TW202212355A - 多特異性抗體及其用途、用於產生其之方法、包括其之藥物組合物、編碼其之核酸序列、包括核酸序列的載體及包括載體的宿主細胞 - Google Patents

多特異性抗體及其用途、用於產生其之方法、包括其之藥物組合物、編碼其之核酸序列、包括核酸序列的載體及包括載體的宿主細胞 Download PDF

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Abstract

本發明是有關於多特異性抗體，多特異性抗體包括與間皮素特異性結合的2個抗體基結合域（MSLN-BD）和與CD3特異性結合的至少一抗體基結合域（CD3-BD）； 其中多特異性抗體不包括免疫球蛋白Fc區多肽，並且其中當通過表面電漿共振測量時，每個MSLN-BD以0.5至20nM範圍內的單價解離常數(K D)結合於間皮素（MSLN）。本發明更有關於編碼多特異性抗體的核酸序列、包含核酸序列的載體、包含核酸序列或載體的宿主細胞、 以及生產多特異性抗體的方法。此外，本發明是有關於包括多特異性抗體的藥物組合物及其使用方法。

Description

多特異性抗體
本發明是有關於多特異性抗體，多特異性抗體包括與間皮素特異性結合的2個抗體基結合域（MSLN-BD)；以及與CD3特異性結合的至少一抗體基結合域(CD3-BD)；其中多特異性抗體不包括免疫球蛋白Fc區多肽，且其中當通過表面電漿共振（SPR）測量時，每個MSLN-BD以0.5至20 nM範圍內的單價解離常數(K D)結合間皮素(MSLN)。本發明進一步有關於編碼多特異性抗體的核酸序列、包含核酸序列的載體、包括核酸序列或載體的宿主細胞、 以及生產多特異性抗體的方法。 此外，本發明有關於包括多特異性抗體的藥物組合物及其使用方法。
儘管在其治療方面取得了相當大的進展，但癌症繼續構成主要的未滿足的醫療需求。近年來，隨著各種分子類別免疫療法的出現，癌症治療取得了一些最重大的進展，包括但不限於：單株抗體（mAbs）、雙特異性抗體（bsAbs）、重組蛋白和嵌合抗原受體-T細胞（chimeric antigen receptor-T cell, CAR-T cell）療法。此類療法通過以下方式誘導抗腫瘤免疫：a) 主動將免疫效應細胞（immune-effector cell）引導至腫瘤駐留細胞（tumor-resident cell）和/或b) 刺激免疫效應細胞和/或c) 緩解腫瘤調節的免疫抑制（tumor-mediated immune-suppression）。與腫瘤外基因座（extratumoral loci）相比，這些免疫療法通常利用腫瘤駐留細胞（例如，惡性細胞、腫瘤血管分布細胞(cells of the tumor vasculature)、基質細胞、免疫細胞等）對特定抗原的過度表現，以將其藥理活性靶向腫瘤。在這些抗原中，腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen, TAA）包括由惡性細胞選擇性過度表現的細胞表面蛋白。通過以高親和力與腫瘤相關抗原結合，免疫療法可以在一定程度上限制其對腫瘤細胞和免疫效應細胞之間的免疫突觸的免疫調節活性。
一類常見的腫瘤相關抗原結合免疫療法（TAA-binding immunotherapeutics）是單株抗體，其通過調理腫瘤細胞並通過Fcγ受體(FcγR)表達細胞、主要自然殺手細胞觸發抗體依賴性細胞調節的細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）來引發抗腫瘤免疫。其他腫瘤相關抗原結合免疫療法利用（leverage）細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）誘導惡性細胞的標靶清除，例如嵌合抗原受體-T細胞以及同時結合T細胞抗原CD3的雙功能抗體（TAA/CD3雙特異性抗體）。
雖然腫瘤相關抗原結合-(重新)定向的細胞毒性T淋巴細胞和常規TAA/CD3雙特異性抗體的治療效用已經得到臨床驗證，但劑量限制性毒性(dose-limiting toxicities, DLTs)通常阻止以最大有效劑量 （maximally effective doses, MEDs）給藥或導致治療中斷，導致療效有限。
劑量限制性毒性的一個原因是常規TAA/CD3雙特異性抗體通常也與細胞激素釋放症候群（cytokine release syndrome, CRS）相關，推測是由於抗CD3結構域的過度活性。免疫療法的腫瘤外活性導致健康組織中促發炎細胞激素的分泌，這可能導致不良的安全狀況。此外，雖然TAA/CD3雙特異性抗體有效地消耗TAA過度表現細胞，但它們通過補充（recruit）和刺激CTL來實現，無論這些細胞是否表達識別腫瘤抗原（即腫瘤反應性T細胞）的T細胞受體（T cell receptor, TCR）。因此，TAA/CD3雙特異性抗體並非是刺激或再活化宿主的天賦抗腫瘤免疫，而是任意地刺激CTL，潛在地構成安全風險。
儘管產生此類DLT的確切途徑可能會有所不同，但通常可以通過增強藥理活性的腫瘤定位來最小化或消除免疫治療相關毒性的風險。
幾乎專門在癌細胞上表達的TAA（例如致癌胎兒腫瘤抗原(oncofetal tumor antigen)），被稱為清潔TAA（clean TAA）。在正常的非癌細胞上也表達的TAA——通常與癌細胞相比水平較低——被認為是非清潔TAA（non-clean TAA）。由於TAA/CD3雙特異性抗體的方法的效力非常高，非清潔TAA 是一個挑戰，因為非清潔TAA會損害也表達TAA的非腫瘤細胞。間皮素(Mesothelin, MSLN)是非清潔TAA的一個例子；它不僅在腫瘤細胞上表達，而且也在各種其他組織中表達，儘管水平較低。因此，當靶向非清潔TAA時，需要新的療法來提高TAA/CD3雙特異性抗體的方法對腫瘤組織的選擇性並最大限度地減少腫瘤/標靶上效應。這尤其適用於MSLN/CD3雙特異性抗體的方法。
間皮素(MSLN)已被提出作為腫瘤相關抗原(TAA)，其可標靶治療MSLN +實體癌（例如間皮瘤）。許多其他類型的癌症也是MSLN +，包括某些形式的卵巢癌和胰腺癌，以及三陰性乳癌。目前間皮瘤的護理標準包括腫瘤切除術、化學療法和放射療法，以及諸如減少液體和疼痛管理等緩和措施。針對持續增長的腫瘤的免疫療法包括使用PD-1/PD-L1阻斷劑（例如派立珠單抗(pembrolizumab)和納武單抗(nivolumab)）或抗CTLA4抗體（例如伊匹單抗(ipilimumab)）來刺激免疫系統，以及使用血管內皮生長因子（VEGF）抑製劑（例如貝伐單抗(bevacizumab)）來阻斷血管新生。雖然這些療法已取得臨床成功，但它們帶來全身副作用的風險更高。因此，需要一種針對MSLN的特定方法。
許多臨床前和早期臨床研究已經或正在進行中，以評估通過幾種不同方法之標靶MSLN的可行性，包括基於抗體的藥物和CAR-T細胞。基於抗體的藥物包括標靶MSLN表達的細胞，具有：抗MSLN片段SS1P免疫毒素與化療藥物（例如培美曲塞(pemetrexed)和順鉑(cisplatin)）或耦合於PE38；阿瑪西單抗(amatuximab)，一種誘導 ADCC的嵌合單株抗體；抗體藥物偶聯物，例如阿內圖單抗拉夫坦辛（anetumab ravtansine）（BAY 94-9343：抗MSLN+微管蛋白抑製劑(tubulin inhibitor)DM4）或DMOT4039A（抗MSLN+抗有絲分裂單甲基奧裡斯他汀E(anti-mitotic monomethyl auristatin E)）以抑制腫瘤生長。HPN536是一種多特異性接合劑（抗MSLN +抗CD3+抗白蛋白），具有更長的半衰期，似乎可以重新導向T細胞以在體外和體內殺死MSLN表達標靶，並且食蟹獼猴（cynomolgous monkey）似乎可以很好地耐受。幾種抗MSLN嵌合抗原受體(CAR)-T療法也具有良好的耐受性，包括瞬間訊息核糖核酸轉染的CAR-T（transient mRNA-transfected CAR-T）（RNA CARTmeso）和帶有自殺基因(iCasp9m28z)的CAR-T。迄今為止，對大多數抗MSLN療法的反應都是適度的，這表明與治療實體腫瘤相關的挑戰。
對於抗MSLN療法，由於MSLN脫落到癌症患者的血清中的事實，該問題進一步複雜化，其中它被稱為可溶性間皮素相關蛋白（soluble mesothelin-related protein, SMRP）。對MSLN具有高親和力的抗體也與SMRP強鍵結，這顯著抵消了它們的活性，從而降低了對癌細胞的有效劑量。
因此，需要能夠在SMRP存在下有效定位於腫瘤並促進T細胞反應的新分子。
具有至少三個結合域的多特異性抗體，其中兩個特異性結合間皮素(MSLN-BD)，一個特異性結合CD3(CD3-BD)，其中兩個MSLN-BD的結合親和力在一平衡良好的範圍中，理論上可以解決許多上述安全性和有效性方面的限制。這種多特異性抗體理論上能夠引起高度的腫瘤定位和改善的選擇性，可以為各種癌症提供更安全、更有效的治療方法。此外，此類分子將進一步限制共同施用額外免疫療法，以提高患者反應的需求，支持易於開發並最大限度地降低治療成本。然而，由於多特異性抗體的分子結構、組分抗原結合域的特性、可生產性和/或較差的生物物理特性，用於治療用途的多特異性抗體的實施一直很複雜。總之，仍然明顯需要新型多特異性抗體，這些抗體表現出增強的腫瘤細胞定位並引發有效的T細胞活化，具有可耐受的毒理學特徵，並且具有使其適合藥物開發的生物物理特性。
此外，儘管已經存在許多對MSLN和/或CD3具有特異性的抗體，但此類多特異性抗體的複雜和特異性要求需要開發具有定制特性的新型抗體結構域。
因此，儘管對於患有癌症的患者有多種治療選擇，仍然需要有效和安全的治療劑，並且需要以更有標靶性的方式優先使用它們。免疫調節生物製劑因其作用模式而在治療癌症方面提供了有希望的方法，但是全體的免疫刺激和缺乏對病理相關細胞和部位的這種免疫調節的任何限制會導致許多副作用和顯著的毒性，這可能會導致發病率和患者的死亡率增加。因此，本發明的一個目的是提供一種藥物以改善增生性疾病（特別是癌症）的治療。
本發明的一個目的是提供一種藥物以改善增殖性疾病（特別是癌症）的治療。特別地，本發明的一個目的是提供一種具有增加的靶向效力（on target efficacy）從而改善毒理學特徵的藥物。
在第一方面，本發明是有關於一種多特異性抗體，多特異性抗體包括： a) 與間皮素特異性結合的2個抗體基結合域(MSLN-BD)；和 b) 與CD3特異性結合的至少一抗體基結合域(CD3-BD)； 其中多特異性抗體不包含免疫球蛋白Fc區多肽，並且其中當通過表面電漿共振（SPR）測量時，每個MSLN-BD以0.5至20 nM範圍內的單價解離常數(K D)結合於間皮素(MSLN)。
在第二方面，本發明是有關於特定的MSLN結合域。
在第三方面，本發明是有關於編碼本發明的多特異性抗體或特異性MSLN結合域的一核酸序列或2個核酸序列。
在第四個方面，本發明是有關於包含本發明的一核酸序列或2個核酸序列的一載體或2個載體。
在第五個方面，本發明是有關於包含本發明的一載體或2個載體的一宿主細胞或多個宿主細胞。
在第六方面，本發明是有關於產生本發明的多特異性抗體或特異性結合域的方法，包括(i)提供本發明的核酸序列或2個核酸序列，或本發明的載體或2個載體，表達核酸序列或該些核酸序列，或該載體或該些載體，並從表達系統收集多特異性抗體或多異性結合域，或(ii)提供本發明的一宿主細胞或多個宿主細胞，培養宿主細胞或多個宿主細胞；從細胞培養物中收集多特異性抗體或特異性結合域。
在第七方面，本發明是有關於包含本發明的多特異性抗體和藥學上可接受的載體（pharmaceutically acceptable carrier）的藥物組合物。
在第八方面，本發明是有關於本發明之用於治療疾病（特別是人類疾病，更特別是選自癌症、發炎和自身免疫疾病的人類疾病）的多特異性抗體，其中多特異性抗體是包含3個或4個結合域（binding domain）的單鏈蛋白。
在第九方面，本發明是有關於本發明的用於治療疾病（特別是人類疾病，更特別是選自癌症、發炎和自身免疫疾病的人類疾病）的多特異性抗體，其中多特異性抗體是包含3個或4個結合域的異二聚體蛋白質（hetero-dimeric protein）。
在第十個方面，本發明是有關於一種治療疾病（特別是人類疾病，更特別是選自癌症、發炎和自身免疫疾病的人類疾病）的方法，包括施用上述步驟所定義的本發明的單鏈多特異性抗體，單鏈多特異性抗體包含3個或4個結合域。
在第十一方面，本發明是有關於一種治療疾病（特別是人類疾病，更特別是選自癌症、發炎和自身免疫疾病的人類疾病）的方法，包括施用上述步驟所定義的本發明的異二聚體多特異性抗體，異二聚體多特異性抗體包含3個或4個結合域。
分別單獨或組合概括在以下各項中的本發明的多個方面、有利特徵和優選實施例進一步有助於解決本發明的目的：
1. 一種多特異性抗體，包括： a) 與間皮素特異性結合的2個抗體基結合域（MSLN-BD）；以及 b) 與CD3特異性結合的至少一抗體基結合域（CD3-BD）； 其中所述多特異性抗體不包含免疫球蛋白Fc區多肽，並且其中當通過表面電漿共振測量時，各個MSLN-BD以0.5至20 nM的範圍內的單價解離常數（K D）結合於間皮素（MSLN）。
2.如第1項所述的多特異性抗體，其中當針對標靶細胞在T細胞驅動的細胞毒性測定中進行確定時，在至少200 ng/ml（特別是至少300 ng/ml，特別是至少400 ng/ml，特別是至少500 ng/ml）可溶性間皮素（soluble mesothelin）的存在下，所述多特異性抗體用於殺傷標靶細胞的EC 50增加不超過25倍，其中通過流式細胞儀測定時，標靶細胞比MeT-5A細胞(ATCC CRL-9444)的MSLN表達水平高6至8倍。
3. 如第1項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體能夠殺死標靶細胞，當針對標靶細胞及MeT-5A細胞在T細胞驅動的細胞毒性測定中進行確定時，具有比用於殺死MeT-5A細胞的EC50小至少10倍（特別是至少20倍，特別是至少25倍）的EC50，其中通過流式細胞儀測定時，標靶細胞比MeT-5A細胞(ATCC CRL-9444)的MSLN表達水平高6至8倍。
4. 如第1至3項中任一項所述的多特異性抗體，其中當通過表面電漿共振測量時，所述MSLN-BD中的每一個以0.5至15 nM的範圍內（特別是在0. 6至15 nM的範圍內，特別是在 0.7至5 nM的範圍內）的單價解離常數（KD）結合於間皮素（MSLN）。
5. 一種多特異性抗體，包括： a) 與間皮素特異性結合的2個抗體基結合域（MSLN-BD）；以及 b) 與CD3特異性結合的至少一抗體基結合域（CD3-BD）； 其中所述多特異性抗體不包含免疫球蛋白Fc區多肽，並且其中當通過表面電漿共振測量時，各個MSLN-BD以0.1至5 nM的範圍內的單價解離常數（K D）結合於間皮素（MSLN）。
6. 如第5項所述的多特異性抗體，其中當針對標靶細胞在T細胞驅動的細胞毒性測定中進行確定時，在至少200 ng/ml（特別是至少300 ng/ml，特別是至少400 ng/ml，特別是至少500 ng/ml）可溶性間皮素的存在下，所述多特異性抗體用於殺傷標靶細胞的EC 50增加不超過50倍，其中通過流式細胞儀測定時，標靶細胞比MeT-5A細胞(ATCC CRL-9444)的MSLN表達水平高6至8倍
7. 如第5或6項中任一項所述的多特異性抗體，其中當通過表面電漿共振測量時，所述MSLN-BD中的每一個以0.1至3 nM的範圍內（特別是在0.15至2 nM的範圍內，特別是在0.2至1 nM的範圍內）的單價解離常數(K D)結合於間皮素。
8. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述MSLN-BD中的每一個特異性結合於人類間皮素。
9. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述MSLN-BD中的每一個結合於MSLN的區域I、區域II和/或區域III，優選地是結合於MSLN的區域I和/或區域II，特別是結合於MSLN的區域I。
10. 如第1至9項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述2個MSLN-BD結合於MSLN上的相同表位。
11. 如第1至4及8至10項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述MSLN-BD包含 (i) 分別為SEQ ID NO: 1、2(或10)和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO:4、5和6的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；及 (ii) VH3或VH4結構域框架序列FR1至FR4；特別是VH3結構域框架序列FR1至FR4；及 (iii)包含VL框架的VL結構域，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3（特別是Vκ1或Vκ3 FR1至FR3，特別是Vκ1 FR1至FR3），以及選自Vκ FR4和Vλ FR4的框架FR4（特別是包含與SEQ ID NO:132至SEQ ID NO:139中任一項具有至少70%、80%或90%的一致性的胺基酸序列的Vλ FR4，更特別地是選自SEQ ID NO:132至SEQ ID NO:139中的任一項的Vλ FR4，特別是根據SEQ ID NO:132或139的Vλ FR4）。
12. 如第1至4和8至11項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述MSLN-BD包括 a.1) 分別為SEQ ID NO:1、2(或10)和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.1) 分別為SEQ ID NO:4、5和6的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.1) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 7至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的VH序列，和 d.1) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 9至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.2) 分別為SEQ ID NO:1、2(或10)和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.2) 分別為SEQ ID NO:4、5和6的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.2) 與胺基酸序列SEQ ID NO:8至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，和 d.2) 與胺基酸序列 SEQ ID NO:9至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的 VL 序列； 或者 a.3) 分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.3) 分別為 SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.3) 與胺基酸序列SEQ ID NO:17至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.3) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 18至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.4) 分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.4) 分別為SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.4) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 9至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.4) 與胺基酸序列SEQ ID NO:21至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.5) 分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.5) 分別為SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.5) 與胺基酸序列SEQ ID NO:20至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.5) 與胺基酸序列SEQ ID NO:21至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.6) 分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.6) 分別為SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2 和 LCDR3 序列， c.6) 與胺基酸序列SEQ ID NO:22至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.6) 與胺基酸序列SEQ ID NO:24至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.7) 分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.7) 分別為SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.7) 與胺基酸序列SEQ ID NO:23至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.7) 與胺基酸序列SEQ ID NO:24至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列。
13. 如第5至10項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述MSLN-BD包括 (i) 分別為SEQ ID NO:25、26和27的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO:28、29和30的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；及 (ii) VH3或VH4結構域框架序列FR1至FR4；特別是VH3結構域框架序列FR1至FR4；及 (iii) 包含VL框架的VL結構域，所述VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3（特別是Vκ1或Vκ3 FR1至FR3，特別是Vκ1 FR1至FR3），以及選自Vκ FR4和Vλ FR4的框架FR4，特別是包含與SEQ ID NO:132至SEQ ID NO: 139中任一項具有至少70%、80%或90%之一致性的胺基酸序列的Vλ FR4，更特別地，Vλ FR4選自SEQ ID NO:132至SEQ ID NO:139中的任一項，特別是根據SEQ ID NO:132或139的Vλ FR4。
14.如第5至10和13項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述MSLN-BD包括 a.1) 分別為SEQ ID NO:25、26和27的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.1) 分別為SEQ ID NO:28、29和30的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.1) 與胺基酸序列SEQ ID NO:31至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.1) 與胺基酸序列SEQ ID NO:33至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.2) 分別為SEQ ID NO:25、26和27的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.2) 分別為SEQ ID NO:28、29和30的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.2) 與胺基酸序列SEQ ID NO:32至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.2) 與胺基酸序列SEQ ID NO:33至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.3) 分別為SEQ ID NO: 25、26和27的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.3) 分別為SEQ ID NO:28、29和30的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.3) 與胺基酸序列SEQ ID NO:34至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.3) 與胺基酸序列SEQ ID NO:36至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.4) 分別為SEQ ID NO:25、26和27的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.4) 分別為SEQ ID NO:28、29和30的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.4) 與胺基酸序列SEQ ID NO:35至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.4) 與胺基酸序列SEQ ID NO:36至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列。
15.如第11至14項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述VH結構域包含C51胺基酸殘基（AHo編號）並且所述VL結構域包含C141胺基酸殘基（AHo編號）。
16. 如第8至15項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述MSLN-BD中的每一個與食蟹獼猴（Macaca fascicularis, Cynomolgus）的MSLN交叉反應，當通過表面電漿共振測量時，特別是以0.2至75 nM的範圍內（特別是在0.3至60 nM的範圍內，特別是0.4至50 nM的範圍內，特別是0.5至40 nM的範圍內）的單價K D與食蟹獼猴的MSLN結合。
17. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述CD3-BD結合於CD3　。
18. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述抗體包含一種或兩種CD3-BD，特別是一種CD3-BD。
19. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中當通過表面電漿共振測量時，所述CD3-BD以小於50 nM的單價K D（特別是0.5至50 nM，特別是1至40 nM，特別是2至30 nM的單價K D）結合於CD3　。
20. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述CD3-BD包括 (i) 分別在人類抗體VH框架（特別是VH3框架）中的SEQ ID NO:45、46和47的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，及 (ii) 分別在人類抗體VL框架中的SEQ ID NO：48、49和50的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中VL框架包括Vκ框架FR1、FR2和FR3（特別是Vκ1框架）和框架FR4，框架FR4選自Vκ FR4和Vλ 框架4。
21. 如第20項所述的多特異性抗體，其中所述CD3-BD 包括 (i) 包含SEQ ID NO:51、140、141或142的胺基酸序列的VH結構域；及 (ii) 包含SEQ ID NO:52的胺基酸序列的VL結構域。
22. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述抗體更包括至少一人類血清白蛋白結合域(hSA-BD)，特別是一個hSA-BD。
23. 如第22項所述的多特異性抗體，其中所述hSA-BD包括 (i) 分別在人類抗體VH框架（特別是VH3框架）中的SEQ ID NO:53、54和55的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，及 (ii) 分別在人類抗體VL框架中的SEQ ID NO：56、57和58的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中VL框架包括Vκ框架FR1、FR2和FR3（特別是Vκ1框架）和框架FR4，框架FR4選自Vκ FR4（特別是Vκ1 FR4）和Vλ框架4； 或者 (i) 分別在人類抗體VH框架（特別是VH3框架）中的SEQ ID NO:63、64和65的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，及 (ii) 分別在人類抗體VL框架中的SEQ ID NO:66、67和68的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中VL框架包括Vκ框架FR1、FR2和FR3（特別是Vκ1框架）和框架FR4，框架FR4選自Vκ FR4（特別是 Vκ1 FR4）和Vλ框架4； 或者 (i) 分別在人類抗體VH框架（特別是VH3框架）中的SEQ ID NO:63、64和65的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，及 (ii) 分別在人類抗體VL框架中的SEQ ID NO:66、67和68的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中VL框架包括Vκ框架FR1、FR2和FR3（特別是Vκ1框架）和框架FR4，框架FR4選自Vκ FR4（特別是Vκ1 FR4）和Vλ框架4。
24. 如第22或23項所述的多特異性抗體，其中所述hSA-BD包括 (i) 包含SEQ ID NO:59的胺基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:60的胺基酸序列的VL結構域；或者 (ii) 包含SEQ ID NO:61的胺基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:62的胺基酸序列的VL結構域；或者 (iii) 包含SEQ ID NO:69的胺基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:70的胺基酸序列的VL結構域；或者 (iv) 包含SEQ ID NO:71的胺基酸序列的VH結構域和包含SEQ ID NO:72的胺基酸序列的VL結構域；或者 (v) 包含SEQ ID NO:79或143的胺基酸序列的VH 結構域；和包含SEQ ID NO:80或144的胺基酸序列的VL結構域；或者 (vi) 包含SEQ ID NO:81或145的胺基酸序列的VH結構域；和包含SEQ ID NO:82或146的胺基酸序列的VL結構域。
25. 如第24項所述的多特異性抗體，其中所述VH結構域包含C51胺基酸殘基（AHo編號）並且所述VL結構域包含C141胺基酸殘基（AHo編號）。
26. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述結合域獨立地選自於由Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb和STAB所組成的群組。
27. 如第26項所述的多特異性抗體，其中每個所述結合域獨立地選自 (a) VL結構域和VH結構域的同源對（cognate pair）（Fv片段）；或者 (b)由寡肽或多肽連接子（scFv片段）連接的VL結構域和VH結構域的同源對。
28. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體處於選自由下列所組成之群組的形式：串聯scDb （tandem scDb, Tandab）、線性二聚體scDb（linear dimeric scDb, LD-scDb）、環狀二聚體scDb（circular dimeric scDb, CD-scDb）、串聯三scFv（tandem tri-scFv）、三體（tribody）（Fab-(scFv)2）、Fab-Fv2、三功能抗體（triabody）、scDb-scFv、四功能抗體（tetrabody）、二－雙功能抗體（di-diabody）、CODV、串聯二scFv（tandem-di-scFv）、串聯三scFv（tandem tri-scFv）、Fab-(scFv)2、Fab-Fv2或CODV融合於異二聚化Fc結構域（heterodimeric Fc domain）以外的異二聚化結構域的N-和/或C-末端，和MATCH。
29. 如第1至28項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述抗體不包含CH1和/或CL區。
30. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述抗體是scDb-scFv、三體、MATCH，特別地其中所述多特異性抗體處於MATCH或三體形式，更特別地其中所述多特異性抗體處於MATCH形式中，更具體地，其中所述多特異性抗體是MATCH3或MATCH4。
31. 如第1至30項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體是單鏈蛋白。
32.如第31項所述的多特異性抗體，其中所述單鏈蛋白包含由下列所組成的胺基酸序列： (i) 第一VL結構域， (ii) 第一多肽連接子， (iii) 第一VH結構域， (iv) 第二多肽連接子， (v) 第二VL結構域， (vi) 第三多肽連接子，及 (vii) 第二VH結構域， 按照所述的順序一個接一個地排列， 其中所述第一VL結構域與所述第二VH結構域締合（associate）以形成第一結合域，並且所述第二VL結構域與所述第一VH結構域締合以形成第二結合域， 並且其中所述單鏈蛋白更包括 (viii)第三結合域，由通過第四多肽連接子連接的第三VL結構域和第三VH結構域所形成，其中所述第三結合域通過第五多肽連接子在C端或N端融合至所述胺基酸序列， 其中所述三個結合域具有以下特異性： a) 第一結合域與人類CD3特異性結合（CD3-BD）；及 b) 第二和第三結合域與間皮素特異性結合（MSLN-BD）。
33. 如第32項所述的多特異性抗體，其中所述單鏈蛋白更包括hSA-BD，hSA-BD由通過第六多肽連接子連接的第四VL結構域和第四VH結構域所形成，其中所述hSA-BD是通過第七多肽連接子在C端或N端與所述胺基酸序列融合。
34. 如第1至30項所述的多特異性抗體，其中所述多特異性抗體是包含第一和第二單鏈蛋白的異二聚體蛋白質， 其中所述第一單鏈蛋白包含由下列所組成的第一胺基酸序列（從N-端到C-端）： (ia) 第一VL結構域， (iia) 第一多肽連接子，和 (iiia) 第二VL結構域，及 其中所述第二單鏈蛋白包括由下列所組成的第二胺基酸序列（從N-端到C-端）： (ib) 第一VH結構域， (iib) 第二多肽連接子，和 (iiib) 第二VH結構域，及 其中所述第一VL結構域與所述第一或所述第二VH結構域締合以形成第一結合域，並且所述第二VL結構域與所述VH結構域中的另一個締合以形成第二結合域， 並且其中所述第一和所述第二單鏈蛋白中的至少一個更包括 (iv) 第三結合域，第三結合域由通過第三多肽連接子連接的第三VL結構域和第三VH結構域所形成，其中所述第三結合域通過第四多肽連接子與所述第一或所述第二胺基酸融合序列， 並且其中選擇性地，所述第一單鏈蛋白和所述第二單鏈蛋白中的至少一個更包括 (v) 第四結合域，第四結合域由通過第五多肽連接子連接的第四VL結構域和第四VH結構域所形成，其中所述第四結合域通過第六多肽連接子與所述第一或所述第二胺基酸序列融合， 其中所述3個、或選擇性地4個結合域具有以下特異性： a) 與人類CD3特異性結合的一抗體基結合域（CD3-BD）； b) 與間皮素特異性結合的另外2個抗體基結合域（MSLN-BD），並且當存在可選的第四結合域時， c) 剩餘的結合域與人類血清白蛋白（hSA-BD）特異性結合。
35. 如第34項所述的多特異性抗體，其中存在選擇性的第四結構域並且其中所述第一和第二結合域中的一個是CD3-BD，並且所述第一和第二結合域中的另一個是hSA-BD。
36. 如第34或35項所述的多特異性抗體，其中存在選擇性的第四結構域並且其中第三結合域與第一或第二胺基酸序列融合，並且第四結合域與2個所述的胺基酸序列中的另一個胺基酸序列融合。
37. 如第34至36項中任一項所述的多特異性抗體，其中包含在所述異二聚體蛋白質中的任何結合域僅由排列在所述第一和第二單鏈蛋白中的免疫球蛋白可變域所組成。
38. 如第34至37項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述異二聚體蛋白質不包含除了所述第一和第二VL和VH域之外的第一和第二蛋白質相互作用域（first and a second proteinaceous interaction domain）的同源對，其中所述第一蛋白質相互作用域包含在所述第一單鏈蛋白中，並且其中所述第二蛋白質相互作用結構域包含在所述第二單鏈蛋白中。
39. 如第34至38項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述第一單鏈蛋白和所述第二單鏈蛋白以平行方向異二聚化，亦即，所述第一VL結構域與所述第一VH結構域締合，並且所述第二VL結構域與所述第二VH結構域締合。
40. 如第34至38項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述第一單鏈蛋白和所述第二單鏈蛋白以反平行方向異二聚化，即。 e.所述第一VL結構域與所述第二VH結構域相關並且所述第二VL結構域與所述第一VH結構域相關。
41. 如第34至40項中任一項所述的多特異性抗體，其中所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO: 83的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:83的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO: 83所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:84的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO的胺基酸序列:84，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO：84所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:85的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:85的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列 SEQ ID NO:85所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:86的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:86的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:86所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:87的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:87的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:87所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:88的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:88的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:88所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:89的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:89的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:89所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:90的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:90的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:90所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:91的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:91的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:91所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:92的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:92的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:92所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:93的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:93的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:93所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:94的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:94的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:94所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:95的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:95的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:95所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:96的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:96的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:96所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:97的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:97的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:97所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:98的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:98的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:98所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:99的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:99的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:99所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:100的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:100的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:100所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:101的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:101的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:101所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:102的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:102的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:102所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:103的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:103的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:103所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:104的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:104的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:104所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:105的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:105的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:105所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:106的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:106的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:106所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:107的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:107的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:107所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:108的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:108的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:108所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:109的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:109的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:109所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:110的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:110的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:110所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:111的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:111的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:111所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:112的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:112的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:112所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:113的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:113的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:113所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:114的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:114的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:114所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:115的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:115的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:115所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:116的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:116的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:116所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:117的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:117的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:117所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:118的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:118的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:118所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:119的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:119的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:119所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:120的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:120的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:120所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:121的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:121的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:121所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:122的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:122的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:122所組成；或者 所述第一單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:123的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，更特別是包含SEQ ID NO:123的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:123所組成，和 所述第二單鏈蛋白包含與SEQ ID NO:124的胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性的胺基酸序列，特別是包含SEQ ID NO:124的胺基酸序列，特別是由胺基酸序列SEQ ID NO:124所組成。
42. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中所述抗體可變域中的至少一個包含源自親代兔抗體的CDR區。
43. 如前述項目中任一項所述的多特異性抗體，其中MSLN-BD和CD3-BD中的至少一個能夠同時結合它們各自的抗原，特別是其中MSLN-BD和CD3-BD兩者都能夠同時結合它們各自的抗原。
44. 一種如第11至15項中任一項所定義的MSLN結合域。
45.編碼第1至43項中任一項所述的多特異性抗體或第44項所述的MSLN結合域的一核酸序列或2個核酸序列。
46. 一載體或2個載體，包括如第45項所述的一核酸序列或2個核酸序列。
47.一宿主細胞或多個宿主細胞，包括如第46項所述的一載體或2個載體。
48. 一種生產如第1至43項中任一項所述的多特異性抗體或如第44項所述的MSLN結合域的方法，包括 (i) 提供如第45項所述的一核酸序列或2個核酸序列，或如第46項所述的一載體或2個載體，表達所述一核酸序列或多個核酸序列，或所述一個載體或多個載體，並從表達系統收集所述多特異性抗體或所述MSLN結合域，或者 (ii)提供如第47項所述的一宿主細胞或多個宿主細胞，培養所述宿主細胞或所述多個宿主細胞；即從細胞培養物中收集所述多特異性抗體或所述MSLN結合域。
49.一種藥物組合物，包含如第1至43項中任一項所述的多特異性抗體和藥學上可接受的載體。
50. 如第1至43項中任一項所述的多特異性抗體是用於治療疾病，特別是人類疾病，更特別是選自癌症、發炎和自身免疫疾病的人類疾病。
51. 如第1至43項中任一項所述的多特異性抗體是用於治療如第50項所述的疾病，其中所述疾病是癌症，特別是選自間皮瘤、胰腺癌和卵巢癌的癌症。
52.一種治療疾病（特別是人類疾病，更特別是選自癌症、發炎和自身免疫疾病的人類疾病）的方法，包括施用如第1至43項中任一項所述的多特異性抗體的步驟。
53. 如第52項所述的方法，其中所述疾病是癌症，特別是選自間皮瘤、胰腺癌和卵巢癌的癌症。
已知的基於間皮素/CD3雙特異性抗體（MSLN/CD3 bsAbs）的免疫療法通常具有劑量限制性毒性和有限的體內功效。因此，醫學領域需要新型基於MSLN/CD3雙特異性抗體的免疫療法，其具有比目前可用的方法更低或沒有劑量限制性毒性和更高的功效。
本發明提供包含2個間皮素結合域（MSLN-BD)和至少一CD3結合域（CD3-BD)的組合的多特異性抗體，其中調節MSLN-BD對MSLN的結合親和力使其可以有效地定位在高MSLN表現的標靶細胞上，而低MSLN表現的健康間皮細胞受到的影響要小得多。由於存在2個MSLN-BD，它們嵌入在沒有免疫球蛋白Fc區多肽的定義明確且緊密的多域抗體結構中，結合良好平衡的MSLN和CD3結合親和力，這些多特異性抗體顯示高度的在靶效力（on-target potency），同時表現出低的非腫瘤副作用（off-tumor side effect）。本發明的多特異性抗體的緊密二價設計，且其良好調節的MSLN和CD3結合親和力是實現所需選擇性和功效的關鍵特徵，這是基於經典免疫球蛋白G（IgG）結構的二價多特異性抗體無法實現的。
本發明的多特異性抗體能夠利用強結合性（avidity）效應之優勢以高抗原密度依賴的方式通過2個MSLN-BD結合標靶細胞。同時，本發明的多特異性抗體能夠通過CD3-BD與CD3結合來誘導T細胞活化和腫瘤細胞殺傷。由於它們對導致有效腫瘤定位的高MSLN表達細胞的增強的選擇性，本發明的多特異性抗體能夠在沒有由T細胞的非特異性活化所造成的劑量限制性毒性的情況下進行治療。
此外，令人驚訝地發現，在患者血清中經常觀察到的高水平可溶性間皮素存在下，殺死高MSLN表現的標靶細胞的效力沒有顯著降低。再者，本發明的多特異性抗體包含(a)2個MSLN結合域和(b)至少一CD3-BD，並具有上述定義的設計和進一步說明之有益特性的抗原結合親和力，如範例及所附圖式所示。又，選擇性添加延長半衰期的抗hSA結構域不僅可以方便給藥，而且還應促進分子向腫瘤微環境的遞送。
因此，本發明的多特異性抗體提供優於常規組合物和療法的獨特治療優勢。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的通常知識者通常理解的相同的含義。
除非另有說明，否則術語「包括」和「包含」在本文中以其開放式和非限制性意義使用。對於此類後面的實施例，術語「包括」因此包括更窄的術語「由……組成」。
在描述本發明的上下文中（尤其是在以下申請專利範圍的上下文中），術語「一」和「該」以及類似的引用應被解釋為涵蓋單數和復數，除非此處另有說明或與上下文明顯矛盾。例如，術語「一細胞」包括多個細胞，包括其混合物。當複數形式用於化合物、鹽等時，也被認為是指單一化合物、鹽等。
在一方面，本發明有關於一種多特異性抗體，包括： a) 與間皮素（mesothelin）特異性結合（MSLN-BD）的2個抗體基結合域，；以及 b) 與CD3特異性結合（CD3-BD）的至少一抗體基結合域； 其中所述多特異性抗體不包含免疫球蛋白Fc區多肽，並且其中當通過表面電漿共振（SPR）測量時，每個MSLN-BD以0.1至20nM範圍內的單價解離常數（monovalent dissociation constant KD）結合間皮素（MSLN）。
如本文所使用的術語「抗體」及類似用語包括完整抗體或其單鏈；和任何抗原結合片段（即「抗原結合部分」）或其單鏈；和包含抗體互補決定區（CDR）、重鏈變異區（VH region）或輕鏈變異區（VL region）的分子（包括但不限於多特異性抗體）。天然存在的「全抗體」是包含通過二硫鍵相互連接的至少2條重（H）鍊和2條輕（L）鏈的醣蛋白。每條重鏈由重鏈可變區（本文縮寫為VH）和重鏈恆定區所構成（heavy chain constant region）。重鏈恆定區由3個結構域組成，CH1、CH2 和 CH3。每條輕鏈由輕鏈可變區（本文縮寫為VL）和輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一結構域CL構成。VH和VL區可以進一步細分為高度變異區，稱為互補決定區（CDR），散佈著更保守的區域，稱為框架區（framework region, FR）。每個VH和VL由3個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端依照下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鍊和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合域。抗體的恆定區可調節免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞（例如效應細胞）和經典補體系統（complement system）的第一組分(Clq)。
如本文所使用的術語「免疫球蛋白Fc區」是指重鏈恆定區的CH2和CH3結構域。
如本文所使用的術語「結合域」、「其抗原結合片段」、抗體的「抗原結合部分」等是指完整抗體的一或多個片段，其保留可特異性結合給定抗原（例如，MSLN、CD3、hSA）的能力。抗體的抗原結合功能可以由完整抗體的片段來執行。在一些實施例中，本發明的多特異性抗體的結合域選自Fab片段、由VL、VH、CL和CH1域組成的單價片段；一F(ab)2片段，包含通過鉸鏈區（hinge region）的雙硫鍵連接的2個Fab片段之一二價片段；由VH和CH1結構域組成的Fd片段；由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；由VH結構域組成的單域抗體(dAb)片段（Ward等人，1989 Nature 341:544-546)；分離的互補決定區、單鏈Fv、dsFv、scAb、STAB、單域抗體（sdAb或dAb）、單域重鏈抗體和單域輕鏈抗體、VHH、VNAR、基於來自鯊魚的VNAR結構的單域抗體、以及的基於替代支架（scaffold）的結合域，包括但不限於錨蛋白（ankyrin）基域、飛諾莫（fynomer）、親合力多聚體（avimer）、抗運載蛋白（anticalin）、纖網蛋白（fibronectin）和被構建到抗體恆定區的結合位點（例如f-star技術(F-star的Modular Antibody TechnologyTM)）。合適地，本發明的結合域是單鏈Fv片段（scFv）或單個抗體可變域。在一較佳實施例中，本發明的結合域是單鏈Fv片段（scFv）。在特定實施例中，抗原結合片段的2個可變結構域（如在Fv或scFv片段中）通過結構域間二硫鍵穩定，特別是其中所述VH結構域在位置51（AHo編號）包含單個半胱胺酸殘基並且所述VL結構域在位置141（AHo編號）包含單個半胱胺酸殘基。
術語「互補決定區」是指具有使用一些已知的方案中的任一種確定的邊界的胺基酸序列，包括下列文獻描述的方案：Kabat等人（(1991) ＂Sequences of Proteins of Immunological Interest＂，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat”編號方案)）；Al-Lazikani等人（(1997) JMB 273, 927-948(“Chothia”編號方案)）；ImMunoGenTics (IMGT) 編號（Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 ( 2003))（“IMGT”編號方案）；以及Honegger與Plückthun描述的編號方案（J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670）（“AHo”編號）。例如，對於經典格式，在Kabat下，重鏈可變域（VH）中的CDR胺基酸殘基編號為31-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）和95-102（HCDR3）；輕鏈可變域（VL）中的CDR胺基酸殘基編號為24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3）。在Chothia下，VH中的CDR胺基酸編號為26-32（HCDR1）、52-56（HCDR2）和95-102（HCDR3）；及VL中的胺基酸殘基編號為24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3）。通過結合Kabat和Chothia的CDR定義，CDR由人類VH中的胺基酸殘基26-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）和95-102（HCDR3）和人類VL中的胺基酸殘基24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3）所組成。在IMGT下，VH中的CDR胺基酸殘基編號約為26-35（HCDR1）、51-57（HCDR2）和93-102（HCDR3），VL中的CDR胺基酸殘基編號約為27-32（LCDR1）、50-52（LCDR2）和89-97（LCDR3）（根據“Kabat”編號）。在IMGT下，可以使用IMGT/DomainGap Align程式確定抗體的CDR。
在本發明的上下文中，除非另外特別提及，否則使用由Honegger與Plückthun建議的編號系統(“AHo”)（Honegger & Plückthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670)。具體而言，以下殘基根據AHo編號方案定義為CDRs：LCDR1（也稱為CDR-L1）：L24-L42；LCDR2（也稱為CDR-L2）：L58-L72；LCDR3（也稱為CDR-L3）：L107-L138；HCDR1（也稱為CDR-H1）：H27-H42；HCDR2（也稱為CDR-H2）：H57-H76；HCDR3（也稱為CDR-H3）：H108-H138。為清楚起見，根據Honegger與Plückthun的編號系統考慮了在不同的VH和VL亞家族兩者中（特別是在CDR中）於天然抗體中發現的長度多樣性，並提供序列的間隙。因此，在給定的抗體可變域中，通常並非所有位置1至149都被胺基酸殘基佔據。
如本文所使用的術語「結合特異性」是指個別的抗體與一抗原決定位（antigenic determinant）反應而不與不同抗原決定位反應的能力。如本文所使用的術語「特異性結合」或「特異於」是指可測量和可重複的相互作用，例如標靶和抗體之間的結合，其決定在異質性群體分子（包括生物分子）存在的情況下標靶的存在。例如，與標靶(其可以是表位)特異性結合的抗體是與該靶標結合的抗體比其與其他靶標結合具有更大的親和力、強結合性、更容易和/或更長的持續時間。以其最一般的形式（並且當未提及定義的參考時），「特異性結合」是指抗體區分感興趣的標靶和無關分子之間的能力，如根據特異性確定的本領域已知的測定。此類測定包括但不限於西方墨點法、酵素免疫測定法（ELISA）、放射免疫測定（RIA）、電化學發光分析（ECL）、免疫放射分析（IRMA）、表面電漿共振（Surface plasmon resonance, SPR）測試和肽掃描（peptide scan）。例如，可以進行標準酵素免疫測定法。評分可以通過標準顯色進行（例如，具有辣根過氧化物酶(horseradish peroxide)的二抗及具有過氧化氫的四甲基聯苯胺(tetramethyl benzidine)）。某些孔中的反應通過光密度評分，例如在450 nm處。典型的背景（=陰性反應）可能約為0.1 OD；典型的陽性反應可能約為1 OD。這意味著正分數和負分數之間的比率可以是10倍或更高。在另一個例子中，可以進行表面電漿共振測定，其中背景和信號之間至少10倍（特別是至少100倍）的差異表示特異性結合。通常，結合特異性的確定不是通過使用單個參考分子，而是通過使用一組大約3到5個不相關的分子（例如奶粉、轉鐵蛋白或類似物）進行。
合適地，本發明的抗體是分離的抗體。如本文所用，術語「分離的抗體」是指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體（例如，特異性結合MSLN和CD3的分離的抗體基本上不含特異性結合除MSLN和CD3之外的抗原的抗體，且特異性結合MSLN、CD3和人類血清白蛋白的分離的抗體基本上不含特異性結合除MSLN、CD3和人類血清白蛋白之外的抗原的抗體）。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料和/或化學品。
合適地，本發明的抗體是單株抗體。如本文所用，術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」是指與胺基酸序列基本相同或源自相同遺傳來源的抗體。單株抗體組合物顯示出對特定表位的結合特異性和親和力，或對特定表位（epitope）的結合特異性和親和力。
本發明的抗體包括但不限於嵌合、人和人類化抗體。
術語「嵌合抗體」（或其抗原結合片段）是其中(a)恆定區或其一部分被改變、替換或交換的抗體分子（或其抗原結合片段），使得抗原結合位點（可變區）連接到不同或改變的類別、效應子功能和/或物種的恆定區，或賦予嵌合抗體新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素（hormone）、生長因子、藥物等；(b)可變區或其一部分被具有不同或改變的抗原特異性的可變區改變、替換或交換。例如，可以通過用來自人類免疫球蛋白的恆定區替換其恆定區來修飾小鼠抗體。由於替換為人類恆定區，嵌合抗體可以保留其識別抗原的特異性，同時與原始小鼠抗體相比在人類中具有降低的抗原性。
如本文所用，術語「人類抗體」（或其抗原結合片段）旨在包括具有可變區的抗體（及其抗原結合片段），其中框架區和CDR區均源自人類起源的序列。此外，如果抗體含有恆定區，則該恆定區也源自此種人類序列，例如，人類性腺（germline）序列，或人類性腺序列的突變版本。本發明的人類抗體及其抗原結合片段可以包括不是由人類序列編碼的胺基酸殘基（例如，通過體外隨機或位點特異性誘變、或通過體內體細胞突變引入的突變）。人類抗體的這一定義特別排除包含非人抗原結合殘基的人類化抗體。可以使用本領域已知的各種技術產生人類抗體，包括噬菌體展示文庫（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581 (1991)）。也可用於製備人類單株抗體的方法描述於下列文獻中：Cole等人（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 100；77 (1985)）;Boemer等人（J. Immunol，147(1)：86-95(1991) ）。另請參見下列文獻：van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)。可以通過將抗原施用於基因轉殖動物來製備人類抗體，該基因轉殖動物已被修飾以產生反應於抗原挑戰的此類抗體，但其內源性基因座已被禁用，例如，經免疫之異種小鼠（immunized xenomice）（參見，例如，關於XENOMOUSE™科技的美國專利號6,075,181和6,150,584）。也參見，例如，Li等人的關於通過人B細胞融合瘤技術（hybridoma technology）產生的人類抗體（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557- 3562 (2006)）。
如本文所用，「人類化」抗體（或其抗原結合片段）是保留非人類抗體的反應性同時在人類中具有較低免疫性的抗體（或其抗原結合片段）。例如，這可以通過保留非人類CDR區並用它們的人類對應體（human counterpart）（即，恆定區以及可變區的框架部分）替換抗體的剩餘部分來實現。可以在人類框架序列內以及在源自另一哺乳動物物種的性腺的CDR序列內進行額外的框架區修飾。本發明的人類化抗體可以包括不是由人類序列編碼的胺基酸殘基（例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變，或促進穩定性或製造的保守置換)。例如，請參見下列文獻：Morrison等人的文獻（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984）；Verhoeyen等人的文獻（Science, 239: 1534-1536, 1988）；Padlan的文獻（Molec. Immun., 28:489-498, 1991; and Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994）。人類工程技術的其他例子包括但不限於美國專利號5,766,886 中揭露的Xoma技術。
如本文所用，術語「重組人類化抗體」包括通過重組方式製備、表達、產生或分離的所有人類抗體，例如來自轉型以表現人類化抗體的宿主細胞中分離的抗體（例如來自轉化融合瘤(transfectoma)），以及通過任何其他方式製備、表達、產生或分離的抗體，這些方式涉及將人類免疫球蛋白基因的全部或部分序列剪接到其他去氧核醣核酸（DNA）序列。
合適地，本發明的抗體或其抗原結合片段是人類化的。適當地，本發明的抗體或其抗原結合片段是人類化的並且包含兔來源的CDR。
如本文所用，術語「多特異性抗體」是指結合至少2個或更多個不同標靶（例如，MSLN和CD3）上的2個或更多個不同表位的抗體。術語「多特異性抗體」包括雙特異性、三特異性、四特異性、五特異性和六特異性。如本文所用，術語「雙特異性抗體」是指結合2個不同標靶（例如，MSLN和CD3）上的2個不同表位的抗體。如本文所用，術語「三特異性抗體」是指結合3個不同標靶（例如，MSLN、CD3和hSA）上的3個不同表位的抗體。
術語「表位」是指能夠與抗體特異性結合的蛋白質決定位。表位通常由分子的化學活性表面基團組成，例如胺基酸或糖側鏈，通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。「構型表位（ㄌal epitope）」和「線性表位（linear epitope）」的區別在於，在變性溶劑的存在下，與前者而非後者的結合會丟失。
本文所用的術語「構型表位」是指當多肽鏈折疊形成天然蛋白質時抗原的胺基酸殘基聚集在表面上。
術語「線性表位」是指具有蛋白質和相互作用分子（例如抗體）之間的所有相互作用點沿著蛋白質的一級胺基酸序列（連續）線性發生的表位。
如本文所用，術語「識別」是指發現其構型表位並與其相互作用（例如，結合）的抗體抗原結合片段。
如本文所用，術語「親和力」是指抗體和抗原在單個抗原位點的相互作用強度。在每個抗原位點內，抗體「臂」的可變區通過弱的非共價力與眾多位點的抗原相互作用；互動越多，親和力越強。
「結合親和力」通常是指分子（例如抗體）的單個結合位點與其結合搭配物（binding partner）（例如抗原）之間非共價相互作用的總和的強度。除非另有說明，如本文所用，「結合親和力」、「與…結合」、「結合於」或「結合至」是指反映結合對（例如，抗體片段和抗原）的成員之間1：1的交互作用的內生性結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力通常可以用解離常數（K D）表示。親和力可以通過本領域已知的常用方法測量，包括本文所述的那些已知的常用方法。低親和力抗體通常與抗原結合緩慢且易於解離，而高親和力抗體通常與抗原結合更快且往往保持結合時間更長。多種測量結合親和力的方法是本領域已知的，其中任何一種都可用於本發明的目的。用於測量結合親和力的具體說明性和示例性實施方案（即結合強度）描述如下。
如本文所用，術語「Kassoc」、「Ka」或「Kon」旨在指特定抗體-抗原相互作用的結合率，而術語「Kdis」、「Kd」或「Koff」，如本文所用，旨在指特定抗體-抗原相互作用的解離率。在一實施例中，如本文所用，術語「K D」旨在指解離常數，其由Kd與Ka之比值(即Kd/Ka)所得，並表示為莫耳濃度（M）。根據本發明的「K D」或「K D值」或「KD」或「KD值」在一實施例中是通過使用表面電漿共振測定來測量的。對重組人類間皮素（human MSLN）和重組食蟹獼猴MSLN（Cynomolgus MSLN）的親和力通過如段落[0168]部分所述的表面電漿體共振(SPR)測量來確定。如段落[0196]部分中所述，通過表面電漿體共振測量對重組人類CD3的親和力。
適當地，本發明的多特異性抗體對於MSLN特異性是二價的。
適當地，本發明的多特異性抗體對於CD3特異性是單價、二價或多價的。在一個實施方案中，本發明的多特異性抗體對於CD3特異性是二價的。在一較佳實施例中，本發明的多特異性抗體對於CD3特異性是單價的。
術語「多價抗體」是指具有多於一種化合價（valency）的單個結合分子，其中「化合價」被描述為結合相同標靶分子上的表位的抗原結合部分（antigen-binding moiety）的數量。因此，單個結合分子可以結合標靶分子上的一個以上結合位點。多價抗體的實例包括但不限於二價抗體、三價抗體、四價抗體、五價抗體等。
如本文所用，術語「單價抗體」是指與標靶分子（例如CD3）上的單個表位結合的抗體。此外，如本文所用，術語「結合域」或「單價結合域」是指結合標靶分子（例如CD3）上的單個表位的結合域。
如本文所用，術語「二價抗體」是指結合2個相同標靶分子（例如MSLN標靶分子）上的兩個表位的抗體。
本發明的多特異性抗體的2個MSLN-BD結合MSLN細胞外部分的任何區域，例如MSLN的I區、II區和/或III 區。優選地，本發明的多特異性抗體的2個MSLN-BD結合MSLN的I區和/或II區，特別是MSLN的I區。區域I是MSLN中離細胞表面最遠的部分（MSLN附著處）。
本發明的多特異性抗體的2個MSLN-BD結合MSLN標靶分子上的相同或不同表位。優選地，本發明的多特異性抗體的2個MSLN-BD結合MSLN標靶分子上的相同表位。如本文所用，術語「相同表位」是指能夠特異性結合抗體的同一蛋白質上的個別蛋白質決定簇，其中這些個別蛋白質決定位是相同的，即由相同的化學活性表面分子群組（例如具有相同的三維結構特徵以及相同的電荷特徵的胺基酸或糖側鏈）所組成。如本文所用的與特定蛋白質標靶相關的術語「不同表位」，是指同一蛋白質上能夠特異性結合抗體的個別蛋白質決定位，其中這些個別蛋白質決定位不相同，即由不相同的化學活性表面分子群組（例如具有相同的三維結構特徵以及相同的電荷特徵的胺基酸或糖側鏈）所組成。這些不同的表位可以重疊或不重疊。
本發明的發明人現在驚奇地發現，例如三特異性分子（雙MSLN 高 KDxCD3xhSA）PRO2000、PRO2562、PRO2565、PRO2566和PRO2567能夠殺死標靶細胞，標靶細胞比健康的MeT-5A細胞（ATCC CRL-9444）的MSLN表現程度高於約7倍，如同通過流式細胞儀測定的，具有高效率且EC 50比殺死MeT-5A細胞的EC 50低至少25倍，如同在針對標靶細胞和MeT-5A細胞的T細胞驅動細胞毒性分析（T-cell driven cytotoxicity assay）所測定（參見例如表31）。因此，雖然PRO2000、PRO2562、PRO2566和PRO2567對高度表現MSLN的標靶細胞表現出非常高的殺傷效力，但它們對健康細胞的殺傷效力要低得多，表明使用PRO2000、PRO2562、PRO2566和PRO2567的治療具有潛在的大治療範圍（therapeutic window）。與此相反，三特異性參考分子PRO1872 (MSLN 低 KDxCD3xhSA)的效力，其包含一個MSLN-BD（其結合親和力(K D)比PRO2000、PRO2562、PRO2566和PRO2567的MSLN-BD好5倍以上，對於殺死所述高度表現MSLN的標靶細胞和所述健康的Met-5A細胞沒有顯著差異）。這一發現表明使用本發明的多特異性抗體治療癌症患者的治療範圍顯著增加。此外，本發明的發明人驚奇地發現三特異性分子PRO2000、PRO2562、PRO2566和PRO2567(biMSLN 高 KDxCD3xhSA)的殺死標靶細胞的EC 50值（其MSLN表達水平比健康的MeT-5A細胞的MSLN表達程度高約7倍，如同通過流式細胞儀所測定），在50 ng/ml可溶性間皮素(sMSLN)存在下不會增加超過6倍，在500 ng/ml可溶性間皮素(sMSLN)存在下不會增加超過40倍，同如在針對標靶細胞的T細胞驅動細胞毒性分析中所確定。另一方面，三特異性參考分子PRO1872 (MSLN 低 KDxCD3xhSA)殺死標靶細胞的EC50值在50 ng/ml可溶性間皮素存在下增加了近8倍，在500 ng/ml可溶性間皮素存在下增加75倍以上。因此，三特異性分子PRO2000、PRO2562、PRO2566和PRO2567對高度表現MSLN的標靶細胞的高殺傷效力僅受高濃度可溶性間皮素的輕微影響。另一方面，三特異性分子 PRO2000、PRO2562、PRO2566和PRO2567對健康細胞的殺傷效力在高濃度可溶性間皮素的存在下進一步降低（數據未顯示），表明在可溶性間皮素的存在下，用於臨床的治療範圍甚至增加。這是一個重要的發現，因為在患者中經常觀察到高血漿水平的可溶性間皮素相關蛋白（soluble mesothelin-related protein, SMRP）。對於PRO2000的CD8+ T細胞活化效力，發明人獲得了類似的有利結果。上述發現甚至更令人驚訝，因為不可能先驗地預期所有4個結合域都保持在具有功能性，而在複雜的多標靶、多細胞情況下不會在立體上（sterically）或以其他方式相互抑制。
用於本發明的多特異性抗體的合適的間皮素-結合域（MSLN-BD）是本揭露中提供的結合域。本發明的間皮素-結合域包括但不限於其序列列於表1中的人類化間皮素-結合域。
用於本發明的多特異性抗體的合適的CD3-結合域（CD3-BD）是本揭露中提供的結合域。本發明的CD3-結合域包括但不限於其序列列於表3中的人類化CD3結合域。
合適地，本發明的多特異性抗體具有兩種不同的特異性（MSLN和CD3）。適當地，本發明的多特異性抗體是雙特異性抗體，其對於MSLN是二價的。本發明的多特異性抗體可包含又一特異性（三特異性抗體）或更多個特異性(四特異性或五特異性或六特異性抗體)。在一實施例中，多特異性抗體是雙特異性的（MSLN和CD3）。在另一個實施例中，多特異性抗體是三特異性的（MSLN、CD3和hSA）。
合適地，本發明的抗體不包含免疫球蛋白Fc區多肽。
為了增加相同或更低分子量的特異性/功能性的數量，有利的是使用包含抗體片段的抗體，例如Fv、Fab、Fab'和F(ab')2片段以及其他抗體片段。這些較小的分子保留了整個抗體的抗原結合活性，並且與整個免疫球蛋白分子相比，還可以表現出改善的組織滲透（tissue penetration）和藥物動力學特性。儘管此類片段似乎比完整免疫球蛋白具有許多優勢，但它們也遭受血清清除率增加的困擾，因為它們缺乏在體內賦予長半衰期的Fc結構域（Medasan等人，1997，J. Immunol. 158:2211-2217)。具有較低分子量的分子更有效地滲透到標靶組織（例如實體癌）中，因此有望在相同或較低劑量下提高療效。
本發明人驚奇地發現，向本發明的多特異性抗體添加人類血清白蛋白結合域(hSA-BD)不會干擾其他結合域與其各自標靶結合的能力。此發現目前是令人驚訝的，因為，不可能先驗地預期所有4個結合域都保持在具有功能性，而在體內之複雜的多標靶、多細胞情況下不會在立體上或以其他方式相互抑制。
適當地，本發明的多特異性抗體可以包含對人類血清白蛋白具有特異性的另外的結合域。在一實施例中，多特異性抗體包含：(i)2個MSLN-BD；(ii)至少一CD3-BD；以及(iii)至少一hSA-BD。
術語「hSA」特別是指具有UniProt ID號P02768的人類血清白蛋白。人類血清白蛋白（Human Serum Albumin, hSA）是人類血清中66.4 kDa豐度的蛋白質（佔總蛋白質的50%），由585個胺基酸組成（Sugio, Protein Eng, Vol. 12, 1999, 439-446）。多功能hSA蛋白與其結構相關，該結構允許結合和運輸多種代謝物，例如脂肪酸、金屬離子、膽紅素（bilirubin）和一些藥物（Fanali, Molecular Aspects of Medicine, Vol. 33, 2012, 209-290）。血清中的HSA濃度約為3.5～5 g/dL。白蛋白結合抗體及其片段可用於例如延長藥物或與其耦接（conjugate）的蛋白質的體內血清半衰期。
在一些實施例中，hSA-BD源自單株抗體或抗體片段。
用於本發明的多特異性抗體的合適的hSA-BD是本揭露中提供的結合域。本發明的hSA-BD包括但不限於其序列列於表4中的人類化hSA結合域。
特別地，本發明的hSA-BD與人類血清白蛋白特異性結合。
用於本發明的多特異性抗體的其他合適的hSA-BD包括或源自一抗體，該抗體選自由下列所組成的群組：(i)結合血清白蛋白的多肽（請參照下列文獻，例如：Smith等人，2001，Bioconjugate Chem. 12：750-756；EP0486525；US6267964；WO 2004/001064；WO 2002/076489；和 WO 2001/45746）； (ii)抗血清白蛋白結合單可變域（描述於下列文獻中：Holt 等人，Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, 5, pp283-288；WO 2004/003019；WO 2008/096158； WO 2005/118642, WO 2006/0591056和WO 2011/006915； (iii) 抗血清白蛋白抗體（描述於下列文獻中：WO 2009/040562；WO 2010/035012和WO 2011/086091）。
本發明的其他可變域包括已經突變的胺基酸序列，但在互補決定區中具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性，具有描述於表1、3和4的序列中所述的互補決定區的區域。本發明的其他可變域包括突變胺基酸序列，其中當相較於描述於表 1、3 和 4的序列中所述的互補決定區時，不超過1、2、3、4或5個胺基酸在互補決定區中發生突變。
合適地，本發明結合域的VH結構域屬於VH3或VH4家族。在一實施例中，本發明的結合域包括屬於VH3家族的VH結構域。在本發明的上下文中，術語「屬於VHx家族（或VLx家族）」是指框架序列FR1至FR3顯示與VHx家族（或分別為VLx）的最高程度的同源性。 VH 和 VL 家族的例子在下列文獻中： Knappik 等人（J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86），或WO 2019/057787 。屬於VH3家族的VH結構域的具體例子由SEQ ID NO：129表示，屬於VH4家族的VH結構域的具體例子由SEQ ID NO：130表示。特別是，來自 SEQ ID NO: 129 的框架區FR1至FR3屬於 VH3 家族（表 7，非粗體標記的區域）。合適地，如本文所用，屬於VH3家族的VH是包含與SEQ ID NO: 129的FR1至FR3具有至少85%、特別是至少90%、更特別是至少95%的序列一致性（sequence identity）的FR1至FR3的VH。VH3 序列的替代範例和 VH4 序列的範例可以在下列文獻中找到： Knappik 等人（J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86） 或 WO 2019/057787。適當地，本發明的hSA-BD包括：Vκ框架FR1、FR2和FR3，特別是Vκ1或Vκ3框架，特別是Vκ1框架FR1至3，和選自VκFR4和VλFR4的構架FR4，特別是Vλ FR4。合適的Vκ1 框架 FR1 至 3 以及示例性的Vλ FR4 列於 SEQ ID NO: 131（表 7，FR 區以非粗體標記）。Vκ1 序列的替代範例，以及Vκ2、Vκ3 或 Vκ4序列的範例，可以在Knappik等人的文獻中找到(J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86）。合適的Vκ1框架FR1至3包括與對應於FR1 至3並取自SEQ ID NO: 131的胺基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%一致性的胺胺基酸序列（表7，FR區以非粗體標記）。合適的Vλ FR4如SEQ ID NO: 132至SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139所示，包含單個半胱胺酸殘基，特別是在對應VH鏈中存在第2個單個半胱胺酸的情況下，特別是在VH的第51位（AHo 編號），用於形成結構域之間的雙硫鍵。在一實施例中，本發明的VL結構域包括與選自SEQ ID NO:132至SEQ ID NO:139中任一項的胺基酸序列（特別是與SEQ ID NO:132或139）具有至少70%、80%或90%一致性的Vλ FR4。
本發明的結合域包括列於表1、3和4中的VH結構域。合適地，本發明的結合域包括列於表1、3和4之一中的VH胺基酸序列，其中在框架序列（例如，非CDR的序列）中不超過20個的胺基酸已被突變（其中，作為各種非限制性範例，突變是添加、取代或缺失）。適當地，本發明的結合域包含列於表1、3和4之一中的VH胺基酸序列，其中不超過15個胺基酸，特別是不超過10個胺基酸，特別是不超過5個胺基酸。框架序列（例如，不是CDR的序列）已被突變（其中，作為各種非限制性實例，突變是添加、替換或缺失）。本發明的其他結合域包括已經突變的胺基酸，但在VH區域與表1、3和4之一中所述的對應序列中描述的VH區域（包括包含至少位置5至140(AHo編號)、特別是表1、3及4中所示序列之一的至少位置3至145的VH區域）具有至少80%、85%、90%、91%、92% 、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。
特別地，本發明的結合域包含列於表1、3和4之一中的VL結構域。合適地，本發明的結合域包含列於表1、3和4之一中的VL胺基酸序列，其中框架序列（例如，非互補決定區的序列）中不超過20個胺基酸已被突變（其中，作為各種非限制性實例，突變是添加、取代或缺失）。適當地，本發明的結合域包括列於表1、3和4之一中的VL胺基酸序列，其中框架序列（例如，非互補決定區的序列）中不超過15個胺基酸（特別是不超過10個胺基酸，特別是不超過5個胺基酸）已被突變（其中，作為各種非限制性範例，突變是添加、取代或缺失）。本發明的其他結合域包括已經突變的胺基酸，但在VL 區域與表1、3和4之一中所述的序列中描述的VL區域（包括包含至少位置5至140(AHo編號)、特別是表1、3和4中所示序列之一的至少位置3至145的VL結構域）具有至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性。
在本發明的上下文中，術語「本發明的結合域」有關於這樣的結合域（即獨立於多特異性的上下文）及特別是包含在多特異性構築體（multispecific construct）中的結合域兩者，例如包含在雙特異性、三特異性或四特異性構築體中的結合域之一。
合適地，本發明的結合域選自由下列所組成的群組：Fab、Fv、scFv、dsFv、scAb和STAB。
合適地，本發明的結合域是scFv抗體片段。
本發明的多特異性抗體可以是任何合適的形式。
合適地，多特異性抗體的結合域被可操作地連接。本發明的多特異性抗體的結合域能夠同時結合它們各自的抗原或受體。在這方面使用的術語「同時」是指多個MSLN-BD的至少其一和CD3-BD同時結合。在特定情況下，例如在細胞表面具有高密度MSLN的標靶細胞的情況下，也可能存在3個結合域（即MSLN-BD和CD3-BD 兩者）同時結合。
本發明的多特異性抗體包含2個MSLN-BD和至少一CD3-BD，其中所述MSLN-BD和所述CD3-BD彼此可操作地連接。
如本文所用，術語「可操作地連接」表示2個分子(例如，多肽、結構域、結合域)連接以便各自保留功能活性。2個分子可以「可操作地連接」，無論它們是直接連接還是間接連接（例如，通過連接子(linker)、通過部分(moiety)、通過連接子與部分連接）。術語「連接子」是指選擇性地位於本發明的結合域或抗體片段之間的肽或其他部分。許多策略可用於將分子共價連接在一起。這些包括但不限於蛋白質或蛋白質結構域的 N 端和 C 端之間的多肽連接、通過雙硫鍵的連接和通過化學交聯劑的連接。在該實施例的一方面，連接子是通過重組技術或肽合成產生的肽鍵。為要連接2條多肽鏈的特定情況選擇合適的連接子取決於各種參數，包括但不限於2條多肽鏈的性質（例如，它們是否天然寡聚化），N端與要連接的C端之間的距離如果已知，和/或連接子對蛋白水解和氧化的穩定性。此外，連接子可包含提供彈性（flexibility）的胺基酸殘基。
在本發明的上下文中，術語「多肽接頭」是指由連接2個結構域的肽鍵連接的胺基酸殘基鏈所組成的連接子，每個結構域連接到連接子的一端。多肽連接子的長度應足以連接2個分子，使它們相對於彼此呈現正確的構型，從而保持所需的活性。在特定實施例中，多肽連接子具有2與30個胺基酸殘基（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個胺基酸殘基）之間的連續鏈。此外，選擇包含在多肽連接子中的胺基酸殘基應表現出不顯著干擾多肽活性的特性。因此，連接子肽整體不應表現出與多肽活性不一致的電荷，或乾擾內部折疊，或與一或多個單體中的胺基酸殘基形成鍵或其他相互作用，這將嚴重阻礙受體單體結構域的結合。在特定實施例中，多肽連接子是非結構化多肽。有用的連接子包括甘胺酸-絲胺酸或GS連接子。 「Gly-Ser」或「GS」連接子是指甘胺酸和絲胺酸串聯的聚合物（包括例如（Gly-Ser） n、（GSGGS） n、（GGGGS） n和（GGGS） n，其中n是至少為 1 的整數）、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和其他彈性連接子，例如用於沙克爾鉀通道（shaker potassium channel）的系鏈（tether），以及多種其他彈性連接子，如同本領域中具有通常知識者將有所理解。甘胺酸-絲胺酸聚合物是優選的，因為這兩種胺基酸都是相對非結構化的，因此可能能夠作為組分之間的中性系鏈。其次，絲胺酸是親水的，因此能夠溶解可能是球狀甘胺酸鏈的物質。第三，類似的鏈已被證明可有效連接重組蛋白的次單元，例如單鏈抗體。
合適地，多特異性抗體是選自任何合適的多特異性抗體的形式，例如至少是本領域已知的雙特異性形式，其不包含免疫球蛋白（多個）Fc區，包括（但非限制性範例的形式）基於下列的形式：串聯單鏈雙價抗體（tandem scDb, Tandab）、線性二聚體單鏈雙價抗體（linear dimeric scDb, LD-scDb）、環狀二聚體單鏈雙價抗體（circular dimeric scDb, CD-scDb）、串聯三單鏈可變片段（tandem tri-scFv）、三功能抗體（抗原結合片段-(單鏈可變片段) 2）（triabody Fab-(scFv) 2）、Fab-Fv 2、三功能抗體、scDb-scFv、四功能抗體（tetrabody）、雙二鏈抗體、交叉雙重可變（CODV）、串聯二scFv、串聯三scFv、Fab-(scFv) 2、Fab-Fv 2或與異二聚Fc結構域以外的異二聚化結構域的N-和/或C-末端融合的CODV，以及雙特異性抗體/多特異性抗體平台（MATCH）（描述於WO 2016/0202457；Egan T.等人，MABS 9 (2017) 68-84）和DuoBodies（通過Duobody技術製備的雙特異性IgG）（MAbs. 2017 Feb/Mar；9(2):182-212. doi: 10.1080/ 19420862.2016.1268307）。特別合適的是，多特異性抗體是單鏈雙抗體(scDb)-scFv或MATCH。
在一實施例中，本發明的多特異性抗體不包含CHl和/或CL區。
在另一實施例中，本發明的多特異性抗體的形式選自由scDb-scFv、三功能抗體和三體組成的列表。特別適用於本文的是scDb-scFv，特別是其中MSLN-BD和CD3-BD之一是scDb的形式並且第2個MSLN-BD是可操作地連接到scDb的scFv。
術語「雙功能抗體（diabody）」是指具有2個抗原結合位點的抗體片段，該片段包含與同一多肽鏈(VH-VL)中的VL連接的VH。通過使用太短而不允許在同一條鏈上的2個結構域之間配對的連接子，這些結構域被迫與另一條鏈的互補域（complementary domain）配對以創建2個抗原結合位點。雙功能抗體可以是二價的或雙特異性的。雙功能抗體在例如下列文獻中所充分描述：EP 404097、WO 93/01161、Hudson 等人（Nat. Med. 9:129-134 (2003)）和Hollinger 等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)）。三功能抗體和四功能抗體也描述於Hudson等人的文獻中（Nat. Med. 9:129-134 (2003)）。
雙特異性scDb，特別是雙特異性單體scDb，特別包含2個可變重鏈結構域(VH)或其片段和2個可變輕鏈結構域(VL)或其片段，通過連接子L1、L2和L3依序連接VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA、VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA、VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA、VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA結構域共同構成第一抗原的抗原結合位點，VLB和VHB共同構成第二抗原的抗原結合位點。
連接子L1特別是2-10個胺基酸、更特別是3~7個胺基酸、最特別是5個胺基酸的肽，連接子L3特別是1~10個胺基酸，更特別是2~7個胺基酸，尤其是5個胺基酸。在特定實施例中，連接子L1和/或L3包含4個甘胺酸胺基酸殘基和1個絲胺酸胺基酸殘基(GGGGS) n的一個或兩個單位，其中n=1或2，特別是n=1。
中間連接子L2特別地是10-40個胺基酸、更特別地15~30個胺基酸、最特別地20-25個胺基酸的肽。在特定實施例中，連接子L2包含4個甘胺酸胺基酸殘基和1個絲胺酸胺基酸殘基(GGGGS) n的一個或多個單元，其中n=1、2、3、4、5、6、7或8，特別是n=4。
在一實施例中，本發明的多特異性抗體是scDb-scFv。術語「scDb-scFv」是指一種抗體形式，其中單鏈Fv(scFv)片段通過彈性Gly-Ser連接子與單鏈雙功能抗體(scDb)融合。在一實施例中，彈性Gly-Ser連接子是2-40個胺基酸（例如，2~35、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10個胺基酸，特別是10個胺基酸）的肽。在特定實施方案中，所述接頭包含四(4)個甘氨酸胺基酸殘基和一(1)個絲氨酸胺基酸殘基(GGGGS)n的一個或多個單位，其中n=1、2、3、4、5、6、7或8，特別是n=2。
在本發明的一實施例中，本發明的多特異性抗體為下列文獻中描述的MATCH形式：WO 2016/0202457； Egan T. 等人，MABS 9 (2017) 68-84。特別地，在該實施例中，本發明的多特異性抗體是MATCH3或MATCH4形式。
本發明的多特異性抗體可以使用本領域已知的任何方便的抗體製造方法來生產（請參見，例如，Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3~14關於雙特異性構築體的生產(with regard to the production of bispecific constructs)；Hornig, N. & Färber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012)713-727和WO 99/57150，關於雙特異性雙功能抗體與串聯scFvs(with regard to bispecific diabodies and tandem scFvs)）。用於製備本發明的雙特異性構築體的合適方法的具體範例進一步包括，除其他外，Genmab（請參見Labrijn 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150）和Merus（請參見de Kruif等人，Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750）的技術。包含功能性抗體Fc部分的雙特異性抗體的生產方法也是本領域已知的（請參見，例如，Zhu等人，Cancer Lett. 86 (1994) 127-134)；和Suresh等人，Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228）。
這些方法通常涉及產生單株抗體，例如通過將骨髓瘤細胞與來自使用融合瘤技術將所需抗原免疫的小鼠的脾細胞融合（請參見，例如，Yokoyama等人， Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2, Unit 2.5, 2006)或通過重組抗體工程（組庫選殖(repertoire cloning)或噬菌體展示/酵母菌展示）（請參見，例如Chames & Baty, FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1-8），以及使用已知分子選殖技術將兩種或更多種不同單株抗體的抗原結合域或其片段或部分組合以產生雙特異性或多特異性構築體。
本發明的多特異性分子可以通過使用本領域已知的方法結合組分結合特異性來製備。例如，雙特異性分子的每種結合特異性可以分別產生，然後彼此結合。當結合特異性是蛋白質或肽時，多種偶聯劑或交聯劑可用於共價結合。交聯劑的例子包括蛋白質A、碳二亞胺（carbodiimide）、N-琥珀醯亞胺-5-乙醯-硫代乙酸酯（N-succinimidyl-5-acetyl-thioacetate, SATA）、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), DTNB）、鄰苯二馬來醯亞胺(o-phenylenedimaleimide, oPDM)、N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（N- succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP）和磺基琥珀醯亞胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯（sulfosuccinimidyl 4- (N- maleimidomethyl)cyclohaxane-l-carboxylate, sulfo-SMCC)（請參見例如下列文獻：Karpovsky等人，1984 J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA等人，1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括描述於下列文獻的方法：Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83)，和Glennie等人，1987 J. Immunol. 139：2367-2375）。偶聯劑是SATA和磺基-SMCC，均可從Pierce Chemical Co. (Rockford, 111)獲得。
當結合特異性是抗體時，它們可以通過2條重鏈的C端鉸鏈區的巰基鍵結來接合。在一特定的實施例中，鉸鏈區在接合之前被修飾為含有奇數個巰基殘基（例如一個）。
或者，可以在同一載體中編碼2種或更多種結合特異性並在同一宿主細胞中表達和組裝。當雙特異性分子是mAb X mAb、mAb X Fab、Fab X F (ab') 2或配體X Fab融合蛋白時，該方法特別有用。本發明的多特異性抗體可以是包含一單鏈抗體和一結合決定位的單鏈分子，或包含2個結合決定位的單鏈多特異性抗體。多特異性抗體可包含至少2個單鏈分子。用於製備多特異性抗體和分子的方法描述於例如美國專利第5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號、和美國專利第5,482,858號。
多特異性抗體與其特異性靶標的結合可以通過例如酵素免疫測定法（ELISA）、放射免疫測定（REA）、FACS分析、生物測定（例如生長抑制）或西方墨點法來證實。這些測定中的每一個通常通過使用對感興趣的複合物特異的標記試劑（例如，抗體）來檢測特別感興趣的蛋白質-抗體複合物的存在。
在另一方面，本發明提供編碼本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域的核酸。可以優化此類核酸序列以在哺乳動物細胞中表達。
術語「核酸」在本文中與術語「多核苷酸」可互換使用，是指單鍊或雙鏈形式的一或多種去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，它們是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核苷酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的範例包括但不限於硫代磷酸酯（phosphorothioate）、胺基磷酸酯（phosphoramidate）、甲基膦酸酯（methyl phosphonate）、手性甲基磷酸酯（chiral-methyl phosphorate）、2-O-甲基核糖核苷酸（2-O-methyl ribonucleotide）、肽-核酸（peptide-nucleic acid, PNA）。除非另有說明，特定的核酸序列也隱含地包括其保守修飾的變體（例如，簡併密碼子(degenerate codon)取代）和互補序列，以及明確指出的序列。具體而言，如下文詳述，簡併密碼子取代可通過產生序列來實現，其中一個或多個選定的（或所有）密碼子的第3個位置被混合鹼基和/或次黃嘌呤核苷殘基（deoxyinosine residue）取代（Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081，1991；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608，1985；和Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
本發明提供了基本上純化的核酸分子，其編碼包含上述多特異性抗體的區段或結構域的多肽。當從合適的表達載體表達時，由這些核酸分子編碼的多肽能夠表現出本發明的多特異性抗體的抗原結合能力。
本發明還提供了編碼表1、3和4中列出編碼本發明多特異性抗體的結合域的至少一CDR區和通常所有3個CDR區的多核苷酸。由於密碼子的簡併性（degeneracy），多種核酸序列將編碼每個免疫球蛋白胺基酸序列。
多核苷酸序列可以通過從生（de novo）固相DNA合成或通過PCR誘變編碼本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域的現有序列（例如，如下列實施例中描述的序列）產生多核酸序列。直接化學合成可以通過本領域已知的方法完成，例如Narang等人（1979, Meth. Enzymol. 68:90）的磷酸三酯方法（phosphotriester method）、Brown等人（Meth. Enzymol. 68:109, 1979）的磷酸二酯方法、Beaucage 等人（Tetra. Lett., 22:1859, 1981）的二乙基亞磷醯胺方法（diethylphosphoramidite method）、和美國專利第4,458,066號的固體支持方法（solid support method）。通過聚合酶連鎖反應（PCR）將突變引入多核苷酸序列可以如下列文獻所述進行操作，例如，H. A. Erlich編輯的聚合酶連鎖反應技術：DNA放大擴增的原理和應用（PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification）（H. A. Erlich(Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992）、Innis等人編輯的聚合酶連鎖反應操作手冊：方法和應用指南（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications）（Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990）、Mattila等人的文獻（Nucleic Acids Res. 19:967, 1991）、和Eckert等人的聚合酶連鎖反應的方法及應用（PCR Methods and Applications 1:17, 1991）。
本發明還提供用於產生本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域的表達載體和宿主細胞。
術語「載體（vector）」旨在指能夠運輸與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是「質體（plasmid）」，它指的是環狀雙股DNA環，環中可以連接額外的DNA片段。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體(episomal mammalian vector)）。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。
此外，某些載體能夠指導與它們有效連接的基因的表達。此類載體在本文中稱為「重組表達載體」（或簡稱為「表達載體」）。一般而言，可用於重組DNA技術的表達載體通常是質體形式。在本說明書中，因為質體是最常用的載體形式，「質體」和「載體」可以互換使用。然而，本發明旨在包括這些其他形式的表達載體，例如病毒載體（例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒），它們具有同等功能。在特定上下文中，術語「可操作地連接」是指2個或多個多核苷酸（例如，DNA）區段之間的功能關係。典型上，它是指轉錄調控序列（transcriptional regulatory sequence）與轉錄序列（transcribed sequence）的功能關係。例如，如果啟動子或增強子序列在合適的宿主細胞或其他表達系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則啟動子或增強子序列與編碼序列可操作地連接。通常，與轉錄序列有效連接的啟動子轉錄調控序列與轉錄序列物理上連續，即，它們是順式作用的（cis-acting）。然而，一些轉錄調控序列（例如增強子）不需要物理上連續或位於它們增強轉錄的編碼序列附近。
可以使用各種表達載體來表達編碼多特異性抗體鍊或結合片段的多核苷酸。基於病毒的和非病毒的表達載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體和系統包括質體、附加型載體（通常具有用於表達蛋白質或RNA的表達匣(expression cassette)）和人類人工染色體（請參見，例如Harrington等人，Nat Genet. 15:345, 1997）。例如，用於在哺乳動物（例如人類）細胞中表達MSLN結合多核苷酸和多肽的非病毒載體包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B 和 C，（Invitrogen, San Diego, Calif.)、MPS V載體和本領域已知的用於表達其他蛋白質的許多其他載體。有用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒的載體、基於SV40的載體、乳突狀瘤病毒、HBP艾司坦-巴爾病毒（Epstein Barr virus）、牛痘病毒載體（vaccinia virus vector）和森林病毒（Semliki Forest, SFV）。請參見下列文獻，Brent等人的文獻（同上）、史密斯的文獻（Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995）和Rosenfeld等人的文獻（Cell 68:143, 1992）。
表達載體的選擇取決於要在其中表達載體的預期宿主細胞。通常，表達載體包含與編碼多特異性抗體鍊或片段的多核苷酸可操作地連接的啟動子和其他調節序列（例如增強子）。在一實施例中，使用誘導型啟動子來阻止插入序列的表達，但在誘導條件下除外。誘導型啟動子包括（例如）阿拉伯糖、乳糖操縱子（lacZ）、金屬硫蛋白啟動子（metallothionein promoter）或熱休克啟動子（heat shock promoter）。轉型生物體（transformed organism）的培養可以在非誘導條件下擴增，而不會偏向於編碼序列的群體，其表達產物更容易被宿主細胞耐受。除了啟動子之外，多特異性抗體鍊或片段的有效表達也可能需要或需要其他調控元件。這些元件通常包括ATG起始密碼子和相鄰的核醣體結合位點或其他序列。此外，表達效率可以通過包含適合所用細胞系統的增強子來增強（參見，例如，Scharf等人，Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；和Bittner等人，Meth. Enzymol., 153:516, 1987)。例如，SV40增強子或CMV增強子可用於增加哺乳動物宿主細胞中的表達。
表達載體還可提供分泌信號序列位置以與由插入的本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域序列編碼的多肽形成融合蛋白。更常見的是，插入的本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域序列在包含在載體中之前與信號序列連接。用於接收編碼多特異性抗體輕鍊和重鏈可變域的結構域的序列的載體有時也編碼恆定區或其部分。
術語「重組宿主細胞」（或簡稱為「宿主細胞」）是指已引入重組表達載體的細胞。應當理解，這些術語不僅是指特定的受試細胞，而且是指這種細胞的後代。由於某些修飾可能由於突變或環境影響而在後代中發生，因此此類後代實際上可能與母細胞不同，但仍包括在本文所用術語「宿主細胞」的範圍內。
用於攜帶和表達本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域的宿主細胞可以是原核的或真核的。大腸桿菌是一種可用於選殖和表達本發明多核苷酸的原核宿主。適用的其他微生物宿主包括桿菌（例如枯草桿菌(Bacillus subtilis)）和其他腸桿菌科（enterobacteriaceae）（例如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)），和各種假單胞菌屬（Pseudomonas）的物種。在這些原核宿主中，還可以製作表達載體，其通常包含與宿主細胞相容的表達控制序列（例如，複製起點）。此外，將存在任意數量的多種眾所周知的啟動子，例如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自λ噬菌體的啟動子系統。啟動子通常控製表達，任選地帶有操縱子序列，並具有核醣體結合位點序列等，用於啟動和完成轉錄和轉譯。其他微生物（例如酵母）也可用於表達本發明的MSLN結合多肽。也可以使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體的組合。
在一個實施例中，哺乳動物宿主細胞用於表達和產生本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域。例如，它們可以是表達內源免疫球蛋白基因的融合瘤細胞系或帶有外源表達載體的哺乳動物細胞系。這些包括任何正常會死的或正常或異常的永生動物或人類細胞。例如，已經開發了許多能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、轉型的B細胞和融合瘤。哺乳動物組織細胞培養物表達多肽的用途一般討論於例如是Winnacker的文獻中（FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, NY, NY, 1987）。哺乳動物宿主細胞的表達載體可以包括表達控制序列（例如複製起點、啟動子和增強子）（請參見，例如，Queen等人，Immunol. Rev. 89:49-68, 1986)，以及必要的處理訊息位點（例如核醣體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點和轉錄終止子序列）。這些表達載體通常含有來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可以是組成型的、細胞類型特異性的、階段特異性的和/或可調整的或可調節的。有用的啟動子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子（dexamethasone-inducible MMTV promoter）、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPS V啟動子、四環素誘導型CMV啟動子（例如人類立即早期CMV啟動子）、組成型CMV啟動子和本領域已知的啟動子-增強子組合。
用於引入包含感興趣的多核苷酸序列的表達載體的方法根據細胞宿主的類型而變化。例如，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主(一般參見Sambrook等人的文獻，同上)。其他方法包括，例如，電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體媒介的轉型、注射和顯微注射、生物彈衝擊法(ballistic method)、病毒顆粒、免疫脂質體、聚陽離子核酸共軛物、裸DNA、人造病毒粒子、與疱疹病毒結構蛋白VP22融合（Elliot及O'Hare,Cell 88:223, 199788:223,1997）、DNA之藥劑增強吸收及體外轉導。對於長期高產量產生重組蛋白而言，通常需要穩定表現。舉例而言，可以使用本發明的表達載體（包含病毒複製起點或內源性表達元件和選擇標記基因）製備穩定表達本發明的多特異性抗體或其片段或其結合域的細胞系。引入載體之後，可使細胞於富營養培養基中生長1~2天，隨後將其轉至選擇性培養基。可選擇標記之目的為賦予針對選擇之抗性且其存在允許成功表現所引入序列的細胞在選擇性培養基中生長。穩定轉染之抗性細胞可使用適合於該細胞類型之組織培養技術增殖。本發明因此提供了產生本發明的抗體或其抗原結合片段的方法，其中所述方法包括培養包含編碼本發明的抗體或其抗原結合片段的核酸或載體的宿主細胞的步驟，由此表達本揭露的所述抗體或其片段。
在一方面，本發明涉及一種產生本發明的多特異性抗體或其結合域或其片段的方法，該方法包括培養表達編碼本發明多特異性抗體或其結合域或其片段的核酸的宿主細胞的步驟。具體而言，本發明是有關於產生本發明的多特異性抗體或其結合域或其片段的方法，該方法包括(i)提供編碼本發明的多特異性抗體或其結合域的一核酸序列或2個核酸序列、或編碼本發明的多特異性抗體或其結合域的一載體或2個載體，表達該核酸序列或核些酸序列、或該載體或該些載體，並收集多特異性抗體或來自表達系統的結合域，或(ii)提供表達編碼本發明的多特異性抗體或其結合域的核酸的一宿主細胞或多個宿主細胞，培養該宿主細胞或該些宿主細胞；及從細胞培養物中收集多特異性抗體或結合域。
在另一方面，本發明有關於包含本發明的多特異性抗體和藥學上可接受的載體（pharmaceutically acceptable carrier）的藥物組合物。藥學上可接受的載體增強或穩定組合物，或促進組合物的製備。藥學上可接受的載體包括生理相容的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑及類似物。
本發明的藥物組合物可以通過本領域已知的多種方法給藥。給藥途徑和/或給藥方式取決於所需的結果。給藥可以是靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下給藥，或在目標位點附近給藥。藥學上可接受的載體應該適用於靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮給藥（例如，通過注射或輸注）。根據給藥途徑，活性化合物（即本發明的多特異性抗體）可以用一種材料包覆以保護化合物免受酸作用和其他可能使化合物失活的自然條件。
本發明的藥物組合物可以根據本領域已知和常規實踐的方法製備。請參照，例如下列文獻：Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。藥物組合物優選在GMP條件下製造。通常，在本發明的藥物組合物中使用治療有效劑量或有效劑量的本發明多特異性抗體。通過本領域技術人員已知的常規方法將本發明的多特異性抗體配製成藥學上可接受的劑型。調整劑量方案以提供最佳的所需反應（例如治療反應）。例如，可以施用單次推注，可以隨著時間的推移施用幾個分開的劑量，或者可以根據治療情況的緊急情況按比例減少或增加劑量。以劑量單位形式配製腸胃外組合物以易於給藥和劑量均勻是特別有利的。如本文所用的劑量單位形式是指適合作為待治療受試者的單位劑量的物理離散單位；每個單元含有預定量的活性化合物（經計算可產生所需的治療效果以及所需的藥物載體）。
本發明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得有效實現特定患者所需治療反應的活性成分的量、組合物和給藥方式，而不會對患者有毒性。選擇的劑量水平取決於多種藥物動力學因素，包括所使用的本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺的活性、給藥途徑、給藥時間、所使用的特定化合物的排泄速率、治療的持續時間、與所使用的特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和既往病史及類似因素。
本發明的多特異性抗體通常在多次施用的情況。單次劑量之間的間隔可以是每週、每月或每年。間隔也可以是不規則的，如通過測量患者體內本發明的多特異性抗體的血液水平所指示的。或者，本發明的多特異性抗體可以作為持續釋放製劑（sustained release formulation），在這種情況下需要較少的給藥頻率。劑量和頻率取決於患者體內抗體的半衰期。一般來說，人類化抗體的半衰期比嵌合抗體和非人類抗體長。給藥的劑量和頻率可以根據治療是預防性的還是治療性而變化。在預防性應用中，在很長一段時間內以相對不頻繁的間隔施用相對低的劑量。一些患者在他們的餘生中繼續接受治療。在治療應用中，有時需要在相對較短的間隔內使用相對高的劑量，直到疾病的進展減緩或終止，優選的，直到患者表現出疾病症狀的部分或完全改善。此後，可以向患者施用預防方案。
在一方面，本發明有關於用作藥物的本發明的多特異性抗體或本發明的藥物組合物。在合適的實施例中，本發明提供用於治療有需要的受試者的增殖性疾病（特別是癌症）的多特異性抗體或藥物組合物。
在另一方面，本發明提供用於製備治療增殖性疾病（特別是癌症）的藥物的多特異性抗體或藥物組合物。
在另一方面，本發明有關於多特異性抗體或藥物組合物用於治療有需要的受試者的增殖性疾病（特別是癌症）的用途。
在又一方面，本發明有關於多特異性抗體或藥物組合物在製備用於治療有需要的受試者的增殖性疾病（特別是癌症）的藥物中的用途。
在另一方面，本發明有關於治療受試者的方法，包括向受試者施用治療有效量的本發明的多特異性抗體。在合適的實施例中，本發明有關於治療受試者的增殖性疾病（特別是癌症）的方法，包括向受試者施用治療有效量的本發明的多特異性抗體。
術語「受試者」包括人類和非人類的動物。非人類的動物包括所有脊椎動物（例如，哺乳動物和非哺乳動物），例如非人類靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非另有說明，否則術語「患者」或「受試者」在本文中可互換使用。
如本文所用，術語「治療」、「治療中」、「進行治療」、「被治療」及類似術語是指獲得期望的藥理學和/或生理學效果。就部分或完全治癒疾病和/或歸因於疾病或延遲疾病進展的副作用而言，效果可以是治療性的。如本文所用，「治療」涵蓋哺乳動物疾病的任何治療，例如，在人類中，包括：(a)抑制疾病，亦即，阻止其發展；(b)緩解疾病，亦即，導致疾病消退。
術語「治療有效量」或「有效量」是指當向哺乳動物或其他受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的此類治療的藥劑的量。「治療有效量」將根據要治療的受試者的藥劑、疾病及其嚴重程度和年齡、體重等而變化。
在一個實施例中，增殖性疾病是癌症。術語「癌症」是指以異常細胞的快速和不受控制的生長為特徵的疾病。癌細胞可以局部擴散或通過血流和淋巴系統擴散到身體的其他部位。術語「腫瘤」和「癌症」在本文中可互換使用，例如，這兩個術語都包括固體和液體（例如瀰漫性或循環性）腫瘤。如本文所用，術語「癌症」或「腫瘤」包括癌前期（premalignant）以及惡性癌症和腫瘤。術語「癌症」在本文中用於表示廣度（broad spectrum）的腫瘤，包括所有實體和血液惡性腫瘤。此類腫瘤的範例包括但不限於：良性或尤其是惡性腫瘤、實體瘤、腦癌、腎癌、肝癌、腎上腺癌、膀胱癌、乳癌、胃癌（例如，胃腫瘤）、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、結腸癌、直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌（例如非小細胞肺癌和小細胞肺癌）、陰道癌、甲狀腺癌、黑色素瘤（例如，不可切除的或轉移性黑色素瘤）、腎細胞癌、肉瘤、神經膠質母細胞瘤、多發性骨髓瘤或胃腸道癌，尤其是結腸癌或結直腸腺瘤（colorectal adenoma）、頸部和頭部腫瘤、子宮內膜癌、多發性缺陷瘤症候群（Cowden syndrome）、萊-杜二氏病(Lhermitte-Duclos disease)、班-鄒二氏症候群(Bannayan-Zonana syndrome)、前列腺增生、贅瘤形成（neoplasia），尤其是上皮特徵，優選乳癌（mammary carcinoma）或鱗狀細胞癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病（myelogenous leukemia）（例如，費城染色體陽性-慢性骨髓性白血病(Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia)）、急性淋巴母細胞白血病（例如，費城染色體陽性-急性淋巴母細胞白血病）、非何杰金氏淋巴癌（non-Hodgkin’s lymphoma）、漿細胞骨髓瘤、何杰金氏淋巴癌、白血病及其任何組合。在一個優選的實施例，癌症是選自間皮瘤（mesothelioma）、胰腺癌和卵巢癌的癌症。
本發明的多特異性抗體或本發明的組合物抑制實體瘤的生長，但也抑制液體腫瘤的生長。在另一實施例中，增殖性疾病是實體瘤。術語「實體瘤」尤其是指乳癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、前列腺癌、胃癌（stomach cancer）（尤其是胃癌(gastric cancer)）、子宮頸癌、肺癌（例如，非小細胞肺癌和小細胞肺癌）和頭頸部腫瘤。此外，根據腫瘤類型和使用的特定組合，可以獲得腫瘤體積的減小。本發明的多特異性抗體或本發明的組合物也適用於在患有癌症的受試者中預防腫瘤的轉移擴散和微轉移的生長或發展。
序列表（根據AHo編號方案所標示的突變，根據 Numab互補決定區定義所定義的互補決定區）
表1.本發明的低親和力MSLN結合域的範例。
SEQ ID NO: 抗體區域 序列
1 HCDR1 54-01-G02 GFSLSSYAMG
2 HCDR2 54-01-G02 YISTINNTYYASWAKG
3 HCDR3 54-01-G02 REIRSGWVDYGFSI
4 LCDR1 54-01-G02 QASQNIYSNLA
5 LCDR2 54-01-G02 DASDLAS
6 LCDR3 54-01-G02 QQVRSSSDIDNP
7 VH 54-01-G02-sc01(PRO1783) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEWIGYISTINNTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREIRSGWVDYGFSIWGQGTLVTVSS
8 VH 54-01-G02-sc01_N66A (54-01-G02-sc03)(PRO2197) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEWIGYISTIANTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREIRSGWVDYGFSIWGQGTLVTVSS
9 VL 54-01-G02-sc01(PRO1783 and PRO2197) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVRSSSDIDNPFGTGTKVTVLG
10 HCDR2 54-01-G02_N66A YISTIANTYYASWAKG
SEQ ID NO: 抗體區域 序列
11 HCDR1 54-32-A07 GFSLSSYAMG
12 HCDR2 54-32-A07 YISKIGTTYYASWAKG
13 HCDR3 54-32-A07 RGSSSGGYLDDGFDP
14 LCDR1 54-32-A07 QASQSISNYLA
15 LCDR2 54-32-A07 DASDLAS
16 LCDR3 54-32-A07 QQVYDSNNVENV
17 VH 54-32-A07-sc02(PRO1925) QSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSS
18 VL 54-32-A07-sc02(PRO1925) ALQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVSSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLG
19 VH 54-32-A07-sc06(PRO2306) QSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSS
20 VH 54-32-A07-sc06_(L12R, V103T, L144Q) QSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTQVTVSS
21 VL 54-32-A07-sc06_(S14R, T22K, T87R)(PRO2306) ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLG
22 VH 54-32-A07-sc09_(G51C)(PRO2309) QSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSS
23 VH 54-32-A07-sc09_(L12R, G51C, V103T, L144Q) QSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTQVTVSS
24 VL 54-32-A07-sc09_(S14R, T22K, T87R, T141C)(PRO2309) ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLG
SEQ ID NO: 抗體區域 序列
25 HCDR1 54-21-H03 GFSFSTTYYMC
26 HCDR2 54-21-H03 CTNTASSVRTYYATWAKG
27 HCDR3 54-21-H03 RDMGFADYALNL
28 LCDR1 54-21-H03 QASQSISNYLA
29 LCDR2 54-21-H03 LASTLAS
30 LCDR3 54-21-H03 QSTDYTTSTHRNS
31 VH 54-21-H03-sc01(PRO1922) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSTTYYMCWVRQAPGKGLEWIGCTNTASSVRTYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDMGFADYALNLWGQGTLVTVSS
32 VH 54-21-H03-sc01_(L12R, V103T, L144Q) EVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSTTYYMCWVRQAPGKGLEWIGCTNTASSVRTYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARDMGFADYALNLWGQGTQVTVSS
33 VL 54-21-H03-sc01(PRO1922) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESIYSSLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTDYTTSTHRNSFGTGTKVTVLG
34 VH 54-21-H03-sc01_(G51C) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSTTYYMCWVRQAPGKCLEWIGCTNTASSVRTYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDMGFADYALNLWGQGTLVTVSS
35 VH 54-21-H03-sc01_(L12R, G51C, V103T, L144Q) EVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSTTYYMCWVRQAPGKCLEWIGCTNTASSVRTYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARDMGFADYALNLWGQGTQVTVSS
36 VL 54-21-H03-sc01_(G141C) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESIYSSLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTDYTTSTHRNSFGCGTKVTVLG
表2.參考MSLN結合域的範例
SEQ ID NO: 描述 序列
37 HCDR1 GISVSNDYYMC
38 HCDR2 CISTYIGNTHYASWAKG
39 HCDR3 KNAGYPGYRYAIDL
40 LCDR1 QASESIGNYLA
41 LCDR2 SASTLAS
42 LCDR3 QSTDYGDSYI
43 VH 54-22-H03-sc01(PRO1795) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGISVSNDYYMCWVRQAPGKGLEWIGCISTYIGNTHYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAGYPGYRYAIDLWGQGTLVTVSS  
44 VL 54-22-H03-sc01(PRO1795) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESIGNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTDYGDSYIFGTGTKVTVLG
表3. 本發明之CD3結合域的範例
SEQ ID NO: 描述 序列
45 HCDR1 GFSLSSYDMS
46 HCDR2 ASYASGPTYYASWAKG
47 HCDR3 RGGWTGTSHSNI
48 LCDR1 QSSQSVFSNNYLA
49 LCDR2 SASTLAS
50 LCDR3 LGSYACSSADCYV
51 VH 28-21-D09 sc04 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSS
140 VH 28-21-D09 sc04_(N94C) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMCSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSS
141 VH 28-21-D09 sc04_(L12R, L144Q) EVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTQVTVSS
142 VH 28-21-D09 sc04_(L12R, N94C, L144Q) EVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMCSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTQVTVSS
52 VL 28-21-D09 sc04 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
表4. 本發明之人類血清白蛋白（hSA）結合域的範例。
SEQ ID NO: 描述 序列
抗人類血清白蛋白結合域（Anti-hSA domain） 19-01-H04-sc03
53 HCDR1 GFSLSSNAMG
54 HCDR2 IISVGGFTYYASWAKG
55 HCDR3 RDRHGGDSSGAFYL
56 LCDR1 QSSESVYSNNQLS
57 LCDR2 DASDLAS
58 LCDR3 AGGFSSSSDTA
59 VH 19-01-H04-sc03(PRO325) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQGTLVTVSS
60 VL 19-01-H04-sc03(PRO325) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGTKLTVLG
61 VH 19-01-H04-sc03 (G51C)(PRO325_Cys) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKCLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQGTLVTVSS
62 VL 19-01-H04-sc03 (G141C)(PRO325_Cys) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGCGTKLTVLG
抗人類血清白蛋白結合域23-13-A01-sc03
63 HCDR1 GFSFSSSYWIC
64 HCDR2 CVFTGDGTTYYASWAKG
65 HCDR3 RPVSVYYYGMDL
66 LCDR1 QASQIISSRSA
67 LCDR2 QASKLAS
68 LCDR3 QCTYIDSNFGA
69 VH 23-13-A01-sc03(PRO459) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEWVGCVFTGDGTTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARPVSVYYYGMDLWGQGTLVTVSS
70 VL 23-13-A01-sc03(PRO459) DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWYQQKPGQPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGAFGGGTKLTVLG
71 VH 23-13-A01-sc03 (G51C)(PRO459_Cys) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWICWVRQAPGKCLEWVGCVFTGDGTTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARPVSVYYYGMDLWGQGTLVTVSS
72 VL 23-13-A01-sc03_ (G141C)(PRO459_Cys) DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWYQQKPGQPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGAFGCGTKLTVLG
抗人類血清白蛋白結合域19-04-A10
73 HCDR1 GFSLSSYAMN
74 HCDR2 HINAGDIAYYATWAKG
75 HCDR3 RGAGGFSTGPFKL
76 LCDR1 QASESINSRLA
77 LCDR2 DASDLTS
78 LCDR3 QGYGGSSTTT
79 VH 19-04-A10-sc02(PRO2155) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKGLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
143 VH 19-04-A10-sc02_(L12R, V103T, L144Q)  EVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKGLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTQVTVSS
80 VL 19-04-A10-sc02(PRO2155) AFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGGGTKLTVLG
144 VL 19-04-A10-sc02_(S95C)  AFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGGGTKLTVLG
81 VH 19-04-A10-sc06_(G51C)(PRO2317) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
145 VH 19-04-A10-sc06_(L12R, G51C, V103T, L144Q) EVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTQVTVSS
82 VL 19-04-A10-sc06_(G141C)(PRO2317) AFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLG
146 VL 19-04-A10-sc06_(S95C, G141C) AFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLG
表5. 本發明之多特異性分子的範例。
SEQ ID NO: 描述 序列
低親和力雙ＭＳＬＮx CD3 x hSA構築體
PRO2000 (MATCH4)
83 CHAIN_1 PRO2000 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVRSSSDIDNPFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEWIGYISTINNTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREIRSGWVDYGFSIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWICWVRQAPGKCLEWVGCVFTGDGTTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARPVSVYYYGMDLWGQGTLVTVSS
84 CHAIN_2 PRO2000 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVRSSSDIDNPFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEWIGYISTINNTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREIRSGWVDYGFSIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWYQQKPGQPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGAFGCGTKLTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2100 (MATCH4)
85 CHAIN_1 PRO2100 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVRSSSDIDNPFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEWIGYISTIANTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREIRSGWVDYGFSIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWICWVRQAPGKCLEWVGCVFTGDGTTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARPVSVYYYGMDLWGQGTLVTVSS
86 CHAIN_2 PRO2100 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVRSSSDIDNPFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEWIGYISTIANTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREIRSGWVDYGFSIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWYQQKPGQPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGAFGCGTKLTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2323 (MATCH4)
87 CHAIN_1 PRO2323 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
88 CHAIN_2 PRO2323 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2417 (MATCH4)
89 CHAIN_1 PRO2417 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
90 CHAIN_2 PRO2417 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSGGSGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2424 (MATCH4)
91 CHAIN_1 PRO2424 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMCSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
92 CHAIN_2 PRO2424 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSGGSGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2434 (MATCH4)
93 CHAIN_1 PRO2434 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
94 CHAIN_2 PRO2434 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2436 (MATCH4)
95 CHAIN_1 PRO2436 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
96 CHAIN_2 PRO2436 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSGGSGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2559 (MATCH4)
97 CHAIN_1 PRO2559 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMCSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
98 CHAIN_2 PRO2559 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2560 (MATCH4)
99 CHAIN_1 PRO2560 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMCSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
100 CHAIN_2 PRO2560 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSGGSGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2562 (MATCH4)
101 CHAIN_1 PRO2562 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMCSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
102 CHAIN_2 PRO2562 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSGGSGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2563 (MATCH4)
103 CHAIN_1 PRO2563 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
104 CHAIN_2 PRO2563 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2564 (MATCH4)
105 CHAIN_1 PRO2564 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
106 CHAIN_2 PRO2564 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSGGSGGSGALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLG
PRO2565 (MATCH4)  
107 CHAIN_1 PRO2565 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
108 CHAIN_2 PRO2565 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGTGTKVTVLG
PRO2566 (MATCH4)
109 CHAIN_1 PRO2566 AFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGTGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKGLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSS
110 CHAIN_2 PRO2566 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGSGGSGGSGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2567 (MATCH4)
111 CHAIN_1 PRO2567 AFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGTGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKGLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSS
112 CHAIN_2 PRO2567 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2569 (MATCH4)
113 CHAIN_1 PRO2569 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
114 CHAIN_2 PRO2569 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSGGSGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2660 (MATCH4)
115 CHAIN_1 PRO2660 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESIYSSLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTDYTTSTHRNSFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSTTYYMCWVRQAPGKGLEWIGCTNTASSVRTYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDMGFADYALNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTLVTVSS
116 CHAIN_2 PRO2660 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESIYSSLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTDYTTSTHRNSFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSTTYYMCWVRQAPGKGLEWIGCTNTASSVRTYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDMGFADYALNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2741 (MATCH4)
117 CHAIN_1 PRO2741 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESIYSSLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTDYTTSTHRNSFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSTTYYMCWVRQAPGKGLEWIGCTNTASSVRTYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARDMGFADYALNLWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTQVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTQVTVSS
118 CHAIN_2 PRO2741 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESIYSSLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTDYTTSTHRNSFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSFSTTYYMCWVRQAPGKGLEWIGCTNTASSVRTYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARDMGFADYALNLWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2744 (MATCH4)
119 CHAIN_1 PRO2744 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMCSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTQVTVSSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKCLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTQVTVSS
120 CHAIN_2 PRO2744 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSAFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGCGTKLTVLGGGSGGSGGSGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2745 (MATCH4)
121 CHAIN_1 PRO2745 AFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGTGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKGLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTQVTVSSGGGSGGGSGGGSGQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTQVTVSS
122 CHAIN_2 PRO2745 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGSGGSGGSGGSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
PRO2746 (MATCH4)
123 CHAIN_1 PRO2746 AFELTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSRLAWYQQKPGQPPKLLIYDASDLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGYGGSSTTTFGTGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMNWVRQAPGKGLEWIGHINAGDIAYYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGAGGFSTGPFKLWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTQVTVSSGGGSGGGSGGGSGQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTQVTVSS
124 CHAIN_2 PRO2746 ALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLVESGGGRVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMGWVRQAPGKCLEYIGYISKIGTTYYASWAKGRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGSSSGGYLDDGFDPWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSALQMTQSPSSLSARVGDRVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGKPPKFLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGRDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYDSNNVENVFGCGTKVTVLGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLG
表6. 參考多特異性分子的範例。
SEQ ID NO: 描述 序列
範例4的構築體: 參考抗-MSLN 低 KDxCD3xhSA
PRO1872 (scMATCH3)
125  scDb-scFv DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWYQQKPGQPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGAFGCGTKLTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLAWIGASYASGPTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARGGWTGTSHSNIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVFSNNYLAWFQQKPGQSPKRLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGSYACSSADCYVFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWICWVRQAPGKCLEWVGCVFTGDGTTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARPVSVYYYGMDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESIGNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTDYGDSYIFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGISVSNDYYMCWVRQAPGKGLEWIGCISTYIGNTHYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAGYPGYRYAIDLWGQGTLVTVSS
表 7. 有關於本發明的其他序列。
SEQ ID NO: 描述 序列
連接子
126 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
127 連接子序列單元（Linker sequence unit） GGGGS
128 一般連接子序列（Generic linker sequence） (GmS)n, m選自2、3和4，n選自2、3、4、5和6
VH和VL序列
129 VH3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSFSANYYPCWVRQAPGKGLEWIG CIYGGSSDITYDANWTKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RSAWYSGWGGDLWGQGTLVTVSS
130 VH4 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVS GFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIG CTFVGSSDSTYYANWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA RHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS
131 Vkappa1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIY RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QSSYGNYGDFGTGTKVTVLG
Vlambda FR4 序列TFGCGTKLTVLG
132 Vlambda性腺基FR4_Sk17 FGTGTKVTVLG
133 Vlambda性腺基FR4_Sk12 FGGGTKLTVLG
134 Vlambda性腺基FR4_1 FGGGTQLIILG
135 Vlambda性腺基FR4_2 FGEGTELTVLG
136 Vlambda性腺基FR4_3 FGSGTKVTVLG
137 Vlambda性腺基FR4_4 FGGGTQLTVLG
138 Vlambda性腺基FR4_5 FGGGTQLTALG
139 Vlambda性腺基FR4_G141C FGCGTKVTVLG
在本申請的全文中，如果說明書的正文（例如表1至7）與序列表之間存在差異，則以說明書的正文為準。
應當理解，為了清楚起見，在個別實施例的上下文中描述的本發明的某些特徵也可以在單個實施例中組合提供。相反，為了簡潔起見，在單個實施例的上下文中描述的本發明的各種特徵也可以分開提供或以任何合適的子組合提供。與本發明有關的實施例的所有組合都具體地包含在本發明中，並且在本文中被揭露，就好像每個組合被各自地和明確地揭露一樣。此外，各種實施例的所有子組合及其要素也被本發明具體地包括並且在本文中被揭露，就好像每個這樣的子組合在本文中被各自地和明確地公開一樣。
本發明的範圍不受這裡描述的具體實施例的限制。實際上，從前面的描述中，除了本文所述之外，對本發明的各種修改對於本領域技術人員來說將變得顯而易見。該些修改旨在落入所附申請專利範圍內。
在相應專利法下可能的範圍內，本文引用的所有專利、申請、出版物、測試方法、文獻和其他材料均通過引用併入本文。
以下實施例說明了上述的本發明，但並不打算以任何方式限製本發明的範圍。相關領域技術人員已知的其他測試模型也可以確定要求保護的發明的有益效果。
範例
實施例1：抗MSLN分子的生成和藥效學（pharmacodynamic）的特徵：
在第一步中，應確認對MSLN具有中度至低度結合親和力的抗MSLN抗體片段。抗MSLN抗體片段應適用於多特異性抗體形式，尤其是MATCH3和MATCH4抗體形式。
本發明抗MSLN結合域的確認、選擇和產生
本發明的人類化scFv抗-MSLN結合域的確認、選擇、人類化和產生類似於專利申請PCT/EP2018/064630中描述的scFv抗-CD3結合域進行，該專利申請茲併入本文參考。
從幾種已確認的具有所需特性，特別是所需親和力的單株抗體，根據以下程序產生scFv分子。
人類化與表達：
通過在λ加帽的Vk1/VH3 Fv支架上植入CDR和任選植入特定兔框架殘基，將兔抗體人類化。每個scFv都設計有N-末端-VL-肽連接子-VH-C-末端的方向（肽連接子：(G 4S) 4）。
重組胺基酸序列是重新合成的，並且使用CHOgro瞬間轉染試劑盒（Mirus）在CHO-S細胞中進行scFv構築體的表達。在 37°C下表達5～7天（細胞生存力＜70%）後通過離心收成培養物，並通過蛋白L或A親和力層析術（affinity chromatography）從澄清的培養物上清液中純化蛋白，然後根據需要通過使用Superdex S200管柱進行粒徑篩析層析法（size-exclusion chromatography, SEC）的精純步驟（polishing step）。
品質控制：
對於製造材料的品質控制，使用標準分析方法，例如粒徑篩-高效液態層析儀（SE-HPLC）、UV280和十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。
粒徑篩-高效液態層析儀
粒徑篩-高效液態層析儀分析使樣品通過Shodex TM（Showa Denko, Cat.#: 554-1740）KW402.5-4F管柱（用於scFv分析）或Shodex TM（Showa Denko, Cat.#: 554-554- 1741）KW403–4F管柱（MATCH蛋白質分析），使用電泳緩衝溶液（Shodex TMKW402.5–4F：250 mM NaCl，50 mM NaOAc(Cat. #:A 1045)，pH 6.0；Shodex TMKW403–4F：35 mM NaH 2PO 4(Cat. #: A3905)、15 mM Na 2HPO 4(Cat. #:A1372)、300 mM NaCl，pH 6.0），流速為0.35 mL/min。洗滌出的蛋白質在λ=280 nm偵測吸光度。
SDS-PAGE
通過SDS-PAGE分析，將變性的蛋白質加載到MiniPROTEAN TGX TM預製凝膠（Bio-Rad Laboratories，Cat. #: 4569036）上並用考馬斯亮藍溶液（Coomassie brilliant blue solution）染色電泳的蛋白質，來評估蛋白質的一致性和降解程度。分子量標準：BioRad Precision TMPlus（Cat. #: 161-03/04）。
生產的scFv分子的製造數據總結在表8中。
抗間皮素scFv抗體PRO1783、PRO1925、PRO2306、PRO2309（低親和力）和PRO1922的藥效學特徵
評估人類化抗間皮素scFv抗體PRO1783的主要藥效學特性，包括測定表面電漿共振中與重組人和食蟹猴MSLN的結合動力學和親和力，在cELISA中評估與人和食蟹獼猴MSLN表達細胞系的質膜結合（plasma-membranous binding）以及在cELISA中評估MSLN/MUC16 的阻斷。此外，還評估了人類化抗MSLN scFvs PRO1922、PRO1925、PRO2306和PRO2309的主要藥效學特性，包括在表面電漿共振中測定與重組人類MSLN的結合動力學和親和力，評估cELISA中與表達人類MSLN的細胞系的質膜結合和評估cELISA中MSLN/MUC16的阻斷（PRO1922 和 PRO1925）。結果總結在表9至13中。
表面電漿共振中對人類和食蟹獼猴MSLN的親和力
通過在T200裝置（Biacore, GE Healthcare）上的表面電漿共振分析確定scFv PRO1783（源自單株抗體54-01-G02）對重組人類和食蟹獼猴MSLN的親和力。在該實驗中，使用標準胺偶聯程序將重組人類和食蟹獼猴MSLN（分別從Peprotech和Sino Biological購買）固定在CM5感測器晶片的不同流動池（flow cell）上。然後，將scFv抗體PRO1783以90至0.12 nM的濃度注射到流動池中5分鐘，並使蛋白質的解離進行12分鐘。解離速率常數(kd)和締合速率常數(ka)以及平衡解離常數(K D)以Biacore T200評估軟體（GE Healthcare）使用一對一的朗繆爾結合模型（Langmuir binding model）計算。scFv PRO1922和PRO1925的親和力如上所述通過表面電漿共振評估，但使用15～0.12 nM的濃度範圍。scFv PRO2306和PRO2309的親和力如上所述通過表面電漿共振評估，但使用90～0.35 nM的濃度範圍。
如表9所示，PRO1783以低的奈米莫耳範圍（K D=2.91 nM）的親和力結合於表面電漿共振中的重組人類MSLN。PRO1922、PRO1925、PRO2306和PRO2309在表面電漿共振中以高的次奈米莫耳範圍（sub-nanomolar range）內的親和力與重組人類MSLN結合。表面電漿共振測量還證明PRO1783結合於重組食蟹獼猴MSLN，儘管親和力降低（K D=30.06 nM，表 10）。
通過cELISA與表達MSLN的細胞系結合
與高水平表達人類MSLN的細胞結合（H226細胞系）
通過cELISA對H226癌細胞評估抗MSLN scFv抗體PRO1783與質膜MSLN的結合。簡而言之，將20'000個表達MSLN或HEK293T（MSLN 陰性）的NCI-H226細胞分配到平底組織培養物處理的96孔盤中。第二天，以每孔450 µl洗滌緩衝液（PBS，0.2% BSA）的溢流模式洗滌96孔盤3次，每個點加入PRO1783和抗MSLN參考抗體阿瑪西單抗的50 μl連續稀釋液，並將96孔盤在室溫（RT）溫和攪拌下反應（incubate）1.5小時。用450 µl洗滌緩衝液洗滌3次後，將50 µl HRP偶聯的蛋白質L或HRP偶聯的抗人類IgG抗體加入每個孔中。在室溫下在周轉混合器（nutating mixer）上反應1小時後，在添加 50 μl TMB（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺，KPL）之前，用每孔450 μl洗滌緩衝液將96孔盤洗滌3次。進展10分鐘後，通過在每孔中加入50 µl 1 M HCl來停止酶促反應，並使用690 nm作為參考波長在450 nm處讀取96孔盤。
評估PRO1783與表達高水平MSLN的H226細胞系的質膜結合的實驗結果顯示在表11中。發現PRO1783與H226細胞系結合的EC 50濃度為1.44 nM，其為與參考抗體阿瑪西單抗獲得的值相比，大約差6倍（比較相對EC 50值，表11）。發現PRO1925、PRO2306和PRO2309結合於H226細胞的EC 50值與PRO1783大致相同。發現PRO1922結合於H226細胞的EC 50值與阿瑪西單抗的EC 50值大致相同。當在cELISA中測試間皮素陰性HEK293T細胞時，未檢測到阿瑪西單抗、PRO1783、PRO1922、PRO1925、PRO2306和PRO2309 的結合（數據未顯示）。PRO1783、PRO1922、PRO1925、PRO2306、PRO2309和阿瑪西單抗在使用H226細胞系的cELISA中的濃度-反應曲線如第1圖所示。
與表達食蟹獼猴MSLN（CHO重組細胞系）的細胞結合
使用表達食蟹猴MSLN的重組CHO細胞系在cELISA中測試抗MSLN scFv抗體PRO1783對食蟹獼猴MSLN的交叉反應性。將表達食蟹獼猴MSLN或CHO-K1細胞（食蟹獼猴MSLN陰性）的20'000 CHO細胞分配到平底組織培養物處理的96孔盤中。第二天，洗滌96孔盤並如cELISA操作手冊中所述，使用H226細胞系添加PRO1783和抗MSLN參考抗體阿瑪西單抗的連續稀釋液。在室溫的溫和攪拌下反應1.5小時後，再次洗滌96孔盤並加入HRP偶聯的蛋白質L或HRP偶聯抗人類IgG抗體以分別檢測PRO1783和阿瑪西單抗的結合。在室溫下在周轉混合器上反應1小時後，洗滌96孔盤並將TMB添加到每個孔中。進展10分鐘後，通過在每孔中加入50 µl 1 M HCl來停止酶促反應，並使用690 nm作為參考波長在450 nm處讀取96孔盤。
使用表達食蟹獼猴MSLN的CHO細胞系的cELISA結果如表12所示。發現PRO1783與質膜食蟹獼猴MSLN結合的EC 50濃度為12 nM，這明顯低於參考抗體阿瑪西單抗（相對EC 50= 0.03）。另一方面，與質膜人類MSLN的結合相比，PRO1783的最大半結合濃度（half-maximal binding concentration）明顯增加，這與表面電漿共振分析的結果一致，表示PRO1783對重組食蟹獼猴MSLN蛋白的親和力降低。PRO1783和阿瑪西單抗在cELISA中的濃度-反應曲線使用表達食蟹獼猴MSLN的CHO細胞系顯示在第2圖中。當在cELISA中測試CHO-K1野生型細胞時，未檢測到阿瑪西單抗和PRO1783的結合（數據未顯示）。
通過競爭型ELISA（competition ELISA）中和MSLN/MUC16相互作用
在競爭型ELISA中評估了抗MSLN scFv抗體PRO1783、PRO1922和PRO1925阻斷MSLN/MUC16相互作用的效力。ELISA盤通過加入50 μl含有1 μg/ml MUC16 的PBS在4°C下過夜進行包覆。第二天，將ELISA盤以溢流模式洗滌3次，每孔450 µl洗滌緩衝液，並在室溫下在周轉混合器上向每孔添加300 µl阻斷緩衝液（blocking buffer）作用1小時。然後，將生物素化MSLN（biotinylated MSLN）在阻斷緩衝液中稀釋，以達到1 ng/ml的最終濃度。接下來，在含有生物素化MSLN的阻斷緩衝液中滴定PRO1783、PRO1922、PRO1925和阿瑪西單抗，並在室溫下在周轉混合器上反應1小時。 ELISA盤以溢流模式洗滌3次，每孔使用450 μl洗滌緩衝液，並將PRO1783、PRO1922、PRO1925和阿瑪西單抗滴定曲線的每個濃度各50 μl以2重複的方式添加到ELISA盤中。將ELISA盤在室溫溫和攪拌下反應1.5小時。每孔用450 µl洗滌緩衝液洗滌3次後，將50 µl的10 ng/ml 鏈黴親和素-多聚HRP40（streptavidin-polyHRP40）添加到ELISA盤的每個孔中。在室溫下反應1小時後，將ELISA盤用450 µl洗滌緩衝液洗滌3次，並在添加50 µl TMB後顯色5至10分鐘。最後，通過加入50 µl 1M HCl停止酶促反應，並在450 nm處使用690 nm作為參考波長讀取ELISA盤。
競爭型ELISA的結果顯示在表13中。發現PRO1783阻斷人類MSLN/MUC16相互作用的IC 50濃度為0.5 nM，如相對IC 50值所示，其低於參考抗體阿瑪西單抗。因此，PRO1783作為參考抗體阿瑪西單抗中和人類MSLN/MUC16相互作用的效力較低。PRO1922和PRO1925可以阻斷人類MSLN/MUC16相互作用，IC 50值顯著低於PRO1783。PRO1783、PRO1922、PRO1925和阿瑪西單抗在競爭型ELISA中的濃度-反應曲線如第3圖所示。
參考抗MSLN分子PRO1795的生成和藥效學特徵：
對MSLN具有高結合親和力的抗MSLN結合域PRO1795用作參考結合域。
類似於本發明的抗MSLN結合域和本文所述的抗CD3分子，進行人類化參考抗MSLN結合域PRO1795的鑑定、選擇、人類化和產生。
此外，評估PRO1795的主要藥效學特性，包括在表面電漿共振中測定與重組人類和食蟹獼猴MSLN的結合動力學和親和力，在cELISA中評估與人類和食蟹獼猴MSLN表達細胞系的質膜結合和在cELISA中評估阻斷MSLN/MUC16。結果總結在表9至13中。
表8. scFv的製造
蛋白質ID 描述 捕穫後效價 [mg/L] 純化 最終效價 [µg 蛋白/mL 表達] 純度粒徑篩-高效液態層析儀 [% 單體] nDSF: 散射開始（Scattering onset）[°C] nDSF: Tonset [°C] nDSF: Tm1 [°C]
PRO1783 54-01-G02-sc01 78.5 蛋白質 L / SEC 11.3 97.2 NA 59.0 65.2
PRO2197 54-01-G02-sc03 38.2 蛋白質 L 30.0 99.2 NA NA NA
PRO1925 54-32-A07-sc02 34.8 蛋白質 A 26.3 94.7 NA 53.7 58.5
PRO1922 54-21-H03-sc01 NA 蛋白質 L 22.2 98.7 64.9 60.8 69.9
PRO2306 54-32-A07-sc06 26.4 蛋白質 L 23.9 97.9 61.0 51.8 61.7
PRO2309 54-32-A07-sc09 16 蛋白質 L 14.7 90.3 63.7 53.4 62.3
*親和力捕穫後的純度；沒有進行粒徑篩-高效液態層析儀 SEC：粒徑篩析層析法 NA：不可用
表 9：表面電漿共振中抗MSLN scFv PRO1783、PRO1922、PRO1925、PRO2306、PRO2309和參考抗MSLN scFv PRO1795與人類MSLN的結合動力學和親和力。
      通過表面電漿共振之對人類MSLN的親和力
殖株ID 蛋白質ID 框架 移植策略(Grafting Strategy) k a k d K D 結合水平正規化為理論 Rmax
[M -1s -1] [s -1] [M] [%]
54-01-G02-sc01 PRO1783 VH3 CDR 7.80E+05 2.27E-03 2.91E-09 27.9
54-22-H03-sc01 PRO1795 VH3 CDR 5.68E+05 1.83E-04 3.21E-10 36.2
54-32-A07-sc02 PRO1925 VH3 CDR 1.63E+06 7.94E-04 4.88E-10 25.17
54-21-H03-sc01 PRO1922 VH3 CDR 7.35E+05 1.30E-04 1.77E-10 26.77
54-32-A07-sc06 PRO2306 VH3 CDR 2.72E+06 8.73E-04 3.22E-10 20.82
54-32-A07-sc09 PRO2309 VH3 CDR 3.11E+06 1.38E-03 4.44E-10 20.49
表10：表面電漿共振中抗MSLN scFv PRO1783和參考抗MSLN scFv PRO1795與食蟹獼猴MSLN的結合動力學和親和力
通過表面電漿共振的食蟹獼猴MSLN的親和力
殖株ID 蛋白質ID 框架 移植策略 k a k d K D 結合水平正規化為理論 Rmax
[M -1s -1] [s -1] [M] [%]
54-01-G02-sc01 PRO1783 VH3 CDR 1.72E+06 5.27E-02 3.06E-08 17.4
54-22-H03-sc01 PRO1795 VH3 CDR 1.02E+06 1.10E-03 1.08E-09 30.9
表11：抗MSLN scFv PRO1783、PRO1922、PRO1925、PRO2306、PRO2309和參考抗MSLN scFv PRO1795與表達高水平人類MSLN的H226細胞系的質膜結合。
        通過cELISA質膜結合於H226細胞
殖株ID 蛋白質ID 框架 移植策略 EC 50 [nM] 相對EC 50(EC 50, 阿瑪西單抗/ EC 50, scFv) 結合相對最大值（rel. Maximum binding ）(OD 450-690nm, scFv/ OD 450-690nm, 阿瑪西單抗)
54-01-G02-sc01 PRO1783 VH3 CDR 1.44 0.16 0.57
54-22-H03-sc01 PRO1795 VH3 CDR 0.25 0.98 0.71
54-21-H03-sc01 PRO1922 VH3 CDR 0.29 0.52 0.61
54-32-A07-sc02 PRO1925 VH3 CDR 1.01 0.11 0.58
PRO1925-S14R-T87R-T22K (54-32-A07-sc06) PRO2306 VH3 CDR 3.05 0.026 0.55
PRO1925-S14R-T87R-T22K-DIS (54-32-A07-sc09) PRO2309 VH3 CDR 1.13 0.07 0.78
表12：抗MSLN scFv PRO1783和參考抗MSLN scFv PRO1795與表達食蟹獼猴MSLN的CHO細胞系的質膜結合。
        與表達食蟹獼猴MSLN的CHO細胞系的質膜結合
殖株ID 蛋白質ID 框架 移植策略 EC 50 [nM] 相對EC 50(EC 50, 阿瑪西單抗/ EC 50, scFv) 結合相對最大值 (OD 450-690nm, scFv/ OD 450-690nm, 阿瑪西單抗)
54-01-G02-sc01 PRO1783 VH3 CDR 12.00 0.03 0.89
54-22-H03-sc01 PRO1795 VH3 CDR 0.76 0.7 0.81
表13：在競爭型ELISA中通過抗MSLN scFv PRO1783、PRO1922、PRO1925和參考抗MSLN scFv PRO1795阻斷人類MSLN/MUC16的相互作用。
在競爭型ELISA中阻斷MSLN/MUC16的相互作用
殖株ID 蛋白質ID 框架 移植策略 IC 50 [nM] rel. IC 50(IC 50, 阿瑪西單抗/ IC 50, scFv) 在最高樣品濃度的最大抑制力 [%]
54-01-G02-sc01 PRO1783 VH3 CDR 0.50 0.03 99.2
54-22-H03-sc01 PRO1795 VH3 CDR 0.02 0.87 99.0
54-21-H03-sc01 PRO1922 VH3 CDR 0.05 0.29 99.3
54-32-A07-sc02 PRO1925 VH3 CDR 0.14 0.11 99.2
抗MSLN兔IgG植株54-01-G02（低親和力抗MSLN scFv結構域PRO1783的前植株）的表位作圖：
通過cELISA與人類/小鼠MLSN變異體結合
為了精確定義選定的抗-MSLN兔IgG的結合區域，通過cELISA評估與用MSLN的胞外域（extracellular domain, ECD）的7種人類/小鼠變異體（V5標記）瞬間轉染的HEK293T細胞的結合水平（第4圖）。盤體為用每孔25,000個細胞塗佈到平底聚-D離胺酸處理的96孔盤。第二天，用相應的構築體轉染細胞並在37°C、5% CO 2下反應。24小時後，用450 µl洗滌緩衝液（PBS, 0.2% BSA）洗滌細胞，並在室溫（RT）溫和攪拌下加入樣品（250 ng/ml rIgG或抗V5標籤抗體連續稀釋）1.5小時。用450 μl洗滌緩衝液洗滌3次後，將50 μl HRP偶聯的山羊和兔IgG抗體加入每個孔中。在室溫下在周轉混合器上反應1小時後，在加入50 µl TMB（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺，KPL，Cat. No. 53-00-00）之前，用450 µl洗滌緩衝液對盤體的每個孔洗滌3次。進展10分鐘後，通過在每孔中加入50 µl 1 M HCl來停止酶促反應，並使用690 nm作為參考波長在450 nm處讀取96孔盤。計算相對於抗V5抗體結合的結合水平。與參考抗體（抗V5標籤）相比，rIgG與特定變異體的結合水平明顯降低將表示在人類MSLN片段中rIgG表位的定位被分別的小鼠序列取代。
當在cELISA中測試抗MSLN兔IgG選殖54-01-G02（低親和力抗MSLN scFv結構域PRO1783的前驅殖株）時，觀察到與嵌合人類/小鼠變異體V1（人類MSLN的ECD的最遠端區域）的結合降低（相對於V5參考抗體的結合降低至65%，表14），而54-01-G02與所有其他變異體的結合高於90%。這些數據建議，人類MSLN的V1區域代表了與54-01-G02結合的重要區域。然而，由於即使在不存在V1區域的情況下54-01-G02仍然可以與人類MSLN實質上結合，因此人類MSLN的ECD的其他區域也參與了54-01-G02的結合（表14）。關於兔IgG 5422-H03（高親和力抗MSLN scFv區域PRO1795的前殖株(predecessor clone)），在使用人類MSLN的ECD的嵌合人類/小鼠變異體的cELISA中無法確定結合區域（數據未顯示）。
表14：結合兔IgG植株54-01-G02的h/m MSLN變異體轉染的HEK293T細胞的總結。
cELISA轉染變異體-受測試的rIgG濃度：250 ng/mL
h/mMSLN-V1 h/mMSLN-V2 h/mMSLN-V3 h/mMSLN-V4 h/mMSLN-V5 h/mMSLN-V6 h/mMSLN-V7
植株ID 結合 (%)    [相對於抗V5抗體]
54-01-G02 65.0 93.7 98.8 93.3 101.0 101.3 104.0
範例2：抗CD3分子的生成和測試：
如專利申請PCT/EP2018/064630中所述進行人類化抗CD3結合域28-21-D09 sc04的確認、選擇、人類化以及生產和特徵，該專利申請通過引用併入本文。
範例3：抗hSA分子的產生和測試：
如專利申請EP19206959.9中所述進行人類化抗hSA結合域19-01-H04-sc03和23-13-A01-sc03的確認、選擇、人類化以及產生和特徵，在此引入作為參考。人類化抗hSA結合域19-04-A10-sc02（PRO2155）的確認、選擇、人類化以及產生和特徵類是似於專利申請EP19206959.9中描述的程序進行。抗-hSA scFv PRO2155的特徵簡要概述如下。
抗hSA scFvs 19-04-A10-sc02（PRO2155）的特徵
結合親和力和物種交叉反應性
所選結構域19-04-A10-sc02與人類血清白蛋白（hSA, Sigma-Aldrich A3782）的結合動力學（包括親和力）通過T200裝置（Biacore, Cytiva）在pH 7.4和pH值5.5兩者的表面電漿共振分析確定。hSA分子被共價固定到羧甲基葡聚糖表面（carboxymethylated dextran surface）（CM5感測器晶片，Biacore，Cytiva），並且將每個scFv分子的連續滴定作為分析物注射。在每個分析物注入週期後，感測器晶片上的每個流道都進行刷新（regenerate）（甘胺酸pH 2.0），並注入新濃度的scFv分子。使用多循環動力學測定法（multi-cycle kinetic assay）測量與hSA的結合動力學，稀釋於相關電泳緩衝液（running buffer）（PBS 0.05 % Tween-20或PBS 0.05 % Tween-20，pH值5.5）中。表觀解離速率常數（kd）和締合速率常數（ka），以及表觀解離平衡常數(KD)使用Biacore分析軟體（Biacore評估軟體版本3.2，Cytiva）使用一對一的朗繆爾結合模型和基於相對
Chi2監測適合品質。結合水平計算為將達到的最大穩定性結合時常規化為理論Rmax。
如上所述，還針對食蟹獼猴血清白蛋白（cSA，Molecular Innovations CYSA)和小鼠血清白蛋白（mSA，Sigma-Aldrich A3559）確定所選scFv的結合動力學，不同之處在於cSA或mSA被用來代替hSA。表15總結了在pH 5.5和pH 7.4下與hSA、mSA 和cSA的結合動力學。
表15：結合血清白蛋白的scFv分子PRO2155（結構域19-04-A10-sc02）對hSA、cSA和mSA的親和力測量的總結。
蛋白質 #ID 蛋白質描敘 檢測pH 抗原 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
PRO2155 19-04-A10-sc02 pH5.5 CSA 9.1E+05 2.1E-03 2.3E-09
PRO2155 19-04-A10-sc02 pH5.5 HSA 9.0E+05 3.0E-03 3.3E-09
PRO2155 19-04-A10-sc02 pH5.5 MSA 7.8E+04 2.0E-04 2.5E-09*
PRO2155 19-04-A10-sc02 pH7.4 CSA 5.8E+05 9.1E-04 1.6E-09
PRO2155 19-04-A10-sc02 pH7.4 HSA 5.5E+05 1.2E-03 2.2E-09
PRO2155 19-04-A10-sc02 pH7.4 MSA 3.2E+04 2.9E-04 9.0E-09*
*雙相結合通過1:1之適合的批量校正（bulk correction）進行校正，從而降低最大反應
生物物理特徵
HSA-結構域19-04-A10-sc02（PRO2155）和19-04-A10-sc06（sc02結構域具有VL-VH雙硫鍵，VL-T141C/VH-G51C，AHo編號；PRO2317)為期4週的穩定性研究，其中scFv在水性緩衝液（50 mM NaCiP、150 mM NaCl，pH 6.4）中以10 mg/ml配製，並在＜-80°C、4°C和40°C的溫度下儲存4個星期。通過整合研究過程中不同時間點的SE-HPLC高峰面積的積分來評估製劑中單體和低聚物的分數。表16總結了相對於d0的單體含量百分比和單體損失百分比。在研究過程中，通過 280 nm處的紫外-可見光光譜儀（UV-Vis）測量監測蛋白質濃度的變化。由於沒有觀察到任何樣品相對於d0的顯著蛋白質含量損失，因此未顯示數據。通過nDSF （NanoTemper）分析熱穩定性，確定展開的開始（Tonset）和展開的中點(Tm)。DSF結果如表16所示。
表16：19-04-A10-sc02和19-04-A10-sc06抗hSA結構域的4週穩定性研究。
蛋白質ID 描述 溫度. [°C] 濃度 [mg/mL] 單體含量[%] % 單體損失 Tm [°C]  
d0 d1 d7 d14 d28 d1 d7 d14 d28
PRO2155 19-04-A10-sc02 -80 10.4  99.4 NA NA NA 99.5 NA NA NA -0.1 75.3
4.0 99.4 99.4 NA NA 99.1 0.1 NA NA 0.3
40.0 99.4 98.6 NA NA 89.1 -0.8 NA NA 10.4
PRO2317 19-04-A10-sc06 40.0 10.5 99.2 98.8 98.7 98.6 98.4 0.4 0.6 0.7 0.9 78.4
NA: 未測量
範例4：本發明的多特異性構築體（biMSLN 低親和力x CD3 x hSA構築體）的產生和藥效學特徵：
分子結構
MATCH是由Numab發明的一種形式，其僅由通過不同連接子連接的可變結構域所組成，這些連接子僅允許匹配結構域對的特異性配對（Egan TJ等人，允許可變域片段模組化組裝的新型多特異性異二聚抗體形式(Novel multi-specific heterodimeric antibody format allowing modular assembly of variable domain fragments) MABS 9 (2017) 68-84)。這種格式特別適用於方便篩選抗原結合域的不同組合以獲得最佳協同性。MATCH可以從哺乳動物細胞中重組表達。對於純化，可以使用常規的親和層析步驟。
第5圖描述了MATCH分子的結構。MATCH4形式需要二聚體次單元由2個分裂可變域對的核心所組成，每個個別的次單元具有串聯定位的2個VL結構域或2個VH結構域，從而驅動2條蛋白質鏈的異二聚化。各自MATCH4鏈上形成二聚體的串聯可變域以反平行的N端-C端方向組織為它們的對應鏈。兩條鏈在哺乳動物細胞中共同表達為功能齊全的四特異性分子。可變域之間的傳統Gly-Ser連接子用於連接它們，如第5圖所示。通常，在MATCH分子中使用不同的連接子長度（參見表5中的MATCH分子序列列表）。此外，如第5圖所示，反平行MATCH4形式適合在核心域之一中引入雙硫鍵。對應的MATCH3形式（未顯示）的構建和組織方式類似，只是僅連接一個scFv結合域到2個分裂可變域對的核心，而不是像MATCH4中的2個scFv結合域。
類似於MATCH4和MATCH3形式，scMATCH3形式僅由通過不同連接子連接的可變域所組成，如第5圖（右）所示。然而，在這種形式中，分裂可變域位於單個肽鏈（single peptide chain, sc）上，肽鏈組裝成功能齊全的三特異性分子，如第5圖（右）所示。作為MATCH4和MATCH3形式，scMATCH3分子也可以在哺乳動物細胞中重組表達，並且對於它們的純化，可以使用常規的親和層析步驟。
將兩到三種用λ加帽的Fv支架人類化的兔抗體、根據本發明的抗平行四特異性MATCH4分子以及僅具有一種高親和力MSLN-BD的參考三特異性scMATCH3分子組合，被設計為總結在表17中。
製造
使用CHOgro瞬間轉染試劑盒（transient transfection kit）（Mirus）在CHO-S細胞中進行MATCH構築體的表達。在 37°C 下通過離心收集表達 5～7 天（細胞生存力 ＜ 70%）後的培養物，通過蛋白 L 或 A 親和層析從澄清的培養物上清液中純化蛋白，如果需要，通過粒徑篩析層析法 (SEC) 使用 Superdex S200 管柱在 50 mM 磷酸鹽 - 檸檬酸鹽緩衝液中，在 pH 6.5 下含有 300 mM 蔗糖。通過SE-HPLC 分析評估 SEC 級分（fraction）的單體含量，並合併單體含量 ＞95% 的級分。對於製造材料的質量控制，使用了標準分析方法，例如 SE-HPLC、UV280 和 SDS-PAGE。
生產的分子的製造細節總結在表18中。
多特異性抗體的藥效學特徵
以下部分描述了示例性多特異性分子的特徵，其對於人類MSLN是單價或二價的，對於人類CD3ε是單價的並且對於人類血清白蛋白(hSA)是單價的。在 表面電漿共振中測試二價抗MSLN 抗體PRO2000、PRO2100、PRO2562、PRO2566、PRO2567 和 PRO2660（即 biMSLNxCD3xhSA）和單價抗MSLN抗體PRO1872（即 MSLN 低 KDxCD3xhSA），以評估它們的結合動力學以及在表面電漿共振中對於重組人類MSLN及人類CD3ε的親和力。
表面電漿共振中與人類MSLN的親和力
多特異性抗MSLN抗體對重組人類MSLN的親和力通過T200裝置（Biacore，GE Healthcare）上的表面電漿共振分析確定。在該實驗中，如上所述，將重組人類MSLN（購自Peprotech）固定在 CM5 感測器晶片上。將多特異性抗體注射到流動池（flow cell）中，並如上所述計算結合動力學以及平衡解離常數（equilibrium dissociation constant, K D）。
在沒有親合力的情況下，多特異性抗MSLN抗體對重組人類MSLN的親和力通過T200裝置（Biacore，GE Healthcare）上的表面電漿共振分析來確定。在該實驗中，如上所述，將專有的抗框架兔IgG （PRO2679） 固定在 CM5 感測器晶片上。通過 20 秒的注射，在各自的流動池中捕獲多特異性抗體。隨後，將重組人類 MSLN（購自 Peprotech）注射到流動池中，並如上所述計算結合動力學以及平衡解離常數 (K D)。
如表19所示，單價抗MSLN抗體PRO1872以次奈米莫耳範圍（K D= 0.187　nM）的結合親和力結合表面電漿共振中的重組人類MSLN。對於相應的抗 MSLN scFv 抗體 PRO1795（K D= 0.321 nM，結構域 54-22-H03-sc01，數據未顯示），發現對人類 MSLN 的類似結合親和力。二價抗 MSLN 抗體 PRO2000 在低奈米莫耳範圍 (K D= 1.06 nM) 顯示對重組人類 MSLN 的結合親和力，這優於針對相應抗 MSLN scFv 抗體 PRO1783（K D= 2.91 nM，結構域 54 -01-G02-sc01，表 9）發現的結合親和力。 PRO2562、PRO2566 和 PRO2567 在測定中顯示出與人類MSLN 非常相似的親和力，K D值在 1.39 和 1.52 nM 之間的低nM範圍內。
表面電漿共振中對人類CD3ε的親和力
多特異性抗-MSLN抗體對重組人類CD3ε的親和力通過T200裝置（Biacore，GE Healthcare）上的表面電漿共振分析確定。在該實驗中，人類重組CD3ε蛋白（Sino Biological）通過胺偶聯（amine-coupling）固定在 CM5 感測器晶片（GE Healthcare）上。將在 HBS-T+緩衝液（10 mM HEPES、150 mM NaCl 和 0.05% Tween 20，pH 7.4）中連續稀釋的抗 MSLN 多特異性抗體以 30 μl/min 的流速注射到流動池中，持續 5 分鐘。使抗體從 CM5 晶片上的 CD3ε解離進行 12 分鐘。在每個注射循環後，通過注射一次10 mM甘胺酸 HCl，pH 2 來再生表面。使用一對一的朗繆爾結合模型並基於Chi2和U值（曲線擬合品質的測量）監測，以Biacore分析軟體（BIAevaluation, GE Healthcare）計算表觀解離速率常數（k d）和締合速率常數（k a）以及表觀解離平衡常數（K D）。由於使用一對一朗繆爾結合模型的擬合顯示出曲線擬合的次優品質，因此另外使用二狀態反應模型（two-state reaction model）計算 K D。該模型描述了分析物與固定配體的1:1 結合，然後藉由構型改變使複合物穩定。
如表20所示，抗MSLN抗體PRO1872和PRO2000對於CD3ε都是單價的並且具有相同的抗CD3結構域（28-21-D09-sc04），以奈米莫耳範圍中相似的結合親和力（PRO1872，K D= 12.1 nM；PRO2000，K D= 20.0 nM）在表面電漿共振中與重組人類CD3ε結合。 PRO2562、PRO2566、PRO2567 和 PRO2660 對重組人 類CD3ε 顯示出更好的親和力，K D值在 2.97 nM和 6.45 nM 之間的低 nM 範圍內。
表面電漿共振中 pH 5.5 時對人類血清白蛋白的親和力
與人類血清白蛋白（hSA，Sigma Aldrich，cat.  A3782）的結合動力學通過 T200 裝置（Biacore，GE Healthcare）上的表面電漿共振進行評估。 HSA 通過胺偶聯固定在感測器晶片（CM5 感測器晶片，GE Healthcare）上。將在 pH 5.5 的電泳緩衝液 （PBS-Tween20） 中稀釋的範圍為 0.7 至 180 nM 的抗 MSLN 多特異性抗體的連續稀釋液注射到流動池中 5 分鐘。解離時間設置為12分鐘。表觀解離速率常數（k d）和締合速率常數（k a）以及表觀解離平衡常數（K D） 使用如上所述的一對一朗繆爾結合模型計算。
如表21所示，抗MSLN抗體PRO1872（抗hSA結構域：23-13-A01-sc02）以次奈米莫耳範圍（KD = 0.175nM）中的結合親和力結合於表面電漿共振中的重組hSA。 PRO2562、PRO2566、PRO2567 和 PRO2660 對重組 hSA 的親和力稍低，K D值在 5.71 和 8.80 nM 之間的低 nM 範圍內。
表 17：MATCH4 分子和參考 scMATCH3 分子的結構。
PRO ID 形式 結構域1 特異性 1 結構域2 特異性 2 結構域3 特異性3 結構域4 特異性4
PRO2000 MATCH4 54-01-G02-sc01 MSLN 23-13-A01-sc02, VL-G141C/VH-G51C* hSA 28-21-D09-sc04 CD3 54-01-G02-sc01 MSLN
PRO2100 MATCH4 54-01-G02-sc01 N66A MSLN 23-13-A01-sc02, VL-G141C/VH-G51C* hSA 28-21-D09-sc04 CD3 54-01-G02-sc01 N66A MSLN
PRO2323 MATCH4 54-32-A07-sc06 MSLN 19-04-A10-sc06 hSA 28-21-D09-sc04 CD3 54-32-A07-sc06 MSLN
PRO2417 MATCH4 54-32-A07-sc06 MSLN 19-04-A10-sc06 hSA 28-21-D09-sc04 CD3 54-32-A07-sc06 MSLN
PRO2424 MATCH4 54-32-A07-sc06 MSLN 19-04-A10-sc06, VL-S95C* hSA 28-21-D09-sc04, VH-N94C* CD3 54-32-A07-sc06 MSLN
PRO2434 MATCH4 54-32-A07-sc06 MSLN 19-04-A10-sc06 hSA 28-21-D09-sc04 CD3 54-32-A07-sc06 MSLN
PRO2436 MATCH4 54-32-A07-sc06 MSLN 19-04-A10-sc06 hSA 28-21-D09-sc04 CD3 54-32-A07-sc06 MSLN
PRO2559 MATCH4 54-32-A07-sc06 MSLN 19-04-A10-sc06, VL-S95C* hSA 28-21-D09-sc04, VH-N94C* CD3 54-32-A07-sc06 MSLN
PRO2560 MATCH4 54-32-A07-sc06 MSLN 19-04-A10-sc06, VL-S95C* hSA 28-21-D09-sc04, VH-N94C* CD3 54-32-A07-sc06 MSLN
PRO2562 MATCH4 54-32-A07-sc09 MSLN 19-04-A10-sc06, VL-S95C* hSA 28-21-D09-sc04, VH-N94C* CD3 54-32-A07-sc09 MSLN
PRO2563 MATCH4 54-32-A07-sc09 MSLN 19-04-A10-sc06 hSA 28-21-D09-sc04 CD3 54-32-A07-sc09 MSLN
PRO2564 MATCH4 28-21-D09-sc04 CD3 19-04-A10-sc06 hSA 54-32-A07-sc06 MSLN 54-32-A07-sc09 MSLN
PRO2565 MATCH4 28-21-D09-sc04 CD3 19-04-A10-sc06 hSA 54-32-A07-sc06 MSLN 54-32-A07-sc09 MSLN
PRO2566 MATCH4 54-32-A07-sc09 MSLN 54-32-A07-sc09 MSLN 28-21-D09-sc04 CD3 19-04-A10-sc02 hSA
PRO2567 MATCH4 54-32-A07-sc09 MSLN 54-32-A07-sc09 MSLN 28-21-D09-sc04 CD3 19-04-A10-sc02 hSA
PRO2569 MATCH4 54-32-A07-sc09 MSLN 19-04-A10-sc06 hSA 28-21-D09-sc04 CD3 54-32-A07-sc09 MSLN
PRO2660 MATCH4 54-21-H03-sc01 MSLN 19-04-A10-sc06 hSA 28-21-D09-sc04 CD3 54-21-H03-sc01 MSLN
PRO2741 MATCH4 54-21-H03-sc01, VH-L12R, V103T, L144Q* MSLN 19-04-A10-sc06, VH-L12R, V103T, L144Q* hSA 28-21-D09-sc04, VH-L12R, L144Q* CD3 54-21-H03-sc01, VH-L12R, V103T, L144Q* MSLN
PRO2744 MATCH4 54-32-A07-sc09, VH-L12R, V103T, L144Q* MSLN 19-04-A10-sc06, VL-S95C/VH-L12R, V103T, L144Q * hSA 28-21-D09-sc04, VH- L12R, N94C, L144Q * CD3 54-32-A07-sc09, VH-L12R, V103T, L144Q* MSLN
PRO2745 MATCH4 54-32-A07-sc09, VH-L12R, V103T, L144Q* MSLN 54-32-A07-sc09, VH-L12R, V103T, L144Q* MSLN 28-21-D09-sc04, VH-L12R, L144Q* CD3 19-04-A10-sc02, VH-L12R, V103T, L144Q* hSA
PRO2746 MATCH4 54-32-A07-sc09, VH-L12R, V103T, L144Q* MSLN 54-32-A07-sc09, VH-L12R, V103T, L144Q* MSLN 28-21-D09-sc04, VH-L12R, L144Q* CD3 19-04-A10-sc02, VH-L12R, V103T, L144Q* hSA
PRO1872 scMATCH3 28-21-D09-sc04 CD3 23-13-A01-sc02, VL-G141C/VH-G51C* hSA 54-22-H03-sc01 MSLN NA NA
*AHo標號
表18：MATCH4分子的製造
蛋白質ID   滴定後捕獲 [mg/L] 精純步驟 最後滴定 [mg/L] 純度 SE-HPLC [% 單體]
PRO2000   21.3 SEC 10.7 97.9
PRO2100   17.6 NA 15.6 97.1
PRO2562   13.0   5.9 96.8  
PRO2660   28.8 SEC 16.0 98.1  
PRO2566   14.0 SEC 2.5 95.9  
PRO2567   22.6 SEC 3.5 97.4  
PRO2741   23.4 SEC 6.0 97.8  
PRO2745   9.4 SEC 1.2 97.4  
PRO2746   10.7 SEC 2.6 98.3  
PRO2563   22.6 SEC 7.1 96.5  
PRO2564   17.8 SEC 6.0 97.8  
PRO2565   21.8 SEC 7.0 96.9  
PRO2569   22.4 SEC 4.9 97.4  
PRO2323   33.4 SEC 5.8 99.1  
PRO2434   27.8 SEC 5.2 98.6  
PRO2436   17.5 SEC 1.3 96.8  
PRO2424   22.2 SEC 11.5 99.1  
PRO2559   32.2 SEC 9.0 97.9  
PRO2560   18.8 SEC 6.2 96.8  
SEC: 粒徑篩析層析法 NA: 不可用
表19：表面電漿共振中示例性抗MSLN多特異性抗體對人類MSLN的結合動力學和親和力。
      藉由表面電漿共振之對人類MSLN的親和力
      k a k d K D 常規化至理論Rmax的結合水平
PRO ID 形式 抗-MSLN 結構域 [M -1s -1] [s -1] [M] [%]
PRO1872 scMATCH3 54-22-H03-sc01 2.65E+05 4.96E-05 1.87E-10 25.3
PRO2000 MATCH4 54-01-G02-sc01 3.98E+05 4.21E-04 1.06E-09 10.5
PRO2562 MATCH4 54-32-A07-sc09 4.10E+05 5.71E-04 1.39E-09 38.8
PRO2566 MATCH4 54-32-A07-sc09 4.00E+05 6.08E-04 1.52E-09 39.2
PRO2567 MATCH4 54-32-A07-sc09 4.11E+05 5.78E-04 1.41E-09 39.8
PRO2660 MATCH4 54-21-H03-sc01 未測量
表 20：SPR 中示例性抗 MSLN 多特異性抗體對人 CD3ε 的結合動力學和親和力
      藉由表面電漿共振之對人類CD3ε的親和力
      k a* k d* K D 常規化至理論Rmax的結合水平  
PRO ID 形式 抗-MSLN 結構域 [M -1s -1] [s -1] [M] [%]  
PRO1872 scMATCH3 54-22-H03-sc01 2.93 E+05 5.08 E-03 1.21E-08 28.7  
PRO2000 MATCH4 54-01-G02-sc01 1.17 E+05 3.91 E-03 2.00E-08 27.6  
PRO2562 MATCH4 54-32-A07-sc09     6.45E-09    
PRO2566 MATCH4 54-32-A07-sc09     2.97E-09    
PRO2567 MATCH4 54-32-A07-sc09     4.78E-09    
PRO2660 MATCH4 54-21-H03-sc01     5.71E-09    
*ka 和 kd 是指二狀態擬合模型（two-state fitting model）中的 ka1 和 kd1，為了清楚起見省略k a2 和 k d2及 K D1 和 K D2
表21：示例性抗MSLN多特異性抗體在SPR中在pH 5.5時與hSA的結合動力學和親和力。
      藉由表面電漿共振之在pH5.5對hSA的親和力
      k a k d K D 常規化至理論Rmax的結合水平
PRO ID 形式 抗-MSLN 結構域 [M -1s -1] [s -1] [M] [%]
PRO1872 scMATCH3 54-22-H03-sc01 3.66E+05 6.39E-05 1.75E-10 71.2
PRO2562 MATCH4 54-32-A07-sc09 2.31E+05 1.49E-03 6.45E-09 57.98
PRO2566 MATCH4 54-32-A07-sc09 5.79E+05 3.99E-03 6.89E-09 58.18
PRO2567 MATCH4 54-32-A07-sc09 5.15E+05 4.53E-03 8.80E-09 58.24
PRO2660 MATCH4 54-21-H03-sc01 2.80E+05 1.60E-03 5.71E-09 51.78
PRO2000 MATCH4 54-01-G02-sc01 未測量
示例性 MATCH4 分子的生物物理特徵
nDSF 的儲存穩定性和熔化溫度
對 MATCH4 分子進行了 28 天穩定性研究，其中將分子以 1 mg/mL 的濃度配製在水性緩衝液（50 mM 磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液和 300 mM 蔗糖，pH 6.5）中，並儲存在 ＜ -80 °C、4 °C 和 40 °C 持續 28 天。通過整合研究過程中不同時間點的 SE-HPLC 波峰面積來評估製劑中單體和低聚物的部分（fraction）。表 22 總結相對於第 0 天的單體含量百分比和單體損失百分比。在研究過程中通過紫外-可見光光譜儀的測量在280 nm監測蛋白質濃度的變化，並顯示在表 23 中。通過 nDSF 分析熱穩定性（NanoTemper）確定展開的開始（Tonset）、展開的中點（Tm）和散射開始溫度。包括二重複/三重複測量的標準偏差（SD）的 Tm 結果顯示在表 24 中。
所有四種 MATCH4 分子都表現出良好的穩定性，並且在反應 28 天後僅表現出輕微的單體含量損失或蛋白質含量損失。在 -80°C 和 4°C 的溫度下以及在SE-HPLC/UV測量之前對第 28/-80°C 天的樣品進行重複凍融 (5x) 後，單體含量沒有顯著變化。
表22：MATCH4 分子在 1 mg/mL 時的儲存穩定性評估（28 天），通過 SE-HPLC 的單體含量變化。
蛋白質 ID   溫度 [°C] 濃度 [mg/mL] 單體含量 [%]   % 單體含量損失
        d0 d1 d7 d14 d21 d28* d1 d7 d14 d21 d28*
PRO2562   -80 1.00 96.78 NA NA NA NA 97.16 NA NA NA NA -0.39
PRO2562   4 1.00 96.78 96.90 97.04 NA 97.23 97.00 -0.12 -0.27 NA -0.46 -0.23
PRO2562   40 1.00 96.78 96.61 96.69 NA 96.10 95.42 0.18 0.09 NA 0.70 1.41
PRO2566   -80 0.95 95.33 NA NA NA NA 96.54 NA NA NA NA -1.27
PRO2566   4 0.95 95.33 95.62 95.69 NA 96.34 96.17 -0.30 -0.38 NA -1.06 -0.88
PRO2566   40 0.95 95.33 95.29 93.60 NA 91.41 89.37 0.04 1.81 NA 4.11 6.25
PRO2567   -80 1.01 97.24 NA NA NA NA 98.01 NA NA NA NA -0.79
PRO2567   4 1.01 97.24 97.45 97.61 NA 97.87 97.82 -0.22 -0.38 NA -0.65 -0.60
PRO2567   40 1.01 97.24 97.09 96.16 NA 95.18 94.04 0.15 1.11 NA 2.12 3.29
PRO2660   -80 0.93 98.89 NA NA NA NA 99.21 NA NA NA NA -0.32
PRO2660   4 0.93 98.89 99.16 99.15 99.02 NA 98.68 -0.27 -0.26 -0.13 NA 0.21
PRO2660   40 0.93 98.89 99.25 97.57 97.15 NA 95.90 -0.36 1.33 1.76 NA 3.02
* 測量前在 -80°C 下儲存 28 天的樣品進行了 5 次重複冷凍/解凍循環，因為40°C 樣品中的低分子量物質高峰無法反摺積（deconvoluted）（肩部），故尚未積分。
表 23：MATCH4 分子在 1 mg/mL（28天）下的儲存穩定性評估，通過 UV（280nm）改變蛋白質含量。
蛋白質ID 溫度 [°C] 蛋白質濃度 [mg/mL] % 含量損失
d0 d1 d7 d14 d21 d28 d1 d7 d14 d21 d28
PRO2562 -80 1.00 NA NA NA NA 0.97 NA NA NA NA 2.20
PRO2562 4 1.00 NA 0.93 NA 0.94 1.00 NA 6.60 NA 6.10 0.10
PRO2562 40 1.00 NA 0.96 NA 0.98 1.05 NA 3.50 NA 2.10 -5.10
PRO2566 -80 0.95 NA NA NA NA 0.95 NA NA NA NA -0.50
PRO2566 4 0.95 NA 0.89 NA 0.92 0.92 NA 5.60 NA 3.00 2.40
PRO2566 40 0.95 NA 0.90 NA 0.94 0.97 NA 4.60 NA 0.70 -2.00
PRO2567 -80 1.01 NA NA NA NA 0.98 NA NA NA NA 2.40
PRO2567 4 1.01 NA 0.95 NA 0.94 1.01 NA 6.10 NA 6.40 0.20
PRO2567 40 1.01 NA 0.93 NA 0.94 1.03 NA 7.50 NA 6.80 -2.10
PRO2660 -80 0.93 NA NA NA NA 0.85 NA NA NA NA 8.69
PRO2660 4 0.93 0.93 1.08 0.96 NA 1.05 0.12 -16.32 -3.40 NA -12.68
PRO2660 40 0.93 0.95 0.95 0.96 NA 0.92 -1.94 -2.88 -3.17 NA 1.12
表24：MATCH4分子的nDSF
蛋白質ID 散射開始 [°C] SD (散射) Tonset [°C] SD (Tonset) Tm1 [°C] SD (Tm1) Tm2 [°C] SD (Tm2)
PRO2562 63.5 0.1 51.0 0.2 61.8 0.0 - -
PRO2660 65.6 0.1 48.8 1.1 63.3 0.8 70.2 0.5
PRO2566 62.5 0.1 52.9 0.3 59.9 0.1 - -
PRO2567 62.2 0.1 52.9 0.2 59.9 0.0 - -
範例5：測定標靶細胞系的細胞表面上的間皮素密度：
介紹
一個目的是比較單價或二價多特異性分子結合間皮素的能力，以靶向在其細胞表面表現出不同水平之間皮素的細胞系。因此，對不同細胞系的質膜間皮素表達進行了量化。
方法
使用量子簡單細胞抗人類IgG試劑盒（Quantum Simply Cellular anti-human IgG kit）（Bangs Laboratories）通過FC（流式細胞儀）評估表達不同水平的間皮素的癌細胞系和健康間皮組織上的抗體結合能力（Antibody Binding Capacity, ABC）。簡而言之，按照製造商的說明，使用 Lightning-Link 快速偶聯試劑盒 (Expedeon) 將 1 mg 抗間皮素抗體（7D9.3，Genentech）與 Alexa Fluor 488 偶聯。受體密度值報告為抗體結合能力。 抗體結合能力值源自使用量子簡單細胞珠子抗人類 IgG（Quantum Simply Cellular beads anti-human IgG） (Bangs Laboratories, Inc.) 生成的標準曲線。這些珠子由4群微球所體組成，每個微球體都耦聯於每個珠子之不同數量的抗人類 IgG 分子。作為第一步，在結合位點數量最多的珠子群上測試增加濃度的 Alexa Fluor 488 標記的抗間皮素抗體，以確定飽和抗體濃度，如製造商的操作手冊所述，在量化過程中使用該濃度。然後，根據製造商的說明，用 Alexa Fluor 488 標記的抗間皮素抗體的相應飽和濃度對珠子和測試樣品進行染色，並在與測試樣品相同的光電倍增管設置下在同一天運行。為了計算 抗體結合能力 值，使用 NovoExpress 軟體（ACEA Biosciences）分析了4個 量子簡單細胞珠子群的幾何平均值。QuickCal v. 2.3基於Excel電子表格的分析模板（Bangs Laboratories, Inc）用於通過線性回歸創建標準曲線。 R平方值通常≥0.99。 Alexa Fluor 488-抗間皮素抗體標記樣品的抗體結合能力值是從標準曲線中插入的。
結果
使用 Quantum Simply Cellular珠子測定3種癌細胞系（H226、H292和HPAC）和一種源自健康間皮組織的細胞系（MeT-5A；(ATCC® CRL-9444™)；供應商：ATCC）的質膜上的間皮素密度。獲得的數據呈現在表25中。H226細胞顯示出最高的表達水平，其次是HPAC細胞系，其表現出低4倍的表達。在 H292 和 MeT-5A 細胞系上發現可比較的間皮素表達水平，這比在 H226 細胞的細胞表面上觀察到的表達低 8 到 10 倍。
表25：癌細胞上的間皮素密度表示為每個細胞系的抗體結合能力（ABC）的平均值並且通過流式細胞儀定量。
細胞系 間皮素密度 (抗體結合能力)
H226 41858
H292 4660
HPAC 12825
Met-5A 5503
範例 6：細胞毒性測定（T 細胞驅動的標靶細胞耗竭）：
介紹
為了評估與MSLN 低 KDxCD3xhSA相比之雙MSLN 高 KDxCD3xhSA（biMSLN highKDxCD3xhSA）選擇性地引導T細胞殺死表達間皮素的細胞的能力，使用在其細胞表面上表達不同間皮素密度的細胞系在人類周邊血單核細胞（PBMC）存在下進行細胞毒性測定。此外，在該測定中還評估了可溶性間皮素(sMSLN) 的存在對分子效力的影響。 MSLN 低 KDxCD3xhSA 三特異性分子同時與癌細胞上的間皮素和 CD3ε 結合，導致 T 細胞上 CD3ε 的交聯，並活化觸發T細胞活化（CD69 上調、細胞激素分泌）和細胞毒性顆粒釋放的傳訊級聯反應（signaling cascade），最終導致標靶細胞殺傷。
方法
血液細胞分離
根據製造商的說明，使用淋巴細胞分離培養基 Lymphoprep （Stemcell Technologies）從健康志願者的新鮮血液中分離人類周邊血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。在這組實驗中，使用了來自三個不同供體（供體#1、供體#2 和供體#3）的血液。個別供體的血液特性差異很大，特別是其中包含的 CD8+T 細胞的數量和反應性。因此，這些血液來源的 CD8+ T 細胞樣本的殺傷效力在很大範圍內變化。如本揭露的範例中所觀察到的，這導致在存在相同標靶細胞的情況下使用相同測試分子產生不同的殺傷效力和CD8+T細胞活化效力。
簡而言之，用人類周邊血單核細胞分離緩衝液（PBS，2%FCS，2mM EDTA）將血液以1:2稀釋並施加到含有推薦量的Lymphoprep培養基的Leucosep管中。 LeucoSep 管在室溫下以 800 x g 離心 30 分鐘，無需剎車。然後，收集含有周邊血單核細胞 的細胞層並用人類周邊血單核細胞分離緩衝液洗滌兩次，並在室溫下使用紅血球細胞裂解緩衝液裂解紅血球細胞 5 分鐘。然後用它們各自的分離緩衝液洗滌分離的人類細胞一次，並用測定培養基（RPMI-1640，10% FCS）洗滌一次。去除血小板後，將分離的周邊血單核細胞以每毫升 3x10 6個活細胞的密度重新懸浮在測定培養基中。
基於流式細胞儀的體外細胞毒性測定（FC測定）和CD8+ T細胞活化：
3種癌細胞系、H226細胞（高間皮素密度）、HPAC細胞（中等間皮素密度）和H292 細胞（低間皮素密度）以及源自健康間皮組織的MeT-5A細胞系（低間皮素密度）用作標靶細胞。將先前用PKH67標記並在75 µl測定培養基（RPMI-1640，10% FCS）中稀釋的5,000個活標靶細胞添加到96孔盤中。適用時，使用含有50、100或500 ng/ml可溶性間皮素的測定緩衝液。將25 µl的6倍濃縮的測試蛋白質在測定培養基中稀釋並加入適當的孔中。將在50 µl測定培養基中稀釋的150'000個活效應細胞（PBMC）添加到每個孔中（E:T比例為30:1），並在室溫下在周轉混合器上混合96孔盤，然後在37°C、5 %二氧化碳反應。40個小時之後，細胞被胰蛋白酶消化，重新懸浮在染色緩衝液（PBS，2% BCS，2 mM EDTA）中並轉移到非結合盤（non-binding plate）中。
細胞針對不同的標記物進行染色，例如CD69、CD8、CD4、CD11c和Annexin-V。對於分析，重點是凋亡和死亡的標靶細胞以及活化的CD8+ T細胞。通過綠色螢光（PKH67）識別標靶細胞，並通過Annexin-V APC 分析它們的活力。效應細胞（CD8+ 細胞）通過檢測其表面上的CD8（抗CD8 PerCP-Cy5.5）來確定。CD8+ T細胞的活化最終通過定量CD69表達（抗CD69 PE）來檢測。CD4用於區分CD8+和CD4+ T細胞。CD11c用於染色單核細胞和樹突細胞並改善標靶細胞的圈選（gating）。對於除Annexin-V外的所有標記物，細胞在室溫下溫和攪拌反應30分鐘。細胞用染色緩衝液洗滌一次，用Annexin結合緩衝液洗滌一次，在室溫下攪拌30分鐘進行Annexin-V染色。細胞用Annexin-V結合緩衝液洗滌一次，並在Novocyte流式細胞儀上進行流式細胞儀分析。
根據以下等式計算特定標靶細胞裂解（lysis）的百分比：
Figure 02_image001
活化的CD8+ T細胞的百分比對應於CD69+ CD8+ T細胞的比例。
基於乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）釋放的細胞毒性：
乳酸脫氫酶從胞質液（cytosol）的釋放是細胞死亡的指標。建立比色乳酸脫氫酶釋放試驗（colorimetric LDH-release assay）（Roche）來檢查由感興趣的先導分子（lead molecule）調節的細胞毒性。2種癌細胞系H226細胞（高間皮素密度）和OVCAR-3細胞（中等間皮素密度）以及源自健康間皮組織（低間皮素密度）的 MeT-5A細胞系用作標靶細胞。將10,000個活標靶細胞添加到96孔盤中以黏附過夜。次日將300,000個活的效應細胞（PBMC）添加到含有hSA的緩衝液中的每個孔中（E:T 比例為30:1）。圖中所示的各個分子從50 nM開始以5倍稀釋步驟添加。在適用的情況下，將最終濃度為0 ng/mL sMSLN、50 ng/mL sMSLN 和500 ng/mL sMSLN 加到孔中。40小時後，取出上清液進行LDH釋放分析，並對細胞進行染色以獲得T細胞標記物，包括活化。
特異性裂解的百分比計算如下： 1. 從所有OD中減去培養基背景的平均OD值 2. 計算細胞毒性百分比（%）=（(樣品-自發殺傷) / (最大殺傷-自發殺傷)）* 100 注意：自發殺傷：未處理的效應+標靶細胞（未經處理）的平均OD值； 注意：最大殺傷：用 1% Triton處理40小時的目標細胞的平均OD值。
結果
使用基於流式細胞儀的細胞毒性測定來評估MATCH分子PRO2000（MATCH-4:雙MSLN 高 KDxCD3xhSA）和PRO1872（scMATCH-3:MSLN 低 KDxCD3xhSA）的細胞毒性潛力和對CD8+T細胞活化的影響。使用源自健康組織的高間皮素表達細胞系H226和低間皮素表達MeT-5A細胞時獲得的數據顯示在表26和27中，而MATCH分子的濃度反應曲線顯示在第6圖中。2種分子都高度對高表達間皮素的H226細胞有效。靶向PRO2000的二價間皮素比靶向PRO1872的單價間皮素有效75倍。相反，在表達低間皮素水平的MeT-5A細胞上，單價間皮素結合分子PRO1872顯示出比PRO2000高16倍的殺傷標靶細胞的效力。在高表達細胞上，PRO2000的殺傷效力（EC 50）為0.07 pM，PRO1872為5.31 pM，而在MeT-5A細胞上，PRO2000的EC50為144.70 pM，PRO1872為8.88 pM。在相應條件下觀察到CD8+ T細胞活化的類似數據。
此外，分別在表達中等和低間皮素水平的另外兩種標靶癌細胞系、HPAC和H292細胞上測試了PRO2000和PRO1872的細胞毒性活性和對CD8+T細胞活化的影響（表27和第7圖）。正如之前觀察到的，PRO1872比靶向間皮素的二價分子PRO2000對間皮素表達低的細胞更有效。相比之下，PRO2000和PRO1872對HPAC細胞具有相似的效力，它們表現出中等間皮素密度。在HPAC上，PRO2000的殺傷效力為40.75 pM，PRO1872為30.26 pM，而在低表達間皮素的H292細胞上，PRO2000的EC50為652.2 pM，PRO1872為91.03 pM。在個別條件下觀察到CD8+ T細胞活化的類似數據，除了在HPAC細胞存在下PRO2000的效力是PRO1872的4倍以上。
幾項研究報告了癌症患者中數百ng/ml的可溶性間皮素的血清濃度。因此，我們評估可溶性間皮素的存在對分子殺死標靶細胞的效力的影響。
在不存在或存在50 ng/ml或500 ng/ml可溶性間皮素（sMSLN）的情況下，使用高表達間皮素的H226細胞比較MATCH分子PRO2000和PRO1872的細胞毒性潛力和對CD8+T細胞活化的影響。獲得的數據顯示在表28和29中，分子的濃度反應曲線顯示在第8圖中。可溶性間皮素以劑量依賴性方式對兩種分子的效力產生負面影響。靶向PRO2000的二價間皮素（對間皮素的單價結合親和力比PRO1872低）與不存在可溶性間皮素時觀察到的效力相比，存在500 ng/ml可溶性間皮素時的殺傷效力降低了17倍。相比之下，對間皮素具有更好單價親和力的間皮素單價分子PRO1872在500 ng/ml可溶性間皮素存在下顯示出比不存在可溶性間皮素時的效力低106倍的效力。在各自的條件下觀察到CD8+ T細胞活化的類似數據。
此外，PRO2000的變異體的PRO2100的特徵在於以顯示兩種分子具有相同的殺傷標靶細胞的效力。在PRO2100中，潛在的醣基化位點已發生突變以防止醣基化。
在高表達間皮素的H226細胞和低表達間皮素的間皮細胞MeT-5A存在下，使用基於流式細胞儀的細胞毒性測定比較MATCH4分子PRO2000和PRO2100的細胞毒性潛力。PRO1872也包括在內。獲得的數據顯示在表30中，濃度反應曲線顯示在第9圖中。測試的分子均未顯示對低表達間皮素的MeT-5A細胞的殺傷。在H226標靶細胞存在的情況下，PRO2000和PRO2100在sMSLN不存在或存在的情況下顯示出非常相似的殺傷效力。在沒有sMSLN的情況下，PRO2000的效力為0.7 pM，PRO2100的效力為1.54 pM。存在100 ng/ml sMSLN時，sMSLN的效力會移動2的係數（factor）（PRO2100為3.56 pM）和5的係數（factor）（PRO2000 為 3.45 pM）。相比之下，在不存在對間皮素具有更好單價親和力的分子sMSLN的情況下，PRO1872的效力分別比PRO2100和PRO2000低10倍和20倍（EC 50PRO1872 = 13.38 pM）。此外，在100 ng/ml sMSLN存在下，PRO1872的效力要低10倍。
基於以上獲得的數據，如方法部分中概述的，通過LDH釋放評估其他示例性MATCH分子PRO2567、PRO2566、PRO2562和PRO2660（MATCH-4:雙MSLN 高 KDxCD3xhSA）的細胞毒性潛力。當檢查PRO2567、PRO2566和PRO2562時，這些分子在高表達MSLN的H226細胞上表現出相對於PRO2660更高的效力和相似的劑量反應曲線（第10圖）。在表達中間OVCAR-3的細胞上觀察到這些分子的效力略有降低，當使用Met-5A細胞作為低MSLN表達標靶時，活性進一步降低（第10圖）。這些數據總結在第11圖中，其中給出了整個實驗的EC 50值，包括與作為參考的PRO1872的比較。我們觀察到，當使用H226細胞作為標靶時，PRO2567、PRO2566、PRO2562和PRO2660的EC 50值似乎低於對PRO1872觀察到的值（第11A圖）。我們在OVCAR-3細胞上觀察到PRO2567、PRO2566和PRO2562的類似趨勢（第11B圖）。當通過計算平均Met-5A EC 50和平均H226 EC 50值之間的x倍差異來檢查活動窗口時，我們觀察到PRO2567、PRO2566和PRO2562的活動窗口明顯大於PRO1872（見表31）。
在50和500 ng/mL sMSLN存在下檢查先導分子的效力和劑量反應曲線的變化（第12圖）。我們觀察到MATCH4雙MSLN 高 KDxCD3xhSA分子在sMSLN存在下保持其效力。例如，與PRO1872相比，即使在高sMSLN濃度下，PRO2566和PRO2567在sMSLN存在下仍能保持其效力（效力從0到500 ng/mL的x倍變化：14.2-和23.8-與78.2-倍；參見表32）。總之，第13圖顯示了絕對EC 50值的差異。PRO2566和PRO2567的EC 50值相對不受sMSLN添加的影響，而單價PRO1872的EC 50值在添加sMSLN後受到的影響相對較大。雖然PRO2660似乎對sMSLN更敏感，但與PRO1872相比，它仍然不太敏感。這些數據表明，MATCH4雙MSLN 高 KDxCD3xhSA的形式在sMSLN存在下保留足夠的抗腫瘤效力是優越的。
範例 7：結合MATCH分子的標靶細胞
介紹
為了支持使用表達不同細胞表面密度的間皮素（H226、HPAC、H292、OVCAR-3和MeT-5A)的標靶細胞獲得的細胞毒性數據，MATCH分子與這些細胞中的至少2個的細胞結合通過流式細胞儀評估細胞系。測試示例性MATCH4分子PRO2000、PRO2100、PRO2562、PRO2566、PRO2567和PRO2660以確認兩種分子具有相似的結合特性。scMATCH3 PRO1872也包括在內以進行比較。
方法
細胞用100 μl PBS洗滌兩次，並與範圍從50'000到0.005 pM之PRO1872、PRO2000、PRO2100、PRO2562、PRO2566、PRO2567或PRO2660在染色緩衝液（PBS，2% BCS熱滅活，2 mM EDTA）中的5倍連續稀釋液一起反應。細胞用染色緩衝液洗滌2次，MATCH4分子的結合通過蛋白質L-PE（2 μg/ml）可顯現（visualized）。將盤體在室溫下在周轉混合器上反應30分鐘，用染色緩衝液洗滌兩次，以200 g離心5分鐘，並重新懸浮在最終體積為50 µl的染色緩衝液中。使用Novocyte流式細胞儀裝置通過流式細胞儀分析每孔的20,000個事件（event）的PE訊號，並使用NovoExpress軟體（ACEA Biosciences）分析數據。通過減去空白（抗體濃度為零），針對非特異性結合校正MATCH分子的平均螢光強度（Mean fluorescence intensity, MFI）值。使用GraphPad Prism數據分析軟體（GraphPad Software）通過4參數邏輯曲線擬合分析ΔMFI數據，並計算達到50%標靶細胞結合所需的目標分子濃度（EC 50）。
結果
PRO2000、PRO2100和PRO1872與不同細胞系的結合通過流式細胞術評估。觀察到半數最大結合時的濃度（EC 50），且達到的最大結合值（MFI）表示於表33中，相應的滴定曲線顯示於第14（A-D）圖中。PRO2000和PRO2100顯示與所有測試細胞系的結合數據相當。與PRO1872相比，PRO2000和PRO2100與高度表達間皮素的癌細胞H226的結合高3倍，與中度表達間皮素的癌細胞HPAC的結合高1.5至2倍，與低度表達間皮素的癌細胞的結合低2倍H292。這些數據與細胞毒性試驗中獲得的數據相關。對每個測試分子觀察到的最大結合證實了細胞系在細胞表面間皮素表達方面的排名。
此外，如上所述，還評估了MATCH4分子PRO2567、PRO2566、PRO2562和PRO2660（雙MSLNxCD3xhSA）與不同細胞系的細胞結合。觀察到半數最大結合（EC 50）和達到的最大結合值（MFI）時的濃度在表34中呈現並且相應的滴定曲線在第14（E-G）圖中呈現。前導MATCH4分子PRO2567、PRO2566和PRO2562表現出與高度表達MSLN的H226細胞的EC 50結合，這與PRO2000和PRO2100相當（比較表33和表34）。當評估與中度MSLN表達水平的OVCAR-3細胞結合時，我們進一步觀察到所有 MATCH4 分子（PRO2567、PRO2566、PRO2562和PRO2660）的EC 50結合降低。二價MATCH4分子的EC 50結合減少是由於OVCAR-3細胞上MSLN的表達水平降低（由獲得的最大MFI值表示）降低了親和力效應對結合強度的貢獻。關於低MSLN表達的Met-5A細胞，我們發現與H226和OVCAR-3細胞相比，最大MFI值實質上降低，並且EC 50值比收回的（retrieved）與H226細胞結合的EC 50值低約5倍。對於PRO2000和PRO2100，我們也獲得了類似的結果。有人可能推測Met-5A細胞上的MSLN局部集中在膜微域（membrane microdomain）中，導致MATCH4分子的緊密且強結合性驅動的結合，從而導致低EC 50值，而因為MSLN的整體低表達在這些細胞上，最大MFI值仍然很低。
綜上所述，先導MATCH4分子PRO2567、PRO2566、PRO2562的EC 50結合與針對PRO2000和PRO2100獲得的細胞結合數據相當。在細胞毒性實驗中也觀察到與中度表達MSLN的OVCAR-3細胞的結合強度降低，這可能是由於強結合性的喪失，在細胞毒性實驗中，與殺死高度表達MSLN的H226細胞相比，發現MATCH4分子殺死OVCAR-3細胞的效力降低。
表26：存在H226和Met-5A細胞時的標靶細胞殺傷和CD8+T細胞活化的效力。
  標靶細胞殺傷 CD8+ T細胞活化
標靶細胞系 H226 Met-5A H226 Met-5A
PRO ID EC 50(pM) 最大殺傷(%) EC 50(pM) 最大殺傷(%) EC 50(pM) 最大活化(%) EC 50(pM) 最大活化(%)
PRO2000 0.07 87.68 144.70 54.65 NA 95.8 544.20 51.0
PRO1872 5.31 93.64 8.88 47.87 0.09 88.9 10.89 59.9
表27：在H292和HPAC細胞存在時的標靶細胞殺傷和CD8+T細胞活化的效力。
  標靶細胞殺傷 CD8+ T細胞活化
標靶細胞系 H292 HPAC H292 HPAC
PRO ID EC 50(pM) 最大殺傷(%) EC 50(pM) 最大殺傷(%) EC 50(pM) 最大活化(%) EC 50(pM) 最大活化(%)
PRO2000 652.20 89.77 40.75 79.82 114.50 53.9 12.24 70.9
PRO1872 91.03 91.97 30.26 83.48 34.06 61.7 47.18 76.3
表28：在不存在或存在可溶性間皮素時的H226標靶細胞殺傷的效力。
間皮素 濃度 沒有間皮素 50 ng/ml 500 ng/ml
PRO ID EC 50(pM) 最大殺傷(%) EC 50(pM) 最大殺傷(%) EC 50(pM) 最大殺傷(%)
PRO2000 9.73 93.75 31.21 94.86 165.30 92.05
PRO1872 43.89 95.65 636.50 95.99 4653.00 97.65
表29：在不存在或存在可溶性間皮素且存在H226標靶細胞時CD8+T細胞活化的效力。
間皮素濃度 沒有間皮素 50 ng/ml 500 ng/ml
PRO ID EC 50(pM) 最大活化(%) EC 50(pM) 最大活化(%) EC 50(pM) 最大活化(%)
PRO2000 1.986 84.73 7.849 83.03 42.43 86.86
PRO1872 22.86 83.02 199.8 79.04 1115 81.39
表30：在不存在或存在可溶性間皮素時殺死標靶細胞的效力。
標靶細胞系 H226 Met-5A
可溶性間皮素濃度 沒有可溶性間皮素 100 ng/ml 沒有可溶性間皮素 100 ng/ml
PRO ID EC 50(pM) 最大殺傷(%) EC 50(pM) 最大殺傷(%) EC 50(pM) 最大殺傷(%) EC 50(pM) 最大殺傷(%)
PRO2000 0.70 49.44 3.45 58.49 無裂解 無裂解
PRO2100 1.54 46.34 3.56 58.92 無裂解 無裂解
PRO1872 13.38 54 129.80 60.66 無裂解 無裂解
表 31：PRO2561、PRO2566、PRO2567、PRO2660和PRO1872對表達不同水平MSLN的標靶細胞的細胞殺傷效力概述。
平均值 PRO2660 PRO2567 PRO2566 PRO2562 PRO1872
H226 EC 50(nM) 0.02851 0.003459 0.006095 0.01339 0.1203
Met-5A EC 50(nM) 0.04852 0.09865 2.656 1.536 0.1381
折疊差異「窗口」（Fold-diff “Window”） 1.7 28.5 435.8 114.7 1.1
表32：PRO2561、PRO2566、PRO2567、PRO2660和PRO1872在不同水平的可溶性MSLN存在下的細胞殺傷效力概述。
Delta 0 - 50 ng/mL Delta 0 - 500 ng/mL
PRO2566 3.1 14.2
PRO2567 3.2 23.8
PRO2662 5.8 37.6
PRO2660 12.0 85.1
PRO1872 8.5 78.2
表 33：PRO2000、PRO2100和PRO1872與H226、H292、Met-5A和HPAC細胞的結合。
  H226 H292 Met-5A HPAC
PRO ID EC 50(pM) 最大結合 (MFI) EC 50(pM) 最大結合(MFI) EC 50(pM) 最大結合(MFI) EC 50(pM) 最大結合(MFI)
PRO2000 658.6 362311 1027.0 6964 128.2 7949 1476.0 17478
PRO2100 524.0 363091 1301.0 6253 62.8 7479 1011.0 18029
PRO1872 1571.0 467461 708.6 12168 194.3 11190 2157.0 33329
表 34：先導MATCH4分子PRO2567、PRO2566、PRO2562和PRO2660與H226、OVCAR-3 和 Met-5A細胞的結合。
  H226 OVCAR-3 Met-5A
PRO ID EC 50(pM) 最大結合(MFI) EC 50(pM) 最大結合(MFI) EC 50(pM) 最大結合(MFI)
PRO2562 446.6 608623 5551 148153 87.7 12044
PRO2566 563.6 756616 5131 154450 106.3 12058
PRO2567 611.4 809233 6637.5 169975 82.4 11230
PRO2660 1084.7 686235 10738.5 197710 157.3 14462
範施例 8：用 PRO2000 （雙MSLN 高 KDxCD3xhSA）抑制體內腫瘤生長：
介紹
在查爾斯河實驗室（Charles River Laboratory）進行了2個體內表達間皮素的細胞系異種移植（xenograft）實驗，以確定PRO2000（雙MSLN 高 KDxCD3xhSA）相對於對照組動物有效控制腫瘤生長的能力。一項實驗檢查 H292 異種移植模型的腫瘤生長抑制，另一項實驗檢查 HPAC 異種移植模型的腫瘤生長抑制。
方法
動物
來自查爾斯河實驗室的雌性NCG小鼠在適合於人類化小鼠工作的條件下養殖及飼養。兩項研究均使用 8~12 週齡的動物。
學習規劃
治療組中的動物（每組 H292的 n = 5~6，每組 HPAC的 n = 10）皮下共同植入 1 x 10 7H292 NSCLC 腫瘤細胞和 1 x 10 7PBMC 或 1 x 10 7HPAC腫瘤細胞和側翼（flank）2.5 x 10 6PBMC。 5天後，向動物靜脈注射感興趣的分子，每5天增加一次劑量，直到實驗結束。在實驗期間，使用卡尺（caliper）測量定期監測動物的腫瘤生長和體重減輕。當對照組的平均腫瘤體積為 800 mm 3或 40 天時，以先到者為準，對動物實施安樂死。根據查爾斯河實驗室的動物健康和福利條例對動物進行監測和安樂死。
結果
如方法中所述，我們使用PBMC/H292共同植入模型評估PRO2000（雙MSLN 高 KDxCD3xhSA）在促進腫瘤生長抑制中的功效。 H292 細胞表達中度水平的 MSLN，並且是從非小細胞肺癌中建立的。靜脈內施用多劑量水平的 PRO2000，如第15 圖所示。作為比較，我們使用帕利珠單抗（palivizumab）（抗 RSV 抗體）作為對照 IgG 治療，以及在沒有 PBMC 的情況下移植的腫瘤細胞（無治療）。我們觀察到對照條件導致腫瘤生長（淺灰色線， 第15A圖）。相對於對照，用 PRO2000 （雙MSLN.CD3）分子處理導致 1 和 5 mg/kg 的腫瘤生長抑制（分別為第15A圖中的黑線和深灰線）。我們使用二因子變異數分析（two-way ANOVA）檢驗治療的顯著性，然後是杜凱的多重比較檢定（Tukey’s multiple comparisons test）；第 40 天的數據顯示在第15B圖中，每個點代表一隻動物。相對於帕利珠單抗治療的動物（ctrl）和未治療的動物，兩個較高的劑量（1 mg/kg 和 5 mg/kg）導致腫瘤體積顯著降低。最低劑量（0.2 mg/kg）似乎是次優的，因為與帕利珠單抗治療的動物相比，這些比較並不顯著。似乎對整體動物健康沒有不利影響，因為動物體重在整個實驗過程中相對穩定（數據未顯示）。總之，這些數據表明多特異性抗體 PRO2000 （雙MSLN 高 KDxCD3xhSA）在體內具有腫瘤生長抑制活性，是癌症免疫治療的一個有前景的概念候選者。
PRO2000（雙MSLN 高 KDxCD3xhSA）在促進腫瘤生長抑制中的功效使用如方法中所述的PBMC/HPAC共同植入模型進一步評估。與H292相比，HPAC腫瘤細胞表達更高水平的MSLN。與 H292 模型類似，我們觀察到對照條件的生長（第16圖，帕利珠單抗），以及測試條件下的劑量依賴性腫瘤生長抑制。我們使用二因子變異數分析，並接續進行杜凱的多重比較檢定以檢查治療的顯著性。我們觀察到，與最低劑量的 PRO1872（MSLNxCD3xhSA）（單價MSLN標靶分子）相比，最低劑量的 PRO2000（雙MSLN 高 KDxCD3xhSA）在多個時間點導致顯著的腫瘤生長抑制。此數據指出細胞上表達更高水平 MSLN 的PRO2000（雙MSLN 高 KDxCD3xhSA)的強結合性基的活性導致改善的效力。
G:甘胺酸 S:絲胺酸 MATCH4,scMATCH3,scDb-scFv:多特異性抗體 V1~V7:變異體 VH:重鏈可變域 VL:輕鏈可變域
第1圖顯示抗MSLN的scFvs的PRO1783、PRO1922、PRO1925、PRO2306、PRO2309和參考抗體阿瑪西單抗（Amatuximab）與來自表達高水平的人類MSLN的H226細胞系的細胞質膜的結合；在競爭型ELISA（cELISA）中測試PRO1783、PRO1922、PRO1925、PRO2306、PRO2309和阿瑪西單抗與H226細胞系的結合；在cELISA中分別使用HRP偶聯的蛋白質L和HRP偶聯的抗人類IgG抗體檢測與H226細胞結合的PRO1783、PRO1922、PRO1925、PRO2306、PRO2309和阿瑪西單抗；光密度（OD 450nm-690nm）表示為以nM為單位的抗體濃度的函數；請注意，僅擬合了值增加的濃度；PRO1783的EC 50值大約比參考抗體阿瑪西單抗的值高六倍；PRO1925、PRO2306、PRO2309的EC 50值與PRO1783在同一範圍內，而PRO1922的EC 50值與阿瑪西單抗接近； 第2圖顯示抗MSLN的scFv的PRO1783和參考抗體阿瑪西單抗與來自表達食蟹獼猴MSLN的CHO細胞系的細胞的質膜的結合；在cELISA中測試了PRO1783和阿瑪西單抗與表達食蟹獼猴MSLN的CHO細胞系的質膜結合；PRO1783和阿瑪西單抗的結合分別通過 HRP偶聯蛋白質L和HRP偶聯抗人類IgG抗體檢測；光密度（OD 450nm-690nm）表示為以nM為單位的抗體濃度的函數；阿瑪西單抗以及PRO1783證明與食蟹獼猴MSLN的結合； 第3圖顯示通過抗MSLN的scFvs的PRO1783、PRO1922和PRO1925對人類MSLN/MUC16相互作用的阻斷；在cELISA中測試PRO1783、PRO1922、PRO1925和阿瑪西單抗阻斷人類MSLN/MUC16相互作用的效力；光密度（OD 450nm-690nm）表示為以nM為單位的抗體濃度的函數；PRO1783的IC 50為0.5 nM，而參考抗體阿瑪西單抗更有效地中和MSLN/MUC16相互作用（IC 50= 0.014 nM）；PRO1925的IC 50與PRO1783相似，而PRO1922的IC 50更接近阿瑪西單抗的IC 50； 第4圖顯示人類間皮素/小鼠間皮素（hMSLN/mMSLN）的嵌合變異體；以深灰色醒目顯示的結構域是由相應的小鼠序列替換的人類MSLN序列的片段（Segment）；片段VI對應於最靠近質膜的MSLN胞外域的C端部分；片段I和片段II對應於MSLN的區域I；片段III和片段IV對應於MSLN的區域II；片段V和VI對應於MSLN的區域III； 第5圖顯示了不同的MATCH形式；（左）反平行MATCH4形式的架構，其中每條鏈上分裂的、形成異二聚體的可變域以相反的N端到C端的順序組織，作為互補MATCH鏈上的同源可變域（cognate variable domain）；（右）scMATCH3形式的示例性結構，其中分裂的可變域位於單個肽鏈上，該肽鏈組裝成三特異性分子；例如VL2-VL1-VH1-VH2-scFv之替代安排也在scMATCH3形式概念的範圍內；用於連接結構域的Gly-Ser連接子用線條表示；表15描述包含在產生的不同分子中的結構域及其在分子內的位置（結構域1至4）；此結構域編號與申請專利範圍中定義的結合域編號不相關； 第6圖顯示在人類血清白蛋白存在下PRO2000和PRO1872的細胞毒性活性和對CD8+T細胞活化的影響；（A）特異性殺死高度表達MSLN的癌細胞（H226細胞）；在表達高度水平間皮素的癌細胞上，PRO2000觀察到的標靶細胞殺傷效力是PRO1872的75倍；（B）特異性殺死低度表達MSLN的間皮細胞（MeT-5A細胞）；在源自健康間皮組織（MeT-5A; ATCC CRL-9444）的細胞中，表達低間皮素水平的單價間皮素結合蛋白PRO1872顯示出最佳的殺傷效力；（C）存在高度表達MSLN的癌細胞（H226細胞）時的CD8+ T細胞活化，和（D）存在低度表達MSLN的間皮細胞（MeT-5A細胞）時的CD8+ T細胞活化；CD8+ T細胞活化也觀察到了類似的數據；使用來自供體#1的人類周邊血單核細胞（PBMC）；標靶細胞和CD8+T細胞在與個別分子反應開始40小時後通過流式細胞儀進行分析，並使用sigmoidal 4PL fit（GraphPad Prism）擬合數據； 第7圖顯示在人類血清白蛋白存在下PRO2000和PRO1872的細胞毒性活性和對CD8+T細胞活化的影響；（A）特異性殺死低度表達MSLN的癌細胞（H292細胞）；在表達低水平間皮素的癌細胞上，PRO1872觀察到的標靶細胞殺傷效力是PRO2000的7倍。（B）特異性殺死中度表達MSLN的癌細胞（HPAC細胞）；在間皮素表達為中度水平的癌細胞上，單價和二價間皮素結合劑PRO1872和PRO2000顯示出相似的殺傷效力；（C）存在低度表達MSLN的癌細胞（H292細胞）時的CD8+ T細胞活化，和（D）存在中度表達MSLN的癌細胞（HPAC細胞）時的CD8+ T細胞活化；對於CD8+ T細胞的活化觀察到類似的數據，除了在HPAC細胞存在的情況下PRO2000明顯比PRO1872更有效（4倍）；使用來自供體#1的PBMC；標靶細胞和CD8+T細胞在與個別分子反應開始40小時後通過流式細胞儀進行分析，並使用sigmoidal 4PL fit（GraphPad Prism）擬合數據； 第8圖顯示在可溶性間皮素（sMSLN）不存在或存在下PRO2000和PRO1872的細胞毒性活性和對CD8+T細胞活化的影響；（A~C）PRO2000和PRO1872對H226標靶細胞的細胞毒性活性；在不存在sMSLN（A）、存在50 ng/ml sMSLN（B）或存在500 ng/ml sMSLN（C）的情況下特異性殺死H226細胞；與PRO1872相比，PRO2000殺傷效力受sMSLN濃度增加的影響較小；（D~F）在相應條件下觀察到CD8+ T細胞活化的類似數據；在存在沒有sMSLN的H226細胞時（D）、存在50 ng/ml sMLSN時（E）或存在500 ng/ml sMLSN時（F）的CD8+ T細胞活化。使用了來自供體#2的PBMC。標靶細胞和CD8+T細胞在與個別分子反應開始40小時後通過流式細胞儀進行分析，並使用sigmoidal 4PL fit（GraphPad Prism）擬合數據； 第9圖顯示在100ng/ml sMSLN不存在或存在下PRO2000、PRO2100和PRO1872的細胞毒性活性：在sMSLN不存在（A）或100ng/ml sMSLN存在下（B）對H226細胞的特異性殺傷；在不存在sMSLN（C）或存在100 ng/ml sMSLN（D）的情況下特異性殺死Met-5A細胞（ATCC CRL-9444)；使用來自供體#3的PBMC；標靶細胞開始與個別分子反應後40小時通過流式細胞儀進行分析，並使用sigmoidal 4PL fit（GraphPad Prism）擬合數據； 第10圖顯示PRO2562、PRO2566、PRO2567和PRO2660對高度表達MSLN的癌細胞（H226細胞）、中度表達MSLN的癌細胞（OVCAR-3細胞）和低度表達MSLN的癌細胞（Met-5A細胞）的細胞毒性活性。帕利珠單抗（Palivizumab）用作陰性對照（對照組）； 第11圖顯示PRO2562、PRO2566、PRO2567、PRO2660和單價參考抗體PRO1872對H226細胞的特異性殺傷（第11A）、OVCAR3細胞的特異性殺傷（第11B，左側）和對Met-5A細胞特異性殺傷（第11B，右側）的EC 50值的概述； 第12圖顯示在50ng/ml sMSLN或500ng/ml sMSLN不存在或存在下PRO2562、PRO2566、PRO2567、PRO2660和單價參考抗體PRO1872對H226細胞的細胞毒性活性； 第13圖顯示PRO2562、PRO2566、PRO2567、PRO2660和單價參考抗體PRO1872在50ng/ml sMSLN或500ng/ml sMSLN不存在或存在下特異性殺傷H226細胞的EC50值的概述； 第14圖顯示MATCH分子與表達不同間皮素細胞表面水平的標靶細胞系的結合；PRO2000、PRO2100和PRO1872與（A）高度表達間皮素的H226細胞、（C）中度表達間皮素的HPAC細胞、（B）低度表達間皮素的H292癌細胞和（D）低度表達間皮素的間皮細胞、MeT-5A（ATCC CRL-9444）的結合，及PRO2562、PRO2566、PRO2567和PRO2660與（E）高度表達間皮素的H226細胞、（F）中度表達間皮素的OVCAR-3細胞和（G）低度表達間皮素的間皮細胞，MeT-5A（ATCC CRL- 9444）的結合是通過流式細胞儀進行評估，並使用sigmoidal 4PL fit (GraphPad Prism)擬合數據； 第15圖顯示相對於對照條件，用分子PRO2000（雙間皮素.CD3 (biMSLN.CD3)）處理導致H292異種移植模型的腫瘤生長抑制；（A）在存在或不存在biMSLN.CD3治療的情況下對腫瘤生長的縱向分析；線條描繪中位數；動物皮下共植入1 x 10 7H292腫瘤細胞和1 x 10 7PBMC，從第5天開始靜脈內給藥，每5天重複一次，直到實驗結束；（B）第40天的數據顯示為散點圖；每個點對應一隻動物，數據以均值和標準差顯示；在二因子重複測量變異數分析（two-way repeated measures ANOVA）後，進行杜凱的多重比較檢定（Tukey’s multiple comparisons test），並描繪每個數據集相對於帕利珠單抗對照（對照組，下方線條）或無治療（上方線條）的顯著性； ns = 不顯著； *表示 p ＜ 0.05; **表示p ＜ 0.01，***表示p ＜ 0.001；灰色的虛線表示y軸上的0； 第16圖顯示相對於對照條件，用分子PRO2000（biMSLN.CD3）治療導致人類胰腺癌（HPAC）異種移植模型的腫瘤生長抑制；（A）在增加濃度的PRO2000（biMSLN.CD3）的情況下對腫瘤生長的縱向分析；線條描繪中位數；動物皮下共植入1x10 7HPAC腫瘤細胞和2.5 x 10 6PBMC，從第5天開始靜脈內給藥，每5天重複一次，直到實驗結束；（B）在濃度增加的PRO2000（biMSLN.CD3）和作為比較的情況下，在濃度增加的PRO1872（MSLN.CD3）下對腫瘤生長的相應縱向分析；線條描繪中位數；帕利珠單抗用作陰性對照；*表示 p ＜ 0.05；****表示p ＜ 0.0001；*****表示p ＜ 0.00001；（C）僅顯示於（B）中隨時間推移的最低劑量的部分的圖。
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G:甘胺酸
S:絲胺酸
MATCH4,scMATCH3,scDb-scFv:多特異性抗體
VH:重鏈可變域
VL:輕鏈可變域

Claims (15)

  1. 一種多特異性抗體，包括： a) 與間皮素特異性結合的2個抗體基結合域（MSLN-BD）；以及 b) 與CD3特異性結合的至少一抗體基結合域（CD3-BD）； 其中該多特異性抗體不包含免疫球蛋白Fc區多肽，並且其中當通過表面電漿共振測量時，各該MSLN-BD以0.5至20 nM的範圍內（特別是在0.6至10 nM的範圍內）的單價解離常數（K D）結合於間皮素（MSLN）。
  2. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該MSLN-BD包括 (i) 分別為SEQ ID NO: 1、2（或10）和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO:4、5和6的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分別為SEQ ID NO: 14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；及 (ii) VH3或VH4結構域框架序列FR1至FR4；特別是VH3結構域框架序列FR1至FR4；及 (iii) 包括一VL框架的VL結構域，該VL框架包含Vκ框架FR1、FR2和FR3，特別是Vκ1或Vκ3的FR1至FR3，特別是Vκ1的FR1至FR3，以及一框架FR4，該框架FR4選自VκFR4和VλFR4，特別是包含與SEQ ID NO: 132至SEQ ID NO: 139中任一項具有至少70%、80%或90%的一致性的胺基酸序列的Vλ FR4，更特別是選自SEQ ID NO: 132至SEQ ID NO: 139中任一項的Vλ FR4，特別是根據SEQ ID NO: 132或139的Vλ FR4。
  3. 如請求項1或2所述之多特異性抗體，其中該MSLN-BD包括 a.1) 分別為SEQ ID NO:1、2(或 10)和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.1) 分別為SEQ ID NO:4、5和6的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.1) 與胺基酸序列SEQ ID NO:7至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.1) 與胺基酸序列SEQ ID NO:9至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.2) 分別為SEQ ID NO:1、2(或10)和3的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.2) 分別為SEQ ID NO:4、5和6的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.2) 與胺基酸序列SEQ ID NO:8至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.2) 與胺基酸序列SEQ ID NO:9至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.3) 分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.3) 分別為SEQ ID NO: 14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.3) 與胺基酸序列SEQ ID NO:17至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.3) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 18至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.4) 分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.4) 分別為SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.4) 與胺基酸序列SEQ ID NO: 19至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.4) 與胺基酸序列SEQ ID NO:21至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.5) 分別為SEQ ID NO:11、12 和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.5) 分別為SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.5) 與胺基酸序列SEQ ID NO:20至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.5) 與胺基酸序列SEQ ID NO:21至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.6) 分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.6) 分別為SEQ ID NO: 14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.6) 與胺基酸序列SEQ ID NO:22至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.6) 與胺基酸序列SEQ ID NO:24至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列； 或者 a.7) 分別為SEQ ID NO:11、12和13的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列， b.7) 分別為SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列， c.7) 與胺基酸序列SEQ ID NO:23至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VH序列，及 d.7) 與胺基酸序列SEQ ID NO:24至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的VL序列。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之多特異性抗體，其中該CD3-BD結合於CD3ε。　　
  5. 如前述請求項求中任一項所述之多特異性抗體，其中該抗體包含一CD3-BD，其中當通過表面電漿共振測量時，該CD3-BD以0.5至50 nM，特別是1至40 nM，特別是2至35 nM的單價K D結合於CD3ε。
  6. 如請求項4或5所述之多特異性抗體，其中該CD3-BD包括 (i) 分別在人類抗體VH框架，特別是VH3框架中的SEQ ID NO:45、46和47的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，及 (ii) 分別在人類抗體VL框架中的SEQ ID NO：48、49和50的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中該VL框架包括Vκ的框架FR1、FR2和FR3，特別是Vκ1框架以及一框架FR4，該框架FR4選自VκFR4和Vλ框架4， 特別地，其中該CD3-BD包括 (i) 包含SEQ ID NO:51、140、141或142的胺基酸序列的VH結構域，及 (ii) 包含SEQ ID NO:52的胺基酸序列的VL結構域。
  7. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中該抗體進一步包含至少一人類血清白蛋白結合域（hSA-BD），特別是一hSA-BD，特別是其中該hSA-BD包括 (i) 分別在人類抗體VH框架，特別是VH3框架中的SEQ ID NO:53、54和55的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和 (ii) 分別在人類抗體VL框架中的SEQ ID NO：56、57和58的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中該VL框架包括Vκ框架FR1、FR2和FR3，特別是Vκ1框架和一框架FR4，該框架FR4選自Vκ FR4（特別是Vκ1 FR4）和Vλ框架4； 或者 (i) 分別在人類抗體VH框架，特別是VH3框架中的SEQ ID NO:63、64和65的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，及 (ii) 分別在人抗體VL框架中的SEQ ID NO：66、67和68的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中該VL框架包括Vκ框架FR1、FR2和FR3，特別是Vκ1框架和一框架FR4，該框架FR4選自Vκ FR4，特別是 Vκ1 FR4，和Vλ框架4； 或者 (i) 分別在人類抗體VH框架，特別是VH3框架中的SEQ ID NO: 73、74和75的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，及 (ii) 分別在人類抗體VL框架中的SEQ ID NO:76、77和78的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中該VL框架包括Vκ框架FR1、FR2和FR3，特別是Vκ1框架和一框架FR4，該框架FR4選自Vκ FR4，特別是 Vκ1 FR4，和Vλ框架4； 特別地，其中該hSA-BD包括 (i) 包含SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的VH結構域，和 (ii) 包含SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的VL結構域； 或者 (i) 包含SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的VH結構域，和 (ii) 包含SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的VL結構域； 或者 (i) 包含 SEQ ID NO: 79或143的胺基酸序列的VH結構域，和 (ii) 包含 SEQ ID NO: 80或144的胺基酸序列的VL結構域； 或者 (i) 包含 SEQ ID NO: 81或145的胺基酸序列的VH結構域，和 (ii) 包含 SEQ ID NO: 82或146的胺基酸序列的VL結構域。
  8. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中該抗體不包含CH1和/或CL區。
  9. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中 該第一單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:101，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO:101所組成，及 該第二單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:102，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO：102所組成；或者 該第一單鏈蛋白包含SEQ ID NO:109的胺基酸序列，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO:109所組成，及 該第二單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:110，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO：110所組成；或者 該第一單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:111，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO:111所組成，及 該第二單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:112，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO：112所組成；或者 該第一單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:119，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO:119所組成，及 該第二單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:120，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO：120所組成；或者 該第一單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:121，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO:121所組成，及 該第二單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:122，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO：122所組成；或者 該第一單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:123，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO:123所組成，及 該第二單鏈蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:124，尤其是由胺基酸序列SEQ ID NO:124所組成。
  10. 一種或兩種核酸序列，編碼如請求項1至9中任一項所述之多特異性抗體。
  11. 一種或兩種載體，包括如請求項10所述之一種或兩種核酸序列。
  12. 一種或多種宿主細胞，包括如請求項11所述之一種或兩種載體。
  13. 一種用於產生如請求項1至9中任一項所述之多特異性抗體的方法，包括(i)提供如請求項10所述之一種或兩種核酸序列，或如請求項11所述之一種或兩種載體，表達該核酸序列或核些酸序列，或該載體或該些載體，並從表達系統收集該多特異性抗體，或(ii)提供如請求項12所述之一種或多種宿主細胞，培養該宿主細胞或該些宿主細胞；以及從細胞培養物中收集該多特異性抗體。
  14. 一種藥物組合物，包括請求項1至9中任一項所述之多特異性抗體和藥學上可接受的載體。
  15. 如請求項1至9中任一項所述之多特異性抗體，用於治療疾病，特別是人類疾病，更特別是選自癌症的人類疾病，特別是選自間皮瘤、胰腺癌和卵巢癌的癌症，一種發炎和自身免疫性疾病， 特別地，其中該多特異性抗體是 包含3個或4個結合域的單鏈蛋白，或 包含3個或4個結合域的異二聚體蛋白質。
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