JP2023516765A - 両親媒性アルギネート－オレイン酸高分子およびその製造方法 - Google Patents

両親媒性アルギネート－オレイン酸高分子およびその製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、スペーサーで結合されたアルギン酸塩とオレイン酸によって合成される、新しいタイプの疎水性修飾されたアルギン酸ナトリウムを提供する。それにより得られるＡＧＯ高分子は、両親媒性であり、臨床的に利用可能な分子サイズ、および抗癌活性を有する。それにより形成されたＡＧＯナノ粒子は、優れた構造安定性、コロイド安定性、およびインビトロおよびインビボにおける生体適合性を示し、例えば、薬物送達システムとして使用するなど、生物医学分野での有用性が期待される。

Description

本発明は、薬物または生物学的物質などの活性剤の送達システムとして用いることができる両親媒性アルギネート－オレイン酸高分子に関する。
ナノ粒子は、医薬品、生物学的物質または細胞などの、生物学的な１つまたは複数の生物学的に活性な物質または薬剤の送達システムとしての使用がしばしば提案されている。多くの場合、生物学的な活性剤をナノ粒子に組み込む（または「ロードする」）ことは、組み込むことができる量が限られているため、または物質を組み込むのに（例えば拡散によって）多大な時間がかかるため、容易なことではなかった。この課題は、生物学的な活性剤の送達メカニズムとしてのナノ粒子の実用的または商業的有用性を制限するものである。
生体高分子の一種であるアルギン酸ナトリウムは、その生体適合性、非毒性および非免疫原性特性でよく知られており、創傷被覆から注射まで、特定の臨床用途についてＦＤＡの承認を受けている。アルギン酸塩（アルギネート）は、薬物送達、創傷被覆、細胞培養、組織再生などの医療材料として広く応用されている。アルギン酸塩は、一般に、医薬用途において、増粘剤、ゲル形成剤、および安定剤として使用される。経口剤形は、現在の医薬用途において、最も頻繁に使用されており、標的薬物送達におけるアルギン酸塩の使用は、近年急速に増加している。キトサン、プロドラッグおよび／または両親媒性修飾と組み合わせて、ゲル化などの薬物ビヒクルとしてアルギン酸塩を使用するいくつかの方法がある。Ｂｏｏｎｔｈｅｅｋｕｌらは、イオン架橋され、部分的に酸化したアルギネートゲルから、フルルビプロフェンが１．５時間で放出されることを報告している。キトサンとイオン複合体を形成することにより、逆の電荷によって、そのようなアルギネート－キトサン複合体は、ｐＨ依存性を示し、シミュレートされた胃内環境（ｐＨ１．２）と比較して、シミュレートされた腸内環境（ｐＨ７．５）において、より高い膨潤性と粒子系からのより速い薬物放出が、観察されている。このｐＨ依存性膨潤の特別な特性により、消化管を受動的に標的とすることが可能になる。［４］。放出を延ばすためのさらなるバージョンでは、研究者は、イオン架橋と共有結合架橋（カルシウムイオンとアジピン酸ジヒドラジド）の組み合わせを用いて、架橋の比率を高め、膨潤を減少させている。
アルギン酸塩は、疎水性物質の放出を調節するために使用され、これは、魅力的な研究対象となり、ここ数十年で大きな注目を集めており、そこでは、天然アルギン酸塩の親水性骨格を伴う両親媒性修飾が、ナノ医薬品用途のための発展した生体材料の開発において、より興味深く、チャレンジングなものであるようである。
一般に７０ＫＤａ未満の範囲に制御された分子量を有するアルギン酸ナトリウムは、インビボ研究において、腎クリアランスによって代謝できることが報告されている。さらに、多くの報告によると、エステル基、ビニル基、または複素環式化合物を含んだ、多数の疎水性物質が、アルギネート骨格に沿ってヒドロキシル基またはカルボキシル基の部分と化学的または共有結合的に会合するために頻繁に使用され、修飾アルギネートの両親媒性を生じさせている。これにより、修飾アルギン酸塩に自己組織化能力を付与することができ、修飾アルギン酸塩を、薬物封入、および親水性および／または疎水性の薬物の制御送達、または治療性能の向上を伴うその両方の組み合わせに、より適用できるようになる。
加水分解および酸化などのいかなる処理も行わない市販のアルギン酸ナトリウムは、その高い分子量（すなわち、＞６００ｋＤａ）および広い分子量分布の両方のために、ナノ粒子の合成のためのベース材料として適していない。Ｙａｎｇらは、未処理のアルギン酸ナトリウムをベースとした薬物担体（ＯＡＡＤ、オクチルグラフト両親媒性アルギン酸アミド誘導体）を報告している。その結果は、粒子サイズが大きく広い分布になることを示している（すなわち、０．８～１０μｍ）。ヒトの体に入るアルギン酸ナトリウムを代謝するために、分子量は、腎臓の腎クリアランス閾値（すなわち、＜７０ｋＤａ）よりも低くなければならない。制御された細胞適合性、制御された分解（腎臓の代謝による）などの追加の生体機能性を、その臨床的に有利な特性、例えば、医療的実施での最終的な使用のための、細胞特異的な適合性、非免疫原性、および構造的安定性など、を変更することなく、修飾アルギン酸塩に導入できるかどうかは、より重要で興味深いことである。文献で報告されているデータの中で、オレイン酸は、ヒトを含む動物や植物油脂に天然に存在する機能性生体分子としてよく知られている。オレイン酸は、医薬品成分および栄養補助食品として、ＦＤＡに承認された物質でもある。乳腺組織は、脂肪組織が豊富であり、乳腺上皮細胞の発達と成長のための環境的地位を提供する。脂肪組織は、トリアシルグリセロール、および、一価不飽和脂肪酸、オレイン酸を含む遊離脂肪酸を蓄積する。したがって、ＡＧＯゲルの製剤にオレイン酸を選択することは、乳腺微小環境を模倣し、さらなる臨床および翻訳用途のための生体適合性材料となる。オレイン酸の抗腫瘍効果は、文献で広く報告されており、例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕの過剰発現の抑制や、Ｚｅｎｇらに議論されているような細胞増殖を促進する細胞内カルシウムシグナル伝達経路などがあり、そこでは、オレイン酸は、非悪性細胞の成長を促進したが、悪性細胞では逆の効果があった。したがって、これらの重要な薬学的利点に基づいて、オレイン酸の長い炭素鎖は、アルギン酸ナトリウムを修飾して、特定の多機能性を有する新しいタイプの両親媒性ナノ粒子を形成するための、優れた疎水性リガンドになる可能性がある。
生物学的に活性な物質または薬剤を送達するためのナノ粒子を製造するための低費用で効率的な方法、およびそれにより製造されるナノ粒子の開発が、依然として必要とされている。
したがって、本発明は、高分子が、両親媒性であり、臨床的に利用可能な分子サイズを有する、両親媒性アルギネート－オレイン酸（ＡＧＯ）高分子、および該高分子を製造する方法を提供する。
一態様において、本発明は、アルギン酸塩とオレイン酸がスペーサーで結合した、アルギネート－オレイン酸（ＡＧＯ）高分子を提供する。
本発明によれば、ＡＧＯ高分子は、両親媒性であり、臨床的に利用可能な分子サイズを有するかまたは抗癌活性を有する。
本発明の一例において、スペーサーは、ジアミンであり、好ましくは、エチレンジアミン、または１，６－ジアミノヘキサンである。好ましい実施形態において、スペーサーは、エチレンジアミンである。
本発明の一例において、ＡＧＯ高分子は、式Ｉ：
Figure 2023516765000001
 式Ｉ
で示される構造を有する。
本発明において、ＡＧＯ高分子は、水溶液中でナノ粒子を形成する自己組織化挙動を有し、アルギン酸塩によって抗癌活性を有することが見出された。
本発明において、ＡＧＯ高分子は、水溶液中で自己組織化挙動を有し、ナノ粒子を形成する。
これにより、ＡＧＯナノ粒子は、ＡＧＯ高分子の自己組織化によって形成することができ、優れた構造安定性、コロイド安定性、およびインビトロおよびインビボにおける生体適合性を有する。
本発明によれば、ＡＧＯ高分子は、薬物または生物学的薬剤または物質（例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、血清産物、ワクチン、複数の細胞または幹細胞など）を含むがこれらに限定されない活性剤の送達システムなどの、多機能用途のための生物医学材料として使用できる、ＡＧＯナノ粒子を形成することができる。。
本発明において、１種、２種または複数種の活性剤をＡＧＯナノ粒子に封入することができ、したがって、本発明はまた、二種薬物ナノ粒子、または多種薬物ナノ粒子を提供する。
別の態様において、本発明は、ＡＧＯ高分子を製造する方法であって、
（１）オレイン酸（ＯＡ）、およびＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ－ＨＣｌ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で混合し、次いで、これをＤＣＭ中でエチレンジアミンと混合して反応混合物を得て；該反応混合物を塩水（ＮＨ４Ｃｌ（ａｑ））と反応させて生成物を得て、該生成物の水相をＤＣＭで抽出して、生成物の有機相を収集し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗生成物を生成し、該粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、濾過して、修飾ＯＡを得る、工程；および
（２）アルギン酸ナトリウムを水に溶解して溶液を調製し、ＨＣｌを用いて溶液のｐＨを３～４に調整し、ｐＨを３～４に調整しながらＥＤＣ－ＨＣｌの水溶液をゆっくりと加えて反応を終了させて、生成物を得て、蒸留水に対して該生成物を透析し、凍結乾燥および精製して、ＡＧＯ高分子を得る、工程、
を含む、方法を提供する。
上記の一般的な説明および以下の詳細な説明はどちらも、例示および説明のみを目的としており、本発明を限定するものではないことが理解される。
上述の概要、および以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現時点の好ましい実施形態が図面に示されている。
図面は、以下のとおりである。
図１は、本発明によるアルギネート－ｍＯＡ（ＡＧＯ）ナノ粒子の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
図２は、挿入した記号で示される、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０の範囲のＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃの異なる比率を有するアルギネート－ｍＯＡ（ＡＧＯ）ナノ粒子のＦＴ－ＩＲスペクトルを示す。
図３は、異なる置換度として示されたＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃの異なる比率でのアルギネート－ｍＯＡ（ＡＧＯ）のＩ３７３／Ｉ３８５値の変化を示す。
図４は、異なる置換度（ＤＳ）を有するＡＧＯナノ粒子の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）値の変化を示す。
図５は、電界放出型走査電子顕微鏡によって調べられた、ＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃの比率が異なるＡＧＯナノ粒子のナノ構造形態を示し、図５の（Ａ）は、０．４ＡＧＯ、（Ｂ）は、０．６ＡＧＯ、（Ｃ）は、０．８ＡＧＯ、（Ｄ）は、１．０ＡＧＯを示す。
図６Ａは、ＡＧＯナノ粒子の細胞毒性を示し、すなわち、対照、２４ｈｒＳＡ、および、異なるＡＧＯナノ粒子、０．４ＡＧＯ、０．６ＡＧＯ、０．８ＡＧＯ、および１．０ＡＧＯの、ＳＫ－ＢＲ－３に対する細胞生存率（％）を示す。 図６Ｂは、ＡＧＯナノ粒子の細胞毒性を示し、すなわち、対照、２４ｈｒＳＡ、および、異なるＡＧＯナノ粒子、０．４ＡＧＯ、０．６ＡＧＯ、０．８ＡＧＯ、および１．０ＡＧＯの、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する細胞生存率（％）を示す。 図６Ｃは、ＡＧＯナノ粒子の細胞毒性を示し、すなわち、対照、２４ｈｒＳＡ、および、異なるＡＧＯナノ粒子、０．４ＡＧＯ、０．６ＡＧＯ、０．８ＡＧＯ、および１．０ＡＧＯの、Ｈ１８４Ｂ５Ｆ５／Ｍ１０に対する細胞生存率（％）を示す。
図７は、ＩＣＲマウスにおけるＡＧＯナノ粒子の静脈内注射に関する毒性研究の組織病理学的所見を示し、１つは０．２５重量％のＡＧＯナノ粒子で処置し、他の１つは０．５重量％のＡＧＯナノ粒子で処置した、２つの群を含む。ここで、０．２５重量％のＡＧＯナノ粒子で処置した群において、心臓（Ａ）、腎臓（Ｂ）、肝臓（ｃ）、肺（Ｄ）、または脾臓（Ｅ）に重大な病変は見られず、また、０．５重量％のＡＧＯナノ粒子で処置した群においても、心臓（Ｆ）、腎臓（Ｇ）、肝臓（Ｈ）、肺（Ｉ）、または脾臓（Ｊ）に重大な病変は見られなかった（Ｈ＆Ｅ染色。４００×）。
図８は、ＩＣＲマウスにおけるＡＧＯナノ粒子の静脈内注射に関する毒性研究の組織病理学的所見を示し、１つは０．８重量％のＡＧＯナノ粒子で処置し、他の１つは１．０重量％のＡＧＯナノ粒子で処置した、２つの群を含む。ここで、０．８重量％のＡＧＯナノ粒子で処置した群において、心臓（Ａ）、腎臓（Ｂ）、肝臓（ｃ）、肺（Ｄ）、または脾臓（Ｅ）に重大な病変は見られず、また、１．０重量％のＡＧＯナノ粒子で処置した群においても、心臓（Ｆ）、腎臓（Ｇ）、肝臓（Ｈ）、肺（Ｉ）、または脾臓（Ｊ）に重大な病変は見られなかった（Ｈ＆Ｅ染色、４００×）。
特に断りのない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本発明は、制御された細胞適合性、制御された分解性（腎臓の代謝による）などの生体機能性を有するナノ粒子を形成することができる新しい高分子を提供し、これは、臨床的に有利な特性、例えば、医療実施における最終的な使用のための構造安定性、非免疫原性、および細胞特異的適合性、を変更することなく、修飾アルギン酸塩（アルギネート）に導入される。
本発明は、「ＡＧＯ高分子」（ＡＧＯ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）とも称される、アルギン酸塩とオレイン酸がスペーサーで結合して構成される、アルギネート－オレイン酸高分子を提供する。
本発明の一実施形態において、ＡＧＯ高分子は、一般的に使用される方法または標準的な方法により製造することができる。例えば、エチレンジアミンを、加水分解したアルギン酸ナトリウムとオレイン酸を連結するスペーサーとして使用し、２つのペプチド結合によって連結された、新規の両親媒性アルギン酸ナトリウム修飾オレイン酸（ｍＯＡ）高分子を製造する。これにより、ペプチド結合したオレイン酸は、脂肪酸アミドが、哺乳動物において酵素によって加水分解され得ることにより、修飾アルギン酸塩から切断および放出され得る。オレイン酸修飾アルギン酸塩ナノ粒子は、薬物または生物学的薬剤などの活性剤の担体として使用される、治療用両親媒性ナノ粒子の形成のための材料として機能することができる。
本発明によれば、ＡＧＯ高分子は、アルギン酸塩に起因する抗癌活性を提供する。このような新規の両親媒性ＡＧＯナノ粒子は、水性環境での自己組織化（自己集合）の際に薬物担持を可能にするミセル構造を形成することができ、その後の生物医学的適用を容易にすることが期待される。
アルギン酸塩
アルギン酸塩（アルギネート）は、１→４結合のβ－Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）およびＣ－５エピマーα－Ｌ－グルロン酸（Ｇ）からなる分岐していないアニオン性多糖類である。
Figure 2023516765000002
このようなアニオン性多糖コポリマーは、オオウキモ（マクロシスチス・ピリフェラ；Macrocystis pyrifera）、ラミナリア・ハイパーボレア（Laminaria hyperborea）、アスコフィラム・ノドサム（Ascophyllum nodosum）などの天然褐藻類から抽出され、また、シュードモナス属（Pseudomonas）、アゾトバクター属（Azotobacter）などの細菌の菌体外多糖（exopolysaccharide）でもある。
アルギン酸塩は、任意の従来の方法によって製造され得る。例えば、藻類源に基づいてアルギン酸塩を製造することができる。天然の褐藻類の細胞内マトリックス中のゲル状のアルギン酸塩は、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、およびバリウムのイオンを含み、対イオン組成は、海水とのイオン交換平衡によって決定される。藻類からのアルギン酸塩の抽出手順を以下に示す。
Figure 2023516765000003
まず、天然アルギン酸塩ゲルについて、０．１～０．２Ｍの無機酸を使用してプロトン交換により対イオンを除去する。この工程により、アルギン酸が得られる。第２の工程では、不溶性のアルギン酸を水酸化ナトリウムや炭酸ナトリウムなどのアルカリで中和することにより溶解し、アルギン酸Ｎａを形成する。その後、ふるい分け、浮遊による分離、遠心分離、および濾過などの分離プロセスによって、天然の藻類に含まれる灰分や粉塵およびその他の不溶性不純物などの粒子状物質を除去する。アルギン酸塩の製造の最終工程については既知の３つの方法があり、それは、（ｉ）アルコール、塩化カルシウム、または無機酸による沈殿、（ｉｉ）フリーフロー電気泳動、（ｉｉｉ）アルギン酸Ｂａゲルによる化学的抽出、である。工程（ｉ）の後、アルギン酸塩は、まだいくらかのマイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）と細胞毒性のある不純物を含んでおり、生物医学的応用には適していない。工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）はどちらも、この問題を効果的に解決できるが、工程（ｉｉ）は、費用対効果が低く、商業的な大規模生産に適用するには時間がかかる。工程（ｉｉｉ）において、Ｂａ２＋は、重要な役割を果たす。アルギン酸Ｂａゲルを形成した後、まず、さまざまな薬剤の処理によって、マイトジェンと細胞毒性不純物をアルギン酸Ｂａビーズから溶出させ、続いて、エタノール抽出を行い、次いで、純粋なアルギン酸ビーズをアルカリ溶液に溶解させた。Ｂａ２＋および試薬を除去するために溶液を透析し、最後にエタノールを添加してアルギン酸Ｎａを沈殿させた。
アルギン酸ナトリウム
生体高分子の一種であるアルギン酸ナトリウムは、生体適合性があり、毒性がなく、免疫原性がないことでよく知られている。アルギン酸塩は、物質送達、創傷被覆、細胞培養、組織再生などの医療材料として、広く応用されている。アルギン酸塩は、一般に、医薬品用途において、増粘剤、ゲル形成剤、および安定剤として、用いられる。経口剤形は、現在の医薬品用途で最も頻繁に使用される。アルギン酸塩は、逆の電荷によって、キトサンとイオン複合体を形成する。そのようなイオン複合体は、ｐＨ依存性を示し、これは、シミュレートされた胃内環境（ｐＨ１．２）と比較して、シミュレートされた腸内環境（ｐＨ７．５）において、より高い膨潤度と、粒子系からのより速い薬物放出が観察されたからである。このｐＨ依存性の膨潤という特別な特性により、消化管を受動的に標的とすることが可能になる。
オレイン酸
オレイン酸（ＯＡ）は、一価不飽和脂肪酸の一種であり、下記の化学構造を有する。
Figure 2023516765000004
オレイン酸（ＯＡ）は、様々な動物性で摂取可能な脂肪および油に天然に存在する一価不飽和脂肪酸の一種である。その薬力学的作用と効果のメカニズムは議論の余地がある。ＯＡが、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の濃度と酸化を低下させること；および、心血管疾患（ＣＶＤ）のリスクを低減させることが、以前に報告されている。オレイン酸には抗腫瘍活性があることも報告されており、主にアポトーシスを誘導し、細胞増殖を抑制する能力によるものである。
ＯＡの抗腫瘍効果は、主に、アポトーシスを誘導し、細胞増殖を抑制する能力、特に、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕの過剰発現を阻害し、腫瘍増殖を制限する作用、によるものである。
アルギネート－ｍＯＡナノ粒子（ＡＧＯナノ粒子）の製造
本発明によれば、アルギン酸ナトリウムを用いて修飾アルギン酸塩を得、次いで、修飾アルギネート－ｍＯＡ（ＡＧＯ）ナノ粒子を合成する。
本発明の一例では、アルギン酸塩を酢酸水溶液と反応させる。反応混合物を中和し、次いで、蒸留水に対して透析して低分子量の不純物を除去し；沈殿物を遠心分離機で分離し；その後、凍結乾燥する。
次に、修飾オレイン酸（ｍＯＡ）は、以下に示す方法で合成される。オレイン酸、およびＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ－ＨＣｌと称する）を一緒に、ジクロロメタン（ＤＣＭと称する）に溶解し、次いで、エチレンジアミン（１．３４ｍＬ）のＤＣＭ液と混合する。反応混合物を、トリエチルアミンと反応させて、粗生成物を得て、この粗生成物を塩水（ＮＨ４Ｃｌ（ａｑ））と混合し、生成物を含む水相をＤＣＭで抽出し、有機相を収集し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、ＤＣＭを除去する。次に、その粗生成物をジエチルエーテルに加え、超音波浴で超音波処理して残留オレイン酸を除去し、ポンプフィルターを用いて沈殿物を収集する。最後に、減圧下でジエチルエーテルを除去する。純粋な修飾オレイン酸（ｍＯＡ）の白色粉末が得られる。修飾オレイン酸（ｍＯＡ）の合成スキームを下記に示す。
Figure 2023516765000005
アルギン酸ナトリウム（０．５ｇ）を水に溶解して３．０重量％の濃度にした。０．４ＭのＨＣｌを用いて、溶液のｐＨを３．４に調整した。次に、ＥＤＣ－ＨＣｌの水溶液を系にゆっくりと添加し、０．４ＭのＨＣｌの添加により反応混合物のｐＨを３．４に維持した。置換度（ＤＳ）の異なるＡＧＯを製造するために、ＥＤＣ－ＨＣｌの量（ＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃ＝０．２、０．４、０．６、０．８、および１．０）は、それぞれ、０．０９６ｇ、０．８５７ｇ、０．２８８ｇ、０．３８３ｇ、０．４７９ｇであった。５分間反応後、ｍＯＡ（Ｎａｍｉｎｅ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃ＝１．０５、量において０．８５７ｇ）を加え、混合物を、３５℃で２４時間、均一に撹拌した。反応の完了後、蒸留水に対して３日間透析して、低分子量の不純物を除去し；未反応のｍＯＡである沈殿物を、遠心分離（９０００ｒｐｍ、１５分）を用いて分離し；その後、凍結乾燥した。凍結乾燥後、残留する有機不純物を、アセトンによるソックスレー抽出を３日間行って、除去した。真空系を用いてアセトンを除去した。その後、ＡＧＯナノ粒子と称する、新規な両親媒性分子の純粋な淡黄色の粉末を収集した。
本発明により、ＡＧＯナノ粒子が特徴付けられ、試験された。ＡＧＯナノ粒子は、構造的に安定であり、生体適合性があり、優れた細胞適合性と生物学的安全性を有することが分かった。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定ではなく、実証の目的で提供される。
１． 方法と材料
１．１ 酸性条件下での加水分解による分解
アルギン酸ナトリウム粉末（５ｇ）を、まず、４５ｍＬの１Ｍ酢酸に溶解し、８５℃で、それぞれ２、６、２４、および４８時間、均一に撹拌した。反応の完了後、反応混合物を室温まで冷却し、５Ｍ水酸化ナトリウムで中和し；蒸留水に対して２日間透析して、低分子量の不純物を除去し；遠心分離（９０００ｒｐｍ、１５分）を用いて沈殿物を分離し、その後、凍結乾燥した。最終的に、分子量の異なる４種類のアルギン酸ナトリウムが、９０％という高い収率で得られた。
１．２ 低分子量アルギン酸ナトリウムのキャラクタリゼーション
１Ｈ核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）
１Ｈ核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）を用いて、化合物の化学構造を同定した。この実験の目的は、アルギン酸ナトリウムの異なる時間での加水分解の影響を確認することである。加水分解されていないアルギン酸ナトリウムおよび異なる時間で加水分解されたアルギン酸ナトリウム５０ｍｇを、別々に１ｍＬの重水に溶解し、組成物ごとにＮＭＲチューブに入れた。上記のサンプルのＮＭＲスペクトルを、Ａｍｅｒｉｃａ ＶＡＲＩＡＮ ３００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計によって記録した。
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）
加水分解されていないアルギン酸ナトリウムおよび加水分解時間の異なるアルギン酸ナトリウムの官能基の変化を観察するために、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）で測定した。さらなる調査のために、少量の各アルギン酸ナトリウム粉末を、減衰全反射（ＡＴＲ）ＦＴＩＲアクセサリ（Ｑｕｅｓｔ ＡＴＲ Ｓ／Ｎ Ｕ５４９１３、Ｓｐｅｃａｃ）に直接置いた。次いで、Ｕｎｉｃａｎ Ｍａｔｔｓｏｎ Ｍｏｄ ７０００ ＦＴ－ＩＲで、５つのアルギン酸ナトリウム組成物（１つの非加水分解サンプルと４つの加水分解サンプル）のＦＴＩＲスペクトルを記録した（４ｃｍ－１の解像度で３２スキャン）。
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
加水分解時間の異なるアルギン酸ナトリウムの分子量（Ｍｗ）と多分散指数（ＰＤＩ）の変化を、ＪＡＳＣＯゲル浸透クロマトグラフィー（ＰＵ－４１８０ ＲＨＰＬＣポンプ、ＲＩ－４０３０屈折率検出器）によって測定した。アルギン酸ナトリウムの分子サイズプロファイルは、オーブン（４０℃）内で直列に連結された２つのＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＭｕｌｔｉｐｏｒｅＰＷ－Ｍカラム（寸法６×１５０ｍｍ）により決定した。各種のアルギン酸ナトリウムは、溶出液として、０．０６９ＭのＰＢＳ／０．００５ＭのＮａＣｌに溶解した。流速は、０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨデキストラン標準品をカラムに使用した（Ｍｗ：５、１２、５０、１５０、２７０、４１０、６７０ｋＤａ）。注入量は各回２０μＬとした。ＭｗおよびＰＤＩを、下記の式で計算した。
Figure 2023516765000006
 上記において、ｔＲ：保持時間、Ｍｗ：質量平均分子量、である。
オレイン酸、およびＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ－ＨＣｌと称する）を、一緒に、ジクロロメタン（ＤＣＭと称する）（８０ｍＬ）に溶解し、４℃で３０分間、均一に撹拌した。３０分後、ＤＣＭ（２０ｍＬ）に少量のエチレンジアミンを入れた別のバイアル瓶を用意した。続いて、エチレンジアミンを含むバイアル瓶のものを、４℃で３０分間撹拌した最初のバイアル瓶のものと混合し、トリエチルアミン（３．４ｍＬ）を注入し、その後、室温で４８時間、均一に撹拌した。反応の完了後、粗生成物を、塩水（ＮＨ４Ｃｌ（ａｑ））と混合した。水相をＤＣＭで抽出し、有機相を収集し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、ＤＣＭを除去した。次に、得られた粗生成物にジエチルエーテルを加え、超音波浴中で１．５時間、超音波処理して、残留するオレイン酸を除去し、ポンプフィルターを用いて、沈殿物を収集した。最後に、減圧下でジエチルエーテルを除去した。その後、純粋な修飾オレイン酸（ｍＯＡ）の白い粉末が得られた。
アルギン酸ナトリウムを水に溶解して３．０重量％の濃度にした。０．４ＭのＨＣｌを用いて、溶液のｐＨを３．４に調整した。次に、ＥＤＣ－ＨＣｌの水溶液を系にゆっくりと添加し、０．４ＭのＨＣｌの添加により反応混合物のｐＨを３．４に維持した。置換度（ＤＳ）の異なるＡＧＯを製造するために、ＥＤＣ－ＨＣｌの量（ＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃ＝０．２、０．４、０．６、０．８、および１．０）は、それぞれ、０．０９６ｇ、０．８５７ｇ、０．２８８ｇ、０．３８３ｇ、０．４７９ｇであった。５分間反応後、ｍＯＡ（Ｎａｍｉｎｅ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃ＝１．０５）を加え、混合物を、３５℃で２４時間、均一に撹拌した。反応の完了後、蒸留水に対して３日間透析して、低分子量の不純物を除去し；未反応のｍＯＡである沈殿物を、遠心分離（９０００ｒｐｍ、１５分）を用いて分離し；その後、凍結乾燥した。凍結乾燥後、残留する有機不純物を、アセトンによるソックスレー抽出を３日間行って、除去した。真空系を用いてアセトンを除去した。その後、生成したＡＧＯ粉末として、純粋な淡黄色の粉末を収集した。
１．３ 修飾オレイン酸およびアルギネート－ｍＯＡナノ粒子のキャラクタリゼーション
１Ｈ核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）
ｍＯＡおよびＡＧＯ粉末５０ｍｇを重クロロホルム／重水１ｍＬに溶解して、サンプルを調製し、それぞれＮＭＲチューブに入れた。ＡＧＯおよびｍＯＡの化学構造を、１Ｈ核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）によってそれぞれ同定した。
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）
ｍＯＡおよびＡＧＯ粉末中の官能基は、下記の実施例に記載のＦＴＩＲを用いて測定した。
元素分析（ＥＡ）
各ＡＧＯ（２４ｈｒ、０．４、０．６、０．８、１．０）について２０ｍｇをバイアル瓶に入れ、その後、国立台湾大学計測センターに送った。ＳＡＯの置換度（ＤＳ）は、元素分析装置で測定されたＳＡＯ中の窒素（Ｎ）の含有率に応じて、Ｙａｎｇらによって報告された下記の式で計算できる。［３７］
Figure 2023516765000007
 Ｍ１：置換されたモノマーの分子量
Ｍ２：置換されていないモノマーの分子量
Ｍ３：窒素の分子量
蛍光分光光度計（ＦＬ）
蒸留水中の異なるＤＳの両親媒性ＡＧＯナノ粒子の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を、プローブとしてピレンを用いた蛍光分光光度計（ＦＬ－２７００）によって調べた。以下の工程は、異なるＤＳの各ＡＧＯナノ粒子のサンプル調製である。まず、ピレン含有アセトン溶液（１．０×１０－４Ｍ）を、１５本のバイアル瓶にそれぞれ滴下した。同時に、ＡＧＯナノ粒子を蒸留水に溶解した１５種類の異なる濃度のＡＧＯ溶液を調製した（濃度（重量％）：１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５、０．０１５６２５、０．００７８１２５、０．００３９０６２５、０．００１９５３１２５、０．０００９７６５６２５、０．０００４８８２８１３、０．０００２４４１４０７、０．０００１２２０７０４、０．００００６１０３５２）。アセトンを真空系によりエバポレートした後、１５種類の異なる濃度のＡＧＯナノ粒子の溶液を、それぞれバイアル瓶に加えた。次に、混合物を、実験前に厳密に遮光して室温で２４時間撹拌した。プローブを３４３ｎｍで励起させ、発光スペクトルを、１．０秒の集積で３００～５００ｎｍの範囲で記録した。励起スリットと発光スリットの開口部は、それぞれ５ｎｍと５ｎｍであった。ＰＭＴ電圧は４００Ｖである。応答は０．０４秒である。スキャン速度は６０ｎｍ／ｍｉｎである。
動的光散乱（ＤＬＳ）
異なるＤＳのＡＧＯナノ粒子の平均粒径と粒径分布を、動的光散乱（ＤＬＳ、ＢＩ－２００ＳＭ Ｇｏｎｉｏｍｅｔｅｒ ＤＬＳ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）によって測定した。サンプルは、異なるＤＳのＡＧＯナノ粒子を蒸留水に溶解して調製し、キュベットにロードする前に室温で２４時間撹拌した。
ゼータ電位
異なるＤＳのＡＧＯナノ粒子のゼータ電位（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、米国）を、レーザードップラー流速計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、米国）によって推定した。ゼータ電位測定のために溶液をフローセルにロードする前に、異なるＤＳのＡＧＯナノ粒子を蒸留水に溶解してサンプルを調製し、室温で２４時間撹拌した。
１．４ 細胞培養およびインビトロ細胞毒性
ＳＫＢＲ－３細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、およびＨＥＲ－２陽性およびトリプルネガティブ乳癌細胞を、それぞれ、ＡＧＯで２４時間処理した。Ｈ１８４Ｂ５Ｆ５／Ｍ１０（ヒト乳腺上皮細胞、ＢＣＲＣ由来；ＢＣＲＣ番号：６０１９７）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳腺上皮癌細胞、ＡＴＣＣ由来；ＡＴＣＣ番号：ＣＲＭ－ＨＴＢ－２６ＴＭ）、ＳＫ－ＢＲ－３（ヒト乳腺上皮癌細胞、ＡＴＣＣ由来；ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－３０ＴＭ）を、細胞毒性試験に使用した。細胞生存率を、ＭＴＴによって決定した。
２． 結果
異なる時間により加水分解を拡大すると、得られたアルギン酸ナトリウムは、表１に示すように、分子量（Ｍｗ）と多分散指数（ＰＤＩ）の減少を示し、集中的な加水分解によるより狭い分子量の分布を示唆しており、分子量分布が加水分解により狭くなることを示している。平均ＭＷは、加水分解の２４～４８時間後に約２３，０００～３５，０００の範囲に減少することができ、したがって、これは、腎臓での腎クリアランスによって代謝することができ（６０ＫＤａの閾値を十分に下回る）、臨床用途で利用可能である。さまざまな分子量の加水分解されたアルギン酸ナトリウムも、１Ｈ－ＮＭＲおよびＦＴＩＲスペクトルを用いて構造を確認して明らかにしたとおり、同一の分子構造および官能基を示した。
表１． 加水分解時間の異なるアルギン酸ナトリウムのキャラクタリゼーション
Figure 2023516765000008
疎水性オレイン酸でさらに修飾するために、２４時間加水分解したアルギン酸ナトリウムを、中程度の加水分解時間（２４時間後での加水分解溶液の粘度の急激な上昇は、さらなる処理について明らかに示唆されない）、および医療用途に適した分子量と分布であるので、以下の研究のためのモデルマトリックスとして使用した。
３．１ 修飾オレイン酸（ｍＯＡ）の形成
修飾オレイン酸の化学構造は、１Ｈ核磁気共鳴スペクトルによって確認し、６．１２ｐｐｍの弱いピークは、「ａ」とマークされたアミド基（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－）上のプロトンを表し；５．３２ｐｐｍのピークは、「ｂ」とマークされたエチレン基（－ＣＨ＝ＣＨ－）上のプロトンを表し；中央の３．３７ｐｐｍのピークは、「ｃ」とマークされたアミン基（－ＮＨ２）上のプロトンを表し；２．１２～２．１７ｐｐｍのピークは、「ｄ」とマークされたアミド基の近くの炭素（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＣＨ２－）上のプロトンを表し；１．９８～２．００ｐｐｍのピークは、「ｅ」とマークされたエチレン基の近くの炭素（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－）上のプロトンを表し；０．８４～０．８８のピークは、「ｆ」とマークされたオレイン酸の末端（－ＣＨ３）のプロトンを表し；１．２５～１．５９ｐｐｍのピークは、「ｇ」とマークされた他の炭素（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、およびＮＨ２－ＣＨ２、－ＣＨ２－ＮＨ２－）のプロトンを表すことが示された。注目すべきことに、カルボン酸（－ＣＯＯＨ）上のプロトンを表す１０．０～１０．７ｐｐｍにわたるブロードなピークが消失し、カルボニル基の近くの炭素（－Ｃ＝Ｏ－ＣＨ２－）上のプロトンを表す２．３０～２．３５ｐｐｍの範囲のピークが、反応後に２．１２～２．１７ｐｐｍとなって現れた。カルボン酸上のプロトンのピークが消失したが、これは、アミド基がカルボン酸基と置き換わったためである。カルボニル基の近くの炭素上のプロトンのピーク変位は、カルボン酸の電子求引能力がアミド基よりも強いことによるものであり、異なる遮蔽作用をもたらした。異なる化学シフトは、アミド基に近い炭素上のプロトンのピークが、カルボン酸基に近い炭素上のプロトンのピークより高磁場である。これにより、ｍＯＡが正常に合成されたことが明らかになった。
ｍＯＡの官能基を、ＦＴ－ＩＲ分析を用いて確認した。ｍＯＡとオレイン酸のＦＴ－ＩＲスペクトルを比較すると、ＯＡの修飾前後の化学構造の違いが示された。３４００ｃｍ－１を中心とする広帯域付近のピークは、第一級アミンのＮ－Ｈ伸縮振動を表している。３２９７ｃｍ－１の中程度のシグナル付近のピークは、二級アミドのＮ－Ｈ伸縮振動を表し、一方、２９７１ｃｍ－１の強いシグナル付近のピークは、Ｃ－Ｈ伸縮振動によるものである。１６４０ｃｍ－１の強いシグナル付近のピークは、アミドのＣ＝Ｏ伸縮振動を表し、１６００ｃｍ－１の強いシグナル付近のピークは、アミドのＮ－Ｈ変角振動を表している。オレイン酸のカルボン酸基のＣ＝Ｏ伸縮振動を表す１７０８ｃｍ－１の強いシグナルが消失したことが観察された。したがって、スペクトル情報から、オレイン酸をエチレンジアミンによって修飾することが成功したことが実証される。
３．２ アルギネート－ｍＯＡナノ粒子の合成とキャラクタリゼーション
１Ｈ核磁気共鳴を用いて、ＡＧＯの化学構造を確認した。スペクトルを、図１に示す。０．９１～０．９６ｐｐｍのピークは、ｃとマークされたオレイン酸の末端（－ＣＨ３）のプロトンを表し；２．７４ｐｐｍのピークは、ｂとマークされた炭素（－ＣＨ２－ＣＨ２－）上のプロトンを表し；２．９３～３．０９ｐｐｍのピークは、「ａ」とマークされた、エチレン基を含む近くの炭素（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－）上のプロトンと、アミド基の近くの炭素（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＣＨ２－）上のプロトンを表し；３．５～４．５ｐｐｍのピークは、ピラノース環のプロトンを表している。ａ、ｂおよびｃのマークから、修飾オレイン酸をアルギン酸ナトリウムに結合させることに成功したことが確認できた。一方、マークされたピークのシグナル強度は、ＥＤＣ－ＨＣｌの反応量とともに明らかに増加した。その理由は、マークされたピークは、すべてオレイン酸に由来するものであり、ＥＤＣ－ＨＣｌの反応量の増加によりオレイン酸の置換度が上昇し得るためである。結果は、ＡＧＯの合成に成功したことを示唆している。
図２に示すように、ＦＴ－ＩＲ分析により、ＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃの比率が異なるアルギネート－ｍＯＡ（ＡＧＯ）の化学構造が明らかになり、それぞれの官能基または化学結合がマークされた。図Ｓ２のアルギン酸ナトリウム固有の官能基と比較すると、２つの化合物の違いは、アミド基のＣ＝ＯＮＨを表す１７０４ｃｍ－１付近のピークであった。Ｃ＝ＯＯ－シグナル（１５９５ｃｍ－１）と重なる１５６１ｃｍ－１付近のピークは、Ｎ－Ｈ変角振動を表し；１２４１ｃｍ－１付近のピークは、ＡＧＯ分子で形成された新しい官能基（－ＮＨ－ＣＯ－）を含むアミド基のＣ－ＮＨを表している。したがって、新規な化合物であるアルギネート－ｍＯＡ（ＡＧＯ）の合成に成功したことが示された。
異なる量のＥＤＣ（ＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃの比率として）との反応から、ＡＧＯに結合したオレイン酸の含有量を決定する。ペプチド結合の形成は、修飾されたバージョン、すなわちＡＧＯと、２４時間加水分解されたＳＡの間の最も明白な違いである。ペプチド結合が寄与する窒素原子の含有量は、元素分析装置によって定量化できる。次いで、置換度を下記の式で計算した。ここで、Ｍ１は、修飾されたモノマーの分子量を表し；Ｍ２は、未修飾（元の）モノマーの分子量を表し；Ｍ３は、窒素原子の分子量を表す。
Figure 2023516765000009
表２に結果を示す。置換度（ＤＳ）は、ＥＤＣ－ＨＣｌの量（および比率）の増加とともに増加する。これらの結果から、特定の量のＥＤＣ－ＨＣｌを使用して予め決定した修飾スキームによって、ＡＧＯの置換度を適切に制御することが実施可能であることが、実証された。
表２． ０．２、０．４、０．６、０．８、１．０の範囲（ＤＳの段階的な増大を測定および観察できる）のＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃの異なる比率での、アルギネート－ｍＯＡ（ＡＧＯ）の置換度
Figure 2023516765000010
３．３ ＡＧＯナノ粒子の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、特に両親媒性分子が水性環境に分散しながら明らかな集合構造を形成する自己組織化挙動能力の特徴的な特性である。ミセルの形成のための最低濃度、すなわちＣＭＣは、ピレンをプローブとして使用して、蛍光分光光度計を用いて、置換度の異なるＡＧＯナノ粒子の強度比（Ｉ３７２／Ｉ３８５）を検出して、決定することができる。異なる置換度のＡＧＯの対数濃度に対応するＩ３７２／Ｉ３８５によって形成される曲線の勾配変化の切片（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｉｏｎ）は、各ＡＧＯ組成物のＣＭＣを表す。図３に、Ｉ３７２／Ｉ３８５と置換度の異なるＡＧＯの対数濃度との関係を示し、表３に、置換度の異なるＡＧＯに対応するＣＭＣ値をまとめる。
ＣＭＣ値は、置換度とともに低下し、０．８ＡＧＯとして表される、５８．８％のＤＳを有するＡＧＯについて、０．００８重量％の最小のＣＭＣ値まで低下した。しかしながら、１．０ＡＧＯとして表される、ＤＳが６６．４％に達したとき、ＣＭＣはさらに０．０１８％の値に増加した。この発見は、ＡＧＯナノ粒子にともなう親水性と疎水性の間の最適なバランスの存在を明確に表しており、その結果、０．８ＡＧＯの両親媒性が熱力学的に最も実現可能であり、最も低い濃度で集合体を形成できることが明らかになった。図４に示す置換度と臨界ミセル濃度の関係から、アルギン酸ナトリウムが過剰なオレイン酸（ＤＳ＝～６６．４％）によって修飾されると、過剰な疎水性をもたらし、両親媒性の平衡が壊され、急速なＣＭＣの増加が生じる。これにより、０．２ＡＧＯにおいて、１６．４％の最低のＤＳで、０．１２５重量％の最高のＣＭＣ値が測定されており、これは、０．８ＡＧＯと比較して、自己組織化による集合体構造を形成するのに必要なＡＧＯ濃度が１５倍以上高く、水性環境で集合体を形成するのにもっとも高いＡＧＯ濃度まで必要としており、熱力学的に不利になっている。
表３． ｄｄＨ２Ｏに溶解した異なる比率のＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃ（「サンプル名」列に示されている）を含むアルギネート－ｍＯＡ（ＡＧＯ）の重要な物理化学的特性（ＡＧＯ濃度は０．０５重量％に固定した）
Figure 2023516765000011
異なるＤＳを有するＡＧＯのＣＭＣを決定するとともに、得られたＡＧＯの粒径を動的光散乱によって調べた。表３に示すように、０．０５％のＡＧＯ濃度を、すべてのＡＧＯ組成物および２４－ｈｒＳＡ（さらなるＯＡ修飾を行わず２４時間の加水分解で処理されたアルギン酸ナトリウムを意味する）で用いた。０．２ＡＧＯと２４－ｈｒＳＡの両方のサンプルには粒子誘導の測定の兆候はなく、０．２ＡＧＯと２４－ｈｒＳＡはどちらも水溶液に分散させたときに、粒子の実体が形成されなかったことが示唆された。０．２ＡＧＯのＣＭＣは０．１２５％であり、これは、サンプル溶液の調製に使用された０．０５％の濃度よりもはるかに高く、一方、ＳＡは、自己組織化メカニズムを引き起こして集合体構造を形成する疎水性相互作用が存在しない、単純な線形ナノ粒子である。したがって、ＤＬＳはこの説明を裏付けているようである。対照的に、ＣＭＣが０．０５％よりはるかに低い残りのＡＧＯ組成物は、粒径（サイズ）が２００～６００ｎｍまたは平均で３００～４５０ｎｍに分布する粒子の実体を形成する明確で強いシグナルを表した。これは、前述のように、この研究で合成されたＡＧＯナノ粒子に付与された自己組織化能力の存在を実証している。
３．３ ＡＧＯナノ粒子のゼータ電位
固まった実体のゼータ電位は、基本的に、与えられた溶液における、実体の表面特性、ｐＨ値、電解質の存在、および電解質の濃度によって影響を受ける。ここでは、ＤＬＳ測定で用いたのと同じ溶液組成物と条件を用意した。得られたＡＧＯ組成物のゼータ電位も、２４－ｈｒＳＡ分子と比較して、表３に示した。すべてのサンプルは、天然のアルギン酸ナトリウムの骨格に沿ったカルボン酸基によって明らかに引き起こされる、負の電荷を示した。ゼータ電位は、ＡＧＯのカルボキシレート基に対するオレイン酸の置換が増加する結果として、ＡＧＯのカルボキシレート基の量が減少するため、置換の程度とともに減少している。ゼータ電位は、コロイド溶液系の安定性を判断する指標でもある。すべてのＡＧＯ組成物のゼータ電位の絶対値は、２０ｍＶをはるかに上回り、ＡＧＯコロイダルナノ粒子が溶液中で十分な分散安定性を有することが示唆される。
表３に示した物理化学的特性を考慮すると、この研究で設計および製造したＡＧＯナノ粒子は、薬物送達ナノシステムなどの生物医学的用途において、医学的に有用であり得ることが強く示唆される。
３．４ ナノ構造形態学
図５ａ、５ｂ、５ｃ、および５ｄは、それぞれ、０．４ＡＧＯ、０．６ＡＧＯ、０．８ＡＧＯ、および１．０ＡＧＯの組成物で記号化された、ＡＧＯナノ粒子のナノ粒子形態を示す。粒子は、直径が３００～５００ｎｍの平均サイズを示しており、前述のＤＬＳによって決定されたものと類似しているようである。ＡＧＯのナノ粒子（０．４、０．６、０．８、１．０）はすべて球状の形状を示し、上記の自己組織化の結果としての直接的な証拠が示唆されており、ここで、水溶液に溶解したＡＧＯナノ粒子についてエネルギーに有利な構造が発生し、これは文献に開示されている多くの両親媒性分子で共通して観察されるものである。このような球状の形態は、血液循環を介した抗がん治療薬の細胞送達にも適用できるようになるものである。
４． インビトロ細胞毒性
異なる組成（ＤＳ）を有するＡＧＯナノ粒子の細胞毒性を評価するために、ＡＧＯのサンプルを用いて、２つの高悪性の乳癌細胞、ＳＫＢＲ－３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびヒト乳腺上皮細胞、Ｈ１８４Ｂ５Ｆ５／Ｍ１０に対して、２４時間、適用した。ＳＫＢＲ－３細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、それぞれ、ＨＥＲ－２陽性のおよびトリプルネガティブ乳癌の細胞と指定されている。細胞生存率は、ＭＴＴによって決定した。図６に示すように、これら２つの癌細胞に対するＡＧＯナノ粒子の毒性は最小限である。両方の細胞で、０～０．１２５ｍｇ／ｍＬの範囲で濃度を増加させたさまざまなＡＧＯ製剤（０．４、０．６、０．８、１．０ ＡＧＯ）は、両方の細胞に対してほとんどまたはまったく毒性を示さなかった。しかしながら、Ｈ１８４Ｂ５Ｆ５／Ｍ１０細胞では、いくつかの抑制挙動を示した０．８ＡＧＯと１．０ＡＧＯの組成物を除いて、残りの組成物は細胞生存率に対して毒性がないことが示された。細胞毒性は、明らかに濃度依存的であり、この研究の範囲では、ＡＧＯは、正常細胞と癌細胞の両方に対して細胞適合性があると考えられる。さらに、これらの結果は、生物学的消化酵素耐性を有するＡＧＯの形成を示し得る。ＡＧＯ製剤を細胞および培養培地でインキュベートしたとき、放出された遊離オレイン酸によって媒介される乳癌への影響は観察されなかった。これは、インビボでの毒性を評価するためのさらなる調査を推奨する。
５．インビボ評価
マウスにおけるＡＧＯナノ粒子の静脈内注射によって誘発された病理学的変化を評価した。この試験では、７週齢のオス２０匹およびメス２０匹のＩＣＲマウスを、ＰＢＳ緩衝水溶液中、０．２５、０．５、０．８、および１重量％のＡＧＯの投与量の４群に分けた。
各群は、オスメス各５匹のマウスを含み、尾静脈注射（ｉ．ｖ．）経路を介して試験動物に単回投与を施した。１４日目に、試験期間の終了前に死亡しなかったすべてのマウスを屠殺した。心臓、腎臓、肺、肝臓、および脾臓を収集し、組織病理学的評価のために提出した。これらの切片サンプルの顕微鏡検査を、０．２５％／０．５％投与群および０．８％／１．０％投与群について、それぞれ、図７ａおよび図７ｂに示す。組織病理学的評価では、心臓、腎臓、肝臓、肺、または脾臓の重大な病変は、ＩＣＲマウスにおいて静脈内（ｉ．ｖ．）注射を介して投与された水溶性ＰＢＳ緩衝液中の０．２５、０．５、０．８、または１重量％のＡＧＯナノ粒子について、検出されなかった。この試験結果により、動物にＡＧＯナノ粒子を用いる際の生体適合性と生物学的安全性がさらに確認され、今後さらに報告される抗がん治療に向けたさらなる評価が推奨される。
６． １種の薬物を封入するためのＡＧＯ両親媒性高分子の使用
疎水性薬物を封入するために用いられる両親媒性高分子の形態である、製造されたとおりのオレイン酸修飾アルギン酸ナトリウム（ＡＧＯ高分子）が開示された。疎水性の高い薬物（水不溶性）であるクルクミンを用い、１００μＬ（クルクミンを４ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解したもの）を、１ｍＬのｄｄＨ２Ｏに混合し、０．５ｍｇのＡＧＯ粉末を加えて、混合物を製造した。混合物を１２時間穏やかに混合し、クリアな溶液を形成した。最終溶液を１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、上清を除去した。得られた固体サンプルについて、特徴付けをし、走査型電子顕微鏡を用いて、製造した薬物担持ＡＧＯ材料の構造形態を調べ、ゼータ電位を調べてクルクミン担持ＡＧＯナノ粒子の表面電荷を調べ（表４）、高速液体クロマトグラフィーを用いてＡＧＯ高分子のクルクミンの封入効率を分析した（表５）。対照のため、ＵＳ８，２６３，１３０Ｂ２に記載されている別の両親媒性多糖類、すなわちカルボキシメチル－ヘキサノイルキトサン（ＣＨＣ）を比較として用いて、クルクミンを封入した（対照群）。表２に結果を示す。封入効率は、ＡＧＯと比較して６５．２％とはるかに低かった。
クルクミンをＡＧＯナノ粒子に非常に効率的に封入できることが明らかとなり、また、得られた薬物を担持するナノ粒子は、ナノメートルサイズで負に帯電した表面を有し、実際の使用のためのコロイド安定性が確かめられた。
表４． ＡＧＯおよびクルクミン担持ＡＧＯナノ粒子の粒径およびゼータ電位
Figure 2023516765000012
表５． ＡＧＯナノ粒子および比較群としてのカルボキシメチル－ヘキサノイルキトサン（ＣＨＣ）ナノ粒子における、クルクミン封入効率
Figure 2023516765000013
７． ２種の薬物を同時に封入するためのＡＧＯ両親媒性高分子の使用
疎水性薬物を封入するために用いられる両親媒性高分子の形態である、製造されたとおりのオレイン酸修飾アルギン酸ナトリウム（ＡＧＯ高分子）が開示された。２種の疎水性の高い薬物（水不溶性）であるクルクミンおよびパクリタキセルを用い、１００μＬ（クルクミンを４ｍｇ／ｍＬで、およびパクリタキセルを０．８ｍｇ／ｍＬで、ＤＭＳＯに同時に溶解したもの）を、１ｍＬのｄｄＨ２Ｏに混合し、０．５ｍｇのＡＧＯ粉末を加えて、混合物を製造した。混合物を１２時間穏やかに混合し、クリアな溶液を形成した。最終溶液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。得られた固体サンプルについて、特徴付けをし、走査型電子顕微鏡を用いて、製造した薬物担持ＡＧＯ材料の構造形態を調べ、ゼータ電位を調べてクルクミン担持ＡＧＯナノ粒子の表面電荷を調べ（表６）、高速液体クロマトグラフィーを用いて、ＡＧＯ高分子のクルクミンの封入効率を分析した（表７）。
クルクミンとパクリタキセルの両方を非常に効率的にＡＧＯナノ粒子に同時封入できることが明らかとなり、また、得られた薬物を担持するナノ粒子は、ナノメートルサイズで負に荷電した表面を有し、実際の使用のためのコロイド安定性が確かめられた。
表６． ＡＧＯおよびクルクミン／パクリタキセル二種薬物担持ＡＧＯナノ粒子の粒径およびゼータ電位
Figure 2023516765000014
表７． ＡＧＯナノ粒子におけるクルクミンとパクリタキセルの同時封入効率
Figure 2023516765000015
結論
新しいタイプの両親媒性アルギン酸塩ベースのナノ粒子（すなわち、アルギネート－ｍＯＡ、またはＡＧＯ）を、加水分解によってさまざまな分子量とし、そして修飾オレイン酸（ｍＯＡ）との化学的な結合によって、合成することに成功した。得られた異なる置換度（ＤＳ）を有するＡＧＯナノ粒子は、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０のＮＥＤＣ－ＨＣｌ／Ｎｈｅｘｕｒｏｎｉｃの所定の比率を用いて、正確に操作され、それぞれ、１６．４％、２９．６％、３９．４％、５８．８％、６６．４％の範囲のＤＳが得られた。ＡＧＯナノ粒子は、水溶液中で自己組織化挙動を示し、平均サイズが直径３００～５００ｎｍの球状のナノ粒子が得られた。ＡＧＯの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を測定し、最低で０．００８％のＣＭＣが達成され、医療用途、特に血液循環におけるＡＧＯナノ粒子の構造安定性が推奨された。水溶液中のＡＧＯナノ粒子のコロイド安定性は、さまざまな置換度を有するＡＧＯナノ粒子の強い負に帯電した電位によってさらに証明された。ＡＧＯの生体適合性は、２種類の癌細胞と１種類の正常細胞を使用して評価され、続いて、インビボ研究がなされ、すべてにおいて、優れた細胞適合性と生体安全性が示された。この研究は、自己組織化し、構造的安定性があり、生体適合性のある、新しいタイプのアルギン酸塩ベースのＡＧＯナノ粒子の設計と合成の成功を明確に示しており、その最小の分子量により、臨床的に展開されたときに腎クリアランスを介した代謝が実施されると予想され、薬物送達の適用などの生物医学分野での使用の可能性が確かになる。
さらに、本発明で開示されるオレイン酸修飾アルギン酸ナトリウム（ＡＧＯ）は、水不溶性の１種または複数種の薬物に対する優れた薬物封入能力が確かなものとなる。実験的観察によりまた、（１）抗癌、抗増殖、および抗炎症などを目的とするこれらの非常に強力な医薬品成分から発揮される可能性のある細胞毒性を減らすこと、（２）これらの水不溶性の高い薬物の水溶性を高めて、治療時のバイオアベイラビリティを高めること、（３）転移性固形腫瘍などの治癒が困難な疾患などを治療するために二剤併用投与を実施して、治療性能を相乗的にすること、（４）必要に応じた臨床用途のための短期から長期の保存期間にわたって安定したコロイド用量を形成すること、および、（５）特定の送達のための後続の新規な剤形に潜在的な多用途性を与えること、において、有益であることが実証された。
本明細書は多くの具体的説明を含むが、これらは本発明の範囲または特許請求の範囲に対する制限として解釈されるべきではなく、本発明の特定の実施形態または実施例に特有の特徴の説明として解釈されるべきである。別の実施形態または実施例の文脈で本明細書に記載されている特定の特徴は、１つの実施形態において組み合わせて実施することも可能である。

Claims (17)

  1. アルギン酸塩とオレイン酸がスペーサーで結合した、アルギネート－オレイン酸（ＡＧＯ）高分子。
  2. 両親媒性であり、臨床的に利用可能な分子サイズを有するかまたは抗癌活性を有する、請求項１に記載のＡＧＯ高分子。
  3. スペーサーが、ジアミンである、請求項１に記載のＡＧＯ高分子。
  4. スペーサーが、エチレンジアミン、または１，６－ジアミノヘキサンである、請求項１に記載のＡＧＯ高分子。
  5. スペーサーが、エチレンジアミンである、請求項１に記載のＡＧＯ高分子。
  6. 式Ｉ：
    Figure 2023516765000016
     式Ｉ
    で示される構造を有する、請求項５に記載のＡＧＯ分子。
  7. 水溶液中でナノ粒子を形成する自己組織化挙動を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のＡＧＯ高分子。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載のＡＧＯ高分子の自己組織化によって形成された、ＡＧＯナノ粒子。
  9. 優れた構造安定性、コロイド安定性、およびインビトロおよびインビボにおける生体適合性を有する、請求項８に記載のＡＧＯナノ粒子。
  10. 活性剤の送達システムとして使用される、請求項９に記載のＡＧＯナノ粒子。
  11. 活性剤が、薬物、生物学的薬剤、または生物学的薬剤である、請求項１０に記載のＡＧＯナノ粒子。
  12. 生物学的薬剤が、ペプチド、タンパク質、抗体、血清産物、ワクチン、または生物学的物質である、請求項１１記載のＡＧＯナノ粒子。
  13. 生物学的物質が、複数の細胞または幹細胞である、請求項１２に記載のＡＧＯナノ粒子。
  14. １種、２種または複数種の活性剤が封入されている、請求項８～１３のいずれか１項に記載のＡＧＯナノ粒子。
  15. 請求項７～１３のいずれか１項に記載のＡＧＯナノ粒子に封入された２種の活性剤を含む、二種薬物ナノ粒子。
  16. 請求項７～１３のいずれか１項に記載のＡＧＯナノ粒子に封入された３種以上の活性剤を含む、多種薬物ナノ粒子。
  17. 請求項１～７のいずれか１項に記載のＡＧＯ高分子を製造する方法であって、
    （１）オレイン酸（ＯＡ）、およびＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ－ＨＣｌ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で混合し、次いで、これをＤＣＭ中でエチレンジアミンと混合して反応混合物を得て；該反応混合物を塩水と反応させて生成物を得て、該生成物の水相をＤＣＭで抽出して、生成物の有機相を収集し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗生成物を生成し、該粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、濾過して、修飾ＯＡを得る、工程；および、
    （２）アルギン酸ナトリウムを水に溶解して溶液を調製し、ＨＣｌを用いて溶液のｐＨを３～４に調整し、ｐＨを３～４に調整しながらＥＤＣ－ＨＣｌの水溶液をゆっくりと加えて反応を終了させて、生成物を得て、蒸留水に対して該生成物を透析し、凍結乾燥および精製して、ＡＧＯ高分子を得る、工程、
    を含む、方法。
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