟(e)中凝膠化粒子的回收形式可任擇，例如，可將聚L-鳥胺酸溶液A靜置一定時間後，去除上清液以回收凝膠化粒子。回收的凝膠化粒子宜具有海藻酸所形成之凝膠化層的表面經聚L-鳥胺酸、海藻酸、及聚L-鳥胺酸包覆之構造。
關於在步驟(f)使用的海藻酸鈉溶液C，其可與在步驟(d)使用的海藻酸鈉溶液B為相同濃度亦可為不同濃度。例如，海藻酸鈉溶液C之海藻酸鈉濃度以0.1w/v%以上且0.3w/v%以下為佳。
步驟(f)中所謂的「將在步驟(e)回收的粒子添加於海藻酸鈉溶液C中」，也包含將海藻酸鈉溶液C添加於在步驟(e)回收的凝膠化粒子中的態樣。步驟(f)的攪拌速度及時間可任擇，例如以攪拌1分鐘~15分鐘為佳。
在步驟(f)中凝膠化粒子的回收形式可任擇，例如，可將海藻酸鈉溶液C靜置一定時間後，去除上清液以回收凝膠化粒子。回收的凝膠化粒子宜具有海藻酸所形成之凝膠化層的表面經聚L-鳥胺酸、海藻酸、聚L-鳥胺酸、及海藻酸包覆之構造。
關於在步驟(g)使用的檸檬酸鈉溶液，宜以0.5~3w/v%之濃度含有檸檬酸鈉。出於使凝膠化粒子內的陽離子螯合並從凝膠變為接近液狀以促使胰島素釋放之目的，可添加檸檬酸鈉溶液。
步驟(g)中所謂的「將在步驟(d)回收的粒子添加於檸檬酸鈉溶液中」，也包含將檸檬酸鈉溶液添加於在步驟(d)回收的凝膠化粒子中的態樣。步驟(e)的攪拌速度及時間可任擇，例如以1分鐘~15分鐘為佳。
在步驟(e)中凝膠化粒子的回收形式可任擇，例如，可將檸檬酸鈉溶液靜置一定時間後，去除上清液以回收凝膠化粒子。咸認為回收的凝膠化粒子內部更加接近液狀。
實施例 以下以實施例對本發明更加詳細進行說明，但本發明並不受其等限制。
1.三層膜製劑的製作 將單離自出生後14日之豬隻的幼豬來源之胰島，以16,000IEQ/mL的濃度懸浮於1.7w/v%海藻酸鈉溶液(Pronova)中。使其通過針頭，利用氣流切割懸浮液同時使其滴入109mM氯化鈣溶液中。從氯化鈣溶液中回收已固化之海藻酸珠粒，添加於0.075w/v%的聚L-鳥胺酸(PLO)(分子量5,000~15,000)溶液中，並攪拌10分鐘。回收珠粒，再添加於0.038w/v%PLO溶液中，攪拌6分鐘後予以回收，並添加於0.17w/v%海藻酸鈉溶液中攪拌6分鐘，最後添加於1.6%檸檬酸鈉溶液中攪拌2分鐘，而得到胰島經海藻酸膜、聚鳥胺酸膜、海藻酸膜的三層膜被覆之膠囊化胰島(製劑)。將所得膠囊化胰島以37℃在CO 2培養箱中培養25日。
2.五層膜製劑的製作1 將單離自出生後14日之豬隻的幼豬來源之胰島，以16,000IEQ/mL的濃度懸浮於1.7w/v%海藻酸鈉溶液(Pronova)中。使其通過針頭，利用氣流切割懸浮液同時使其滴入109mM氯化鈣溶液中。從氯化鈣溶液中回收已固化之海藻酸珠粒，添加於0.075w/v%的聚L-鳥胺酸(PLO)(分子量5,000~15,000)溶液中，並攪拌10分鐘。回收珠粒，再添加於0.038w/v%PLO溶液中，攪拌6分鐘後予以回收，並添加於0.17w/v%海藻酸鈉溶液中攪拌6分鐘。回收珠粒，再度添加於0.038w/v%PLO溶液中，攪拌6分鐘後予以回收，並添加於0.17w/v%海藻酸鈉溶液中攪拌6分鐘。最後添加於1.6%檸檬酸鈉溶液中攪拌2分鐘，而得到胰島經海藻酸膜、聚鳥胺酸膜、海藻酸膜、聚鳥胺酸膜、及海藻酸膜的五層膜被覆之膠囊化胰島(五層膜製劑1)。將所得膠囊化胰島以37℃在CO 2培養箱中培養25日。
3.五層膜製劑的製作2 將單離自出生後14日之豬隻的幼豬來源之胰島，以16,000IEQ/mL的濃度懸浮於1.7w/v%海藻酸鈉溶液(Pronova)中。使其通過針頭，利用氣流切割懸浮液同時使其滴入109mM氯化鈣溶液中。從氯化鈣溶液中回收已固化之海藻酸珠粒，添加於0.10w/v%的聚L-鳥胺酸(PLO)(分子量5,000~15,000)溶液中，並攪拌10分鐘。回收珠粒，再添加於0.05w/v%PLO溶液中，攪拌6分鐘後予以回收，並添加於0.17w/v%海藻酸鈉溶液中攪拌6分鐘。回收珠粒，再度添加於0.038w/v%PLO溶液中，攪拌6分鐘後予以回收，並添加於0.17w/v%海藻酸鈉溶液中攪拌6分鐘。最後添加於1.6%檸檬酸鈉溶液中攪拌2分鐘，而得到胰島經海藻酸膜、聚鳥胺酸膜、海藻酸膜、聚鳥胺酸膜、及海藻酸膜的五層膜被覆之膠囊化胰島(五層膜製劑2)。將所得膠囊化胰島以37℃在CO 2培養箱中培養25日。
4.五層膜製劑的製作3 將單離自出生後14日之豬隻的幼豬來源之胰島，以16,000IEQ/mL的濃度懸浮於1.7w/v%海藻酸鈉溶液(Pronova)中。使其通過針頭，利用氣流切割懸浮液同時使其滴入109mM氯化鈣溶液中。從氯化鈣溶液中回收已固化之海藻酸珠粒，添加於0.15w/v%的聚L-鳥胺酸(PLO)(分子量5,000~15,000)溶液中，並攪拌10分鐘。回收珠粒，再次添加於0.075w/v%PLO溶液中，攪拌6分鐘後予以回收，並添加於0.17w/v%海藻酸鈉溶液中攪拌6分鐘。回收珠粒，再度添加於0.038w/v%PLO溶液中，攪拌6分鐘後予以回收，並添加於0.17w/v%海藻酸鈉溶液中攪拌6分鐘。最後添加於1.6%檸檬酸鈉溶液中攪拌2分鐘，而得到胰島經海藻酸膜、聚鳥胺酸膜、海藻酸膜、聚鳥胺酸膜、及海藻酸膜的五層膜被覆之膠囊化胰島(五層膜製劑4)。將所得膠囊化胰島以37℃在CO 2培養箱中培養25日。
5.膠囊大小之測定 將膠囊化胰島取至6孔盤，使用實體顯微鏡(M165FC，Leica)以2倍的倍率拍攝膠囊。使用Leica Application Suite V3的圓分析工具，測定30個膠囊的直徑，並計算平均值。
6.膠囊強度之測定 將20~50個膠囊化胰島取至35mm培養皿，使用黏度測定裝置從上方壓破膠囊，測出膠囊被破壞時的力。將所施的力除以膠囊數，作為每1膠囊的強度。
7.胰島包埋量之測定 將胰島取至6孔盤，以50μm為級距計數50μm以上之胰島的個數。將各胰島數乘以依各個大小而定之係數，算出IEQ。將此等之和作為總IEQ，調整成為16,000IEQ並添加海藻酸鈉溶液。
8.使用糖尿病小鼠之有效性評價 將經STZ誘發糖尿病之C57BL/6J小鼠之腹部沿正中線微創切開。使用滅菌滴管，將懸浮於生理食鹽液中之膠囊化胰島以10,000IEQ/隻(IEQ/body)的用量移植於該處。移植後進行12週的飼育，並從小鼠的尾靜脈採血按時測定血糖值。 如圖1所示，已確認藉由五層膜製劑的投予，相較於三層膜製劑更能夠長期持續抑制糖尿病小鼠的血液中葡萄糖濃度的上升。
9.纖維化率之測定 將健全C57BL/6J小鼠之腹部沿正中線微創切開。使用滅菌滴管，將膠囊化胰島以1,000膠囊/隻(capsules/body)的用量移植於該處。移植1週後從腹腔內回收膠囊化胰島至裝有Hanks平衡鹽溶液(Hanks Balanced Salt Solution, HBSS)的125mL容器中。去除上清液，添加HBSS加以洗淨。將懸浮的膠囊化胰島取至35mm培養皿，計數經纖維母細胞被覆的膠囊個數。將纖維化膠囊數除以培養皿內的總膠囊數，以2個培養皿份的平均值示為纖維化率。 如圖2所示，已確認若膠囊化胰島的直徑約大於400μm，則其纖維化顯著被抑制。
圖1顯示投予膠囊化胰島後的糖尿病模式小鼠之血液中葡萄糖濃度測定結果。塗黑之四方形為投予三層膜製劑之結果，●為投予五層膜製劑1之結果，▲為投予五層膜製劑2之結果，×為投予五層膜製劑3之結果。 圖2顯示投予膠囊化胰島後的纖維化率之測定結果。塗黑之四方形為投予三層膜製劑之結果，●為投予五層膜製劑1之結果，▲為投予五層膜製劑2之結果，×為投予五層膜製劑3之結果。
(無)

Claims (8)

  1. 一種核心經5層膜被覆之製劑， 前述核心包含胰島；且 前述5層膜之由內側起算第1、第3、及第5層膜包含海藻酸，由內側起算第2及第4層膜包含聚鳥胺酸。
  2. 如請求項1    之製劑，該製劑之平均直徑為400μm以上。
  3. 如請求項1    或2之製劑，該製劑之平均直徑為400μm以上且500μm以下。
  4. 如請求項1    至3中任一項之製劑，其係糖尿病治療用。
  5. 如請求項1    至4中任一項之製劑，其中胰島為取自出生後1至3週之幼豬的胰島。
  6. 一種如請求項1至5中任一項之製劑之製造方法，該製造方法包含下述步驟： 步驟(a)，調製含有胰島之海藻酸鈉溶液A； 步驟(b)，將該海藻酸鈉溶液A滴入二價陽離子溶液中，並回收已凝膠化之粒子； 步驟(c)，將在步驟(b)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液A中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(d)，將在步驟(c)回收的粒子添加於海藻酸鈉溶液B中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(e)，將在步驟(d)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液B中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(f)，將在步驟(e)回收的粒子添加於海藻酸鈉溶液C中，攪拌預定時間，然後回收粒子； 步驟(g)，將在步驟(f)回收的粒子添加於檸檬酸鈉溶液中，攪拌預定時間，然後回收粒子。
  7. 如請求項6之方法，其中聚L-鳥胺酸溶液A的聚L-鳥胺酸濃度為0.05w/v%以上且小於1w/v%。
  8. 如請求項6或7之方法，其中於步驟(d)中，係將在步驟(c)回收的粒子添加於聚L-鳥胺酸溶液A’中，攪拌預定時間，然後予以回收後，添加於海藻酸鈉溶液B中。
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