TW202144015A

TW202144015A - Ｂ７ｈ３抗體－依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途

Info

Publication number: TW202144015A
Application number: TW110110880A
Authority: TW
Inventors: 應華; 張玲; 胡齊悅; 蔣海俠
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2021-12-01
Also published as: WO2021190586A1; CN115605510A

Abstract

本揭露涉及B7H3抗體-依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途。具體而言，本揭露涉及B7H3抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及其在製備用於治療B7H3介導的疾病或病症的藥物中的用途；尤其在製備抗癌藥物中的用途。

Description

B7H3抗體-依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途

本申請要求2020年3月25日提交的中國專利申請(申請號CN 202010218100.7)的優先權。

本揭露關於抗B7H3抗體-依喜替康類似物偶聯物及其在醫藥上的應用。進一步地，本揭露關於抗B7H3抗體-依喜替康類似物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及包含前述偶聯物或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物，以及其製備用於治療B7H3介導的疾病或病症的藥物中的用途；尤其在製備抗癌藥物中的用途。

這裡的陳述僅是提供與本揭露有關的背景資訊，而不必然地構成現有技術。

T細胞介導的免疫反應在機體抗腫瘤過程中發揮著極其重要的作用，而T細胞的活化和增殖不僅需要TCR識別的抗原信號，還需要共刺激分子提供的第二信號。B7家族分子屬於共刺激分子免疫球蛋白超家族。越來越多的研究表明，該家族分子在機體正常免疫功能和病理狀態下均發揮了重要的調節作用。

B7H3是B7家族的成員之一，屬於I型跨膜蛋白，包含胺基端的一個信號肽，一個細胞外的免疫球蛋白樣可變區(IgV)和恆定區(IgC)、一個跨膜區和一個含有約45個胺基酸的胞質尾區(Tissue Antigens.2007 Aug；70(2)：96-104)。目前，B7H3主要存在2種剪切體，B7H3a和B7H3b。B7H3a胞外段由IgV-IgC 2個免疫球蛋白結構域組成，又稱為2IgB7H3；而B7H3b胞外段由IgV-IgC-IgV-IgC 4個免疫球蛋白結構域組成，又稱為4IgB7H3。

B7H3在正常組織、細胞中不表達或極低表達，卻高表達於多種腫瘤組織。B7H3與腫瘤的進展、患者的生存及預後密切相關。臨床上已經報導，B7H3在許多癌症類型中、特別是在非小細胞肺癌、腎癌、泌尿道上皮癌、結直腸癌、前列腺癌、多形性膠質母細胞瘤、卵巢癌和胰腺癌中過表達(Lung Cancer.2009 Nov；66(2)：245-249；Clin Cancer Res.2008 Aug 15；14(16)：5150-5157)。此外，也有文獻報導，在前列腺癌中，B7H3的表達強度與臨床病理學惡性(諸如腫瘤體積、前列腺外侵襲或Gleason評分)正相關，且也與癌症進展相關(Cancer Res.2007 Aug 15；67(16)：7893-7900)。類似地，在多形性膠質母細胞瘤中，B7H3的表達與無事件存活負相關；且在胰腺癌中，B7H3的表達與淋巴結轉移和病理學進展相關。因此，B7H3被認為是一種新的腫瘤標誌物和潛在的治療靶點。

目前，已有針對B7H3靶點的治療策略用於臨床前研究，如靶向小鼠B7H3的抗體會增強瘤內的浸潤性的CD8-陽性的T細胞和抑制腫瘤生長(Mod Pathol.2010 Aug；23(8)：1104-1112)。此外，WO2008/066691專利申請顯示，識別B7H3a的抗體會對腺癌表現出體內抗腫瘤作用。在臨床研究中，一種鼠源的B7H3抗體與放射性I¹³¹的偶聯藥物可顯著抑制患者成神經母細胞瘤的生長(J Neufooocol 97(3)：409-18(2010))。但目前在研的專案都是鼠源抗體經改造的人源化抗體，而人源化抗體在免疫時存在免疫原性相對較高的問題，在人體應用時是一個不利的因素。

噬菌體展示技術(phage display technology)將外源蛋白質或多肽與噬菌體外殼蛋白融合表達，從而將外源蛋白表達在噬菌體的表面。噬菌體抗體庫是將噬菌體展示技術、PCR擴增技術、蛋白表達技術相結合的一項運用綜合技術手段所建立起來的抗體庫。

噬菌體抗體庫最大的優點是不經體內免疫，模擬體內抗體生成的三個過程而製備出全人源的抗體。除此之外，噬菌體抗體庫還具有以下優勢：

①實現了基因型與表型的統一。此外，實驗方法簡單、快速，傳統的藉由融合瘤技術抗體產生方法需歷經數月，而抗體庫技術只需短短幾周的時間。

②表達的是完全人源抗體，且分子量小，主要以活性片段Fab、scFv的形式表達，與完整抗體相比在組織穿透力方面都有明顯優勢。

③篩選容量大，融合瘤技術是在上千個選殖內篩選，抗體庫技術可以在百萬甚至億萬個分子中進行選擇，篩選到的抗體種類多。

④用途廣泛，採用了原核表達系統，當大規模生產時優勢更加明顯(Curr Opin Biotechnol.2002 Dec；13(6)：598-602；Immunotechnology,2013，48(13)48(13)：63-73)。

抗體-藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)把單株抗體或者抗原結合片段藉由接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連，充分利用了抗體對正常細胞和腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和細胞毒性物質的高效性，同時又避免了抗體的療效偏低和毒性物質毒副作用過大等缺陷。這也就意味著，與以往傳統的化療藥物相比，抗體-藥物偶聯物能更精準地殺傷腫瘤細胞並降低對正常細胞的影響。

目前已有多種ADC藥物被用於臨床或臨床研究；如Kadcyla，是靶向Her2的曲妥珠單抗與DM1形成的ADC藥物。同時，也有靶向B7H3的抗體及ADC藥物的專利報導，如WO2008100934、WO2012147713、WO2014061277、WO2015184203、WO2016044383。

用於抗體藥物偶聯物的具有細胞毒性的小分子有幾類；其中有一類是喜樹鹼衍生物，它們藉由抑制拓撲異構酶I而具有抗腫瘤作用的。報道喜樹鹼衍生物依沙替康(化學名：(1S，9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]咪唑并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮)應用於抗體偶聯藥物(ADC)的文獻有WO2014057687；Clinical Cancer Research(2016)22(20)：5097-5108；Cancer Sci(2016)107：1039-1046。但仍需進一步開發療效更好的ADC藥物。

為了降低抗體分子的免疫原性，提供一種更符合需要的B7H3抗體-藥物偶聯物。本揭露提供了一種通式Pc-L-Y-D所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：

其中，

Y選自-O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-、-O-CR¹R²-(CR^aR^b)_m-、-O-CR¹R²-、-NH-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-和-S-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-；

R^a和R^b相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基和雜環基；或者，R^a和R^b與其相連接的碳原子一起形成環烷基和雜環基；

R¹選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；R²選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；或者，R¹和R²與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；

或者，R^a和R²與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；

m為0至4的整數；非限制性示例如m選自0、1、2、3和4；

n為1至10，n是小數或整數；

L為接頭單元；

Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含：

重鏈可變區，其為SEQ ID NO：1的變體，所述的變體包含一個或多個選自T16R、Y103F、I28T、A33D、S99E、A100G、A104G、R101K、A104S和A113T的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含一個或多個選自T16R、Y103F、I28T和A113T的胺基酸取代；和

輕鏈可變區，其為SEQ ID NO：2或其變體，所述的變體包含一個或兩個選自R56K和S57G的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含S57G的胺基酸取代；

所述胺基酸編號為依據可變區序列的自然順序編號。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含：

重鏈可變區為SEQ ID NO：1的變體，所述的變體包含T16R的胺基酸取代；較佳包含T16R和A113T的胺基酸取代。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含如序列SEQ ID NO：2所示的輕鏈可變區。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區為SEQ ID NO：2的變體，所述的變體包含S57G的胺基酸取代。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區為SEQ ID NO：1的變體，所述的變體包含選自以下任一組的胺基酸取代：

a、T16R、Y103F和A113T；

b、T16R、I28T、Y103F和A113T；

c、T16R和A113T；和

d、T16R、I28T和A113T。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含以下任一組：

e、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

如SEQ ID NO：2所示的輕鏈可變區；

f、重鏈可變區，其包含T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

如SEQ ID NO：2所示的輕鏈可變區；

g、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

h、重鏈可變區，其包含T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

i、重鏈可變區，其包含T16R和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

j、重鏈可變區，其包含T16R、I28T和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代。

本揭露提供了一種通式Pc-L-Y-D所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：

其中，

或者，R^a和R²與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；

m為0至4的整數；非限制性示例如m選自0、1、2、3和4；

n為1至10，n是小數或整數；

L為接頭單元；

重鏈可變區，其為SEQ ID NO：1中的重鏈可變區的變體，所述的變體包含一個或多個選自T16R、Y103F、I28T、A33D、S99E、A100G、A104G、R101K、A104S和A113T的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含一個或多個選自T16R、Y103F、I28T和A113T的胺基酸取代；和

輕鏈可變區，其為SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區或其變體，所述的變體包含一個或兩個選自R56K和S57G的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含S57G的胺基酸取代；

所述胺基酸編號為依據可變區序列的自然順序編號。

重鏈可變區為SEQ ID NO：1中的重鏈可變區的變體，所述的變體包含T16R的胺基酸取代；較佳包含T16R和A113T的胺基酸取代。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含如序列SEQ ID NO：2中所示的輕鏈可變區。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區為SEQ ID NO：2的輕鏈可變的變體，所述的變體包含S57G的胺基酸取代。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區為SEQ ID NO：1的重鏈可變區的變體，所述的變體包含選自以下任一組的胺基酸取代：

a、T16R、Y103F和A113T；

b、T16R、I28T、Y103F和A113T；

c、T16R和A113T；和

d、T16R、I28T和A113T。

e、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區；

g、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

i、重鏈可變區，其包含T16R和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

j、重鏈可變區，其包含T16R、I28T和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一项所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段選自以下任一組：

如SEQ ID NO：3所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：4所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：5所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：6所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：10所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：12所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含抗體恆定區；所述抗體恆定區的重鏈恆定區來源於人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳地，所述重鏈恆定區的胺基酸序列源於人IgG1；所述抗體恆定區的輕鏈恆定區來源於人抗體κ、λ鏈。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體包含選自以下任一組：

如SEQ ID NO：17所示的重鏈、和

SEQ ID NO：18所示的輕鏈；

如SEQ ID NO：19所示的重鏈、和

SEQ ID NO：20所示的輕鏈；

如SEQ ID NO：21所示的重鏈、和

SEQ ID NO：22所示的輕鏈；和

如SEQ ID NO：23所示的重鏈、和

SEQ ID NO：24所示的輕鏈。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)和二硫鍵穩定化的V區(dsFv)。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中n為1至8，較佳為3-8，更較佳為3-7，n是小數或整數。作為非限制性示例，可以提及的n是1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、或前述任意數值間的範圍；允許技術人員根據需求，確定小數點後的精度。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，

其中，

Y為-O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-；

R^a和R^b相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素和C1_-6烷基；

R¹為鹵C_1-6烷基或C_3-6環烷基；

R²選自氫原子、鹵C_1-6烷基和C_3-6環烷基；

或者，R¹和R²與其相連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基；

m為0或1。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體一藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中Y選自以下任一項：

其中Y的O端與接頭單元L相連。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中接頭單元-L-為-L¹-L²-L³-L⁴-，

L¹選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)-和-C(O)-W-C(O)-；其中W選自C_1-8烷基、C_1-8烷基-環烷基和1至8個原子的直鏈雜烷基，所述雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中所述的C_1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；

L²選自-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-、-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-、-S(CH₂)p¹C(O)-和化學鍵，其中p¹為1至20的整數；

L³為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中所述的胺基酸殘基選自苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、賴胺酸(K)、瓜胺酸(Cit)、絲胺酸(S)、谷胺酸(E)和天冬胺酸(D)中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；

L⁴選自-NR⁵(CR⁶R⁷)_t-、-C(O)NR⁵、-C(O)NR⁵(CH₂)_t-和化學鍵，其中t為1至6的整數；

R³、R⁴和R⁵相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；

R⁶和R⁷相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。

L¹為

，s¹為2至8的整數(具體而言，2、3、4、5、6、7或8)；

L²為化學鍵；

L³為四肽殘基；較佳地，L³為GGFG(SEQ ID NO：33)的四肽殘基；

L⁴為-NR⁵(CR⁶R⁷)t-，R⁵、R⁶或R⁷相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2；

其中所述的L¹端與Pc相連，L⁴端與Y相連。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中-L-為：

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中-L-Y-任選自以下任一項：

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為通式(Pc-L_a-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：

其中，

Pc、n、m、R¹、R²如通式(Pc-L-Y-D)中所定義；

W、L²、L³、R⁵、R⁶和R⁷如接頭單元-L-中所定義；

具體地，

m為0至4的整數；

n為1至10，n是小數或整數；

W選自C_1-8烷基、C_1-8烷基-環烷基和1至8個原子的直鏈雜烷基，所述雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中所述的C_1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；

L³為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中所述的胺基酸殘基選自苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、賴胺酸(K)、瓜胺酸、絲胺酸(S)、谷胺酸(E)和天冬胺酸(D)中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；

R⁵選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為通式(Pc-L_b-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：

其中，

s¹為2至8的整數；

Pc、R¹、R²、R⁵至R⁷、m和n如通式(Pc-L_a-Y-D)中所定義。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，所述抗體-藥物偶聯物選自以下任一項：

其中，Pc和n如通式(Pc-L_a-Y-D)中所定義。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，所述抗體-藥物偶聯物為：

其中，

n為1至8，較佳3至8；更較佳3至7，n是小數或整數；

h1702-DS-107為抗B7H3抗體，其包含序列如SEQ ID NO：21所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：22所示的輕鏈。

在另一些實施方式中，本揭露提供一種如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中n為1至8，較佳為3-8，更較佳為3-7，n是小數或整數。

另一方面，本揭露一個實施方式提供一種抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，其為SEQ ID NO：1中的重鏈可變區的變體，所述的變體包含一個或多個選自T16R、Y103F、I28T、A33D、S99E、A100G、A104G、 R101K、A104S和A113T的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含一個或多個選自T16R、Y103F、I28T和A113T的胺基酸取代；和

輕鏈可變區，其為SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區或其變體，所述的變體包含一個或兩個選自R56K和S57G的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含S57G的胺基酸取代。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區為SEQ ID NO：1重鏈可變區的變體，所述的變體包含選自以下任一組的胺基酸取代：

a、T16R、Y103F和A113T；

b、T16R、I28T、Y103F和A113T；

c、T16R和A113T；和

d、T16R、I28T和A113T。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含：

e、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區；

f、重鏈可變區，其包含T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代，和SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區；

g、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

h、重鏈可變區，其包含T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代，和輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

i、重鏈可變區，其包含T16R和A113T的胺基酸取代，和輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

j、重鏈可變區，其包含T16R、I28T和A113T的胺基酸取代，和輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段選自：

如SEQ ID NO：3所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：4所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：5所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：6所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：10所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：12所示的輕鏈可變區；和

如SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含抗體恆定區；所述抗體恆定區的重鏈恆定區来源於人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳地，所述重鏈恆定區的胺基酸序列源於人IgG1，更較佳如SEQ ID NO：15所示的重鏈恆定區；所述抗體恆定區的輕鏈恆定區来源於人抗體κ、λ鏈；較佳如SEQ ID NO：16所示的輕鏈恆定區。

在另一個實施方式中，本揭露提供一種所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體選自：

如SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：18所示的輕鏈；

如SEQ ID NO：19所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈；

如SEQ ID NO：21所示的重鏈和SEQ ID NO：22所示的輕鏈；和

如SEQ ID NO：23所示的重鏈和SEQ ID NO：24所示的輕鏈。

另一方面，本揭露一個實施方式提供一種核酸分子，其編碼如上所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段。

另一方面，本揭露一個實施方式提供一種宿主細胞，其包含如上所述的核酸分子。

另一方面，本揭露一個實施方式提供一種製備如通式Pc-L_a-Y-D所示的化合物的方法，其包括如下步骤：

Pc’為經還原後的Pc，與通式(L_a-Y-D)所示的化合物進行偶聯反應，得到通式(Pc-L_a-Y-D)所示的化合物；作為一個示例，Pc’為帶有反應性基團(如巰基)，還原劑較佳為TCEP，特別地，較佳為還原抗體上的二硫键，得到巰基；

其中，

Pc為如前所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段；

W、L²、L³、R¹、R²、R⁵至R⁷、m和n如通式Pc-La-Y-D中所定義。

抗B7H3抗體h1702-DS-107還原後得到h1702-DS-107’，h1702-DS-107’與式9-A所示的化合物進行偶聯反應，得到通式(h1702-DS-107-9-A)所示的化合物；還原劑較佳TCEP，特別地，較佳還原抗體上的二硫鍵，得到巰基；

n為1至8，較佳3-8，n是小數或整數；

1702-DS-107為抗B7H3抗體，其包含序列如SEQ ID NO：3所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：4所示的輕鏈。

另一方面，本揭露提供了一種藥物組合物，其包含：

- 如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或如前任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，以及

- 一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。

在一些實施方案中，所述單位劑量的藥物組合物中含有0.1mg至3000mg或1mg至1000mg如前所述的抗B7H3抗體、其抗原結合片段、或如前所述的抗體藥物偶聯物。

另一方面，本揭露提供了如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或如前任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段或包含其的藥物組合物作為藥物的用途。

另一方面，本揭露提供了如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或如前任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段、或包含其的藥物組合物在製備用於治療B7H3介導的疾病或病症或腫瘤的藥物中的用途，其中所述B7H3介導的疾病或病症為B7H3高表達癌症，中表達癌症或低表達癌症。

另一方面，本揭露提供如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或如前任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段或包含其的藥物組合物在製備用於治療或預防腫瘤的藥物中的用途，其中所述腫瘤和癌症較佳為頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系统癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、咽頭癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宫內膜癌、子宫頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、庫肯勃氏瘤、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克爾細胞癌；更較佳的，所述淋巴瘤選自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤，所述肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌，所述白血病選自：慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病和髓樣細胞白血病。

另一方面，本揭露進一步關於一種用於治療或預防腫瘤或癌症的方法，該方法包括向需要其的受試者施用治療有效劑量或預防有效劑量的如前任一項所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或如前任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段、或包含其的藥物組合物。

在一些實施方案中，適用於採用本申請的活性化合物進行處理的腫瘤或癌症，與B7H3的高表達、中表達或低表達相關。在一些實施方案中，所述腫瘤和癌症選自：頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、庫肯勃氏瘤、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克爾細胞癌。

在一些具體的實施方案中，所述淋巴瘤選自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤。

在一些具體的實施方案中，所述肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌。

在一些具體的實施方案中，所述白血病選自：慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病和髓樣細胞白血病。

另一方面，本揭露進一步提供前述的抗B7H3抗體或其抗體-藥物偶聯物作為藥物，較佳作為治療癌症或腫瘤的藥物，更較佳作為治療B7H3介導的癌症的藥物。

可將活性化合物(例如根據本揭露所述的配體-藥物偶聯物、或其藥學上可接受的鹽)製成適合於藉由任何適當途徑給藥的形式，活性化合物較佳是以單位劑量的方式，或者是以受試者能夠以單劑進行自我給藥的方式。本揭露化合物或組合物的單位劑量的方式可以是片劑、膠囊、扁囊劑、瓶裝藥水、藥粉、顆粒劑、錠劑、栓劑、再生藥粉或液體製劑。

本揭露治療方法中所用活性化合物或組合物的施用劑量通常將隨疾病的嚴重性、受試者的體重和化合物的相對功效而改變。作為一般性指導，合適的單位劑量可以是0.1mg至1000mg。

本揭露的藥物組合物除活性化合物外，可含有一種或多種輔料，所述輔料選自以下成分：填充劑、稀釋劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑或賦形劑等。根據給藥方法的不同，組合物可含有0.1重量%至99重量%的活性化合物。

本揭露提供的抗B7H3抗體及抗體藥物偶聯物具有降低的免疫原性，更高的抑瘤效果和治療活性，更低的毒性，更好的藥物代謝動力學特性和成藥性(如穩定性)。

圖1：不同ADC對不同B7H3表達水準Detroit562細胞株的增殖抑制。

圖2：不同ADC對裸鼠Detroit562移植瘤的療效。

一、術語

除非另有限定，本文所用的所有技術和科學術語均與本揭露所屬領域具有通常知識者的通常理解一致。雖然也可採用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本揭露，但本文描述了較佳的方法和材料。描述和要求保護本揭露時，依據以下定義使用下列術語。

當本揭露中使用商品名時，旨在包括該商品名產品的製劑、該商品名產品的藥物和活性藥物部分。

除非有相反陳述，在說明書和申請專利範圍中使用的術語具有下述含義。

術語“藥物”是指細胞毒性藥物，能在細胞內具有較強破壞其正常生長的化學分子。細胞毒性藥物原則上在足夠的濃度下都可以殺死細胞，但是由於缺乏特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會導致正常細胞的凋亡，導致嚴重的副作用。該術語包括毒素(如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素)，放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)，化療藥物，抗生素和核溶酶。

術語“L”、“接頭單元”、“接頭”、“連接單元”或“連接片段”是指一端與配體(具體是抗體或抗原結合片段)連接，而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與配體或藥物相連。

接頭(包括延伸物、間隔物和胺基酸單元)，可以藉由本領域已知方法合成，諸如US2005-0238649A1中所記載的。接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。

術語“抗體-藥物偶聯物”(antibody drug conjugate，ADC)，指抗體藉由連接單元與藥物相連。在本揭露中“抗體-藥物偶聯物”指把單株抗體或者抗原結合片段藉由穩定的連接單元與具有生物活性的毒性藥物相連。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

術語“抗體”指免疫球蛋白，完整抗體是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

全長抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括 3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的框架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本揭露所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的IMGT規則。

術語“完全人源抗體”、“完全人抗體”或“全人抗體”，也稱“全人源單株抗體”，其抗體的可變區和恆定區都是人源的，降低了免疫原性和毒副作用。全人源抗體製備的相關技術主要有：人融合瘤技術、EBV轉化B淋巴細胞技術、噬菌體顯示技術(phage display)、轉基因小鼠抗體製備技術(transgenic mouse)和單個B細胞抗體製備技術等。

術術語“抗原結合片段”是指抗體的保持結合抗原的能力的一個或多個片段。可利用全長抗體的片段来進行抗體的抗原結合功能。“抗原結合片段”中包含的結合片段的示例包括：

(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；

(ii)F(ab')₂片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，

(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；

(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；

(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和

(vi)分離的互補決定區(CDR)；或

(vii)藉由接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。

此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由接頭連接它們，從而使得其能够產生VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈，稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。

使用術所屬領域具有通常知識者已知的常規技術獲得此類抗原結合片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式進行功用性篩選。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白来產生抗原結合片段。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。

通常，Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(例如，切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的具有約50,000分子量並具有抗原結合活性的片段，其中H鏈N端側的部分和L鏈藉由二硫鍵結合在一起。

通常，F(ab')2是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中二硫鍵的下方部分而獲得的，分子量約為100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的片段。

通常，Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的片段。

此外，可以藉由將編碼Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，並將載體導入到原核生物或真核生物中進行表達，來生產所述Fab'。

術術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或VH)和抗體輕鏈可變結構域(或VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本揭露的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

術術語“框架區”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗體結合的部位。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

術術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大约小於10^-7M，例如大约小於10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的親和力(以KD計)結合。

術術語“核酸分子”是指DNA分子或RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增强子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增强子有效地連接至所述編碼序列。

術術語“表達載體”是指能够運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，表達載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，表達載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能够在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌屬(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞株包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞株)和NS0細胞。

本揭露的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。譬如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染宿主細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的N端位點。陽性的選殖在生物反應器的培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。譬如，用A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗原結合片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，譬如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

術語“肽”是指分子量介於胺基酸和蛋白質之間的化合物片段，由2個或2個以上胺基酸分子藉由肽鍵相互連接而成。

術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12個)碳原子的烷基，更較佳含有1至10個碳原子的烷基，最較佳含有1至6個碳原子(包含1個、2個、3個、4個、5個或6個碳原子)的烷基。非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更較佳的，烷基是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的。當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、經基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基。

術語“雜烷基”指含有一個或多個選自N、O或S的雜原子的烷基，其中烷基如上所定義。

術語“亞烷基”指飽和的直鏈或支鏈脂肪族烴基，其具有從母體烷的相同碳原子或兩個不同的碳原子上除去兩個氫原子所衍生的殘基，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12個)碳原子，更較佳含有1至6個碳原子(包含1個、2個、3個、4個、5個或6個碳原子)的亞烷基。亞烷基的非限制性示例包括但不限於亞甲基(-CH₂-)、1,1-亞乙基(-CH(CH₃)-)、1,2-亞乙基(-CH₂CH₂)-、1,1-亞丙基(-CH(CH₂CH₃)-)、1,2-亞丙基(-CH₂CH(CH₃)-)、1,3-亞丙基(-CH₂CH₂CH₂-)、1,4-亞丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂-)和1,5-亞丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-)等。亞烷基可以是取代的或非取代的。當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代基較佳獨立地任選選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基中的一個或多個取代基所取代。

術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(環烷基)，其中烷基或環烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性示例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是任選取代的或非取代的。當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基和雜環烷硫基。

術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環的環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳包含3至12個碳原子，更較佳包含3至10個碳原子，最較佳包含3至8個碳原子(包含3個、4個、5個、6個、7個或8個碳原子)。單環環烷基的非限制性示例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環或橋環的環烷基。

術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環的環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0、1或2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳包含3至12個環原子，其中1至4個是雜原子(1個、2個、3個或4個雜原子)；更較佳，環烷基環包含3至10個環原子(包含3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個環原子)。單環雜環基的非限制性示例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫基嗎啉基、高哌嗪基等。多環雜環基包括螺環、稠環或橋環的雜環基。

術語“螺雜環基”指單環之間共用一個原子(稱螺原子)的，5至20員的多環雜環基團，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更較佳為7至10員。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺雜環基分為：單螺雜環基、雙螺雜環基或多螺雜環基，較佳為單螺雜環基或雙螺雜環基。更較佳為4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺雜環基。螺雜環基的非限制性示例包括：

術語“稠雜環基”指5至20員，系統中的每個環與體系中的其他環共用毗鄰的一對原子的多環雜環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0、1或2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更較佳為7至10員(7員、8員、9員或10員環)。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠雜環基，較佳為雙環或三環，更較佳為5員/5員或5員/6員雙環稠雜環基。稠雜環基的非限制性示例包括：

術語“橋雜環基”指5至14員，任意兩個環共用兩個不直接連接的原子的多環雜環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0、1或2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更較佳為7至10員(7員、8員、9員或10員環)。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋雜環基，較佳為雙環、三環或四環，更較佳為雙環或三環。橋雜環基的非限制性示例包括：

所述雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性示例包括：

和

等。

雜環基可以是任選取代的或非取代的。當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基。

術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共用毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至10員(6員、7員、8員、9員或10員)，例如苯基和萘基，較佳苯基。所述芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性示例包括：

芳基可以是取代的或非取代的。當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基和雜環烷硫基。

術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子(1個、2個、3個或4個雜原子)、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳為5至10員(5員、6員、7員、8員、9員或10員雜芳基)，更較佳為5員或6員，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性示例包括：

雜芳基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基和雜環烷硫基。

術語“胺基保護基”是為了使分子其他部位進行反應時胺基保持不變，用易於脫去的基團對胺基進行保護。非限制性示例包含9-芴甲氧羰基、第三丁氧羰基、乙醯基、苄基、烯丙基和對甲氧苄基等。這些基團可任選地被選自鹵素、烷氧基或硝基中的1-3個取代基(1個、2個或3個取代基)所取代。所述胺基保護基較佳為9-芴甲氧羰基。

術語“鹵烷基”指烷基上的氫被一個或多個鹵素取代，其中烷基如上所定義。

術語“氘代烷基”指烷基上的氫被一個或多個氘原子取代，其中烷基如上所定義。

術語“羥基”指-OH基團。

術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

術語“胺基”指-NH₂。

術語“硝基”指-NO₂。

術語“醯胺基”指-C(O)N(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。

術語“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。

本揭露還包括各種氘化形式的式(I)化合物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。所屬領域具有通常知識者能夠參考相關文獻合成氘化形式的式(I)化合物。在製備氘代形式的式(I)化合物時可使用市售的氘代起始物質，或它們可使用常規技術採用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限於氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

“任選”或“任選地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選被烷基取代的雜環基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團被烷基取代的情形和雜環基團不被烷基取代的情形。

“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更較佳為1個、2個或3個氫原子彼此獨立地被取代基取代。取代基僅處在它們的可能的化學位置，所屬領域具有通常知識者能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。

術語“藥物組合物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性化合物的吸收進而發揮生物活性。

術語“藥學上可接受的鹽”或“可藥用鹽”是指本揭露抗體-藥物偶聯物的鹽，或本揭露中所述的活性化合物的鹽，這類鹽用於受試者時具有安全性和有效性，且具有應有的生物活性。作為一個示例，本揭露抗體-抗體藥物偶聯化合物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，可藥用鹽的非限制性示例包括：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。

“載藥量”也稱藥物抗體比例(Drug-to-Antibody Ratio，DAR)，即ADC中每個抗體所偶聯的藥物的平均數量。其可在例如每個抗體偶聯約1至約10個藥物的範圍內；並且在某些實施例中，在每個抗體偶聯約1至約8個藥物的範圍內，較佳選自2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，3-4，3-5，5-6，5-7，5-8和6-8的範圍。示例性地，載藥量可以為在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10基礎上所得的算術平均值。本揭露的ADC通式包括與前述一定載藥量範圍內的抗體藥物偶聯物的集合。

在本揭露的實施方式中，載藥量表示為n，可用常規方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗和HPLC特徵測定載藥量。

可以用以下非限制性方法控制抗體藥物偶聯物的載量，包括：

(1)控制連接試劑和單抗的摩爾比，

(2)控制反應時間和溫度，

(3)選擇不同的反應試劑。

藥物組合物的常規製備方法見中國藥典。

術語“載體”用於本揭露的藥物，是指能改變藥物進入受試者的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶點的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的示例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。

術語“賦形劑”是在藥物製劑中除活性成分以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。

術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。如澱粉、乳糖、鈣的無機鹽、微晶纖維素等。

藥物組合物可以是無菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶劑中有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性化合物溶於油相的無菌注射水包油微乳。例如將活性化合物溶於大豆油和卵磷脂的混合物中，然後將油溶液加入水和甘油的混合物中處理形成微乳。可藉由局部大量注射，將注射液或微乳注入受試者的血流中。或者，最好按可保持本揭露化合物恆定迴圈濃度的方式施用溶液和微乳。為保持這種恆定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的示例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型靜脈注射泵。

藥物組合物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油混懸液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該混懸液。無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中製備的無菌注射溶液或混懸液，例如1,3-丁二醇中製備的溶液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用包括合成甘油單或二酯在內的任何調和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以製備注射劑。

二、合成方法

為了完成合成目的，採用如下的合成技術方案：

製備抗體-藥物偶聯物h1702-DS-107的方法，其包括如下步骤：

抗B7H3抗體h1702-DS-107還原後得到h1702-DS-107’，h1702-DS-107’與式9-A所示的化合物進行偶聯反應，得到通式(h1702-DS-107-9-A)所示的化合物；還原劑較佳為TCEP，特別地，較佳為還原抗體上的二硫鍵，得到巰基；n為1至8，較佳3-8，n是小數或整數。

在以上說明書中提出了本揭露一種或多種實施方式的細節。雖然可使用與本文所述類似或相同的任何方法和材料來實施或測試本揭露，但是以下描述較佳的方法和材料。藉由說明書和申請專利範圍，本揭露的其他特點、目的和優點將是顯而易見的。

在說明書和申請專利範圍中，除非上下文中有清楚的另外指明，單數形式包括複數指代物的情況。

除非另有定義，本揭露使用的所有技術和科學術語都具有本揭露所屬領域具有通常知識者所理解的一般含義。說明書中引用的所有專利和出版物都藉由引用納入。

提出以下實施例是為了更全面地說明本揭露的較佳實施方式。這些實施例不應以任何方式理解為限制本揭露的範圍，本揭露的範圍由申請專利範圍限定。

[具體實施方式]

一、抗體的製備

實施例1-1 抗體的製備、表達與純化

(一)抗體的設計

WO2019/024911公開了一種抗B7H3抗體h1702-DS的製備，其全文可參考引用，抗體h1702-DS具體序列包括重鏈(IgG1)胺基酸序列(如公開WO2018/177393中所述第22號序列)：

SEQ ID NO：1；

和輕鏈胺基酸序列(如公開WO2018/177393中所述的第26號序列)：

SEQ ID NO：2。

對上述抗B7H3抗體進行突變，得到具有更低免疫原性的抗體，檢測其對B7H3結合活性(測試例1)，獲得了新的抗體，相應抗體的輕鏈可變區及重鏈可變區如下：

抗體可變區再與恆定區基因(CH1-FC/CL)片段進行同源重組，構建完整抗體VH-CH1-FC/VK-CL/VL-CL，所述的恆定區序列如下：

重鏈恆定區：

SEQ ID NO：15；

輕鏈恆定區：

SEQ ID NO：16。

得到完整抗體，具體抗體序列包括但不限於：

抗體h1702-DS-105

重鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：17；

輕鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：18。

抗體h1702-DS-106

重鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：19；

輕鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：20。

抗體h1702-DS-107

重鏈(IgG1)胺基酸序列：

SEQ ID NO：21；

輕鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：22。

抗體h1702-DS-108

重鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：23；

輕鏈胺基酸序列：

SEQ ID NO：24。

其中上述完整抗體輕重鏈中CDR序列(IMGT編號規則)如表2所示。

(二)全人抗體的表達與純化

分別表達抗體輕重鏈的質粒以轉染HEK293E細胞，6天後收集表達上清液，高速離心去除雜質，用Protein A柱進行純化。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性沖提液沖提目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。沖提樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。

實施例1-2 相關檢測細胞株和抗體的製備

(一)B7H3過表達的細胞株

本揭露使用過表達B7H3的重組細胞株(CT26/B7H3，其中CT26來源於中科院細胞庫，TCM37)或腫瘤細胞(A498)，檢測本揭露抗體與B7H3抗原的結合能力。

人B7H3全長胺基酸序列：B7H3(SEQ ID NO：31)：

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；

劃橫線部分為B7H3胞外區(Extracellular domain：29-466)，其中29-139為Ig-樣V-型1結構域，145-238為Ig-樣C2-型1結構域；243-357為Ig-樣V-型2結構域，363-456為Ig-樣C2-型2結構域；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：467-487)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：488-534)。

(二)猴B7H3全長胺基酸序列

SEQ ID NO：32

註釋：

雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；

劃橫線部分為B7H3胞外區(Extracellular domain：29-466)，其中29-139為Ig-like V-type 1 Domain，145-238為Ig-like C2-type 1 Domain；243-357為Ig-like V-type 2 Domain，363-456為Ig-like C2-type 2 Domain；

點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：467-487)；

斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：488-534)。

二、化合物的製備

本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或質譜(MS)來確定的。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)，化學位移是以10^-6(ppm)作為單位給出。

MS的測定用FINNIGAN LCQAd(ESI)質譜儀(生產商：Thermo，型號：Finnigan LCQ advantage MAX)。

UPLC的測定用Waters Acquity UPLC SQD液質聯用儀。

HPLC的測定使用安捷倫1200DAD高壓液相色譜儀(Sunfire C18 150×4.6mm色譜柱)和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀(Gimini C18 150×4.6mm色譜柱)。

UV-HPLC的測定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度計。

增殖抑制率及IC₅₀值的測定用PHERA starFS酶標儀(德國BMG公司)。

薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm至0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm至0.5mm矽膠板。

柱層析一般使用煙臺黃海200至300目矽膠為載體。

本揭露的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。

實施例中如無特殊說明，反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。

氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。

加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。

氫化反應通常抽真空，充入氫氣，反復操作3次。

微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。

實施例中如無特殊說明，反應中的溶液是指水溶液。

實施例中如無特殊說明，反應的溫度為室溫。室溫為最適宜的反應溫度，溫度範圍是20℃至30℃。

實施例中pH=6.5的PBS緩衝液的配製：取KH₂PO₄ 8.5g，K₂HPO₄.3H₂O 8.56g，NaCl 5.85g，EDTA 1.5g置於瓶中，定容至2L，超聲波使其全部溶解，搖勻即得。

純化化合物採用的柱層析的沖提劑的體系和薄層色譜法的展開劑的體系包括：A：二氯甲烷和異丙醇體系，B：二氯甲烷和甲醇體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和酸性或鹼性試劑等進行調節。

本揭露部分化合物是藉由Q-TOF LC/MS來表徵的。Q-TOF LC/MS使用安捷倫6530精確質量數四級杆-飛行時間質譜儀和安捷倫1290-Infinity超高效液相色譜儀(安捷倫Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色譜柱)。

本揭露抗體藥物偶聯物的Y-D藥物部分參見PCT/CN2019/107873。全文包括相關的化合物合成及測試例引用至本專利。其中的非限制性示例合成引用如下：

實施例2-1

N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環丙烷-1-甲醯胺1

向依喜替康甲磺酸鹽1b(2.0mg，3.76μmol，採用專利申請“EP0737686A1”公開的方法製備而得)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1- 羥基環丙基甲酸1a(1.4mg，3.7μmol，採用公知的方法“Tetrahedron Letters，25(12)，1269-72；1984”製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(3.8mg，13.7μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應2小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物1(1.6mg，產率：82.1%)。

MS m/z(ESI)：520.2[M+1]

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 7.90-7.84(m，1H)，7.80-7.68(m，1H)，5.80-5.70(m，1H)，5.62-5.54(m，2H)，5.44-5.32(m，2H)，5.28-5.10(m，2H)，3.40-3.15(m，3H)，2.44(s，3H)，2.23(t，1H)，2.06-1.75(m，2H)，1.68-1.56(m，1H)，1.22-1.18(m，2H)，1.04-0.98(m，2H)，0.89(t，3H)。

實施例2-2

(S)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-A

(R)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-B

向1b(4mg，7.53μmol)中加入2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入2-環丙基-2-羥基乙酸2a(2.3mg，19.8μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)、1-羥基苯并三唑(3mg，22.4μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(4.3mg，22.4μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌2小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物2用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH₄OAc)，B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(2-A：1.5mg，2-B：1.5mg)。

MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。

單一構型化合物2-B(較短保留時間)。

UPLC分析：保留時間1.06分鐘，純度：88%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d ₆)：δ 8.37(d，1H)，7.76(d，1H)，7.30(s，1H)，6.51(s，1H)，5.58-5.56(m，1H)，5.48(d，1H)，5.41(s，2H)，5.32-5.29(m，2H)，3.60(t，1H)，3.19-3.13(m，1H)，2.38(s，3H)，2.20-2.14(m，1H)，1.98(q，2H)，1.87-1.83(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，1.34-1.28(m，1H)，0.86(t，3H)，0.50-0.39(m，4H)。

單一構型化合物2-A(較長保留時間)。

UPLC分析：保留時間1.10分鐘，純度：86%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d ₆)：δ 8.35(d，1H)，7.78(d，1H)，7.31(s，1H)，6.52(s，1H)，5.58-5.53(m，1H)，5.42(s，2H)，5.37(d，1H)，5.32(t，1H)，3.62(t，1H)，3.20-3.15(m，2H)，2.40(s，3H)，2.25-2.16(m，1H)，1.98(q，2H)，1.87-1.82(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，1.21-1.14(m，1H)，0.87(t，3H)，0.47-0.35(m，4H)。

實施例2-3

(S)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-A

(R)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-B

向1b(5.0mg，9.41μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啡啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入3,3,3-三氟-2-羥基丙酸3a(4.1mg，28.4μmol，供應商 Alfa)、1-羥基苯并三唑(3.8mg，28.1μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(5.4mg，28.2μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應10分鐘。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌8小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物3用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH₄OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(1.5mg，1.5mg)。

MS m/z(ESI)：561.9[M+1]。

單一構型化合物(較短保留時間)。

UPLC分析：保留時間1.11分鐘，純度：88%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d ₆)：δ 8.94(d，1H)，7.80(d，1H)，7.32(s，1H)，7.20(d，1H)，6.53(s，1H)，5.61-5.55(m，1H)，5.45-5.23(m，3H)，5.15-5.06(m，1H)，4.66-4.57(m，1H)，3.18-3.12(m，1H)，2.40(s，3H)，2.26-2.20(m，1H)，2.16-2.08(m，1H)，2.02-1.94(m，1H)，1.89-1.82(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，0.87(t，3H)。

單一構型化合物(較長保留時間)。

UPLC分析：保留時間1.19分鐘，純度：90%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d ₆)：δ 8.97(d，1H)，7.80(d，1H)，7.31(s，1H)，7.16(d，1H)，6.53(s，1H)，5.63-5.55(m，1H)，5.45-5.20(m，3H)，5.16-5.07(m，1H)，4.66-4.57(m，1H)，3.18-3.12(m，1H)，2.40(s，3H)，2.22-2.14(m，1H)，2.04-1.95(m，2H)，1.89-1.82(m，1H)，1.50-1.40(m，1H)，0.87(t，3H)。

實施例2-4

N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環戊烷-1-甲醯胺4

向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基-環戊烷甲酸4a(2.2mg，16.9μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.7mg，16.9μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4(2.5mg，產率：80.9%)。

MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 7.73-7.62(m，2H)，5.75-5.62(m，1H)，5.46-5.32(m，2H)，5.26-5.10(m，1H)，3.30-3.10(m，1H)，2.43(s，3H)，2.28-2.20(m，2H)，2.08-1.84(m，8H)，1.69-1.58(m，2H)，1.04-1.00(m，2H)，0.89(t，3H)。

實施例2-5

N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羥甲基)環丙烷-1-甲醯胺5

向1b(2.0mg，3.76μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-(羥甲基)-環戊烷甲酸5a(0.87mg，7.5μmol，採用專利申請“WO201396771”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2mg，7.24μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應2小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物5(1.0mg，產率：50%)。

MS m/z(ESI)：533.9[M+1]。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 8.07(s，1H)，7.23-7.18(m，2H)，6.71-6.64(m，1H)，6.55-6.51(m，1H)，5.36-5.27(m，2H)，4.67-4.61(m，2H)，3.53-3.48(m，1H)，3.30-3.22(m，2H)，3.18-3.13(m，1H)，2.71-2.61(m，2H)，2.35-2.28(m，1H)，2.04-1.91(m，4H)，1.53-1.40(m，3H)，0.91-0.75(m，4H)。

實施例2-6

N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羥基甲基)環丁烷-1-甲醯胺6

向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-(羥基甲基)環丁烷-1-甲酸6a(2.2mg，16.9μmol；採用文獻“Journal of the American Chemical Society，2014，vol.136，#22，p.8138-8142”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.7mg，16.9μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物6(2.1mg，產率：67.9%)。

MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d ₆)：δ 7.85-7.62(m，1H)，6.88(br，1H)，5.87-5.48(m，2H)，5.47-5.33(m，1H)，5.31-5.06(m，1H)，4.25-3.91(m，2H)，3.25(br，1H)，2.60-2.32(m，3H)，2.23(t，1H)，2.15-1.95(m，3H)，1.70-1.56(m，2H)，1.41-1.17(m，9H)，1.03(s，1H)，0.95-0.80(m，2H)。

實施例2-7

N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環丁烷-1-甲醯胺7

向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啡啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基環丁烷甲酸7a(2.0mg，17.22μmol，供應商藥石)，1-羥基苯并三唑(2.3mg，17.0μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(3.2mg，16.7μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應10分鐘。撤去冰水浴，常溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物7(2.5mg，產率：83.1%)。

MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d ₆)：δ 8.28(d，1H)，7.75(d，1H)，7.29(s，1H)，6.51(s，1H)，6.12(s，1H)，5.59-5.51(m，1H)，5.41(s，2H)，5.20-5.01(m，2H)，3.27-3.17(m，1H)，3.15-3.05(m，1H)，2.71-2.63(m，1H)，2.37(s，3H)，2.12-2.05(m，1H)，2.03-1.94(m，2H)，1.92-1.78(m，4H)，1.50-1.42(m，1H)，0.90-0.83(m，4H)。

實施例2-8

1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8

第一步：1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸苄酯8c

將1-羥基環丙烷-1-羧酸苄酯8a(104mg，0.54mmol；採用專利申請“US2005/20645”公開的方法製備而得)和2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲基乙酸酯8b(100mg，0.27mmol；採用專利申請“CN105829346A”公開的方法製備而得)加入反應瓶，加入5mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(61mg，0.54mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌10分鐘，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於3mL 1,4-二噁烷中，加入0.6mL水，加入碳酸氫鈉(27mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(70mg，0.27mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物8c(100mg，產率：73.6%)。

MS m/z(ESI)：501.0[M+1]。

第二步：1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸8d

將8c(50mg，0.10mmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(25mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到標題產物8d(41mg，產率：100%)。

MS m/z(ESI)：411.0[M+1]。

第三步：(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯8e

將1b(7mg，0.013mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入8d(7mg，0.017mmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(7mg，0.026mmol)，冰浴攪拌反應35分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物8e(8.5mg，產率78.0%)。

MS m/z(ESI)：828.0[M+1]。

第四步：1-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8f

將8e(4mg，4.84μmol)溶於0.2mL二氯甲烷中，加入0.1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物8f(2.9mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。

MS m/z(ESI)：606.0[M+1]。

第五步：1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8

將粗品8f(2.9mg，4.84μmol)溶於0.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入(S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-二側氧-1H-吡咯-1-基)已醯胺基)乙醯胺基)乙醯胺基)-3-苯基丙酸8g(2.7mg，5.80μmol，採用專利申請“EP2907824”公開的方法製備而得)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2.7mg，9.67μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌15分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH₄OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮得到標題產物8(2mg，產率：39.0%)。

MS m/z(ESI)：1060.0[M+1]。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d ₆)：δ 9.01(d，1H)，8.77(t，1H)，8.21(t，1H)，8.08-7.92(m，2H)，7.73(d，1H)，7.28(s，1H)，7.24-7.07(m，4H)，6.98(s，1H)，6.50(s，1H)，5.61(q，1H)，5.40(s，2H)，5.32(t，1H)，5.12(q，2H)，4.62(t，1H)，4.52(t， 1H)，4.40-4.32(m，1H)，3.73-3.47(m，8H)，3.16-3.04(m，2H)，2.89(dd，1H)，2.69-2.55(m，2H)，2.37-2.23(m，4H)，2.12-1.93(m，4H)，1.90-1.74(m，2H)，1.52-1.38(m，4H)，1.33-1.11(m，5H)，0.91-0.81(m，4H)。

實施例2-9

N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-A

N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-B

第一步：2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯9a

將2a(1.3g，11.2mmol；採用專利申請“WO2013/106717”公開的方法製備而得)溶於50mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(6.18g，44.8mmol)，溴化苄(1.33mL，11.2mmol)和四丁基碘化銨(413mg，1.1mmol)。將反應液室溫攪拌48小時，藉由矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物9a(2g，產率：86.9%)。

第二步：10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯9b

將9a(120.9mg，0.586mmol)和8b(180mg，0.489mmol)加入反應瓶，加入4mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(109mg，0.98mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌40分鐘，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於4mL二噁烷中，加入2mL水，加入碳酸氫鈉(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯 (126mg，0.49mmol)，室溫攪拌2小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物9b(48mg，產率：19%)。

MS m/z(ESI)：515.0[M+1]。

第三步：10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸9c

將9b(20mg，0.038mmol)溶於4.5mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(12mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物9c(13mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。

MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。

第四步：(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-環丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯9d

將1b(10mg，18.8μmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品9c(13mg，30.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(16.9mg，61.2μmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物9d(19mg，產率：73.6%)。

MS m/z(ESI)：842.1[M+1]。

第五步：2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺9e

將9d(19mg，22.6μmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入1mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。往殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，保留固體。將固體殘餘物減壓濃縮，油泵乾燥得到粗品標題產物9e(17mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。

MS m/z(ESI)：638.0[M+18]。

第六步：N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-A

將粗品9e(13.9mg，22.4μmol)溶於0.6mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(21.2mg，44.8μmol)的0.3mL N, N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(18.5mg，67.3μmol)，冰浴攪拌反應10分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物9。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH₄OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(9-A：2.4mg，9-B：1.7mg)。

MS m/z(ESI)：1074.4[M+1]。

單一構型化合物9-A(較短保留時間)：

UPLC分析：保留時間1.14分鐘，純度：85%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d ₆)：δ 8.60(t，1H)，8.51-8.49(d，1H)，8.32-8.24(m，1H)，8.13-8.02(m，2H)，8.02-7.96(m，1H)，7.82-7.75(m，1H)，7.31(s，1H)，7.26-7.15(m，4H)，6.99(s，1H)，6.55-6.48(m，1H)，5.65-5.54(m，1H)，5.41(s，2H)，5.35-5.15(m，3H)，4.74-4.62(m，1H)，4.54-4.40(m，2H)，3.76-3.64(m，4H)，3.62-3.48(m，2H)，3.20-3.07(m，2H)，3.04-2.94(m，1H)，2.80-2.62(m，1H)，2.45-2.30(m，3H)，2.25-2.15(m，2H)，2.15-2.04(m，2H)，1.93-1.78(m，2H)，1.52-1.39(m，3H)，1.34-1.12(m，5H)，0.87(t，3H)，0.64-0.38(m，4H)。

單一構型化合物9-B(較長保留時間)：

UPLC分析：保留時間1.16分鐘，純度：89%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH₄OAc)，B-乙腈)。

¹H NMR(400MHz，DMSO-d ₆)：δ 8.68-8.60(m，1H)，8.58-8.50(m，1H)，8.32-8.24(m，1H)，8.13-8.02(m，2H)，8.02-7.94(m，1H)，7.82-7.75(m，1H)，7.31(s，1H)，7.26- 7.13(m，3H)，6.99(s，1H)，6.55-6.48(m，1H)，5.60-5.50(m，1H)，5.41(s，2H)，5.35-5.15(m，2H)，4.78-4.68(m，1H)，4.60-4.40(m，2H)，3.76-3.58(m，4H)，3.58-3.48(m，1H)，3.20-3.10(m，2H)，3.08-2.97(m，2H)，2.80-2.72(m，2H)，2.45-2.30(m，3H)，2.25-2.13(m，2H)，2.13-2.04(m，2H)，2.03-1.94(m，2H)，1.91-1.78(m，2H)，1.52-1.39(m，3H)，1.34-1.12(m，4H)，0.91-0.79(m，3H)，0.53-0.34(m，4H)。

三、ADC的製備

ADC藥物載量分析

實驗目的及原理

採用紫外分光光度法(UV-Vis)測定ADC載量。儀器：Thermo nanodrop2000紫外分光光度計。其原理是在某波長下ADC的總吸光值等於藥物與單株抗體在該波長下吸光值的加和。

實驗方法

將裝有琥珀酸鈉緩衝液的比色皿分別置於參比吸收池和樣品測定吸收池中後，扣除溶劑空白後，再將裝有供試品溶液的比色皿置於樣品測定吸收池中，測定280nm和370nm處吸光度。

結果計算：

A_280nm=ε_mab-280bC_mab+ε_Drug-280bC_Drug 式(1)

ε_Drug-280：藥物在280nm平均摩爾消光係數5100；

C_Drug：藥物的濃度；

ε_mab-280：單抗在280nm平均摩爾消光係數214600；

C_mab：單抗的濃度；

b：光程長度為1cm。

同理可以得到樣品在370nm下的總吸光值方程：

A_370nm=ε_mab-370bC_mab+ε_Drug-370bC_Drug 式(2)

ε_Drug-370：藥物在370nm平均摩爾消光係數19000；

C_Drug：藥物的濃度；

ε_mab-370：單抗在370nm消光係數為0；

C_mab：單抗的濃度；

b：光程長度為1cm。

由式(1)和式(2)結合單株抗體和藥物在兩個檢測波長下的消光係數和濃度資料可以計算出ADC中藥物的載量。

藥物載量=C_Drug/C_mab。

實施例3 抗體藥物偶聯的製備

(一)不同DAR值的抗體藥物偶聯h1702-DS-107-9-A的製備：

ADC偶聯物h1702-DS-107-9-A的製備過程如下：將人源化的抗體(h1702-DS-107)置於pH 6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液中(抗體濃度10mg/mL)，加入相當於配置好的10mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(Innochem，CAS：51805-45-9，Cat# B45573)，置於37℃恆溫振盪培養箱中，反應3小時。將上述反應液置於冰浴中降溫至25℃。

將化合物9-A溶解於二甲基亞碸中，加入到上述反應液中，置於室溫下的振盪器上，反應3小時後停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到目標抗體藥物偶聯分子。

藉由對抗體和藥物比例、反應量規模、以及其他條件的調整，可以獲得不同DAR值(n)的抗體藥物偶聯物，較佳DAR值為1-8，更佳為3-8，最較佳3-7。

具體製備獲得ADC化合物h1702-DS-107-9-A如下：

實施例3-1 ADC-1(DAR=6.92)

在37℃條件下，向抗體h1702-DS-107的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，10.7mL，723nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，383μL，3830nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物9-A(12.2mg，11358nmol)溶解於600μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物ADC-1的PBS緩衝液(1.33mg/mL，70mL)，於4℃儲存。

UV-Vis計算平均值：n=6.92。

實施例3-2 ADC-2(DAR=4.75)

在37℃條件下，向抗體h1702-DS-107的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.99mL，66.9nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，20.6μL，206nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物9-A(1.07mg，996nmol)溶解於28.5μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物ADC-2的PBS緩衝液(0.57mg/mL，12.9mL)，於4℃儲存。

UV-Vis計算平均值：n=4.75。

實施例3-3 ADC-3(DAR=3.09)

在37℃條件下，向抗體h1702-DS-107的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.99mL，66.9nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，12.0μL，120nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物9-A(0.71mg，661nmol)溶解於18.9μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物ADC-3的PBS緩衝液(0.54mg/mL，13.9mL)，於4℃儲存。

UV-Vis計算平均值：n=3.09。

(二)不同DAR值的參考抗體藥物偶聯h1702-DS-9-A的製備：

實施例3-4 ADC-4(DAR=6.87)

在37℃條件下，向抗體h1702-DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，180mL，12.16μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，6.20mL，62.0μmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物9-A(195.9mg，182.4nmol)溶解於乙腈(3.6mL)和DMSO(1.8mL)的混合溶液中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液先後用50mM pH=6.5 PBS緩衝液(含有4% v/v乙腈和2% v/v DMSO)、10mM pH=5.3琥珀酸緩衝液藉由超濾膜包換液純化，除去小分子，加入蔗糖至60mg/mL、吐溫-20至0.2mg/mL，裝瓶凍乾後得到標題產物ADC-4的凍乾粉樣品(20mg/瓶)，於4℃儲存。

UV-Vis計算平均值：n=6.87。

實施例3-5 ADC-5(DAR=4.80)

在37℃條件下，向抗體h1702-DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.20mL，81.1nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，25.1μL，251nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物9-A(1.30mg，1210nmol)溶解於34.7μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物ADC-5的PBS緩衝液(0.68mg/mL，13.6mL)，於4℃儲存。

UV-Vis計算平均值：n=4.80。

實施例3-6 ADC-6(DAR=2.97)

在37℃條件下，向抗體h1702-DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.20mL，81.1nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，14.6μL，146nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物9-A(0.87mg，931nmol)溶解於23.2μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物ADC-6的PBS緩衝液(0.73mg/mL，12.2mL)，於4℃儲存。

UV-Vis計算平均值：n=2.97。

參照例

本揭露將申請WO2020063676中的全部內容引入本申請。參考引用PCT/CN2019/107873第104頁至105頁，製備ADC-28，ADC-29。

其中ADC-28為FADC-26通式的示例性產物，結構如下：

UV-Vis計算平均值：n=7.46。

ADC-29為FADC-25通式的示例性產物，結構如下：

UV-Vis計算平均值：n=7.24。

所述的h1702-DS具有SEQ ID NO：1所示的重鏈和SEQ ID NO：2所示的輕鏈。

所述化合物20((參考引用PCT/CN2019/107873第88頁實施例20製備)具有如下式所示的結構。

生物學評價

體外活性生物學評價

測試例1. h1702-DS突變體的表達以及對B7H3結合活性的檢測

為了消除h1702-DS潛在的T細胞表位，對h1702-DS進行了一系列突變體的設計、表達以及純化，並用FACS的方法檢測純化後的突變體對CT26-B7H3細胞株的結合。

結果顯示，本揭露的突變體h1702-DS-107與CT26-B7H3細胞株存在明顯結合信號。隨後對該突變體進行梯度稀釋後，進一步檢測其與CT26-B7H3細胞株結合的EC₅₀。如表3所示。

為了進一步驗證突變體與腫瘤細胞株表面的B7H3以及猴B7H3的結合，進一步檢測了突變體與A498細胞株以及CHOK1-cynoB7H3的結合。

結果如表4顯示，這些突變體均可與A498細胞株以及CHOK1-cynoB7H3的結合。

測試例2：ADC的體外細胞增殖實驗

測試例2-1：ADC對腫瘤細胞株增殖抑制實驗

本實驗藉由檢測細胞內ATP含量，根據IC₅₀大小評價本揭露ADC對細胞增殖的抑制效果。

待測腫瘤細胞包括：Calu-6細胞(ATCC，Catalog # ATCC® HTB-56^TM)，Detroit562細胞(ATCC，Catalog #ATCC® CCL-138^TM)，和CHO-K1(ATCC，Catalog #ATCC® CCL-61^TM)。

將待測ADC樣品用PBS或DMSO以3倍倍比依次稀釋成9個濃度(樣品的起始濃度均為500nM)。將樣品加入培養板中，將培養板在培養箱孵育6天(37℃，5% CO₂)。用CellTiter-Glo試劑(Promega，G7571)進行檢測，在Victor3中讀取化學發光信號值，資料使用GraphPad軟體處理。測得的IC₅₀值見表5。

結果顯示，h1702-DS-107和h1702-DS抗體對應的ADC，在DAR值接近的情況下，對各腫瘤細胞的增殖抑制效果接近，且抑制效果與DAR值正相關，DAR值越大，抑制效果越明顯。

測試例2-2：ADC對腫瘤細胞株的增殖抑制療效與B7H3的表達水準呈正相關

為了進一步驗證本揭露中ADC對細胞的增殖抑制效果是否與B7H3的表達水準呈正相關性，分別在Detriot562腫瘤細胞株(Wildtype Detriot562)上進行了B7H3過表達和B7H3的敲除(得到Detriot562^B7H3-/-細胞株)。對於B7H3過表達的Detroit562細胞株，根據B7H3表達水準的高低，分別得到B7H3中表達細胞株(Detriot562^B7H3中)和B7H3高過表達細胞株(Detriot562^B7H3高)，如圖1所示(FACS鑒定所用抗體來自sino biology，貨號：11188-MM06-A)。

細胞增殖抑制試驗的方法如測試例2-1中描述，結果如表6顯示，抗體h1702-DS-107所對應的ADC-1與h1702-DS對應的ADC-4，對各Detroit562 細胞株的增殖抑制療效相近，且兩個ADC對Detroit562的增殖抑制療效與B7H3的表達水準呈現明顯的正相關性，B7H3表達水準越高，增殖抑制效果越明顯。

體內活性生物學評價

測試例3：ADC對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效評價

1.測試方法：

實驗用BALB/c-nude裸小鼠，雌性，6-7周，皮下接種人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562細胞。接種細胞後第十天，將動物隨機分組(D0)，每組8只，開始腹腔注射給藥1次/周，共給藥3次，1mpk以及3mpk兩個劑量，或者10mpk單次給藥，觀察至D28，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄資料。腫瘤體積(V)計算公式為：

V=1/2×a×b2

其中a、b分別表示長、寬。

相對體積(RTV)=VT/V0

抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)

其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的對照組(空白)及實驗組的相對腫瘤體積。

2.測試對象：

ADC-1；

ADC-4；

對照組(PBS)。

3.抗體ADC的抑瘤效果如表7和圖2所示：

受試ADC抑瘤率分別是：ADC-1 1mg/kg(1mpk)的抑瘤率達到50.68%；ADC-1 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到78.21%(P<0.05)；ADC-1 10mg/kg(10mpk)單次給藥的抑瘤率達到59.7%(P<0.05)；ADC-4 1mg/kg(1mpk)的抑瘤率達到55.91%；ADC-4 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到72.47%(P<0.05)；ADC-4 10mg/kg(10mpk)單次給藥的抑瘤率達到86.37%(P<0.001)。

給藥過程中各組動物體重正常，提示ADC無明顯毒副作用。

測試例4：SD大鼠T1/2評價

SD大鼠4只，雌雄各半，12/12小時光/暗調節，溫度24±3℃恆溫，濕度50-60%，自由進食飲水。購自傑思捷實驗動物有限公司。實驗當天對SD大鼠分別尾靜脈注射受試藥物ADC，給藥劑量為3mg/kg，注射體積5mL/kg。

取血時間點為：第1天給藥後5分鐘、8小時、1天、2天、4天、7天、10天、14天、21天、28天，於大鼠眼底靜脈取血，每次300μL；收集的血樣在室溫下置放半小時至凝集，然後4℃下1000×g離心15分鐘。收集上清液，立即放置-80℃貯存。

用ELISA檢測血清中的B7H3抗體和ADC濃度，分別檢測完整ADC(intact ADC)和總抗體(Total antibody，與ADC偶聯的抗體和血清中游離的抗體)的PK，檢測方法分別為包被抗毒素抗體，或包被B7H3抗原，檢測血清中B7H3抗體(Anti-Human IgG(HRP)mouse preadsorbed，abcam，ab97175)。

結果如表8所示，表明ADC-1和ADC-4在總抗體以及整ADC的半衰期非常接近。

參照測試例：ADC對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效評價(WO2020063673，測試例8)

一、試驗目的

本實驗以BALB/c-nude裸小鼠為受試動物，評價ADC化合物對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效。

二、受試藥物及材料

1、受試藥物

ADC-29(3mg/kg)；

ADC-28(3mg/kg)；

陰性對照ADC(3mg/kg)：非B7H3靶點抗體與化合物20偶聯形成的配體毒素偶聯物。

2、配製方法：均用PBS稀釋配製。

3、試驗動物

BALB/c-nude裸小鼠：購自常州卡文斯實驗動物有限責任公司。

三、試驗方法

實驗用BALB/c-nude裸小鼠，雌性，6-7周，皮下接種人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562細胞(ATCC，Catalog #ATCC® CCL-138^TM)。接種細胞後第十天，將動物隨機分組(D0)，每組8只，開始腹腔注射給藥1次/周，共給藥3次，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄資料。腫瘤體積(V)計算公式為：

V=1/2×a×b²

其中a、b分別表示長、寬。

相對體積(RTV)=V_T/V₀

抑瘤率(%)=(C_RTV-T_RTV)/C_RTV(%)

其中V₀、V_T分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。C_RTV、T_RTV分別為實驗結束時的對照組(陰性對照)及實驗組的相對腫瘤體積。

四、試驗結果

腹腔注射給藥每週1次，共給藥3次，觀察至第28天時，受試ADC抑瘤率分別是：ADC-29 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到72.27%(P<0.001)；ADC-28 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到56.2%(P<0.001)。ADC-29均顯示出比ADC-28更強的抗腫瘤療效。

給藥過程中各組動物體重正常，提示ADC無明顯毒副作用。檢測結果如表9所示。所檢測抗體能夠有效抑制荷瘤裸鼠中Detroit 562移植瘤的生長，並且呈現出劑量依賴性。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.) 上海恆瑞醫藥有限公司(SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)

<120> B7H3抗體-依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途

<130> 721023CPCT

<150> CN202010218100.7

<151> 2020-03-25

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS重鏈序列

<400> 1

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS輕鏈序列

<400> 2

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-79 HV

<400> 3

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-79 LV

<400> 4

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-84 HV

<400> 5

<210> 6

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-84 LV

<400> 6

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-105 HV

<400> 7

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-105 LV

<400> 8

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-106 HV

<400> 9

<210> 10

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-106 LV

<400> 10

<210> 11

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-107 HV

<400> 11

<210> 12

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-107 LV

<400> 12

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-108 HV

<400> 13

<210> 14

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> h1702-DS-108 LV

<400> 14

<210> 15

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> 重鏈恆定區

<400> 15

<210> 16

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> 輕鏈恆定區

<400> 16

<210> 17

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS-105 HC

<400> 17

<210> 18

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS-105 LC

<400> 18

<210> 19

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS-106 HC

<400> 19

<210> 20

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS-106 LC

<400> 20

<210> 21

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS-107 HC

<400> 21

<210> 22

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS-107 LC

<400> 22

<210> 23

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS-108 HC

<400> 23

<210> 24

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> h1702-DS-108 LC

<400> 24

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR1

<400> 25

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR2

<400> 26

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR3

<400> 27

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1

<400> 28

<210> 29

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR2

<400> 29

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR3

<400> 30

<210> 31

<211> 534

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 534

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 32

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(4)

<223> 四肽接頭

<400> 33

Claims

一種抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗體-藥物偶聯物是通式(Pc-L-Y-D)所示：

其中，

Y選自-O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-、-O-CR¹R²-(CR^aR^b)_m-、-O-CR¹R²-、-NH-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-和-S-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-；

R^a和R^b相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基和雜環基；或者，R^a和R^b與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；

R¹選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；R²選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；或者，R¹和R²與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；

或者，R^a和R²與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；

m為0至4的整數；

n為1至10，n是小數或整數；

L為接頭單元；

Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含：

重鏈可變區，其為SEQ ID NO：1中的重鏈可變區的變體，所述的變體包含一個或多個選自T16R、I28T、A33D、S99E、A100G、R101K、Y103F、A104G、A104S和A113T的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含一個或多個選自T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代；和

輕鏈可變區，其為SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區或其變體，所述的變體包含一個或兩個選自R56K和S57G的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含S57G的胺基酸取代。
如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含選自以下任一組的胺基酸取代：

a、T16R、Y103F和A113T；

b、T16R、I28T、Y103F和A113T；

c、T16R和A113T；和

d、T16R、I28T和A113T。
如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含：

e、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區；

f、重鏈可變區，其包含T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區；

g、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

h、重鏈可變區，其包含T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

i、重鏈可變區，其包含T16R和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

j、重鏈可變區，其包含T16R、I28T和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代。
如請求項1至3中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段選自以下任一組：

如SEQ ID NO：3所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：4所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：5所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：6所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：10所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：12所示的輕鏈可變區；和

如SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。
如請求項1至4中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區；

所述重鏈恆定區來源於人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，

較佳地，所述重鏈恆定區源於人IgG1，更較佳如SEQ ID NO：15所示的重鏈恆定區；

較佳地，所述輕鏈恆定區來源於人抗體κ、λ鏈；較佳如SEQ ID NO：16所示的輕鏈恆定區。
如請求項1至5中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗B7H3抗體選自以下任一組：

如SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：18所示的輕鏈；

如SEQ ID NO：19所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈；

如SEQ ID NO：21所示的重鏈和SEQ ID NO：22所示的輕鏈；和

如SEQ ID NO：23所示的重鏈和SEQ ID NO：24所示的輕鏈。
如請求項1至6中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')₂、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)和二硫鍵穩定化的V區(dsFv)。
如請求項1至7中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中n為1至8，較佳為3至7，n是小數或整數。
如請求項1至8中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，

其中，

Y為-O-(CR^aR^b)_m-CR¹R²-C(O)-；

R^a和R^b相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素和C_1-6烷基；

R¹為鹵C_1-6烷基或C_3-6環烷基；

R²選自氫原子、鹵C_1-6烷基和C_3-6環烷基；

或者，R¹和R²與其相連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基；

m為0或1。
如請求項1至9中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中通式(Pc-L-Y-D)中，Y選自：

其中Y的O端與接頭單元L相連。
如請求項1至10中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中通式(Pc-L-Y-D)中，接頭單元-L-為-L¹-L²-L³-L⁴-，

L¹選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)-和-C(O)-W-C(O)-，其中W選自C_1-8烷基、C_1-8烷基-環烷基、和1至8個原子的直鏈雜烷基，所述雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中所述的C_1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；

L²選自-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-、-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-、-S(CH₂)p¹C(O)-和化學鍵，其中p¹為1至20的整數；

L³為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中所述的胺基酸殘基選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸和天冬胺酸中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；

L⁴選自-NR⁵(CR⁶R⁷)_t-、-C(O)NR⁵、-C(O)NR⁵(CH₂)_t-和化學鍵，其中t為1至6的整數；

R³、R⁴和R⁵相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；

R⁶和R⁷相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。
如請求項1至11中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中通式(Pc-L-Y-D)中，接頭單元-L-為-L¹-L²-L³-L⁴-，

L¹為
，s¹為2至8的整數；

L²為化學鍵；

L³為四肽殘基；較佳地，L³為SEQ ID NO：33所示的四肽殘基；

L⁴為-NR⁵(CR⁶R⁷)t-，其中R⁵、R⁶或R⁷相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2；

其中所述的L¹端與Pc相連，L⁴端與Y相連。
如請求項1至12中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述-L-為：
如請求項1至13中任一項所述的通式抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中所述--L-Y-是選自以下的任一個所示：
如請求項1至10中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為通式(Pc-L_a-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：

其中，

Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含：

重鏈可變區，其為SEQ ID NO：1中的重鏈可變區的變體，所述的變體包含一個或多個選自T16R、Y103F、I28T、A33D、S99E、A100G、A104G、R101K、A104S和A113T的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含一個或多個選自T16R、Y103F、I28T和A113T的胺基酸取代；和

輕鏈可變區，其為SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區或其變體，所述的變體包含一個或兩個選自R56K和S57G的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含S57G的胺基酸取代；

m為0至4的整數；

n為1至10，n是小數或整數；

R¹選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；R²選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；或者，R¹和R²與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；

W選自C_1-8烷基、C_1-8烷基-環烷基和1至8個原子的直鏈雜烷基，所述雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中所述的C_1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；

L²選自-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂CH₂C(O)-、-NR⁴(CH₂CH₂O)p¹CH₂C(O)-、-S(CH₂)p¹C(O)-和化學鍵，其中p¹為1至20的整數；

L³為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中所述的胺基酸殘基選自苯丙胺酸(F)、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸和天冬胺酸中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；

R⁵選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；

R⁶和R⁷相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。
如請求項1至12、15中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為通式(Pc-L_b-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：

其中，

s¹為2至8的整數；

Pc、R¹、R²、R⁵至R⁷、m和n如請求項15中所定義。
如請求項1至16中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，所述抗體-藥物偶聯物是選自以下的任一個所示：

其中Pc和n如請求項1中所定義。
如請求項1至17中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，所述抗體-藥物偶聯物為：

其中，

n為1至8，較佳3至7，n是小數或整數；

h1702-DS-107為抗B7H3抗體，其包含如SEQ ID NO：21所示的重鏈和如SEQ ID NO：22所示的輕鏈。
一種抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其包含：

重鏈可變區，其為SEQ ID NO：1中的重鏈可變區的變體，所述的變體包含一個或多個選自T16R、I28T、A33D、S99E、A100G、R101K、Y103F、A104G、A104S和A113T的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含一個或多個選自T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代；和

輕鏈可變區，其為SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區或其變體，所述的變體包含一個或兩個選自R56K和S57G的胺基酸取代；較佳地，所述的變體包含S57G的胺基酸取代。
如請求項19所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段重鏈可變區包含選自以下任一組的胺基酸取代：

a、T16R、Y103F和A113T；

b、T16R、I28T、Y103F和A113T；

c、T16R和A113T；和

d、T16R、I28T和A113T。
如請求項19或20所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含：

e、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區；

f、重鏈可變區，其包含T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

SEQ ID NO：2中的輕鏈可變區；

g、重鏈可變區，其包含T16R、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

h、重鏈可變區，其包含T16R、I28T、Y103F和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

i、重鏈可變區，其包含T16R和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代；

j、重鏈可變區，其包含T16R、I28T和A113T的胺基酸取代，和

輕鏈可變區，其包含S57G的胺基酸取代。
如請求項19至21中任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段選自以下任一組：

如SEQ ID NO：3所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：4所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：5所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：6所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：10所示的輕鏈可變區；

如SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：12所示的輕鏈可變區；和

如SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。
如請求項19至22中任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區；

所述重鏈恆定區來源於人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，

較佳地，所述重鏈恆定區源於人IgG1，更較佳如SEQ ID NO：15所示的重鏈恆定區；

所述輕鏈恆定區來源於人抗體κ、λ鏈；較佳如SEQ ID NO：16所示的輕鏈恆定區。
如請求項19至23中任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7H3抗體選自以下任一組：

如SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：18所示的輕鏈；

如SEQ ID NO：19所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈；

如SEQ ID NO：21所示的重鏈和SEQ ID NO：22所示的輕鏈；和

如SEQ ID NO：23所示的重鏈和SEQ ID NO：24所示的輕鏈。
一種核酸分子，其編碼請求項19至24中任一项所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段。
一種宿主細胞，其包含如請求項25所述的核酸分子。
一種製備如通式(Pc-L_a-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽的方法，其包括以下步骤：

Pc’與通式(L_a-Y-D)所示的化合物進行偶聯反應，得到通式(Pc-L_a-Y-D)所示的化合物；

其中，

Pc’為經還原後的Pc，

Rc、n、m、W、L²、L³、R¹、R²、R⁵、R⁶和R⁷如請求項15中所定義。
一種藥物組合物，其包含：

根據請求項1至18中任一项所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或根據請求項19至24中任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段，以及

一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
如請求項1至18中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、根據請求項19至24中任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段、或根據請求項28所述的藥物組合物在製備用於治療B7H3介導的疾病或病症的藥物中的用途。
如請求項1至18中任一项所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、根據請求項19至24中任一項所述的抗B7H3抗體或其抗原結合片段、或根据請求項28所述的藥物組合物在製備治疗和/或預防腫瘤和癌症的藥物中的用途，其中，

較佳地，所述腫瘤和癌症選自：頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系统癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宫內膜癌、子宫頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、庫肯勃氏瘤、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克爾細胞癌；

更較佳的，所述淋巴瘤選自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤；

更選佳地，所述肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌；

更選佳地，所述白血病選自：慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病和髓樣細胞白血病。