TW202400248A - 抗b7h3抗體-藥物結合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了與B7H3特異性結合之抗體-藥物結合物及包含其之醫藥組合物。本發明亦提供了使用本發明之抗體-藥物結合物之方法及用途。

Description

抗B7H3抗體-藥物結合物及其用途
本發明提供了與B7H3特異性結合之抗體-藥物結合物及包含其之組合物。亦提供了使用本發明之抗體-藥物結合物之方法及用途。
B7H3，亦稱為CD276、B7RP-2及B7-H3，係B7家族成員，與其他B7家族成員有20%至27%之胺基酸序列同源性。雖然B7H3轉錄物廣泛表現，但在正常組織及免疫細胞上之表現有限且維持在低水準，並且在多種人類惡性腫瘤中過度表現，包括黑色素瘤、乳癌、前列腺癌等。據報導，B7-H3在細胞膜、細胞質中表現，或者在癌細胞核內，亦在腫瘤相關血管系統上表現。B7H3在T細胞及NK細胞上沒有組成性表現，但在部分APC (諸如DC)上有組成性低表現，且GM-CSF、IFNγ等可誘導其在APC上表現。
B7-H3係一個很有希望之抗癌靶標。儘管B7-H3之確切功能尚不清楚，但其不同的免疫功能已被證明，包括刺激、抑制T細胞增殖及抑制NK細胞功能。認為免疫細胞上存在不同受體，此等受體可能與腫瘤上之B7H3競爭結合。除了其免疫檢查點功能外，據報導，B7H3之高表現量與癌症預後較差相關，並增強細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成、轉移能力及抗癌耐藥性。
與其他B7家族分子一樣，B7H3係一種1型跨膜糖蛋白，其胞外域包含IgV-IgC結構域。與小鼠B7H3基因只有一個IgV-IgC結構域不同，人類B7H3有兩個亞型，一個亞型包含一個IgV-IgC結構域拷貝(命名為2IgB7H3)，另一個亞型包含兩個IgV-IgC結構域(命名為4IgB7H3)，其係基因複製及差異剪接之結果。4IgB7H3而非2IgB7H3係免疫細胞及惡性細胞上表現之主要亞型，表明4IgB7H3可能在腫瘤發展及腫瘤免疫中發揮獨特的重要作用。
由於B7H3在許多腫瘤細胞上過度表現，目前正在開發針對B7H3之治療分子來治療相關適應症。然而，新型抗B7H3抗體，或抗體-藥物結合物之開發仍有改良空間及臨床需求。
本申請提供了一種抗B7H3之抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其可以具有選自以下群之一或多種效果：(1)具有對腫瘤細胞之活體外增殖之抑制活性；(2)與人B7H3親和力更好；(3)具有血漿穩定性；(4)具有活體內抑瘤效果；(5)具有旁觀殺傷效應(Bystander Effect)；(6)具有抗轉運體轉運能力；(7)具有活體內腫瘤靶向能力；及(8)具有良好的活體內安全性。
在一個態樣中，本申請提供一種抗體-藥物結合物，其包含：靶向B7H3之抗體或其抗原結合片段，連接子單元及細胞毒性藥物；該靶向B7H3之抗體或其抗原結合片段包含：胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示之HCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示之HCDR2、胺基酸序列如SEQ ID NO:3所示之HCDR3、胺基酸序列如SEQ ID NO:4或7所示之LCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:5所示之LCDR2及胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示之LCDR3。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (I) 胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示之重鏈可變區及胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示之輕鏈可變區；或胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示之重鏈可變區及胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示之輕鏈可變區；或 (II)與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之重鏈可變區，及與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈可變區；或與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之重鏈可變區，及與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈可變區；或 (III) 與SEQ ID NO:8或10相比，其構架區具有一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸之添加、缺失及/或取代之重鏈可變區，及與SEQ ID NO:9或11相比，其構架區具有一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸之添加、缺失及/或取代之輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體選自：人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、單株抗體及多株抗體。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，本發明之抗體-藥物結合物中之抗體為單株抗體。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體為全長抗體或抗體之抗原結合片段，該抗原結合片段例如選自：Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、ScFv、Fab'-SH、sdAb、VHH、雙抗體及線性抗體。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體包含免疫球蛋白恆定區，該免疫球蛋白恆定區係人IgG恆定區，例如人IgG1恆定區。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體為IgG1形式之抗體、IgG2形式之抗體、IgG3形式之抗體或IgG4形式之抗體。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (I) 胺基酸序列如SEQ ID NO:12所示之重鏈及胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示之輕鏈；或胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示之重鏈及胺基酸序列如SEQ ID NO:15所示之輕鏈；或 (II) 與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之重鏈，及與SEQ ID NO:13具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈；或與SEQ ID NO:14具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之重鏈，及與SEQ ID NO:15具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈。
在一些實施例中，本發明所述之抗體為抗B7H3抗體WBP301088。
在本發明之某些較佳實施例中，本發明之抗體-藥物結合物中之如式(A-1)、(A-2) 、(A-1a)及(A-1b)所示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽中之某些基團如下定義，未提及之基團同本申請任一方案所述(簡稱「在一些實施例中」)。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物包含或選自以下結構：式(A-1)所示之結構、其互變異構物、鏡像異構物、非鏡像異構物、或異構物之混合物，或其醫藥學上可用之鹽或其溶劑合物， 其中， M為-L 2-L 1-C(O)-； L 2為-O-或-S-； L 1為-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-、C 3-C 6飽和環烷基或3員至6員飽和雜環基，該C 3-C 6飽和環烷基及3員至6員飽和雜環基各自獨立地視情況經一或多個R 2a取代； m選自1、2、3或4；該3員至6員飽和雜環基中之雜原子選自N、O及S，雜原子數為1至3個； R 1a各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、胺基及C 1-C 6烷基，該C 1-C 6烷基視情況經一或多個R取代； R 1b及R 2a各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、胺基及C 1-C 6烷基，該C 1-C 6烷基視情況經一或多個R取代； R各自獨立地為氫或鹵素。 在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該L 1為-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-；R 1a選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基；R 1b選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基。在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中L 1為-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-；R 1a為氫或-CH 3；R 1b選自：氫及-CH 3；例如R 1a為-CH 3；R 1b選自：氫及-CH 3。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中L 1為-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-；m為1或2。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中L 1選自： 。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中L 1為C 3-C 6飽和環烷基或3員至6員飽和雜環基，該C 3-C 6飽和環烷基及3員至6員飽和雜環基各自獨立地視情況經一或多個R 2a取代，R 2a各自獨立地選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中L 1為視情況經一或多個R 2a取代之C 3-C 6飽和環烷基；R 2a各自獨立地選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基。在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中L 1為C 3-C 6飽和環烷基。 在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中L 1為視情況經1、2或3個R 2a取代之： ；R 2a各自獨立地選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中L 1選自 。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該-M-選自： 。
在一些實施例中，本發明提供了抗B7H3抗體藥物結合物、其異構物、其醫藥學上可接受之鹽或其混合物，其中該-M-為： 。
在一些實施例中，本發明提供了抗B7H3抗體藥物結合物，其中細胞毒性藥物 選自以下任一結構： 。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該連接子單元L為-L a-L b-L c-，且 -L a-為 ； -L b-選自： ；較佳為 ； -L c-為 。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該連接子單元L，其L a端與Ab相連，L c端與連接子單元M相連。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該連接子單元L為 。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該連接子單元L為 。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物結構如式(A-2)所示： 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數； Ab、M、L同本申請任一方案所描述。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物結構如式(A-2)所示： 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數； Ab為靶向B7H3之抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示之HCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示之HCDR2、胺基酸序列如SEQ ID NO:3所示之HCDR3、胺基酸序列如SEQ ID NO: 4所示之LCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:5所示之LCDR2及胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示之LCDR3； M為-L 2-L 1-C(O)-； L 2為-O-或-S-；較佳為-O-； L 1為-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-； m選自1、2、3或4；較佳為1或2； R 1a或R 1b各自獨立可以為氫、鹵素或視情況經1、2或3個R取代之C 1-C 6烷基； R各自獨立地可以為氫或鹵素； L為 。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中p為2至8之整數或小數；例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物結構如式(A-2a)或式(A-2b)所示： ， 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數，較佳2至8之整數或小數，例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數； Ab為靶向B7H3之抗體或其抗原結合片段，其包含：胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示之HCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示之HCDR2、胺基酸序列如SEQ ID NO:3所示之HCDR3、胺基酸序列如SEQ ID NO: 4所示之LCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:5所示之LCDR2及胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示之LCDR3； L 2為-O-或-S-；較佳為-O-； X 1選自視情況經1、2或3個R 2a取代之C 3-C 6飽和環烷基； X 2選自-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-； m選自1、2、3或4；較佳為1或2； R 1a、R 1b或R 2a各自獨立可以為氫、鹵素或視情況經1、2或3個R取代之C 1-C 6烷基； R各自獨立地可以為氫或鹵素。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物選自以下結構式： 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數，較佳2至8之整數或小數，例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數；Ab同本申請任一方案所描述。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該抗體-藥物結合物選自： 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數，較佳2至8之整數或小數，例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數，例如p為7.45、5.68或4.02；WBP301088為抗B7H3抗體，其包含如SEQ ID NO:12所示之重鏈及如SEQ ID NO:13所示之輕鏈。
在一些實施例中，本發明提供了抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該抗體-藥物結合物選自： 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數，較佳2至8之整數或小數，例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數，例如p為7.45、5.68或4.02； WBP301088為抗B7H3抗體，其重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:12所示，及輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示。在一些實施例中，本發明之抗體-藥物結合物中之平均連接數p可以為2至8之整數或小數。例如，該平均連接數p可以為3至8之整數或小數。例如，該平均連接數p可以為1至2、2至3、3至4、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10之整數或小數。
在又另一態樣中，本發明提供了一種醫藥組合物，其包含如本文所述之抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
在又另一態樣中，本發明提供了如本文所述之抗體-藥物結合物、其醫藥學上可接受之鹽或如本文所述之醫藥組合物在製備用於治療及/或預防B7H3介導之疾病或病症之藥物中之用途，較佳地，該疾病或病症為癌症。較佳地，該疾病或病症為B7H3陽性表現之疾病或病症。
在又另一態樣中，本發明提供了一種治療及/或預防B7H3介導之疾病或病症之方法，其包括向有需要之個體投與如本文所述之抗體-藥物結合物、其醫藥學上可接受之鹽或如本文所述之醫藥組合物，較佳地，該疾病或病症為癌症。較佳地，該疾病或病症為B7H3陽性表現之疾病或病症。
在又另一態樣中，本發明提供了如本文所述之抗體-藥物結合物、其異構物、其醫藥學上可接受之鹽或醫藥組合物，其用於治療及/或預防B7H3介導之疾病或病症，較佳地，該疾病或病症為癌症。較佳地，該疾病或病症為B7H3陽性表現之疾病或病症。
在一些實施例中，本發明所述之癌症選自乳癌、神經腫瘤、黑色素瘤、肺癌、頭頸癌、結直腸癌、胰臟癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膠質母細胞瘤、食管癌、腎細胞癌、子宮內膜癌、皮膚癌、睾丸癌，甲狀腺癌、尿路上皮癌、淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)、慢性淋巴細胞白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤及多發性骨髓瘤。
在又另一態樣中，本發明提供了一種藥物組合，其包含如本文所述之抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽或本文所述之醫藥組合物，以及一或多種另外之治療劑。
在又另一態樣中，本發明提供了一種套組，其包含如本文所述之抗體-藥物結合物、或本文所述之醫藥組合物。
以下由特定的具體實施例說明本發明之實施例，熟習此項技術者可由本說明書所揭示之內容容易地瞭解本申請發明之其他優點及效果。 術語定義
除非另有說明，本發明之實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，其均在此項技術之技術範圍內。
為了可以更容易地理解本發明，某些科技術語具體定義如下。除非本文其他部分另有明確定義，否則本文所用之科技術語均具有一般熟習本發明所屬技術者通常理解之含義。關於本領域之定義及術語，熟習此項技術者具體可參考Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel F.等人編著，John Wiley & Sons, New York, 2000)。胺基酸殘基之縮寫係此項技術中所用之指代20個常用L-胺基酸之一的標準三字母及/或單字母代碼。本文(包括申請專利範圍)所用單數形式包括其相應之複數形式，除非文中另有明確規定。
術語「約」通常係指在指定數值以上或以下0.5%至10%之範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%之範圍內變動。
術語「抗體」或「Ab」在本文中以其最廣義使用，包括各種抗體結構，包括多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。天然完整抗體通常係Y形四聚體蛋白質，其包含藉由共價二硫鍵及非共價相互作用結合在一起之兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L)多肽鏈。抗體之輕鏈可分類成κ輕鏈及λ輕鏈。重鏈可分類成μ、δ、γ、α及ε，其分別將抗體之同型定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈中，可變區經由大約12個或更多個胺基酸的「J」區與恆定區連接，並且重鏈亦包含大約3個或更多個胺基酸的「D」區。各重鏈由重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區通常由3個結構域(CH1、CH2及CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)組成。VH及VL區可進一步分成高變區(稱為互補決定區(CDR))，該等區域之間由相對保守之區域(稱為構架區(FR))隔開。每個VH及VL自N端至C端由按下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4之3個CDR及4個FR組成。每個重鏈/輕鏈對之可變區(VH及VL)分別形成抗原結合位點。構架區及CDR之範圍可以使用此項技術已知之方法來精確鑑定，例如藉由Kabat定義、Dr. Martin網站之定義、Chothia定義、AbM定義、EU定義及Contact定義，所有此等方法均係此項技術中所熟知的。參見例如，Kabat, E.A.等人(1991年) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公告號91-3242；Martin A，「Antibody bioinformatics website of Dr. Andrew Martin's lab at UCL」，最後更新於2018年7月31日；Chothia等人(1989年)，Nature，第342卷：第877頁；Chothia, C.等人(1987年)，J. Mol.Biol.，第196卷：第901-917頁；Al-lazikani等人(1997年)，J. Molec.Biol.，第273卷：第927-948頁；Edelman等人，Proc Natl Acad Sci U S A，1969年五月，第63卷第1期：第78-85頁；以及Almagro，J. Mol.Recognit.，第17卷：第132-143頁(2004年)。亦可參見hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs。根據不同定義之編號之間的對應或比對例如可見於http://www.imgt.org/(亦參見Giudicelli V等人，「IMGT, the international ImMunoGeneTics database」，Nucleic Acids Res.，(1997年)第25卷：第206-211頁；Lefranc MP等人，「Unique database numbering system for immunogenetic analysis」，Immunol Today(1997年)，第18卷：第509頁；以及Lefranc MP等人，「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」，Dev Comp Immunol.(2003年)，第27卷：第55-77頁)。抗體可以為不同的抗體同型，例如IgG (例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。
術語「B7H3」，亦稱為CD276抗原，係指一種I型跨膜蛋白，屬於B7家族，具有由單個IgV-IgC結構域組成之胞外結構域。B7家族蛋白含有胞外IgV樣及IgC樣結構域，並具有短胞質尾。B7H3係一種免疫檢查點分子，在多種癌症中異常過表現。B7H3蛋白之胺基酸序列包括全長B7H3蛋白(諸如人4IgB7H3蛋白或人2IgB7H3蛋白)，或B7H3之胞外結構域(B7H3 ECD)或含有B7H3 ECD之片段；B7H3-ECD融合蛋白。B7H3蛋白質之示例性序列見Uniprot ID：Q5ZPR3 (人4IgB7H3)、Genebank登錄號NP_001019907 (人)、NP_001316557 (人)、NP_001316558 (人)、NP_079516 (人)及NP_598744 (小鼠)。食蟹猴B7H3與人及小鼠B7H3之胺基酸序列同源性分別約為97%及88%。
術語「結合B7H3之抗體」或「抗B7H3抗體」包括其特異性識別B7H3蛋白之抗體及抗原結合片段，以及其特異性結合B7H3蛋白之抗體及抗原結合片段。此處使用之「抗B7H3抗體」包括具有單一特異性之單價抗體，以及包含結合B7H3之第一抗原結合位點及結合第二抗原之第二抗原結合位點之雙特異性抗體。
術語「單株抗體」係指獲自基本均質抗體群體之抗體，亦即組成該群體之各個抗體除可少量存在的可能天然存在之突變之外係相同的。單株抗體係高度特異性的，針對單一抗原表位。相比之下，習知(多株)抗體製備物通常包括大量針對不同表位(或對不同表位有特異性)之抗體。修飾語「單株」表明獲自基本均質抗體群體之抗體的特徵，且不得解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。
術語「全長抗體」，係指天然存在的包含四條肽鏈之免疫球蛋白分子：兩條重(H)鏈(全長時約50至70kDa)及兩條輕(L)鏈(全長時約25kDa)藉由二硫鍵互相連接。每一條重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區(在本文中縮寫為CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2及CH3組成。每一條輕鏈由輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區(在本文中縮寫為CL)組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH及VL區可被進一步細分為具有高可變性之互補決定區(CDR)及與CDR間隔的更保守的稱為構架區(FR)之區域。每一個VH或VL區由按下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4自胺基端至羧基端排列之3個CDR及4個FR組成。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白對宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如，效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq))之結合。
術語「CDR」係指抗體可變序列內之互補決定區。在重鏈及輕鏈之各個可變區中存在3個CDR，其對於各個重鏈及輕鏈可變區被命名為HCDR1、HCDR2及HCDR3或LCDR1、LCDR2及LCDR3。本發明之抗體之可變區CDR之精確胺基酸序列邊界可使用許多公知方案中之任何方案來確定，包括基於抗體之三維結構及CDR環之拓樸學之Chothia (Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；Al-Lazikani等人, 「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948(1997))，基於抗體序列可變性之Kabat (Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987))，AbM (University of Bath)，Contact (University College London)，International ImMunoGeneTics database (IMGT) (1999 Nucleic Acids Research, 27, 209-212)，以及基於利用大量晶體結構之近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)之North CDR定義。本發明抗體之CDR可以由熟習此項技術者根據此項技術之任何方案(例如不同的指派系統或組合)確定邊界。
術語抗體(「親本抗體」)之「抗原結合片段」或「抗體片段」包括抗體之片段或衍生物，通常包括親本抗體之抗原結合區或可變區(例如一或多個CDR)之至少一個片段，其保持親本抗體之至少一些結合特異性。抗體結合片段之實例包括但不限於Fab，Fab'，F(ab')2及Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如scFv；由抗體片段形成之奈米抗體(nanobody)及多特異性抗體。當與抗原之結合活性在莫耳濃度基礎上表示時，抗原結合片段或衍生物通常保持親本抗體之抗原結合活性之至少10%。較佳抗原結合片段或衍生物保持親本抗體之抗原結合親和力之至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高。亦預期抗體之抗原結合片段可包括不明顯改變其生物活性之保守胺基酸取代(稱為抗體之「保守變體」或「功能保守變體」)或非保守胺基酸取代。
術語「嵌合抗體」係具有第一抗體之可變結構域及第二抗體之恆定結構域的抗體，其中第一抗體及第二抗體來自不同物種。通常，可變結構域獲自嚙齒動物等之抗體(「親本抗體」)，而恆定結構域序列獲自人抗體，使得與親本嚙齒動物抗體相比，所得嵌合抗體在人個體中誘導不良免疫反應之可能性較低。
術語「人源化抗體」係指含有來自人及非人(例如小鼠、大鼠)抗體之序列的抗體形式。一般而言，人源化抗體包含基本所有之至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本所有之超變環相當於非人免疫球蛋白之超變環，而所有或基本所有的框架(FR)區係人免疫球蛋白序列之構架區。人源化抗體視情況可包含至少一部分的人免疫球蛋白恆定區(Fc)。
在本申請中，術語「鹵素」通常係指氟、氯、溴、碘，例如可以為氟、氯。
在本申請中，術語「烷基」通常係指烷除去氫原子所衍生之殘基。烷基可以為經取代或未經取代的，經置換或未經置換的。術語「烷基」通常係指飽和的直鏈或分支鏈脂族烴基，其具有自母體烷類之相同碳原子或兩個不同之碳原子上除去氫原子所衍生之殘基，其可以為包含1至20個碳原子之直鏈或分支鏈基團，例如含有1至12個碳原子，例如含有1至6個碳原子之鏈烷基。烷基之非限制性實例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等。烷基可以為經取代或未經取代的、經置換或未經置換的，例如當經取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基可以獨立地視情況選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基及側氧基中之一或多個取代基所取代，例如可以為氫、氕、氘、氚、鹵素、-NO 2、-CN、-OH、-SH、-NH 2、-C(O)H、-CO 2H、-C(O)C(O)H、-C(O)CH 2C(O)H、-S(O)H、-S(O) 2H、-C(O)NH 2、-SO 2NH 2、-OC(O)H、-N(H)SO 2H或C 1-6脂族基團。例如當被環烷基取代時，為環烷基烷基。
在本申請中，術語「伸烷基」通常係指飽和的直鏈或分支鏈脂族烴基，其具有2個自母體烷類之相同碳原子或兩個不同的碳原子上除去兩個氫原子所衍生之殘基，其可以為包含1至20個碳原子之直鏈或分支鏈基團，例如，術語「亞甲基」可以係指1個碳原子之基團除去兩個氫原子所衍生之殘基。亞甲基可以為經取代或未經取代的，經置換或未經置換的；例如含有1至12個碳原子，例如含有1至6個碳原子之伸烷基。伸烷基之非限制性實例包括但不限於亞甲基(-CH 2-)、1,1-亞乙基(-CH(CH 3)-)、1,2-亞乙基(-CH 2CH 2)-、1,1-亞丙基(-CH(CH 2CH 3)-)、1,2-亞丙基(-CH 2CH(CH 3)-)、1,3-亞丙基(-CH 2CH 2CH 2-)、1,4-亞丁基(-CH 2CH 2CH 2CH 2-)及1,5-亞戊基(-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-)等。伸烷基可以為經取代或未經取代的，經置換或未經置換的，例如當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該等取代基可以獨立地視情況選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基及側氧基中之一或多個取代基所取代，例如可以為氫、氕、氘、氚、鹵素、-NO 2、-CN、-OH、-SH、-NH 2、-C(O)H、-CO 2H、-C(O)C(O)H、-C(O)CH 2C(O)H、-S(O)H、-S(O) 2H、-C(O)NH 2、-SO 2NH 2、-OC(O)H、-N(H)SO 2H或C 1-6脂族基團。亞甲基或伸烷基可以為經取代或未經取代的。
術語「烷氧基」係指-O-(烷基)及-O-(未經取代之環烷基)，其中烷基或環烷基之定義如本文所描述烷氧基之非限制性示例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以為視情況經取代的或未經取代的，當被取代時，取代基較佳為一或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
在本申請中，術語「烯基」通常係指含有一或多個雙鍵之直鏈或分支鏈烴基。烯基之示例性實例包括烯丙基、高烯丙基、乙烯基、巴豆基、丁烯基、戊烯基及己烯基等。具有一個以上雙鍵之C2-6烯基之示例性實例包括丁二烯基、戊二烯基、己二烯基及己三烯基以及其分支形式。不飽和鍵(雙鍵)的位置可以在碳鏈之任何一個位置。烯基可以為經取代或未經取代的。例如，當被取代時，可以在任何可使用的連接點上進行取代基之取代，並且該取代基較佳地獨立地視情況選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷基硫基、雜環烷基硫基、雜環烷基硫基及側氧基中之一或多者組成的群，例如，其可以為氫、氕、氘、氚、鹵素、-NO 2、-CN、-OH、-SH、-NH 2、-C(O)H、-CO 2H、-C(O)C(O)H、-C(O)CH 2C(O)H、-S(O)H、-S(O) 2H、-C(O)NH 2、-SO 2NH 2、-OC(O)H、-N(H)SO 2H或C 1-6脂族基團。
在本申請中，術語「伸烯基」通常係指具有自烯烴之碳原子上除去兩個氫原子所衍生之殘基。例如，可以是亞烯丙基、伸乙烯基、伸丁烯基、伸戊烯基及伸己烯基等。伸烯基可以為經取代或未經取代的。例如，當被取代時，可以在任何可使用的連接點上進行取代基之取代，並且該取代基較佳地獨立地視情況選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷基硫基、雜環烷基硫基、雜環烷基硫基及側氧基中之一或多者組成的群，例如，其可以為氫、氕、氘、氚、鹵素、-NO 2、-CN、-OH、-SH、-NH 2、-C(O)H、-CO 2H、-C(O)C(O)H、-C(O)CH 2C(O)H、-S(O)H、-S(O) 2H、-C(O)NH 2、-SO 2NH 2、-OC(O)H、-N(H)SO 2H或C 1-6脂族基團。
在本申請中，術語「炔基」通常係指含有一或多個三鍵之直鏈或分支鏈烴基。炔基可以為不飽和直鏈或分支鏈炔基，例如乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、丁炔基等。炔基可以為經取代或未經取代的。例如，當被取代時，可以在任何可使用的連接點上進行取代基之取代，並且該取代基較佳地獨立地視情況選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷基硫基、雜環烷基硫基、雜環烷基硫基及側氧基中之一或多者組成的群，例如，其可以為氫、氕、氘、氚、鹵素、-NO 2、-CN、-OH、-SH、-NH 2、-C(O)H、-CO 2H、-C(O)C(O)H、-C(O)CH 2C(O)H、-S(O)H、-S(O) 2H、-C(O)NH 2、-SO 2NH 2、-OC(O)H、-N(H)SO 2H或C 1-6脂族基團。
在本申請中，術語「伸炔基」通常係指具有自炔烴之碳原子上除去兩個氫原子所衍生之殘基。例如，可以為伸乙炔基、伸丙炔基、伸炔丙基、伸丁炔基等。伸炔基可以為經取代或未經取代的。例如，當被取代時，可以在任何可使用的連接點上進行取代基之取代，並且該取代基較佳地獨立地視情況選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷基硫基、雜環烷基硫基、雜環烷基硫基及側氧基中之一或多者組成的群，例如，其可以為氫、氕、氘、氚、鹵素、-NO 2、-CN、-OH、-SH、-NH 2、-C(O)H、-CO 2H、-C(O)C(O)H、-C(O)CH 2C(O)H、-S(O)H、-S(O) 2H、-C(O)NH 2、-SO 2NH 2、-OC(O)H、-N(H)SO 2H或C 1-6脂族基團。
在本申請中，術語「芳基」通常係指具有芳環上除去氫原子所衍生之殘基。術語「芳環」可以指具有共軛之π電子系統之6至14元全碳單環或稠合多環(亦即共用毗鄰碳原子對之環)，可以為6員至10員，例如苯及萘。該芳環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起之環為芳基環。芳基可以為經取代或未經取代的，當被取代時，取代基可以為一或多個以下基團，其獨立地選自以下群：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、及雜環烷硫基。芳基可以為經取代或未經取代的。
在本申請中，術語「雜芳基」通常係指具有自雜芳環之碳原子上除去氫原子所衍生之殘基。術語「雜芳環」指包含1至4個雜原子、5至14個環原子之雜芳族系統，其中雜原子可以選自以下群：氧、硫及氮。雜芳基可以為5員至10員，可以為5員或6員，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡𠯤基、咪唑基、四唑基等。該雜芳族環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起之環為雜芳基環。雜芳基可以為視情況經取代或未經取代的，當被取代時，取代基可以為一或多個以下基團，其獨立地選自以下群：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基及雜環烷硫基。雜芳基可以為經取代或未經取代的。
在本申請中，術語「環烷基」指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳包含3至12個碳原子，較佳包含3至10個碳原子，較佳包含3至8個碳原子，更佳包含3至6個碳原子。單環環烷基之非限制性示例包括環丙烷基、環丁烷基、環戊烷基、環戊烯基、環己烷基、環己烯基、環己二烯基、環庚烷基、環庚三烯基、環辛烷基等；多環環烷基包括螺環、稠環及橋環之環烷基。環烷基可以為經取代或未經取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基及雜芳基中之一或多個取代基所取代。
在本申請中，術語「部分不飽和」通常係指環狀結構中環分子間至少含一個雙鍵或三鍵。術語「部分不飽和」涵蓋帶有多處不飽和環狀結構，但並非意在包括本申請所定義之芳環或雜芳環。術語「不飽和」表示部分具有一或多個不飽和度。
在本申請中，術語「雜環基」指飽和或部分不飽和之非芳香族單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一或多個環原子為選自氮、氧或硫之雜原子，其餘環原子為碳。較佳包含3至12個環原子，其中1至4個係雜原子；更佳包含3至8個環原子，其中1至3個係雜原子；更佳包含3至6個環原子，其中1至3個係雜原子；最佳包含5或6個環原子，其中1至3個係雜原子。單環雜環基之非限制性示例包括吡咯啶基、四氫哌喃基、哌啶基、𠰌啉基、硫代𠰌啉基及高哌𠯤基之等。多環雜環基包括螺環、稠環及橋環之雜環基。該雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其與母體結構連接在一起之環為雜環基。雜環基可以為經取代或未經取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用之連接點上被取代，該取代基較佳獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基及雜芳基中之一或多個取代基所取代。
在本申請中，術語「成環原子」通常係指環狀結構上包含之原子。例如，成環原子可為苯環上之碳原子，可為吡啶環上之氮原子。當成環原子上連接氫原子時，成環原子可以為經取代或未經取代的。
在本申請中，術語「各自獨立地」通常係指變數適用於任何一種情況，而不考慮在相同化合物中具有相同或不同定義之變數存在與否。例如其中的變數可以係指化合物之取代基種類、數目或化合物中原子之種類等。例如，在化合物中出現2次R並且R被定義為「獨立地碳或氮」時，兩個R可以均為碳，兩個R可以均為氮，或一個R可以為碳而另一個R為氮。
在本申請中，術語「視情況」或「視情況地」通常意謂隨後所描述之事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生之場合。例如，「視情況經烷基取代之雜環基團」意謂烷基可以但不必須存在，該說明可以包括雜環基團被烷基取代之情形及雜環基團不被烷基取代之情形。
在本申請中，術語「經取代」通常指基團中之一或多個氫原子，例如為至多5個，例如為1至3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。取代基僅處在其可能之化學位置，熟習此項技術者能夠在不付出過多努力之情況下(藉由實驗或理論)確定可能或不可能的取代。例如，具有游離氫之胺基或羥基與具有不飽和(諸如烯屬)鍵之碳原子結合時可能係不穩定的。
在本申請中，術語「0個或多個(例如，0個或1個或更多個、0個或1個、0個)亞甲基單元被置換」通常係指當該結構包含1個或多個亞甲基單元時，該一或多個亞甲基單元可以不被置換，或被一或多個不是亞甲基之基團(例如-NHC(O)-、-C(O)NH-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-NH-、-O-、-S-、-SO-、-SO 2-、-PH-、-P(=O)H-、-NHSO 2-、-SO 2NH-、-C(=S)-、-C(=NH)-、-N=N-、-C=N-、-N=C-或-C(=N 2)-)置換。
在本申請中，基團X與基團Y的「連接」通常可以處於任一定向，任一定向通常係指在基團X用於連接子Y及基團Z時，該基團X之兩個或更多個連接位點可以任意地與基團Y或基團Z連接。
在本申請中，術語「化合物」通常指具有兩種或更多種不同元素之物質。例如，本申請之化合物可為有機化合物，例如本申請之化合物可以是分子量500道爾頓以下之化合物，可為分子量1000道爾頓以下之化合物，亦可為分子量1000道爾頓以上之化合物，亦可為10000道爾頓以上、100000道爾頓以上之化合物。在本申請中，化合物亦可以係指藉由化學鍵相連之化合物，例如可為一或多個分子量1000道爾頓以下之分子藉由化學鍵與生物大分子相連之化合物，該生物大分子可為高聚糖、蛋白、核酸、多肽等。例如本申請之化合物可以包括蛋白質與一或多個分子量1000道爾頓以下之分子相連之化合物，可為包括蛋白質與一或多個分子量10000道爾頓以下之分子相連之化合物，可為包括蛋白質與一或多個分子量100000道爾頓以下之分子相連之化合物。
在本申請中，如熟習此項技術者可知的，「烷基」、「烯基」、「環烷基」等之類的術語可以在名稱前加一個標識表示在特定情況下基團中存在之原子數，例如，C 1-C 4烷基，C 3-C 7環烷氧基，C 1-C 4烷基羰基胺基等，「C」後所跟下標數字表示在基團中存在之碳原子數。例如，C 3烷基係指具有三個碳原子之烷基(例如，正丙基，異丙基)；C 1-10中，基團之成員可具有落入1至10範圍內之任何數目的碳原子。
基團中之一或多個氫原子，例如為至多5個，例如為1至3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。取代基僅處在其可能之化學位置，熟習此項技術者能夠在不付出過多努力之情況下(藉由實驗或理論)確定可能或不可能的取代。例如，具有游離氫之胺基或羥基與具有不飽和(諸如烯屬)鍵之碳原子結合時可能係不穩定的。
在本申請中，本申請之化合物或配體-藥物結合物包含其互變異構物、內消旋物、外消旋物、鏡像異構物、及/或非鏡像異構物。在本申請中，術語「非鏡像異構物」通常係指具有兩個或更多個對掌性中心並且其分子不是彼此的鏡像之立體異構物。非鏡像異構物可以具有不同之物理性質，例如，熔點、沸點、波譜性質及反應性。在本申請中，術語「互變異構物」或「互變異構形式」可互換使用，通常係指可藉由低能障壁(low energy barrier)互相轉化之不同能量之結構異構物。例如，質子互變異構物(protontautomer) (亦稱為質子移變互變異構物(prototropic tautomer))包括藉由質子遷移進行之互相轉化，諸如酮-烯醇異構化及亞胺-烯胺異構化。價鍵互變異構物(valence tautomer)包括藉由一些成鍵電子之重組進行之互相轉化。在本申請中，術語「內消旋物」通常係指分子內含有不對稱性的原子，但具有對稱因素而使分子內總旋光度為零。術語「外消旋物」或「外消旋混合物」係指由等莫耳量之兩種鏡像異構物物質構成之組合物。
在本申請中，術語化合物或配體-藥物結合物之「異構物」通常包含化合物之互變異構物、內消旋物、外消旋物、鏡像異構物非鏡像異構物。
術語「配體-藥物結合物」通常係指配體藉由穩定的連接單元與具有生物活性之細胞毒性藥物相連。在本申請中「配體-藥物結合物」可以為抗體-藥物結合物(antibody drug conjugate，ADC)，該ADC可以係指將抗體或者抗體片段藉由穩定的連接單元與具有生物活性之藥物(例如，細胞毒性藥物)相連。
在本申請中，術語「配體」通常指能識別及結合目標細胞相關之抗原或受體之大分子化合物。配體之作用可為將藥物呈遞給與配體結合之目標細胞群體，此等配體包括但不限於蛋白類激素、凝集素、生長因子、抗體或其他能與細胞、受體及/或抗原結合之分子。在本申請中，配體可以表示為Ab，配體抗原藉由配體上之雜原子與連接單元形成連接鍵。配體可以為抗體或其抗原結合片段(Ab)，該抗體可以選自嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或鼠源抗體；該抗體可為單株抗體。
術語「細胞毒性藥物」通常指毒性藥物，該細胞毒性藥物可為在腫瘤細胞內具有較強破壞其正常生長之化學分子。細胞毒性藥物可以在足夠高之濃度下殺死腫瘤細胞。該「細胞毒性藥物」可以包括毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At 211、I 131、I 125、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、Bi 212、P 32或Lu之放射性同位素)，毒性藥物，化療藥物，抗生素及核溶酶，例如，可為毒性藥物，包括但不限於喜樹鹼衍生物，例如，可為喜樹鹼衍生物依沙替康(exatecan)(化學名：(1 S,9 S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1 H,12 H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]咪唑并[1,2-b]喹啉-10,13(9 H,15 H)-二酮)。
術語「連接子單元」或「連接子結構」通常係指一端與配體連接而另一端與細胞毒性藥物相連之化學結構片段或鍵，亦可以連接其他連接子後再與細胞毒性藥物相連。直接或間接連接配體可以係指基團藉由共價鍵直接連接配體，亦可以是藉由連接子結構連接配體。例如，可以使用包含酸不穩定連接子結構(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)連接子結構、光不穩定連接子結構、二甲基連接子結構、或含二硫化物連接子結構之化學結構片段或鍵作為連接子結構。
術語某個結構「視情況地與其他分子部分相連接」通常係指該結構不與任何其他化學結構相連接，或者該結構與一或多個不同於該結構之其他化學結構(例如本申請所述之配體)相連接(例如，藉由化學鍵連接、或藉由連接子結構連接)。
術語「載藥量」通常係指每個配體上加載之細胞毒性藥物平均數目，亦可以表示為細胞毒性藥物及抗體量之比值，細胞毒性藥物載量之範圍可以是每個配體(Ab)連接0-12個，例如1-10個細胞毒性藥物。在本申請之實施例中，載藥量表示為DAR，示例性的值可以為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10之均值。可用習知方法如UV/可見光光譜法，質譜，ELISA試驗及HPLC特徵鑑定結合反應後每個ADC分子之載藥量。
在本申請中，本申請之化合物之某些原子可能以超過一種同位素形式出現。例如，氫可能以氕( 1H)、氘( 2H)及氚( 3H)之形式存在，碳可能以三種不同之同位素( 12C、 13C及 14C)自然存在。可併入本申請化合物中之同位素示例亦包括但不限於 15N、 18O、 17O、 18F、 32P、 33P、 129I、 131I、 123I、 124I、 125I，或者類似之同位素。因此，相對於此等同位素之自然豐度，本申請之化合物可富集在一或多種此等同位素中。如熟習此項技術者所知，此類同位素富集化合物可用於多種用途。例如，用重同位素如氘( 2H)替代可能會由於更高的代謝穩定性二提供某些治療優勢。例如，氘( 2H)之自然豐度約為0.015%。因此，自然界中大約每6500個氫原子，就有一個氘原子。因此，本申請之含氘化合物在一或多個位置(視情況而定)之氘豐度大於0.015%。除非另有指明，否則本申請所述之結構亦可以包括僅在是否存在一或多個同位素富集原子方面存在差別之化合物。舉例而言，除了氫原子被氘或氚所取代，或碳原子被碳13或碳14所取代之外，其餘部分均與本申請結構一致之化合物均在本申請之範疇之內。
術語「醫藥組合物」通常係指含有一或多種本申請所述之化合物或其生理學上/醫藥學上可接受之鹽或前驅體藥物與其他化學組分之混合物，以及其他組分例如生理學上/醫藥學上可接受之載劑及賦形劑。醫藥組合物可係促進對生物體之給藥，利於活性成分之吸收進而發揮生物活性。習知之醫藥組合物之製備可以見中國藥典。醫藥組合物可以是用於肌內及皮下給藥之無菌注射水或油懸浮液之形式。可按已知技術，用適宜之分散劑或濕潤劑及懸浮劑製備該懸浮液。無菌注射製劑亦可係在無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中製備之無菌注射溶液或懸浮液，例如1,3-丁二醇中製備之溶液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。例如，可使用包括合成甘油單酯或二酯在內之任何調和固定油。此外，脂肪酸例如油酸亦可以製備注射劑。
術語「醫藥學上可接受之鹽」或「可藥用之鹽」通常係指本申請化合物或配體-藥物結合物之鹽，或本申請中所述之化合物之鹽，此類鹽用於哺乳動物體內時可以具有安全性及/或有效性，且可以具有應有的生物活性，本申請之抗體-藥物結合物可以與酸形成鹽，醫藥學上可接受之鹽之非限制性實例包括：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、山梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。
術語「醫藥學上可接受之載劑」通常係指給予治療劑，例如抗體或多肽、基因及其他治療劑之載劑或載劑。該術語係指本身不誘導對接受組合物之個體有害的抗體產生並且可以給予而不產生過度毒性之任何藥物載劑。合適之載劑可為大的、代謝緩慢之大分子，例如蛋白質、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚胺基酸、胺基酸共聚物、脂質聚集物及滅活之病毒顆粒。熟習此項技術者熟知此等載劑。治療組合物中醫藥學上可接受之載劑可包括液體，例如水、鹽水、甘油及乙醇。此等載劑中亦可存在輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝物質等。
術語「治療(treatment)」及「治療(treating)」通常係指獲得有益或希望效果的方法，該等有益或希望效果包括但不限於治療益處。治療益處包括但不限於根除、抑制、減少或改善所治療的潛在疾病。另外，治療益處係藉由根除抑制、減少或改善與潛在的疾病相關之一或多種生理症狀實現的，從而在患者中觀察到改善，但是患者仍然可能患有潛在疾病。
術語「B7H3相關疾病」係指由B7H3 (諸如人B7H3)之表現或活動增加或減少(一般增加)引起、加劇或以其他方式與之相關之任何疾病或病症。
術語「預防(prevention)」及「預防(preventing)」通常係指獲得有益或希望效果的方法，該等有益或希望效果包括但不限於預防益處。為了預防益處，可以向處於患上特定疾病之風險之患者或向報告具有疾病之一或多種生理症狀之患者投與醫藥組合物，即使尚未診斷出該疾病。
術語「個體」或「患者」通常係指人類(亦即，任何年齡組之男性或女性，例如，小兒對象(例如，嬰兒、兒童、青少年)或成人對象(例如，年輕人、中年人或老年人))及/或其他靈長類動物(例如，食蟹猴、恆河猴)；哺乳動物，包括商業上相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、山羊、貓及/或犬；及/或禽類，包括商業上相關之禽類，諸如雞、鴨、鵝、鵪鶉及/或火雞。
術語「治療有效量」、「治療有效劑量」及「有效量」係指本發明配體-藥物結合物單獨或與其他治療藥物組合給予細胞、組織或個體時，有效預防或改善一或多種疾病或病況之症狀或該疾病或病況之發展的量。治療有效劑量亦指足以導致症狀改善之劑量，例如治療、治癒、預防或改善相關醫學病況或者提高此類病況之治療、治癒、預防或改善之速度的量。當對個體投與單獨給予之活性成分時，治療有效劑量僅係指該成分。當組合投與時，治療有效劑量係指引起治療效果之活性成分的綜合量，不論係組合、依次給予抑或同時給予。治療劑之有效量將導致診斷標準或參數提高至少10%，通常至少20%，較佳至少約30%，更佳至少40%，最佳至少50%。
術語「癌症」在本文中用於指表現出異常高水準之增殖及生長的一組細胞。癌症可能係良性的(亦稱為良性腫瘤)，惡性前或惡性。癌細胞可以是實體癌細胞或血液病癌細胞。本文使用之術語「腫瘤」係指包含癌症之一或多個細胞。術語「腫瘤生長」在本文中用於指代包含癌症之一或多種細胞之增殖或生長，其導致癌症之大小或程度之相應增加。 抗B7H3抗體
本發明提供特異性結合B7H3之抗體，例如，特異性結合人B7H3、小鼠B7H3、食蟹猴B7H3及其ECD結構域之抗體。本文使用之術語「抗體」如上定義，包括全長免疫球蛋白及其結合至相同抗原之抗體部分。抗體可為例如單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人源化抗體或單鏈抗體。在一些實施例中，抗體部分為Fab片段或F(ab') 2片段。在一些實施例中，抗體部分保留特異性結合B7H3之能力。
重組抗B7H3抗體，例如嵌合抗體及人源化單株抗體，包括人及非人部分，可使用標準重組DNA技術製備，屬於本發明之範圍。此類嵌合及人源化單株抗體可藉由重組DNA技術生產，如美國專利號7112421中所述之方法；Better等人(1988) Ssience240:1041-1043；或Liu等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci.U S A, 84:3439-3443。本發明亦包括進一步修飾/最佳化之人源化單株抗體，例如藉由親和力成熟、反向突變及去除轉譯後修飾位點。
較佳地，如本文所揭示之抗體或其抗原結合部分可以高親和力結合至人4IgB7H3。如本文所揭示之抗體或其抗原結合部分可以低得多的親和力結合人2IgB7H3。如本文所揭示之抗體或其抗原結合部分可以高親和力結合人4IgB7H3，但以低得多的親和力結合人2IgB7H3。
本發明抗體與B7H3之結合可使用一或多種此項技術中公認之技術進行評估，例如ELISA或流動式細胞測量術。在一些實施例中，可藉由流動式細胞測量術分析測試抗體，其中抗體與表現人B7H3之細胞株反應，該表現人B7H3之細胞株例如MCF-7癌細胞或已轉染以在其細胞表面表現B7H3之CHOK1細胞。此外，亦可以在雙核結合分析中測試抗體之結合，包括結合動力學(例如，KD值)。在一些其他實施例中，藉由ELISA測試抗體，其中抗體與可溶性B7H3蛋白反應。
本發明提供了與人4IgB7H3蛋白結合之抗體，藉由表面電漿子共振(SPR)量測，其K D為1×10 -8M或更小、K D為1×10 -9M或更小、K D為5×10 -10M或更小、K D為1×10 -10M或更小、K D為9×10 -11M或更小、K D為8×10 -11M或更小或K D為7×10 -11M或更小。藉由表面電漿子共振(SPR)量測，本文所揭示之抗體亦可與人2IgB7H3蛋白結合，其K D為5×10 -9M或以上、K D為1×10 -8M或以上、K D為2×10 -8M或以上、K D為3×10 -8M或以上或KD為4×10 -8M或以上。在一些實施例中，本文中之抗體與人4IgB7H3結合，其K D值比與人2IgB7H3結合之K D值小500倍以上、小100倍以上或小50倍以上。此等用於比較之K D值可以是藉由表面電漿子共振(SPR)所量測得到。
在一些實施例中，本發明之抗體能夠以小於5 nM、小於4 nM、小於3 nM或小於2 nM之EC 50結合人或食蟹猴B7H3表現細胞株，藉由FACS測定。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分係特異性結合B7H3，較佳為人4IgB7H3之嵌合抗體或鼠抗體。在一些進一步實施例中，抗體或其抗原結合部分係特異性結合B7H3，較佳為人4IgB7H3之人源化抗體。在一些更進一步的實施例中，人源化抗體或其抗原結合部分在構架區中包含一或多個回復突變。在一些更進一步的實施例中，人源化抗體或其抗原結合部分在潛在的轉譯後修飾(PTM)位點包含一或多個修飾，例如以去除CDR、NXS及NXT (X可係全長中除P之外的任何胺基酸)中之NG、NS及DG之外的任何胺基酸。
在一些實施例中，如本文所揭示之抗體或其抗原結合部分包含一或多個重鏈CDR (HCDR)，其選自以下組成之群中之至少一者： (i)包含SEQ ID NO: 1之HCDR1； (ii)包含SEQ ID NO: 2之HCDR2；及 (iii)包含SEQ ID NO: 3之HCDR3；及/或 一或多個輕鏈CDR (LCDR)選自以下群中之至少一者： (i)包含SEQ ID NO: 4或7或18之LCDR1； (ii)包含SEQ ID NO: 5之LCDR2；及 (iii)包含SEQ ID NO: 6之LCDR3。
在一些實施例中，如上所述之抗體或其抗原結合部分可以包括：包含或由SEQ ID NO：1組成之HCDR1；包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR2；包含或由SEQ ID NO: 3組成之HCDR3；包含或由SEQ ID NO: 7組成之LCDR1；包含或由SEQ ID NO: 5組成之LCDR2； 包含或由SEQ ID NO: 6 組成之LCDR3。具體地，該抗體可進一步在CDR上包含一或多個修飾以去除潛在的PTM位點。在一些實施例中，抗體在LCDR1之序列SEQ ID NO: 7 (「KSSQSLL NSSNQKNYLA」)上包含一或多個修飾以去除「NS」，該「NS」係該序列中潛在的PTM位點。在一些較佳實施例中，抗體在LCDR1之胺基酸序列SEQ ID NO：7 (「KSSQSLL NSSNQKNYLA」)之第8或第9位包含一個取代。在一些更佳的實施例中，抗體在LCDR1之胺基酸序列之第8位包含N至Q取代(亦即SEQ ID NO: 4，「KSSQSLL QSSNQKNYLA」)。在一些其他實施例中，抗體在LCDR1之胺基酸序列之第9位包含S至P取代(亦即SEQ ID NO: 18，「KSSQSLL NPSNQKNYLA」)。熟習此項技術者應理解，只要基本上保留對B7H3之結合親和力，亦可以選擇其他類型的取代。
在一些實施例中，如上所述之抗體或其抗原結合部分可以包括：包含或由SEQ ID NO：1組成之HCDR1；包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR2；包含或由SEQ ID NO: 3組成之HCDR3；包含或由SEQ ID NO: 4組成之LCDR1；包含或由SEQ ID NO: 5組成之LCDR2； 包含或由SEQ ID NO: 6 組成之LCDR3。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中重鏈可變區及輕鏈可變區包含分別如上所述之HCDR1-3及LCDR1-3。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分之重鏈可變區包含： (i) SEQ ID NO: 8或10之胺基酸序列； (ii)與SEQ ID NO: 8或10至少85%、90%或95%同一性之胺基酸序列；或(iii)與SEQ ID NO: 8或10相比具有一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)個胺基酸之添加、缺失及/或取代之胺基酸序列。
在一些實施例中，胺基酸取代可為保守取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分之輕鏈可變區包含： (i) SEQ ID NO: 9或11之胺基酸序列； (ii)與SEQ ID NO: 9或11至少85%、至少90%或至少95%同一性之胺基酸序列； (iii)與SEQ ID NO: 9或11相比具有一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)個胺基酸之添加、缺失及/或取代之胺基酸序列。
在一些實施例中，胺基酸取代可為保守取代。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含： (i) SEQ ID NO: 8或10之胺基酸序列； (ii)與SEQ ID NO: 8或10 相比，在構架區中一或多個(例如1、2、3、4、5或更多)胺基酸取代之胺基酸序列； 及/或VL 包括： (i) SEQ ID NO: 9或11 之胺基酸序列；或(ii)與SEQ ID NO: 9或11相比，在構架區中一或多個(例如 1、2、3、4、5或更多個)胺基酸取代之胺基酸序列。
在一些實施例中，胺基酸取代可為保守取代。
在一些實施例中，抗體或抗原結合部分包含SEQ ID No: 8或10之重鏈可變區(VH)之HCDR1、HCDR2及HCDR3，及包含SEQ ID No: 9或11之輕鏈可變區(VL)之LCDR1、LCDR2及LCDR3。
如熟習此項技術者將理解，CDR之準確編號及置放在不同編號系統中可能不同。然而，應當理解，可變重鏈及/或可變輕鏈序列之揭示包括相關(固有)CDR之揭示。因此，每個重鏈可變區之揭示係對重鏈CDR (例如，HCDR1、HCDR2 及HCDR3)之揭示，並且每個輕鏈可變區之揭示係對輕鏈DR (例如，LCDR1、LCDR2 及LCDR3)之揭示。胺基酸對每個CDR之分配可根據編號方案之一個或組合，其全部均係此項技術中所熟知的。下面是一個CDR編號之比較，參閱Lafranc等人, Dev. Comp. Immunol.27(1):55-77 (2003):
CDR Kabat IMGT Chothia AbM Kabat+ Chothia Martin博士之描述(參見Martin A，「Antibody bioinformatics website of Dr. Andrew Martin's lab at UCL」，最後更新於2018年7月31日)
HCDR1 31-35 27-38 26-32 26-35 26-35 CXXX+HCDR1+W
HCDR2 50-65 56-65 52-56 50-58 50-65 LEWG+HCDR2
HCDR3 95-102 105-117 95-102 95-102 95-102 CAR+HCDR3+WGXG
LCDR1 24-34 27-38 24-34 24-34 24-34 C+LCDR1+W
LCDR2 50-56 56-65 50-56 50-56 50-56 LCDR1之後的16個殘基
LCDR3 89-97 105-117 89-97 89-97 89-97 C+LCDR3+ FGXG
在一些實施例中，CDR胺基酸序列可與上述各序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些實施例中，可變區之胺基酸序列可與上述各序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之同一性。
如上所述，VH或VL區域中至少一種胺基酸之添加、缺失及/或取代可能不在任何CDR序列中，而是在框架(FR)序列中。例如，其分離抗體或抗原結合部分可包含框架序列中胺基酸之一或多個取代，諸如VH或VL區域之FR1、FR2、FR3及/或FR4。在一些實施例中，VH區之構架區包含一或多個如下取代：S025T、V071R、Y091F、V089T。
在一些實施例中，6個CDR中之變化可以具有總共0、1、2、3、4或5個胺基酸修飾(較佳胺基酸取代)，以及重鏈可變區及輕鏈可變區之構架區域中的變化，只要框架(不包括CDR)與親本抗體保持至少約80、85或90%之同一性(例如，W301088-1.145.16)。因此，如本文所述之相同CDR可以與來自人類生殖系序列之不同框架序列組合，只要構架區域與人類生殖系序列保持至少80、85或90%之同一性。
在某些實施例中，如本文所提供之分離抗體或其抗原結合部分包含任何合適之構架區(FR)序列，只要抗原結合域可以特異性結合至B7H3，較佳為人Ig4B7H3。
在一些實施例中，可在本文中所提供抗體之Fc區中引入一或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(諸如取代)之人Fc區序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在一些實施例中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。
在一些實施例中，本文中所提供之抗體可進一步經修飾為含有此項技術中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
可採用用於產生抗體之任何合適方法來產生本發明之抗體。任何合適形式之B7H3均可用作產生抗體之免疫原(抗原)。藉由舉例而非限制，任何B7H3變體或其片段都可用作免疫原。在一些實施例中，產生鼠源之單株抗人B7H3抗體之雜交瘤細胞可藉由此項技術中公知之方法產生。來源於嚙齒動物(如小鼠)之抗體在活體內用作治療藥物時可能引起不需要的抗體免疫原性，重複使用導致人體產生針對治療性抗體之免疫反應，此類免疫反應至少導致喪失治療功效，而嚴重的則導致潛在致死過敏反應。降低嚙齒動物抗體之免疫原性之一種方法包括嵌合抗體之產生，其中將小鼠可變區與人恆定區融合(Liu等(1987)， Proc. Natl. Acad. Sci.USA 84:3439-3443)。然而，嵌合抗體中之完整嚙齒動物可變區之保留仍可能在患者中引起有害的免疫原性。將嚙齒動物可變結構域之互補決定區(CDR)環移植至人類構架上(亦即人源化)已被用於進一步將嚙齒動物序列減至最低(Jones等(1986)，Nature 321 :522；Verhoeyen等(1988)， Science239:1534)。
在一些實施例中，本發明之嵌合或人源化抗體可基於所製備之鼠單株雜交瘤抗體之序列來製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可以自目標鼠雜交瘤中獲得，並且使用標準分子生物學技術進行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。
在一些實施例中，本發明所述之嵌合B7H3抗體，可使用此項技術中已知之方法將雜交瘤來源之免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區與人IgG恆定區有效連接(參見例如屬於Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)，獲得嵌合型重鏈及嵌合型輕鏈來製備。在一些實施例中，本發明之嵌合抗體包含之恆定區可選自任何人IgG亞型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，較佳IgG1。
在一些實施例中，本發明之嵌合B7H3抗體可由嵌合型輕鏈與嵌合型重鏈表現質體「混合及匹配」轉染表現細胞獲得，此類「混合及匹配」之抗體與B7H3之結合可使用上述結合測定及其他習知結合測定(例如，ELISA)來進行測試。
本發明所述之人源化抗體，可以使用此項技術中已知之方法將鼠源CDR區插入人類生殖系構架區。參見Winter等人的美國專利第5,225,539號及Queen等人的美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號。
在一些實施例中，在本發明之藥物結合物、組合物、用途或方法中使用之抗體的CDR序列包括抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 (簡稱WBP301088)之CDR序列。在一些實施例中，在本發明之藥物結合物、組合物、用途或方法中使用之抗體的CDR序列包括抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320之CDR序列。在一些實施例中，在本發明之藥物結合物、組合物或用途中使用之抗體的可變區序列包括來自抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320或W301088-1.145.16-xIgG1KV320之可變區序列。在一些實施例中，在本發明之藥物結合物、組合物、用途或方法中使用之抗體之胺基酸序列包括來自抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320或W301088-1.145.16-xIgG1KV320之全長胺基酸序列。
本發明所述之抗B7H3抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320或其抗原結合片段參考實施例中之描述製備。在一些實施例中，在本發明之藥物結合物、組合物、用途或方法中使用之抗體之CDR序列包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3所示之HCDR1、HCDR2及HCDR3，及包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示之LCDR1、LCDR2及LCDR3。在一些實施例中，在本發明之藥物結合物、組合物或用途中使用之抗體之可變區序列包括胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示之重鏈可變區，及胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示之輕鏈可變區。在一些實施例中，在本發明之藥物結合物、組合物、用途或方法中使用之抗體包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 14所示之重鏈，及胺基酸序列如SEQ ID NO: 15所示之輕鏈。
本發明所述之抗B7H3抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 (簡稱WBP301088)或其抗原結合片段參考實施例中所述製備。在一些實施例中，在本發明之藥物結合物、組合物、用途或方法中使用之抗體之CDR序列包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3所示之HCDR1、HCDR2及HCDR3，及包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示之LCDR1、LCDR2及LCDR3。在一些方案中，在本發明之藥物結合物、組合物或用途中使用之抗體之可變區序列包括胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示之重鏈可化變區，及胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示之輕鏈可變區。在一些實施例中，在本發明之藥物結合物、組合物、用途或方法中使用之抗體包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 12所示之重鏈，及胺基酸序列如SEQ ID NO: 13所示之輕鏈。
本發明嵌合抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320及人源化抗體W301088-1.145.16-z3-pl-ulgGlKV320之胺基酸序列如下所示。在一些實施例中，本發明抗體CDR之編號方法為：Kabat+Chothia組合編號。 W301088-1.145.16-xlgG1KV320胺基酸序列(下劃線部分為CDR) 重鏈可變區VH SEQ ID NO: 8 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT DYSITGDYAWNWIRQFPGNKLEWMG YISYSGSTSYNPSLQSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTSEDTATYFCAR SLGRRWYFVVWGAGTTVTVSA HCDR1: DYSITGDYAWN(SEQ ID NO:1) HCDR2: YISYSGSTSYNPSLQS(SEQ ID NO:2) HCDR3: SLGRRWYFVV(SEQ ID NO:3) 輕鏈可變區VL SEQ ID NO: 9 DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSC KSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY FASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDL TDYFC QQHYSAPWTFGGGTKLEIK LCDR1: KSSQSLLNSSNQKNYLA(SEQ ID NO:7) LCDR2: FASTRES(SEQ ID NO:5) LCDR3: QQHYSAPWT(SEQ ID NO:6) 重鏈SEQ ID NO: 14 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT DYSITGDYAWNWIRQFPGNKLEWMG YISYSGSTSYNPSLQSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTSEDTATYFCAR SLGRRWYFVVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 輕鏈SEQ ID NO: 15 DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSC KSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY FASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLTDYFC QQHYSAPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC W301088-1.145.16-z3-pl-ulgG1KV320胺基酸序列(下劃線部分為CDR) 重鏈可變區VH SEQ ID NO: 10 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVT DYSITGDYAWNWIRQHPGKGLEWIG YISYSGSTSYNPSLQSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCAR SLGRRWYFVVWGQGTTVTVSS HCDR1: DYSITGDYAWN(SEQ ID NO:1) HCDR2: YISYSGSTSYNPSLQS(SEQ ID NO:2) HCDR3: SLGRRWYFVV(SEQ ID NO:3) 輕鏈可變區VL SEQ ID NO: 11 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLLQSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIY FASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQHYSAPWTFGGGTKVEIK LCDR1: KSSQSLLQSSNQKNYLA(SEQ ID NO:4) LCDR2: FASTRES(SEQ ID NO:5) LCDR3: QQHYSAPWT(SEQ ID NO:6) 重鏈SEQ ID NO: 12 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTDYSITGDYAWNWIRQHPGKGLEWIGYISYSGSTSYNPSLQSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARSLGRRWYFVVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 輕鏈SEQ ID NO: 13 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLQSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSAPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
本文所揭示之抗體或其抗原結合部分具有特定功能特徵或特性。在一些實施例中，抗體(包括嵌合抗體及人源化抗體)具有以下一或多個特性： (a)以高親和力(例如，藉由FACS量測小於2 nM)特異性結合人類4IgB7H3表現細胞； (b)與人4IgB7H3相比，與人2IgB7H3結合之親和力顯著降低，與2IgB7H3及4IgB7H3結合之抗體親和力之間的差異顯著； (c)特異性結合cyno B7H3，親和力高(例如藉由FACS量測小於5 nM)，優於基準抗體；及 (d)表現B7H3之癌細胞對該抗體表現出良好之內化能力。 醫藥組合物及醫藥調配物
在又另一態樣中，本發明提供了一種醫藥組合物，其包含如本文所述之抗體-藥物結合物、其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 應理解，本發明提供之抗體-藥物結合物或、其醫藥學上可接受之鹽，或其醫藥組合物可以整合調配物中合適之載劑、賦形劑及其他試劑以聯合給藥，從而提供改善的轉移、遞送、耐受等。
術語「醫藥組合物」係指如下調配物，其允許包含在其中的活性成分以生物學活性有效之形式存在，並且不包含對投與該調配物之個體具有不可接受之毒性之另外的成分。
可以藉由將具有所需純度之本發明之抗B7H3抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種視情況之醫藥輔料( Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A.編輯(1980))混合來製備包含本文所述之抗B7H3抗體之醫藥調配物，較佳地為水溶液或凍乾調配物之形式。
本發明之醫藥組合物或調配物亦可以包含一或多種其他活性成分，該等活性成分係被治療之特定適應症所需的，較佳具有不會不利地影響彼此之互補活性的活性成分。在一些實施例中，其他活性成分為化療劑、免疫檢查點抑制劑、細胞生長抑制劑、抗生素或已知的各種抗腫瘤或抗癌劑，該等活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物亦包含編碼抗B7H3抗體之聚核苷酸之組合物。
在又另一態樣中，本發明提供了一種藥物組合，其包含如本文所述之抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽或本文所述之醫藥組合物，以及一或多種另外的治療劑。
在又另一態樣中，本發明提供了一種套組，其包括如本文所述之抗體-藥物結合物、其醫藥學上可接受之鹽或本文所述之醫藥組合物，較佳其進一步包括給藥裝置。 醫藥用途
在又另一態樣中，本發明提供了如本文所述之抗體-藥物結合物、其醫藥學上可接受之鹽或如本文所述之醫藥組合物在製備用於治療及/或預防B7H3介導之疾病或病症之藥物中之用途，較佳地，該疾病或病症為癌症。
在又另一態樣中，本發明提供了如本文所述之抗體-藥物結合物、其醫藥學上可接受之鹽或如本文所述之醫藥組合物用於治療及/或預防B7H3介導之疾病或病症之用途，較佳地，該疾病或病症為癌症。
在又另一態樣中，本發明提供了一種治療及/或預防B7H3介導之疾病或病症之方法，其包括向有需要之個體投與如本文所述之抗體-藥物結合物、其醫藥學上可接受之鹽或如本文所述之醫藥組合物，較佳地，該疾病或病症為癌症。
在又另一態樣中，本發明提供了如本文所述之抗體-藥物結合物、其醫藥學上可接受之鹽或醫藥組合物，其用於治療及/或預防B7H3介導之疾病或病症，較佳地，該疾病或病症為癌症。
在一些實施例中，本發明所述之癌症選自乳癌、神經腫瘤、黑色素瘤、肺癌、頭頸癌、結直腸癌、胰臟癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膠質母細胞瘤、食管癌、腎細胞癌、子宮內膜癌、皮膚癌、睾丸癌，甲狀腺癌、尿路上皮癌、淋巴瘤(諸如非霍奇金淋巴瘤)、慢性淋巴細胞白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤及多發性骨髓瘤。
在又另一態樣中，本發明提供了一種藥物組合，其包含如本文所述之抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽或本文所述之醫藥組合物，以及一或多種另外的治療劑。
在又另一態樣中，本發明提供了一種套組，其包括如本文所述之抗體-藥物結合物、或本文所述之醫藥組合物。
在一些實施例中，本發明給藥方式包括但不限於口服、靜脈內、皮下、肌內、動脈內、關節內(例如在關節炎關節中)、藉由吸入、噴霧劑遞送或腫瘤內給予等。
在一些實施例中，本發明提供了向個體聯合投與治療有效量之一或多種療法(例如治療方式及/或其他治療劑)。在一些實施例中，該等療法包括手術治療及/或放射療法。
在一些實施例中，本發明提供之方法或用途亦包括向個體投與一或多種療法(例如治療方式及/或其他治療劑)。可以單獨或與療法中之其他治療劑組合投與本發明之抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽。例如，可以與至少一種另外之治療劑共投與。
本申請所述之抗體-藥物結合物可以具有對腫瘤細胞之活體外增殖的抑制活性。該抑制活性可為：本申請之藥物結合物加入腫瘤細胞之培養基中，相比於加入陰性對照或者對照藥物，該等腫瘤細胞的細胞增殖能力下降1%以上、2%以上、4%以上、5%以上、8%以上、10%以上、15%以上、18%以上、20%以上、25%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上。例如，該抑制活性可以是對於腫瘤細胞之IC50值(nM)可以為10000nM以下、5000nM以下、4000nM以下、3000nM以下、2000nM以下、1000nM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、150nM以下、120nM以下、110nM以下、100nM以下、99nM以下、98nM以下、97nM以下、95nM以下、90nM以下、80nM以下、75nM以下、70nM以下、65nM以下、62nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、25nM以下、23nM以下、22nM以下、20nM以下、19nM以下、18nM以下、18.5nM以下、17nM以下、15nM以下、12nM以下、10nM以下、9nM以下、8.5nM以下、7nM以下、6.7nM以下、6nM以下、5.9nM以下、5.5nM以下、5.0nM以下、4.8nM以下、4.5nM以下、4.4nM以下、4nM以下、3.5nM以下、3nM以下、2.5nM以下、2nM以下、1.5nM以下、1.0nM以下、0.5nM以下、0.3nM以下、0.29nM以下、0.25nM以下、0.21nM以下、0.20nM以下、0.18nM以下、0.17nM以下、0.15nM以下、0.12nM以下、0.10nM以下、0.09nM以下、0.08nM以下、0.07nM以下、0.06nM以下、0.05nM以下、0.04nM以下、0.03nM以下、0.02nM以下或0.01 nM以下。例如，該等腫瘤細胞可以包括但不限於實體瘤細胞，例如該等腫瘤細胞包括但不限肺癌細胞，例如該等腫瘤細胞可以包括但不限於肺癌細胞Calu-6。
本申請所述之抗體-藥物結合物可以具有活體內抑瘤效果。該抑瘤效果可為：本申請之抗體-藥物結合物投與於動物，相比於加入陰性對照或者對照藥物，該動物之腫瘤在1天、3天、5天、7天、14天、20天、21天或30天之體積減少1%以上、2%以上、4%以上、5%以上、8%以上、10%以上、15%以上、18%以上、20%以上、25%以上、40%以上、50%以上、55%以上、60%以上、70%以上、73%以上、75%以上、80%以上、90%以上、或95%以上，或者相比於投與陰性對照或者對照藥物，該動物之腫瘤在1天、3天、5天、7天、14天、20天、21天或30天之體積減少1.1倍以上，1.3倍以上，1.5倍以上，兩倍以上，三倍以上，五倍以上，十倍以上，二十倍以上，二十二倍以上，三十倍以上，五十倍以上，一百倍以上，五百倍以上，一千倍以上，或一千五百倍以上。該動物可以包括但不限於哺乳動物，例如該動物可以包括但不限於貓、狗、馬、豬、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠、猴或人。該投與可以包括但不限於口服、靜脈注射、靜脈滴注、腹腔注射、或局部給藥。例如，該等腫瘤細胞可以包括但不限於實體瘤細胞，例如該等腫瘤細胞包括但不限肺癌細胞、黑色素瘤細胞、腦癌細胞、前列腺癌細胞，例如該等腫瘤細胞可以包括但不限於肺癌細胞Calu-6、黑色素瘤細胞A375、腦癌細胞U87、前列腺癌細胞PC-3。
本發明包括所敍述特定實施例之所有組合。本發明之進一步實施例及可應用性的完整範疇將自下文所提供之詳細描述變得顯而易見。然而，應理解，儘管詳細描述及特定實施例指示本發明之較佳實施例，但僅以說明之方式提供此等描述及實施例，因為本發明之精神及範疇內之各種改變及修改將自此詳細描述對熟悉此項技術者變得顯而易見。出於所有目的，包括引文在內之本文所引用的所有揭示內容、專利及專利申請將以引用之方式全部併入本文。 實例
提供以下例以證明並進一步解釋本發明之一些較佳實施例及態樣，不應被解釋為限制其範疇。 材料及方法：表1. 市售材料之資訊
材料 供應商 目錄號
MCF7細胞 ATCC HTB-22
CHOK1細胞 ATCC CTL-61
Expi293™表現系統套組 Invitrogen A14635
Expi293F™表現培養基 Invitrogen A1435101
Flp-In™-CHO細胞株 Invitrogen R75807
TMB單一溶液 Invitrogen 002023
Lipofectamine™ 2000轉染試劑 Invitrogen 11668027
FreeStyle™ CHO表現培養基 Gibco 12651014
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Calcein AM Invitrogen C3099
pHrodo iFL Red STP Invitrogen P36011
NuPAGE4%-12% Bis-Tris凝膠 Invitrogen NP0322BOX
10×PBS Invitrogen AM9624
RPMI培養基1640(1×) Gibco 22400089
0.25%胰蛋白酶-EDTA(1×) Gibco 25200072
FBS ExCell Bio FND500
4% PFA DING GUO AR-0211
BSA BOVOGEN BSAS 1.0
DPBS CORNING 21-031-CVC
Ni管柱 Cytiva 173712
蛋白質A管柱 Cytiva 175438
TSKgel G3000SWXL管柱 Tosoh 0008541
山羊抗人IgG-Fc-HRP Bethyl A80-304P
山羊抗小鼠IgG-Fc-HRP Bethyl A90-231P
山羊抗小鼠IgG1 Bethyl A90-205A
山羊抗小鼠IgG2a Bethyl A90-207A
山羊抗小鼠IgG2b Bethyl A90-209A
山羊抗小鼠IgG3 Bethyl A90-211A
山羊抗小鼠IgG-Fc Alexa 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-164
Alexa 647山羊抗人抗體 Jackson ImmunoResearch 109-605-098
山羊抗小鼠IgG Fc PE Jackson ImmunoResearch 115-115-164
山羊抗人IgG Fc PE Jackson ImmunoResearch 109-115-098
抗人Fc IgG Jackson ImmunoResearch 109-005-098
抗小鼠Fc IgG SouthernBiotech 1013-01
山羊抗小鼠κ輕鏈HRP Southern Biotech A90-119P
山羊抗小鼠λ輕鏈HRP Southern Biotech A90-121P
F(ab')2山羊抗人IgG-Fc Jackson ImmunoResearch 109-006-098
F(ab')2-山羊抗小鼠IgG-Fc Jackson ImmunoResearch 115-005-064
人B7-H3/CD276蛋白質，His標籤(2IgB7H3) ACROBiosystems B73-H52E2
食蟹猴B7-H3/CD276蛋白質，His標籤 ACROBiosystems B73-C52Ha
S系列感測器晶片CM5 Cytiva 29-1496-03
胺基結合套組 Cytiva BR100050
10×HBS-EP+ Cytiva BR100669
樣本偵測方法
1. ADC DAR 值分析方法 – HIC-HPLC( 疏水層析法 )高效液相層析儀：Waters e2965高效液相層析系統。 層析管柱：MabPac™ HIC-Butyl 5μm 4.6×100mm (製造商：Thermo)； 移動相A：1.5 M (NH4) 2SO 4+ 50 mM K 2HPO 4(pH 7.0)； 移動相B：50 mM K 2HPO 4(pH 7.0)/異丙醇(75:25 V/V)； 按照以下溶離程序進行溶離，
時間 移動相B
0-2 min 0%-10%
2-22 min 10%-65%
22-24 min 65%-100%
24-26 min 100%-0%
26-30 min 0%
偵測條件：設置移動相流速為1ml/min，偵測波長為280nm，管柱溫度30℃。
2. SEC 純度分析 – SEC-HPLC( 分子排阻層析法 )高效液相層析儀：1260 Agilent液相層析儀。 層析管柱：Waters Xbridge BEH200 SEC (7.8×300 mm, 3.5 μm) 移動相：50mM NaH 2PO 4+ 200mM精胺酸(pH 6.80) +10% 異丙醇
時間 移動相
0-30 min 100%
偵測條件：設置移動相流速為0.5ml/min，偵測波長為280nm，管柱溫度30℃。 實例 1. 抗 B7H3 抗體之產生及 表徵 1.1 抗原、基準抗體及細胞株之製備 1.1.1 抗原之產生
首先對編碼人4IgB7H3胞外結構域之胺基酸序列(Uniprot ID：Q5ZPR3，胺基酸29-461)之核苷酸序列進行密碼子最佳化以用於哺乳動物表現，然後由Sangon Biotech (上海，中國)合成。將該等DNA段次選殖至在C端具有6xHis之pcDNA3.3表現載劑中，然後將其轉染至Expi293F細胞(Invitrogen，A14635)中。溫育五天後，使用Ni管柱(Cytiva，173712)純化上清液。將溶離之蛋白質經由透析袋(Spectrum-888-10987，MWCO 3.5kDa)透析至PBS中。藉由在NanoDrop裝置上280nm處之吸光度確定蛋白質濃度。將2μg純化之蛋白質在含有及不含有還原劑之SDS-PAGE凝膠(Invitrogen)上電泳。利用TSKgel G3000SWXL體積排阻層析管柱(Tosoh，008541)，藉由HPLC-SEC定量純化之蛋白質的純度。將純化之蛋白質保存於-80℃下。人2IgB7H3購自ACRO (目錄號B73-H52E2)；食蟹猴B7H3購自ACRO(目錄號B73-C52Ha)。 1.1.2 基準抗體之產生
抗B7H3抗體依布妥組單抗(Enoblituzumab)(MacroGenics，其輕鏈及重鏈胺基酸序列為US20120294796A1中之SEQ ID NO：117、119)用作基準抗體。編碼抗體之可變結構域之核酸序列首先進行密碼子最佳化以用於哺乳動物表現，然後由Sangon Biotech (上海，中國)合成。然後將DNA段次選殖到具有人IgG1之恆定區之修飾之pcDNA3.4表現載劑中。將含有VH及VL基因之質體共轉染至Expi293F細胞(Invitrogen，A14635)中。溫育五天後，使用蛋白質A管柱(Cytiva，175438)純化上清液。將溶離之蛋白質經由透析袋(Spectrum，888-10987)透析至PBS中。藉由在NanoDrop裝置上280nm處之吸光度確定蛋白質濃度。將2μg純化之蛋白質在含有及不含有還原劑之SDS-PAGE凝膠(Invitrogen)上電泳。利用TSKgel G3000SWXL體積排阻層析管柱(Tosoh，008541)，藉由HPLC-SEC定量純化之蛋白質的純度。將純化之抗體保存於-80℃下。 1.1.3 穩定之細胞株 / 細胞池之建立
產生表現人4IgB7H3之細胞株。簡言之，根據製造商之方案，使用Lipofectamine 2000轉染套組(Invitrogen，11668027)，用含有全長4IgB7H3之pcDNA3.3表現載劑轉染CHOK1細胞。在轉染後48小時，將細胞傳代培養至T75燒瓶中之選擇性培養基(含有10% FBS及15μg/mL殺稻瘟菌素之F12-K)中。選擇兩次或三次傳代後，藉由殺稻瘟菌素選擇及有限稀釋獲得人4IgB7H3穩定表現之細胞株(W3XX088-CHOK1.hPro1.2A5)，並使用抗B7H3抗體藉由FACS測定表現量。
產生表現食蟹猴B7H3之細胞池。簡言之，根據製造商之方案，使用Lipofectamine 2000轉染套組(Invitrogen，11668027)，用含有全長食蟹猴B7H3之pcDNA5/pOG44表現載劑轉染FlipinCHO細胞。在轉染後48小時，將細胞傳代培養至T75燒瓶中之選擇性培養基(含有10% FBS及600μg/mL潮黴素B之F12)中。選擇兩次或三次傳代後，藉由潮黴素B選擇及BD FACSMelody™細胞分選獲得穩定地高表現食蟹猴B7H3之細胞池(WBP3XX088-FlpinCHO.cPro1.pool)。 1.2 抗體之產生 1.2.1 動物免疫
用實例1.1.3之編碼人全長4IgB7H3之DNA質體免疫6週齡至8週齡之4隻Balb/c小鼠，每隻200μg至400μg。佐劑混合物包括Adju-Phos、CpG-ODN及GM-CSF。每隔一週經由皮下、肌內及流體動力學尾靜脈注射動物一次。在第三次注射後(第1次取血)及第五次注射後(第2次取血)自小鼠取血。藉由ELISA及FACS量測血清力價。
ELISA測定法用於量測針對4IgB7H3抗原之血清抗體力價。用100μL His標籤以0.5μg/mL包被盤(Nunc)，在4℃下過夜，然後用封閉緩衝液(2% BSA之PBS溶液)在環境溫度下封閉1小時。然後洗滌該盤，並在環境溫度下與1μg/mL抗原溫育1小時。洗滌後，小鼠血清自1:100稀釋度開始在封閉緩衝液中以1:3系列稀釋，加入培養盤中，並在環境溫度下溫育2小時。然後洗滌該盤，隨後與第二抗體，亦即，山羊抗小鼠IgG-Fc-HRP(Bethyl，A90-231P)溫育1小時。洗滌後，加入TMB受質，並用2M HCl終止相互作用。使用微盤讀取器(Molecular Device)讀取450nm處之吸光度。在2倍背景下測定血清力價。 表2. 藉由ELISA對結合人4IgB7H3之小鼠血清進行血清力價測試
抗體力價 小鼠#1 小鼠#2 小鼠#3 小鼠#4
第2次取血之血清 218700 1968300 656100 1968300
第1次取血之血清 218700 218700 656100 218700
取血前之血清 ＜100 ＜100 ＜100 ＜100
FACS測定法用於量測針對4IgB7H3抗原之血清抗體力價。簡言之，將實例1.1.3的經工程改造之表現B7H3之細胞以1×10 5個細胞/孔之密度接種至96孔U形底盤中，在4℃下以1500rpm離心4分鐘，然後去除上清液。將小鼠血清自1:100稀釋度開始以1:3系列稀釋在1×PBS/1%BSA中，以再懸浮細胞，並在4℃下溫育1小時。用180μL 1×PBS/1%BSA洗滌細胞兩次。將第二抗體山羊抗小鼠IgG-Fc Alexa 647 (Jackson，109-605-098)添加至再懸浮細胞中並在4℃下避光溫育30分鐘，然後用180μL 1×PBS/1%BSA洗滌。最後，將細胞再懸浮於100μL 1×PBS/1%BSA中，並藉由FACS (BD Canto II)量測螢光強度，並藉由FlowJo版本軟體分析。在2倍背景下測定血清力價。 表3. 藉由FACS對表現人4IgB7H3之細胞株之結合進行血清力價測試
抗體力價 小鼠#1 小鼠#2 小鼠#3 小鼠#4
第2次取血之血清 218700 1968300 1968300 接近1968300
當血清力價足夠高時，在與骨髓瘤細胞融合前用400μg實例1.1.3之編碼人全長4IgB7H3之DNA質體經由流體動力學尾靜脈及4×10 6MCF-7細胞經由足墊及皮下進行最後一次增強免疫。收集淋巴結及脾用於細胞融合。 1.2.2 雜交瘤產生
將來自實例1.2.1之免疫小鼠之淋巴結及脾均質化並過濾以去除血塊及細胞碎片。收集呈對數生長之Sp2/0骨髓瘤細胞並離心。按照習知的電融合程序，在電融合溶液中以1:1之比例將免疫小鼠之淋巴結及脾均質化獲得的B細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞融合。將融合的細胞懸浮在補充有20% FBS及1X HAT之DMEM培養基中，然後轉移至96孔盤(CORNING)中。將融合的細胞在設定為37℃、5% CO 2之培養箱中培養10天至14天。 1.2.3 抗體篩選
第一次篩選：基於細胞之ELISA測定法用作第一次篩選以測試雜交瘤上清液與人4IgB7H3之結合。簡言之，將實例1.1.3之人4IgB7H3轉染之CHOK1細胞株以5×10 3個細胞/孔之密度接種於96孔盤(CORNING)中，然後在設定為37℃、5% CO 2之培養箱中保持2天。然後洗滌該盤，並在環境溫度下與雜交瘤上清液溫育1小時。然後洗滌該盤，隨後與第二抗體山羊抗小鼠IgG-Fc-HRP (Bethyl，A90-231P)溫育1小時。洗滌後，加入TMB受質，並用2M HCl終止相互作用。使用微盤讀取器(Molecular Device)讀取450nm處之吸光度。
第二次篩選：為了證實雜交瘤上清液與人及食蟹猴抗原之結合，進行FACS。親本CHOK1細胞株及實例1.1.3之4IgB7H3轉染之CHOK1細胞株用CellTrace染料(分別為Violet及FarRed)染色，而實例1.1.3之B7H3轉染之FlipinCHO細胞池不用染料製備。在環境溫度下溫育15分鐘並洗滌後，將三種類型之細胞等量混合至1×10 6個細胞/mL。將三種細胞混合物以1×10 5個細胞/孔之密度轉移到96孔U形底盤(BD)中。然後將雜交瘤上清液轉移至盤，並在4℃下溫育1小時。洗滌後，加入第二抗體，亦即，山羊抗小鼠IgG Fc PE (Jackson，115-115-164)並在4℃下與細胞避光溫育0.5小時。然後洗滌細胞，並在藉由流動式細胞測量術分析之前再懸浮於1×PBS/1% BSA中。
為了測試雜交瘤上清液與人2IgB7H3之結合，使用傳統ELISA測定法。在環境溫度下，用100μL/孔之人2IgB7H3(0.2μg/mL)預包被盤，保持1小時。用200μL/孔之1×PBS/2% BSA封閉1小時後，用1×PBST將盤洗滌3次。將雜交瘤上清液以100μL/孔之體積加入至盤中，並在環境溫度下溫育2小時。用1×PBST將盤洗滌3次後，將100μL/孔之山羊抗小鼠IgG-Fc HRP (Bethyl，A90-231P)加入至盤中，並在環境溫度下溫育1小時。洗滌6次後，藉由將TMB受質以100μL/孔加入盤中持續5分鐘至10分鐘來使顏色顯色，然後藉由加入100μL/孔之2M HCl使反應停止。使用微盤讀取器讀取450nm處之吸光度。
藉由SPR進一步證實藉由FACS篩選之選定的陽性細胞株。SPR允許即時、無標記地偵測生物分子相互作用。當偏振光入射至兩個介質之間的界面處之導電表面時，會發生SPR。其會產生稱為電漿子之電子電荷密度波，以與感測器表面質量成比例之特定角度(稱為共振角)降低反射光之強度。使用Biacore 8K對上清液與人4IgB7H3之結合分級。藉由在注射至通道前立即混合400mM EDC及100mM NHS (GE)來製備活化劑。用活化劑使CM5感測器晶片活化，保持420秒。然後以10μL/min之流速將山羊抗小鼠Fc IgG (30μg/mL，在10mM NaAc中，pH 4.5)注射至通道，保持420秒。用1M乙醇胺-HCl將晶片去活化。將上清液以10μL/min之流速注射至通道，保持30秒。將200nM人4IgB7H3之分析物以30μL/min之流速注射至通道，保持120秒之結合期，隨後300秒之解離。在解離期後注射甘胺酸(10mM，pH 1.5)，作為再生緩衝液。將感測器圖譜與參考通道及緩衝液通道相減。然後用1:1之Langmuir結合模型對數據進行擬合。
pHrodo iFL染料可以與生物分子(諸如抗體)結合，並且僅當在存在於酸性環境(諸如細胞溶酶體及核內體)中時才變成高度螢光。其使得能夠在活細胞測定中偵測所結合之生物分子。用pHrodo iFL Red STP酯胺反應性染料標記AffiniPure F(ab') 2片段山羊抗人IgG Fcγ及抗小鼠IgG Fcγ，並根據製造商說明書藉由Zeba Spin脫鹽管柱純化。將表現人全長B7H3之MCF-7細胞(2×10 4個細胞/孔)接種至用8μg/mL聚-D-離胺酸預包的之96孔透明黑色底盤中。細胞在設定為37 oC、5% CO 2之培養箱中生長過夜。第二天，將WBP301088-1陽性細胞株上清液以100μL之體積加入至相應的孔中。將細胞在設定為37 oC、5% CO 2之培養箱中溫育0.5小時。人及小鼠IgG1同型抗體用作陰性對照。以100μL/孔之體積加入50nM pHrodo iFL Red/F(ab') 2山羊抗小鼠或抗人IgG Fcγ結合物(用完全培養基稀釋)。然後將盤在設定為37 oC、5% CO 2之培養箱中避光溫育5小時。溫育後，棄去上清液。用完全培養基洗滌盤。將混合染料溶液(1μg/mL Hoechst 33342及0.5μg/mL在DPBS中稀釋之Calcein AM)以100μL/孔之體積加入至盤中，並在環境溫度下保持15分鐘。溫育後，棄去染料溶液，並用1×PBS/1% BSA將盤洗滌一次。藉由Perkin Elmer Operetta CLS高含量分析系統讀取及分析MCF-7細胞之螢光強度。
在初步篩選中測試總共8460個孔，在24孔盤中選擇279個雜交瘤並擴增。在第二次篩選中，使用來自24孔盤之上清液來證實針對人4IgB7H3及食蟹猴B7H3之強結合、針對人2IgB7H3之弱結合以及對MCF-7之強內化活性。基於第二次篩選結果，選擇WBP301088-1.145雜交瘤進行次選殖。 1.2.4 抗體次選殖
使用實例1.2.3選定之陽性雜交瘤細胞進行次選殖。對呈對數生長之細胞計數，並加入1.5mL半固體HAT培養基中。將細胞在渦旋振盪器中輕輕混合5秒至10秒，然後接種在6孔盤(CORNING)中。將盤在設定為37℃、5% CO 2之培養箱中保持7天至8天。挑取每個可見的單菌落至96孔盤(CORNING)中，此等盤具有補充有10% FBS之DMEM培養基。2天至3天後，收集細胞上清液，並使用如上所述之抗體篩選方案，藉由基於細胞之ELISA (人4IgB7H3)、習知ELISA (人2IgB7H3)篩選。在藉由FACS使用表現人4IgB7H3及食蟹猴B7H3之細胞對抗體次選殖進行確認性篩選後，收集選定之單陽性殖株之培養上清液，並純化抗體以供進一步表徵。在次選殖篩選及確認性篩選後獲得W301088-1.145.16雜交瘤殖株。 1.2.5 抗體分型
在96孔高結合盤(Nunc)中進行ELISA分型。每孔分別用2μg/mL捕獲抗體山羊抗小鼠IgG1 (Bethyl, A90-205A)、山羊抗小鼠IgG2a (Bethyl, A90-207A)、山羊抗小鼠IgG2b (Bethyl, A90-209A)、山羊抗小鼠IgG3 (Bethyl, A90-211A)包被，在4℃下過夜，並用1×PBS/2% BSA封閉。將實例1.2.4之雜交瘤上清液在包被的孔中溫育，並使用過氧化物酶結合之山羊抗小鼠κ/λ輕鏈抗體量測抗體與固定在盤上的捕獲抗體之特異性結合。藉由加入TMB受質偵測HRP信號，12分鐘後使用2M HCl終止反應。所有溫育步驟均在環境溫度下進行，並且在各步驟之間用PBS洗滌盤。使用微盤讀取器(Molecular Device)讀取450nm處之吸光度。
W301088-1.145.16殖株之分型結果示於下表(表4)。 表4. W301088-1.145.16殖株之分型結果
殖株編號 同型
W301088-1.145.16 IgG2b，κ
1.2.6 抗體產生
當需要少量純化抗體時，T75燒瓶(CORNING)通常用於進行雜交瘤細胞培養規模之擴大。將單株雜交瘤細胞以5×10 6至1×10 7個細胞/T75燒瓶接至燒瓶。使細胞連續生長約7天-10天，直到細胞生存力達到約30%-40%。收穫培養上清液，並藉由離心去除細胞碎片。將上清液無菌過濾並保存用於抗體純化。 1.2.7 雜交瘤定序
按照TaKaRa MiniBEST通用型RNA提取套組的說明書，首先提取W-301088-1.145.16雜交瘤細胞樣本之總RNA。然後使用來自Clonetech之SMART RACE cDNA擴增套組將RNA轉變為cDNA。然後用30個PCR循環自cDNA擴增VH及VL結構域DNA序列，每個循環在94℃下變性30秒，在60℃下黏著30秒，然後在72℃下伸長30秒。然後將PCR產物次選殖至TA選殖載劑中，送往Biosune Biotech (上海，中國)進行定序。
一旦定序數據證實雜交瘤細胞樣本之單株性，則藉由PCR擴增VH及VL結構域之DNA序列。引子由Sangon Biotech (上海，中國)合成。然後將DNA片段次選殖至具有LALA突變之人IgG1恆定區之pcDNA3.4表現載劑中，然後藉由Tsingke Biotechnology (北京，中國)定序。 1.2.8 IgG 轉變
一旦定序數據證實雜交瘤細胞樣本之單株性，則對編碼VH及VL結構域之胺基酸序列之核苷酸序列進行密碼子最佳化以用於哺乳動物表現，然後由Sangon Biotech (上海，中國)合成經密碼子最佳化之核苷酸序列。然後將DNA片段次選殖至具有L234A/L235A (LALA)突變之人IgG1恆定區之pcDNA3.4表現載劑中。
以此方式，將W301088-1.145.16殖株所產生之抗體轉變成具有LALA突變形式之人IgG1抗體，由此獲得嵌合抗體，命名為抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320。經蛋白質A純化及緩衝液交換後，藉由SDS-PAGE及SEC-HPLC表徵。在還原條件下，該蛋白質在SDS-PAGE上以50kDa及25kDa之表觀分子量遷移，對應於IgG重鏈及輕鏈。純度高於99% (SEC-HPLC)。 表5. 產生之嵌合抗體
抗體名稱 濃度 (mg/mL) 緩衝液 純度 SEC-HPLC(%) 理論分子量
W301088-1.145.16-xIgG1KV320 2.50 PBS 99.64% 147 kDa
1.2.9 抗體之人源化
運行開源軟體ANARCI (Dunbar J及Deane CM，「ANARCI: antigen receptor numbering and receptor classification」，Bioinformatics，2015年；第32卷第5期：第298-300頁)之本地複本以在W301088-1.145.16抗體上分配Kabat編號。根據Dr. Martin網站之定義鑑定CDR (Martin，2018年，出處同上)，並示於表6中。 表6. 根據Dr. Martin抗體資訊學網站定義之CDR範圍
CDR Kabat 前面之殘基 後面之殘基 長度
L1 L24-L34 總是C 總是W 10個至17個殘基
L2 L50-L56 L1後之16個殘基 / 7個殘基
L3 L89-L97 總是C 總是F-G-X-G 7個至11個殘基
H1 H31-H35b 總是C-X-X-X 總是W 10個至12個殘基
H2 H50-H65 通常為L-E-W-G K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A 16個至19個殘基
H3 H95-H102 通常為C-A-R 總是W-G-X-G 3個至25個殘基
表7. W301088-1.145.16抗體之VH及VL胺基酸序列，其中CDR序列加下劃線
抗體ID 胺基酸序列
W301088-1.145.16 VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT DYSITGDYAWNWIRQFPGNKLEWMG YISYSGSTSYNPSLQSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTSEDTATYFCAR SLGRRWYFVVWGAGTTVTVSA (SEQ ID NO: 16)
VL DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSC KSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY FASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLTDYFC QQHYSAPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 17)
表8. W301088-1.145.16抗體之經鑑定之重鏈及輕鏈CDR序列
抗體 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
W301088-1.145.16 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
DYSITGDYAWN YISYSGSTSYNPSLQS SLGRRWYFVV KSSQSLLNSSNQKNYLA FASTRES QQHYSAPWT
將鼠抗體W301088-1.145.16之VH及VL結構域序列分別與IMGT之VH及VL結構域之人類生殖系序列庫比對。選擇相對於W301088-1.145.16抗體之VH/VL結構域序列在框架中具有最小數目胺基酸差異的VH/VL結構域的人類生殖系序列作為VH/VL結構域之人源化模板。IGHV4-31*02與IGHJ6*01之結合及IGKV4-1*01與IGKJ4*01之結合分別係與W301088-1.145.16抗體之VH及VL結構域序列最同源的人類生殖系序列。將W301088-1.145.16抗體之CDR移植至該兩個人類生殖系模板之框架中，以構成生殖系序列。
根據經驗選擇框架中之幾個「回復突變」位置，以將生殖系序列中之胺基酸轉變為其在原始鼠序列中之胺基酸對應物。根據經驗設計一組人源化變體以研究此等選定回復突變位點的不同組合。在VL結構域之16個位置處及VH結構域之20個位置處，生殖系序列不同於原始鼠W301088-1.145.16抗體序列。對於回復突變考慮總共36個不同位點中之14個位點，分別為VH：Q001D、S025T、H040F、K043N、G044K、I048M、V067I、V071R、A085E、V089T、Y091F，VL：I021M、P043S、Y087F。根據經驗設計一組人源化變體以測試這三個回復突變的不同組合。 1.2.10 PTM 去除
掃描人源化變體之VH及VL結構域序列之若干類型的關鍵轉譯後修飾(PTM)位點：CDR中之天冬醯胺脫胺(N-G及N-S)、CDR中之天冬胺酸異構化(D-G)、整個長度上之未配對C及整個長度上之 N-連接糖基化位點(N-X-S/T，其中X可為除P以外之任何胺基酸)。根據經驗設計點突變以去除人源化變體中之此等關鍵PTM位點，以避免PTM修飾之潛在風險。最後，選擇與親本抗體相比不影響表現、結合及熱穩定性之PTM去除抗體。
考慮到鼠源抗體W301088-1.145.16之VL結構域序列含有N-S-S N連接之糖基化位點，因此，設計VL：N027dQ、VL：S027eP及VL：S027fA (根據Kabat編號)三個點突變以去除關鍵PTM位點。其與人源化變體一起藉由 k off分級進行測試。 1.2.11 藉由 SPR 之 k off 分級
在Biacore 8K表面電漿子共振(SPR)設備上執行經過濾上清液之 k off分級。首先以10μL/min之流速用400mM EDC及100mM NHS (GE)將CM5感測器晶片活化，保持420秒。然後以10μL/min之流速將10mM NaAc (pH 4.5)中之30μg/mL抗人Fc IgG (Jackson)注射至通道1至8中，保持420秒。然後以10μL/min之流速用1M乙醇胺-HCl(GE)將晶片去活化，保持420秒。以10μL/min之流速將稀釋之各抗體上清液注射至通道之Fc2。不具有質體轉染之細胞培養物之上清液用作陰性對照，並以10μL/min之流速注射至通道之Fc1。將100nM人4IgB7H3及流動緩衝液以30μL/min之流速依次注射至通道之Fc1-Fc2，保持180秒之結合期，隨後3600秒之解離期。每次運行後注射10mM甘胺酸(pH 1.5)以使晶片再生。藉由Biacore 8K設備附帶之軟體分析感測器圖譜。將樣本之感測器圖譜與參考通道及緩衝液通道相減。然後用1:1之Langmuir結合模型對數據進行擬合。 1.2.12 PTM 去除突變與人源化變體之組合
將實例1.2.11中顯示出最佳 k off速率之PTM去除點突變組合至具有最佳 k off速率逐點誘變之人源化變體中，以構成用於親和力驗證之最終構築體。
根據k off速率，將VL：N027dQ之PTM去除突變與四個選定之人源化突變胺基酸S025T、V071R、Y091F、V089T組合構成最終抗體。將最終抗體稱為W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320。 表9. W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體之重鏈及輕鏈CDR序列
抗體 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
DYSITGDYAWN YISYSGSTSYNPSLQS SLGRRWYFVV KSSQSLL QSSNQKNYLA FASTRES QQHYSAPWT
圖12A至圖12B示出了抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320及抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320之間的VH區及VL區之胺基酸序列比對結果。圖中帶框之胺基酸段係VH區及VL區中之各CDR區。 1.2.13 生產規模之瞬時轉染及純化
使用ExpiFectamine TM瞬時轉染套組，將最終濃度為1μg/mL之質體瞬時轉染至20mL Expi293F細胞，細胞密度為3.0×10 6個/mL，並且細胞生存力超過95%。細胞培養物在加濕平台式振盪器中生長，旋轉速度為150rpm。溫度保持在37℃，而CO 2水準保持在8%。
細胞培養物溫育5天後，收集表現目標抗體之上清液，並過濾，使用GE MabSelect SuRE蛋白質A管柱(Cytiva-175438)純化。所溶離之抗體經由D-Tube透析器Maxi (EMD Millipore 71508，MWCO 3.5kDa)透析至PBS中。藉由在NanoDrop裝置上280nm處之吸光度確定抗體濃度。將2μg純化之抗體樣本在含有及不含有還原劑之SDS-PAGE凝膠(Invitrogen NuPAGE TM4%-12% Bis-Tris蛋白質凝膠)上電泳。利用TSKgel G3000SWXL體積排阻層析管柱(Tosoh 008541)藉由HPLC-SEC定量純化之抗體樣本之純度。將純化之抗體保存在-80℃下。 1.3 抗體之 活體外表徵 1.3.1 SDS-PAGE 及藉由 SEC-HPLC 之純度偵測
將實例1.2之純化之抗體樣本與上樣緩衝液混合，並使用乾燥浴在75℃下加熱10分鐘。樣本上樣後，SDS-PAGE在恆定電壓(200V)下電泳35分鐘。將凝膠染色並用eStain TML1脫色。使用BIO-RAD成像系統獲得SDS-PAGE結果。
結果彙總於下表10中。在還原條件下，該蛋白質在SDS-PAGE上以50kDa及25kDa之表觀分子量遷移，對應於IgG重鏈及輕鏈，而在非還原條件下，以預期之約150kDa帶遷移(圖1)。 1.3.2 藉由 SEC-HPLC 之純度偵測
藉由配有TSKgel G3000SWXL管柱(Tosoh Bioscience-0008541)之Agilent 1260 Infinity II系統(Agilent Technologics TM)偵測實例1.2之抗體之純度。將適當體積之抗體樣本(5μL-100μL)注射至管柱中，並以1mL/min之流速分離20分鐘。運行緩衝液為50mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH 7.0。用280nm波長之UV光偵測峰保留。採用SEC-HPLC分析法將自4.5分鐘至10.5分鐘之所有峰面積積分來分析抗體之純度。操作分析軟體為OpenLab CDS工作站(v2.3.0.443或v2.2.0.484)。
結果彙總於下表10中。W301088-z3-p1抗體經SEC-HPLC偵測之純度高於99% (圖2)。 1.3.3 藉由 DSF 測定之熱穩定性 (T m)
使用QuantStudio® 7 Flex即時PCR系統(Applied Biosystems)研究各抗體之T m(熔融溫度)。將19μL實例1.2之抗體溶液與1μL SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合且轉移至96孔盤(Applied Biosystems)。將該盤用光學黏合劑膜(Applied Biosystems)密封，並以3,000rpm離心5分鐘以去除任何氣泡。以0.9℃/min之速率將盤自26℃加熱至95℃，並收集所得的螢光數據。計算螢光隨不同溫度變化之負導數，將最大值定義為熔融溫度T m。若蛋白質具有多個解摺疊轉變，則報導第一個T m，將其命名為T m1。藉由QuantStudio®即時PCR軟體(v1.3)自動進行數據收集及T m計算。
將W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體之T m值定義為螢光隨不同溫度變化之負導數之最大值，如下表10所列出。數據分佈示於圖3，其中虛線表示T m1值在螢光曲線中之位置。W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體之T m1為70.1℃，表明其具有良好的熱穩定性。 1.3.4 藉由 HIC-HPLC 偵測疏水性
藉由HPLC 1260 infinity II系統(Agilent Technologics TM)用TSKgel butyl-NPR管柱(Tosoh-0042168)偵測實例1.2之抗體之疏水性特性。用PBS緩衝液將抗體樣本稀釋至0.5mg/mL，將20μL稀釋之樣本注射至管柱中，並以0.5mL/min之流速分離61分鐘。運行緩衝液係25mM磷酸鈉，pH 7.0 (緩衝液A)及25mM磷酸鈉、1.5M (NH 4) 2SO 4，pH 7.0 (緩衝液D)。3分鐘至53分鐘之運行梯度為0%至100%緩衝液D。用280nm及230nm波長之UV光偵測峰保留。採用HIC-HPLC分析法將自20分鐘至40分鐘之所有峰面積積分來分析保留時間。操作分析軟體為OpenLab CDS工作站(v2.6.0.691)。
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體之HIC保留時間為23.52分鐘(表10及圖4)，表明其係一種具有良好親水性的抗體。 1.3.5 藉由 DLS 測定擴散相互作用參數 ( k D)
使用DynaPro盤式讀取器III(Wyatt Technology)研究DLS- k D量測結果。在抗體樣本製備過程中，在解凍、過濾及濃縮時記錄樣本之外觀。將抗體樣本濃縮至超過20mg/mL，然後用PBS緩衝液稀釋至2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL及20mg/mL之最終濃度。然後將7.5μL樣本溶液加入至1536孔微盤(Aurora-ABI1-00110A)中。用ClearSeal膜(Hampton Research-HR4-521)密封該盤，並以3,000rpm離心5分鐘，使樣本下降至孔的底部。將每個樣本一式兩份在孔中測試。將盤放入相應位置中，並藉由DYNAMICS操作軟體(v7.8.1.3)進行數據收集。收集每個蛋白質樣本之5次採集值，同時每次採集時間為5s。對於每次量測，確定擴散係數並針對蛋白質濃度作圖。
k D值由DYNAMICS操作軟體(v7.8.1.3)自動計算，結果在表10中示出。數據分佈示於圖5中。W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體在PBS中之 k D為-5.17mL/g，表明其係一種具有高溶解度的抗體。在測定過程中，同時記錄抗體蛋白質之外觀，在解凍並輕輕搖動後觀察到一些顆粒。若將緩衝液換成20mM His、8%蔗糖、0.02% PS80，pH 6.5，則觀察不到顆粒。
上述SDS-PAGE、SEC-HPLC、HIC-HPLC、DSF及DLS結果彙總於表10中。 表10. W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體之分析數據彙總
抗體名稱 藉由SEC-HPLC之純度 產率(mg/L) 分子量 pI HIC保留時間(min) T m(℃) DLS- k D(mL/g)
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 99.26 % 416.0 147 kDa 8.54 23.52 70.1 -5.17
1.3.6 與人 B7H3 之結合 (FACS)
使用FACS來偵測抗體與人B7H3之結合。該方法可以定量分析及鑑定在活細胞表面上表現之特定分子。未標記之細胞用作對照以在偵測前設定臨限值，並且分析超過螢光強度臨限值之每組之百分比變化。表現人全長B7H3之MCF-7細胞(1×10 5個細胞/孔)與各種濃度之抗體(用1×DPBS/1% BSA自50nM至0.0005nM系列稀釋3.16倍)以100μL/孔之體積在設定為4℃之冰箱中溫育1小時。抗人B7H3參考抗體依布妥組單抗(MacroGeneics)用作陽性對照。人IgG1同型抗體用作陰性對照。在用1×DPBS/1% BSA洗滌細胞後，加入Alexa 647山羊抗人抗體(在1×DPBS/1% BSA中以1:500稀釋)。將細胞在設定為4℃之冰箱中避光溫育0.5小時。用流式細胞儀量測細胞之平均螢光強度(MFI)，並用FlowJo進行分析。使用GraphPad Prism 7軟體，藉由四參數非線性回歸分析計算EC 50值。
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體示出與表現B7H3之MCF-7細胞良好結合，EC 50為1.08nM及最大MFI為19900，其與嵌合抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320相當並優於參考抗體依布妥組單抗(MacroGenics)(表11，圖6)。 表11. 對表現人B7H3之細胞MCF-7之FACS結合數據
抗體樣本 MCF-7
EC 50(nM) 最大MFI
W301088-1.145.16-xIgG1KV320 1.16 19800
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 1.08 19900
依布妥組單抗(MacroGenics) 2.49 4644
hIgG1同型 N.A. 47.8
註：N.A. 表示不適用。 1.3.7 與食蟹猴 B7H3 之結合 (FACS)
使用FACS來偵測抗體與食蟹猴B7H3之結合。用食蟹猴B7H3 (W3XX088-FlpinCHO.cProl.pool )(1×10 5個細胞/孔)轉染FlpinCHO細胞，並將經轉染之細胞與各種濃度之抗體(用1×DPBS/1% BSA自50nM至0.0005nM系列稀釋3.16倍)以100μL/孔之體積在設定為4℃之冰箱中溫育1小時。抗人B7H3參考抗體依布妥組單抗(MacroGeneics)用作陽性對照。人IgG1同型抗體用作陰性對照。在用1×DPBS/1% BSA洗滌細胞後，加入Alexa 647山羊抗人抗體(在1×DPBS/1% BSA中以1:500稀釋)。將細胞在設定為4℃之冰箱中避光溫育0.5小時。用流式細胞儀量測細胞之平均螢光強度(MFI)，並用FlowJo進行分析。使用GraphPad Prism 7軟體，藉由四參數非線性回歸分析計算EC 50值。
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體示出以4.68nM之EC 50與食蟹猴轉染之細胞良好結合，其與嵌合抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320相當並優於依布妥組單抗(MacroGenics)(表12，圖7)。 表12. 對食蟹猴B7H3轉染之穩定細胞池之FACS結合數據
抗體樣本 食蟹猴B7H3轉染之穩定細胞池
EC 50(nM) 最大MFI
W301088-1.145.16-xIgG1KV320 5.25 67100
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 4.68 63600
依布妥組單抗(MacroGenics) 9.58 19700
hIgG1同型 N.A. 6.67
註：N.A. 表示不適用。 1.3.8 與人 4IgB7H3 之結合親和力 (SPR)
使用表面電漿子共振(SPR)來測定抗體對人4IgB7H3之親和力。藉由Biacore 8K測定抗體對人4IgB7H3之親和力。藉由在注射至通道前立即混合400mM EDC及100mM NHS(GE)來製備活化劑。用活化劑將CM5感測器晶片活化，保持420秒。然後以10μL/min之流速將山羊抗人Fc IgG(30μg/mL，在10mM NaAc中，pH 4.5)注射至通道，保持420秒。用1M乙醇胺鹽酸將晶片去活化。將稀釋於流動緩衝液(1×HBS-EP+)中之抗體以10μL/min之流速注射至通道，保持30秒。將7種濃度(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、2.125nM及1.563nM)之分析物人4IgB7H3以30μL/min之流速依次注射至通道，保持180秒之結合期，隨後3600秒之解離。在解離期後注射甘胺酸(10mM，pH 1.5)，作為再生緩衝液。
自測試感測器圖譜中減去參考通道及緩衝液通道之感測器圖譜。用1:1結合模型對實驗數據進行擬合。用於計算的人4IgB7H3之分子量為47.8kDa。
藉由Biacore 8K評估軟體附帶之1:1結合模型對實驗數據進行擬合。如表13及圖8A至圖8C所示，W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體示出對人4IgB7H3之高結合親和力。K D值為7.08E-11M，其優於依布妥組單抗(MacroGenics)。 表13. 與人4IgB7H3結合之抗體親和力結果
分析物 抗體 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
人    4IgB7H3 W301088-1.145.16 -xIgG1KV320 6.57E+05 3.39E-05 5.15E-11
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 6.57E+05 4.65E-05 7.08E-11
依布妥組單抗(MacroGenics) 1.24E+05 1.26E-04 1.02E-09
1.3.9 與人 2IgB7H3 之結合親和力 (SPR)
使用表面電漿子共振(SPR)來測定抗體對人2IgB7H3之親和力。藉由Biacore 8K測定抗體對人2IgB7H3之親和力。藉由在注射至通道前立即混合400mM EDC及100mM NHS (GE)來製備活化劑。用活化劑將CM5感測器晶片活化，保持420秒。然後以10μL/min之流速將山羊抗人Fc IgG(30μg/mL，在10mM NaAc中，pH 4.5)注射至通道，保持420秒。用1M乙醇胺鹽酸將晶片去活化。將稀釋於流動緩衝液(1×HBS-EP+)中之抗體以10μL/min之流速注射至通道，保持30秒。將7種濃度(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.625nM及7.813nM)之分析物人2IgB7H3以30μL/min之流速依次注射至通道，保持120秒之結合期，隨後300秒之解離。在解離期後注射甘胺酸(10mM，pH 1.5)，作為再生緩衝液。
自測試感測器圖譜中減去參考通道及緩衝液通道之感測器圖譜。用1:1結合模型對實驗數據進行擬合。用於計算的人2IgB7H3之分子量為25.2kDa。
藉由Biacore 8K評估軟體附帶之1:1結合模型對實驗數據進行擬合。如表14及圖9A至圖9C所示，相比於對人4IgB7H3之結合，W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體示出對人2IgB7H3之較弱結合親和力。K D值為4.64E-08M。 表14. 與人2IgB7H3結合之抗體親和力結果
分析物 抗體 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
人    2IgB7H3 W301088-1.145.16 -xIgG1KV320 2.35E+05 1.36E-02 5.77E-08
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 3.03E+05 1.41E-02 4.64E-08
依布妥組單抗(MacroGenics) 6.44E+04 1.68E-02 2.61E-07
1.3.10 與食蟹猴 B7H3 之結合親和力 (SPR)
使用表面電漿子共振(SPR)來測定抗體對食蟹猴B7H3之親和力。藉由Biacore 8K測定抗體對食蟹猴B7H3之親和力。藉由在注射至通道前立即混合400mM EDC及100mM NHS (GE)來製備活化劑。用活化劑將CM5感測器晶片活化，保持420秒。然後以10μL/min之流速將山羊抗人Fc IgG(30μg/mL，在10mM NaAc中，pH 4.5)注射至通道，保持420秒。用1M乙醇胺鹽酸將晶片去活化。將稀釋於流動緩衝液(1×HBS-EP+)中之抗體以10μL/min之流速注射至通道，保持30秒。將9種濃度(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.563nM、0.781nM、0.391nM及0.196nM)之分析物食蟹猴B7H3以30μL/min之流速依次注射至通道，保持180秒之結合期，隨後3600秒之解離。在解離期後注射甘胺酸(10mM，pH 1.5)，作為再生緩衝液。
自測試感測器圖譜中減去參考通道及緩衝液通道之感測器圖譜。用1:1結合模型對6種分析物濃度(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM及1.563nM)之實驗數據進行擬合。用於計算的食蟹猴B7H3之分子量為49kDa。
藉由Biacore 8K評估軟體附帶之1:1結合模型對實驗數據進行擬合。如表15及圖10A至圖10C所示，W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體示出對食蟹猴B7H3之高結合親和力，其相當於對人4IgB7H3之結合。K D值為5.74E-11M，其優於依布妥組單抗(MacroGenics)。 表15. 與食蟹猴B7H3結合之抗體親和力結果
分析物 抗體 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
食蟹猴B7H3 W301088-1.145.16 -xIgG1KV320 5.21E+05 2.94E-05 5.64E-11
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 5.27E+05 3.02E-05 5.74E-11
依布妥組單抗(MacroGenics) 1.85E+05 8.14E-05 4.41E-10
1.3.11 內化測試 (HCS)
抗體內化由operetta CLS (PerkinElmer)測定，該operetta CLS係一種可以高速及高靈敏度收集及分析樣本圖像之高含量成像及分析系統。將表現人全長B7H3之MCF-7細胞(1.5×10 4個細胞/孔)接種之用8μg/mL聚-D-離胺酸預包被的96孔透明黑色底盤中。在設定為37℃、5% CO 2之培養箱中溫育過夜後，將各種濃度之抗體(用1×DPBS/1% BSA自50nM至0.0005nM系列稀釋3.16倍)以100μL/孔之體積在設定為4℃之冰箱中溫育2小時。抗人B7H3參考抗體依布妥組單抗(MacroGeneics)用作陽性對照。人IgG1同型抗體用作陰性對照。在用1×DPBS/1% BSA洗滌細胞後，加入Alexa 647山羊抗人抗體(在1×DPBS/1% BSA中以1:500稀釋)。將細胞在設定為4℃之冰箱中避光溫育1小時。然後將細胞洗滌一次，並在37℃下在1×DPBS/1% BSA中再懸浮2小時。溫育後，棄去上清液，加入100μL/孔Hoechst 33342 (在1×DPBS中以1:5000稀釋)並在環境溫度下溫育15分鐘。用1×DPBS洗滌細胞後，加入100μL/孔酸洗緩衝液(100mM甘胺酸、150mM NaCl，pH 2.5)，並在設定為4℃之冰箱中溫育5分鐘。用1×DPBS將細胞洗滌一次，並用60μL 4% PFA固定。藉由operetta CLS量測及分析細胞之平均螢光強度(MFI)。使用GraphPad Prism 7軟體，藉由四參數非線性回歸分析計算EC 50值。
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320抗體示出以0.51nM之EC 50被表現B7H3之MCF-7細胞內化，表明了良好的內化能力，其與嵌合抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320相當並優於參考抗體依布妥組單抗(MacroGenics)(表16，圖11)。 表16. 表現人B7H3之細胞MCF-7對抗體之內化
樣本 抗體內化
EC 50(nM) 最大MFI
W301088-1.145.16-xIgG1KV320 0.51 57180
W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 0.44 52315
依布妥組單抗(MacroGenics) 1.95 39777
hIgG1同型 N.A. 21
註：N.A. 表示不適用。 實例 2. 抗體 - 藥物結合物 (ADC) 之製備及與 B7H3 抗原之結合活性
本實例之抗體 -藥物結合物中使用之抗B7H3抗體為W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 (簡稱WBP301088)或W301088-1.145.16-xIgG1KV320。W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 (WBP301088)之重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。 2.1 連接子 - 細胞毒素 ( 連接子 - 有效負載 ) 之製備 2.1.1 連接子 - 有效負載 X1 之製備：
連接子-有效負載X1之製備方案如下所示： 第一步
在氮氣保護下，向27a (5.00 g，43.0 mmol)，NaHCO 3(10.9 g，129 mmol)於DMF(50 mL)中之溶液中逐滴添加溴甲苯(11.0 g，64.6 mmol)，並在25℃反應17小時。TLC (PE/EA= 2/1) (PE係石油醚之縮寫；EA係乙酸乙酯之縮寫)顯示反應完全後，將反應液加入至500 mL水中，用EA (250 mL)萃取兩遍，分液後經飽和氯化鈉水溶液(500 mL)洗滌，無水Na 2SO 4乾燥，濃縮過管柱(PE:EA=3:2)得5.1 g無色液體，收率：57.1%。 第二步
在氮氣保護下，在0℃下，向KI2 (4.00 g，10.9 mmol)，TsOH (800 mg，4.65 mmol)於THF (30 mL)中之溶液中逐滴添加27b (4.50 g，21.8 mmol)於THF (10 mL)中之溶液，並在25℃反應2小時。TLC (PE/EA = 1/2)顯示反應完全後，將反應液加入至200 mL水中，用EA (200 mL)萃取兩次分液，無水Na 2SO 4乾燥，濃縮過管柱(PE/EA=3/2)得白色固體1.56g，收率：26%。 第三步
在氫氣保護下，在0℃下，向27c (800 mg，1.55mmol)於EtOH (8 mL)及EA(8 mL)之混合物中之溶液中加入Pd/C (80 mg)，在0℃攪拌2.5小時。LCMS顯示反應完全。反應液經矽藻土過濾，用EA(200 mL)洗滌濾餅，濃縮後用THF(20 mL)溶解旋乾得白色固體600 mg，收率：91% 第四步
在氮氣保護下，在0℃下，向27d (220mg，0.515mmol)，KI4 (250 mg，0.47mmol)及HATU (214mg，0.56mmol)於DMF (6 mL)中之溶液中加入DIEA (152 mg，1.18 mmol)，並在0℃反應2小時。LCMS顯示反應完全。將反應液加入檸檬酸水溶液(pH = 4)(150 mL)中，過濾，並用175 mL水洗滌濾餅，濾乾，用油泵拉乾得棕色固體260mg，收率：66%。 第五步 在氮氣保護下，在0℃下，向27e (260 mg，0.309 mmol)於二氯甲烷(DCM)(30 mL)中之溶液中逐滴添加二乙胺(8 mL)，並在0℃反應3小時。LCMS顯示反應完全。將反應液加入0℃之石油醚溶液(600 mL)中，有固體析出，靜置待固體吸附於瓶底後，倒出溶液，用油泵拉乾，得棕色固體90mg，收率：47.1%。 第六步
在氮氣保護下，在0℃下，向27f (90 mg，0.13 mmol)，KI-1 (92 mg，0.19 mmol )及DIEA (50 mg，0.39 mmol)於DMF (2.5 mL)中之溶液中加入HATU (74 mg，0.19 mmol)並在0℃反應2小時。LCMS顯示基本反應結束。在0℃下，將反應液加入pH=4之檸檬酸水溶液(30 mL)中，有絮狀固體析出，過濾，經製備板(DCM/MecOH=10/1)得9.2 mg淡黃色固體X1，收率：6%。 MS m/z (ESI)：1074 [M+1] H-NMR (400 MHz，MeOD)：7.65 (d, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.30-7.21(m, 5H), 6.79 (s, 2H), 5.69-5.65 (m, 1 H), 5.57 (d, 1H), 5.43-5.10 (m, 3H), 4.70 (d, 2H), 4.48-4.39 (m, 2H), 4.10-4.05 (m, 1H), 4.01-3.75 (m, 5H),3.46 (t, 2H), 3.22-3.15 (m, 2H), 3.07-3.00 (m, 1H), 2.75 (m, 1H), 2.62 (m, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.37-2.20 (m, 6H), 2.10-2.02 (m, 2H), 2.00-1.92 (m, 2H) 1.68-1.57 (m, 6H), 1.01 (t, 3H) 2.1.2 連接子 - 有效負載 X2 之製備
連接子-有效負載X2之製備方案如下所示： 第一步
將34a (5 g，48.0 mmol)、K 2CO 3(19.9 g，144.0 mmol)溶於DMF(20 mL)中，逐滴添加溴甲苯(12.3 g，72.0 mmol)，在25℃下反應17小時。TLC(PE/EA = 3/1)偵測原料反應完全。將反應液加入水(200 mL)中、用EA (250 mL)萃取分液，用飽和NaCl洗滌，無水Na 2SO 4乾燥後濃縮過管柱(PE:EA = 2:1)得8.7 g無色液體34b，收率93%。MS-ESI: m/z 195.1 [M+H]+。 第二步
將43c (7.3 g，19.8 mmol)、TsOH (1.46 g，8.5 mmol)溶於THF(20 mL)中，氮氣保護並降溫至0℃，逐滴添加34b (7.7 g，39.6 mmol)於THF (10 mL)中之溶液，加完後在0℃反應2小時。TLC (PE/EA = 2/1)顯示原料大部分反應。將反應液倒入100 mL水中，DCM (100 mL)萃取，分液並用飽和NaCl洗滌，無水Na 2SO 4乾燥後過管柱(PE/EA = 1/1)，得3.9 g無色黏狀物34d，收率：39%。MS-ESI: m/z 503.3 [M+H]+。 第三步
在氫氣保護下，在0℃下，向34d (1.9 g，3.78 mmol)於EtOH (100 mL)及EA(100 mL)之混合物中之溶液中加入Pd/C (1 g，10 wt.%)，在0℃反應3 小時。TLC (PE/EA = 2/1)顯示反應完全。反應液經矽藻土過濾，用EA/EtOH (1:1，100 mL×3)洗滌濾餅，濾液濃縮，並用THF (50 mL×3)溶解旋乾並重複三次得1 g灰色固體34e，收率：64%。MS-ESI: m/z 435.2 [M+Na]+。 第四步
在氮氣保護下，0℃下向34e (426 mg，1.03 mmol)，KI4 (500 mg，0.94 mmol)及HATU(429 mg，1.13 mmol)於DMF(20 mL)中之溶液中逐滴添加DIEA (303 mg，2.35 mmol)，加完後在0℃反應2小時。LCMS顯示反應結束。將反應液逐滴添加至300 mL水中，攪拌後靜置5分鐘，過濾，濾餅用DCM/MeOH (10:1，100 mL)之溶液溶解後，乾燥旋乾速度所得溶液，管柱層析(EA:MeOH = 30:1)得600 mg黃色固體34f，收率：77%。MS-ESI: m/z 830.3 [M+H]+。 第五步
在氮氣保護下，在0℃下，向34f (150 mg，0.18 mmol)於DCM(5 mL)中之溶液中逐滴添加二乙胺(5 mL)，並在0℃反應2 小時。LCMS顯示反應完全。將石油醚溶液(100 mL×6)加入反應液中，有固體析出，靜置待固體沈澱後，倒出溶液，再用油泵拉乾，得120 mg白色粉末34g，LCMS顯示產物含量為70%，收率：76%。MS-ESI: m/z 608.3 [M+H]+。 第六步
在氮氣保護下，在0℃下，向34g (60 mg，0.099 mmol)、43h (51 mg，0.108 mmol)及DIEA (32 mg，0.25 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液中加入HATU (45 mg，0.118 mmol)於DMF(1 mL)中之溶液，並在0℃下反應2小時。LCMS顯示原料反應完全。將反應液直接過反相管柱，溶離劑((MeCN/MeOH=1/1)：H2O=60%：40%)，純化得14.8 mg黃色固體X2，收率14%。 MS-ESI: m/z 1062.4 [M+H]+。 1H NMR (400 MHz, 甲醇-d4) δ 7.69 – 7.61 (m, 2H), 7.22 – 7.16 (m, 2H), 7.16 – 7.09 (m, 3H), 6.76 (s, 2H), 5.70 – 5.64 (m, 1H), 5.60 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 5.40 – 5.31 (m, 2H), 5.26 (d, J = 19.0 Hz, 1H), 4.65 – 4.50 (m, 7H), 4.25 – 4.16 (m, 1H), 3.87 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 3.83 – 3.76 (m, 3H), 3.72 (d, J = 17.0 Hz, 2H), 3.44 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.25 – 3.17 (m, 2H), 3.10 – 3.02 (m, 1H), 2.92 – 2.83 (m, 1H), 2.45 – 2.39 (m, 5H), 2.32 – 2.20 (m, 5H), 1.97 – 1.89 (m, 2H), 1.63 – 1.50 (m, 4H), 1.34 – 1.20 (m, 6H), 0.99 (t, J = 7.3 Hz, 3H). 2.1.3 連接子 - 有效負載 X3 之製備
連接子-有效負載X3之製備方案如下所示： 第一步
向含32a (2.00 g，6.6 mmol)，K 2CO 3(1.82 g，13.2 mmol)MeCN(20 mL)中加入溴丙烯(960 mg，7.92 mmol)，在20℃下攪拌5小時。TLC (PE/EA = 1/2)顯示反應結束。將反應液倒入水100 mL中，將pH值調至5，用EA (100 mL)萃取三次，經無水硫酸鈉乾燥，旋乾過管柱純化(PE/EA = 2/1)得1.83 g白色固體32b，收率：81%。 第二步
向含32b (1.38 g，4.02 mmol)之DCM (10 mL)中加入TFA (10 mL)，在25℃下攪拌17小時。TLC (PE/EA = 1/3)顯示反應結束。將反應液旋乾得0.91 g黃色黏狀物32c，收率不計。 第三步
向含32c (910 mg，4.87 mmol)，NaHCO 3(613 mg，7.3 mmol)之DME/H 2O (20 mL/10 mL)中加入41d (1.92 g，4.87 mmol)，在25℃下攪拌3小時。TLC (DCM/MeOH = 1/1)顯示反應結束。將反應液倒入水100mL中，用HC水溶液(1 N)將pH值調至5，用EA (150 mL)萃取兩次，經無水硫酸鈉乾燥，旋乾過管柱純化(DCM/MeOH = 20/1)得1.53 g白色固體32e，收率：67%。MS-ESI: m/z 467.4 [M+H]+。 第四步
含32f (3 g，5.83 mmol)之MeOH (50 mL)中加入Pd/C(600 mg)，在25℃在氫氣下攪拌5小時。TLC (EA)顯示反應結束。將反應液過濾旋乾得1.9 g白色固體32g，收率：77%。 第五步
向含32g (789 mg，1.86 mmol)，KI4 (900 mg，1.69 mmol)，三乙胺(342 mg，3.38 mmol)之DMF (10 mL)中加入HATU (707 mg，1.86 mmol)，在0℃下攪拌3.5小時。TLC (EA)顯示反應結束。將反應液倒入H 2O (80 mL)，用EA (100 mL)萃取兩次，經無水硫酸鈉乾燥，旋乾過管柱純化(EA)得1.186 g白色固體32h，收率：83%。MS-ESI: m/z 842.3 [M+H]+。 第六步
將含32h (1.186 g，1.41 mmol)之DCM/二乙胺(20 mL，20/1)在25℃下攪拌17小時。TLC (DCM/MeOH = 10/1)顯示反應結束。將反應液倒入石油醚(200 mL)中過濾得768 mg白色固體32i，收率：88%。MS-ESI: m/z 620.3 [M+H]+。 第七步
向含32i (676 mg，1.09 mmol)，32e (508 mg，1.09 mmol)，DIEA (423 mg，3.27 mmol)之DMF (10 mL)中加入HATU (414 mg，1.09 mmol)，在20℃下攪拌17小時。TLC (PE/EA = 1/5)顯示反應結束。將反應液倒入水中(30 mL)過濾，濾餅過管柱純化(DCM/MeOH = 50/1)，得到511 mg白色固體32j，收率：44%。MS-ESI: m/z 1068.3 [M+H]+。 第八步
將32j (482 mg，0.451 mmol)於二乙胺/DCM(10 mL，1/5)中之溶液在10℃下攪拌17小時。TLC (EA)顯示反應結束。將反應液倒入PE (300 mL)中，過濾得301 mg白色固體32k，收率不計。 第九步
向含32k (301 mg，0.356 mmol)，Pd(PPh 3) 4(82 mg，0.071 mmol)之THF(5 mL)中加入𠰌啉(93 mg，1.07 mmol)，在25℃下攪拌5小時。LCMS顯示反應結束。將反應液製備得108 mg白色固體32l，收率：38%。MS-ESI: m/z 806.3 [M+H]+。 第十步
向含32l (108 mg，0.134 mmol)，三乙胺(41 mg，0.402 mmol)之THF (2 mL)及DMF (2 mL)中加入溴乙醯溴(27 mg，0.134 mmol)，在0℃下攪拌1小時。TLC (DCM/MeOH = 10/1)顯示反應結束。將反應液直接製備得15 mg白色固體X3，收率：12%。 MS-ESI: m/z 926.3 [M+H]+。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.11 (s, 1H), 8.54 – 8.42 (m, 3H), 8.27 – 8.16 (m, 2H), 7.78 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.61 – 5.51 (m, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.20 – 5.05 (m, 2H), 4.56 – 4.42 (m, 2H), 4.32 – 4.22 (m, 1H), 3.96 – 3.87 (m, 3H), 3.79 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.70 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.25 – 3.08 (m, 2H), 2.61 – 2.53 (m, 2H), 2.45 – 2.36 (m, 4H), 2.36 – 2.22 (m, 3H), 2.20 – 2.03 (m, 4H), 1.99 – 1.68 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H). 2.1.4 連接子 - 有效負載 X4 之製備：
連接子-有效負載X4之製備方案如下所示： 第一步
向含33a (2.00 g，2.58 mmol)之MeOH (20 mL)中加入Pd/C (400 mg，10 wt.%)，在20℃下攪拌5小時。TLC (EA)顯示反應結束。將反應液過濾旋乾得1.3 g白色固體33b，收率：74%。 第二步
向含33b (0.55 g，0.802 mmol)，KI4 (427 mg，0.802 mmol)及DIPEA (310 mg，2.40 mmol)之DMF (5 mL)中加入HATU (305 mg，0.802 mmol)，在0℃下攪拌2小時。TLC (DCM/MeOH = 1/10)顯示反應結束。將反應液倒入水(40 mL)中，過濾得粗品，經管柱純化(DCM/MeOH = 20/1)得360 mg黃色固體33c，收率41%。 第三步
向33c (360 mg，0.326 mmol)之DCM (10 mL)中加入二乙胺(2 mL)。在25℃下攪拌17小時。TLC (DCM/MeOH = 5/1)顯示反應結束。將反應液倒入PE (100Ml)中，過濾得205 mg白色固體33d，收率：71%。MS-ESI: m/z 881.3 [M+H]+。 第四步
向33d (205 mg，0.233 mmol)及三乙胺(118 mg，1.17 mmol)之DMF (1 mL)及水(1 mL)中加入溴乙醯溴(94 mg，0.446 mmol)於TH F(2 mL)中之溶液，並在0℃攪拌1小時，反應液直接製備得15 mg白色固體X4，收率：6%。 MS-ESI: m/z 1001.2 [M+H]+。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.57 – 8.50 (m, 1H), 8.50 – 8.43 (m, 2H), 8.35 – 8.29 (m, 1H), 8.19 – 8.12 (m, 2H), 7.80 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.27 – 7.14 (m, 7H), 6.53 (s, 1H), 5.59 – 5.51 (m, 1H), 5.44 – 5.39 (m, 2H), 5.20 – 5.07 (m, 2H), 4.56 – 4.44 (m, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.80 – 3.68 (m, 5H), 3.41 (s, 1H), 3.21 – 3.12 (m, 2H), 2.83 – 2.74 (m, 1H), 2.58 – 2.55 (m, 3H), 2.39 (s, 4H), 2.18 – 2.03 (m, 4H), 1.93 – 1.78 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H). 2.2 抗 B7H3 抗體藥物 - 結合物之製備 2.2.1 參照 ADC-1 (Daiichi Sankyo ， DS7300) 之製備
DS-7300由人源化抗B7-H3 IgG1單株抗體藉由基於四肽之可裂解連接子結合於拓樸異構酶I抑制劑有效負載Exatecan衍生物Deruxtecan組成。
用超純水分別配製還原劑及保護劑如下：2 mg/ml TCEP (Tris-2-羧乙基-膦，製造商：Thermo)水溶液及100 mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二鈉，製造商：Sigma)水溶液。
將連接子-有效負載(Deruxtecan)溶於乾燥之DMA ( N,N-二甲基乙醯胺，製造商：國藥集團)，以製備10 mg/mL之連接子-有效負載DMA溶液。
取16 mg 7.4mg/ml之參照單抗(抗體序列使用專利「CN104755494B」中序列號9所示之重鏈，序列號16所示之輕鏈，轉染CHO細胞後按照習知抗體表現純化得到，抗體純度＞95%)置於50 ml離心管，加入30mM His-HAc, pH5.5緩衝液稀釋抗體濃度至5 mg/ml，按照反應液總體積5%加入100 mM EDTA水溶液，震盪混勻後加入2 mg/ml TCEP水溶液進行抗體還原，TCEP與抗體之莫耳比2.7：1，震盪混勻後置於制冷型恆溫混勻儀上反應，37℃，2h。按照藥物與抗體終濃度莫耳比9：1加入前述連接子-有效負載之DMA溶液，按照反應液總體積10%補充DMA，震盪混勻後置於制冷型恆溫混勻儀上反應，4℃，1h。用超濾管(MWCO 30KD，製造商：密理博公司)置換樣本保存緩衝液，先用含有10% DMSO之30mM His-HAc, pH5.5緩衝液超濾3次，再用無DMSO之30mM His-HAc, pH5.5超濾6次，最終用0.2 μm PES膜過濾除菌，得到抗體-藥物結合物參照ADC-1 11 mg，濃度5.825 mg/mL，收率68.75%。
經偵測，抗體-藥物結合物參照ADC-1之載藥量(DAR)為4.59，SEC純度為99.64%。 2.2.2 抗體 - 藥物結合物 WBP301088-X2 之製備
用超純水分別配製還原劑及保護劑如下：2 mg/ml TCEP (Tris-2-羧乙基-膦，製造商：Thermo)水溶液及100 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二鈉，製造商：Sigma)水溶液。
將實例2.1.2製備之連接子-有效負載X2溶於乾燥之DMA ( N,N-二甲基乙醯胺，製造商：國藥集團)，以製備10 mg/mL之linker-payload DMA溶液。 1)    如下製備抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR4)：
取20 mg 11.3mg/ml之WBP301088單抗置於50 ml離心管，加入30mM His-HAc, pH5.5緩衝液稀釋抗體濃度至5 mg/ml，按照反應液總體積5%加入100 mM EDTA水溶液，震盪混勻後加入2 mg/ml TCEP水溶液進行抗體還原，TCEP與抗體之莫耳比4.5：1，震盪混勻後置於制冷型恆溫混勻儀上反應，37℃，2h。按照藥物與抗體終濃度莫耳比12：1加入前述連接子-有效負載之DMA溶液，按照反應液總體積10%補充DMA，震盪混勻後置於制冷型恆溫混勻儀上反應，4℃，1h。用超濾管(MWCO 30KD，製造商：密理博公司)置換樣本保存緩衝液，先用含有10% DMSO之30mM His-HAc, pH5.5緩衝液超濾3次，再用無DMSO之30mM His-HAc, pH5.5超濾6次，最終用0.2 μm PES膜過濾除菌，得到抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR4) 15 mg，濃度7.162 mg/mL，收率75%。
經偵測，抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR4)之載藥量(DAR)為4.02，SEC純度為99.20%。 2)    如下製備抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR6)：
取20 mg 11.3mg/ml之WBP301088單抗置於50 ml離心管，加入30mM His-HAc, pH5.5緩衝液稀釋抗體濃度至5 mg/ml，按照反應液總體積5%加入100 mM EDTA水溶液，震盪混勻後加入2 mg/ml TCEP水溶液進行抗體還原，TCEP與抗體之莫耳比8：1，震盪混勻後置於制冷型恆溫混勻儀上反應，37℃，2h。按照藥物與抗體終濃度莫耳比12：1加入前述連接子-有效負載之DMA溶液，按照反應液總體積10%補充DMA，震盪混勻後置於制冷型恆溫混勻儀上反應，4℃，1h。用超濾管(MWCO 30KD，製造商：密理博公司)置換樣本保存緩衝液，先用含有10% DMSO之30mM His-HAc, pH5.5緩衝液超濾3次，再用無DMSO之30mM His-HAc, pH5.5超濾6次，最終用0.2 μm PES膜過濾除菌，得到抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR6) 10.8 mg，濃度4.933 mg/mL，收率54%。
經偵測，抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR6)之載藥量(DAR)為5.68，SEC純度為99.57%。 3)    如下製備抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR8)：
取20 mg 11.3mg/ml之WBP301088單抗置於50 ml離心管，加入30mM His-HAc, pH5.5緩衝液稀釋抗體濃度至5 mg/ml，按照反應液總體積5%加入100 mM EDTA水溶液，震盪混勻後加入2 mg/ml TCEP水溶液進行抗體還原，TCEP與抗體之莫耳比15：1，震盪混勻後置於制冷型恆溫混勻儀上反應，37℃，2h。按照藥物與抗體終濃度莫耳比18：1加入前述連接子-有效負載之DMA溶液，按照反應液總體積10%補充DMA，震盪混勻後置於制冷型恆溫混勻儀上反應，4℃，1h。用超濾管(MWCO 30KD，製造商：密理博公司)置換樣本保存緩衝液，先用含有10% DMSO之30mM His-HAc, pH5.5緩衝液超濾3次，再用無DMSO之30mM His-HAc, pH5.5超濾6次，最終用0.2 μm PES膜過濾除菌，得到抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR8) 10.2 mg，濃度4.278 mg/mL，收率51.0%。
經偵測，抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR8)之載藥量(DAR)為7.45，SEC純度為98.73%。 2.3. 細胞毒素 ( 有效負載 ) 之製備
有效負載P-III-30之製備方案如下所示： 第一步
在氮氣保護下，向KI4 (100 mg，0.19 mmol)，HATU (85.7 mg，0.23 mmol)，23a (21.5 mg，0.21 mmol)於DMF(2 mL)中之溶液中逐滴添加DIEA (60.6 mg，0.47 mmol)，加完後在0℃反應2小時。LCMS顯示原料反應完全。將反應液逐滴添加到=至20 mL水中，攪拌，析出固體後過濾，得60.2 mg灰色固體P-III-30，收率：61%。MS-ESI: m/z 522.2 [M+H]+。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.42 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.62 – 5.53 (m, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.30 – 5.16 (m, 2H), 4.63 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.09 – 3.99 (m, 1H), 3.22 – 3.11 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.28 (dd, J = 13.7, 7.2 Hz, 1H), 2.22 – 2.08 (m, 3H), 1.94 – 1.78 (m, 2H), 1.08 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H). 2.4 基於 ELISA 偵測抗體 - 藥物結合物及其未結合抗體對人 B7H3 抗原之結合活性
在本實例中，使用ELISA法偵測抗體與藥物結合之前及之後對B7H3抗原蛋白的特異性結合是否有變化。所使用之抗原及偵測抗體的資訊如下。
材料 供應商 目錄號 批次號
人PD-L1, His Tag ACRO PD1-H5229 449-214EF1-142
人B7-H2, His Tag ACRO B72-H5221 741-71AF1-XX
人B7-H3(4Ig), His Tag(為本實例中「重組之人B7H3抗原」) ACRO B7B-H52E7 2856C-2047F1-ZR
人B7-H4蛋白, His Tag ACRO B74-H5222 1042-21B5F1-123
人B7-H5, His Tag ACRO B75-H52H0 1760-20CAF1-ZL
人B7-H6 ACRO B76-H52H8 2058b-89MF1-VD
人B7-1蛋白, His Tag ACRO B71-H5228 2408-209HF2-111
人B7-2蛋白, His Tag ACRO CD6-H5223 743-208VF1-YH
人PD-L2，His Tag (經SPR證實的) ACRO PD2-H5220 1040-2143F1-W7
人B7-H7, His Tag ACRO B77-H52H5 2060b-219DF1-11B
人BTNL2蛋白, His Tag AtaGenix ATMP02212HU 64306
抗人IgG (Fab特異性)-過氧化物酶，山羊產生之抗體 SIGMA A0293 0000106803
2.4.1 基於 ELISA 偵測結合活性
在96孔ELISA盤上，包被重組之人B7H3抗原(見上表)2 μg/mL，30 μL/孔，4℃過夜。次日，將孔盤用PBST洗3次後用5%脫脂牛奶封閉2 h，用PBST洗盤3次後，加入梯度稀釋之抗體WBP301088、抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR6)或同型對照抗體hIgG1同型，並溫育1 h。之後，用PBST清洗3次後加入100 μL/孔1:5000稀釋之HRP標記之抗人第二抗體並溫育1 h。溫育完成後，用PBST洗盤六次，加TMB (SurModics，TMBS-1000-01)顯色。根據顯色結果，加入2M 之HCl終止反應，藉由酶標儀(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下讀盤，結果顯示在圖13中，結果表明，抗體與藥物結合之前及之後對人B7H3抗原蛋白之結合活性沒有顯著性變化。 2.4.2 基於 ELISA 偵測與 B7 家族蛋白之結合活性
藉由在4℃溫育過夜將人PD-L1蛋白(見上表)、人B7-H2蛋白、人B7-H3蛋白、人B7-H4蛋白、人B7-H5蛋白、人B7-H6蛋白、人B7-1蛋白、人B7-2蛋白、人PD-L2蛋白、人B7-H7蛋白、人BTNL2蛋白分別固定至96孔盤上。然後將該96孔盤藉由在37℃與PBS中之1% BSA一起溫育1小時來封閉。在封閉之後，將該96孔盤用PBST (含有0.05% Tween20之PBS)洗滌3次。在結合緩衝液(含有0.05% Tween20及0.5% BSA之PBS)中製備連續稀釋之抗體WBP301088、抗體-藥物結合物WBP301088-X2(DAR6)或同型對照抗體hIgG1同型，並且在37℃將其與固定至96孔盤上之各B7家族蛋白一起溫育1小時。在溫育之後，將該96孔盤用PBST洗滌3次，在37℃與結合緩衝液中之第二抗體(見上表)一起溫育1小時，再次洗滌，用TMB顯影並且使用1 M H 2SO 4終止反應。結果示於圖14中。
由圖14可見，抗體與藥物結合之前及之後對人B7H3抗原蛋白之結合活性沒有顯著性變化，且僅與人B7-H3特異性結合，與其他B7家族蛋白均不特異性結合。 實例 3. 測試抗體 - 藥物結合物對腫瘤細胞活體外增殖之抑制作用
採用CellTiter-Glo ®化學發光細胞生存力偵測法(亦即CTG方法)評估抗B7H3 ADC WBP301088-X2 (DAR6)及參照分子ADC-1與B7H3陽性表現之人腫瘤細胞溫育處理7天，對細胞增殖之抑制作用。
收集對數生長期細胞，以1000至3000個細胞/孔之密度鋪盤，將細胞盤放入37℃、5% CO 2培養箱培養過夜。實驗第二天，將WBP301088-X2 (DAR6)用完全培養基按3倍稀釋，獲得9個濃度梯度(以1000nM之最高濃度開始)藥物後，50μL/孔加入細胞培養盤中，完全培養基作為空白對照，設置3個複孔；繼續於37℃、5%CO 2培養箱內溫育5天。溫育結束，取出細胞培養盤，平衡至室溫後，每孔加入50μL CTG偵測試劑，震盪混勻後放置於暗處靜置10分鐘後，利用酶標儀偵測讀取信號值。應用GraphPad Prism軟體，使用非線性回歸模型繪製S型劑量-反應曲線並計算IC 50值。細胞生存力計算公式=(Lum test drug- Lum blank control) / (Lum solvent blank control- Lum blank control) × 100%。
實驗結果如下表所示，其中，CAL-120來源DSMZ，其他細胞株來源ATCC。 表17：抗體-藥物結合物對人腫瘤細胞之增殖抑制活性
細胞 細胞類別 WBP301088-X2 (IC 50(nM)) 參照ADC-1 (IC 50(nM))
NCI-H1568 肺癌 4.8 32.8
NCI-H358 肺癌 11.4 122.9
Calu-6 肺癌 52.3 428.5
MCF-7 乳癌 55.5 435.2
U87 MG 腦癌 86.5 354.3
HT-29 結直腸癌 446 1144
A375 黑色素瘤 164.7 314.7
A549 肺癌 369.3 378.5
PC-3 前列腺癌 180.8 958.9
CAL-120 乳癌 268.8 NA
根據表17之結果可見，本申請抗體-藥物結合物WBP301088-X2(DAR6)對多種B7H3陽性表現之腫瘤細胞具有增殖抑制活性，其活性優於參照ADC-1。 實例 4. 抗體 - 藥物結合物對人肺癌細胞 Calu-6 荷瘤小鼠之藥效評價
為研究WBP301088-X2 (DAR6)對體內形成腫瘤之抑制作用，在小鼠體內用B7H3陽性表現之人肺癌細胞Calu-6形成移植瘤後，評估WBP301088-X2(DAR6)之活體內抗腫瘤效果。
使用6至8週齡之雌性BALB/c Nude小鼠(購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司)作為試驗動物。將10×10 6個Calu-6肺癌細胞接種於6至8週齡之雌性BALB/c Nude小鼠右側背部皮下。觀察小鼠之腫瘤生長情況，當腫瘤體積達到約139 mm³，對荷瘤小鼠進行隨機分組，空白對照組或治療組每組6隻小鼠，並於分組當天(第0天)藉由靜脈(i.v.)注射WBP301088-X2或參照ADC-1，共注射1次，投與劑量分別為1mg/kg或3mg/kg，於第28天結束實驗。實驗分組及給藥如下。每週量測2次腫瘤體積及小鼠體重，記錄數據。 空白對照(陰性對照組)：生理鹽水 WBP301088-X2 (治療組)：1 mg/kg WBP301088-X2 (治療組)：3 mg/kg 參照ADC-1 (治療組，為陽性對照組)：1 mg/kg 參照ADC-1 (治療組，為陽性對照組)：3 mg/kg
所有樣本均用生理鹽水稀釋調配。
實驗結束時，將小鼠安樂死，如下計算腫瘤抑制率TGI： TGI (%) = [1-(T i-T 0)/ (V i-V 0)] ×100 T i：治療組及陽性對照組在給藥第i天之腫瘤體積均值； T 0：治療組及陽性對照組在給藥第0天之腫瘤體積均值； V i：陰性對照組在給藥第i天之腫瘤體積均值； V 0：陰性對照組在給藥第0天之腫瘤體積均值。
實驗結果如圖15、表18及表19所示。 表18. 各組在不同時間點之腫瘤體積(mm³)
組別 1 2 3 4 5
天數 (天) 空白對照 腫瘤體積(mm³) 參照ADC-1, 1 mg/kg 腫瘤體積(mm³) 參照ACD-1, 3 mg/kg 腫瘤體積(mm³) WBP301088-X2, 1 mg/kg 腫瘤體積(mm³) WBP301088-X2, 3 mg/kg 腫瘤體積(mm³)
0 139 ± 10 139 ± 14 139 ± 16 140 ± 14 140 ± 20
3 207 ± 18 195 ± 20 184 ± 20 196 ± 17 192 ± 27
7 355 ± 27 245 ± 28 210 ± 23 238 ± 21 219 ± 28
10 547 ± 44 309 ± 44 225 ± 27 267 ± 22 227 ± 30
14 963 ± 74 446 ± 82 237 ± 29 290 ± 29 198 ± 22
17 1357 ± 97 595 ± 103 252 ± 31 317 ± 35 156 ± 15
21 1866 ± 169 946 ± 151 254 ± 28 363 ± 47 116 ± 3
24 2521 ± 257 1241 ± 160 267 ± 32 394 ± 56 75 ± 9
28 2956 ± 233 1623 ± 201 296 ± 37 457 ± 76 61 ± 9
註：腫瘤體積用平均值 ± 標準誤表示；天數為開始給藥後之天數。 表19. 受試抗體-藥物結合物對Calu-6細胞皮下異種移植之腫瘤小鼠模型之抑瘤藥效評價 (基於給藥後第24天腫瘤體積計算得出)
組別 腫瘤體積(mm³) (第24天) T/C (%) TGI (%) p值
空白對照 2521 ± 257 -- -- --
參照ADC-1, 1 mg/kg 1241 ± 160 49.25 53.72 0.056
參照ADC-1, 3 mg/kg 267 ± 32 10.61 94.62 0.005
WBP301088-X2, 1 mg/kg 394 ± 56 15.61 89.37 0.005
WBP301088-X2, 3 mg/kg 75 ± 9 2.99 102.73 0.003
注：腫瘤體積用平均值 ± 標準誤表示；腫瘤生長抑制由T/C (T/C (%) = T i/ V i×100)及TGI (TGI (%) = [1-(T i-T 0)/ (V i-V 0)] ×100) 反映； p值根據腫瘤體積計算( p＞ 0.05代表沒有統計學差異， p＜ 0.01代表有顯著性差異)。
圖15、表18及表19之結果表明，本申請之抗體-藥物結合物WBP301088-X2單次給藥後表現出顯著之劑量依賴性抑瘤活性且在1 mg/kg及3 mg/kg這兩個劑量下之抑瘤效果均顯著優於參照ADC-1。 實例 5. 抗體 - 藥物結合物對人黑色素瘤細胞 A375 荷瘤小鼠之藥效評價
為研究WBP301088-X2(DAR6)對體內形成腫瘤之抑制作用，在小鼠體內用B7H3陽性表現之人黑色素瘤細胞A375形成移植瘤後，評估WBP301088-X2(DAR6)之活體內抗腫瘤效果。
使用6至8週齡之雌性NOD/SCID小鼠(購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司)作為試驗動物。將5×10 6個A375人黑色素瘤細胞接種於6至8週齡之雌性NOD/SCID小鼠右側背部皮下，觀察腫瘤生長情況，當腫瘤體積達到約89 mm³，對荷瘤小鼠進行隨機分組，空白對照組或治療組每組6隻小鼠，並於分組當天(第0天)藉由靜脈(i.v.)注射WBP301088-X2或參照ADC-1，共注射1次，投與劑量分別為1mg/kg、3mg/kg 及10mg/kg。於第20天結束實驗。每週量測2次腫瘤體積及小鼠體重，記錄數據。 空白對照(陰性對照組)：生理鹽水 WBP301088-X2 (治療組)：1 mg/kg WBP301088-X2 (治療組)：3 mg/kg WBP301088-X2 (治療組)：10 mg/kg 參照ADC-1 (治療組)：3 mg/kg 參照ADC-1 (治療組)：10 mg/kg
所有樣本均用生理鹽水稀釋配製。
實驗結束時，將小鼠安樂死，並計算TGI TV(相對腫瘤抑制率)。TGI TV(相對腫瘤抑制率)計算公式為： 其中， ：給藥組RTV平均值； ：媒劑組(媒劑組，在本實例中是僅投與生理鹽水組)RTV平均值； RTV之計算公式為： 其中， ：編號為n之小鼠在第t天之腫瘤體積； ：編號為n之小鼠在第0天之腫瘤體積； ：編號為n之小鼠在第t天之腫瘤相對體積。
實驗結果如圖16、表20及表21所示。 表20 不同組別之腫瘤體積變化
組別 腫瘤體積(mm 3)
D0 D3 D6 D9 D13 D16 D20
空白對照 88.55 ±9.79 179.90 ±40.56 317.78 ±66.27 484.12 ±77.65 753.85 ±112.97 987.29 ±159.48 1453.17 ±226.44
WBP301088-X2, 1 mpk 88.92 ±8.64 91.83 ±5.88 71.71 ±11.17 89.8 ±17 152.36 ±36.98 244.50 ±55.84 533.31 ±87.51
WBP301088-X2, 3 mpk 88.77 ±9.27 78.50 ±20.22 36.83 ±9.16 17.21 ±6.87 9.25 ±6.46 35.24 ±26.23 32.16 ±22.79
WBP301088-X2, 10 mpk 88.87 ±9.18 69.55 ±11.66 27.76 ±4.21 14.4 ±1.39 1.08 ±1.08 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00
參照ADC-1, 3 mpk 88.67 ±8.85 64.19 ±8.68 40.14 ±10.24 24.81 ±7.51 11.04 ±4.20 31.20 ±18.76 93.10 ±68.47
參照ADC-1, 10 mpk 88.89 ±8.57 78.21 ±12.7 29.82 ±4.55 16.94 ±2.89 2.37 ±1.55 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00
備註：數據以平均值 ± 標準誤表示。 表21 不同組別之相對腫瘤抑制率(TGI TV)
組別 D0 D3 D6 D9 D13 D16 D20
WBP301088-X2 1 mpk 0.00% 45.31% 75.46% 80.52% 79.33% 74.28% 62.21%
WBP301088-X2 3 mpk 0.00% 55.27% 88.25% 96.69% 98.95% 96.22% 98.17%
WBP301088-X2 10 mpk 0.00% 59.93% 90.91% 96.91% 99.89% 100.00% 100.00%
參照ADC-1 3 mpk 0.00% 62.43% 87.68% 95.00% 98.56% 97.13% 94.69%
參照ADC-1 10 mpk 0.00% 55.14% 90.28% 96.51% 99.75% 100.00% 100.00%
圖16、表20及表21之結果表明，本申請之抗體-藥物結合物WBP301088-X2單次給藥後表現出顯著的劑量依賴性抑瘤活性。 實例 6. 抗體 - 藥物結合物對 人腦癌細胞 U87 荷瘤小鼠之藥效評價
為研究WBP301088-X2 (DAR6)對體內形成腫瘤之抑制作用，在小鼠體內用B7H3陽性表現之人腦癌細胞U87形成移植瘤後，評估WBP301088-X2 (DAR6)之活體內抗腫瘤效果。
使用6至8週齡之雌性NCG小鼠(購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司)作為試驗動物。將5×10 6個U87人腦癌細胞接種於6至8週齡之雌性NCG小鼠右側頸背部皮下，觀察小鼠之腫瘤生長情況，當腫瘤體積達到約187 mm³，對荷瘤小鼠進行隨機分組，空白對照組或治療組每組6隻小鼠，並於分組當天(第0天)藉由靜脈(i.v.)注射WBP301088-X2或參照ADC-1，共注射1次，投與劑量分別為1mg/kg 及3mg/kg。於第20天結束實驗。實驗分組及給藥如下。每週量測2次腫瘤體積及小鼠體重，記錄數據。 空白對照(陰性對照組)：生理鹽水 WBP301088-X2 (治療組)：1 mg/kg WBP301088-X2 (治療組)：3 mg/kg 參照ADC-1 (治療組，為陽性對照組)：1 mg/kg 參照ADC-1 (治療組，為陽性對照組)：3 mg/kg
所有樣本均用生理鹽水稀釋調配。
實驗結束時，將小鼠安樂死，如下計算腫瘤抑制率TGI： TGI (%) = [1-(T i-T 0)/ (V i-V 0)] ×100 T i：治療組及陽性對照組在給藥第i天之腫瘤體積均值； T 0：治療組及陽性對照組在給藥第0天之腫瘤體積均值； V i：陰性對照組在給藥第i天之腫瘤體積均值； V 0：陰性對照組在給藥第0天之腫瘤體積均值。
實驗結果如圖17、表22及表23所示。 表22. 各組在不同時間點之腫瘤體積(mm³)
組別 天數 第0天 第3天 第6天 第9天 第13天 第16天 第20天
1 空白對照 188±25 247±29 362±46 466±47 614±54 988±105 1651±149
2 參照ADC-1 1 mg/kg 腫瘤體積(mm³) 187±25 231±31 301±42 403±61 489±80 808±171 1355±247
3 參照ADC-1 3 mg/kg 腫瘤體積(mm³) 187±22 226±25 285±36 381±57 457±90 846±137 1314±162
4 WBP301088-X2 1 mg/kg 腫瘤體積(mm³) 187±25 234±27 308±49 387±42 439±51 646±42 1074±64
5 WBP301088-X2 3 mg/kg 腫瘤體積(mm³) 188±20 220±25 254±43 231±45 202±49 266±80 474±148
註：腫瘤體積用平均值 ± 標準誤表示；天數為開始給藥後之天數。 表23. 受試抗體-藥物結合物對U87 MG細胞皮下異種移植之腫瘤小鼠模型之抑瘤藥效評價(基於給藥後第20天腫瘤體積計算得出)
組別 腫瘤體積(mm³) (第20天) T/C (%) TGI (%) p值
空白對照 1651±149 -- -- --
參照ADC-1, 1 mg/kg 1355±247 82.08 20.21 0.969
參照ADC-1, 3 mg/kg 1314±162 79.63 22.96 0.819
WBP301088-X2, 1 mg/kg 1074±64 65.06 39.40 0.138
WBP301088-X2, 3 mg/kg 474±148 28.70 80.49 0.008
註：腫瘤體積用平均值 ± 標準誤表示；腫瘤生長抑制由T/C (T/C (%) = T i/ V i×100)及TGI (TGI (%) = [1-(T i-T 0)/ (V i-V 0)] ×100)反映； p值根據腫瘤體積計算( p＞ 0.05代表沒有統計學差異， p＜ 0.01代表有顯著性差異)。
圖17、表22及表23之結果表明，本申請之抗體-藥物結合物WBP301088-X2單次給藥後表現出顯著的劑量依賴性抑瘤活性且3 mg/kg 劑量之抗體-藥物結合物WBP301088-X2之抑瘤效果顯著優於參照ADC-1。 實例 7. 抗體 - 藥物結合物對 人前列腺癌細胞 PC-3 荷瘤小鼠之藥效評價
為研究WBP301088-X2 (DAR6)對體內形成腫瘤之抑制作用，在小鼠體內用B7H3陽性表現之人前列腺癌細胞PC-3形成移植瘤後，評估WBP301088-X2 (DAR6)之活體內抗腫瘤效果。
使用6至8週齡之雌性BALB/c Nude小鼠(購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司)作為試驗動物。將5×10 6個人前列腺癌細胞PC-3接種於6至8週齡之雌性BALB/c Nude小鼠右側頸背部皮下，觀察腫瘤生長情況，當腫瘤體積達到約155 mm³，對荷瘤小鼠進行隨機分組，空白對照組或治療組每組6隻小鼠，並於分組當天(第0天)藉由靜脈(i.v.)注射WBP301088-X2或參照ADC-1，共注射1次，投與劑量分別為2 mg/kg或6 mg/kg。於第21天結束實驗。實驗分組及給藥如下。每週量測2次腫瘤體積及小鼠體重，記錄數據。 空白對照(陰性對照組)：生理鹽水 WBP301088-X2 (治療組)：2 mg/kg WBP301088-X2 (治療組)：6 mg/kg 參照ADC-1 (治療組，為陽性對照組)：2 mg/kg 參照ADC-1 (治療組，為陽性對照組)：6 mg/kg
所有樣本均用生理鹽水稀釋配製。
實驗結束時，將小鼠安樂死，如下計算腫瘤抑制率TGI： TGI (%) = [1-(T i-T 0)/ (V i-V 0)] ×100) T i：治療組及陽性對照組在給藥第i天之腫瘤體積均值； T 0：治療組及陽性對照組在給藥第0天之腫瘤體積均值； V i：陰性對照組在給藥第i天之腫瘤體積均值； V 0：陰性對照組在給藥第0天之腫瘤體積均值。
實驗結果如圖18、表24及表25所示。 表24. 各組在不同時間點之腫瘤體積(mm³)
組別 天數 0 4 7 11 14 18 21
1 空白對照 腫瘤體積(mm³) 154 ± 8 202 ± 10 269 ± 14 382 ± 29 540 ± 40 826 ± 44 1017 ± 59
2 參照ADC-1, 2 mg/kg 腫瘤體積(mm³) 154 ± 7 196 ± 10 249 ± 17 346 ± 45 410 ± 65 540 ± 91 655 ± 115
3 參照ADC-1, 6 mg/kg 腫瘤體積(mm³) 154 ± 6 203 ± 9 218 ± 12 262 ± 12 273 ± 14 305 ± 16 349 ± 23
4 WBP301088-X2, 2 mg/kg 腫瘤體積(mm³) 155 ± 7 202 ± 8 248 ± 23 268 ± 27 274 ± 28 282 ± 32 298 ± 37
5 WBP301088-X2, 6 mg/kg 腫瘤體積(mm³) 155 ± 9 199 ± 11 233 ± 6 241 ± 6 225 ± 14 231 ± 15 184    ± 11
註：腫瘤體積用平均值 ± 標準誤表示；天數為開始給藥後之天數。 表25. 受試抗體-藥物結合物對PC-3細胞皮下異種移植之腫瘤小鼠模型之抑瘤藥效評價 (基於給藥後第21天腫瘤體積計算得出)
組別 腫瘤體積(mm³) (第21天) T/C (%) TGI (%) p值
媒劑 1017 ± 59 -- -- --
參照ADC-1, 2 mg/kg 655 ± 115 64.40 41.96 ＜ 0.001
參照ADC-1, 6 mg/kg 349 ± 23 34.26 77.46 ＜ 0.001
WBP301088-X2, 2 mg/kg 298 ± 37 29.30 83.41 ＜ 0.001
WBP301088-X2, 6 mg/kg 184 ± 11 18.06 96.62 ＜ 0.001
註：腫瘤體積用平均值 ± 標準誤表示；腫瘤生長抑制由T/C (T/C (%) = T i/ V i×100)及TGI (TGI (%) = [1-(T i-T 0)/ (V i-V 0)] ×100) 反映； p值根據腫瘤體積計算( p＞ 0.05代表沒有統計學差異， p＜ 0.01代表有顯著性差異)。
圖18、表24及表25之結果表明，本申請之抗體-藥物結合物WBP301088-X2單次給藥後表現出顯著之劑量依賴性抑瘤活性且抑瘤效果在2 mg/kg及6 mg/kg劑量下均顯著優於參照ADC-1。 實例 8. 抗體 - 藥物結合物對前列腺癌人源腫瘤異種移植 (PDX) 模型之藥效評價
為研究WBP301088-X2 (DAR6)在前列腺癌人源腫瘤異種移植模型中之藥效，將人源前列腺癌PR9586、PR9587腫瘤組織(獲自冠科生物技術(中山)有限公司)皮下異種移植NPG與NOG雄性小鼠，評估WBP301088-X2(DAR6)之抗腫瘤效果。
1.受試藥物及材料 空白對照(對照組)：生理鹽水 WBP301088-X2 (治療組)：10 mg/kg
2.受試藥物製備方法： 所有樣本均用生理鹽水稀釋製備。
3.實驗動物： NPG小鼠購自北京維通達生物技術有限公司，NOG小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
4.實驗方法：
將人源前列腺癌PR9586，PR9587腫瘤組織分別接種至NPG或NOG小鼠皮下，待腫瘤長至500至800mm 3左右時，收集腫瘤組織，將小鼠安樂死。將收集之腫瘤組織切成直徑為2至3mm之瘤塊，接種於NPG或NOG小鼠右前肩胛處皮下，當該瘤塊接種之NPG或NOG小鼠之平均腫瘤體積達到約100至200 mm 3時，將小鼠隨機分組，空白對照組或治療組每組6隻小鼠。
分組當天(第0天)藉由靜脈(i.v.)注射WBP301088-X2給藥，每兩週一次，共注射2次，每次投與劑量為10 mg/kg。分別於第25天(對接種PR9586之小鼠)或於第48天(對接種PR9587之小鼠)結束實驗。開始給藥後，每週量測兩次小鼠之體重及腫瘤之大小。腫瘤體積計算公式：腫瘤體積(mm 3)= 1/2 ×(a × b 2)(其中a表示長徑，b表示短徑)。
實驗結束時，將小鼠安樂死，計算腫瘤抑制率TGI： TGI (%) = [1-(T i-T 0)/ (V i-V 0)] ×100 其中 T i：治療組在給藥第i天之腫瘤體積均值； T 0：治療組在給藥第0天之腫瘤體積均值； V i：陰性對照組在給藥第i天之腫瘤體積均值； V 0：陰性對照組在給藥第0天之腫瘤體積均值。
5.實驗結果：
實驗結果如圖19A、圖19B、表26及表27所示。 表26. 受試抗體-藥物結合物對PR9586人源腫瘤異種移植模型之抑瘤藥效評價 (基於首次給藥後第25天之腫瘤體積計算得出)
組別 給藥 劑量 (mg/kg) 第 25 天
腫瘤體積( 平均值 ± SEM) T/C (%) TGI (%) p 值
1 對照組 - 2524.01 ±411.33 - - -
2 WBP301088-X2 10 17.08 ±6.02 0.68 99.32 0.00562
註： p值根據腫瘤體積計算( p＞ 0.05代表沒有統計學差異， p＜ 0.01代表有顯著性差異)。 表27. 受試抗體-藥物結合物對PR9587人源腫瘤異種移植模型之抑瘤藥效評價 (基於首次給藥後第48天之腫瘤體積計算得出)
組別 給藥 劑量 (mg/kg) 第48 天
腫瘤體積( 平均值 ± SEM) T/C (%) TGI (%) p 值
1 對照組 - 292.06 ±31.00 - - -
2 WBP301088-X2 10 90.29 ±39.21 30.91 69.09 0.00261
註： p值根據腫瘤體積計算( p＞ 0.05代表沒有統計學差異， p＜ 0.01代表有顯著性差異)。
結果表明，本申請之抗體-藥物結合物WBP301088-X2在給藥後表現出顯著之抑瘤活性。 實例 9. 抗體 - 藥物結合物對前列腺癌微小人源腫瘤異種移植模型之藥效評價
為研究WBP301088-X2 (DAR6)在前列腺癌人源腫瘤異種移植模型中之藥效，在前列腺癌微小人源腫瘤異種移植小鼠模型上評價WBP301088-X 2(DAR6)之抗腫瘤效果。
1.受試藥物及材料
空白對照(對照組)：生理鹽水
WBP301088-X2 (治療組)：10 mg/kg
膠原酶消化液：
名稱 供應商 目錄號
DNase SIGMA D5025-375KU
透明質酸酶 SIGMA H6254-500MG
II型膠原酶 GIBCO 17101-015
IV型膠原酶 GIBCO 17104-019
將表中各組分按照製造商之說明書混合製備膠原酶消化液。
2.受試藥物製備方法：所有樣本均用生理鹽水稀釋製備。
3.實驗動物： CB17 SCID小鼠，雄性，6至8週齡，體重約18至22g。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
4.實驗方法：
將人源前列腺癌移植模型LD1-2027-410644、LD1-2034-362055模型之腫瘤組織(獲自上海立迪生物技術股份有限公司)接種至小鼠皮下，待腫瘤長至500-800mm 3時，自小鼠體內手術無菌摘取腫瘤組織，於生物安全櫃中去除非腫瘤組織及壞死組織，以保證接種腫瘤組織之純度，將小鼠安樂死。將經處理之腫瘤組織切成1至3立方毫米小塊，使用膠原酶消化液37℃消化腫瘤塊1至2小時，1200 rpm離心3分鐘去除上清，使用10 ml含1 % FBS之PBS再懸浮細胞並血球計數盤計數；去除鼠源細胞，1200 rpm離心3分鐘去除上清液，用RPMI1640細胞培養液再懸浮細胞，血球計數盤計數，調整細胞密度。
將細胞懸液灌裝至膠囊中，CB17 SCID小鼠根據體重隨機分組，空白對照組或治療組每組各3隻小鼠，每隻小鼠左右兩側皮下各接種1個膠囊，每組總計接種6個膠囊，每個膠囊中含有5000個腫瘤細胞。接種當天為第0天，進行動物給藥，以尾靜脈注射之方式單次給藥，實驗進行10天。
實驗結束後將小鼠安樂死，取出膠囊，用CellTiter-Glo進行細胞生存力偵測，亦即將膠囊剪碎，加入等體積之PBS以及CellTiter-Glo™試劑，量測發光值，在光信號及系統中，發光值與ATP量成正比，而ATP又與活細胞數正相關，因此可藉由偵測ATP含量獲知細胞生存力。
5.實驗結果：
實驗結果如圖20A、圖20B、表28所示。 表28. 實驗終點細胞生存力偵測結果
組別 受試物 LD1-2027-410644模型 LD1-2034-362055模型
平均信號值 標準誤 平均信號值 標準誤
1 對照組 266766.78 24960.75 2403679.39 563363.25
2 WBP301088-X2, 10 mg/kg 85868.38 6086.40 1118020.86 90799.15
圖20A、圖20B、表28之結果表明，WBP301088-X2具有顯著抗腫瘤效果。 實例 10. 抗體 - 藥物結合物單次給藥之藥代動力學研究測試目的
食蟹猴單次靜脈輸注給予抗體-藥物結合物WBP301088-X2 (DAR6)後，測定不同時間點血清中WBP301088-X2 (DAR6)、WBP301088-總抗體及細胞毒素P-III-30之濃度，計算WBP301088-X2 (DAR6)、WBP301088-總抗體及細胞毒素P-III-30之藥代動力學參數，為臨床前及臨床研究提供依據。 實驗方法
18隻食蟹猴，雌雄各半，給藥前一天稱重，根據體重分層隨機分為3組(3雌3雄/組)，分別為低劑量組(1 mg/kg)、中劑量組(3 mg/kg)、高劑量組(10 mg/kg)，每隻動物靜脈輸注給予WBP301088-X2溶液。
各組於食蟹猴前肢靜脈採集血液，其中將給藥前0 h及給藥後0.5、1、4、8、24、48、72、96、168、240、336、504、672 h採集之血液經處理後的樣本作為PK樣本，各個時間點採集血液完成後，離心獲得血清，用於樣本分析。
採用ELISA方法分別定量偵測食蟹猴血清樣本中WBP301088總抗體濃度、WBP301088-X2濃度；採用LC-MS/MS方法定量偵測食蟹猴血清樣本中P-III-30濃度。實驗結果見表29。 表29. 單次靜脈輸注給予不同劑量之WBP301088-X2 (DAR6)在食蟹猴體內暴露量參數
待測物 PK 參數 單位 參數均值
低劑量組 (1 mg/kg) 中劑量組 (3 mg/kg) 高劑量組 (10 mg/kg)
WBP301088-X2 C max μg/mL 22.6 71.9 246
AUC 0-t h·μg/mL 403 2070 11000
AUC 0-∞ h·μg/mL 430 2110 11100
WBP301088-總抗體 C max μg/mL 22.4 70.8 253
AUC 0-t h·μg/mL 319 1760 10200
AUC 0-∞ h·μg/mL 323 1770 10200
P-III-30 C max ng/mL NA 0.133 0.573
AUC 0-t h·ng/mL NA 1.07 44.5
實驗結論
在本實驗條件下，食蟹猴單次靜脈給予1、3及10 mg/kg之WBP301088-X2後，抗體-藥物結合物及總抗體(抗體WBP301088)之間無明顯藥代動力學差異，均呈劑量依賴性增加，表明WBP301088-X2在體內血漿中穩定性好。同時，偵測到P-III-30具有較低血漿濃度，表明ADC在猴中緩慢釋放，結合方式穩定，P-III-30之全身暴露量較低，WBP301088-X2具有較高安全性。 實例 11 ：抗體 - 藥物結合物多次給藥之藥代動力學及毒性研究實驗目的
食蟹猴靜脈給予WBP301088-X2(DAR6)，每3週給藥1 次，共給藥2次。觀察抗體-藥物結合物可能引起毒性反應之性質、程度、量效及時效關係，判斷毒性目標器官或目標組織，為後續研究提供參考。 實驗方法
6隻食蟹猴，雌、雄各半，分組時體重2.3 ~ 3.4 kg，低劑量組(30 mg/kg)、高劑量組(80 mg/kg)，每3週給藥1次，共給藥2次，給藥容積5 mL/kg。藉由臨床觀察、體重及攝食量、血液學、血生化、尿液、大體解剖等多個方面考察動物之耐受性，以及藥物相關之毒性表現。 實驗結論
食蟹猴靜脈給予30 mg/kg、80 mg/kg之WBP301088-X2(DAR6)，每3週給藥1次，共給藥2次，第2次給藥後4天(亦即，開始給藥後之第25天)解剖。
結果表明在試驗期間，所有動物對抗體-藥物結合物耐受良好，體重、耗食量、心電圖指標、凝血指標及大體解剖，均未見異常。表明抗體-藥物結合物安全性好。
儘管已經出於說明本發明之目的顯示了一些代表性實施例及細節，但是熟習此項技術者顯而易見的係可以對其進行多種變化及修改而不脫離本發明主題之範疇。就此而言，本發明範疇僅由申請專利範圍限定。
圖1：W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320之SDS-PAGE結果。M：PageRuler™未染色蛋白梯；泳道1：W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320，非還原性；泳道2：W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320，還原性；凝膠資訊：NuPAGE，Novex 4-12% Bis-Tris凝膠。 圖2：W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320之SEC-HPLC結果。 圖3：W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320之DSF曲線。 圖4：W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320之HIC-HPLC曲線。 圖5：W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320之DLS- k D曲線。 圖6：抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320及抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320對表現人B7H3之細胞MCF-7之FACS結合結果。使用抗B7H3抗體依布妥組單抗(Enoblituzumab)作為陽性對照；使用hIgG1同型作為陰性對照。 圖7：抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320及抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320對食蟹猴B7H3轉染之細胞之FACS結合結果。使用抗B7H3抗體依布妥組單抗作為陽性對照；使用hIgG1同型作為陰性對照。 圖8A至圖8C：抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320 (圖8A)、抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 (圖8B)及MacroGenics之依布妥組單抗(圖8C)與人4IgB7H3之結合。 圖9A至圖9C：抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320 (圖9A)、抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 (圖9B)及MacroGenics之依布妥組單抗(圖9C)與人2IgB7H3之結合。 圖10A至圖10C：抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320 (圖10A)、W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320 (圖10B)及MacroGenics之依布妥組單抗(圖10C)與食蟹猴B7H3之結合。 圖11：表現人B7H3之細胞MCF-7在結合抗體後對抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320及抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320之內化。使用抗B7H3抗體依布妥組單抗作為陽性對照；使用hIgG1同型作為陰性對照。 圖12A至圖12B：抗體W301088-1.145.16-xIgG1KV320及抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320之間的VH區及VL區之胺基酸序列比對。圖中帶框之胺基酸段係VH區及VL區中之各CDR區。 圖13：ELISA偵測抗體-藥物結合物及其未結合抗體對人B7H3抗原之結合活性。圖中「WBP301088」表示未結合抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320。 圖14：ELISA偵測抗體-藥物結合物及其未結合抗體對各B7家族蛋白之結合。圖中「WBP301088」表示未結合抗體W301088-1.145.16-z3-p1-uIgG1KV320。 圖15：抗體-藥物結合物對Calu-6荷瘤小鼠之藥效評價。 圖16：抗體-藥物結合物對A375荷瘤小鼠之藥效評價。 圖17：抗體-藥物結合物對U87荷瘤小鼠之藥效評價。 圖18：抗體-藥物結合物對PC-3荷瘤小鼠之藥效評價。 圖19A及圖19B：抗體-藥物結合物對前列腺癌人源腫瘤異種移植模型之藥效評價。 圖20A及圖20B：抗體-藥物結合物對前列腺癌微小人源腫瘤異種移植模型藥效評價。
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Claims (25)

  1. 一種抗體-藥物結合物，其包含：靶向B7H3之抗體或其抗原結合片段，連接子單元及細胞毒性藥物；該靶向B7H3之抗體或其抗原結合片段包含：胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示之HCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示之HCDR2、胺基酸序列如SEQ ID NO:3所示之HCDR3、胺基酸序列如SEQ ID NO:4或7所示之LCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:5所示之LCDR2及胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示之LCDR3。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (I) 胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示之重鏈可變區及胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示之輕鏈可變區；或胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示之重鏈可變區及胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示之輕鏈可變區；或 (II)與SEQ ID NO:8具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之重鏈可變區，及與SEQ ID NO:9具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈可變區；或與SEQ ID NO:10具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之重鏈可變區，及與SEQ ID NO:11具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈可變區；或 (III) 與SEQ ID NO:8或10相比，其構架區具有一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸之添加、缺失及/或取代之重鏈可變區，及與SEQ ID NO:9或11相比，其構架區具有一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸之添加、缺失及/或取代之輕鏈可變區。
  3. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該抗體選自：人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體、單株抗體及多株抗體。
  4. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該抗原結合片段選自：Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、ScFv、Fab'-SH、sdAb、VHH、雙抗體及線性抗體。
  5. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該抗體包含免疫球蛋白恆定區，該免疫球蛋白恆定區係人IgG恆定區，例如人IgG1恆定區。
  6. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (I) 胺基酸序列如SEQ ID NO:12所示之重鏈及胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示之輕鏈；或胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示之重鏈及胺基酸序列如SEQ ID NO:15所示之輕鏈；或 (II) 與SEQ ID NO:12具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之重鏈，及與SEQ ID NO:13具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈；或與SEQ ID NO:14具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之重鏈，及與SEQ ID NO:15具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈。
  7. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒性藥物包含式(A-1)所示之結構、其互變異構物、鏡像異構物、非鏡像異構物、或異構物之混合物，或其醫藥學上可用之鹽或其溶劑合物， 其中， M為-L 2-L 1-C(O)-； L 2為-O-或-S-； L 1為-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-、C 3-C 6飽和環烷基或3員至6員飽和雜環基，該C 3-C 6飽和環烷基及3員至6員飽和雜環基各自獨立地視情況經一或多個R 2a取代； m選自1、2、3或4；該3員至6員飽和雜環基中之雜原子選自N、O及S，雜原子數為1至3個； R 1a、R 1b及R 2a各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、胺基及C 1-C 6烷基，該C 1-C 6烷基視情況經一或多個R取代； R各自獨立地為氫或鹵素。
  8. 如請求項7之抗體-藥物結合物，其中該L 1為-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-；R 1a選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基；R 1b選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基。
  9. 如請求項8之抗體-藥物結合物，其中L 1為-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-；m為1或2。
  10. 如請求項9之抗體-藥物結合物，其中L 1選自： 。
  11. 如請求項7之抗體-藥物結合物，其中L 1為C 3-C 6飽和環烷基或3員至6員飽和雜環基，該C 3-C 6飽和環烷基及3員至6員飽和雜環基各自獨立地視情況經一或多個R 2a取代，R 2a各自獨立地選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基。
  12. 如請求項11之抗體-藥物結合物，其中L 1為視情況經一或多個R 2a取代之C 3-C 6飽和環烷基；R 2a各自獨立地選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基。
  13. 如請求項12之抗體-藥物結合物，其中L 1為視情況經1、2或3個R 2a取代之 ；R 2a各自獨立地選自：氫、鹵素及C 1-C 6烷基。
  14. 如請求項13之抗體-藥物結合物，其中L 1選自： 。
  15. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該連接子單元L為-L a-L b-L c-， -L a-為 ； -L b-選自： ；較佳為 ； -L c-為 。
  16. 如請求項15之抗體-藥物結合物，其中該連接子單元L為 ；較佳為 。
  17. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物結構如式(A-2)所示： 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數； Ab如請求項1至6之任一項所描述； M如請求項7至14中任一項所描述； L如請求項15或16所描述。
  18. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中p為2至8之整數或小數，例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數。
  19. 如請求項18之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物結構如式(A-2a)或式(A-2b)所示： ， 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數，較佳2至8之整數或小數，例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數； Ab為靶向B7H3之抗體或其抗原結合片段，其包含：胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示之HCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示之HCDR2、胺基酸序列如SEQ ID NO:3所示之HCDR3、胺基酸序列如SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 7所示之LCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:5所示之LCDR2及胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示之LCDR3； L 2為-O-或-S-；較佳為-O-； X 1選自視情況經1、2或3個R 2a取代之C 3-C 6飽和環烷基； X 2選自-(C(R 1a)(R 1b)) m-CH 2-； m選自1或2； R 1a、R 1b或R 2a各自獨立地選自氫、鹵素或視情況經1、2或3個R取代之C 1-C 6烷基； R各自獨立地為氫或鹵素。
  20. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物選自以下結構式： 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數，較佳2至8之整數或小數，例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數； Ab如請求項1至6之任一項所描述。
  21. 如請求項20之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物選自： 或其醫藥學上可接受之鹽；其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數，較佳2至8之整數或小數，例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數；Ab為抗B7H3抗體，其包含胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示之HCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示之HCDR2、胺基酸序列如SEQ ID NO:3所示之HCDR3、胺基酸序列如SEQ ID NO: 4所示之LCDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO:5所示之LCDR2及胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示之LCDR3；例如，其包含胺基酸序列如SEQ ID NO:10所示之重鏈可變區及胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示之輕鏈可變區；例如，其包含胺基酸序列如SEQ ID NO:12所示之重鏈及如SEQ ID NO:13所示之輕鏈。
  22. 如請求項21之抗體-藥物結合物，其中該抗體-藥物結合物選自： 其中， p表示平均連接數，且p選自1至10之整數或小數，較佳2至8之整數或小數；例如p為4至8之整數或小數，例如p為4至6或6至8之整數或小數，例如p為7.45、5.68或4.02； WBP301088為抗B7H3抗體，其重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:12所示，及輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
  23. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至22中任一項之抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  24. 一種如請求項1至22中任一項之抗體-藥物結合物、其醫藥學上可接受之鹽或請求項23之醫藥組合物在製備用於治療及/或預防B7H3介導之疾病或病症之藥物中之用途，較佳地，該疾病或病症為癌症，例如，該疾病或病症為B7H3陽性表現之疾病或病症。
  25. 如請求項24之用途，其中該癌症選自乳癌、神經腫瘤、黑色素瘤、肺癌、頭頸癌、結直腸癌、胰臟癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膠質母細胞瘤、食管癌、腎細胞癌、子宮內膜癌、皮膚癌、睾丸癌，甲狀腺癌、尿路上皮癌、淋巴瘤(諸如非霍奇金淋巴瘤)、慢性淋巴細胞白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤及多發性骨髓瘤。
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US8802091B2 (en) * 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
CN109641962A (zh) * 2016-06-08 2019-04-16 艾伯维公司 抗b7-h3抗体和抗体药物偶联物
WO2018161872A1 (zh) * 2017-03-06 2018-09-13 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2019024911A1 (zh) * 2017-08-04 2019-02-07 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途
EP3858386A4 (en) * 2018-09-26 2022-10-12 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. LIGAND-DRUG CONJUGATE OF AN EXATECAN ANALOG, METHOD FOR PREPARATION AND THEIR USE
CN112543771B (zh) * 2018-09-30 2023-04-11 江苏豪森药业集团有限公司 抗b7h3抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途
WO2021190586A1 (zh) * 2020-03-25 2021-09-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7h3抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途
CN115175705A (zh) * 2020-09-30 2022-10-11 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种抗肿瘤化合物及其制备方法和应用

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