KR20230026414A - 캡슐화 췌도 - Google Patents

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나호 이이즈카
히로후미 다무라
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가부시키가이샤 오츠까 세이야꾸 고죠
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Abstract

본 발명은 개량된 캡슐화 췌도를 제공하는 것에 관한 것이다. 개량화된 캡슐화 췌도는, 코어가 5중막으로 덮인 제제로서, 상기 코어는 췌도를 포함하고, 상기 5중막의 내측으로부터 1번째, 3번째 및 5번째의 막은 알긴산을 포함하고, 내측으로부터 2번째 및 4번째의 막은 폴리오르니틴을 포함하는, 제제이다.

Description

캡슐화 췌도
캡슐화 췌도에 관한 기술이 개시된다.
췌도 이식은 인체에의 부하가 비교적 적은 당뇨병의 치료 수단이지만, 이식된 췌도가 장기 생착하기 위해서는 강력한 면역 억제가 필수이며, 이식 환자에의 면역 억제제의 투여가 의료 현장에서는 실시되고 있다. 단 면역 억제제의 투여에는 부작용 등의 리스크가 있기 때문에, 미소한 마이크로 캡슐화에 의해 면역 격리를 하여 췌도를 다수 복강 내에 이식하는 방법이 검토되고 있으며, 이 경우, 면역 억제는 불필요하거나 혹은 투여량을 감쇠시키는 것이 가능하지만, 아직 충분한 치료 성적은 얻어지고 있지 않다.
WO2001/052871
METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.137, 575-580, 1988 TRANSPLANTATION, Vol.53, 1180-1183, No.6, June 1992 Bioartificial Pancreas, Vol., 98, No.6, 1996, 1417-1422 Drug Delivery System, Vol., 12, No.2, 1997 JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS, 2013 VOL., 101B, ISSUE 2, 258-268
개량된 캡슐화 췌도를 제공하는 것이 하나의 과제이다.
이러한 과제의 해결 수단으로서 하기를 포함하는 발명이 제공된다.
항 1.
코어가 5중막으로 덮인 제제로서,
상기 코어는 췌도를 포함하고,
상기 5중막의 내측으로부터 1번째, 3번째 및 5번째의 막은 알긴산을 포함하고, 내측으로부터 2번째 및 4번째의 막은 폴리오르니틴을 포함하는, 제제.
항 2.
제제의 평균 직경이 400 ㎛ 이상인, 항 1에 기재된 제제.
항 3.
제제의 평균 직경이 400 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하인, 항 1 또는 2에 기재된 제제.
항 4.
당뇨병 치료용인, 항 1∼3 중 어느 하나에 기재된 제제.
항 5.
췌도가, 생후 1∼3주령의 유약 돼지로부터 취득한 췌도인, 항 1∼4 중 어느 하나에 기재된 제제.
항 6.
(a) 췌도를 함유하는 알긴산나트륨 용액 A를 조제하는 공정,
(b) 상기 알긴산나트륨 용액 A를 2가 양이온 용액에 적하하여, 겔화한 입자를 회수하는 공정,
(c) 공정 (b)에서 회수한 입자를 폴리L-오르니틴 용액 A에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정,
(d) 공정 (c)에서 회수한 입자를 알긴산나트륨 용액 B에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정,
(e) 공정 (d)에서 회수한 입자를 폴리L-오르니틴 용액 B에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정,
(f) 공정 (e)에서 회수한 입자를 알긴산나트륨 용액 C에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정, 및
(g) 공정 (f)에서 회수한 입자를 시트르산나트륨 용액에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정을 포함하는, 항 1∼5 중 어느 하나에 기재된 제제의 제조 방법.
항 7.
폴리L-오르니틴 용액 A의 폴리L-오르니틴 농도가 0.05 w/v% 이상 1 w/v% 미만인, 항 6에 기재된 방법.
항 8.
공정 (d)에 있어서, 공정 (c)에서 회수한 입자를, 폴리L-오르니틴 용액 A'에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 회수한 후에, 알긴산나트륨 용액 B에 첨가하는, 항 6 또는 7에 기재된 방법.
당뇨병의 치료에 유효한 수단이 제공된다.
도 1은 캡슐화 췌도 투여 후의 당뇨병 모델 마우스에 있어서의 혈중 글루코오스 농도를 측정한 결과를 나타낸다. 검게 칠한 사각은 삼중막 제제를 투여한 결과이고, ●는 오중막 제제 1을 투여한 결과이고, ▲는 오중막 제제 2를 투여한 결과이고, ×는 오중막 제제 3을 투여한 결과이다.
도 2는 캡슐화 췌도 투여 후의 섬유화율을 측정한 결과를 나타낸다. 검게 칠한 사각은 삼중막 제제를 투여한 결과이고, ●는 오중막 제제 1을 투여한 결과이고, ▲는 오중막 제제 2를 투여한 결과이고, ×는 오중막 제제 3을 투여한 결과이다.
제제는, 코어가 5중의 막으로 덮인 제제이고, 상기 코어는 췌도를 포함하고, 상기 5중막의 내측으로부터 1번째, 3번째 및 5번째의 막은 알긴산을 포함하고, 내측으로부터 2번째 및 4번째의 막은 폴리오르니틴을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 제제는, 보다 장기에 걸쳐 혈당값을 적절한 범위로 유지하는 것을 가능하게 할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 제제는, 5중보다 많은 막(예컨대, 6중막, 7중막, 8중막, 9중막, 또는 10중막)으로 덮여 있어도 좋다. 오중의 막으로 덮인 제제란, 후술하는 바와 같은 막을 형성하는 공정을 5회 포함하는 방법으로 조제된 제제인 것을 의미할 수 있다.
췌도의 종류는, 임의이며 특별히 제한되지 않는다. 췌도는, 인슐린 산생 β 세포, 글루카곤 함유 α 세포, 소마토스타틴 분비 델타 세포, 및 췌장 폴리펩티드 함유 세포(PP 세포)를 포함하는 것이 바람직하다. 췌도는, 그 대부분이 인슐린 산생 β 세포인 것이 바람직하다. 췌도의 유래는, 목적에 따라 선택할 수 있고, 인간, 돼지, 마우스, 래트, 원숭이, 또는 개인 것이 바람직하다. 일 실시형태에 있어서, 췌도는, 돼지 유래인 것이 바람직하고, 유약 돼지(예컨대, 생후 3일∼4주일 또는 생후 7일∼3주일)의 췌도인 것이 바람직하다. 췌도는, 해당 기술분야에 있어서 알려져 있는 방법을 임의로 채용함으로써 얻을 수 있다. 예컨대, 소화 효소에 Liberase를 이용하는 방법(T. J. Cavanagh et al. Transplantation Proceedings, 30, 367(1998))을 바람직하게 이용할 수 있다.
췌도의 사이즈는, 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하가 바람직하고, 50 ㎛ 이상 350 ㎛ 이하가 보다 바람직하다. 췌도의 사이즈는, 현미경의 마이크로미터를 이용하여 측정할 수 있다. 췌도는, β 세포를 10% 이상 포함하고 있는 것이 특성으로서 바람직하다. β 세포의 비율의 상한은 특별히 없지만, 예컨대, 80%이다.
막이 알긴산을 포함하는 것은, 막이 주로 알긴산으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 막이 폴리오르니틴을 포함하는 것은, 막이 주로 폴리오르니틴으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
제제는, 1 캡슐 중에 1∼5의 췌도를 함유하는 것이 바람직하다.
알긴산의 막을 구성하는 알긴산의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 폴리오르니틴의 막을 구성하는 폴리오르니틴의 종류는 특별히 제한되지 않는다.
제제는, 섬유화를 억제하는 관점에서 평균 직경이 400 ㎛ 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 420 ㎛ 이상이다. 평균 직경의 상한은 특별히 없지만, 예컨대, 700 ㎛ 이하, 600 ㎛ 이하, 또는 500 ㎛ 이하로 설정할 수 있다. 평균 직경은, 후술하는 실시예에서 채용한 측정 방법으로 측정할 수 있다.
전술한 제제는, 당뇨병의 치료에 유용하다. 당뇨병의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 1형 당뇨병을 들 수 있다. 그 외에, 상기 제제는, 원인을 막론하고 혈당 컨트롤이 어려운 환자의 치료에 유용하다.
췌도의 제조 방법은 임의이다. 일 실시형태에 있어서, 췌도는, 다음의 공정 (a)∼(g)를 포함하는 것이 바람직하다:
(a) 췌도를 함유하는 알긴산나트륨 용액 A를 조제하는 공정,
(b) 상기 알긴산나트륨 용액 A를 2가 양이온 용액에 적하하여, 겔화한 입자를 회수하는 공정,
(c) 공정 (b)에서 회수한 입자를 폴리L-오르니틴 용액 A에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정,
(d) 공정 (c)에서 회수한 입자를 알긴산나트륨 용액 B에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정,
(e) 공정 (d)에서 회수한 입자를 폴리L-오르니틴 용액 B에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정,
(f) 공정 (e)에서 회수한 입자를 알긴산나트륨 용액 C에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정, 및
(g) 공정 (f)에서 회수한 입자를 시트르산나트륨 용액에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정.
알긴산나트륨 용액 A의 알긴산나트륨 농도는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 1 w/v% 이상 3 w/v% 이하인 것이 바람직하다.
알긴산나트륨 용액 A는, 췌도를 10000 IEQ/mL 이상의 농도로 함유하는 것이, 캡슐화 후의 췌도의 당 응답성을 양호하게 한다는 관점에서 바람직하다. 여기서, IEQ란, 직경 150 ㎛를 기준으로 한 췌도의 수를 의미한다. 췌도 농도는, 11,000 IEQ/mL 이상, 또는 12,000 IEQ/mL 이상인 것이 바람직하다. 췌도 농도의 상한은 특별히 제한은 없지만, 예컨대, 30,000 IEQ/mL 이하, 25,000 IEQ/mL 이하로 할 수 있다.
알긴산나트륨 용액 A는, 췌도를 상기와 같은 농도로 함유하도록 조제되는 한, 그 구체적인 조제 방법은 제한되지 않는다. 예컨대, 생리 식염수에 적량의 알긴산나트륨을 용해하고, 거기에 적량에 췌도를 첨가하여, 필요에 따라 교반함으로써, 알긴산나트륨 용액 A를 얻을 수 있다.
공정 (b)에서 사용하는 2가 양이온 용액은, 그곳에 알긴산나트륨 용액 A를 적하함으로써, 췌도를 포함한 겔화 입자(캡슐)가 얻어지는 한 제한되지 않는다. 이러한 2가 양이온 용액을 구성하는 2가 양이온으로서는, 수용액 중에서 2가의 금속 이온을 유리하는 염(예컨대, 염화칼슘, 젖산칼슘, 염화바륨, 및 염화스트론튬 등)을 들 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 바람직한 염은 염화칼슘이고, 바람직한 2가 양이온 용액은 염화칼슘 용액이다.
2가 양이온 용액의 2가 양이온의 농도는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 50∼500 mM의 범위로 설정할 수 있다.
2가 양이온 용액에의 알긴산나트륨 용액 A의 적하 양식은, 췌도를 포함하는 겔화 입자가 얻어지는 한 제한되지 않는다. 일 실시형태에 있어서, 2가 양이온 용액에, 알긴산나트륨 용액 A를 적당한 크기의 니들을 통하여 적하하는 것이 바람직하다.
겔화 입자의 회수는, 임의이며, 예컨대, 겔화 입자가 형성된 2가 양이온 용액을 일정 시간 정치하고, 상청을 제거하는 것 또는 이것을 반복하는 것에 의해, 실시할 수 있다.
공정 (c)에서 사용되는 폴리L-오르니틴 용액 A는, 공정 (b)에서 형성된 겔화 입자를 코팅할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 폴리L-오르니틴을 생리 식염수에 용해함으로써 조제할 수 있다.
폴리L-오르니틴 용액 A에 있어서의 폴리L-오르니틴의 농도는 특별히 제한되지 않지만, 0.05 w/v% 이상 1 w/v% 미만이 제제(캡슐)의 평균 직경을 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하로 제어하는 관점에서 바람직하다. 일 실시형태에 있어서, 폴리L-오르니틴 용액 A에 있어서의 폴리L-오르니틴의 농도는 0.9 w/v% 이하 또는 0.8 w/v% 이하인 것이 바람직하다.
공정 (c)의 「공정 (b)에서 회수한 입자를 폴리L-오르니틴 용액 A에 첨가」란, 공정 (b)에서 회수한 겔화 입자에 폴리L-오르니틴 용액 A를 첨가하는 양태도 포함한다. 공정 (c)에 있어서의 교반의 속도 및 시간은 임의이며, 예컨대, 1분간∼20분간이 바람직하다.
공정 (c)에 있어서의 겔화 입자의 회수의 양식은 임의이며, 예컨대, 폴리L-오르니틴 용액 A를 일정 시간 정치시키고, 상청을 제거함으로써 겔화 입자를 회수할 수 있다. 회수된 겔화 입자는, 알긴산에 의한 겔화층의 표면이 폴리L-오르니틴으로 코팅된 구조를 갖는 것이 바람직하다.
공정 (d)에서 사용하는 알긴산나트륨 용액 B는, 공정 (a)에서 사용하는 알긴산나트륨 용액 A와 동일 농도여도 달라도 좋다. 일 실시형태에 있어서, 알긴산나트륨 용액 B의 알긴산나트륨 농도는, 코팅 조작의 용이성이라는 관점에서 알긴산나트륨 용액 A의 알긴산나트륨 농도보다 낮은 것이 바람직하다. 예컨대, 알긴산나트륨 용액 A의 알긴산나트륨 농도가 1 w/v% 이상 3 w/v% 이하인 경우, 알긴산나트륨 용액 B의 알긴산나트륨 농도는 0.1 w/v% 이상 0.3 w/v% 이하인 것이 바람직하다.
공정 (d)의 「공정 (c)에서 회수한 입자를 알긴산나트륨 용액 B에 첨가」란, 공정 (c)에서 회수한 겔화 입자에 알긴산나트륨 용액 B를 첨가하는 양태도 포함한다. 공정 (d)에 있어서의 교반의 속도 및 시간은 임의이며, 예컨대, 1분간∼15분간 교반하는 것이 바람직하다.
공정 (d)에 있어서의 겔화 입자의 회수의 양식은 임의이며, 예컨대, 알긴산나트륨 용액 B를 일정 시간 정치시키고, 상청을 제거함으로써 겔화 입자를 회수할 수 있다. 회수된 겔화 입자는, 알긴산에 의한 겔화층의 표면이 폴리L-오르니틴으로 코팅되고, 또한 그 위에 알긴산에 의한 겔화층을 갖는 것이 바람직하다.
일 실시형태에 있어서, 공정 (c)에서 회수한 입자를, 알긴산나트륨 용액 B에 첨가하기 전에, 폴리L-오르니틴 용액 A'에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하고, 그것을 공정 (d)의 알긴산나트륨 용액 B에 첨가하는 것이 바람직하다. 여기서, 폴리L-오르니틴 용액 A'는, 폴리L-오르니틴 용액 A와 동일 농도 또는 달라도 좋다. 일 실시형태에 있어서, 폴리L-오르니틴 용액 B의 폴리L-오르니틴 농도는, 폴리L-오르니틴 용액 A의 폴리L-오르니틴 농도보다 낮은 것이 바람직하다. 예컨대, 폴리L-오르니틴 용액 A'의 폴리L-오르니틴 농도는 0.01 w/v% 이상 0.05 w/v% 미만인 것이 바람직하다.
공정 (e) 및 공정 (f)는 기본적으로 공정 (c) 및 공정 (d)의 반복이다. 폴리L-오르니틴 용액 B에 있어서의 폴리L-오르니틴의 농도는 특별히 제한되지 않지만, 0.01 w/v% 이상 0.05 w/v% 미만이 바람직하다.
공정 (e)의 「공정 (d)에서 회수한 입자를 폴리L-오르니틴 용액 B에 첨가」란, 공정 (d)에서 회수한 겔화 입자에 폴리L-오르니틴 용액 B를 첨가하는 양태도 포함한다. 공정 (e)에 있어서의 교반의 속도 및 시간은 임의이며, 예컨대, 1분간∼20분간이 바람직하다.
공정 (e)에 있어서의 겔화 입자의 회수의 양식은 임의이며, 예컨대, 폴리L-오르니틴 용액 A를 일정 시간 정치시키고, 상청을 제거함으로써 겔화 입자를 회수할 수 있다. 회수된 겔화 입자는, 알긴산에 의한 겔화층의 표면이 폴리L-오르니틴, 알긴산, 및 폴리L-오르니틴으로 코팅된 구조를 갖는 것이 바람직하다.
공정 (f)에서 사용하는 알긴산나트륨 용액 C는, 공정 (d)에서 사용하는 알긴산나트륨 용액 B와 동일 농도여도 달라도 좋다. 예컨대, 알긴산나트륨 용액 C의 알긴산나트륨 농도는 0.1 w/v% 이상 0.3 w/v% 이하인 것이 바람직하다.
공정 (f)의 「공정 (e)에서 회수한 입자를 알긴산나트륨 용액 C에 첨가」란, 공정 (e)에서 회수한 겔화 입자에 알긴산나트륨 용액 C를 첨가하는 양태도 포함한다. 공정 (f)에 있어서의 교반의 속도 및 시간은 임의이며, 예컨대, 1분간∼15분간 교반하는 것이 바람직하다.
공정 (f)에 있어서의 겔화 입자의 회수의 양식은 임의이며, 예컨대, 알긴산나트륨 용액 C를 일정 시간 정치시키고, 상청을 제거함으로써 겔화 입자를 회수할 수 있다. 회수된 겔화 입자는, 알긴산에 의한 겔화층의 표면이 폴리L-오르니틴, 알긴산, 폴리L-오르니틴, 및 알긴산으로 코팅된 구조를 갖는 것이 바람직하다.
공정 (g)에서 사용하는 시트르산나트륨 용액은, 0.5∼3 w/v%의 농도로 시트르산나트륨을 함유하는 것이 바람직하다. 겔화 입자 내의 양이온을 킬레이트하여, 겔로부터 액형에 근접시킴으로써 인슐린 방출을 재촉할 목적으로 시트르산나트륨 용액을 첨가할 수 있다.
공정 (g)의 「공정 (d)에서 회수한 입자를 시트르산나트륨 용액에 첨가」란, 공정 (d)에서 회수한 겔화 입자에 시트르산나트륨 용액을 첨가하는 양태도 포함한다. 공정 (e)에 있어서의 교반의 속도 및 시간은 임의이며, 예컨대, 1분간∼15분간인 것이 바람직하다.
공정 (e)에 있어서의 겔화 입자의 회수의 양식은 임의이며, 예컨대, 시트르산나트륨 용액을 일정 시간 정치시키고, 상청을 제거함으로써 겔화 입자를 회수할 수 있다. 회수된 겔화 입자는, 내부가 보다 액형에 근접하고 있다고 생각된다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다.
1. 삼중막 제제의 제작
1.7 w/v% 알긴산나트륨 용액(Pronova)에 생후 14일령의 돼지로부터 단리한 유약 돼지 유래 췌도를 16,000 IEQ/mL의 농도로 현탁하였다. 이것을 니들에 통과시켜, 에어플로우에 의해 현탁액을 컷트하면서 109 mM 염화칼슘 용액 중에 적하시켰다. 염화칼슘 용액으로부터 고화한 알긴산 비드를 회수하고, 0.075 w/v%의 폴리L-오르니틴(PLO)(분자량 5,000∼15,000) 용액에 첨가하여, 10분간 교반하였다. 비드를 회수하고, 또한 0.038 w/v% PLO 용액에 첨가하여, 6분간 교반하여 회수하고, 0.17 w/v% 알긴산나트륨 용액에 첨가하여 6분간 교반하고, 마지막으로 1.6% 시트르산나트륨 용액에 첨가하여 2분간 교반시켜, 췌도가 알긴산막, 폴리오르니틴막, 알긴산막이라고 하는 삼중막으로 덮인 캡슐화 췌도(제제)를 얻었다. 얻어진 캡슐화 췌도를 37℃로 CO2 인큐베이터 속에서 25일간 배양하였다.
2. 오중막 제제의 제작 1
1.7 w/v% 알긴산나트륨 용액(Pronova)에 생후 14일령의 돼지로부터 단리한 유약 돼지 유래 췌도를 16,000 IEQ/mL의 농도로 현탁하였다. 이것을 니들에 통과시켜, 에어플로우에 의해 현탁액을 컷트하면서 109 mM 염화칼슘 용액 중에 적하시켰다. 염화칼슘 용액으로부터 고화한 알긴산비드를 회수하고, 0.075 w/v%의 폴리L-오르니틴(PLO)(분자량 5,000∼15,000) 용액에 첨가하여, 10분간 교반하였다. 비드를 회수하고, 또한 0.038 w/v% PLO 용액에 첨가하여, 6분간 교반하여 회수하고, 0.17 w/v% 알긴산나트륨 용액에 첨가하여 6분간 교반하였다. 비드를 회수하고, 재차 0.038 w/v% PLO 용액에 첨가하여, 6분간 교반하여 회수하고, 0.17 w/v% 알긴산나트륨 용액에 첨가하여 6분간 교반하였다. 마지막으로 1.6% 시트르산나트륨 용액에 첨가하여 2분간 교반시켜, 췌도가 알긴산막, 폴리오르니틴막, 알긴산막, 폴리오르니틴막, 및 알긴산막이라고 하는 오중막으로 덮인 캡슐화 췌도(오중막 제제 1)를 얻었다. 얻어진 캡슐화 췌도를 37℃로 CO2 인큐베이터 속에서 25일간 배양하였다.
3. 오중막 제제의 제작 2
1.7 w/v% 알긴산나트륨 용액(Pronova)에 생후 14일령의 돼지로부터 단리한 유약 돼지 유래 췌도를 16,000 IEQ/mL의 농도로 현탁하였다. 이것을 니들에 통과시켜, 에어플로우에 의해 현탁액을 컷트하면서 109 mM 염화칼슘 용액 중에 적하시켰다. 염화칼슘 용액으로부터 고화한 알긴산비드를 회수하고, 0.10 w/v%의 폴리L-오르니틴(PLO)(분자량 5,000∼15,000) 용액에 첨가하여, 10분간 교반하였다. 비드를 회수하고, 또한 0.05 w/v% PLO 용액에 첨가하여, 6분간 교반하여 회수하고, 0.17 w/v% 알긴산나트륨 용액에 첨가하여 6분간 교반하였다. 비드를 회수하고, 재차 0.038 w/v% PLO 용액에 첨가하여, 6분간 교반하여 회수하고, 0.17 w/v% 알긴산나트륨 용액에 첨가하여 6분간 교반하였다. 마지막으로 1.6% 시트르산나트륨 용액에 첨가하여 2분간 교반시켜, 췌도가 알긴산막, 폴리오르니틴막, 알긴산막, 폴리오르니틴막, 및 알긴산막이라고 하는 오중막으로 덮인 캡슐화 췌도(오중막 제제 2)를 얻었다. 얻어진 캡슐화 췌도를 37℃로 CO2 인큐베이터 속에서 25일간 배양하였다.
4. 오중막 제제의 제작 3
1.7 w/v% 알긴산나트륨 용액(Pronova)에 생후 14일령의 돼지로부터 단리한 유약 돼지 유래 췌도를 16,000 IEQ/mL의 농도로 현탁하였다. 이것을 니들에 통과시켜, 에어플로우에 의해 현탁액을 컷트하면서 109 mM 염화칼슘 용액 중에 적하시켰다. 염화칼슘 용액으로부터 고화한 알긴산비드를 회수하고, 0.15 w/v%의 폴리L-오르니틴(PLO)(분자량 5,000∼15,000) 용액에 첨가하여, 10분간 교반하였다. 비드를 회수하고, 또한 0.075 w/v% PLO 용액에 첨가하여, 6분간 교반하여 회수하고, 0.17 w/v% 알긴산나트륨 용액에 첨가하여 6분간 교반하였다. 비드를 회수하고, 재차 0.038 w/v% PLO 용액에 첨가하여, 6분간 교반하여 회수하고, 0.17 w/v% 알긴산나트륨 용액에 첨가하여 6분간 교반하였다. 마지막으로 1.6% 시트르산나트륨 용액에 첨가하여 2분간 교반시켜, 췌도가 알긴산막, 폴리오르니틴막, 알긴산막, 폴리오르니틴막, 및 알긴산막이라고 하는 오중막으로 덮인 캡슐화 췌도(오중막 제제 4)를 얻었다. 얻어진 캡슐화 췌도를 37℃로 CO2 인큐베이터 속에서 25일간 배양하였다.
5. 캡슐 사이즈의 측정
6 웰 플레이트에 캡슐화 췌도를 취하여, 실체 현미경(M165FC, Leica)을 이용하여 2배의 배율로 캡슐을 촬영하였다. Leica Application Suite V3의 원 분석 툴을 이용하여, 30개의 캡슐의 직경을 측정하고, 평균값을 계산하였다.
6. 캡슐 강도의 측정
35 ㎜ 디쉬에 캡슐화 췌도를 20∼50개 취하여, 점도 측정 장치를 이용하여 캡슐을 위로부터 찌부러뜨려, 캡슐이 파괴되었을 때의 힘을 측정하였다. 가해진 힘을 캡슐 수로 나누어, 1 캡슐당의 강도로 하였다.
7. 췌도 포매량의 측정
6 웰 플레이트에 췌도를 취하여, 50 ㎛ 이상의 췌도의 개수를 50 ㎛씩 카운트하였다. 각 췌도 수에 사이즈마다 결정된 팩터를 곱하여, IEQ를 산출하였다. 이들의 합을 총 IEQ로 하여, 16,000 IEQ가 되도록 조정하여 알긴산나트륨을 더하였다.
8. 당뇨병 마우스를 이용한 유효성 평가
STZ에 의해 당뇨병을 유도한 C57BL/6J 마우스의 복부를 정중선을 따라 소절개하였다. 그곳에 멸균 스포이드를 이용하여 생리 식염액에 현탁한 캡슐화 췌도를 10,000 IEQ/body의 용량으로 이식하였다. 이식 후는 12주간 사육을 행하여, 마우스의 미정맥으로부터 채혈하여 경시적으로 혈당값을 측정하였다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 오중막 제제의 투여에 의해, 삼중막 제제보다 장기간에 걸쳐, 당뇨병 마우스에 있어서의 혈중 글루코오스 농도의 상승을 억제할 수 있는 것이 확인되었다.
9. 섬유화율의 측정
건강 C57BL/6J 마우스의 복부를 정중선을 따라 소절개하였다. 그곳에 멸균 스포이드를 이용하여 캡슐화 췌도를 1,000 capsules/body의 용량으로 이식하였다. 이식으로부터 일주일 후에 복강 내로부터, Hanks Balanced Salt Solution(HBSS)이 든 125 mL 컨테이너에 캡슐화 췌도를 회수하였다. 상청을 제거하고, HBSS를 더하여 세정하였다. 현탁한 캡슐화 췌도를 35 ㎜ 디쉬에 취하여, 섬유아 세포로 덮인 캡슐 개수를 카운트하였다. 섬유화 캡슐 수를 디쉬 내의 전체 캡슐 수로 나누어, 2 디쉬분의 평균값을 섬유화율로서 나타내었다.
도 2에 나타내는 바와 같이, 캡슐화 췌도의 직경이 대략 400 ㎛를 넘으면, 그 섬유화가 유의하게 억제되는 것이 확인되었다.

Claims (8)

  1. 코어가 5중막으로 덮인 제제로서,
    상기 코어는 췌도를 포함하고,
    상기 5중막의 내측으로부터 1번째, 3번째 및 5번째의 막은 알긴산을 포함하고, 내측으로부터 2번째 및 4번째의 막은 폴리오르니틴을 포함하는, 제제.
  2. 제1항에 있어서, 제제의 평균 직경이 400 ㎛ 이상인 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제제의 평균 직경이 400 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하인 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병 치료용인 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 췌도가 생후 1∼3주령의 유약(幼若) 돼지로부터 취득한 췌도인 제제.
  6. (a) 췌도를 함유하는 알긴산나트륨 용액 A를 조제하는 공정,
    (b) 상기 알긴산나트륨 용액 A를 2가 양이온 용액에 적하하여, 겔화한 입자를 회수하는 공정,
    (c) 공정 (b)에서 회수한 입자를 폴리L-오르니틴 용액 A에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정,
    (d) 공정 (c)에서 회수한 입자를 알긴산나트륨 용액 B에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정,
    (e) 공정 (d)에서 회수한 입자를 폴리L-오르니틴 용액 B에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정,
    (f) 공정 (e)에서 회수한 입자를 알긴산나트륨 용액 C에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정, 및
    (g) 공정 (f)에서 회수한 입자를 시트르산나트륨 용액에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 입자를 회수하는 공정을 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 제제의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 폴리L-오르니틴 용액 A의 폴리L-오르니틴 농도가 0.05 w/v% 이상 1 w/v% 미만인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 공정 (d)에 있어서, 공정 (c)에서 회수한 입자를, 폴리L-오르니틴 용액 A'에 첨가하여, 소정 시간 교반 후, 회수한 후에, 알긴산나트륨 용액 B에 첨가하는 방법.
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