TW202206600A - 大幅增加稻米產量的方式 - Google Patents

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李文雄
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Abstract

一種基因轉殖稻米植物在其基因組中含有重組DNA構築體，該構築體包含第一核酸，該第一核酸具有與其天然啟動子及5’非轉譯區（5’ untranslated region，5’ UTR）可操作地連接的第一Golden 2-like轉錄因子（GLK ）基因的序列，以及第二核酸，該第二核酸具有與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接的第二GLK 基因的序列，該第二GLK 基因不同於該第一GLK 基因。該第一GLK 基因以及該第二GLK 基因均來自C4植物，且相較於未經轉形的野生型稻米植物，該基因轉殖稻米植物在枝條生物量上增加65-106%且在穀物產量上增加50-95%。還提供一種生產基因轉殖稻米植物之方法以及一種可用於該方法的重組DNA構築體。

Description

大幅增加稻米產量的方式
本發明係關於一種大幅增加稻米產量的方式。
不斷擴大的人口需要增加作物產量。為了滿足這一需求，近期致力於提高稻米等作物的光合作用效率上。自1960年代初至2000年，一系列目的在於提高全球農業產量的舉措，亦即所謂的綠色革命，造成稻米產量大約倍增。然而，近年來產量的提升則較不引人注意。
由於超過90%的作物生物量來自光合作用，因此增加稻米等主要作物的光合作用可能會顯著提高產量。
葉綠體在光合作用中發揮重要作用，也是調節植物生長、發育，以及逆境耐受性的植物激素生合成的場所。已知一對Golden 2-like（GLK）轉錄因子基因可調節高等植物如玉米（一種C4 型植物）以及稻米（一種C3 型植物）中葉綠體的發育。透過演化，相較於稻米的GLK 基因，來自玉米的GLK 基因，特別是GLK2 ，可能獲得更新、更強的功能。
由於玉米的光合作用比稻米更有效，將兩個玉米的GLK 基因轉形至稻米的基因組中可能會增強基因轉殖稻米植物的光合作用，進而提高稻米的產量。
最近有報導稱，轉形由玉米泛素啟動子所控制的兩個玉米GLK 基因中的任何一個，特別是玉米GLK2 基因，稻米的產量提高了16-40%。然而，使用玉米泛素啟動子，一種強組成型啟動子，來驅動玉米GLK基因在基因轉殖稻米中的表現導致稻米種子變小。
為了滿足人口增長的需求，提高稻米產量仍是強烈的需求。
為了滿足不斷增長的人口對糧食需求的日益增長，提供一種基因轉殖稻米植物，其在其基因組中包含重組DNA構築體，該構築體包含第一核酸，該第一核酸具有與其天然啟動子及5’非轉譯區（5’ untranslated region，5’ UTR）可操作地連接的第一Golden 2-like轉錄因子（GLK ）基因的序列，以及第二核酸，該第二核酸具有與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接的第二GLK 基因的序列，該第二GLK 基因不同於該第一GLK 基因。該第一GLK基因以及該第二GLK基因都是異源的，亦即並非來自稻米，且相較於一未經轉形的野生型稻米植物，該基因轉殖稻米植物在枝條生物量上（65-106%）及在穀物產量上（50-95%）具有顯著，亦即至少50%的增加。
還提供一種生產上述基因轉殖稻米植物之方法。
進一步公開一種可用於該方法之重組DNA構築體。該重組DNA構築體包含第一核酸序列，該第一核酸序列包含第一GLK 基因，該第一GLK 基因與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接，以及第二核酸序列，該第二核酸序列包含第二GLK 基因，該第二GLK 基因與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接，該第二GLK 基因不同於該第一GLK 基因。該第一GLK 基因以及該第二GLK 基因來自C4植物，例如玉米。
本發明之數個具體實施例的細節於以下描述及附圖中闡述。本發明之所有特徵、目的，及優點將從該描述及附圖，以及從所附申請專利範圍中顯而易見。
如上所述，提供一種基因轉殖稻米植物，其基因組中含有兩個不同的異源GLK 基因，每個基因都在其天然啟動子及5’UTR的控制下。例如，兩個GLK 基因皆可來自C4植物。該GLK 基因的示例性C4植物來源包含，但不限於，Zea mays L.（玉米）、Sorghum bicolor L.（高粱）、Saccharum officinarum L.（甘蔗），以及Setaria italica L.（粟）。
於一具體實施例中，該第一GLK 基因為Zea mays GLK1 ，且該第二GLK 基因為Zea mays GLK2 ，亦稱為G2。更具體而言，由該GLK1 基因表現的蛋白質具有如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列，由該GLK2 基因表現的蛋白質具有如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列。
此外，該第一GLK 基因的天然啟動子及5’UTR可具有如SEQ ID NO: 1所示之序列，而該第二GLK 基因的天然啟動子及5’UTR可具有如SEQ ID NO: 4所示之序列。
如上所述，相較於未轉形的野生型稻米植物，基因轉殖稻米植物的枝條生長及穀物產量顯著增加，亦即至少 50%。
於一具體實施例中，相較於未轉形的野生型稻米植物，例如稻米品種台農67（TNG67），pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖植物中枝條生長的增加，如透過生物量變化所測量的，可在65%至106%之間的範圍內。
於同一實施例中，pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖植物的穀物產量可以比未轉形的野生型稻米高出50%至95%。
發明內容部分還提到一種產生上述基因轉殖植物之方法。該方法透過（i）將重組DNA構築體引入宿主稻米植物中，該構築體包含與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接的第一GLK 基因以及與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接的第二GLK 基因，以及（ii）鑑定基因轉殖稻米植物，該基因轉殖稻米植物相較於未轉形的野生型稻米植物，例如 TNG67，至少增加50%的枝條生物量及穀物產量。
於該方法中，該第一GLK 基因以及該第二GLK 基因彼此不同且與稻米異源。於一實施例中，該第一GLK 基因以及該第二GLK 基因來自C4植物，例如，玉米、高粱、甘蔗，以及粟。於一具體方法中，該第一GLK 基因為Zea mays GLK1 ，且該第二GLK 基因為Zea mays GLK2 。
於一實施例中，該重組DNA構築體可表現具有如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列的蛋白質，亦即Zea mays GLK1，以及具有如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列的蛋白質，亦即Zea mays GLK2。
GLK1 以及GLK2 的表現可分別在具有如SEQ ID NO: 1所示之序列的天然啟動子及5’UTR以及具有如SEQ ID NO: 4所示之序列的天然啟動子及5’UTR的控制下。
相較於未轉形的野生型稻米植物，例如 TNG67，已鑑定的基因轉殖稻米植物的穀物產量顯著更高。例如，相較於該未轉形的野生型稻米植物，可以看到pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖稻米植物的穀物產量增加了 50%至95%。
基因轉殖稻米植株的枝條生物量也顯著高於未轉形的野生型稻米植株。示例性的pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖稻米植物的枝條質量比該未轉形的野生型稻米植物的枝條質量高出65%至106%。
接下來討論的是上述發明內容部分中提到的重組DNA構築體。該重組DNA構築體包含一與其天然啟動子以及5’UTR可操作地連接的第一GLK 基因，以及一與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接的第二GLK 基因。該第二GLK 基因與該第一GLK 基因不同，該兩個GLK 基因來自一C4植物。因此，它們與稻米異源。
於一示例性重組DNA構築體中，該第一GLK 基因為Zea mays GLK1 ，且該第二GLK 基因為Zea mays GLK2 。
一特定的重組DNA構築體包含（i）一編碼如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列的第一GLK 基因，且其受其具有如SEQ ID NO: 1所示之序列的天然啟動子/5’UTR的控制，以及（ii）一編碼如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列的第二GLK 基因，且其受其具有如SEQ ID NO: 4所示之序列的天然啟動子/5’UTR的控制。
在特定的重組DNA構築體中，該第一GLK 基因由具有如SEQ ID NO: 2所示之序列的核酸編碼，而該第二GLK 基因由具有如SEQ ID NO: 5所示之序列的核酸編碼。
無需進一步闡述，相信本領域技術人員可基於本文之公開內容最大限度地利用本發明內容。因此，以下具體實施例被解釋為僅為描述性的，並且無論如何不以任何方式限制本發明之其餘部分。本文引用之所有出版物及專利文件均透過引用整體併入。
實施例 1：用於農桿菌媒介的稻米轉形作用的玉米GLK 構築體
五種玉米GLK構築體透過以下實施例7中提到之標準技術製備，包含圖1中所示的基因及調控序列。
稻米（Oryza sativa cv. TNG67）癒傷組織誘導、與農桿菌共培養、轉形癒傷組織的潮黴素篩選，以及植株再生依照Yeh等人2015年（Rice 8:36-48）之方法進行。將所有陽性轉基因幼苗移植到土壤中並在一溫室中培養以進行分子、生理，以及解剖學分析。透過熱不對稱交錯（thermal asymmetric interlaced，TAIL）-PCR 確定轉基因插入位置。TAIL-PCR的條件先前在Liu 等人2005年（Methods Mol. Biol. 286:341-348）以及Møller等人2009年（Plant Cell 21:2163-2178）中描述過。使用根據Tail-PCR確定的轉基因插入位點側翼的3’以及5’端區域設計的基因分型引子，以基因分型 PCR 篩選同基因型組合的基因轉殖植物。
實施例 2：玉米GLK 構築體在基因轉殖稻米植物中之表現
透過qRT-PCR以及西方墨點分析確定玉米GLK 基因的表現量，如下文實施例7中所述。結果如圖2A-2D中所示。
泛素以及35S啟動子過度驅動了所有基因轉殖稻米組織中玉米GLK 基因的表現。在pZmUbi::ZmG1基因轉殖植物的葉片中檢測到大量GLK蛋白，反映ZmG1 在葉片中的高表現量。參見圖2B。
異基因型組合的pZmG2::ZmG2植株生長發育延遲1個月，而同基因型組合的的pZmG2::ZmG2幼苗在培養兩個月後死亡。這表示pZmG2::ZmG2植物中玉米GLK2 的高量表現抑制了植物的生長及發育。
在pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖植物的所有研究組織中，ZmG1 的表現得到促進而ZmG2 的表現受到抑制，進而提供這兩個基因在pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖稻米中協調表現的證據。
稻米內源性GLK1 以及GLK2 基因在玉米GLK 基因轉殖稻米植株中的表現量普遍降低。
實施例 3：基因轉殖稻米植物中生長及葉綠體的特徵描述。
相較於所有其他測試的稻米植物，pZmG2::ZmG2（異基因型組合）稻米植物的開花及結實延遲了一個月。參見圖3A。
穿透式電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）分析顯示，稻米中玉米GLK 基因的表現誘導了所有五個基因轉殖稻米品系的葉肉（M）以及束鞘（BS）細胞中大葉綠體的發育。與WT相似，所有GLK 基因轉殖稻米植株的M及BS葉綠體結構都具有完整的顆粒結構及類囊體膜。
相對於WT，所有5種GLK 基因轉殖植物的旗葉及小花內的葉綠素含量分別增加18-39%以及10-127%，旗葉中核酮糖雙磷酸羧化酶（Rubisco）活性以及蛋白質含量分別增加了27-28%以及21-28%。見圖3B、3C，以及3D。這些觀察結果與增加的葉綠體發育以及相關基因的表現一致。
顯然，這五種基因轉殖稻米品系的所有光合功能都顯著增強，特別是在pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖植物中。
實施例 4：光飽和光合速率
分析旗葉以測量光合作用，因為它們比其他葉子對穀粒生長的貢獻更大。相較於WT，所有5種GLK 基因轉殖植物的旗葉光合速率增加了5-11%。 參見圖4。在pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖稻米植物中觀察到最高的光合速率。
實施例 5：生長性狀及穀物產量
相較於WT（100%），所有5種GLK 基因轉殖植物的每株植物的總枝條生物量（109-180%）以及總穗數（137-224%）均增加，這主要是由於產生了額外的分蘗。參見圖5A及5B。
基因轉殖pZmG1::ZmG1以及pZmG2::ZmG2（異基因型組合）稻米植株的每株植物的總穀粒重分別增加了51%以及47%，同時伴隨著1000粒穀粒重量的適度下降，亦即1-10%。參見圖5C及5D。
令人驚訝的是，pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2稻米植株每株植物的總穀粒重增加最高達95%，平均增加70%。 參見圖5C。
pZmUbi::ZmG1植物由於穀粒重量減少15%而未顯示總穀物產量顯著增加。因此，雖然組成型泛素啟動子增加了生物量（參見圖5A），但其導致生殖生長減少。
不受理論的束縛，據信在強玉米泛素啟動子的驅動下，玉米GLK1 的高量表現可能會抑制生殖生長及發育。
實施例 6：基因轉殖稻米植株之轉錄組分析
如前所述，自WT、pZmG1::ZmG1、pZmG2::ZmG2，以及pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖植物的4天大幼苗的枝條及根中分離總 RNA。參見劉等人2013年（PNAS 110:3979-3984）。轉錄組分析亦按照Liu等人（2013年）的描述進行。結果示於圖6A及6B。
上調差異表現基因
pZmG2::ZmG2枝條在與生物/非生物刺激以及幾丁質分解代謝過程相關的基因本體（GO）註釋條目中顯著富集（參見圖6A），而pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2枝條主要在脂質運輸的GO註釋條目中富集（圖6B）。
pZmG1::ZmG1根顯著在轉錄調節相關的GO註釋條目中富集，而pZmG2::ZmG2根在生物逆境反應的GO註釋條目中富集，包含脂氧素（oxylipin）生合成過程（茉莉酸甲酯生合成途徑）、幾丁質分解代謝過程，以及植物防禦素代謝過程。顯然，在稻米中，兩個玉米GLK 基因都刺激葉綠體發育，但ZmG1 的作用較像是轉錄調節因子，而ZmG2 的作用較像是防禦調節因子。
pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2根在轉錄調節相關的GO註釋條目中富集（也見於pZmG1::ZmG1根）、幾丁質分解代謝/植物防禦素生合成過程（也見於pZmG2::ZmG2根）以及光合作用活化相關途徑、吉貝素（GA）代謝過程、類異戊二烯生合成過程、木聚醣分解代謝過程，以及蛋白質泛素化。
總之，這些結果表示這兩個玉米GLK 基因以互補的方式促進稻米光合作用、代謝，以及逆境反應。
下調差異表現基因
pZmG2::ZmG2根表現出對參與離子轉運、胺生合成過程、硫化合物生合成過程，以及天門冬胺酸家族胺基酸生合成過程的基因下調中富集，而pZmG1::ZmG1 /pZmG2::ZmG2根主要在胺生合成以及離子轉運的下調中富集。見圖6A及6B。這表示當ZmG1 與ZmG2 在稻米中共表現時，ZmG1 可能會部分抵消ZmG2 的抑制功能。這與pZmG2::ZmG2植物的幼苗在萌發後在枝條及根中均表現出發育遲緩的觀察結果一致，以及與具有ZmG2 基因高量表現的同基因型組合的pZmG2::ZmG2植物在生長兩個月後死亡的觀察一致。
實施例 7：材料與方法
啟動子及基因選殖
使用十六烷基三甲基溴化銨方法從玉米葉（White Crystal，一種糯質玉米品種）中萃取基因組DNA。基於Ensembl植物資料庫中的ZmG1（GRMZM2G026833）以及ZmG2（GRMZM2G087804）的序列（可在plants.ensembl.org/index.html網站上找到），以聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction，「PCR」）選殖玉米GLK1 啟動子（ZmG1；下表1中的引子SEQ ID NOs: 9及10）以及G2 啟動子（ZmG2；引子SEQ ID NOs: 11及12），兩者均含有5’-UTR區域。如Liu等人，PNAS 110:3979-3984（2013年）所述，從玉米胚葉中萃取總RNA並用於合成cDNA。以PCR使用下表1中所示之特異性引子（ZmG1: SEQ ID NOs: 13及14；ZmG2: SEQ ID NOs: 15及16）選殖ZmG1以及ZmG2 cDNA。ZmG1以及ZmG2的啟動子及全長cDNA的序列透過定序得到證實。 表 1. 引子序列
引子  序列（5’至3’） SEQ ID NO:
G1 啟動子_F CCAACCCTGCATATCTTGC 9
G1 啟動子_R GGCGACACTGCAAGCATATC 10
G2 啟動子_F GCTATCTCCAACCACGGCTC 11
G2 啟動子_R CTTGCTGCCGCTGCTAGTAG 12
G1 cDNA_F ATGCTTGCAGTGTCGCCGTC 13
G1 cDNA_R TCATCCACAAGCTTGCGGCAC 14
G2 cDNA_F ATGCTTGAGGTGTCGACGCTGCGC 15
G2 cDNA_R TCATCCGGTGGCGCCGGTGG 16
G1p_F（XbaI） CGTCTAGACCAACCGCTGCATATCTTG 17
G1p_R（BhI） CAGGATCCGGCGACACTGCAAGCATA 18
G2p_mF（HdIII） TGGCTTGGCACATGAAGCTT 19
G2p_R（BhI） CAGGATCCACTTGCTGCCGCTGCTAG 20
G1_cDNA_F（BglII） GGAGATCTATGCTTGCAGTGTCG 21
G1_cDNA_R（BglII） GGAGATCTTCATCCACAAGCTTGCG 22
G2_cDNA_F（BglII） GGAGATCTATGCTTGAGGTGTCG 23
G2_cDNA_F（BglII） ATAGATCTTCATCCGGTGGCGCC 24
SP0 TCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGA 25
SP1 TAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATA 26
SP2 AATCCAGTACTAAAATCCAGATCC 27
AD1 GTNCGASWCANAWGTT 28
AD2 GWGNAGWANCASAGA 29
AD3 NTCGASTWTSGWGTT 30
GT_F_G1 CGATCGTGTTGGCACGTGATG 31
GT_R_G1 TCGAAGAGTCAACCTTCGAGGTC 32
GT_F_G2 GCCTTGGAGGAAGTAGAACAGC 33
GT_R_G2 GTAGGTTTGGGAAATCTTTCAGC 34
GT_F_G1G2 GTGACCGGAATCCCTCTCAAG 35
GT_R_G1G2 GTTGCACTGTGTGTACTAGTC 36
G1p_F CCAACCGCTGCATATCTTG 37
G1p_R GGCGACACTGCAAGCATA 38
G2p_F TGGCTTGGCACATGAAGCTT 39
G2p_R CACTTGCTGCCGCTGCTAG 40
G1_mF GTCGTTCTGGCACCATGCTTAC 41
G2_mF CGCACAGAAAGCACCTGATGG 42
NOS_R TCATCGCAAGACCGGCAACA 43
G1-F1 qPCR GCACATAGGCGCCGTGGATCC 44
G1-R1 qPCR TTACCGGCGGCTGCTACCTCG 45
G2-F qPCR GACAAAGGTGTAGCAGTAGCCGCCGC 46
G2-R qPCR CGTTGGAGTTCTTGCCCGCCGACTTC 47
OsGLK1-F qPCR GATGCTGGCATGGAGGTCGTC 48
OsGLK1-R qPCR TGCACACCTTCGCCTCCACTC 49
OsGLK2-F qPCR GTGACGACGGAGGATTCCTCG 50
OsGLK2-R qPCR CCGATGACGACGACGACGACG 51
OsFRD3_F_exon 1 CGCGCTGTCCAAGGCCTATCTCT 52
OsFRD3_R_exon 1 GCAACAGCATGGGGAGCATTGG 53
OsFRD3_F_exon 6 GGCTTGGCATAACTGGAGCTGC 54
OsFRD3_R_exon 6-7 AACTCAAAGCCCCCTGGGAGAG 55
OsFRD3_F_exon 7 GGTGGCATGCTGTTAGGAAGAACCC 56
OsFRD3_R_exon 7 GCCATAGCTGTTGGGCCTTGTCG 57
17S rRNA_F GATAACTCGACGGATCGCACGG 58
17S rRNA_R GCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTG 59
OsActin_F ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA 60
OsActin_R ATCCAACCGGAGGATAGCATG 61
HptII_F GACCTGATGCAGCTCTCGGAG 62
HptII_R TGCTCCATACAAGCCAACCACG 63
轉形載體之構築
在玉米或組成型啟動子的控制下，製備五種構築體以在稻米中表現ZmG1 以及ZmG2 基因。以PCR選殖這兩個基因的玉米啟動子及全長cDNA，並次選殖至轉形載體pCAMBIA或Geteway（Invitrogen公司）中。使用特異性引子（表1中的SEQ ID NOs: 17-24）產生具有相容限制性位點的PCR片段。ZmG1啟動子及cDNA片段的5’及3’端分別以XbaI/BamHI以及BglII處理，ZmG2啟動子及cDNA片段的5’及3’端分別以HindIII/BamHI以及BglII 處理。融合至其cDNA（1428 bp；SEQ ID NO: 2）的ZmG1啟動子（2134 bp；SEQ ID NO: 1）以及融合至其cDNA（1386 bp；SEQ ID NO: 5）的ZmG2啟動子（1942 bp；SEQ ID NO: 4）分別連接到含有胭脂鹼合成酶終止子的中間載體中，以獲得 ZmG1p::ZmG1以及ZmG2p::ZmG2片段。中間載體中的所有片段均透過限制性內切酶消化分析確認。隨後，將來自中間載體的以EcoRI消化的ZmG1p::ZmG1片段以及以HindIIII/EcoRI消化的ZmG2p::ZmG2片段連接到pCAMBIA1300的EcoRI以及HindIIII/EcoRI 位點，以產生pZmG1::ZmG1以及pZmG2::ZmG2構築體。此外，將以EcoRI切割的ZmG1p::ZmG1片段選殖至ZmG2p::ZmG2載體的相同限制酶切位以生成pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2構築體。
為了在組成型啟動子控制下在稻米中表現玉米G1及G2，將含有ZmG1或ZmG2 cDNA的Gateway進入選殖株分別轉移到在玉米泛素啟動子控制下的Gateway供體載體pCAMBIA1302或在35S啟動子控制下的pH2GW7以產生pZmUbi::ZmG1以及p35S::ZmG2構築體。
包含用於篩選的潮黴素磷酸轉移酶II基因的pZmUbi::ZmG1、p35S::ZmG2、pZmG1::ZmG1、pZmG2::ZmG2，以及pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2構築體分別透過電穿孔而轉染至農桿菌（Agrobacterium tumefaciens ）EHA105菌株中。所有的構築體都在圖1中以圖表形式顯示。
稻米轉形
根據Yeh等人，2015年，Rice 8:36-48進行稻米（Oryza sativa 栽培品種TNG67）癒傷組織誘導、與農桿菌共培養、轉形癒傷組織的潮黴素篩選，以及植株再生。將所有基因轉殖陽性幼苗移植到土壤中並於溫室中進行分子、生理以及解剖學分析。
透過熱不對稱交錯（TAIL）-PCR確定轉基因插入位置
TAIL-PCR的條件如Liu等人（2013年）以及Møller等人（2009年）所述。以T0基因轉殖植物的基因組DNA作為模板用於三個連續運行的PCR，該PCR使用短的任意簡併引子（AD；SEQ ID NOs: 28-30）以及三個特異性巢式引子（SP0；SEQ ID NO: 25，SP1；SEQ ID NO: 26以及SP2；SEQ ID NO: 27）以擴增 T-DNA側翼基因組DNA區域。Tail-PCR產物被純化並定序。以BLAST將PCR產物序列與在Ensemble Plants中的溫帶粳稻（Oryza sativa Japonica）群DNA序列（可在plants.ensembl.org/Multi/Tools/Blast?db=core網站上獲得）進行比較，以確定轉基因在稻米染色體上的插入位點。然後將鑑定的序列用於評估基因轉殖植物的接合狀態。
透過基因分型 PCR 篩選同源基因轉殖植物
基因分型引子係從以Tail-PCR確定的轉基因插入位點側翼的3’以及5’端區域設計的。基因組特異性引子對（GT-F以及GT-R；SEQ ID NOs: 31-36）是基於跨假定插入位點的染色體DNA序列設計的。此外，轉基因特異性SP2以及基因組特異性引子GT-R用於篩選具有轉基因插入的基因轉殖植物。使用Phire Plant Direct PCR Master Mix（Thermo Scientific公司）按照操作手冊從T1基因轉殖植物的葉組織中萃取DNA。在PCR反應中，以兩個引子組（基因組特異性GT-F與GT-R引子，以及轉基因特異性SP2與基因組GT-R引子；表 1）進行PCR擴增。由於不含轉基因，WT僅產生一種來自基因組特異性引子對的PCR產物。異基因型組合的基因轉殖植物透過（i）由基因組特異性引子對擴增基因組序列的未被破壞的DNA鏈以及（ii）由SP2與GT-R引子擴增存在轉基因的一股DNA鏈而產生兩種 PCR產物。相較之下，由於兩股DNA鏈都被特定位點的轉基因插入破壞，因此在同基因型組合的基因轉殖植物中只能看到來自SP2以及GT-R引子的一種 PCR產物。篩選後，從陽性同基因型組合的植物的幼葉中分離基因組DNA，以透過PCR進一步確認玉米GLK基因的存在。
DNA 萃取以及 PCR
為了檢測基因轉殖稻米植物中的玉米GLK基因，在PCR分析中使用特異性引子（參見表 1，SEQ ID NOs: 37-43）。透過上述CTAB方法從WT以及代表性基因轉殖稻米植株的幼葉中分離基因組DNA。玉米GLK基因的PCR擴增在以下條件下於熱循環儀中進行：94°C/5分鐘，94°C/30秒、58°C/30秒，以及72°C/30秒的30個循環，以及最後在72°C/5分鐘進行延伸。
南方氏墨點分析
基因組DNA的製備以及南方氏凝膠墨點分析按照Yeh等人（2015年）先前的描述進行。從以基因組PCR證實存在玉米GLK基因的基因轉殖植物中分離基因組DNA，以HindⅢ於37°C下消化16-18小時，在1%瓊脂凝膠上進行電泳，並轉移至一尼龍膜上進行探針雜交。按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（Roche公司）中的指示，使用長葉毛地黃配質-dUTP探針進行隨機引子DNA標記。
RNA 萃取以及即時定量 PCR （ qRT-PCR ）
使用TRIZOL試劑（Invitrogen公司）自WT以及基因轉殖植物的葉片中分離總RNA，並透過酸性苯酚-氯仿萃取進行純化。cDNA合成以及qRT-PCR按照Yeh等人的描述進行。用於擴增目標基因（SEQ ID NOs: 44-57）以及17S基因（登錄號X00755；SEQ ID NOs: 58及59）作為標準化表現值的內部對照的基因特異性引子列於表1中。
轉錄組分析
使用TRIZOL試劑（Invitrogen公司）從WT、pZmG1::ZmG1、pZmG2::ZmG2，以及pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖植物的4天大的幼苗的枝條及根中分離總RNA。樣品製備以及轉錄組分析使用Liu等人之方法完成。使用Tophat（2.0.10 版）處理定序讀數並將其定位至稻米基因組（IRGSP-1.0）。每個讀數都對齊，最多允許10次命中。使用Cufflinks（版本 2.1.1）評估每個基因的表現量，亦即每百萬個定位的讀數中每千個鹼基外顯子的讀數（reads per kilobase exon per million reads mapped，「RPKM」）。至少一個樣本中RPKM ≥1的基因被認為是「表現的」並被選擇用於進一步分析。為了比較WT、pZmG1::ZmG1、pZmG2::ZmG2，以及pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2基因轉殖植物的枝條及根中所選基因的表現量，採用Bullard等人，2010 年，BMC Bioinform. 11:94中所述的上四分位數標準化程序。Tarazona等人的非參數方法（2011年，Genome Research 21:2213-2223）被用來鑑定兩個樣本之間的差異表現基因（differentially expressed genes，「DEGs」），該方法中的q值（差異表現概率）設置為0.740。以本研究中所有表現基因的背景集進行功能富集分析。將錯誤發現率（false discovery rate，「FDR」）＜ 0.05 的Fisher精確檢驗與MapMan的功能註釋一起應用（請參閱 mapman.gabipd.org網站）。針對DEGs的功能分類，GO分析採用AgriGO V2軟體進行Fisher精確檢驗，FDR ≤ 0.05，得到基於生物程序的GO註釋。
DEGs 的 GO 分析
為了對DEGs的生物學功能進行分類，使用基於生物學過程的AgriGO V2軟體進行GO分析。有向無環圖（direct acyclic graph，「DAG」）繪圖是一種可視化工具，用於說明重要的GO註釋條目。DAG基於GO結構的性質，指示註釋條目之間的相互關係。為了研究GLK基因對每個基因轉殖稻米的影響，使用 ≤ 0.05 的錯誤發現率（FDR）分析來自根及枝條的上調與下調的DEGs。
蛋白質純化以及西方墨點分析
如前所述，從新成熟的葉子中萃取總可溶性蛋白質用於 SDS-PAGE以及西方免疫檢測分析（參見Dai 等人，1994年，Planta 192:287-294以及Ku等人，1999年，Nat. Biotechnol. 17:76-80）。如Ku等人所述，製備抗玉米 Rubisco大次單位的抗體。此外，將與玉米GLK基因（SEQ ID NO: 7）共有的 OsGLK1部分681 bp序列選殖至pET21b載體中以產生用於產生抗GLK抗體的重組蛋白。透過親和色層分析（Yao-Hong Biotechnology Inc.，台灣）純化針對稻米/玉米GLK部分胜肽產生的抗體。
葉綠素測量以及 Rubisco 測定
收集旗葉或小花的葉段並以96%乙醇萃取。葉綠素含量由波長665 nm以及649 nm處的吸光度計算，並以葉面積或鮮重表示。如前所述測定Rubisco的活性。參見Pyankov等人，2000年，Photosynth. Res. 63:69-84。 酶活性基於葉綠素含量或葉面積。
光合作用測量
在夏季開花期間在溫室內生長的四個月大稻米植物的主要分蘗上完整旗葉的中段用於使用CIRAS2便攜式光合作用系統（PP 系統，Amesbury，麻州）測量CO2 以及H2 O的交換。測量在晴天的上午7:00至12:30進行，條件為2000 μmol m-2 s-1 光子通量密度、30o C 葉溫、70%相對濕度，以及415 ppm CO2 。記錄穩態光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、細胞間二氧化碳濃度（Ci），以及蒸散速率（E）。
穿透式電子顯微鏡
將旗葉樣品（1 mm x 2 mm）固定在含有1%戊二醛的0.1 M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液中，pH 7.2，4°C 過夜。在緩衝液中沖洗3次，每次20分鐘之後，將樣品在含有1% OsO4 的相同緩衝液中固定2小時，然後在室溫下沖洗3次，每次20分鐘，並更換緩衝液。樣品在丙酮系列中脫水，嵌入Spurr樹脂中，並以Lecia Reichert Ultracut S或Lecia EM UC7超薄切片機切片。超薄切片（70-90 nm）以5% 醋酸雙氧鈾/50%甲醇以及0.4%檸檬酸鉛/0.1N NaOH染色。使用80 KV的FEI G2 Tecnai Spirit Twin穿透式電子顯微鏡進行觀察，並使用Gatan Orius CCD相機記錄影像。
農藝性狀研究
WT以及GLK基因轉殖稻米植物在3月至8月之間，於自然陽光條件下在溫室中的5升盆（一株/盆）中栽培。植物每天澆水，每週施肥。成熟後，種子於43°C而枝條於60°C下乾燥兩天後，分析總地上生物量、總穗數、1000粒穀粒重量，以及每株植物的總穀粒重。
其他具體實施例
本說明書中所公開之所有特徵可以任何組合進行組合。本說明書中所公開之每個特徵可被用於相同、等效或類似目的的替代特徵替換。因此，除非另有明確說明，所公開之每個特徵僅為等效或相似特徵的通用系列之示例。
由以上描述，本領域技術人員可以很容易地確定本發明之本質特徵，並且在不脫離本發明之精神及範圍的情況下，可對本發明進行各種變化及修改以適應各種用途及條件。因此，其他具體實施例也在所附申請專利範圍之範圍內。
無
以下描述參照附圖，其中：
圖1為用於農桿菌媒介的稻米轉形的五種玉米GLK 構築體之示意圖，以比較它們對基因表現及植物生長與產量的影響。pUbi：泛素啟動子；p35S：35S啟動子；Zm：Zea mays （玉米）；pZmG1::ZmG1：玉米GLK1 構築體，具有其自身的啟動子及5’UTR；pZmG2::ZmG2：玉米GLK2 構築體，具有其自身的啟動子及5’UTR；HygR：潮黴素抗性基因；ZmG1：玉米GLK1 基因；ZmG2：玉米GLK2 基因；35ST：35S終止子；NOST：胭脂鹼合成酶（nopaline synthase，nos）終止子；pro：啟動子；LB：左邊框；以及RB：右邊框。
圖2A所示為不同玉米組織中ZmG1 （左）以及ZmG2 （右）的相對基因表現量圖，係透過分離自9天大幼苗的幼葉（YL）、2個月大植物的成熟葉（ML），以及幼莖（S）、雄花序（T），以及根（R）的總RNA進行定量即時聚合酶連鎖反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，「qRT-PCR」）來測定。數值為平均值 ± 三個重複的標準差（S.D.），並標準化為17S rRNA的表現量。
圖2B所示為ZmG1 （左）以及ZmG2 （右）的相對基因表現量的圖，係透過來自野生型（WT）以及基因轉殖稻米植物的總RNA進行qRT-PCR來確定。基因轉殖稻米植物帶有如圖1所標記之轉基因構築體。從成熟的葉子（L）、莖（S）、小花（F），以及根（R）中分離出總RNA。異基因型組合的pZmG2::ZmG2植物以及其他四種基因轉殖植物的同基因型組合的植物如圖所示；由於高基因表現量，該同基因型組合的pZmG2::ZmG2植物在培養兩個月後死亡。數值為平均值 ± 三個重複的標準差（S.D.），並標準化為17S rRNA的表現量。
圖2C包含以qRT-PCR測量的WT以及基因轉殖稻米植物的不同組織中OsGLK1 以及OsGLK2 的表現量的圖。組織來源及基因轉殖稻米植物如圖2B 之圖例所述。數值為平均值 ± 三個重複的標準差（S.D.），並標準化為17S rRNA的表現量。
圖2D所示為使用抗稻米及玉米GLK蛋白共有胜肽的抗體對玉米幼葉、成熟WT稻米旗葉，以及基因轉殖稻米旗葉中的GLK蛋白進行的西方墨點分析。在每個泳道中加入相同量的總葉蛋白（20 μg）。RbcL作為內部對照，並以玉米葉蛋白作為GLK的陽性對照。M：分子量標記。
圖3A所示為4 個月大的WT以及基因轉殖稻米植物的照片。轉基因的標記如上圖1所示。
圖3B為所示野生型以及基因轉殖稻米植株旗葉中每葉面積的葉綠素含量的柱狀圖，以μg/cm2 表示。圖表上方所示為每葉面積的相對葉綠素含量，以相對於野生型植物的百分比表示，野生型植物設定為100%。相對於WT的統計顯著性（*P ＜0.05; **P ＜0.01; ***P ＜0.001）如圖所示。數據 = 平均值 ± S.D.，n = 4（從三種不同植物的葉部分獲得的每個樣本）。
圖3C為所示野生型及基因轉殖稻米植物小花中每10粒的葉綠素含量之柱狀圖，以μg/10粒表示。構築體及統計顯著性數值如圖3B的圖例所示。
圖3D所示為透過酶活性分析的核酮糖雙磷酸羧化酶（ribulose bisphosphate carboxylase，rubisco）含量的柱狀圖（上圖）以及旗葉中每葉面積的總可溶性蛋白質含量（下圖）。統計檢驗基於成對t-檢驗。星號表示相較於WT的統計顯著性程度（*P ＜0.05; **P ＜0.01; ***P ＜0.001）。數據 = 平均值 ± S.D.，n = 4（每個樣品均來自三種不同植物的葉部分）。基因轉殖植物如上所述。
圖4所示為4個月大的WT以及GLK 基因轉殖稻米植株的旗葉中每葉面積的光飽和光合速率，以μmol/m2 /s表示。該圖所示為數值範圍、25%至75% 的四分位數（框）以及平均值（水平線）。測量條件為2000 μmol/m2 /s PPFD、30o C，以及400 μL/L CO2 。統計檢驗基於Wilcoxon-Mann-WhitneyU -檢驗，用於兩組的非參數比較。星號表示相較於WT具有統計學意義（**P ＜0.01，n = 6）。構築體如上所述。
圖5A所示為WT以及5種GLK 基因轉殖稻米植株的總枝條生物量乾重/植株。植物在5月至9月之間於溫室中生長。統計檢驗如上針對圖4所述。星號表示統計顯著性程度（*P ＜0.05; **P ＜0.01; ***P ＜0.001，n = 9）。轉基因構築體如圖1所示。
圖5B為WT以及5種GLK 基因轉殖稻米植株每株植株總穗數的圖。構築及統計分析如圖5A之圖例所示。
圖5C所示為WT以及上述5種GLK 基因轉殖稻米植株的每株植株總穀粒重。構築及統計分析如圖5A之圖例所示。
圖5D所示為WT以及5株GLK 基因轉殖稻米植物的每株植株1000顆穀粒的乾重。構築及統計分析如圖5A之圖例所示。
圖6A所示為相對於WT，基因轉殖植物pZmG1::ZmG1、pZmG2::ZmG2，以及pZmG1::ZmG1/pZmG2::ZmG2幼枝中差異表現基因的生物程序類別基因本體（Gene Ontology，GO）註釋條目富集分析結果。塗色的格子表示上調（左圖）或下調（右圖）的生物程序。
圖6B所示為相對於WT，基因轉殖植物（如上標記）的幼枝中差異表現基因的GO註釋條目富集分析。塗色的格子表示上調（左圖）或下調（右圖）的生物程序。
無
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Claims (20)

  1. 一種基因轉殖稻米植物，在其基因組中包含重組DNA構築體，該構築體包含第一核酸，該第一核酸具有與其天然啟動子及5’非轉譯區（5’ untranslated region，5’UTR）可操作地連接的第一Golden 2-like轉錄因子（GLK ）基因的序列，以及第二核酸，該第二核酸具有與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接的第二GLK 基因的序列，該第二GLK 基因不同於該第一GLK 基因， 其中該第一GLK 基因以及該第二GLK 基因皆為異源的，且相較於未轉形的野生型稻米植物，該基因轉殖稻米植物表現至少50%增加的枝條生物量及穀物產量。
  2. 如請求項1之基因轉殖稻米植物，其中該第一GLK 基因以及該第二GLK 基因來自C4植物。
  3. 如請求項2之基因轉殖稻米植物，其中該第一GLK 基因為玉米（Zea mays ）GLK1 ，且該第二GLK 基因為Zea mays GLK2 。
  4. 如請求項1之基因轉殖稻米植物，其中該第一核酸序列包含編碼具有如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列的蛋白質的第一編碼序列，以及該第二核酸序列包含編碼具有如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列的蛋白質的第二編碼序列。
  5. 如請求項4之基因轉殖稻米植物，其中該第一GLK 基因的天然啟動子及5’UTR具有如SEQ ID NO: 1所示之序列，以及該第二GLK 基因的天然啟動子及5’UTR具有如SEQ ID NO: 4所示之序列。
  6. 如請求項4之基因轉殖稻米植物，其中該第一編碼序列為SEQ ID NO: 2，以及該第二編碼序列為SEQ ID NO: 5。
  7. 如請求項1之基因轉殖稻米植物，其中相較於該未轉形的野生型稻米植物，該基因轉殖稻米植物的穀物產量提高50%至95%。
  8. 一種生產基因轉殖稻米植物之方法，該方法包含： 將一重組DNA構築體引入宿主稻米植物，該構築體包含第一核酸序列，該第一核酸序列包含與其天然啟動子及 5’UTR可操作地連接的第一Golden 2-like轉錄因子（GLK ）基因，以及第二核酸序列，該第二核酸序列包含與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接的第二GLK 基因，該第二GLK 基因不同於該第一GLK 基因，該第一GLK 基因以及該第二GLK 基因為異源的；以及 鑑定基因轉殖稻米植物，該基因轉殖稻米植物相較於未轉形的野生型稻米植物表現至少增加50%的枝條生物量及穀物產量。
  9. 如請求項8之方法，其中該第一GLK 基因以及該第二GLK 基因來自C4植物。
  10. 如請求項9之方法，其中該第一GLK基因為玉米（Zea mays ）GLK1 ，該第二GLK 基因為玉米(Zea mays) GLK2 。
  11. 如請求項8之方法，其中該第一核酸序列包含編碼具有如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列的蛋白質的第一編碼序列，以及該第二核酸序列包含編碼具有如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列的蛋白質的第二編碼序列。
  12. 如請求項11之方法，其中該第一GLK 基因的天然啟動子及5’UTR具有如SEQ ID NO: 1所示之序列，以及該第二GLK 基因的天然啟動子及5’UTR具有如SEQ ID NO: 4所示之序列。
  13. 如請求項8之方法，其中該第一編碼序列為SEQ ID NO: 2，以及該第二編碼序列為SEQ ID NO: 5。
  14. 如請求項8之方法， 其中相較於該未轉形的野生型稻米植物，該基因轉殖稻米植物的穀物產量提高50%至95%。
  15. 如請求項8之方法，其中相較於該未轉形的野生型稻米植物，該基因轉殖稻米植物的枝條生物量提高65%至106%。
  16. 一種重組DNA構築體，包含 第一核酸序列，該第一核酸序列包含與其天然啟動子及 5’UTR可操作地連接的第一Golden 2-like轉錄因子（GLK ）基因，以及第二核酸序列，該第二核酸序列包含與其天然啟動子及5’UTR可操作地連接的第二GLK 基因，該第二GLK 基因不同於該第一GLK 基因，其中該第一GLK 基因以及該第二GLK 基因來自C4植物。
  17. 如請求項16之重組DNA構築體，其中該第一GLK 基因為玉米（Zea mays ）GLK1 ，且該第二GLK 基因為玉米(Zea mays) GLK2 。
  18. 如請求項16之重組DNA構築體，其中該第一核酸序列包含編碼具有如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列的蛋白質的第一編碼序列，以及該第二核酸序列包含編碼具有如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列的蛋白質的第二編碼序列。
  19. 如請求項18之重組DNA構築體，其中該第一GLK 基因的天然啟動子及5’UTR具有如SEQ ID NO: 1所示之序列，以及該第二GLK 基因的天然啟動子及5’UTR具有如SEQ ID NO: 4所示之序列。
  20. 如請求項18之重組DNA構築體，其中該第一編碼序列為SEQ ID NO: 2，以及該第二編碼序列為SEQ ID NO: 5。
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