TW202146052A - 兩親性海藻酸-油酸大分子及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種新穎的疏水修飾的海藻酸鈉，其係透過海藻酸以及油酸以一間隔基連接所合成的。由此獲得的AGO大分子為兩親性的且具有臨床上可行的分子大小及抗癌活性。由此形成的AGO奈米粒子在體外及體內皆顯現出優異的結構穩定性、膠體穩定性，以及生物相容性，並有望應用於生物醫學領域中，例如藥物遞送系統。

Description

兩親性海藻酸-油酸大分子及其製備方法
本發明涉及兩親性海藻酸-油酸大分子，其可作為活性劑如藥物或生物材料的遞送系統。
奈米粒子通常被提議作為一種遞送系統，以遞送生物的一種或多種生物活性材料或試劑，例如藥物、生物物質或細胞。通常，將生物活性劑摻入(或「載入」)到奈米粒子中一直是個挑戰，因為可摻入的量有限或需要大量時間才能摻入材料(例如，透過擴散)。此一挑戰將限制奈米粒子作為生物活性劑的遞送機制的實際或商業用途。
海藻酸鈉為一種生物聚合物，以其生物相容性、無毒以及非免疫原性等特性而聞名，並已獲得FDA核准用於從傷口包紮到注射的某些臨床應用。海藻酸已被廣泛作為醫學材料，例如藥物遞送、傷口敷料、細胞培養以及組織再生。海藻酸通常在藥物應用中作為增稠劑、凝膠形成劑，以及穩定劑。口服劑型為目前藥物應用中最常見的，而且近年來海藻酸在標靶藥物傳遞系統中的使用正在迅速增長。有幾種方法將海藻酸作為藥物載體，例如與殼聚醣組合的凝膠作用、前藥及/或兩親修飾作用。Boontheekul等人報導了在1.5小時內自離子交聯的部分氧化的海藻酸凝膠中釋放出氟白普洛芬(flurbiprofen)。透過與殼聚醣形成離子錯合物，由於相反的電荷，相較於模擬胃環境(pH 1.2)下，這種海藻酸-殼聚醣錯合物在模擬腸環境(pH 7.5)下顯現出pH依賴性與較高的膨脹度，並且自該粒子系統中觀察到更快的藥物釋放。這種pH依賴性膨脹的特殊性質使其能夠被動地以胃腸道為目標。 [4] 在延長釋放的進階版本中，研究人員使用離子與共價交聯(鈣離子與己二酸二醯肼)的組合來增加交聯的比例並減少膨脹。
海藻酸用於調節疏水性物質的釋放，這已成為一個有吸引力的研究目標，且在近幾十年受到了廣大的注意，其中兩親性修飾以及天然海藻酸的親水性主鏈在應用於奈米藥物的進階生物材料的開發中似乎更加有趣且富挑戰性。
據報導，在體內研究中，分子量通常控制在70 KDa以下的海藻酸鈉能夠透過腎臟清除代謝。此外，從許多報導中，許多疏水性物質包括酯基、乙烯基或雜環化合物經常被用於與沿著海藻酸骨架的羥基或羧基部分化學或共價結合，進而產生修飾的海藻酸的兩親性性質。這使得修飾的海藻酸具有自組裝能力，並使該修飾的海藻酸更適用於藥物包囊以及控制遞送親水性及/或疏水性藥物或兩者之組合，並具有增強的治療效果。
未經例如水解及氧化等任何處理的商業化藻酸鈉，由於其高分子量(亦即，＞ 600 kDa)以及廣泛的分子量分佈，因此不適合作為合成奈米粒子的基礎材料。楊等人報導一種基於未經處理的海藻酸鈉的藥物載體(OAAD，辛基接枝的兩親性海藻醯胺衍生物)。其結果展現出大而廣泛的粒徑分佈(亦即，0.8-10 μm)。為了代謝進入人體的海藻酸鈉，分子量必須低於腎臟的腎清除閾值(亦即，＜ 70 kDa)。如果可以在不改變修飾的海藻酸的臨床優勢(如，最終在醫學實作中使用的細胞特異性相容性、非免疫原性以及結構穩定性)的情況下，將其他生物功能(例如，受控的細胞相容性、受控的降解(透過腎臟代謝)等)引入修飾的海藻酸中，將更為重要且有趣。在文獻報導的那些數據中，油酸是包括人類在內的動物以及植物油脂中的習知的天然存在的功能性生物分子。油酸也是FDA核准的物質，可作為藥物成分以及食品補充劑。乳腺組織富含脂肪組織，為乳腺上皮細胞的發育及生長提供了環境利基。脂肪組織會積聚三醯基甘油以及游離脂肪酸，包括單不飽和脂肪酸，油酸。因此，選擇油酸來配製兩親性海藻酸-油酸(amphiphilic alginate-oleic acid，AGO)凝膠是一種適合進一步臨床及平移應用的乳腺微環境模擬及生物相容性材料。油酸的抗腫瘤效果已在文獻中被廣泛報導，如抑制Her-2/neu的過表現，以及促進細胞增殖的細胞內鈣訊息傳遞途徑，如曾等人所討論的，油酸可以促進非惡性細胞的生長，但在惡性細胞中卻具有相反的作用。因此，基於這些重要的藥學優勢，油酸的長碳鏈可為一良好的疏水性配體，用於修飾海藻酸鈉以形成具有特定多功能性的新型兩親性奈米粒子。
仍需開發廉價、有效的製造用於遞送生物活性材料或試劑的奈米粒子的方法，以及由此製備的奈米粒子。
因此，本發明提供一種兩親性海藻酸-油酸(alginate-oleic acid，AGO)大分子以及一種製備該大分子之方法，其中該大分子為兩親性且具有臨床上可達到的分子大小。
於一方面，本發明提供一種海藻酸-油酸(AGO)大分子，其由海藻酸及油酸以一間隔基連接所組成。
根據本發明，AGO大分子為兩親性且具有臨床上可達到的分子大小，或抗癌活性。
於本發明之一實施例中，該間隔基為二胺，較佳為乙二胺或1,6-二胺基己烷。於一較佳的具體實施例中，該間隔基為乙二胺。
於本發明之一實施例中，該AGO大分子具有式I之結構：
Figure 02_image001
式I。
於本發明中，發現該AGO大分子在水溶液中具有自組裝行為以形成奈米粒子，並因海藻酸而具有抗癌活性。
於本發明中，該AGO大分子在水溶液中具有自組裝行為以形成奈米粒子。
因此，可透過自組裝該AGO大分子形成AGO奈米粒子，其在體外及體內皆具有優異的結構穩定性、膠體穩定性以及生物相容性。
根據本發明，該AGO大分子可形成AGO奈米粒子，其可作為多功能應用的生物醫學材料，例如用於活性劑的遞送系統，該活性劑包括但不限於藥物或生物劑或材料，例如胜肽、蛋白質、抗體、血清產品、疫苗、多個細胞或幹細胞。
於本發明中，可將單一、雙重或多種活性劑包封在該AGO奈米粒子中，因此，本發明還提供一種雙重藥物奈米粒子或多重藥物奈米粒子。
於另一方面，本發明提供一種製備該AGO大分子之方法，該方法包括以下步驟： (1) 將油酸(oleic acid，OA)以及N-(3-二甲基胺基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HCl)於二氯甲烷(dichloromethane，DCM)中混合，然後與乙二胺在DCM中混合，得到反應混合物；使該反應混合物與鹽水(NH4 Cl(aq) )反應以獲得一產物，並以DCM萃取該產物的水相，並收集該產物的有機相，並使該有機相經無水硫酸鎂乾燥，並減壓濃縮得到一粗產物，以乙醚洗滌該粗產物，過濾得到一修飾的OA；以及 (2) 將海藻酸鈉溶解在水中以得到一溶液，並以HCl將該溶液的pH調整至pH 3~4，緩慢加入EDC-HCl水溶液，同時將pH調整至pH 3~4以完成反應並得到一產物，以蒸餾水透析該產物，凍乾並純化得到AGO大分子。
應當理解的是，以上之一般描述以及以下之詳細描述都僅為示例性及說明性的，並不限制本發明。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之技術人員通常理解的含義相同之含義。
本發明提供一種新穎的大分子，其可形成具有生物功能性的奈米粒子，該生物功能性例如受控的細胞相容性、受控的降解(透過腎臟代謝)等，其被引入至修飾的海藻酸中而不改變其臨床上有利的性質，例如最終在醫學實作中使用的細胞特異性相容性、非免疫原性，以及結構穩定性。
本發明提供一種海藻酸-油酸大分子，亦稱為「AGO大分子」，其由海藻酸及油酸以一間隔基連接所組成。
於本發明之一具體實施例中，可以任何常用或標準方法製備AGO大分子。例如，以乙二胺作為間隔基以連接水解的海藻酸鈉以及油酸以製備新穎的兩親性海藻酸鈉修飾的油酸(modified oleic acid，mOA)大分子，其透過兩個胜肽鍵連接。因此，由於在哺乳動物中脂肪酸醯胺可被酶水解，因此可將胜肽連接的油酸裂解並從修飾的海藻酸中釋放出來。油酸修飾的海藻酸奈米粒子可作為形成治療性兩親性奈米粒子的材料，作為活性劑如藥物或生物試劑的載體。
根據本發明，該AGO大分子提供由海藻酸引起的抗癌活性。此類新穎的兩親性AGO奈米粒子可形成一膠束結構，進而在水性環境中自組裝時進行藥物裝載，並有望促進後續的生物醫學應用。
海藻酸
海藻酸為直鏈的陰離子多醣，由1→4連接的β-D-甘露醣醛酸(mannuronic acid，M)以及C-5表異構物α-L-葡萄糖醛酸(guluronic acid，G)所組成：
Figure 02_image004
Figure 02_image006
此類陰離子多醣共聚物是從天然褐藻中萃取的，例如，巨藻(Macrocystis pyrifera )、極北海帶(Laminaria hyperborea )、泡葉藻(Ascophyllum nodosum )，以及包括假單孢菌屬(Pseudomonas )、固氮菌屬(Azotobacter )等細菌的胞外多醣。
海藻酸可透過任何常規方法製造。例如，海藻酸可基於藻類來源產生。作為凝膠的天然褐藻細胞內基質中的海藻酸含有鈉、鈣、鎂、鍶以及鋇離子，因此相對離子的組成取決於與海水的離子交換平衡。從藻類中萃取海藻酸的步驟如下所示。
Figure 02_image008
自海藻萃取海藻酸之步驟
首先，使用0.1-0.2 M無機酸透過質子交換除去天然海藻酸凝膠的相對離子。透過該步驟獲得海藻酸。於第二步驟中，透過以鹼如氫氧化鈉或碳酸鈉中和以溶解不溶性的海藻酸以形成海藻酸鈉。之後，透過分離方法，例如篩分、浮選、離心以及過濾將如灰分、灰塵以及其他不溶性雜質等的顆粒物質自天然藻類中去除。海藻酸製造的最後步驟已知有三種方法：(i) 透過酒精、氯化鈣或無機酸沉澱；(ii) 自由流電泳；(iii) 以海藻酸鋇凝膠化學萃取。在步驟(i)之後，海藻酸仍含有幾種促分裂原以及細胞毒性雜質，導致不適合生物醫學應用。步驟(ii)以及(iii)均可有效解決此問題，但步驟(ii)成本高且費時，不適合商業上大規模生產。Ba2+ 在步驟(iii)中具有重要作用。在形成海藻酸鋇凝膠之後，首先透過以各種試劑處理流洗出促分裂原以及細胞毒性雜質，接著以乙醇萃取，然後將純的海藻酸鋇珠溶解在鹼性溶液中。透析溶液以除去Ba2+ 以及試劑，最後透過加入乙醇沉澱出海藻酸鈉。
海藻酸鈉
海藻酸鈉為一種生物聚合物，以其生物相容性、無毒以及無免疫原性而聞名。海藻酸已被廣泛作為醫療材料，例如物質輸送、傷口敷料、細胞培養以及組織再生。海藻酸通常在醫藥應用中作為增稠劑、凝膠形成劑，以及穩定劑。口服劑型為目前醫藥應用中最常見的。由於相反的電荷，海藻酸與殼聚醣形成離子錯合物。這樣的離子錯合物表現出pH依賴性，因為相較於模擬的胃環境(pH 1.2)，在模擬的腸環境(pH 7.5)中從該顆粒系統觀察到更高的膨脹度以及更快的藥物釋放。pH依賴性膨脹的這種特殊性質使其能夠被動地以胃腸道為目標。
油酸
油酸(Oleic acid，OA)是一種單不飽和脂肪酸，具有以下化學結構：
Figure 02_image010
油酸(OA)為一種天然存在於各種動物以及可食用油脂中的單不飽和脂肪酸。其藥效動力學作用以及這些效應的機制仍存在爭議。先前已有報導，OA降低了低密度脂蛋白(low density lipoproteins，LDL)的濃度及氧化作用；並降低了罹患心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)的風險。亦已報導油酸具有抗腫瘤活性，主要取決於其誘導凋亡以及抑制細胞增殖的能力。
OA的抗腫瘤效果主要取決於其誘導凋亡以及抑制細胞增殖的能力，具體而言是抑制Her-2/neu的過度表現以限制腫瘤增殖的作用。
海藻酸 -mOA 奈米粒子 (AGO 奈米粒子 ) 之製備
根據本發明，使用海藻酸鈉獲得修飾的海藻酸，然後合成修飾的海藻酸-mOA (AGO)奈米粒子。
於本發明之一實施例中，使海藻酸與醋酸水溶液反應。將反應混合物中和，然後以蒸餾水透析以除去低分子量雜質；透過離心分離沉澱物；然後凍乾。
然後，透過以下所示之方法合成修飾的油酸(mOA)。將油酸以及N-(3-二甲基胺基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(稱為EDC-HCl)一起溶解於二氯甲烷(稱為DCM)中，然後與乙二胺(1.34 mL)於DCM中混合。使反應混合物與三乙胺反應，得到粗產物，將該粗產物與鹽水(NH4 Cl( 水溶液 ) )混合，並將該產物的水相以DCM萃取，並收集有機相，以無水硫酸鎂乾燥，並以減壓濃縮以除去DCM。接著，將這種粗產物添加到乙醚中，在超音波水浴中以超音波處理以除去殘留的油酸，並透過使用幫浦過濾器收集沉澱物。最後，在減壓下除去乙醚。獲得純的修飾的油酸(mOA)的白色粉末。修飾的油酸(mOA)的合成方案如下：
Figure 02_image012
將海藻酸鈉(0.5 g)溶於水中至3.0重量%的濃度。透過使用0.4 M HCl將溶液的pH值調節至3.4。接著，將EDC-HCl的水溶液緩慢地添加至該系統中，並透過添加0.4M HCl將反應混合物的pH值維持在3.4。為了製備不同取代度(DS)的AGO，EDC-HCl (NEDC-HCl /N己醣醛酸 = 0.2、0.4、0.6、0.8以及1.0)的量分別為0.096 g、0.857 g、0.288 g、0.383 g、0.479 g。反應5分鐘後，添加mOA (N胺 /N己醣醛酸 = 1.05，0.857 g 的量)，並將混合物於35o C下均勻攪拌24小時。反應完成後，以蒸餾水透析3天以除去低分子量雜質；透過離心(9000 rpm，15分鐘)分離出未反應的mOA沉澱物；然後凍乾。冷凍乾燥後，透過以丙酮進行索司勒(Soxhlet)萃取3天，除去殘留的有機雜質。我們使用真空系統除去丙酮。然後，我們收集純的淺黃色粉末，為一種新穎的兩親性分子，稱為AGO奈米粒子。
根據本發明，對AGO奈米粒子進行特徵分析以及測試。發現AGO奈米粒子在結構上是穩定的，且為生物相容的，並具有優異的細胞相容性以及生物安全性。
透過以下實施例進一步說明本發明，提供這些實施例的目的在於說明而非限制。
實施例
1. 方法與材料
1.1 酸性條件下水解降解
首先將海藻酸鈉粉末(5 g)溶於45 mL 1 M醋酸中，並分別於85o C下均勻攪拌2、6、24，以及48小時。當反應完成時，將反應混合物冷卻至室溫，以5 M氫氧化鈉中和，以蒸餾水透析2天，以除去低分子量雜質；以離心機(9000 rpm，15分鐘)分離出沉澱物；然後凍乾。最後，我們可以得到四種不同分子量的海藻酸鈉，產率高達90%。
1.2 低分子量海藻酸鈉的特徵分析
1 H 核磁共振 (1 H NMR)
以1 H核磁共振(1 H NMR)鑑定化合物之化學結構。該實驗的目的是檢查藻酸鈉在不同時間的水解效果。 將50 mg未水解以及經不同水解時間的海藻酸鈉分別溶於1 mL重水(deuterium oxide)中，並放入每種組合物的NMR管中。上述樣品的NMR光譜透過American VARIAN 300 MHz NMR光譜儀記錄。
傅立葉轉換紅外光譜法 (Fourier-Transform Infrared Spectroscopy ， FTIR)
為了觀察未水解海藻酸鈉以及經不同水解時間的海藻酸鈉中官能基團的變化，採用傅立葉轉換紅外光譜法(FTIR)進行測定。將少量的每種海藻酸鈉粉末直接放在衰減的全反射率(attenuated total reflectance，ATR) FTIR配件(Quest ATR S/N U54913，Specac公司)上進行進一步研究。然後，在Unican Mattson Mod 7000 FT-IR上記錄五個藻酸鈉組合物(一個未水解樣品以及四個水解樣品)的FTIR光譜(32個掃描，解析度為4 cm-1 )。
凝膠滲透色層分析法 (Gel Permeation Chromatography ， GPC)
透過JASCO凝膠滲透色層分析法(PU-4180 RHPLC幫浦，RI-4030折射率檢測器)測量經不同水解時間的海藻酸鈉的分子量(molecular weight，Mw )以及多分散指數(polydispersity index， PDI)的變化。海藻酸鈉的分子大小特徵是透過在烤箱(40°C)中串聯連接的兩個TSKgelSuperMultiporePW-M管柱(尺寸6 x 150 mm)所確定的。將每種海藻酸鈉溶解在0.069 M PBS/0.005 M NaCl中作為流洗劑。流速為0.5 mL/分鐘。管柱使用SIGMA-ALDRICH葡聚醣標準品(Mw : 5、12、50、150、270、410、670 kDa)。每次注入的量為20 μL。Mw 以及PDI由以下公式計算：
Figure 02_image014
Figure 02_image016
其中tR：保留時間。 Mw ：質均分子量。
將油酸以及N-(3-二甲基胺基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(稱為EDC-HCl)一起溶解於二氯甲烷(稱為DCM)(80 mL)中，並於4°C下均勻攪拌30分鐘。30分鐘後，我們準備另一裝有少量乙二胺的DCM (20 mL)的小瓶。隨後，將該裝有乙二胺的小瓶與第一個小瓶混合，該第一小瓶已於4°C下攪拌30分鐘，注入三乙胺(3.4 mL)，然後於室溫下均勻攪拌48小時。當反應完成時，將粗萃物與鹽水(NH4 Cl( 水溶液 ) )混合。以DCM萃取水相，並收集有機相，以無水硫酸鎂乾燥，並以減壓濃縮除去DCM。接著，對該粗萃物中加入乙醚，在超音波水浴中以超音波處理1.5小時以去除殘留的油酸，並透過使用幫浦過濾器收集沉澱物。最後，在減壓下除去乙醚。然後，我們可以獲得純的修飾的油酸(mOA)的白色粉末。
海藻酸鈉溶解於水中至3.0重量%的濃度。透過使用0.4 M HCl將溶液的pH值調節至3.4。接下來，將EDC-HCl水溶液緩慢地添加至該系統中，並透過添加0.4 M HCl將反應混合物的pH值維持於3.4。為了製備不同取代度(DS)的AGO，EDC-HCl (NEDC-HCl /N己醣醛酸 = 0.2、0.4、0.6、0.8以及1.0)的量分別為0.096 g、0.857 g、0.288 g、0.383 g、0.479 g。反應5分鐘後，加入mOA (N胺 /N己醣醛酸 = 1.05)，並將混合物於35°C下均勻攪拌24小時。反應完成後，以蒸餾水透析3天以除去低分子量雜質。透過離心(9000 rpm，15分鐘)分離出未反應的mOA沉澱；隨後凍乾。冷凍乾燥後，透過以丙酮進行索司勒萃取3天，除去殘留的有機雜質。我們使用真空系統除去丙酮。然後，我們收集純的淺黃色粉末作為所得的AGO粉末。
1.3 修飾的油酸以及海藻酸 -mOA 奈米粒子的特徵分析
1 H 核磁共振 (1 H NMR)
透過將50 mg mOA與AGO粉末溶解於1 mL氘代氯仿/重水中並置於NMR管中來製備樣品。AGO與mOA的化學結構分別透過1 H核磁共振(1 H NMR)鑑定。
傅立葉轉換紅外光譜法 (FT-IR)
使用以下實施例中所述之FTIR測量mOA與AGO粉末中的官能基團。
元素分析儀 (Elemental Analyzer ， EA)
我們將20 mg的每個AGO (24小時，0.4、0.6、0.8、1.0)分別放入小瓶中，然後將其送至國立台灣大學儀器中心。SAO的取代度(DS)可根據元素分析儀測得的SAO中氮(N)的百分比，透過Yang等人報告的以下公式進行計算。[37]
Figure 02_image018
Figure 02_image020
M1 ：取代單體的分子量。 M2 ：未取代單體的分子量。 M3 ：氮的分子量。
螢 光分光光度計 (Fluorescence Spectrophotometer ， FL)
透過螢光分光光度計(FL-2700)，以芘為探針，檢測蒸餾水中不同DS的兩親性AGO奈米粒子的臨界膠束濃度(CMC)。以下步驟為不同DS的每個AGO奈米粒子的樣品製備。首先，將含芘的丙酮溶液(1.0*10-4 M)分別滴入15個小瓶中。同時，製備十五種不同濃度的AGO溶液，使AGO奈米粒子溶解在蒸餾水中(濃度(重量%)：1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625、0.001953125、0.0009765625、0.0004882813、0.0002441407、0.0001220704、0.0000610352)。在將丙酮透過真空系統蒸發之後，分別對小瓶添加十五種不同濃度的AGO奈米粒子溶液。接下來，在實驗之前，在嚴格排除光的條件下，將混合物在室溫下攪拌24小時。探針於波長343 nm處激發，並於波長300 - 500 nm範圍內以1.0秒的積分記錄了發射光譜。激發及發射狹縫開口分別為5 nm以及5 nm。PMT電壓為400V。反應為0.04秒。掃描速度為60 nm/分鐘。
動態散光 (Dynamic Light Scatting ， DLS)
透過動態光散射(DLS，BI-200SM Goniometer DLS，Brookhaven公司，Holtsville市，紐約州)測量不同DS的AGO奈米粒子的平均大小以及尺寸分佈。透過將不同DS的AGO奈米粒子溶解於蒸餾水中並於室溫下攪拌24小時，然後裝載到比色杯中來製備樣品。
Zeta 電位
透過雷射都卜勒風速測定法(Beckman Coulter公司，美國)，評估不同DS的AGO奈米粒子的zeta電位(Beckman Coulter公司，美國)。在將溶液裝載到流通池中以進行zeta電位測量之前，透過將不同DS的AGO奈米粒子溶解於蒸餾水中並於室溫下攪拌24小時來製備樣品。
1.4 細胞培養以及體外細胞毒性
以AGO分別處理SKBR-3以及MDA-MB-231細胞、HER-2陽性以及三陰性乳癌細胞24小時。H184B5F5/M10 (人類乳腺上皮細胞，源自BCRC； BCRC編號：60197)，MDA-MB-231 (人類乳腺上皮癌細胞，源自ATCC；ATCC編號：CRM-HTB-26TM )以及SK-BR-3 (人類乳腺上皮癌細胞，源自ATCC； ATCC編號：HTB-30TM )用於細胞毒性測試。細胞存活率透過MTT確定。
2. 結果
經過不同時間的廣泛水解後，所得到的海藻酸鈉顯示出分子量(Mw )以及多分散指數(poly-dispersity index，PDI)降低，表示在強力水解時分子量分佈較窄，如表1所示，表示分子量的分佈隨著水解而變窄。水解24-48小時後，平均MW可降低至約23,000 - 35,000，可透過腎臟中的腎清除代謝(遠低於60 KDa的閾值，應可在臨床上使用)。使用1 H NMR以及FTIR光譜確認結構，各種分子量的水解海藻酸鈉也顯現出相同的分子結構與官能基團。表 1. 不同水解時間的海藻酸鈉的特徵分析
水解時間 (小時) Mw (g/mol)a PDI (Mw /Mn )a
收到的海藻酸鈉(SA) ＞ 600,000 13.5991
2 249,891 3.3321
6 140,768 1.9527
24 35,150 1.4324
48 23,486 1.3796
a：以SEC使用右旋糖酐作為標準品來確定。
為了進一步以疏水性油酸進行修飾，將具有24小時水解作用的海藻酸鈉作為模型基質以進行接下來的研究，因為它具有適度的水解時間(其中24小時水解後水解溶液的黏度突然增加，這顯然不建議進一步進行)以及用於醫療用途的有利的分子量與分佈。
3.1 修飾的油酸 (mOA) 之形成
透過1 H核磁共振光譜證實修飾的油酸的化學結構，顯示在6.12 ppm處的弱峰表示醯胺基(-NH-C=O-)上的質子，其標記為「a」；在5.32 ppm處的峰表示亞乙基(-CH=CH-)上的質子，其標記為「b」；在3.37 ppm處的中心峰表示胺基(-NH2 )上的質子，其標記為「c」；2.12 - 2.17 ppm之間的峰表示醯胺基(-NH-C=O-CH2 -)附近的碳上的質子，其標記為「d」；在1.98 - 2.00 ppm之間的峰表示在亞乙基(-CH2 -CH=CH-CH2 -)附近的碳上的質子，其標記為「e」；在0.84 - 0.88的峰表示在油酸(-CH3 )末端的質子，其標記為「f」；以及在1.25 - 1.59 ppm之間的峰表示的其他碳(-CH2 -CH2 -CH2 - 以及NH2 -CH2 、-CH2 -NH2 -)的質子，其標記為「 g」。值得注意的是，通過10.0 - 10.7 ppm的寬峰代表羧酸(-COOH)上的質子消失了，且該峰代表羰基(-C=O-CH2 -)附近的碳上的質子介於2.30 - 2.35 ppm至反應後出現的2.12 - 2.17 ppm。羧酸上的質子峰消失，這是由於醯胺基取代了羧酸基。在接近羰基的碳上的質子的峰位移是由於羧酸的吸電子能力強於醯胺基，導致不同的去屏蔽作用。不同的化學位移，其中醯胺基附近的碳原子上的質子峰比羧酸基附近的碳原子上的質子峰高。這表示mOA已成功合成。
使用FT-IR分析鑑定mOA的官能基團。結果顯示，相較於OA修飾前後的化學結構差異，mOA與油酸的FT-IR光譜相當。在以3400 cm-1 為中心的寬帶附近的峰代表一級胺的N-H拉伸振動。在3297 cm-1 處的中等訊號附近的峰表示二級醯胺的N-H拉伸振動，而在2971 cm-1 處的強訊號附近的峰是由於C-H拉伸振動。在1640 cm-1 處的強訊號附近的峰表示醯胺的C=O拉伸振動，在1600 cm-1 處的強訊號附近的峰表示醯胺的N-H彎曲振動。觀察到在1708 cm-1 處的強訊號表示油酸中的羧酸基團的C＝O拉伸振動消失。因此，從光譜訊號可證實，乙二胺成功地修飾了油酸。
3.2 海藻酸 -mOA 奈米粒子之合成與特徵分析
1 H核磁共振用於鑑定AGO的化學結構。其光譜如圖1所示。0.91 - 0.96 ppm之間的峰表示油酸(-CH3 )末端的質子，其標記為c；在2.74 ppm處的峰表示碳(-CH2 -CH2 -)上的質子，其標記為b；在2.93 - 3.09 ppm之間的峰表示靠近包括亞乙基(-CH2 -CH=CH-CH2 -)以及靠近醯胺基(-NH-C=O-CH2 -)的碳原子上的質子，其標記為「a」；在3.5 - 4.5 ppm之間的峰表示吡喃糖環上的質子。透過a、b以及c的標記可用於確認該修飾的油酸已成功與海藻酸鈉鍵合。另一方面，標記峰的訊號強度隨著EDC-HCl反應量的增加而明顯增加。原因是明顯的峰均來自油酸，而EDC-HCl反應量的增加可能會提高油酸的取代度。結果表示，AGO已成功合成。
FT-IR分析顯示，具有不同比例的NEDC-HCl /N己醣醛酸 的海藻酸-mOA (AGO)的化學結構，如圖2所示，標記各個官能基團或化學鍵。相較於海藻酸鈉固有的官能基團，圖S2兩種化合物之間的差異為表示醯胺基團C=ONH的1704 cm-1 附近的峰；與C=OO- 訊號重疊的1561 cm-1 附近的峰(1595 cm-1 )代表N-H彎曲振動；在1241 cm-1 附近的峰代表醯胺基團的C-NH，包括在AGO分子中形成的新官能基團(-NH-CO-)。因此，這表示成功合成了新化合物海藻酸-mOA (AGO)。
透過與不同量的EDC (以NEDC-HCl /N己醣醛酸 之比例)反應確定與AGO相連的油酸含量。胜肽鍵的形成是修飾版本，亦即AGO，與24小時水解SA之間最明顯的區別。可透過元素分析儀定量由胜肽鍵貢獻的氮原子含量。然後，透過以下公式計算取代度，其中M1 代表修飾單體的分子量；M2 代表未修飾的(原始)單體的分子量；M3 表示氮原子的分子量。
Figure 02_image018
Figure 02_image020
結果列於表2，其中取代度(DS)隨EDC-HCl的量(以及比率)的增加而增加。這些結果證實，可透過預定的修飾方法以特定量的EDC-HCl對AGO的取代度進行成功的控制。表 2 在 0.2 、 0.4 、 0.6 、 0.8 至 1.0 範圍內的不同 NEDC-HCl /N 己醣醛酸 比例的海藻酸 -mOA (AGO) 的取代度 (DS) ，其中可測量並觀察到 DS 的逐步增加。
樣品名稱 取代度 (DS，%)
0.2 AGO 16.4
0.4 AGO 29.6
0.6 AGO 39.4
0.8 AGO 58.8
1.0 AGO 66.4
3.3 AGO 奈米粒子的臨界膠束濃度 (Critical Micelle Concentration ， CMC)
臨界膠束濃度(CMC)為特殊的兩親性分子自組裝行為能力的特徵，可形成分散在水環境中的明確定義的聚集體結構。可使用芘(pyrene)作為探針來確定形成膠束，亦即CMC，的最低濃度，以透過使用螢光分光光度計檢測具有不同取代度的AGO奈米粒子的強度比(I372 /I385 )。由I372 /I385 形成的對應於不同取代度的AGO的對數濃度的曲線斜率變化的截距表示每種AGO組成的CMC。I372 /I385 與不同取代度的AGO的對數濃度之間的關係如圖3所示，表3總結了與不同取代度的AGO對應的CMC值。
CMC值隨取代度而降低，對於DS為58.8%的AGO，最低CMC值為0.008重量%，表示為0.8 AGO。但是，當DS達到66.4%時，CMC進一步增加到0.018%，表示為1.0 AGO。該發現清楚地揭示親水性及疏水性與AGO奈米粒子之間存在最佳平衡，導致0.8 AGO的兩親性在熱力學上最可行，以形成最低濃度的聚集體。根據取代度以及臨界膠束濃度之間的關係，如圖4所示，我們推測海藻酸鈉被過高的油酸(DS = 約66.4%)修飾，導致過度的疏水性，然後破壞兩親性平衡，進而造成CMC迅速的增加。因此，以16.4%的最低DS，測得0.2 AGO的最高CMC值為0.125重量%，這在熱力學上不利於形成聚集體，直到在水性環境中所需的最高AGO濃度為止，相較於0.8 AGO，這是透過自組裝形成聚集結構所需AGO濃度的15倍以上。表 3. 溶解在 ddH2 O 中的具有不同 NEDC-HCl /N 己醣醛酸 比例的海藻酸 -mOA (AGO)( 以「樣品名稱」欄中的符號表示 ) 的重要理化性質，其中 AGO 的濃度固定為 0.05 重量 % 。
樣品名稱 CMC (重量%) 大小 (nm) Zeta電位 (mV)
24-hr SA NA NA -38.68
0.2 AGO 0.125 NA -38.31
0.4 AGO 0.032 385.45 ± 128.36 -31.37
0.6 AGO 0.032 350.35 ± 134.36 -25.29
0.8 AGO 0.008 330.27 ± 135.70 -24.33
1.0 AGO 0.018 450.52 ± 119.76 -22.92
在確定具有不同DS的AGO的CMC後，透過動態光散射檢查所得的AGO粒子的大小。如表3中提供的，其中對於所有AGO組合物以及24小時SA (這代表以24小時水解處理而沒有進一步的OA修飾的海藻酸鈉)使用0.05%的AGO濃度。對於0.2 AGO以及24小時SA樣品皆沒有顆粒誘導測量的跡象，這表示在將0.2 AGO以及24小時SA都分散在水溶液中時沒有形成特定的實體。0.2 AGO的CMC為0.125%，遠高於用於製備樣品溶液的0.05%的濃度，同時，SA是簡單的線性奈米粒子，不存在導致自組裝機制形成聚集體結構體的疏水相互作用。因此，DLS似乎證實了此一解釋。相反地，其餘AGO成分的CMC遠低於0.05%，顯示出形成特定實體的清晰且強烈的訊號，其粒徑分佈在200 - 600 nm之間或平均在300 - 450 nm之間。如前所述，這證明了在這項工作中合成的AGO奈米粒子具有自組裝能力。
3.3 AGO 奈米粒子的 Zeta 電位
固體實體的Zeta電位基本上受實體的表面性質、pH值、電解質的存在以及給定溶液中電解質濃度的影響。在此，我們準備了與DLS測量相同的溶液組成分及條件。相較於24小時SA分子，表3還列出了所得的AGO組合物的Zeta電位。所有樣品都顯示出負電荷，這顯然是由羧酸鹽基團以及天然海藻酸鈉的骨架所造成的。油酸對AGO的羧酸酯基的取代增加，造成AGO中羧酸酯基的數量減少，因此Zeta電位隨取代度的降低而降低。Zeta電位也是確定膠體溶液系統穩定性的指標。所有AGO組合物的Zeta電位的絕對值都遠高於20 mV，表示AGO膠體奈米粒子在溶液中具有足夠的分散穩定性。
考慮到表3中公開的物理化學性質，強烈建議在這項工作中設計及製備的AGO奈米粒子可以醫藥方式應用於生物醫學用途，例如藥物輸送奈米系統。
3.4 奈米結構形態
圖5a、5b、5c，以及5d所示分別為以0.4 AGO、0.6 AGO、0.8 AGO以及1.0 AGO符號組成表示的AGO奈米粒子的奈米粒子形態。顆粒的平均直徑為300 - 500 nm，看起來與上述DLS所確定的相似。AGO (0.4、0.6、0.8、1.0)的奈米粒子都呈現球形結構，這是上述自組裝的直接證據，其中溶解在水溶液中的AGO奈米粒子形成有利於能量的結構，通常在文獻中公開的許多兩親性分子中觀察的到。這種球形的形態也鼓勵其適用於透過血液循環進行抗癌治療的細胞遞送。
4. 體外細胞毒性
為了評估具有不同成分(DS)的AGO奈米粒子的細胞毒性，AGO樣品被用於處理兩種高度惡性的乳腺癌細胞SKBR-3、MDA-MB-231，以及人類乳腺上皮細胞H184B5F5/M10Ｍ，共24小時。SKBR-3與MDA-MB-231細胞分別稱為HER-2陽性以及三陰性乳腺癌細胞。細胞活力透過MTT確定。如圖6所示，AGO奈米粒子對這兩種癌細胞的毒性極小。在這兩種細胞中，濃度從0到0.125 mg/mL的各種AGO製劑(0.4、0.6、0.8、1.0 AGO)對這兩種細胞的毒性很小或沒有。但是，在H184B5F5/M10細胞中，除了0.8 AGO以及1.0 AGO的組合物表現出一定的抑制作用外，其餘組合物似乎對細胞活力無毒性。細胞毒性顯然是濃度依賴性的，在本研究範圍內，AGO被認為對正常細胞及癌細胞都具有細胞相容性。此外，這些結果可能表示生物消化酶抗性的AGO形成。由於在將AGO製劑與細胞及培養基一起培養時，未觀察到由釋放的游離油酸調節的對乳腺癌的作用。這鼓勵了進一步的研究以評估體內毒性。
5. 體內評估
評估透過靜脈注射AGO奈米粒子在小鼠中誘導的病理變化。該試驗將20隻7週齡雄性以及20隻7週齡雌性ICR小鼠分為4組，分別由0.25、0.5、0.8，以及1重量%的PBS緩衝溶液中的AGO劑量組成。
每組包含五隻兩種性別的小鼠，透過尾靜脈注射(i.v.)途徑單次給予試驗動物。除非在測試期結束前發現其死亡，否則將所有小鼠於第14天犧牲。收集心臟、腎臟、肺臟、肝臟，以及脾臟，並進行組織病理學評估。圖7a及7b所示為對這些切片樣品的顯微檢查，分別為0.25%/0.5%組以及0.8%/1.0%組的劑量。在組織病理學評估下，在靜脈注射(i.v.)於PBS水溶液中的0.25、0.5、0.8，或1重量%的AGO奈米粒子的ICR小鼠中，未發現心臟、腎臟、肝臟、肺臟，或脾臟的明顯病變。該測試結果進一步證實在動物中使用AGO奈米粒子的生物相容性及生物安全性，並鼓舞了進一步對抗癌治療的評估，該評估將在未來進一步報導。
6. AGO 兩親性大分子用於封裝單一藥物之用途
公開了一種預製的油酸修飾的海藻酸鈉(AGO大分子)，其為一種兩親性大分子形式以用於包封疏水性藥物。透過將100 μL (溶於DMSO的4 mg/mL薑黃素)與1 mL ddH2 O混合併加入0.5 mg AGO粉末，製備高度疏水性藥物(不溶於水)薑黃素。將該混合物溫和混合12小時，形成澄清溶液。將最終溶液以12,000 rpm離心10分鐘，除去上清液。使用掃描電子顯微鏡對所得固體樣品進行特徵分析，以檢查製備的載體AGO材料的結構形態、Zeta電位以檢查裝載有薑黃素的AGO奈米粒子的表面電荷(表4)，以及以高效液相色層分析法分析薑黃素在AGO大分子中的包封效率(表5)。相較之下，我們採用另一種兩親性多醣，即US 8.263,130 B2中所述的羧甲基-己醯基殼聚醣(carboxymethyl-hexanoyl chitosan，CHC)，以包封薑黃素作為對照(對照組)。結果提供於表2中，其封裝效率遠低於AGO，為65.2%。
顯然，薑黃素可高效地包封在AGO奈米粒子中，與此同時，所得的裝載有藥物的奈米粒子具有奈米級尺寸及帶負電荷的表面，進而確保了實際使用時的膠體穩定性。表 4. AGO 與裝載薑黃素的 AGO 奈米粒子的大小以及 Zeta 電位。
樣品 尺寸 (nm) Zeta電位(mV)
AGO 329.6±144.8 -33.45±2.98
AGO/薑黃素 453.8±111.4 -18.31±1.52
表 5. 在 AGO 奈米粒子以及在作為比較組的羧甲基 - 己醯基殼聚醣 (CHC) 奈米粒子中薑黃素的包封效率。
樣品 包封效率(%)
AGO/薑黃素 96.3±0.2
CHC/薑黃素 65.2±0.3
7. 利用 AGO 兩親性大分子同時包封雙重藥物
公開了一種預製的油酸修飾的海藻酸鈉(AGO大分子)，其為一種兩親性大分子形式以用於包封疏水性藥物。透過將100 μL薑黃素與紫杉醇(4 mg/mL薑黃素以及0.8 mg/mL紫杉醇，同時溶於DMSO)在1 mL ddH2 O中混合並添加0.5 mg AGO粉末以製備兩種高度疏水性藥物(不溶於水)薑黃素及紫杉醇。將混合物溫和混合12小時，形成澄清溶液。將最終溶液以12,000 rpm離心10分鐘，除去上清液。使用掃描電子顯微鏡對所得固體樣品進行特徵分析，以檢查製備的載體AGO材料的結構形態、Zeta電位以檢查裝載有薑黃素的AGO奈米粒子的表面電荷(表6)以及高效液相色層分析法分析薑黃素在AGO大分子中的包封效率(表7)。
顯然，薑黃素及紫杉醇都可高效地共包封到AGO奈米粒子中，與此同時，所得的裝載有藥物的奈米粒子具有奈米級尺寸且帶負電荷的表面，確保實際使用時的膠體穩定性表 6. AGO 以及薑黃素 / 紫杉醇雙重裝載 AGO 奈米粒子的尺寸及 Zeta 電位。
樣品 尺寸(nm) Zeta電位(mV)
AGO 329.6±144.8 -33.45±2.98
AGO/紫杉醇-薑黃素 511.5±60.4 -30.27±1.53
表7.  在AGO奈米粒子中薑黃素及紫杉醇的共包封效率。
樣品 包封效率(%)
AGO/在雙重藥物中的薑黃素 82.05±2.3
AGO/在雙重藥物中的紫杉醇 63.63±15.19
結論
透過水解並接著與修飾的油酸(mOA)進行化學偶聯，成功地合成了具有不同分子量的新穎兩親性海藻酸為基底的奈米粒子(亦即，海藻酸-mOA或AGO)。使用NEDC-HCl /N己醣醛酸 的預定比率從0.2、0.4、0.6、0.8至1.0精確地處理所得的具有不同取代度(DS)的AGO奈米粒子，其DS的範圍分別為16.4%、29.6%、39.4%、58.8%，至66.4%。AGO奈米粒子在水溶液中表現出自組裝行為，進而產生平均直徑為300 – 500 nm的球形奈米粒子。確定AGO的臨界膠束濃度(CMC)，並可實現0.008%的最低CMC，這促進了AGO奈米粒子在醫療用途，尤其是血液循環，中的結構穩定性。AGO奈米粒子在水溶液中的膠體穩定性進一步由具有不同取代度的AGO奈米粒子的強負電荷潛力所證明。使用兩種類型的癌細胞以一種正常細胞對AGO的生物相容性進行評估，然後進行一項體內研究，均顯現出優異的細胞相容性以及生物安全性。這項工作清楚地證明成功設計並合成了新穎自組裝、結構穩定且具有生物相容性的海藻酸為基底的AGO奈米粒子，其最低分子量確保其在生物醫學領域的潛在用途，例如藥物輸送應用，當允許其進行臨床轉用時，預期將透過腎臟清除進行隨後的代謝。
此外，於本發明中公開的油酸修飾的海藻酸鈉(AGO)確保了其對於單一或多種不溶於水的藥物的強大藥物包封能力。實驗觀察也證實了這對以下幾點是有利的：(1) 減少那些高效藥物成分可能產生的細胞毒性，這些藥物具有抗癌、抗增殖，以及抗發炎等作用；(2) 增加那些高度不溶於水的藥物的水溶性，以提高其在治療時的生物利用度；(3) 協同治療，同時進行雙藥聯合來治療難以治癒的疾病，例如轉移性實體瘤等，(4) 根據需要，在短期到長期的儲存期內形成穩定的膠體劑量，以用於臨床，以及 (5) 為隨後針對特定遞送的新穎劑型提供了潛在的多功能性。
儘管本說明書包含許多細節，但這些細節不應被解釋為對本發明之範圍或所主張保護的範圍之限制，而應理解為對本發明的特定具體實施例或實施例的特定特徵之描述。於本說明書中在單獨的具體實施例或實施例的上下文中描述的某些特徵也可在單個具體實施例中組合實現。
無
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述發明內容以及以下對本發明之詳細描述。為了說明本發明，於圖式中示展示目前較佳的具體實施例。
於圖式中：
圖1提供根據本發明之海藻酸-mOA (AGO)奈米粒子的1 H NMR光譜。
圖2提供具有不同比例的海藻酸-mOA (AGO)奈米粒子的FT-IR光譜，其NEDC-HCl /N己醣醛酸 的比例在0.2、0.4、0.6、0.8至1.0的範圍內，如插圖中所示。
圖3所示為不同比例的NEDC-HCl /N己醣醛酸 的海藻酸-mOA (AGO)的I373 /I385 值的變化，表示為不同的取代度。
圖4所示為具有不同取代度(degrees of substitution，DS)的AGO奈米粒子的臨界膠束濃度(Critical Micelle Concentration，CMC)值的變化。
圖5所示為不同比例的NEDC-HCl /N己醣醛酸 的AGO奈米粒子的奈米結構形態，透過場發射掃描電子顯微鏡檢查；其中圖5(A) 0.4 AGO、(B) 0.6 AGO、(C) 0.8 AGO、(D)1.0 AGO。
圖6所示為AGO奈米粒子的細胞毒性，即對照組、24小時海藻酸鈉(SA)，以及不同的AGO奈米粒子，0.4 AGO、0.6 AGO、0.8 AGO以及1.0 AGO，分別針對SK-BR-3、MDA-MB-231以及H184B5F5/M10的細胞存活率(%)。
圖7提供在ICR小鼠中靜脈注射AGO奈米粒子的毒性研究的組織病理學發現：包括兩組：一組以0.25重量%的AGO奈米粒子處理，另一組以0.5重量%的AGO奈米粒子處理；其中以0.25重量%的AGO奈米粒子處理的組別中沒有發現心臟(A)、腎臟(B)、肝臟(c)、肺臟(D)或脾臟(E)的明顯病變，而且在以0.5重量%的AGO奈米粒子處理的組別中亦未發現心臟(F)、腎臟(G)、肝臟(H)、肺臟(I)或脾臟(J)的明顯病變(H&E染色，400倍)。
圖8提供在ICR小鼠中靜脈注射AGO奈米粒子的毒性研究的組織病理學發現，包括兩組：一組以0.8重量%的AGO奈米粒子處理，另一組以1.0重量%的AGO奈米粒子處理；其中在以0.8 重量%的AGO奈米粒子處理的組別中沒有發現心臟(A)、腎臟(B)、肝臟(c)、肺臟(D)或脾臟(E)的明顯病變，而且在以1.0 重量%的AGO奈米粒子處理的組別中亦未發現心臟(F)、腎臟(G)、肝臟(H)、肺臟(I)或脾臟(J)的明顯病變(H&E染色，400倍)。
無
Figure 110108024-A0101-11-0002-1

Claims (17)

  1. 一種海藻酸-油酸(AGO)大分子，其由海藻酸以及油酸以一間隔基連接所組成。
  2. 如請求項1所述之AGO大分子，其為兩親性且具有臨床上可行之分子大小或抗癌活性。
  3. 如請求項1所述之AGO大分子，其中該間隔基為二胺。
  4. 如請求項1所述之AGO大分子，其中該間隔基為乙二胺或1,6-二胺基己烷。
  5. 如請求項1所述之AGO大分子，其中該間隔基為乙二胺。
  6. 如請求項5所述之AGO分子，其具有式I之結構：
    Figure 03_image001
    式I。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之AGO大分子，其在水溶液中具有自組裝行為以形成奈米粒子。
  8. 一種AGO奈米粒子，其透過如請求項1-7中任一項所述之AGO大分子自組裝所形成。
  9. 如請求項8所述之AGO奈米粒子，其在體外及體內具有優異的結構穩定性、膠體穩定性，以及生物相容性。
  10. 如請求項9所述之AGO奈米粒子，其作為一活性劑的遞送系統。
  11. 如請求項10所述之AGO奈米粒子，其中該活性劑為一藥物、一生物試劑或一生物試劑。
  12. 如請求項11所述之AGO奈米粒子，其中該生物試劑為一胜肽、一蛋白質、一抗體、一血清產物、一疫苗，或一生物材料。
  13. 如請求項12所述之AGO奈米粒子，其中該生物材料為多個細胞或幹細胞。
  14. 如請求項8-13中任一項所述之AGO奈米粒子，其中包封有單一、雙重或多種活性劑。
  15. 一種雙重藥物奈米粒子，其包含包封在如請求項7-13中任一項所述之AGO奈米粒子中的兩種活性劑。
  16. 一種多種藥物奈米粒子，其包含包封在如請求項7-13中任一項所述之AGO奈米粒子中的超過兩種的活性劑。
  17. 如請求項1至7中任一項所述之製備AGO大分子的方法，包含以下步驟：(1) 將油酸(OA)以及N-(3-二甲基胺基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HCl)在二氯甲烷(dichloromethane，DCM)中混合，然後與乙二胺在DCM中混合，得到反應混合物；使該反應混合物與鹽水反應，得到一產物，並以DCM萃取該產物的水相，收集該產物的有機相，並使該有機相經無水硫酸鎂乾燥，並在減壓下濃縮以得到一粗產物，並以乙醚洗滌該粗產物，過濾得到修飾的OA；以及 (2) 將海藻酸鈉溶解在水中製成一溶液，並以HCl將溶液的pH值調節至pH 3-4，緩慢加入EDC-HCl水溶液，同時將pH值調節至pH 3-4以完成反應，得到產物，以蒸餾水透析該產物，凍乾並純化得到該AGO大分子。
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