TW202207977A - 包含ｔ細胞重導向治療劑及ｖｌａ－４黏附路徑抑制劑之組成物 - Google Patents

Abstract

在本文中揭示一種醫藥組成物，其包含T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑、以及其用於殺滅癌細胞之用途。

Description

包含T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑之組成物

本揭露係關於組成物及利用T細胞重導向治療劑殺滅癌細胞。電子提交序列表之參照

本申請案含有序列表，其已經以ASCII格式藉由電子方式提交且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII副本（建立於2021年4月9日）被命名為JBI6312WOPCT1_SL.txt且檔案大小為29 KB。

儘管有數種治療選項，目前無法治癒急性骨髓白血病(acute myeloid leukemia, AML)及多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)。即使在達到高的完全血液緩解(complete remission, CR)率（50%至80%）（該完全血液緩解率係定義為在骨髓(BM)中之≤5%之白血病母細胞(AML)或漿細胞(MM)之存在）之後(1, 2)，大部分患有AML或MM之患者復發(3-5)。復發已與微量殘存疾病(minimal residual disease, MRD)有關，藉此小量癌症幹細胞(cancer stem cell, CSC)或其他惡性前驅細胞無法被清除，即使在治療之後仍保留(persist)(6)。預防AML及MM的復發及尋找AML及MM之治癒方法(cure)需要尋找消除MRD之更佳策略。

如同造血幹細胞(hematopoietic stem cell, HSC)，在AML和MM中之CSC駐留，且優先保留在BM區位(7, 8)。BM區位(niche)經由保護CSC之可溶性生長因子與細胞-細胞交互作用提供特殊微環境(9)。此外，BM區位係免疫抑制性，且被理解為在穩態下之免疫豁免(privilege)部位，以允許正常造血及免疫細胞產生(10)。BM區位之此等態樣已提供針對數種抗癌藥物（包括化療、靶向小分子抑制劑、及基於抗體療法(antibody-based therapy)）之抗性，且使該等抗癌藥物之功效最小化(11-14)。

T細胞特異性地溶解腫瘤細胞且分泌細胞激素以招募及支持抗癌免疫力之能力使得其等變成一種有吸引力的治療選擇。數種方法已利用此策略，諸如雙特異性T細胞接合體（(bispecifirc T-cell engager, BiTE)，小雙特異性生物製劑）、嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)、及雙特異性抗體等(15)。BiTE及抗體介導之重導向係藉由接合在腫瘤細胞上之特異性表位與T細胞上之CD3而將T細胞與腫瘤細胞交聯，導致T細胞活化，且分泌最終殺滅腫瘤細胞之穿孔素和顆粒酶。此等CD3重導向療法已在臨床上證實為有效的抗癌策略，其中CD19 x CD3 BiTE（蘭妥莫單抗(blinatumomab)）已核准用於急性淋巴母細胞淋巴瘤(acute lymphoblastic lymphoma, ALL) (16)。然而，BM區位之免疫抑制和保護本質可能對T細胞重導向療法造成重大障礙。

例如，如在本文中所示，使用靶向特異性腫瘤抗原（CD123及BCMA）及CD3之雙特異性抗體觀察到，體外AML細胞系或MM細胞系與BM基質細胞之共培養物顯著地保護癌細胞免於受到雙特異性T細胞介導之裂解。當用雙特異性抗體治療時觀察到人源化(humanized)異體移植AML模式中之人類BM基質細胞之存在衰減腫瘤生長抑制(tumor growth inhibition, TGI)時，在體內觀察到類似結果。受損之CD3重導向細胞毒性與降低之T細胞效應物反應相關，從而提供說明該雙特異性抗體之活性喪失之機制。

在本文中提供一種醫藥組成物，其包含T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑，其中該T細胞重導向治療劑包含具有針對T細胞表面抗原之特異性之第一結合區及具有針對腫瘤相關抗原(tumor associated antigen, TAA)之特異性之第二結合區。

在醫藥組成物之一實施例中，組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑。

在醫藥組成物之進一步實施例中，T細胞重導向治療劑係抗體或其抗原結合片段。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，T細胞表面抗原係選自由以下所組成之群組：CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、CD137、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、以及NKG2C。

在醫藥組成物之又進一步之實施例中，T細胞表面抗原係CD3。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，TAA係選自由以下所組成之群組：BCMA、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38、以及SLAMF7。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，T細胞表面抗原為BCMAxCD3雙特異性抗體，其具有免疫特異性地結合BCMA之第一抗原結合部位及免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，BCMAxCD3雙特異性抗體包含第一重鏈(HC1)、第一輕鏈(LC1)、第二重鏈(HC2)、及第二輕鏈(LC2)，且其中該HC1及該LC1配對形成該第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成該第二抗原結合部位。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，HC1包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，LC1包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，HC2包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及LC2包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，HC1包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，LC1包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，HC2包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及LC2包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

在該醫藥組成物之又進一步實施例中，T細胞表面抗原為CD123xCD3雙特異性抗體，其具有免疫特異性地結合CD123之第一抗原結合部位及免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，CD123xCD3雙特異性抗體包含第一重鏈(HC1)、第一輕鏈(LC1)、第二重鏈(HC2)、及第二輕鏈(LC2)，且其中該HC1及該LC1配對形成該第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成該第二抗原結合部位。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，HC1包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，LC1包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列，HC2包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及LC2包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，VLA-4黏附路徑抑制劑係抗VLA-4抗體或其抗原結合片段。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，抗VLA-4抗體或其抗原結合片段係選自由以下所組成之群組：單株抗體、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、及F(v)片段、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、及由一個重鏈及一個輕鏈所組成之二聚體。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，VLA-4黏附路徑抑制劑係VLA拮抗劑。

在醫藥組成物之又進一步實施例中，VLA-4黏附路徑抑制劑係選自由以下所組成之群組之VLA-4拮抗劑：BIO1211、TCS2314、BIO5192、及TR14035。

在本文中進一步提供一種殺滅癌細胞之方法，其包含投予治療有效量之以上提供之醫藥組成物。

在方法之進一步實施例中，癌症係血液惡性疾病或實體腫瘤。

在方法之又進一步實施例中，T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

在方法之又進一步實施例中，在T細胞重導向治療劑之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

在方法之又進一步實施例中，在T細胞重導向治療劑之投予之後，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

在本文中又進一步提供一種套組，其包含以上提供之醫藥組成物。

各篇公開案、論文、及專利已於先前技術及整份說明書引用或描述；此等參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。在本說明書中所包括之對於文件、行動、材料、裝置、物品、或其類似者的論述，目的在於提供關於本發明的脈絡。此等論述並非承認，任一或所有此等情事形成了關於任何所揭示或請求之發明的先前技術部分。

除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語，均與本發明有關技術領域中具有通常知識者所通常了解之意義相同。在其他方面，在本文中所使用的某些用語具有如本說明書所闡述之意義。

必須注意的是，本文及附加之申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。

除非以其他方式說明，在本文中描述之任何數值諸如濃度或濃度範圍應理解為在所有情況下皆受到用語「約(about)」之修飾。因此，數值一般包括記載值之± 10%。例如，濃度1 mg/mL包括0.9 mg/mL至1.1 mg/mL。同樣地，濃度範圍1%至10% (w/v)包括0.9% (w/v)至11% (w/v)。如本文中所使用，明示使用之數值範圍包括所有可能的子範圍、在該範圍內之所有個別數值，包括在該等範圍內之整數及數值之分數，除非上下文以其他方式清楚指示。

除非以其他方式指示，在一系列元件之前的用語「至少(at least)」應理解為係指該序列中的每一元件。所屬技術領域中具有通常知識者將認可或僅使用例行實驗即可確定本文所述之本發明的特定實施例的許多等效物。該等等效物意欲涵蓋於本發明中。

如本文中所使用，用語「包含(comprises、comprising)」、「包括(includes、including)」、「具有(has、having)」、或「含有(contains、containing)」或彼等之任何其他變體將被理解為隱含包括所述整體或整體之群，但不排除任何其他整體或整體之群，且意欲為非排他性或開放式的。例如，包含表列元件之組成物、混合物、過程、方法、物品、或設備未必局限於僅該些元件，但可包括未明示表列或為該組成物、混合物、過程、方法、物品、或設備所固有之其他元件。再者，除非明示相反說明，「或(or)」係指包括性的「或」而非排他性的「或」。例如，下列任一者皆滿足條件A或B：A為真（或存在）且B為偽（或不存在）、A為偽（或不存在）且B為真（或存在）、及A及B兩者皆為真（或存在）。

如本文中所使用，多個所述元件之間的聯合用語「及/或(and/or)」係理解為涵蓋個別及組合選項兩者。例如，其中兩個元件係藉由「及/或」結合，第一選項係指第一元件在沒有第二元件的情況下之適用性。第二選項係指第二元件在沒有第一元件的情況下之適用性。第三選項係指第一及第二元件一起的適用性。這些選項之任一者應理解為落入該含義內，並因此滿足如本文中所使用之用語「及/或」之要求。該等選項之多於一者的並行適用性亦應理解為落入該含義內，並因此滿足用語「及/或」之要求。

如本文中所使用，用語「由...組成(consists of)」、或諸如「由...組成（consist of或consisting of）」之變體，如在整個說明書及申請專利範圍中所使用，指示包括任何所述整體或整體之群組，但不能將額外的整體或整體之群組加入所指定之方法、結構、或組成物中。

如本文中所使用，用語「基本上由...組成(consists essentially of)」、或諸如「基本上由...組成（consist essentially of或consisting essentially of）」之變體，如在整個說明書及申請專利範圍中所使用，指示包括任何所述整體或整體之群組，並可選地包括任何所述整體或整體之群組，其不會實質上改變所指定之方法、結構、或組成物之基本或新穎性質。參見M.P.E.P.§ 2111.03。

如本文中所使用之「對象(subject)」意指任何動物，較佳的是哺乳動物，最佳的是人類。如本文中所使用的用語「哺乳動物(mammal)」，其涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物之實例包括（但不限於）牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、兔、天竺鼠、猴、人類等，更佳的是人類。

詞語「右(right)」、「左(left)」、「下部(lower)」、及「上部(upper)」係標示用作參考之圖式中的方向。

亦應理解的是，在本文中使用之用語「約(about)」、「大約(approximately)」、「通常(generally)」、「實質上(substantially)」、及類似用語當用於較佳發明之組分的尺寸或特徵時，指示所述尺寸/特徵並非嚴格邊界或參數，且不排除將為所屬技術領域中具有通常知識者所理解的彼等之功能上相同或類似的微小變化。在最小限度上，包括數值參數之該等指稱將包括使用所屬技術領域中已接受之數學及工業原理（例如，四捨五入、測量或其他系統誤差、製造公差等）不會改變最低有效數位(least significant digit)之變化。

如本文中所使用，用語「單離(isolated)」意指生物組分（諸如核酸、肽、或蛋白質）已經與該組分所天然出現於內之生物體中的其他生物組分（即其他染色體及染色體外DNA和RNA、及蛋白質）實質上分離、與該等其他生物組分分開生產、或自該等其他生物組分純化出來。已「單離(isolated)」之核酸、肽及蛋白質因而包括藉由標準純化方法所純化之核酸及蛋白質。「單離(isolated)」核酸、肽及蛋白質可為組成物之一部分且仍為單離，只要該組成物並非該核酸、肽、或蛋白質之原生環境的一部分。該用語亦包含藉由在宿主細胞中重組表現所製備之核酸、肽及蛋白質以及化學合成之核酸。

如本文中所使用，用語「多核苷酸(polynucleotide)」同義地稱為「核酸分子(nucleic acid molecule)」、「核苷酸(nucleotide)」、或「核酸(nucleic acid)」，係指任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸，其可為未經修飾之RNA或DNA、或經修飾之RNA或DNA。「多核苷酸(polynucleotide)」包括但不限於單股及雙股DNA、為單股及雙股區之混合物的DNA、單股及雙股RNA、及為單股及雙股區之混合物的RNA、包含可為單股或（更典型地）雙股或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA之混成分子。此外，「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。用語多核苷酸亦包括含有一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有為了穩定性或其他理由經修飾之主鏈的DNA或RNA。「經修飾(modified)」鹼基包括例如三苯甲基化(tritylated)鹼基及不常見鹼基諸如肌苷(inosine)。可對DNA及RNA進行各種修飾；因此，「多核苷酸(polynucleotide)」包含典型在自然界所發現之經化學、酶、或代謝修飾之多核苷酸形式，以及病毒和細胞所特有之DNA及RNA的化學形式。「多核苷酸(polynucleotide)」亦包含相對短之核酸鏈，其通常稱為寡核苷酸。

如本文中所使用，用語「載體(vector)」是一種複製子(replicon)，可將另一個核酸區段可操作地插入其中，從而使該區段複製或表現。

如本文中所使用，用語「宿主細胞(host cell)」係指包含本發明之核酸分子之細胞。「宿主細胞(host cell)」可為任何類型的細胞，例如初代細胞、培養中之細胞、或來自細胞系之細胞。在一實施例中，「宿主細胞(host cell)」是用本發明之核酸分子轉染或轉導之細胞。在另一實施例中，「宿主細胞」是此經轉染或轉導之細胞之後代或潛在後代。細胞的後代可能因為例如發生在後繼世代或核酸分子整合至宿主細胞基因體時可能發生的突變或環境影響，而與親代細胞同一或不同一。

如本文所使用，用語「表現(expression)」係指基因產物之生物合成。該用語涵蓋將基因轉錄成RNA。該用語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多肽，並且進一步涵蓋所有天然發生之轉錄後及轉譯後修飾。

如在本文中所使用之用語「抗體(antibody)」係以廣義的方式意指並包括免疫球蛋白分子，其包括單株抗體（包括鼠類、人類、人源化、及嵌合單株抗體）、抗原結合片段、多特異性抗體（諸如雙特異性、三特異性、四特異性等）、二聚體、四聚體、或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體、及任何其他包含具有所需特異性之抗原結合部位的免疫球蛋白分子之修飾構形。「全長抗體(full length antibody)」包含藉由雙硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)以及其多聚體（例如IgM）。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區（包含域CH1、鉸鏈、CH2、及CH3）。每條輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。VH區及VL區可進一步細分成散佈於架構區(FR)中的多個高度變異區，其被稱為互補決定區(CDR)。各VH及VL係由三個CDR及四個FR鏈段所構成，依下列順序自胺基至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。取決於重鏈恆定域胺基酸序列，免疫球蛋白可分成五個主要類別IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM。IgA及IgG係進一步被細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可被分為兩種明確不同類型（即kappa (κ)及lambda (λ)）中之一者，其視其恆定域的胺基酸序列而定。

如在本文中所使用之用語「單株抗體(monoclonal antibody)」係指自實質上均一的抗體分子群體獲得之抗體，亦即，除了可能熟知之改變之外包含該群體之個別抗體係同一的，該等改變諸如從抗體重鏈移除C端離胺酸或轉譯後修飾，諸如胺基酸異構化或脫醯胺化、甲硫胺酸氧化或天冬醯胺酸或麩醯胺酸脫醯胺化。單株抗體一般結合一種抗原表位。雙特異性單株抗體會結合兩種不同的抗原表位。單株抗體在抗體群內可具有異源醣基化。單株抗體可係單特異性或多特異性的（諸如雙特異性的）、單價、二價、或多價的。

如在本文中所使用之用語「人類抗體(human antibody)」係指經最佳化以在投予至人類對象時具有最小免疫反應之抗體。人類抗體之可變區係衍生自人類免疫球蛋白序列。若人類抗體含有恆定區或恆定區的一部分，則該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。如果該人類抗體的可變區係得自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重及輕鏈可變區。此類例示性系統係經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫、及基因轉殖非人類動物（諸如帶有人類免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠）。當相較於人類中表現之免疫球蛋白時，「人類抗體」一般含有胺基酸差異，此係由於用於獲得人類抗體及人類免疫球蛋白基因座之系統之間的差異、引入體細胞突變、或向架構或CDR或兩者中刻意引入取代。一般而言，「人類抗體」在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況下，「人類抗體(human antibody)」可含有自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如在Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86中所述，或併入經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如在Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96及國際專利公開號WO2009/085462中所述。至少一種CDR係衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。

如在本文中所使用之用語「人源化抗體(humanized antibody)」係指至少一個CDR係衍生自非人類物種且至少一個架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可在架構中包括取代，所以該等架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或人類免疫球蛋白生殖系基因序列的確切複製物。

用語「經單離之抗體(isolated antibody)」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學物的抗體，且涵蓋經單離成更高純度的抗體，諸如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純度。

如在本文中所使用之用語「抗原結合片段(antigen binding fragment)」或「抗原結合域(antigen binding domain)」係指結合抗原之免疫球蛋白分子之一部分。抗原結合片段可為合成的、可酶促獲得的、或經基因工程改造之多肽，且包括VH、VL、VH及VL、Fab、F(ab')2、Fd、及Fv片段、由一個VH域或一個VL域所組成之域抗體(dAb)、鯊可變IgNAR域(shark variable IgNAR domain)、駱駝化VH域、由模擬抗體之CDR（諸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3、以及LCDR1、LCDR2、及/或LCDR3）的胺基酸殘基所組成之最小識別單元。VH域及VL域可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域可進行分子內配對，或者在VH域及VL域係由分開之單鏈抗體建構體所表現之情況下可進行分子間配對，以形成單價抗原結合部位，諸如單鏈Fv (scFv)或雙鏈抗體(diabody)；例如描述於下列中者：國際專利申請案公開號WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804及WO1992/01047。

用語「雙特異性(bispecific)」係指特異性地結合二種不同抗原或相同抗原內兩個不同表位的抗體。雙特異性抗體可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種（諸如人類或猴）的相同抗原（同源物(homolog)）具有交叉反應性，例如食蟹獼猴(Macaca cynomolgus, cynomolgus, cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes)，或者可以結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。

如在本文中所使用之用語「多特異性(multispecific)」係指特異性地結合少二種不同抗原或相同抗原內之至少兩個不同表位的抗體。多特異性抗體可結合例如二、三、四或五種不同抗原或在相同抗原內不同的表位。

當「特異性結合(specific binding)」或「免疫特異性結合(immunospecific binding)」或其衍生用語在提及抗體、或抗體片段時使用，代表經由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所編碼之域結合至所關注蛋白質之一或多個表位，並且在含有混合分子群體之樣本中不會優先結合其他分子。典型而言，抗體以小於約1x10^-8 M之K_d 結合至同源(cognate)抗原，如由表面電漿共振測定或細胞結合測定所測得者。

用語「癌症(cancer)」係指一群廣泛的各種疾病，其特徵在於身體中異常細胞的不受控制生長。未經調節之細胞分裂及生長導致侵犯鄰近組織的惡性腫瘤形成且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體的遠距部分。「癌症(cancer)」或「癌症組織(cancer tissue)」可包括腫瘤。

如在本文中所使用之用語「組合(combination)」意指二或更多種治療劑一起以混合物形式投予至對象、同時以單劑投予、或以任何順序以單劑依序投予。

如在本文中所使用之用語「增強(enhance)」或「增強的(enhanced)」係指測試分子之一或多種功能相較於對照分子增強，或測試分子之組合的一或多種功能相較於一或多個對照分子增強。可測量之例示性功能係腫瘤細胞殺滅、T細胞活化、相對或絕對T細胞數量、Fc介導之效應物功能（例如ADCC、CDC及/或ADCP）或結合至Fcγ受體(FcγR)或FcRn。「增強」可為約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多之增強、或統計上顯著的增強。

如在本文中所使用之用語「突變(mutation)」係指當相較於參考序列時，多肽或多核苷酸序列中之經工程改造或天然發生的改變。改變可為取代、插入或缺失一或多個胺基酸或多核苷酸。

如在本文中所使用之用語「非固定組合(non-fixed combination)」係指T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑之分開醫藥組成物，其作為分開實體在沒有特定間隔時間限制的情況下同時、並行、或依序投予，其中此投予提供兩種化合物在對象之身體內的有效水準。

如在本文中所述之用語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指包含活性成分及醫藥上可接受之載劑之組成物。

如在本文中所述之用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」或「賦形劑(excipient)」係指活性成分以外之醫藥組成物中的成分，其對對象係無毒的。

如在本文中所述之用語「重組(recombinant)」係指當來自不同來源的鏈段經連接以生產重組DNA、抗體、或蛋白質時，藉由重組手段來製備、表現、建立、或單離的DNA、抗體、及其他蛋白質。

如在本文中所述之用語「減少(reduce)」或「減少的(reduced)」係指測試分子之一或多種功能相較於對照分子減少，或測試分子之組合的一或多種功能相較於一或多個對照分子減少。可測量之例示性功能係腫瘤細胞殺滅、T細胞活化、相對或絕對T細胞數量、Fc介導之效應物功能（例如ADCC、CDC及/或ADCP）或結合至Fcγ受體(FcγR)或FcRn。「減少的」可為約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多之減少、或統計上顯著的增強。

如在本文中所使用之用語「難治性(refractory)」係指不適用於手術介入且初步對療法無反應之癌症。

如在本文中所述之用語「復發(relapsed)」係指對治療有反應但接著回復的癌症。

如在本文中所述之用語「對象(subject)」包括任何人類或非人類動物。「非人類動物(nonhuman animal)」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、爬蟲類等。除非另有說明，用語「患者(patient)」或「對象(subject)」可互換使用。

如在本文中所使用之用語「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指有效達成所欲治療成果所需之劑量及時間段的量。治療有效量可依不同因素而異，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在個體中誘發所欲反應的能力。有效的治療劑或治療劑組合之例示性指標包括例如患者之幸福感改善。

如在本文中所使用之用語「治療(treat/treatment)」係指治療性治療及預防性或防治性措施兩者，其中目標係預防或減緩（減輕）非所欲的生理變化或病症。有益或所欲之臨床成果包括緩解症狀、減小疾病程度、使疾病進入穩定化（即不惡化）狀態、延緩或減慢疾病進程、改善或緩和疾病狀態、及緩解（無論部分或完全），無論可偵測或不可偵測。「治療」亦可意指相較於未接受治療之對象之預期存活而延長存活。該等有治療需要的包括該等已具有狀況或病症的，以及該等易患有狀況或病症的，或者該等要防治狀況或病症的。

如在本文中所使用之用語「腫瘤細胞(tumor cell)」或「癌細胞(cancer cell)」係指在體內、離體、或在組織培養物中具有自發或誘發之表型改變的癌性(cancerous)、癌前(pre-cancerous)、或轉化細胞。這些變化不一定涉及新遺傳物質的攝取。儘管轉化可能來自轉化病毒的感染及新基因組核酸的摻入或外源核酸的攝取，其也可以自發地發生或在暴露於致癌物後發生，從而突變內源基因。轉化/癌症的例子如下：在體外、體內、及離體的形態變化、細胞永生化、異常的生長控制、病灶形成、增殖、惡性腫瘤、腫瘤特異性標記水平的調節、侵襲性、在合適的動物宿主例如裸鼠中的腫瘤生長等等。T 細胞重導向治療劑

在本文中揭示之T細胞重導向治療劑（在整個本申請案，其亦稱為「T細胞重導向雙特異性抗體(T cell redirecting bispecific antibody)」或「雙特異性抗體(bispecific antibody)」）係指含有二或更多個結合區之分子，其中一個結合區與目標細胞或組織上之細胞表面抗原（諸如腫瘤相關抗原(TAA)）特異性地結合且其中分子之第二結合區與T細胞表面抗原（諸如CD3）特異性地結合。此雙/多目標結合能力招募T細胞至目標細胞或組織，導致根除目標細胞或組織。

在本文中所使用之T細胞重導向治療劑可為抗體、衍生自抗體之蛋白質、或例如展現抗原結合部位之重組蛋白。在一實施例中，在本文中所使用之T細胞重導向治療劑係雙特異性抗體，其涵蓋「完整的(whole)」抗體（諸如，完整的IgG或類IgG分子）及小的重組型式（諸如，串聯單鏈可變片段分子(tandem single chain variable fragment molecule, taFv)、雙抗體(diabody, Db)、單鏈雙抗體(single chain diabody, SDb)、及此等之各種其他衍生物（參見如Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11): 621-632所述之雙特異性抗體型式，其中圖2顯示各種雙特異性抗體型式；Weidle U. H. et al. (2013) Cancer Genomics and Proteomics 10: 1-18，特別是圖1顯示各種雙特異性抗體型式；及Chan, A. C. and Carter, P. J. (2010) Nat Rev Immu 10: 301-316，其中圖3顯示各種雙特異性抗體型式）。雙特異性抗體型式之實例包括但不限於四源融合瘤(quadroma)、化學耦合之Fab（片段抗原結合）、及BiTE®（雙特異性T細胞接合體）。

在一實施例中，在本文中所使用之雙特異性抗體可選自包含以下之群組：Triomab；混成融合瘤（四源融合瘤）；多特異性抗運載蛋白(anticalin)平台(Pieris)；雙抗體；單鏈雙抗體；串聯單鏈Fv片段；TandAb，三特異性Ab (Affimed)（105至110 kDa）; Dart（雙親和性重靶向；Macrogenics）；雙特異性Xmab (Xencor)；雙特異性T細胞接合體(Bites; Amgen; 55 kDa)；三重體(Triplebody)；三抗體=Fab-scFv融合蛋白(CreativeBiolabs)多功能性重組抗體衍生物(110 kDa)；Duobody平台(Genmab)；塢與鎖(dock and lock)平台；鈕扣(knob into hole, KIH)平台；人源化雙特異性IgG抗體(REGN1979) (Regeneron)；Mab2雙特異性抗體(F-Star)；DVD-Ig=雙可變域免疫球蛋白(Abbvie)；κ-λ抗體；四價雙特異性串聯Ig；及CrossMab。

在進一步實施例中，如在本文中所使用之雙特異性抗體可選自雙特異性類IgG抗體(BsIgG)，其包含CrossMab；DAF（二合一）；DAF（四合一）；DutaMab；DT-IgG；鈕扣常見LC；鈕扣總成；電荷配對；Fab-臂交換；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；κλ-體；及正交Fab。此等雙特異性抗體型式係顯示且描述於例如Spiess C., Zhai Q. and Carter P. J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106，特別是圖1及例如第95至101頁之對應的敘述。

在又進一步實施例中，在本文中所使用之雙特異性抗體可選自具有額外抗原結合部份之附加IgG之抗體，該附加IgG之抗體包含DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zy體；及DVI-IgG（四合一）。此等雙特異性抗體型式係顯示且描述於例如Spiess C., Zhai Q. and Carter P. J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106，特別是圖1及例如第95至101頁之對應的敘述。

在又進一步實施例中，如在本文中所使用之雙特異性抗體可選自雙特異性抗體片段，其包含奈米抗體(nanobody)；奈米抗體-HAS；BiTE；雙抗體；DART；TandAb；sc雙抗體；sc-雙抗體-CH3；雙抗體-CH3；三重體；微型抗體；微型體；TriBi微型體；scFv-CH3 KIH；Fab-scFv；scFv-CH-CL-scFv；F(ab’)2；F(di)2-scFv2；scFv-KIH；Fab-scFv-Fc；四價HCAb；sc雙抗體-Fc；雙抗體-Fc；串聯scFv-Fc；及胞內抗體。此等雙特異性抗體型式係顯示且描述於例如Spiess C., Zhai Q. and Carter P. J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106，特別是圖1及例如第95至101頁之對應的敘述。

在又進一步實施例中，如在本文中所使用之雙特異性抗體可選自雙特異性融合蛋白，其包含塢與鎖；ImmTAC；HSA體(HSAbody)；sc雙抗體-HAS；及串聯scFv-毒素。此等雙特異性抗體型式係顯示且描述於例如Spiess C., Zhai Q. and Carter P. J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106，特別是圖1及例如第95至101頁之對應的敘述。

在又進一步實施例中，如在本文中所使用之雙特異性抗體可選自雙特異性抗體偶聯物，其包含IgG-IgG；Cov-X-體；及scFv1-PEG-scFv2。此等雙特異性抗體型式係顯示且描述於例如Spiess C., Zhai Q. and Carter P. J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106，特別是圖1及例如第95至101頁之對應的敘述。

在又進一步實施例中，在本文中所使用之雙特異性抗體可基於任何免疫球蛋白類別（例如IgA、IgG、及IgM等）及子類別（例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等）。在態樣中，在本文中所使用之雙特異性抗體可具有類IgG型式（基於IgG，亦稱為「IgG型(IgG type)」），其通常包含兩個重鏈及兩個輕鏈。具有類IgG型式之抗體之實例包括四源融合瘤及各種IgG-scFv型式（參見：Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11): 621-632；圖2A至E），藉此四源融合瘤係較佳，其較佳係藉由兩種不同的融合瘤的融合所產生。在IgG類別裡，雙特異性抗體可基於IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4子類別。

在又進一步實施例中，在本文中所使用之雙特異性抗體係呈類IgG抗體型式，其包含例如混成融合瘤（四源融合瘤）、具有共同輕鏈之鈕扣、各種IgG-scFv型式、各種scFv-IgG型式、二合一IgG、雙V域IgG、IgG-V、及V-IgG，其等係例如於Chan, A. C. and Carter, P. J. (2010) Nat Rev Immu 10: 301-316之圖3c所示且描述於該文章中。進一步例示性雙特異性類IgG抗體型式，包括，例如DAF、CrossMab、IgG-dsscFv、DVD、IgG-dsFV、IgG-scFab、scFab-dsscFv、及Fv2-Fc，其等係例如於Weidle U. H. et al. (2013) Cancer Genomics and Proteomics 10: 1-18之圖1A所示且描述於該文章中。在又進一步的例示性雙特異性類IgG抗體型式包括DAF（二合一）；DAF（四合一）；DutaMab；DT-IgG；鈕扣總成；電荷配對；Fab-臂交換；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；κλ-體；正交Fab；DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zy體；及DVI-IgG（四合一）係顯示且描述於例如Spiess C., Zhai Q. and Carter P. J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106，特別是圖1及例如第95至101頁之對應的敘述。

例如，雙特異性抗體可藉由三種不同方法來產生：(i)化學偶聯，其涉及化學交聯；(ii)兩種不同融合瘤細胞系之融合；或(iii)涉及重組DNA技術之基因方法。兩種不同融合瘤之融合產生分泌包括雙特異性分子之非均質(heterogeneous)抗體群體之混成融合瘤（或「四源融合瘤」）。替代的方法包括兩種不同mAbs及/或較小抗體片段之化學偶聯。因為多個天然雙硫鍵之再氧化期間存在副反應，發現連結兩種不同抗體或抗體片段之氧化再締合策略不足。目前用於化學偶聯的方法聚焦於使用同源雙官能性交聯劑或異源雙官能性交聯劑。重組DNA技術已通過人工操縱基因產出最大範圍之雙特異性抗體，且代表用於雙特異性抗體產生之最多樣化方法（在過去二十年有45個型式；參見Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11): 621-632）。

特別是藉由使用此類重組DNA技術，近來亦出現各種進一步的多特異性抗體。用語「多特異性抗體(multispecific antibody)」係指具有多於一個互補位及結合至二或更多個不同表位之能力之蛋白。因此，用語「多特異性抗體(multispecific antibody)」包含如上定義之雙特異性抗體，但一般亦係蛋白質（例如，特別是結合至三或更多個不同表位之抗體、支架，亦即，具有三或更多個互補位之抗體）。此類多特異性蛋白質（特別是具有三或更多個互補位）一般係藉由重組DNA技術來達成。在本發明的上下文中，該抗體可特別具有多於兩種特異性，且因此，多於兩個互補位，因為根據本發明需要至少兩個互補位，例如一個用於目標細胞及另一個用於T細胞。因此，除了兩個互補位以外，根據本發明之抗體還可具有進一步的互補位，特別是關於進一步的特異性。因此，本發明亦包含多特異性抗體。因此，應瞭解本發明不限於雙特異性抗體，雖然在本文中特別指雙特異性抗體，其表示最小需求。因此，本文中關於雙特異性抗體的說明也可以適用於多特異性抗體。

如上所定義之雙特異性抗體及多特異性抗體能夠使效應細胞針對在疾病過程中扮演重要角色的目標細胞重導向。具體而言，在本文中所使用之T細胞重導向雙特異性抗體可例如結合至T細胞受體(T cell receptor, TCR)複合物及將T細胞「重導向」至目標細胞（諸如例如腫瘤細胞）。為此，在本文中所使用之此類雙特異性抗體一般具有至少一種針對T細胞特異（較佳的是針對T細胞表面抗原（例如CD3）特異）之用於招募T細胞之特異性、以及至少另一種針對腫瘤細胞特異（較佳的是腫瘤細胞上之TAA）之將T細胞導向腫瘤細胞之特異性（例如至少一個互補位）。藉由T細胞重導向雙特異性抗體將T細胞「重導向」至腫瘤細胞一般導致T細胞介導的腫瘤細胞殺滅。

在一實施例中，在本文所使用之T細胞重導向治療劑包含具有針對T細胞表面抗原之特異性之第一結合區、及具有針對在腫瘤細胞上之TAA之特異性之第二結合區。

在進一步實施例中，T細胞表面抗原可選自CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、CD137、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、以及NKG2C。或者，T細胞表面抗原係CD3。

在又進一步實施例中，TAA可選自係B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen, BCMA)、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD10、CD21、CD22、CD25、CD30、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD52、CD133、ROR1、B7-H6、B7-H3、HM1.24、SLAMF7、Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT-3, CD135)、硫酸軟骨素蛋白多糖4（CSPG4、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白多糖）、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、Her2、Her3、IGFR、IL3R、纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、CDCP1、Derlin1、腱生蛋白(tenascin)、捲曲蛋白(frizzled) 1至10、VEGFR2 (KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4, CD309)、PDGFR-α (CD140a)、PDGFR-β (CD140b)、內皮糖蛋白(endoglin)、CLEC14、Tem1-8、或Tie2。進一步例示性的腫瘤細胞上之TAA包括A33、CAMPATH-1 (CDw52)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、碳酸酐酶IX (MN/CA IX)、de2-7、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、葉酸結合蛋白、G250、c-Kit (CD117)、CSF1R (CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受體、IL3R、MCSP（黑色素瘤相關細胞表面硫酸軟骨素蛋白多糖）、Muc-1、前列腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)、前列腺特異性抗原(prostate stem cell antigen, PSA)、hK2、TAG-72、或腫瘤細胞新抗原。或者，TAA可選自BCMA、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38、及SLAMF7。或者，TAA可係選自BCMA或CD123。

在一實施例中，T細胞重導向治療係免疫特異性地結合至BCMA⁺ MM細胞及CD3 T細胞之BCMAxCD3雙特異性抗體。BCMAxCD3雙特異性抗體可選自彼等揭示於以下者：WO2007117600、WO2009132058、WO2012066058、WO2012143498、WO2013072406、WO2013072415、WO2014122144、及US10,072,088，其全文係以引用方式併入本文中。

在一實施例中，BCMAxCD3雙特異性抗體係雙特異性DuoBody®抗體，其係揭示於US10,072,088，其全文係以引用方式併入本文中。BCMAxCD3雙特異性抗體包含第一重鏈(HC1)、第一輕鏈(LC1)、第二重鏈(HC2)、及第二輕鏈(LC2)，其中HC1及LC1配對形成免疫特異性地結合BCMA之第一抗原結合部位，且HC2及LC2配對形成免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。在一實施例中，BCMAxCD3抗體包含具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之HC1、具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之LC1、具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之HC2、及具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的LC2，其中HC1及LC1配對形成免疫特異性地結合BCMA之第一抗原結合部位，且HC2及LC2配對形成免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。在一實施例中，BCMAxCD3抗體包含具有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之HC1、具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之LC1、具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之HC2、及具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的LC2，其中HC1及LC1配對形成免疫特異性地結合BCMA之第一抗原結合部位，且HC2及LC2配對形成免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。

在一實施例中，T細胞重導向治療劑係免疫特異性地結合至CD123⁺ AML細胞及CD3 T細胞之CD123xCD3雙特異性抗體。CD123xCD3雙特異性抗體可係雙特異性DuoBody®抗體，如彼等揭示於US9,850,310中者，其全文係以引用方式併入本文中。在一實施例中，CD123xCD3抗體包含具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之HC1、具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之LC1、具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之HC2、及具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的LC2，其中HC1及LC1配對形成免疫特異性地結合CD123之第一抗原結合部位，且HC2及LC2配對形成免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。 SEQ ID NO: 1 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSISKNSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSMYYSGSTYYNSSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGGASIFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 2 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDMDACWYQQRPGQSPVVVIYQDSERPSGIPERFAGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 4 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 5 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 6 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 7 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 8 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 9 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNAYATYYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 10 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSVLA-4 黏附路徑抑制劑

非常晚期抗原-4 (very late antigen-4, VLA-4)亦稱為α4β1，係細胞表面受體之β1整合素家族之成員。VLA-4含有α4鏈及β1鏈，且涉及細胞-細胞交互作用。其表現主要限於淋巴細胞及骨髓細胞。其係細胞黏附之關鍵因素。研究亦顯示，VLA-4在BM中介導AML/MM-基質交互作用中扮演重要角色。血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)（由造骨細胞及內皮細胞所表現）及纖維連接蛋白（細胞外基質之組分）為VLA-4的兩個配體。

在本文中所使用之VLA-4黏附路徑抑制劑可為能夠阻斷VLA-4介導之黏附路徑之任何分子。

例如，在本文中所使用之VLA-4黏附路徑抑制劑可為抗VLA-4抗體或自抗VLA-4抗體製備之VLA-4結合片段，諸如Fab、Fab’、F(ab’)2、及F(v)片段；重鏈單體或二聚體；輕鏈單體或二聚體；及由一個重鏈及一個輕鏈所組成之二聚體亦為在本文中所設想。此類抗體片段可藉由化學方法（例如藉由蛋白酶（諸如胃蛋白酶或木瓜酶）切割完整抗體）、或經由重組DNA技術（例如藉由使用截短之重鏈基因及/或輕鏈基因轉化之宿主細胞）而產生。藉由以還原劑（諸如二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇）治療完整抗體，或藉由使用以編碼所欲重鏈或輕鏈或兩者、或諸如，單株抗體或其抗體片段之DNA轉化之宿主細胞，而可類似地產生重鏈單體或輕鏈單體。

在本文中可使用之能夠阻斷VLA-4介導之黏附路徑之任何合適的抗VLA-4抗體或VLA-4結合片段可包括但不限於那他珠單抗(natalizumab)及彼等揭示於美國專利第6,602,503號及美國專利申請公開案第US20140161794 A1號中者，其全文係以引用方式併入本文中。

在某些實施例中，在本文中所使用之VLA-4黏附路徑抑制劑可為能夠阻斷VLA-4介導之黏附路徑之VLA-4拮抗劑。在本文中所使用之例示性VLA-4拮抗劑包括但不限於來自Tocris Bioscience之VLA-4拮抗劑（例如BIO1211、TCS2314、BIO5192、及TR14035）。

因為VCAM-1與纖維連接蛋白是VLA-4的配體，VLA-4黏附路徑抑制劑亦可包括VCAM-1或纖維連接蛋白之拮抗劑（包括抗體）。醫藥組成物

在本文中進一步揭示醫藥組成物，其包含如上揭示之T細胞重導向治療劑、及如上揭示之VLA-4黏附路徑抑制劑、及醫藥上可接受之載劑。本發明之多核苷酸、多肽、宿主細胞、及/或經工程改造之免疫細胞、及包含彼等之組成物亦可用於製造用於本文中提及之治療應用的藥劑。在某些實施例中，醫藥組成物係包含如上揭示之T細胞重導向治療劑、及如上揭示之VLA-4黏附路徑抑制劑、及醫藥上可接受之載劑之分開的組成物。在其他實施例中，醫藥組成物不是分開的組成物，且該醫藥組成物包含如上揭示之T細胞重導向治療劑、及如上揭示之VLA-4黏附路徑抑制劑、及醫藥上可接受之載劑。

本文中所使用之用語「載劑(carrier)」係指任何賦形劑、稀釋劑、填充料、鹽、緩衝劑、穩定劑、助溶劑、油、脂質、含脂質囊泡、微球、脂質體包封、或其他所屬技術領域中已知用於醫藥配方之材料。將理解載劑、賦形劑或稀釋劑之特徵將取決於特定應用之投予途徑而定。本文中所使用之用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」係指不干擾根據本發明之組成物的有效性或根據本發明之組成物的生物活性之非毒性材料。根據鑒於本揭露之具體實施例，任何適合用於多核苷酸、多肽、宿主細胞、及/或經工程改造之免疫細胞的醫藥組成物之醫藥上可接受之載劑可用於本發明。

醫藥活性成分與醫藥上可接受之載劑的配方係所屬技術領域中已知，例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy（例如第21版(2005)、及任何之後的版本）。額外成分之非限制性實例包括：緩衝劑、稀釋劑、溶劑、張力調節劑、保存劑、穩定劑、及螯合劑。一或多種醫藥上可接受之載劑可用於配製本發明之醫藥組成物。

在本揭露之實施例中，醫藥組成物係液體配方。液體配方之較佳實例係水溶液配方，即包含水之配方。液體配方可包含溶液、懸浮液、乳液、微乳液、凝膠、及類似者。

在一實施例中，醫藥組成物可調製成可例如經由注射裝置（例如注射器或輸注泵）注射之注射用劑。例如，注射可經皮下、肌內、腹膜內、玻璃體內(intravitreally)、或靜脈內遞送。

在另一實施例中，醫藥組成物係固體配方，例如冷凍乾燥或噴霧乾燥組成物，其可照原樣使用，或在使用前由醫師或患者添加溶劑、及/或稀釋劑至其中。使用方法

在另一大致態樣中，本發明係關於一種治療有需要之對象之癌症之方法，其包含投予醫藥組成物至該對象，該醫藥組成物包含在本文中揭示之T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑。

在另一大致態樣中，本發明係關於一種殺滅癌細胞之方法，其包含使該癌細胞經受組成物，該組成物包含在本文中揭示之T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑。

對象可具有新確診之癌症，或對於先前的抗癌療法係復發或難治的。癌症可係血液惡性疾病或實體腫瘤。

根據本發明之實施例，醫藥組成物包含治療有效量之在本文中揭示之T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑。如本文中所使用，用語「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指活性成分或組分在對象中引起所欲生物或醫學反應之量。治療有效量可以憑經驗且以常規方式參考所述目的來判定。

如在本文中參照T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑所使用，治療有效量意指調節有需要之對象之免疫反應之T細胞重導向治療劑與VLA-4黏附路徑抑制劑之組合之量。又，如在本文中參照T細胞重導向治療劑所使用，治療有效量意指T細胞重導向治療劑與VLA-4黏附路徑抑制劑導致下列之量：疾病、病症、或病況的治療；預防或減緩疾病、病症、或病況的進展；或者減少或完全緩解與疾病、病症、或病況相關之症狀。

治療有效量或劑量可根據各種因子變化，諸如所欲治療之疾病、病症或病況、投予手段、標靶部位、對象之生理狀態（包括例如年齡、體重、健康）、對象係人類抑或動物、其他投予藥物、及治療係疾病預防性抑或治療性。治療劑量經最佳地滴定以最佳化安全性及功效。

根據具體實施例，本文所述之組成物係配製成適用於對象的預期投予途徑。例如，本文中所述之組成物可配製成適用於靜脈內、皮下、或肌內投予。

如本文中所使用，用語「治療（treat、treating、及treatment）」皆意欲指改善或逆轉至少一個與癌症有關的可測量物理參數，該物理參數未必可在對象中覺察，但可係在對象中可覺察的。用語「治療」亦可指造成疾病、病症、或病況消退、預防疾病、病症、或病況進展、或至少延緩疾病、病症、或病況之進展。在一具體實施例中，「治療」係指減輕一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀、預防一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀的發展或開始、或減少一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀的持續期間，該疾病、病症、或病況諸如腫瘤或更加的是癌症。在一具體實施例中，「治療」係指預防疾病、病症、或病況之復發。在一具體實施例中，「治療」係指增加具有疾病、病症、或病況之對象的存活。在一具體實施例中，「治療」係指排除對象之疾病、病症、或病況。

根據具體實施例，所提供者係用於治療癌症的醫藥組成物。針對癌症療法，所提供之醫藥組成物可與另一治療組合使用，該治療包括但不限於化療、抗CD20 mAb、抗TIM-3 mAb、抗LAG-3 mAb、抗EGFR mAb、抗HER-2 mAb、抗CD19 mAb、抗CD33 mAb、抗CD47 mAb、抗CD73 mAb、抗DLL-3 mAb、抗脂肪細胞因子(apelin) mAb、抗TIP-1 mAb、抗FOLR1 mAb、抗CTLA-4 mAb、抗PD-L1 mAb、抗PD-1 mAb、其他免疫腫瘤藥物、抗血管生成劑、放射療法、抗體藥物偶聯物(antibody-drug conjugate, ADC)、標靶治療、或其他抗癌藥。

根據具體實施例，治療有需要之對象之癌症之方法包含投予在本文中揭示之T細胞重導向治療劑與VLA-4黏附路徑抑制劑之組合至該對象。

本文中所使用之在向對象投予二或更多種療法上下文中之用語「組合(in combination)」係指使用超過一種療法。用語「組合」之使用並不限制向對象投予療法之順序。例如，第一療法（例如在本文中所述之T細胞重導向治療劑）可在投予第二療法（例如VLA-4黏附路徑抑制劑）至對象之前（例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、或12週前）、之同時、或之後（例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週之後）投予。套組

在另一大致態樣中，在本文中提供套組、單位劑量、及製品，其等包含在本文中揭示之T細胞重導向治療劑、在本文中揭示之VLA4黏附路徑抑制劑、及可任選地醫藥載劑。在某些實施例中，較佳的是套組提供使用說明。

在另一具體態樣中，在本文中提供套組，其包含(1)在本文中揭示之T細胞重導向治療劑、及(2)在本文中揭示之VLA-4黏附路徑抑制劑。

在另一具體態樣中，在本文中提供包含醫藥組成物之套組，該醫藥組成物包含醫藥上可接受之載劑、及(1)在本文中揭示之T細胞重導向治療劑、及(2)在本文中揭示之VLA-4黏附路徑抑制劑。實施例

本發明之實施例1包括醫藥組成物，其包含T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑，其中該T細胞重導向治療劑包含免疫特異性地結合T細胞表面抗原之第一結合區及免疫特異性地結合腫瘤相關抗原(TAA)之第二結合區。

本發明之實施例2包括如實施例1所述之醫藥組成物，其進一步包含醫藥上可接受之載劑。

本發明之實施例3包括如實施例1或2所述之醫藥組成物，其中該T細胞重導向治療劑係抗體或其抗原結合片段。

本發明之實施例4包括如實施例1至3中任一者所述之醫藥組成物，其中該T細胞表面抗原係選自由以下所組成之群組：CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、CD137、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、以及NKG2C。

本發明之實施例5包括如實施例4所述之醫藥組成物，其中該T細胞表面抗原係CD3。

本發明之實施例6包括如實施例1至5中任一者所述之醫藥組成物，其中該TAA係選自由以下所組成之群組：BCMA、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38、以及SLAMF7。

實施例7包括如實施例6所述之醫藥組成物，其中該T細胞重導向治療劑係BCMAxCD3雙特異性抗體，該BCMAxCD3雙特異性抗體具有免疫特異性地結合BCMA之第一抗原結合部位及免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。

實施例8包括如實施例7所述之醫藥組成物，其中該BCMAxCD3雙特異性抗體包含第一重鏈(HC1)、第一輕鏈(LC1)、第二重鏈(HC2)、及第二輕鏈(LC2)，且其中該HC1及該LC1配對形成該第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成該第二抗原結合部位。

實施例9包括如實施例8所述之醫藥組成物，其中該HC1包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，該LC1包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，該HC2包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及該LC2包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

實施例10包括如實施例8所述之醫藥組成物，其中該HC1包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，該LC1包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，該HC2包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及該LC2包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

本發明之實施例11包括如實施例6所述之醫藥組成物，其中該T細胞重導向治療劑係CD123xCD3雙特異性抗體，其具有免疫特異性地結合CD123之第一抗原結合部位及免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。

本發明之實施例12包括如實施例11所述之醫藥組成物，其中該CD123xCD3雙特異性抗體包含第一重鏈(HC1)、第一輕鏈(LC1)、第二重鏈(HC2)、及第二輕鏈(LC2)，且其中該HC1及該LC1配對形成該第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成該第二抗原結合部位。

本發明之實施例13包括如實施例12所述之醫藥組成物，其中該HC1包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，該LC1包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列，該HC2包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及該LC2包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。

本發明之實施例14包括如實施例1至13中任一者所述之醫藥組成物，其中該VLA-4黏附路徑抑制劑係抗VLA-4抗體或其抗原結合片段。

本發明之實施例15包括如實施例14所述之醫藥組成物，其中該抗VLA-4抗體或其抗原結合片段係選自由以下所組成之群組：單株抗體、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、及F(v)片段、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、及由一個重鏈及一個輕鏈所組成之二聚體。

本發明之實施例16包括如實施例1至13中任一者所述之醫藥組成物，其中該VLA-4黏附路徑抑制劑係VLA-4拮抗劑。

本發明之實施例17包括如實施例16所述之醫藥組成物，其中該VLA-4黏附路徑抑制劑係選自由以下所組成之群組：BIO1211、TCS2314、BIO5192、及TR14035。

本發明之實施例18包括殺滅癌細胞之方法，其包含使該癌細胞經受治療有效量之如實施例1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中癌細胞經歷某種形式之細胞死亡。

本發明之實施例19包括如實施例18所述之方法，其中該T細胞重導向治療劑及該VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

本發明之實施例20包括如實施例19所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例21包括如實施例20所述之方法，其中在該T細胞重導向治療劑之投予之後，投予該VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例22包括殺滅癌細胞之方法，其包含破壞癌細胞與基質細胞之間之細胞-細胞接觸，其包含使癌細胞經受治療有效量之如實施例1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中癌細胞經歷某種形式之細胞死亡。

本發明之實施例23包括如實施例22所述之方法，其中該T細胞重導向治療劑及該VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

本發明之實施例24包括如實施例22所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例25包括如實施例22所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之後，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

實施例26包括殺滅癌細胞之方法，其包含增加T細胞依賴性細胞毒性，其包含使癌細胞經受治療有效量之如實施例1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中癌細胞經歷某種形式之細胞死亡。

本發明之實施例27包括如實施例26所述之方法，其中T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

本發明之實施例28包括如實施例26所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例29包括如實施例26所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之後，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例30包括殺滅癌細胞之方法，其包含破壞癌細胞與基質細胞之間之細胞-細胞接觸且增加T細胞依賴性細胞毒性，其包含使癌細胞經受治療有效量之如實施例1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中癌細胞經歷某種形式之細胞死亡。

本發明之實施例31包括如實施例30所述之方法，其中T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

本發明之實施例32包括如實施例30所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例33包括如實施例30所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之後，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例34包括改變腫瘤微環境中之免疫抑制之方法，其包含使腫瘤微環境經受治療有效量之如實施例1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中在該腫瘤微環境中之免疫抑制衰減且癌細胞經歷某種形式之細胞死亡。

本發明之實施例35包括如實施例34所述之方法，其中T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

本發明之實施例36包括如實施例34所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例37包括如實施例34所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之後，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例38包括改變腫瘤微環境中之免疫抑制之方法，其包含破壞癌細胞與基質細胞之間之細胞-細胞接觸，其包含使腫瘤微環境經受治療有效量之如實施例1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中在該腫瘤微環境中之免疫抑制衰減且癌細胞經歷某種形式之細胞死亡。

實施例39包括如實施例38所述之方法，其中該T細胞重導向治療劑及該VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

本發明之實施例40包括如實施例38所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例41包括如實施例38所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之後，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例42包括改變腫瘤微環境中之免疫抑制之方法，其包含增加T細胞依賴性細胞毒性，其包含使腫瘤微環境經受治療有效量之如實施例1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中其中在該腫瘤微環境中之免疫抑制衰減且癌細胞經歷某種形式之細胞死亡。

本發明之實施例43包括如實施例42所述之方法，其中T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

本發明之實施例44包括如實施例42所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例45包括如實施例42所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之後，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例46包括改變腫瘤微環境中之免疫抑制之方法，其包含破壞癌細胞與基質細胞之間之細胞-細胞接觸且增加T細胞依賴性細胞毒性，其包含使腫瘤微環境經受治療有效量之如實施例1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中在該腫瘤微環境中之免疫抑制衰減且癌細胞經歷某種形式之細胞死亡。

本發明之實施例47包括如實施例46所述之方法，其中T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

本發明之實施例48包括如實施例46所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例49包括如實施例46所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之後，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例50包括治療有需要之對象的癌症之方法，其包含投予治療有效量之如請求項1至17中任一者所述之醫藥組成物至該對象。

本發明之實施例51包括如實施例50所述之方法，其中該對象具有新確診之癌症。

本發明之實施例52包括如實施例51所述之方法，其中該對象對先前的抗癌療法係復發或難治。

本發明之實施例53包括如實施例50至52中任一者所述之方法，其中該癌症係血液惡性疾病或實體腫瘤。

本發明之實施例54包括如實施例53所述之方法，其中該對象患有AML或MM。

本發明之實施例55包括如實施例50至54所述之方法，其中該T細胞重導向治療劑及該VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。

本發明之實施例56包括如實施例55所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之前，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例57包括如實施例55所述之方法，其中在T細胞重導向治療劑之投予之後，投予VLA-4黏附路徑抑制劑。

本發明之實施例58包括套組，其包含如請求項1至17中任一者所述之醫藥組成物。

本發明之實施例59包括套組，其包含如請求項1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物分開包裝。

本發明之實施例60包括套組，其包含如請求項1至17中任一者所述之醫藥組成物，其中該等醫藥組成物一起包裝。實例 材料及方法 抗體設計

生產靶向人類CD123及CD3或靶向人類BCMA及CD3之雙特異性抗體，其中藉由使用Genmab技術產生受控片段抗原結合臂交換，而將抗CD123抗體或抗BCMA抗體及抗CD3抗體在純化後連接在一起(17, 18)。這導致單價結合、雙功能性DuoBody®抗體，其特異性地結合至人類CD123⁺ AML或人類BCMA⁺ MM細胞、及CD3 T細胞（圖8A及圖8B）。為了使抗體介導之效應物功能最小化，將突變引入Fc域中以減少其與Fcγ受體之交互作用。用於以下實驗之雙特異性抗體（BCMAxCD3雙特異性及CD123xCD3雙特異性）包含第一重鏈(HC1)、第二重鏈(HC2)、第一輕鏈(LC1)、及第二輕鏈(LC2)，其中HC1及LC1配對形成免疫特異性地結合CD123或BCMA之第一抗原結合部位，且HC2及LC2配對形成免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。以下實例中所使用之BCMAxCD3雙特異性包含具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之HC1，具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之LC1，具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之HC2，及具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之LC2。以下實例中所使用之CD123xCD3雙特異性包含具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之HC1，具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之LC1，具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之HC2，及具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之LC2。 體外及離體細胞毒性測定

將腫瘤細胞系以羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)標示，且在基質細胞系（HS-5與HS-27a）、初代間葉基質細胞(mesencymal stromal cell, MSC)與CD105⁺ 內皮細胞之存在或不存在下，與解凍之純化冷凍T細胞共培養。24小時之後，將雙特異性抗體添加至孔，且將盤在37℃下以5%CO₂ 培養為期48小時。接著，將細胞在流動式細胞測量儀上分析之前，針對各種標記進行染色。針對跨孔相關實驗，測定係在96孔U底盤中執行，該盤具有或不具有0.4 µm跨孔插入物(HTS TRANSWL96, Corning)。針對IncuCyte®相關實驗，使用紅色螢光OCI-AML5細胞(OCI-AML5-NucLight Red)及綠色HS-5(HS-5-NucLight Green)。

針對離體測定，在添加AML周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)或MM骨髓單核細胞(bone marrow mononuclear cell, BMMC)之前，先接種HS-5細胞。添加CD123 x CD3或BCMA x CD3或空x CD3雙特異性抗體(1 µg/ml)且有或無抗VLA4抗體(5 µg/ml)。72小時之後，經由流動式細胞測量術監測CD123⁺ 母細胞或CD138⁺ MM漿細胞之耗盡。此外，評估CD8 T細胞之擴增以及其等活化狀態（CD25之上調）。 體內MOLM-13 異體移植模式

在腫瘤細胞植入前6至7天，靜脈(intravenously, iv)接種人類PBMC（1 x 107個細胞/小鼠）。在研究第0天，將小鼠皮下(subcutaneously, sc)植入1 x 106個MOLM-13細胞及兩個濃度為2 x 105及5 x 105之HS-5骨髓基質細胞。每三天(q3d)靜脈(iv)給予用CD123 x CD3（0.04 mg/kg及0.008 mg/kg，n=8）或媒劑PBS對照組(n=5)之治療，共5劑。在研究之持續期間，每週兩次監測個別小鼠之體重減輕及腫瘤生長抑制。在以VLA-4阻斷抗體之體內研究之情況下，治療係以iv給予CD123 x CD3雙特異性抗體（0.008 mg/kg，n=8或9）或PBS媒劑對照組(n=5)，且腹膜內(intraperitoneally, ip)給予抗VLA-4抗體(5 mg/kg)。無動物從分析中排除。 統計方法

將數據以GraphPad軟體Prism第8版(SAS Institutes, Cary, NC)分析。將Browne-Forsythe及Welch ANOVA測試分析應用於圖1及圖2，同時將一般2-因子ANOVA分析應用於圖3至7。 細胞系

自美國組織培養保藏中心(American Tissue Culture Collection)(Manassas, VA)獲得KG1、H929、RPMI-8226、MM.1S、HS-5、及HS-27a細胞系。自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Germany)獲得MOLM 13及OCI-AML5。自Lonza (Basel, Switzerland)購買來自正常人類捐贈者之冷凍保存之初代間葉基質細胞，且自All Cells (Alameda, California)購買CD105⁺ 骨髓內皮細胞。自Essen Bioscience (Ann Arbor, Michigan)購買IncuCyte® NucLight Green或NucLight Red Lentivirus Reagent (EF1a, Brano)，且根據製造商說明使用以產生HS-5-NucLight Green及OCI-AML5-NucLight Red細胞。將嘌呤黴素治療用以選擇螢光陽性細胞系。雖然近來細胞系未經認證，但其等針對黴漿菌污染之測試為陰性。 具有雙特異性抗體之結合測定

將所有腫瘤細胞離心，以達爾伯克磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco’s phosphate-buffered saline)洗滌兩次，及添加1×104個細胞至96孔U底盤之各孔之中央，連同添加2 mg/mL之可結晶片段(fragment crystallizable, Fc)阻斷（人類IgG1片段）為期10分鐘。將連續稀釋之雙特異性抗體添加至適當孔。將盤在37℃下，以5%CO₂ ，於暗處培養為期4小時。接著，以DPBS洗滌細胞，且藉由以小鼠抗人類IgG4（Southern Biotech，殖株HP6025，目錄號9200-09）及LIVE/DEAD（L/D；Invitrogen，目錄號L34976）染色為期30分鐘而偵測雙特異性抗體。最後，洗滌細胞，將其再懸浮於染色緩衝劑中，且在FACSCanto II流動式細胞測量儀(BD Biosciences)上分析。於Prism第7版(GraphPad)中繪製幾何平均螢光強度(geometric mean fluorescence intensity, gMFI)。X軸係經對數轉換，且施加4參數非線性曲線擬合。 細胞系之體外細胞毒性測定

將腫瘤細胞系(KG1、MOLM 13、OCI-AML5、H929、RPMI-8226、及MM.1S）計數，且以DPBS洗滌，之後在室溫下以1×107個細胞/mL之CFSH（再懸浮於150 µL二甲基亞碸中，且以1：10,000稀釋）與CFSH培養為期8分鐘。以HI FBS淬熄染色。將細胞於完全培養基中洗滌，之後於含有1 mg/mL人類IgG1片段之完全培養基中以2×10⁵ 個細胞/mL再懸浮，接著培養為期15分鐘。將純化之冷凍T細胞（獲自BioIVT (Westport, New York)）解凍，且以1×10⁶ 個細胞/mL再懸浮。藉由使用Ficoll梯度（以單離單核細胞）及在室溫下與抗體混合物（CD16、CD19、CD36、CD56、及CD66b）培養後進行負向選擇以去除「非所要(unwanted)」細胞，而自全血單離T細胞。採集基質細胞系（HS-5與HS-27a），將其洗滌，計數，及以4×10⁵ 個細胞/mL再懸浮。在初代間葉基質細胞(MSC)與CD105⁺ 內皮細胞之情況下，將分別源自Lonza及All cells之冷凍等分試樣解凍且以4×10⁵ 個細胞/mL再懸浮。最後，將50 µL之純化T細胞、50 µL之基質細胞、及100 µL之標示之腫瘤細胞在96孔U底盤之各孔中與0.5 mg/mL人類IgG1片段組合。24小時之後，將測試抗體添加至孔。將抗體在DPBS或完全培養基中稀釋至133 nM之最終起始濃度。將抗體進一步稀釋3倍，且添加至適當的孔。添加抗體後，所有盤皆在37℃下，以5% CO2培養為期48小時。接著，將細胞以DPBS洗滌，且針對各種標記進行染色，之後在流動式細胞測量儀上分析。

針對增殖實驗，如以上詳述執行體外測定，除了此處在共培養前以CFSE染料標示T細胞，因此允許藉由在添加雙特異性抗體之後96小時監測CFSE而評估增殖。

針對跨孔相關實驗，測定係在96孔U底盤中執行，該盤具有或不具有0.4 µM跨孔插入物(HTS TRANSWL96, Corning)。基質細胞係與T細胞及腫瘤細胞組合、或藉由在跨孔插入物上接種而與T細胞及腫瘤細胞分離。

針對IncuCyte®相關實驗，使用紅色螢光OCI-AML5細胞(OCI-AML5-NucLight Red)及綠色HS-5 (HS-5-NucLight Green)。將腫瘤細胞、基質細胞、及T細胞洗滌，且於用於此等測定之不含酚紅之RPMI/10% HI FBS中組合。在120小時的時程內，將每孔之紅色及綠色物體（表示紅色OCI-AML5及綠色HS-5）之影像每6小時以IncuCyte® Zoom記錄。

針對阻斷實驗，使用以下抑制劑及中和抗體：購買自R&D systems (Minneapolis, Minnesota)之Bcl-2抑制劑(HA14-1)、抗人類CXCR4 (12G5)、及抗人類ITGA4/VLA4 (2B4)抗體。 以初代AML 及MM 患者樣本進行之離體細胞毒性測定

將每孔30,000或600,000個HS-5細胞接種於6孔盤中隔夜。第二天早上，小心地除去培養基，之後在αMEM+10% FBS中，以0.5 mg/mL人類IgG1片段分別置換3x10⁶ 初代AML或MM PBMC及BMMC。接下來，添加CD123 x CD3、BCMA x CD3、或空x CD3雙特異性抗體(1 µg/ml)且有或無抗VLA4抗體(5 µg/ml)。72小時之後，經由流動式細胞測量術監測CD123⁺ 母細胞或CD138⁺ MM漿細胞之耗盡。此外，評估CD8 T細胞之擴增以及其等活化狀態（CD25之上調）。 流動式細胞測量術及抗體試劑

用於FACS之抗體包括以下抗人類抗體：CD278/ICOS (DX-29)、CD4 (SK3)、顆粒酶B (GB11)（購買自BD Biosciences）、CD8 (RPA-T8)、41BB/CD137 (4B4-1)、CD25 (BC96)、穿孔素(dG9)、Tbet (4b10)、PD-1/CD279 (EH12.2H7)、TIM3 (F38-2E2)、CD33 (WM53)、CD38 (HIT2)、CD123 (6H6)、CD138 (MI15)（購買自BioLegend）、LAG3 (3DS223H)（購買自eBiosciences）、及LIVE/DEAD Near-IR (Life Technologies)。

針對FACS分析，將盤在1500 rpm下離心，為期5分鐘。接著，將細胞以DPBS洗滌，且針對T細胞活化標記和針對細胞毒性染色，為期30分鐘。最後，將細胞洗滌，且再懸浮於染色緩衝劑中。以細胞內染色而言，根據製造商說明使用IC染色(IC Staining)套組(eBiosciences)來固定及透化細胞，只進行小幅修改（在與細胞內細胞激素抗體培養之前，以透化緩衝劑洗滌四次）。

在FACSCanto II (BD Biosciences)或LSRFortessa ((BD Biosciences)上獲取數據。藉由下列評估腫瘤細胞死亡：就前向散射(FSC)及側向散射(SSC)進行圈選以識別細胞群，接著就CFSE⁺ 腫瘤事件進行圈選，最後就LIVE/DEAD Near-IR進行圈選以評估腫瘤細胞毒性。在與PBS治療及同型對照組相比之後，繪出L/D+閘(gate)。此等對照組亦有助於考量與抗體的非特異性結合或外溢(spillover)效應有關的錯誤。藉由就FSC和SSC進行圈選以識別細胞群、CFSE^- 事件、活細胞，接著尋找針對數種標記之陽性染色，而評估T細胞活化。將死亡腫瘤細胞之百分比以Prims 8繪圖，並以4參數非線性迴歸曲線擬合來分析。針對T細胞活化標記，經由FlowJo軟體分析各種標記之幾何平均螢光強度，且使用Prism 8繪圖。 免疫墨點法及抗體試劑

根據製造商說明，使用Wes自動化系統(ProteinSimple, California, USA)執行自動西方墨點法。將樣本與含有SDS、DTT、及螢光分子量標準品之5x樣本緩衝液混合且在95℃下加熱為期5 min，且接著裝載到以堆疊及分離基質預填充之盤上，連同阻斷及洗滌緩衝劑、抗體溶液、及偵測試劑。將預設設定用於分析。將以下購買自Cell Signaling Technology (Danvers, MA)之抗人類抗體用於偵測蛋白質：Bcl-2 (#2872)、磷-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (D3F9) XP®兔mAb (#4511)、磷-Akt (Ser473) (D9E) XP®兔mAb (#4060)、及β-肌動蛋白(D6A8)兔mAb (#8457)。 動物

在雌性NSG（NOD scid gamma或NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）小鼠(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)約6至8週齡且稱重為20 g時使用。在實驗使用之前，允許所有動物適應環境並自任何運輸相關壓力中恢復最少5天。提供逆滲透(reverse osmosis, RO)氯化水與輻照食物(Laboratory Autoclavable Rodent Diet 5010, Lab Diet)自由攝食，而動物們係供養於12 h亮與暗的週期。籠子、墊草、及水瓶在使用前係經高壓蒸氣滅菌並且每週更換。所有實驗遵照實驗動物照護與使用指南(The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)，並由Janssen R&D, Spring House, PA的動物照護與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)核准。結果 BM 基質細胞保護AML 細胞系及MM 細胞系免於受到CD3 雙特異性抗體及T 細胞介導之細胞毒性

BM區位之特徵在於其保護性及免疫抑制之微環境。將BM基質細胞用於模擬BM區位，因為其等係支配基本造血幹細胞(hematopoietic stem cell, HSC)細胞命運決定（包括自我更新、存活、分化、及增殖）之骨內膜區位和血管區位之主要細胞組分(19, 20)。亦記載BM基質細胞介導免疫抑制(13, 21)，同時其亦活化腫瘤細胞中之多個存活和抗細胞凋亡路徑，因此使得其等對不同類型的療法產生抗性(22)。在BM基質細胞之不存在或存在下，將AML細胞系或MM細胞系與T細胞及雙特異性抗體共培養。使用靶向CD123或BCMA及CD3之雙特異性抗體（工具抗體）。證明此等抗體之功效之組合、殺滅、及T細胞活化數據顯示於圖8。使用CD123 x CD3雙特異性抗體，觀察到CD123表現性白血病細胞系KG-1之劑量依賴性殺滅（圖1A及圖1B）。用表現CD3或CD123連同非靶向性（空）臂之雙特異性抗體時並未觀察到此殺滅（圖1A及圖1B）。當使用BCMA表現性之MM細胞系H929及另一種雙特異性抗體BCMA x CD3時，觀察到類似結果（圖1C至圖1D），其中相對於空對照組，特異性殺滅係由BCMA x CD3介導。當將基質細胞添加至共培養物時，即使在高濃度的雙特異性抗體下，觀察到的最大細胞毒性反應也有統計學上的顯著減少（圖1A至圖1D）。此外，雙特異性抗體之EC50值在基質之存在下係高3至5倍（圖9A）。雙特異性抗體活性之基質抑制不僅限於纖維母細胞基質細胞系（HS-5及HS-27a），而亦觀察到衍生自健康捐贈者之BM之初代間葉基質細胞(MSC)（圖1A至圖1D）。雙特異性抗體活性之抑制係取決於存在於共培養物中之基質細胞數量；藉此當共培養物中基質細胞比癌細胞少10倍時，仍觀察到減少之功效（圖9B）。有趣的是，在分選自來自健康捐贈者之BM單核細胞之CD105⁺ 內皮細胞之添加後，未觀察到抑制（圖1A至圖1D）。此結果顯示並非所有基質細胞不利影響CD3重導向雙特異性抗體之功效，且亦考量在腫瘤-T細胞共培養物中僅存在另一種細胞類型對抑制效果無貢獻之事實。雙特異性抗體活性之基質介導之抑制不是來自一個捐贈者之T細胞獨有的，而是在多個捐贈者之T細胞中觀察到（分別在圖1A、圖1C、及圖1B、圖1D中繪製之不同捐贈者之平均值及中位數）。此等數據並非對一種AML細胞系或MM細胞系特異的，因為用其他CD123⁺ AML（MOLM-13及OCI-AML5）及BCMA⁺ MM細胞系（RPMI-8226及MM.1S）時亦觀察到類似的結果（圖9C及9D）。此等數據首次證明基質細胞影響CD3重導向雙特異性抗體之功效及效力。BM 基質細胞在癌細胞中抑制T 細胞活性及活化存活和抗細胞凋亡路徑

接下來，研究雙特異性抗體活性之基質抑制之機制。為此，在基質細胞之不存在或存在下，在T細胞-腫瘤共培養細胞毒性測定中評估T細胞的表型。在基質之不存在下，用CD123 x CD3雙特異性抗體之治療導致在CD8⁺ T細胞中之包括CD25、CD137、及ICOS之活化標記之上調，及包括PD1、LAG3、及TIM3之檢查點標記之同時增加（圖2A）。此外，CD8⁺ T細胞係藉由增加效應物蛋白（諸如穿孔素和顆粒酶B）之產生及T-bet表現之上調，而展現細胞毒性T淋巴球(cytotoxic T lymphocytes)之特徵（圖2A）。然而，當基質細胞存在於共培養物時，T細胞之活化程度較低，且活化標記、效應物標記、及檢查點標記之表現降低（圖2A）。在多名T細胞捐贈者（圖2A中繪製不同捐贈者之中位數）以及MM細胞系H929及BCMAxCD3雙特異性抗體中觀察到此等結果（圖10A）。鑒於PD1、TIM3、LAG3被認為是調控T細胞活化反應之抑制性蛋白質，在基質之存在下，T細胞上之檢查點標記之表現降低之結果乍看下似乎違反直覺。然而，此等蛋白質僅在T細胞活化時誘發，且不存在於初始T細胞(23-29)。因此，鑒於此等數據，在基質細胞之存在下T細胞上之PD1、TIM3、及LAG3之上調減少，且在抑制性基質區室之存在下支持T細胞之活化程度較低之表型就不足為奇了。此外，在基質之存在下，以兩種雙特異性抗體治療後均降低T細胞增殖（圖10B）。

除了免疫抑制以外，還研究了白血病和骨髓瘤腫瘤細胞中之多個促存活和抗細胞凋亡路徑之活化可能是介導對療法有抗性之另一個機制(30)。在與HS-5基質細胞一起培養之KG-1細胞中觀察到磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)和Akt之磷酸化增加，且觀察到在已HS-5基質細胞培養的KG-1細胞中Bcl-2的蛋白表現增加，而在單獨的KG-1或HS-5細胞中沒有觀察到（圖2B）。此等數據共同表明，AML和MM腫瘤細胞可以藉由基質細胞依賴性機制而逃避T細胞介導之死亡，該機制除了抑制T細胞活化外，還涉及腫瘤細胞中之抗性路徑之活化。

接下來，研究T細胞免疫抑制和促存活路徑之上調對CD3重導向之功效降低之表型之相對貢獻。鑒於自數種療法得知Bcl-2已直接涉及AML細胞和MM細胞之存活和抗性(30, 31)，在有或無添加Bcl-2抑制劑HA14-1之基質之存在下執行細胞毒性測定。儘管抑制劑成功防止Bcl-2的表現（圖11），它無法拯救基質介導之CD3重導向抑制（圖2C），且T細胞維持活化程度較低（圖2D）。此等數據支持先前公開之發現，其中目標細胞中之Bcl-2之過度表現對AMG110 (EpCAMxCD3 BiTE)之活性影響最小(32)。 骨髓基質細胞使體內CD3 重導向之功效衰減

接下來，研究基質細胞可否在體內保護腫瘤細胞免於受到雙特異性抗體-T細胞介導之細胞毒性。為此，在雌性NSG小鼠中靜脈接種人類PBMC，且一週之後，將MOLM-13與或不與HS-5骨髓基質細胞皮下(sc)植入到小鼠之側腹。接著，從腫瘤細胞植入之後第5天開始，每週以CD123 x CD3(8 µg/kg)治療小鼠兩次，總共5次治療。相較於PBS或CD3 x空對照組，在單獨的MOLM-13組中，用CD123 x CD3之治療顯著抑制sc腫瘤生長（腫瘤生長抑制（第25天之TGI）= 78%，p ＜0.0001）（圖3A）。在基質之存在下，此抗腫瘤活性明顯降低（第25天之TGI= 15%），且相較於雙特異性抗體治療之單獨MOLM-13組，係統計上顯著的（p ＜0.0001）（圖3A）。此外，雖然觀察到具有或不具有間質之腫瘤中之CD8⁺ T細胞之浸潤程度相同（圖3B），但與基質之存在相關之T細胞之活化概況有差異（圖3C）。相較於MOLM-13對照組，來自雙特異性抗體治療之MOLM-13+HS-5組之CD8⁺ T細胞展現CD25、PD1、及顆粒酶B之受損上調（圖3C）。此等結果支持體外觀察，並強烈暗示BM基質細胞係藉由抑制T細胞活化而降低了原本有效之CD3重導向治療劑之功效。

對基質之黏附對於介導免疫抑制及癌細胞存活而言係關鍵的。

基質細胞可經由分泌可溶性因子（包括免疫抑制介質（諸如IL-10、TGF-β、及PGE2）或生長因子（諸如幹細胞因子(stem cell factor, SCF)、IL-7、IL-15、CXCL-12等等）介導免疫抑制，且保護腫瘤細胞免於受到細胞毒性(21, 33)。此外，基質細胞可以經由誘發抗性的黏附路徑與腫瘤細胞直接交互作用(34)，從而以細胞-細胞接觸的方式保護惡性細胞免於受到T細胞介導之細胞毒性。目測檢查細胞毒性測定發現，未被雙特異性抗體-T細胞介導之細胞毒性殺死之殘餘白血病細胞緊密聚集在基質細胞周圍（圖4A），這意味著細胞-細胞接觸路徑可能在癌細胞之基質介導之保護中扮演重要角色。為了區分可溶性與細胞-細胞接觸依賴性機制，執行體外跨孔測定，以評估基質細胞是否仍能抑制雙特異性抗體-T細胞介導之裂解功效，即使與腫瘤和T細胞分離。觀察到細胞-細胞接觸在介導基質保護AML細胞系和MM細胞系免於受到雙特異性抗體-T細胞重導向之細胞毒性中扮演主要角色，因為基質細胞與腫瘤細胞分離時沒有展現任何抑制效果（圖4B及圖12A）。針對來自不同捐贈者之T細胞，觀察到類似的趨勢（圖4B中使用了2名不同的T細胞捐贈者）。此外，將基質細胞置於跨孔插入物中時，其等無法抑制T細胞活化、及穿孔素、顆粒酶B及T-bet之表現（圖4C）此等數據證明基質介導之T細胞抑制對細胞-細胞交互作用的強烈依賴性以及對T細胞依賴性細胞毒性的保護作用。 在體外及體內阻斷VLA-4 拯救基質介導之CD3 重導向抑制

研究黏附路徑以判定哪一者對於基質抑制雙特異性抗體的功效至關重要。因為CXCR4和VLA-4在介導BM中之AML/MM-基質交互作用中揮了重要作用，因此受到了關注(34)。使用針對VLA-4或CXCR4之阻斷抗體（購買自R&D Systems），觀察到與CXCR4抑制不同，在基質存在下CXCR4抑制無法挽救雙特異性抗體介導的細胞毒性反應，而VLA-4抑制反轉（50至60%）基質介導之KG-1及MOLM-13免受CD123 x CD3雙特異性抗體-T細胞的細胞毒性（圖5A和圖12B）。對於H929和BCMA x CD3雙特異性抗體，即使在存在基質的情況下，VLA-4抑制能回復細胞毒性反應(80-100%)，這種作用更加明顯（圖5B）。有VLA-4抑制之細胞毒性反應增加與在CXCR4阻斷下仍被抑制之T細胞活化標記（諸如，顆粒酶B和CD25）之恢復表現有關（圖5C和5D）。相較於未治療之對應物（含有HS-5或初代MSC基質細胞之共培養物），具有VLA-4抑制之T細胞活化標記之此增加亦是統計上顯著。VLA-4抑制亦使Akt及PI3K路徑之磷酸化衰減（圖13）。

先前的體內結果顯示在以HS-5骨髓基質細胞治療MOLM-13腫瘤時，CD123 x CD3之功效衰減。為了判定是否可以恢復抗腫瘤效果，將抗VLA-4中和抗體與CD123 x CD3組合，以治療帶有MOLM-13之小鼠。與先前的觀察類似，與PBS治療之對照組相比，CD123 x CD3(8 µg/kg)促進52.3% (p≤0.0001)之第24天之TGI，而相同劑量之雙特異性抗體針對與HS-5細胞共注射之MOLM-13腫瘤有最小效果（第23天之TGI= 7.6%）（圖6A）。然而，抗VLA-4抗體與CD123 x CD3之同時添加導致具有HS-5細胞之MOLM-13腫瘤之第23天之TGI增加為48.4%，(p=0.0001)（圖6A）。具有接受VLA-4阻斷和雙特異性抗體治療之基質之MOLM-13腫瘤之TGI增加，伴有CD8⁺ T細胞活化和效應物反應（包括穿孔素、CD25、及PD1之表現）之改善（圖6B）。增加之TGI和增強之CD8⁺ T細胞反應限於彼等接受VLA-4阻斷和雙特異性抗體治療之組合的荷瘤+HS-5小鼠，且當小鼠自己服用任何一種藥劑時不存在。此等結果強烈表明，VLA-4連同CD3重導向劑之共同阻斷可以克服基質細胞介導之抑制作用，且可以介導優異的抗腫瘤反應。

儘管存在基質，在離體初代患者培養物中阻斷VLA-4 恢復CD3 重導向之功效

然後，以初代冷凍/解凍AML樣本和MM樣本驗證此發現。鑒於初代腫瘤細胞在沒有外源補充細胞激素或基質支撐下在培養物中維持可係具有挑戰的，吾等對具有不同數量之基質細胞之AML/MM樣本執行離體培養（圖14和15所示之代表性圈選策略）。令人驚訝地，觀察到在具有低基質：腫瘤比率(0.01x HS-5)之CD123 x CD3和BCMA x CD3雙特異性抗體治療之培養物中，CD123⁺ CD33⁺ AML母細胞以及BCMA⁺ CD138⁺ MM腫瘤細胞之明顯和選擇性殺滅，而在以空對照組治療之培養物中則否（圖7A和7C）。在具有高基質：腫瘤比率之培養物中，CD123 x CD3的殺滅效果最小（0.2x HS-5，圖7A和7C）。額外地，在清除初代腫瘤細胞之有效細胞毒性反應之後，CD8⁺ T細胞之擴增或活化受限於具有較低基質含量之雙特異性抗體治療之培養物（圖7B及7D）。最後，當中和之VLA-4與CD123 x CD3或BCMA x CD3組合使用時，儘管培養物中之基質含量較高，仍觀察到腫瘤細胞之優異殺滅及雙特異性抗體之功效之恢復（圖7A至7D）。阻斷VLA-4連同雙特異性抗體治療亦恢復在具有較高基質含量之培養物中之CD8⁺ T細胞之擴增/活化（圖7B和7C）。在3名不同的患者（圖7A與7B中之AML患者及圖7C與7D中之MM患者）中觀察到此等結果，且強化了先前的體外和體內發現。VLA-4抑制本身導致在AML患者樣本中之一者中之具有高基質：腫瘤比率之培養物中之CD123⁺ 母細胞之耗盡增加，但並未廣泛觀察到此效果（數據未顯示）。此等數據確實顯示，將VLA-4阻斷與CD3重導向雙特異性抗體治療劑組合可以克服基質細胞之抑制效果，且為在臨床探索此種組合提供了原理說明。討論

近年來，BM區位的複雜性得到了真正的理解，在了解對於維持和調控造血幹細胞有貢獻之分子和細胞因子方面取得了重大進展。在血液惡性疾病的背景下，癌症幹細胞可以利用相同的因子來保護和抵抗數種抗癌療法，從而貢獻微量殘存疾病。

在本文中之結果首次顯示如何藉由BM微環境之組分阻礙原本有效的T細胞療法。具體地，觀察到在BM基質細胞之存在下，保護AML癌細胞和MM癌細胞免於受到T細胞和雙特異性抗體介導之細胞毒性。減少的癌細胞殺滅與鈍化的T細胞活化和效應器反應有關。阻斷細胞-細胞交互作用，特別是彼等藉由VLA-4路徑介導者反轉T細胞免疫抑制，導致對AML癌細胞和MM癌細胞之殺滅增加。因此，結果再次證明，BM微環境係一個強大的因素，即使在原本有力且有效的免疫療法（諸如CD3重導向）的背景下，亦需要考慮此因素。該結果亦為了將干擾黏附的藥劑與CD3重導向治療劑組合，以更強且更徹底地消除MRD提供了原理說明和證據。

雖然已經顯示阻斷VLA-4反轉雙特異性T細胞介導之細胞毒性和免疫抑制之功效之基質抑制，該調控之機制尚待闡明。VLA-4在T細胞上表現，且除了介導白血球的黏附及跨內皮遷移外，還可以提供共刺激訊號，導致T淋巴細胞之活化(35-38)。在用那他珠單抗（一種獲准用於MS之人源化單株IgG4 VLA-4阻斷抗體）之多發性硬化症患者之臨床研究已顯示該藥物不僅增加了周邊血液中之CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞數量(39)，亦刺激CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞產生更多IL-2、TNF-a、IFN-γ、及IL-17 (40-43)。雖然結果較為適度，在體外觀察到相似的結果，其中那他珠單抗在來自健康的捐贈者之離體繁殖的活化初代人類CD4⁺ T細胞中誘發IL-2、IFN-γ、及IL-17表現之輕度上調，這意味著那他珠單抗直接作用於T細胞(42)。以上研究集中在CD4⁺ 細胞；因此，是否在體外觀察到CD8⁺ T細胞有相同的情況仍有待研究。解釋VLA-4阻斷之另一個機制可能是阻斷腫瘤與基質細胞之間的交互作用破壞基質周圍之腫瘤細胞之聚集，因此使T細胞進入腫瘤細胞，導致更好的CD3重定向功效。最後，VLA-4抑制已顯示直接作用於AML細胞和MM細胞，藉由防止腫瘤細胞本身之關鍵存活路徑之表現和上調(34)或改變消炎細胞激素之腫瘤細胞產生，而使其等對化療和標靶治療更敏感。

雖然此研究的重點在於BM微環境，實體腫瘤中亦可能發生類似的現象。實體腫瘤含有細胞外基質分子以及可為免疫抑制之各種基質細胞類型之複雜緻密網絡。

該結果指向結合CD3重導向治療劑靶向BM微環境之重要性。額外地，該結果顯示，VLA-4可以潛在地用作預測針對CD3重導向之反應的生物標記，且可能用以引導患者選擇此等免疫療法。參考文獻

在本文中所引用之所有公開案之全文係以引用方式特此併入本文中。 1. Paietta E. Minimal residual disease in acute myeloid leukemia: coming of age. Hematology American Society of Hematology Education Program. 2012;2012:35-42. 2. Harousseau JL, Attal M, Avet-Loiseau H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 2009;114(15):3139-46. 3. El Rassi F, Arellano M. Update on optimal management of acute myeloid leukemia. Clinical Medicine Insights Oncology. 2013;7:181-97. 4. Martinez-Lopez J et al. Long-term prognostic significance of response in multiple myeloma after stem cell transplantation. Blood. 2011;118(3):529-34. 5. Malard F, Harousseau JL, Mohty M. Multiple myeloma treatment at relapse after autologous stem cell transplantation: A practical analysis. Cancer treatment reviews. 2017;52:41-7. 6. Blatter S, Rottenberg S. Minimal residual disease in cancer therapy--Small things make all the difference. Drug resistance updates : reviews and commentaries in antimicrobial and anticancer chemotherapy. 2015;21-22:1-10. 7. Basak GW, Srivastava AS, Malhotra R, Carrier E. Multiple myeloma bone marrow niche. Current pharmaceutical biotechnology. 2009;10(3):345-6. 8. Sanchez-Aguilera A, Mendez-Ferrer S. The hematopoietic stem-cell niche in health and leukemia. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2016. 9. Lane SW, Scadden DT, Gilliland DG. The leukemic stem cell niche: current concepts and therapeutic opportunities. Blood. 2009;114(6):1150-7. 10. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nature reviews Immunology. 2011;12(1):49-60. 11. Noborio-Hatano K et al. Bortezomib overcomes cell-adhesion-mediated drug resistance through downregulation of VLA-4 expression in multiple myeloma. Oncogene. 2009;28(2):231-42. 12. Green AS et al. Pim kinases modulate resistance to FLT3 tyrosine kinase inhibitors in FLT3-ITD acute myeloid leukemia. Science advances. 2015;1(8):e1500221. 13. Krause DS, Scadden DT. A hostel for the hostile: the bone marrow niche in hematologic neoplasms. Haematologica. 2015;100(11):1376-87. 14. Pallasch CP et al. Sensitizing protective tumor microenvironments to antibody-mediated therapy. Cell. 2014;156(3):590-602. 15. Zhukovsky EA, Morse RJ, Maus MV. Bispecific antibodies and CARs: generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection. Current opinion in immunology. 2016;40:24-35. 16. Topp MS et al. Phase II trial of the anti-CD19 bispecific T cell-engager blinatumomab shows hematologic and molecular remissions in patients with relapsed or refractory B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2014;32(36):4134-40. 17. Labrijn AF et al. Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(13):5145-50. 18. Labrijn AF et al. Controlled Fab-arm exchange for the generation of stable bispecific IgG1. Nat Protoc. 2014;9(10):2450-63. 19. Rashidi A, Uy GL. Targeting the microenvironment in acute myeloid leukemia. Current hematologic malignancy reports. 2015;10(2):126-31. 20. Shiozawa Y, Havens AM, Pienta KJ, Taichman RS. The bone marrow niche: habitat to hematopoietic and mesenchymal stem cells, and unwitting host to molecular parasites. Leukemia. 2008;22(5):941-50. 21. Tripodo C et al. The bone marrow stroma in hematological neoplasms--a guilty bystander. Nature reviews Clinical oncology. 2011;8(8):456-66. 22. Meads MB, Hazlehurst LA, Dalton WS. The bone marrow microenvironment as a tumor sanctuary and contributor to drug resistance. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2008;14(9):2519-26. 23. Chikuma S et al. PD-1-mediated suppression of IL-2 production induces CD8+ T cell anergy in vivo. J Immunol. 2009;182(11):6682-9. 24. Inozume T et al. Selection of CD8+PD-1+ lymphocytes in fresh human melanomas enriches for tumor-reactive T cells. J Immunother. 2010;33(9):956-64. 25. Gros A et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 2014;124(5):2246-59. 26. Simon S et al. PD-1 expression conditions T cell avidity within an antigen-specific repertoire. Oncoimmunology. 2016;5(1):e1104448. 27. Gros A et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nat Med. 2016;22(4):433-8. 28. Huard B, Gaulard P, Faure F, Hercend T, Triebel F. Cellular expression and tissue distribution of the human LAG-3-encoded protein, an MHC class II ligand. Immunogenetics. 1994;39(3):213-7. 29. Hastings WD et al. TIM-3 is expressed on activated human CD4+ T cells and regulates Th1 and Th17 cytokines. Eur J Immunol. 2009;39(9):2492-501. 30. Matsunaga T et al. Interaction between leukemic-cell VLA-4 and stromal fibronectin is a decisive factor for minimal residual disease of acute myelogenous leukemia. Nat Med. 2003;9(9):1158-65. 31. Maji S et al. Bcl-2 Antiapoptotic Family Proteins and Chemoresistance in Cancer. Adv Cancer Res. 2018;137:37-75. 32. Deisting W, Raum T, Kufer P, Baeuerle PA, Munz M. Impact of Diverse Immune Evasion Mechanisms of Cancer Cells on T Cells Engaged by EpCAM/CD3-Bispecific Antibody Construct AMG 110. PloS one. 2015;10(10):e0141669. 33. Raffaghello L, Vacca A, Pistoia V, Ribatti D. Cancer associated fibroblasts in hematological malignancies. Oncotarget. 2015;6(5):2589-603. 34. Rashidi A, DiPersio JF. Targeting the leukemia-stroma interaction in acute myeloid leukemia: rationale and latest evidence. Therapeutic advances in hematology. 2016;7(1):40-51. 35. Sato T, Tachibana K, Nojima Y, D'Avirro N, Morimoto C. Role of the VLA-4 molecule in T cell costimulation. Identification of the tyrosine phosphorylation pattern induced by the ligation of VLA-4. Journal of immunology. 1995;155(6):2938-47. 36. Davis LS, Oppenheimer-Marks N, Bednarczyk JL, McIntyre BW, Lipsky PE. Fibronectin promotes proliferation of naive and memory T cells by signaling through both the VLA-4 and VLA-5 integrin molecules. Journal of immunology. 1990;145(3):785-93. 37. Shimizu Y, van Seventer GA, Horgan KJ, Shaw S. Costimulation of proliferative responses of resting CD4+ T cells by the interaction of VLA-4 and VLA-5 with fibronectin or VLA-6 with laminin. Journal of immunology. 1990;145(1):59-67. 38. Mittelbrunn M et al. VLA-4 integrin concentrates at the peripheral supramolecular activation complex of the immune synapse and drives T helper 1 responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004;101(30):11058-63. 39. Marousi S, Karkanis I, Kalamatas T, Travasarou M, Paterakis G, Karageorgiou CE. Immune cells after prolonged Natalizumab therapy: implications for effectiveness and safety. Acta neurologica Scandinavica. 2013;128(1):e1-5. 40. Bornsen L et al. Effect of natalizumab on circulating CD4+ T-cells in multiple sclerosis. PloS one. 2012;7(11):e47578. 41. Kivisakk P et al. Natalizumab treatment is associated with peripheral sequestration of proinflammatory T cells. Neurology. 2009;72(22):1922-30. 42. Benkert TF et al. Natalizumab exerts direct signaling capacity and supports a pro-inflammatory phenotype in some patients with multiple sclerosis. PloS one. 2012;7(12):e52208. 43. Kimura K et al. Disrupted balance of T cells under natalizumab treatment in multiple sclerosis. Neurology(R) neuroimmunology & neuroinflammation. 2016;3(2):e210. 44. Yu S et al. Recent advances of bispecific antibodies in solid tumors. Journal of hematology & oncology. 2017;10(1):155. 45. Ishiguro T et al. An anti-glypican 3/CD3 bispecific T cell-redirecting antibody for treatment of solid tumors. Science translational medicine. 2017;9(410). 46. Feig C et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2013;110(50):20212-7.

無

前述發明內容以及本申請案之實施方式與具體例在結合隨附申請專利範圍與圖式閱讀時將更易於理解。然而，應理解的是，本發明並不受限於在本文中揭示之確切記載。 ［圖1］顯示基質細胞之存在保護AML細胞系及MM細胞系免於受到T細胞重導向之細胞毒性。在基質細胞（HS-5、HS-27a、初代(primary)MSC或CD105⁺ 內皮細胞；每孔 20,000個細胞）之存在或不存在下，將人類T細胞（40,000個細胞/孔）與CFSE標示之AML KG1(A, B)或MM H929細胞系(C, D)以2：1之比率培養。將不同濃度之CD123 x CD3 (A, B)或BCMA x CD3 (C, D)添加至培養物，為期48小時。藉由流動式細胞測量術定量死亡CFSE⁺ 細胞之百分比。左邊之劑量滴定圖(A, C)係以平均值±標準偏差(standard deviation, SD)顯示。右邊(B,D)之散射圖顯示最高濃度之雙特異性抗體之數據（具有範圍的中位數）。數據代表三或更多個實驗。∗∗ p ＜ 0.005、∗∗∗ p ＜ 0.0005；∗∗∗∗ p ＜ 0.0001；n.s.無統計顯著性。 ［圖2］顯示基質細胞抑制T細胞功能、上調腫瘤細胞中之訊號傳遞路徑、及保護腫瘤細胞免於受到T細胞重導向之細胞毒性。(A)在基質細胞（HS-5、初代MSC或CD105⁺ 內皮細胞；每孔 20,000個細胞）之存在或不存在下，將人類T細胞（40,000個細胞/孔）與CFSE標示之KG-1細胞以2：1之比率培養。在添加33 nM之CD123 x CD3至培養物之後，執行CD8⁺ T細胞中之活化標記、效應物標記、及檢查點抑制標記之分析。幾何平均螢光強度係藉由流動式細胞測量術在48小時定量。(B)在單獨培養或在HS-5基質細胞系之存在下培養為期48小時之KG-1細胞中之PI3K與Akt之活化（磷酸化）及Bcl-2之表現之免疫墨點分析。(C)與A類似，但此處所有培養物係經或未經Bcl-2i治療，且死亡CFSE⁺ 細胞之百分比係藉由流動式細胞測量術定量。(D)與A和C類似，其中在基質之不存在或存在及有或無經Bcl-2i治療下，在腫瘤及T細胞培養物中評估T細胞之活化狀態。所顯示的所有數據代表三或更多個實驗，且係描繪為具有SD之平均值（劑量滴定曲線）或具有範圍之中位數（散射圖）。∗ p ＜ 0.05、∗∗ p ＜ 0.005、∗∗∗ p ＜ 0.0005；∗∗∗∗ p ＜ 0.0001；n.s.無統計顯著性。 ［圖3］顯示基質細胞體內影響CD3重導向之功效。在研究第0天，在注射huPBMC之雌性NSG小鼠中皮下植入MOLM-13 AML及MOLM-13與HS-5骨髓基質細胞(5:1)。在腫瘤細胞植入後第5天開始，每週以CD123 x CD3(8 µg/kg)治療小鼠兩次，總共5次治療。包括PBS治療組作為對照。(A)在不同時間點之所有群組之平均腫瘤體積測量。(B)在研究結束（第24天）時，小鼠腫瘤中之CD8⁺ T細胞浸潤之百分比。(C)在第24天，在小鼠腫瘤中之CD8⁺ T細胞中之活化標記、效應物標記、及檢查點抑制標記之分析。顯示之所有數據代表兩個獨立實驗，且表示為平均值±標準誤差(standard error of mean, SEM)(A)或具有範圍之中位數（B及C）。∗ p ＜ 0.05、∗∗ p ＜ 0.005、∗∗∗ p ＜ 0.0005；n.s.無統計顯著性。 ［圖4］顯示細胞-細胞接觸扮演介導基質細胞之免疫抑制及保護性表型中的主要角色。(A)將人類T細胞（40,000個細胞/孔）與Incucyte NucLight® Red標示之OCI-AML5細胞（20,000個）且與或不與Incucyte NucLight® Green標示之HS-5細胞（每孔20,000個細胞）培養，且以不同濃度之雙特異性抗體治療為期72小時。代表性影像顯示在添加11 nM之CD123 x CD3雙特異性抗體之後72小時之培養物之快照。(B)與A相同，但此處將T細胞與CFSE標示之腫瘤細胞且與或不與基質細胞（HS-5或初代MSC）培養，且以不同濃度之雙特異性抗體治療為期48小時。在此等測定中，在跨孔(trans-well)上，將基質細胞與腫瘤細胞及T細胞一起培養或與其分開培養。藉由流動式細胞測量術定量死亡CFSE⁺ 細胞之百分比。此處所顯示之來自一個實驗之數據代表3次獨立的生物重複。此處所顯示之數據係平均值± SD。(C)在殺滅測定中在CD8⁺ T細胞上之活化標記及效應物標記之流動分析。數據顯示為具有範圍之中位數。∗ p ＜ 0.05、∗∗ p ＜ 0.005、∗∗∗ p ＜ 0.0005；n.s.無統計顯著性。 ［圖5］顯示VLA-4抑制體外反轉基質介導之免疫抑制及保護腫瘤細胞免於受到CD3重導向之細胞毒性。將人類T細胞與CFSH標示之腫瘤細胞且與或不與基質細胞（HS-5或初代MSC）培養，且在與VLA-4或CXCR4中和之抗體之存在或不存在下，以不同濃度之雙特異性抗體治療為期48小時。(A, B)藉由流動式細胞測量術定量死亡CFSE⁺ 細胞之百分比。(C, D)在殺滅測定中在CD8⁺ T細胞上之顆粒酶B及CD25表現之流動分析。數據代表三或更多個實驗，且表示為平均值±SD (A, B)及具有範圍之中位數(C, D)。∗ p ＜ 0.05、∗∗ p ＜ 0.005、∗∗∗ p ＜ 0.0005；∗∗∗∗ p ＜ 0.0001；n.s.無統計顯著性。 ［圖6］顯示VLA-4抑制體內反轉基質介導之免疫抑制及保護腫瘤細胞免於受到CD3重導向之細胞毒性。在研究第0天，在注射huPBMC之雌性NSG小鼠中皮下植入AML細胞系MOLM-13及MOLM-13與HS-5骨髓基質細胞(5:1)。將小鼠以CD123xCD3 (8 µg/kg)單獨治療或與針對VAL-4之中和抗體(3 mg/kg)組合治療。包括PBS治療組作為對照。(A)在不同時間點之所有群組之平均腫瘤體積測量。(B)在第23天，在小鼠腫瘤中之CD8⁺ T細胞中之活化標記、效應物標記、及檢查點抑制標記之分析顯示之所有數據代表兩個獨立實驗，且表示為平均值±SEM (A)及具有範圍之中位數(B)。∗ p ＜ 0.05、∗∗ p ＜ 0.005、∗∗∗ p ＜ 0.0005；∗∗∗∗ p ＜ 0.0001；n.s.無統計顯著性。 ［圖7］顯示VLA-4抑制離體(ex vivo) 初代AML及MM培養物中拯救CD3重導向之功效。在HS-5之存在及具有/不具有針對VLA-4之中和抗體下，將來自3個初代AML樣本之PBMC (A, B)或來自3個初代MM樣本之BMMC (C, D)與1 µg/mL之雙特異性抗體培養，為期72小時。針對所有3個初代樣本，繪製針對細胞毒性（A及C）或CD8 T細胞擴增(B)/活化(D)之具有範圍之中位數值。∗ p ＜ 0.05。 ［圖8］顯示CD123 x CD3及BCMA x CD3結合腫瘤細胞及介導殺滅與T細胞活化。(A)將CD123⁺ 或BCMA⁺ 細胞系用各種濃度的雙特異性抗體染色，以表徵表面結合概況。藉由用小鼠抗人類IgG4染色，而偵測雙特異性抗體之結合。(B) CD123 x CD3及BCMA x CD3對於介導T細胞活化（由CD25上調及顆粒素b之產生所測量）及CD123⁺ 或BCMA⁺ 腫瘤細胞系之細胞毒性之能力。 ［圖9］顯示基質細胞之存在保護AML細胞系及MM細胞系免於受到T細胞重導向之細胞毒性。在基質細胞（HS-5、HS-27a、初代MSC或CD105⁺ 內皮細胞）之存在或不存在下，人類T細胞與CFSE標示之AML細胞系或MM細胞系以2：1之比率培養。將不同濃度之CD123 x CD3或BCMA x CD3添加至培養物，為期48小時。藉由流動式細胞測量術定量死亡CFSE⁺ 細胞之百分比。(A)顯示分別介導AML細胞系KG-1及MM細胞系H929之細胞毒性之CD123 x CD3與BCMA x CD3之EC50值之彙總之表。(B)與A類似之實驗設置，但此處增加添加至KG-1-T細胞培養物之HS-5細胞之量。(C)評估在基質之不存在或存在下，CD123 x CD3介導AML細胞系OCI-AML5與MOLM13之細胞毒性之能力。(D)評估在基質之不存在或存在下，BCMA x CD3介導MM細胞系RPMI-8226與MM.1S之細胞毒性之能力。 ［圖10］顯示基質細胞之存在減緩T細胞活化及增殖。(A)在基質細胞（HS-5、HS-27a、初代MSC或CD105+內皮細胞）之存在或不存在下，人類T細胞與CFSE標示之MM細胞系H929以2：1之比率培養。將不同濃度之BCMA x CD3添加至培養物，為期48小時。在以雙特異性抗體治療後48小時，藉由流動式細胞測量術定量T細胞活化標記之幾何平均螢光強度。(B)與A類似，但此處在基質細胞（HS-5、初代MSC或CD105⁺ 內皮細胞）之存在或不存在下，CFSE標示之T細胞與未標示之腫瘤細胞系以2：1之比率培養。FACS分析顯示CFSE稀釋概況之覆蓋（空x CD3對照組以陰影顯示，而治療組以黑色直方圖顯示），其描繪T細胞增殖。 ［圖11］顯示以Bcl-2抑制劑之治療阻斷Bcl2之表現。在HS5基質細胞系之存在及有或無經Bcl-2i治療下，培養為期48小時，在KG-1細胞中之Bcl-2之表現之免疫墨點分析。 ［圖12］顯示細胞-細胞接觸及VLA-4黏附路徑在MOLM-13細胞中之基質介導之細胞毒性抑制中發揮作用。(A)將人類T細胞與CFSE標示之MOLM-13細胞且與或不與HS-5或初代MSC細胞培養，且以不同濃度之雙特異性抗體治療為期48小時。在此等測定中，在跨孔(trans-well)上，將基質細胞與腫瘤細胞及T細胞一起培養或與其分開培養。藉由流動式細胞測量術定量死亡CFSE⁺ 細胞之百分比。(B)與A類似，但此處評估當所有細胞一起培養且在與VLA-4或CXCR4中和之抗體之存在或不存在下之細胞毒性。 ［圖13］顯示以VLA-4中和抗體之治療減少AKT和PI3K路徑之磷酸化。在HS5基質細胞系之存在及有或無經抗VLA4中和抗體治療下，培養為期48小時，在KG-1細胞中之pAkt及PI3K之表現之免疫墨點分析。 ［圖14］顯示用於AML初代患者樣本之圈選策略。用於離體實驗之圈選策略係以初代AML患者樣本進行。對應的同型對照組係顯示在旁邊。(A)藉由首先就前向散射(forward scatter, FSC)及側向散射(side scatter, SSC)進行圈選以單離所關注細胞來識別CD123⁺ 母細胞。接著，對活CD45⁺ 細胞進行圈選，之後對CD38⁺ CD33⁺ 母細胞進行圈選。接下來，在各種條件下定量表現CD123之母細胞。(B)為了定量樣本中之T細胞擴增，首先對具有SSC/FSC之所關注細胞進行圈選，且接著識別活CD45⁺ 細胞。接著，基於CD4及CD8染色，識別CD4⁺ CD8^- 及CD8⁺ CD4^- T細胞。 ［圖15］顯示用於MM初代患者樣本之圈選策略。用於離體實驗之圈選策略係以初代MM患者樣本進行。對應的同型對照組係顯示在旁邊。(A)藉由首先就FSC/SSC進行圈選以單離所關注細胞來識別CD138⁺ MM細胞。接著，在各種條件下定量活CD138⁺ 細胞。(B)為了定量樣本中之T細胞活化，首先對具有SSC/FSC之淋巴球進行圈選，且接著識別活CD138^- 細胞。接著，測量在CD8⁺ T細胞上之CD25之表現。

Claims (23)

1. 一種醫藥組成物，其包含T細胞重導向治療劑及VLA-4黏附路徑抑制劑，其中該T細胞重導向治療劑包含免疫特異性地結合T細胞表面抗原之第一結合區及免疫特異性地結合腫瘤相關抗原(TAA)之第二結合區。
2. 如請求項1所述之醫藥組成物，其進一步包含醫藥上可接受之載劑。
3. 如請求項1或2所述之醫藥組成物，其中該T細胞重導向治療劑係抗體或其抗原結合片段。
4. 如請求項1至3中任一項所述之醫藥組成物，其中該T細胞表面抗原係選自由以下所組成之群組：CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、CD137、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195、以及NKG2C。
5. 如請求項4所述之醫藥組成物，其中該T細胞表面抗原係CD3。
6. 如請求項1至5中任一項所述之醫藥組成物，其中該TAA係選自由以下所組成之群組：BCMA、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38、及SLAMF7。
7. 如請求項6所述之醫藥組成物，其中該T細胞重導向治療劑係BCMAxCD3雙特異性抗體，該BCMAxCD3雙特異性抗體具有免疫特異性地結合BCMA之第一抗原結合部位及免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。
8. 如請求項7所述之醫藥組成物，其中該BCMAxCD3雙特異性抗體包含第一重鏈(HC1)、第一輕鏈(LC1)、第二重鏈(HC2)、及第二輕鏈(LC2)，及其中該HC1及該LC1配對形成該第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成該第二抗原結合部位。
9. 如請求項8所述之醫藥組成物，其中該HC1包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，該LC1包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，該HC2包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及該LC2包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
10. 如請求項8所述之醫藥組成物，其中該HC1包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，該LC1包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，該HC2包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及該LC2包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
11. 如請求項6所述之醫藥組成物，其中該T細胞重導向治療劑係CD123xCD3雙特異性抗體，該CD123xCD3雙特異性抗體具有免疫特異性地結合CD123之第一抗原結合部位及免疫特異性地結合CD3之第二抗原結合部位。
12. 如請求項11所述之醫藥組成物，其中該CD123xCD3雙特異性抗體包含第一重鏈(HC1)、第一輕鏈(LC1)、第二重鏈(HC2)、及第二輕鏈(LC2)，及其中該HC1及該LC1配對形成該第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成該第二抗原結合部位。
13. 如請求項12所述之醫藥組成物，其中該HC1包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，該LC1包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列，該HC2包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及該LC2包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
14. 如請求項1至13中任一項所述之醫藥組成物，其中該VLA-4黏附路徑抑制劑係抗VLA-4抗體或其抗原結合片段。
15. 如請求項14所述之醫藥組成物，其中該抗VLA-4抗體或其抗原結合片段係選自由以下所組成之群組：單株抗體、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、及F(v)片段、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、及由一個重鏈及一個輕鏈所組成之二聚體。
16. 如請求項1至13中任一項所述之醫藥組成物，其中該VLA-4黏附路徑抑制劑係VLA-4拮抗劑。
17. 如請求項16所述之醫藥組成物，其中該VLA-4拮抗劑係選自由以下所組成之群組：BIO1211、TCS2314、BIO5192、及TR14035。
18. 一種殺滅癌細胞之方法，其包含破壞癌細胞與基質細胞之間之細胞-細胞接觸，其包含使癌細胞經受治療有效量之如請求項1至17中任一項所述之醫藥組成物。
19. 如請求項18中任一者所述之方法，其中該癌症係血液惡性疾病或實體腫瘤。
20. 如請求項18或19所述之方法，其中該T細胞重導向治療劑及該VLA-4黏附路徑抑制劑係同時或依序投予。
21. 如請求項20所述之方法，其中在該T細胞重導向治療劑之前，投予該VLA-4黏附路徑抑制劑。
22. 如請求項20所述之方法，其中在該T細胞重導向治療劑之投予之後，投予該VLA-4黏附路徑抑制劑。
23. 一種套組，其包含如請求項1至17中任一項所述之醫藥組成物。

Images