TW202140778A

TW202140778A - 產生異種胰島細胞和用所述異種胰島細胞治療胰島素抗性或缺乏性病症的方法和組合物

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Publication number: TW202140778A
Application number: TW110100597A
Authority: TW
Inventors: 高楊濱; 岳亞男; 璐菡楊; 馬克桂爾; 沂南坎; 文寧秦
Original assignee: 美商Ｅ開創生物技術股份有限公司; 大陸商杭州啟函生物科技有限公司
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2021-11-01
Also published as: EP4087917A4; JP2023509072A; KR20220147073A; WO2021139722A1; AU2021205151A1; CA3164008A1; EP4087917A1; MX2022008362A; BR112022013442A2; IL294519A; CN115605585A; US20230056661A1

Abstract

本文描述了用於產生適合於異種移植的基因轉殖胰島細胞的方法、組合物和系統。

Description

產生異種胰島細胞和用所述異種胰島細胞治療胰島素抗性或缺乏性病症的方法和組合物

目前的估計表明，截至2030年全球所有年齡組的1/2型糖尿病患病率將達到4.4%。目前用於1型糖尿病的藥物治療包括胰島素替代，並且用於2型糖尿病的藥物治療包括單獨或與二甲雙胍、磺脲類、格列奈類、DPP-4抑制劑、GLP-1受體促效劑、SGLT-2抑制劑或吡格列酮組合的胰島素補充。所有這些策略都需要詳細的患者管理和用藥依從性。此外，儘管有這些干預，但許多患者仍無法實現血糖控制。

需要如下治療策略，所述治療策略在沒有複雜的抗糖尿病藥物或胰島素投予的情況下改善糖尿病患者的血糖控制，或者改善儘管投予抗糖尿病藥物或胰島素但血糖控制仍不佳的糖尿病患者的血糖控制。已經看到同種異體胰島細胞移植（例如門靜脈內胰島細胞移植）在具有嚴重風險因素（例如不穩定型T1DM、無症狀低血糖、嚴重的低血糖發作、血糖不穩定）的1型糖尿病患者的情況下的使用的增加；然而，嚴格的免疫抑制的必然性、移植物存活挑戰和供體細胞可用性阻礙了該技術在1型糖尿病患者、2型糖尿病患者以及1型或2型糖尿病患者的疾病早期的更廣泛使用，在疾病早期改善的血糖控制最大程度地使長期併發症的風險最小化。

在一態樣，本公開文本提供了一種分離的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述細胞：(a) 基本上不含至少一種糖基轉移酶的酶活性，其中所述糖基轉移酶是GGTA、B4GALNT2或CMAH；(b) 表現源自非豬哺乳動物物種的至少兩個多肽序列，其中所述至少兩個多肽序列包括CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-2中的至少兩個；並且 (c) 展現出以下中的一種或多種：來自源自所述非豬哺乳動物物種的補體的降低的毒性、源自所述非豬哺乳動物物種的啟動蛋白C凝血的降低的誘導、源自所述非豬哺乳動物物種的凝血酶-抗凝血酶複合物的降低的誘導或來自源自所述非豬物種的NK細胞的降低的毒性。

在一些實施例中，所述細胞基本上不含選自GGTA、B4GALNT2和CMAH的至少兩種或全部三種糖基轉移酶的酶活性。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，所述細胞表現CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1中的至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個或全部。

在另一態樣，本公開文本提供了一種分離的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述胰島細胞：(a) 基本上不含至少兩種糖基轉移酶的酶活性，其中所述糖基轉移酶包括GGTA、B4GALNT2或CMAH中的至少兩種；(b) 表現源自非豬哺乳動物物種的多肽序列，其中所多肽序列是CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1；並且 (c) 展現出來自源自所述非豬哺乳動物物種的補體的降低的毒性、源自所述非豬物種的啟動蛋白C凝血的降低的誘導、源自所述非豬物種的凝血酶-抗凝血酶複合物的降低的誘導或來自源自所述非豬物種的NK T細胞的降低的毒性。

在一些實施例中，所述細胞基本上不含GGTA、B4GALNT2和CMAH的酶活性。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，所述細胞表現CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1中的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個或全部。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，所述細胞表現CD46、CD55、CD59、CD39、B2M、HLAE和CD47。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，所述細胞基本上不含所述一種或多種糖基轉移酶的表現。在一些實施例中，所述細胞在所述一種或多種糖基轉移酶中包含導致轉譯過早終止的移碼突變，從而去除所述糖基轉移酶的活性。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，將編碼源自非豬哺乳動物物種的所述一個或多個多肽序列的一個或多個核酸序列插入所述豬直系同源物的非直系同源基因座內。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，編碼源自非豬哺乳動物物種的所述一個或多個多肽序列的一個或多個核酸序列與所述豬直系同源物的非直系同源啟動子可操作地連接。在一些實施例中，所述非直系同源啟動子是非豬啟動子。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，所述胰島細胞是通過豬胰腺的分解而得到的。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，所述胰島細胞是α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、胰多肽（PP）細胞或其任何組合。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，所述非豬哺乳動物物種是靈長類物種。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，當移植到所述非豬哺乳動物物種中時，所述細胞展現出大於8天的存活。

在本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的一些實施例中，所述細胞展現出對從所述非豬哺乳動物物種分離的PBMC的降低的IBMIR。

在另一態樣，本公開文本提供了一種組合物，其包含治療有效量的本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞。在一些實施例中，所述等滲緩衝溶液還包含肝素或TNF-α抑制劑。

在本文公開的任何組合物的一些實施例中，所述組合物包含至少約12%至約25% β細胞或至少約15%至約30% α細胞。

在本文公開的任何組合物的一些實施例中，所述組合物是根據本文公開的任何一種方法來製備的。

在另一態樣，本公開文本提供了一種治療有需要的非豬哺乳動物的胰島素抗性或缺乏性病症的方法，其包括向所述哺乳動物投予治療有效劑量的本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞或本文公開的任何組合物。

在一些實施例中，所述方法包括經由所述哺乳動物的頸內靜脈或肝門靜脈集中投予所述細胞。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，所述胰島素抗性病症包括1型糖尿病。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，所述胰島素抗性病症包括2型糖尿病。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，在投予所述基因轉殖豬胰島細胞或所述組合物之前，所述非豬哺乳動物已經接受過誘導方案，所述誘導方案包括治療有效劑量的抗胸腺細胞球蛋白、抗CD40抗體、抗CD20抗體、雷帕黴素類似物（rapalog）、鈣調磷酸酶抑制劑、更昔洛韋或其前驅藥、抗組胺藥和皮質類固醇。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，所述方法還包括在投予所述基因轉殖豬胰島細胞或所述組合物之後投予治療有效劑量的抗CD40抗體、雷帕黴素類似物、鈣調磷酸酶抑制劑和更昔洛韋或其前驅藥。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，所述方法還包括在投予所述基因轉殖豬胰島細胞或所述組合物之後投予治療有效劑量的中效或長效胰島素類似物、甘精胰島素、地特胰島素或NPH胰島素。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，本文公開的任何治療有效劑量是至少5,000 IEQ/kg非豬哺乳動物體重。

在另一態樣，本公開文本提供了一種分離的豬胰島，其包含本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞。在一些實施例中，所述胰島基本上不含胰腺外分泌細胞。

在另一態樣，本公開文本提供了一種分離的豬胰腺類器官，其包含本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞。在一些實施例中，所述類器官基本上不含胰腺外分泌細胞。在一些實施例中，所述胰腺類器官是通過以下方式製備的：(a) 在新生的第7天或更早從新生豬動物分離胰腺；以及 (b) 對所述胰腺進行機械或酶消化以產生類器官片段，以及視情況：(c) 通過ficoll梯度沈降純化步驟 (b) 的類器官片段。

在另一態樣，本公開文本提供了一種分離的豬胰腺，其包含本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞。

在另一態樣，本公開文本提供了一種在移植到非豬哺乳動物受體之前提高來自豬供體的胰島產量的方法，其包括：(a) 提供已經經受純化程序的來自新生豬動物的胰腺類器官；(b) 在所述純化之後，在存在有效濃度的胱冬肽酶抑制劑的情況下將所述類器官培養至少90分鐘；以及 (c) 在存在有效濃度的皮質類固醇的情況下繼續培養至少7天。

在一些實施例中，所述純化程序包括：(a) 在新生的第7天或更早從基因轉殖新生豬動物分離胰腺；以及 (b) 對所述胰腺進行機械或酶消化以產生類器官片段，以及視情況：(c) 通過ficoll梯度沈降從所述經消化的胰腺中純化類器官片段。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，所述新生豬動物是基因轉殖豬，其包含根據本文公開的任何分離的基因轉殖豬胰島細胞的至少一種豬細胞。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，所述胱冬肽酶抑制劑是Z-VAD-FMK。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，所述皮質類固醇是甲潑尼龍。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，在存在IBMX、磷酸二酯酶抑制劑或腺苷受體拮抗劑的情況下培養所述胰腺類器官。

在本文公開的任何一種方法的一些實施例中，在存在菸鹼醯胺或其代謝可接受的類似物的情況下培養所述胰腺類器官。在另一態樣，本公開文本提供了一種治療有需要的非豬哺乳動物的胰島素抗性或缺乏性病症的方法，其包括當根據本文公開的任何一種類器官的類器官滿足以下標準中的任何一種時，將所述類器官移植到所述非豬哺乳動物中：(a) 內毒素小於約5 EU/kg；(b) 革蘭氏染色陰性；(c) 活力大於約70%；或 (d) 胰島濃度大於或等於約20,000 IEQ/mL總沈降體積。

相關申請的交叉引用

本申請要求2020年1月7日提交的國際申請號PCT/CN2020/070698的優先權，將其出於所有目的通過引用以其整體併入本文。通過引用併入

本說明書中所提到的所有出版物、專利和專利申請都通過引用併入本文，併入程度如同指示每個單獨出版物、專利或專利申請明確且單獨地通過引用併入一般。概述

本公開文本通過提供用於移植的異種胰島細胞解決了與移植相關的免疫抑制、移植物存活和供體細胞可用性挑戰。所公開的異種細胞（例如經基因修飾的異種細胞）展現出降低的免疫原性和增加的存活，因此適用於胰島細胞移植，從而需要減少免疫抑制劑在移植受體中的使用。本文進一步描述了用於衍生此類細胞的方法、組合物和系統以及涉及使用此類細胞的治療方法。定義

術語“豬（pig）”、“豬（swine）”和“豬（porcine）”在本文中可互換使用，是指與家豬物種野豬（Sus scrofa ）的各種品種有關的任何動物。

當在疾病、損傷或障礙的情況下使用時，術語“治療（treatment）”、“治療（treating）”、“減輕”等在本文中用於通常意指獲得所需藥理學和/或生理學作用，並且還可以用於指代改善、減輕和/或降低所治療病症的一種或多種症狀的嚴重性。就完全或部分延遲疾病、病症或其症狀的發作或復發而言，所述作用可以是預防性的，和/或就部分或完全治癒疾病或病症和/或可歸因於所述疾病或病症的不利作用而言，所述作用可以是治療性的。如本文所用的“治療”涵蓋對哺乳動物、特別是人的疾病或病症的任何治療，並且包括：(a) 在可能易患所述疾病或病症但尚未被診斷為患有所述疾病或病症的受試者中預防所述疾病或病症發生；(b) 抑制所述疾病或病症（例如，阻止其發展）；或 (c) 緩解所述疾病或病症（例如，使所述疾病或病症消退，從而改善一種或多種症狀）。

當用於指代蛋白質或多肽的片段或衍生物時，術語“生物活性”意指所述片段或衍生物保留了參考全長蛋白質或多肽的至少一種可量測和/或可檢測的生物活性。例如，CRISPR/Cas9蛋白的生物活性片段或衍生物可以能夠結合gRNA，有時在本文中也稱為單指導RNA（sgRNA），當與指導RNA複合時結合靶DNA序列，和/或切割一條或多條DNA鏈。例如，細胞受體的生物活性片段或衍生物可以能夠結合通過所述受體發出信號的天然配體，或者能夠傳遞通常由所述受體響應於配體而傳遞的細胞內信號。

如本文所用，本文中的術語“插入缺失（indel）”是指在染色體或附加體中的靶DNA序列中的核苷酸鹼基的插入或缺失。例如，這種插入或缺失可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個鹼基的插入或缺失。在某些實施例中，插入缺失可以甚至更大，至少約20、30、40、50、60、70、80、90或100個鹼基。如果將插入缺失引入基因的開放閱讀框（ORF）中，則所述插入缺失可以通過產生移碼突變來破壞由ORF編碼的蛋白質的野生型表現。插入缺失可以是基因組序列雙鏈切割（例如通過定點或可程式設計核酸酶）、接著使用非同源末端連接（NHEJ）進行細胞修復的結果。

如本文所用，術語“1型糖尿病”（T1DM）是指特徵在於由於胰腺中的β細胞的破壞（例如自體免疫破壞）而無法產生胰島素的病症。在一些實施例中，1型糖尿病由特定臨床標準（“3期T1DM”）來定義，所述特定臨床標準包括以下中的至少一種：空腹血漿葡萄糖（FPG）水準 ≥ 126 mg/dL（7.0 mmol/L）、在75 g口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）期間2小時血漿葡萄糖水平 ≥ 200 mg/dL（11.1 mmol/L）、具有高血糖或高血糖危象的典型症狀的患者的隨機血漿葡萄糖 ≥ 200 mg/dL（11.1 mmol/L）或者血紅蛋白A1c（HbA1c）水準為6.5%或更高。在一些實施例中，“1型糖尿病”（T1DM）是T1DM的特定分期，如1期、2期或3期。雖然1期除了存在針對β細胞的多種自體抗體以外可能是無症狀的，但2期可能伴有血糖代謝障礙（IFG和/或IGT）、中等FPG水準（如100-125 mg/dL（5.6-6.9 mmol/L））、在75 g口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）期間中等2小時血漿葡萄糖水平140-199 mg/dL（7.8-11.0 mmol/L）或者中等血紅蛋白A1c（HbA1c）水準為5.7%-6.4%（39-47 mmol/mol）。1型糖尿病（T1DM）可能發生在兒童、少年、青少年或成人中。1型糖尿病通常在發生多尿、多飲、多食、糖尿病酮症酸中毒或無法解釋的體重減輕後被診斷出。

如本文所用，術語“2型糖尿病”（T2DM）是指特徵在於在胰島素抗性的背景下頻繁地β細胞胰島素分泌的逐漸喪失的病症。在一些實施例中，1型糖尿病由特定臨床標準來定義，所述特定臨床標準包括以下中的至少一種：空腹血漿葡萄糖（FPG）水準 ≥ 126 mg/dL（7.0 mmol/L）、在75 g口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）期間2小時血漿葡萄糖水平 ≥ 200 mg/dL（11.1 mmol/L）、具有高血糖或高血糖危象的典型症狀的患者的隨機血漿葡萄糖 ≥ 200 mg/dL（11.1 mmol/L）或者血紅蛋白A1c（HbA1c）水準為6.5%或更高。

在一些實施例中，本文所提及的蛋白質或基因是根據下表的：

蛋白質/基因	名稱	也稱為	示例性人或豬UniProtKB參考
GGTA	N-乙醯乳糖胺α-1,3-半乳糖基轉移酶	GGTA1	P50127 (GGTA1_豬)
β4GALNT2	β1,4 N-乙醯胺基半乳糖轉移酶	B4GALNT2，B4GAL
CMAH	胞苷單磷酸-N-乙醯神經胺酸羥化酶		O19074 (CMAH_豬)
CD46	CD46補體調節蛋白		P15529 (MCP_人)
CD55	CD55分子(Cromer血型)	衰變加速因子，DAF	P08174 (DAF_人)
CD59	CD59分子(CD59血型)		P13987 (CD59_人)
THBD	血栓調節蛋白	CD141抗原	P07204 (TRBM_人)
TFPI	組織因子途徑抑制劑	脂蛋白相關凝血抑制劑	P10646 (TFPI1_人)
CD39	CD39抗原	外核苷三磷酸二磷酸水解酶1，ENTPD1	P55772 (ENTP1_小鼠)
HLA-E	主要組織相容性複合物I類E	MHC I類抗原E，MHC Ib類抗原	P13747 (HLAE_人)
B2M	β-2微球蛋白	MHC I類分子的β鏈	P61769 (B2MG_人)
CD47	分化簇47，CD47抗原	整合素相關蛋白	Q08722 (CD47_人)
A20	A20	TNF α誘導蛋白3，TNFAIP3	P21580 (TNAP3_人)
PD-L1	程式性細胞死亡配體1	CD274，B7同系物1，B7H1	Q9NZQ7 (PD1L1_人)
FasL	Fas配體	FASL，CD95，腫瘤壞死因子(配體)超家族成員6，TNFL6	P48023 (TNFL6_人)

細胞、組織、產生細胞和組織的方法以及使用所述細胞、組織的治療方法

本公開文本提供了具有多個經修飾基因的細胞、組織和器官，以及產生所述細胞、組織和器官的方法。在一些實施例中，所述細胞、組織或器官是從動物獲得的。在一些實施例中，所述動物是哺乳動物。在一些實施例中，所述哺乳動物是非人哺乳動物，例如馬、靈長類、豬、牛、綿羊、山羊、犬或貓。在一些實施例中，所述哺乳動物是豬。

在一些實施例中，所述一種或多種細胞是豬細胞。豬細胞起源或所源自的品種的非限制性例子包括任何以下豬品種：美國長白豬（American Landrace）、美國約克夏豬（American Yorkshire）、阿克塞黑色雜色豬（Aksai Black Pied）、昂格爾恩白肩豬（Angeln saddleback）、阿巴拉契亞英國豬（Appalachian English）、阿拉帕瓦島豬（Arapawa Island）、奧克蘭群島豬（Auckland Island）、澳大利亞約克夏豬（Australian Yorkshire）、巴比甘榜豬（Babi Kampung）、巴川豬（Ba Xuyen）、班圖豬（Bantu）、巴斯克豬（Basque）、巴茲納豬（Bazna）、北京黑豬（Beijing Black）、白俄羅斯黑色雜色豬（Belarus Black Pied）、比利時長白豬（Belgian Landrace）、孟加拉棕色山納豬（Bengali Brown Shannaj）、本特海姆黑色雜色豬（Bentheim Black Pied）、巴克夏豬（Berkshire）、比薩羅豬（Bisaro）、班古爾豬（Bangur）、黑斯拉夫尼亞豬（Black Slavonian）、黑色加那利豬（Black Canarian）、布裡伊土烏豬（Breitovo）、英國長白豬（British Landrace）、英國羅布泊豬（British Lop）、英國白肩豬（British Saddleback）、保加利亞白豬（Bulgarian White）、卡母布拉夫豬（Cambrough）、廣東豬（Cantonese）、凱爾特豬（Celtic）、查托穆爾西亞豬（Chato Murciano）、賈斯特白豬（Chester White）、清邁黑豬（Chiangmai Blackpig）、喬克托豬（Choctaw Hog）、克裡奧爾豬（Creole）、捷克改良白豬（Czech Improved White）、丹麥長白豬（Danish Landrace）、丹麥普羅泰斯特豬（Danish Protest）、德曼替斯雜色豬（Dermantsi Pied）、裡延豬（Li Yan）、杜洛克豬（Duroc）、荷蘭長白豬（Dutch Landrace）、東方長白豬（East Landrace）、東方巴爾幹豬（East Balkan）、埃塞克斯豬（Essex）、愛沙尼亞培根豬（Estonian Bacon）、楓涇豬（Fengjing）、芬蘭長白豬（Finnish Landrace）、林山豬（Forest Mountain）、法國長白豬（French Landrace）、加斯科涅豬（Gascon）、德國長白豬（German Landrace）、格洛斯特郡斑點豬（Gloucestershire Old Spots）、哥廷根小型豬（Gottingen minipig）、格萊斯豬（Grice）、幾內亞豬（Guinea Hog）、漢普郡豬（Hampshire）、漢特豬（Hante）、赫裡福德豬（Hereford）、荷佐豬（Hezuo）、霍根豬（Hogan Hog）、亨廷頓黑豬（Huntington Black Hog）、伊比利亞豬（Iberian）、義大利長白豬（Italian Landrace）、日本長白豬（Japanese Landrace）、濟州黑豬（Jeju Black）、金華豬（Jinhua）、卡克黑提安豬（Kakhetian）、可萊豬（Kele）、克麥羅沃豬（Kemerovo）、韓國本土豬（Korean Native）、克斯烤普捷豬（Krskopolje）、庫內昆豬（Kunekune）、拉孔布豬（Lamcombe）、大黑豬（Large Black）、大黑白豬（Large Black-White）、大白豬（Large White）、拉脫維亞白豬（Latvian White）、萊科馬豬（Leicoma）、立陶宛本土豬（Lithuanian Native）、立陶宛白豬（Lithuanian White）、林肯郡卷毛豬（Lincolnshire Curly-Coated）、利夫內豬（Livny）、瑪律哈多-德阿爾科巴薩豬（Malhado de Alcobaca）、曼加利察豬（Mangalitsa）、梅山豬（Meishan）、中白豬（Middle White）、民豬（Minzhu）、三川比塔豬（Minokawa Buta）、蒙開豬（Mong Cai）、莫拉-羅馬諾拉豬（Mora Romagnola）、莫拉豬（Moura）、木庫塔豬（Mukota）、繆爾福特豬（Mulefoot）、穆羅姆豬（Murom）、米爾霍羅德豬（Myrhorod）、尼祿-迪-內布羅迪豬（Nero dei Nebrodi）、內江豬（Neijiang）、紐西蘭豬（New Zealand）、寧鄉豬（Ningxiang）、北高加索豬（North Caucasian）、北西伯利亞豬（North Siberian）、挪威長白豬（Norwegian Landrace）、挪威約克夏豬（Norwegian Yorkshire）、奧薩寶島豬（Ossabaw Island）、牛津桑迪黑豬（Oxford Sandy and Black）、派克叢5豬（Pakchong 5）、菲律賓本土豬（Philippine Native）、皮特蘭豬（Pietrain）、波中豬（Poland China）、紅垂豬（Red Wattle）、白肩豬（Saddleback）、塞米爾程思科豬（Semirechensk）、西伯利亞黑色雜色豬（Siberian Black Pied）、小黑豬（Small Black）、小白豬（Small White）、斑點豬（Spots）、泗水巴比豬（Surabaya Babi）、斯瓦比亞-哈爾豬（Swabian-Hall）、瑞典長白豬（Swedish Landrace）、燕覆曼加利察豬（Swallow Belied Mangalitza）、太湖豬（Taihu pig）、塔姆沃思豬（Tamworth）、修-紐埃豬（Thuoc Nhieu）、藏豬（Tibetan）、東京-X豬（Tokyo-X）、齊維利斯克豬（Tsivilsk）、圖羅波列豬（Turopolje）、烏克蘭草原花豬（Ukrainian Spotted Steppe）、烏克蘭草原白豬（Ukrainian White Steppe）、烏爾茹姆豬（Urzhum）、越南大肚豬（Vietnamese Potbelly）、威爾士豬（Welsh）、威賽克斯白肩豬（Wessex Saddleback）、西法白豬（West French White）、文斯奈兒豬（Windsnyer）、五指山豬（Wuzhishanm）、雅南豬（Yanan）、約克夏豬（Yorkshire）和約克夏藍白豬（Yorkshire Blue and White）。在一些實施例中，所述豬細胞是約克夏（Yorkshire）和尤卡坦（Yucatan）豬細胞。

在一些實施例中，本公開文本的細胞是胰島細胞或其子集。所述胰島細胞可以包括β細胞、α細胞、δ細胞、ε細胞或PP細胞（也稱為γ細胞或F細胞）。在一些實施例中，本公開文本的細胞是胰島。在一些實施例中，本公開文本的細胞包含在完整胰腺中。在一些實施例中，本公開文本的細胞包含在胰腺片段中。在一些實施例中，本公開文本的細胞包含在胰腺類器官中。在一些實施例中，本公開文本的細胞包含在細胞聚集體中。在一些實施例中，本公開文本的細胞是分散在介質（例如，固體、半固體、凝膠、液體或其組合）中的細胞。在一些實施例中，本公開文本的細胞包含在細胞簇中。在一些實施例中，本公開文本的胰島細胞或類器官基本上不含胰腺外分泌細胞。

在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織、器官或動物已經進行基因修飾，使得一個或多個基因已經通過添加、缺失、失活、破壞、切除其部分而被修飾，或者所述基因序列的一部分已經被改變。

在一些實施例中，本公開文本的細胞、組織或器官包含使一個或多個基因失活的一個或多個突變。在一些實施例中，所述細胞、組織、器官或動物包含一個或多個突變或表觀遺傳變化，其導致具有所述一個或多個突變的一個或多個基因的表現減少或消除。在一些實施例中，通過對存在於所述細胞、組織、器官或動物中的一個或多個核酸進行基因修飾來使所述一個或多個基因失活。在一些實施例中，一個或多個基因的失活通過測定來證實。在一些實施例中，所述測定是逆轉錄酶PCR測定、RNA-seq、即時PCR或連接PCR定位測定。在一些實施例中，所述測定是針對所述基因蛋白的功能的酶促測定或針對從所述基因或所述基因的片段轉錄的蛋白質的免疫測定。

本公開文本的細胞、組織或器官可以通過任何合適的方法進行基因修飾。用於本文公開和描述的敲除（KO）、敲入（KI）和/或基因組置換策略的合適方法的非限制性例子包括使用Cas9、Cas12a（Cpf1）、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、Cas12i或其他CRISPR核酸內切酶、Argonaute核酸內切酶、轉錄啟動因子樣（TAL）效應物核酸酶（TALEN）、鋅指核酸酶（ZFN）、表現載體、轉座子系統（例如PiggyBac轉座酶）或其任何組合的CRISPR介導的基因修飾。在一些實施例中，

在一些實施例中，所述細胞、組織或器官基本上不含至少一種糖基轉移酶的酶活性，其中所述糖基轉移酶是GGTA、B4GALNT2或CMAH。所述細胞、組織或器官可以基本上不含選自GGTA、B4GALNT2和CMAH的至少兩種糖基轉移酶的酶活性。所述細胞、組織或器官可以基本上不含選自GGTA、B4GALNT2和CMAH的三種糖基轉移酶的酶活性。在一些情況下，基本上不含選自GGTA、B4GALNT2和CMAH的至少一種糖基轉移酶的酶活性的細胞基本上不含可檢測水準的所述糖基轉移酶蛋白的全長拷貝。在一些情況下，基本上不含選自GGTA、B4GALNT2和CMAH的至少一種糖基轉移酶的酶活性的細胞基本上不含可檢測水準的所述糖基轉移酶蛋白的功能性多肽片段。在一些情況下，基本上不含選自GGTA、B4GALNT2和CMAH的至少一種糖基轉移酶的酶活性的細胞基本上不含編碼所述全長糖基轉移酶的mRNA的轉錄。在一些情況下，基本上不含選自GGTA、B4GALNT2和CMAH的至少一種糖基轉移酶的酶活性的細胞基本上不含編碼所述糖基轉移酶的功能性片段的mRNA的轉錄。在一些情況下，基本上不含選自GGTA、B4GALNT2和CMAH的至少一種糖基轉移酶的酶活性的細胞包含所述至少一種糖基轉移酶的開放閱讀框內的插入缺失。可以使用定點核酸酶產生所述插入缺失。所述插入缺失可以破壞所述至少一種糖基轉移酶的開放閱讀框（ORF）（或在基因組內具有多個拷貝的基因的情況下，所有ORF），使得當糖基轉移酶基因被轉錄時，阻止全長或功能性片段mRNA或蛋白質的產生。

在一些實施例中，所述細胞、組織或器官表現源自非豬哺乳動物物種的至少兩個多肽序列（例如，至少兩個異源多肽序列），其中所述至少兩個多肽序列包括CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1中的至少兩個。所述細胞、組織或器官可以表現CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1中的至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個或全部。在一些情況下，源自非豬哺乳動物物種的所述至少兩個多肽序列包括CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1或其組合的全長序列。在一些情況下，源自非豬哺乳動物物種的所述至少兩個多肽序列包括CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1或其組合的功能性片段。在一些情況下，表現源自非豬哺乳動物物種的至少兩個多肽序列的細胞、組織或器官表現編碼CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1或其組合的全長序列的mRNA。在一些情況下，表現源自非豬哺乳動物物種的至少兩個多肽序列的細胞、組織或器官表現編碼CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1或其組合的功能性片段序列的mRNA。

在一些實施例中，本文公開的任何一個異源多肽序列與由目的人基因或其片段編碼的多肽序列至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施例中，編碼本文公開的任何一個異源多肽序列的多核苷酸序列與目的人基因或其片段至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些例子中，本文公開的目的人基因可以包括選自以下的一個或多個成員（例如，兩個或更多個成員）：CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL和HO-1。

在一些實施例中，本文公開的任何經基因修飾的細胞、組織或器官可以用於治療與經基因修飾的細胞不同物種的受試者。在一些實施例中，本公開文本提供了將本文所述的任何經基因修飾的細胞、組織或器官移植到有需要的受試者中的方法。在一些實施例中，所述受試者是人。在一些實施例中，所述受試者是非人靈長類。

所述非豬哺乳動物物種可以是靈長類物種。在一些實施例中，所述非豬哺乳動物物種是非人靈長類。

在一些實施例中，所述非豬哺乳動物物種是智人（Homo Sapiens ）。

在一些情況下，表現源自非豬哺乳動物物種的至少兩個多肽序列的細胞、組織或器官包含編碼CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1、其組合或其融合物的基因組序列。在一些情況下，所述基因組序列包含編碼CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1、其組合或其融合物的全長拷貝的開放閱讀框。在一些情況下，所述基因組序列包含編碼CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1、其組合或其融合物的功能性片段的開放閱讀框。在一些實施例中，所述開放閱讀框與啟動子可操作地連接。在一些實施例中，所述啟動子是遍在啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是人啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是非豬啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是病毒啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是豬啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是遍在啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是源自所述非豬哺乳動物物種的基因的天然人啟動子或其功能性片段，例如CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1的天然啟動子。在一些實施例中，所述啟動子是源自所述非豬哺乳動物物種的基因的豬直系同源物的豬啟動子或其功能性片段，例如CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1的啟動子。

編碼所述至少兩個多肽序列的基因組序列可以位於所述細胞、組織或器官的基因組中的任何合適位置。在一些實施例中，編碼所述至少兩個多肽序列的基因組序列位於所述豬基因組中的“安全港”基因座，例如AAVS1、CEP112、ROSA26、Pifs302或Pifs501。在一些實施例中，編碼所述至少兩個多肽序列的基因組序列位於或接近于另一基因的基因座，所述基因座已經通過使用定點或可程式設計核酸酶（例如上文提到的GGTA、B4GALNT2、CMAH）形成插入缺失而被“敲除”。在一些實施例中，編碼所述至少兩個多肽序列的基因組序列位於源自所述非豬哺乳動物物種的多肽的相應直系同源豬基因座，例如CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1的直系同源物的基因座。在一些實施例中，編碼所述至少兩個多肽序列的基因組序列位於相應直系同源豬多肽（例如CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1的直系同源物）的位置。

在一些實施例中，源自非豬哺乳動物物種的至少兩個多肽序列包括CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1的子集。所述子集可以是CD46、CD55、CD59、CD39、B2M、HLAE和CD47。所述子集可以是選自炎性反應基因轉殖、免疫反應基因轉殖、免疫調節劑基因轉殖、凝血反應基因轉殖、補體反應基因轉殖及其組合的至少兩種類型的基因轉殖。炎性反應基因轉殖可以包括TNF α誘導蛋白3（A20）、血紅素加氧酶（HO-1）、分化簇47（CD47）或其組合。免疫反應基因轉殖可以包括人白細胞抗原-E（HLA-E）、β-2微球蛋白（B2M）或其組合。免疫調節劑基因轉殖可以包括程式性死亡配體1（PD-L1）、Fas配體（FasL）或其組合。凝血反應基因轉殖可以包括分化簇39（CD39）、血栓調節蛋白（THBD）、組織因子途徑抑制劑（TFPI）及其組合。補體反應基因轉殖可以包括膜輔因子蛋白（hCD46）、補體衰變加速因子（hCD55）、MAC抑制因子（hCD59）或其組合。

在一些實施例中，源自非豬哺乳動物物種的所述至少兩個多肽序列可以作為串聯序列（例如作為例如通過同源重組整合的單個構建體）來提供。

在一些實施例中，當移植到非豬哺乳動物物種中時，本文所述的細胞、組織或器官可以展示出大於約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、20天、24天、36天、48天、60天、72天、84天或更長時間的存活。

在一些實施例中，當移植到本文所述的非豬哺乳動物物種中時，本文所述的細胞、組織或器官可以展示出改變的免疫反應。本文所述的細胞、組織或器官可以展示出對從非豬哺乳動物物種分離的PBMC的降低的IBMIR。血液介導的即刻免疫反應（IBMIR）是在供體胰島移植到受體後不久誘導的有效的先天免疫反應，包括凝血和補體級聯以及白細胞和血小板群體，所述有效的先天免疫反應可以例如使用監測補體啟動的測定來量測（Kourtzelis等人, 第11章 “Regulation of Instant Blood Mediated Inflammatory Reaction (IBMIR) in Pancreatic Islet Xeno-Transplantation: Points for Therapeutic Interventions” 在J.D. Lambris等人 (編輯), Immune Responses to Biosurfaces (2015), Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer International中）。IBMIR可以降低至少約0.25倍、約0.5倍、約0.75倍、約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍或約10倍或更多。本文所述的細胞、組織或器官可以展示出來自源自非豬物種的補體的降低的毒性。可以使用放射性測定（例如，⁵¹ Cr測定）、活細胞染色（例如，通過流式細胞術）、釋放的胞內酶（如LDH或GAPDH）的活性或死細胞染色來量測來自源自非豬物種的補體的毒性。示例性方法描述於Yamamoto等人 Scientific Reports (10): 9771 (2020)中。源自非豬物種的補體的毒性可以降低至少約0.25倍、約0.5倍、約0.75倍、約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍或約10倍或更多。本文所述的細胞、組織或器官可以展示出源自非豬哺乳動物物種的啟動蛋白C凝血的降低的誘導。源自非豬哺乳動物物種的啟動蛋白C凝血的誘導可以降低至少約0.25倍、約0.5倍、約0.75倍、約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍或約10倍或更多。本文所述的細胞、組織或器官可以展示出源自非豬物種的凝血酶-抗凝血酶複合物形成的降低的誘導。源自非豬物種的凝血酶-抗凝血酶複合物形成的誘導可以降低至少約0.25倍、約0.5倍、約0.75倍、約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍或約10倍或更多。本文所述的細胞、組織或器官可以展示出來自源自非豬物種的NK細胞的降低的毒性。可以使用放射性測定（例如，⁵¹ Cr測定）、活細胞染色（例如，通過流式細胞術）、釋放的胞內酶（如LDH或GAPDH）的活性、死細胞染色或其他用於評估細胞毒性的技術來量測來自源自非豬物種的NK細胞的毒性。來自源自非豬物種的NK細胞的毒性可以降低至少約0.25倍、約0.5倍、約0.75倍、約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍或約10倍或更多。

在一些情況下，本公開文本提供了組合物，其包含治療有效劑量的根據本文所述的任何實施例的豬胰島細胞。所述胰島細胞可以包括在胰腺中發現的處於其自然比例的胰島細胞，或者可以包括胰島細胞或處於不同於在胰腺中自然發現的比例的胰島細胞的子集。所述胰島細胞可以包括β細胞、α細胞、δ細胞、ε細胞或PP細胞（也稱為γ細胞或F細胞）。

在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的β細胞：至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、50%或更多。在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的β細胞：至多約50%、45%、40%、35%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約10%至約30%的量的β細胞。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約12%至約25%的量的β細胞。

在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的α細胞：至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、50%或更多。在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的α細胞：至多約50%、45%、40%、35%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約10%至約40%的量的α細胞。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約15%至約30%的量的β細胞。

在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的δ細胞：至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、50%或更多。在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的δ細胞：至多約50%、45%、40%、35%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約10%至約40%的量的δ細胞。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約15%至約30%的量的δ細胞。

在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的ε細胞：至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、50%或更多。在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的ε細胞：至多約50%、45%、40%、35%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約10%至約40%的量的ε細胞。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約15%至約30%的量的ε細胞。

在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的胰多肽（PP）細胞：至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、50%或更多。在一些情況下，所述胰島細胞可以包括如下量的PP細胞：至多約50%、45%、40%、35%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約10%至約40%的量的PP細胞。在一些例子中，所述胰島細胞可以包括範圍從約15%至約30%的量的PP細胞。

在一些情況下，β細胞的數量相比於α細胞的數量可以是至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在一些情況下，β細胞的數量相比於α細胞的數量可以是至多約50%、45%、40%、35%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少。在一些例子中，β細胞的數量相比於α細胞的數量可以在約10%至約40%之間的範圍內。在一些例子中，β細胞的數量相比於α細胞的數量可以在約15%至約30%之間的範圍內。

所述細胞可以通過如下方式來配製：首先將它們從其培養基或從分解的胰腺收穫，然後在適合於以治療有效量投予的介質和容器系統（“醫藥上可接受的”載劑）中洗滌和濃縮所述細胞。合適的輸注介質可以是任何等滲介質配製品，例如可以利用生理鹽水、Normosol R（Abbott）、血漿-裂解物A（Baxter）、水中的5%右旋糖、乳酸林格液、不含酚紅加肝素的CMRL 1066（例如，100 U/kg受體）等。輸注介質可以補充有人血清白蛋白、胎牛血清或其他人血清組分。在一些情況下，可以將抗凝劑（例如，肝素）以如下量投予：至少1個單位/公斤受體（U/kg）、2 U/kg、3 U/kg、4 U/kg、5 U/kg、10 U/kg、15 U/kg、20 U/kg、30 U/kg、40 U/kg、50 U/kg、60 U/kg、70 U/kg、80 U/kg、90 U/kg、100 U/kg、150 U/kg、200 U/kg、250 U/kg、300 U/kg、350 U/kg、400 U/kg、450 U/kg、500 U/kg、600 U/kg、700 U/kg、800 U/kg、900 U/kg、1,000 U/kg或更多。可以將所述抗凝劑與所述胰島細胞在同一溶液（例如，緩衝液）中投予。在其他實施例中，可以將所述抗凝劑和所述胰島細胞單獨投予。在一些情況下，可以將TNF-α抑制劑（例如，依那西普）以如下量投予：至少約0.1毫克/公斤受體（mg/kg）、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg或更多。在一個例子中，可以將所述TNF-α抑制劑以約3 mg/kg的量投予。可以將所述TNF-α抑制劑與所述胰島細胞在同一溶液（例如，緩衝液）中投予。在其他實施例中，可以將所述TNF-α抑制劑和所述胰島細胞單獨投予。

在一些情況下，本公開文本提供了治療有需要的非豬哺乳動物的胰島素抗性或缺乏性病症的方法。所述胰島素抗性或缺乏性病症可以包括1型或2型糖尿病、單基因糖尿病綜合征（如新生兒糖尿病和青少年發病的成人型糖尿病[MODY]）、外分泌胰腺疾病（如囊性纖維化和胰腺炎）或者藥物或化學品誘導的糖尿病（如在治療HIV/AIDS時或器官移植後使用糖皮質激素）。在一些實施例中，當所述胰島素抗性或缺乏性病症包括1型或2型糖尿病時，所述哺乳動物可能展現出特定的臨床標準，如空腹血漿葡萄糖水平、口服葡萄糖耐量試驗的表現或HbA1C。在一些實施例中，所述胰島素抗性或缺乏性病症可以包括存在於所述哺乳動物中的增強的風險因素，如不穩定型糖尿病、無症狀低血糖、嚴重的低血糖發作或血糖不穩定。

所述非豬哺乳動物物種可以是靈長類物種。在一些實施例中，所述非豬哺乳動物物種是非人靈長類。所述非人靈長類包括根據非人現存靈長類的任何或全部的各種分類法的非人現存靈長類，包括但不限於狨猴科（Callitrichidae）（狨猴和絹毛猴）、卷尾猴科（Cebidae）（新世界猴）、獼猴科（Cercopithecidae）（舊世界猴）、鼠狐猴科（Cheirogaleidae）（倭狐猴和鼠狐猴）、指猴科（Daubentoniidae）（狐猿）、嬰猴科（Galagonidae）（嬰猴和叢猴）、人科（Hominidae）（包括類人猿）、長臂猿科（Hylobatidae）（長臂猿和小猿（lesser apes））、光面狐猴科（Indridae）（馬達加斯加大狐猴、冕狐猴屬（sifakas）和親屬）、狐猴科（Lemuridae）（真正的狐猴）、懶猴科（Loridae）（懶猴）、嬉猴科（Megaladapidae）（鼬狐猴屬（sportive lemurs））和跗猴科（Tarsiidae）（眼鏡猴）。術語“非人靈長類”涵蓋非人靈長類及其根據非人現存靈長類的任何或全部的各種分類法所分類的族群。例如，Wilson和Reeder (1993) 將嬉猴科與狐猴科、嬰猴科與懶猴科（以及在將後者拼寫為懶猴科（Loridae）而不是懶猴科（Lorisidae）時）分開，並且包括以下文獻中的類人猿：Hominidae. Wilson, D. E.和D. M. Reeder. 1993. Mammal Species of the World, A Taxonomic and Geographic Reference. 第2版. Smithsonian Institution Press, Washington。Anderson和Jones (1984) 將現存靈長類（primates/Primates）的目分為兩個亞目即原猴亞目（Strepsirhini）和簡鼻亞目（Haplorhini）。Thorington, R. W., Jr.和S. Anderson. 1984. Primates. 第187-217頁在Anderson, S.和J. K. Jones, Jr. (編輯). Orders and Families of Recent Mammals of the World. John Wiley and Sons, N.Y.中。原猴亞目主要包括具有許多原始特徵的樹棲物種，但同時也針對特定的生活方式進行了一些極端的特化，並且其中簡鼻亞目是所謂的“高級”靈長類，進一步分為兩大類即闊鼻類（Platyrrhini）和狹鼻類（Catarrhini）。闊鼻類具有扁平的鼻子、向外指向的鼻孔、在上頜和下頜中的三顆前磨牙、帶有3或4個大尖的前上磨牙，並且僅在新世界中發現（卷尾猴科和狨猴科）。狹鼻類具有成對的緊靠在一起的向下指向的鼻孔；通常在每個頜中的兩顆前磨牙、帶有4個尖的前上磨牙，並且僅在舊世界中發現（獼猴科、長臂猿科、人科）。大多數靈長類物種生活在熱帶或亞熱帶，但有些也居住在溫帶地區。除了少許陸生物種外，靈長類是樹棲的。有些物種吃葉子或果實；其他則是食蟲或食肉的。參見Myers, P. 1999. “Primates” (線上), Animal Diversity Web，訪問於2005年8月26日。

在一些實施例中，所述非豬哺乳動物物種是智人。

治療所述有需要的非豬哺乳動物的胰島素抗性或缺乏性病症的方法可以涉及投予或移植本文所述的任何組合物、細胞、器官或組織。在一些情況下，當投予細胞組合物時，將所述組合物集中投予，例如經由所述非豬哺乳動物的頸內靜脈或肝門靜脈投予。

在一些情況下，在用所述組合物、細胞、器官或組織治療之前，所述非豬哺乳動物已經接受過誘導免疫抑制方案。所述誘導方案可以包括在投予所述細胞、組織或器官之前的治療有效劑量的抗胸腺細胞球蛋白、抗CD40抗體、抗CD20抗體、雷帕黴素類似物、鈣調磷酸酶抑制劑、更昔洛韋或其前驅藥、抗組胺藥或皮質類固醇。

在一些情況下，在用所述組合物、細胞、器官或組織治療後，所述非豬哺乳動物接受維持免疫抑制方案。所述維持方案可以包括治療有效劑量的抗CD40抗體、雷帕黴素類似物、鈣調磷酸酶抑制劑和更昔洛韋或更昔洛韋的前驅藥。

在一些情況下，在用所述組合物、細胞、器官或組織治療後，所述非豬哺乳動物接受支持性胰島素方案。所述支持性胰島素方案可以包括在投予所述細胞、組織、器官或組合物後的治療有效劑量的中效或長效胰島素類似物（例如甘精胰島素、地特胰島素或NPH胰島素）。

治療所述有需要的非豬哺乳動物的胰島素抗性或缺乏性病症的方法可以涉及投予特定的胰島當量劑量（IEQ/kg）。為了參考，胰島當量（IEQ）被定義為等於直徑為150 μm的單個球形胰島的一個IEQ（Huang等人 Cell Transplant 2018年7月: 27(7): 1017-26），並且胰島當量劑量是每kg受體非豬哺乳動物體重的IEQ。在一些情況下，所述劑量可以是至少約1,000 IEQ/kg非豬哺乳動物體重（IEQ/kg）、2,000 IEQ/kg、3,000 IEQ/kg、4,000 IEQ/kg、5,000 IEQ/kg、6,000 IEQ/kg、7,000 IEQ/kg、8,000 IEQ/kg、9,000 IEQ/kg、10,000 IEQ/kg、11,000 IEQ/kg、12,000 IEQ/kg、13,000 IEQ/kg、14,000 IEQ/kg、15,000 IEQ/kg、16,000 IEQ/kg、17,000 IEQ/kg、18,000 IEQ/kg、19,000 IEQ/kg、20,000 IEQ/kg或更多。在一些情況下，所述劑量可以是至多約20,000 IEQ/kg、19,000 IEQ/kg、18,000 IEQ/kg、17,000 IEQ/kg、16,000 IEQ/kg、15,000 IEQ/kg、14,000 IEQ/kg、13,000 IEQ/kg、12,000 IEQ/kg、11,000 IEQ/kg、10,000 IEQ/kg、9,000 IEQ/kg、8,000 IEQ/kg、7,000 IEQ/kg、6,000 IEQ/kg、5,000 IEQ/kg、4,000 IEQ/kg、3,000 IEQ/kg、2,000 IEQ/kg、1,000 IEQ/kg或更少。在一個例子中，所述劑量可以是至少5,000 IEQ/kg非豬哺乳動物體重。

在一些態樣，本公開文本提供了在移植到非豬哺乳動物受體之前提高來自豬供體的胰島產量的方法。所述方法可以包括提供胰腺類器官、在存在有效濃度的胱冬肽酶抑制劑的情況下培養所述類器官以及在存在有效濃度的皮質類固醇的情況下繼續培養。可以將所述類器官在存在胱冬肽酶抑制劑的情況下培養至少30分鐘、至少60分鐘、至少90分鐘、至少2小時、至少4小時、至少6小時、至少12小時、至少18小時、至少24小時、至少30小時、至少90小時、至少120小時、至少180小時、至少360小時、至少720小時或更長時間。在用所述胱冬肽酶抑制劑治療後，可以將所述類器官在存在皮質類固醇的情況下培養至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14天。可以在第7天或更早從豬動物分離所述胰腺類器官。所述胱冬肽酶抑制劑可以是Z-VAD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-IETD-FMK、恩利卡生（Emricasan）、Z-VEIDFMK、Z-DEVD-CMK、MX1122、M867、MMPSI、靛紅磺醯胺、Boc-Asp-FMK、VX-166、Q-VD-OPh或IDN-6556。所述皮質類固醇可以是甲潑尼龍。可以在存在菸鹼醯胺或其代謝可接受的類似物的情況下培養所述類器官。實例實例 1. - 基因轉殖豬動物和源自其的內皮細胞的構建和表徵

將CRISPR-Cas9介導的NHEJ用於在來自巴馬（Bama）小型豬的豬原代成纖維細胞中功能性敲除三個主要的產生碳水化合物的糖基轉移酶/糖基水解酶基因GGTA1、CMAH和B4GALNT2。然後經由PiggyBAC轉座子介導的隨機整合將十二個人基因轉殖（CD46、CD55、CD59、CD39、CD47、A20、PD-L1、HLA-E、B2M、THBD、TFPI、HO-1）整合到豬基因組中的單個多基因轉殖盒中，以產生命名為“4-7”的3KO/12TG細胞，將其用於經由體細胞核轉移（SCNT）生產豬。首先用以下兩者電穿孔野生型豬耳成纖維細胞：a) 靶向GGTA、CMAH和B4GALNT2基因的CRISPR-Cas9試劑；和b) 攜帶 (i) PiggyBac轉座酶盒、(ii) 包含12個人基因轉殖中的一個或多個的基因轉殖構建體的有效載荷質體。將基因轉殖佈置到具有所需的遍在或組織特異性啟動子的4個不同的順反子中。將每個順反子內的基因轉殖用核糖體跳躍2A肽分開，以確保以相似的莫耳比表現。此外，引入順式元件（如泛染色質開放元件（UCOE））的組合，以防止基因轉殖沈默；並且引入具有強聚腺苷酸化位點和終止子的隔離子，以最小化基因轉殖之間以及基因轉殖與側翼染色體之間的相互作用。產生成纖維細胞的單細胞克隆，並且通過片段分析/全基因組測序對其進行篩選，以鑒定具有所需基因組修飾的克隆，然後將攜帶所需修飾的克隆用作供體，以通過SCNT生產活豬。

通過qPCR確定基因轉殖表現水準，使用基於反向PCR的連接捕獲確定整合位點，並且經由螢光啟動細胞分選（FACS）確定蛋白質水準。結果總結在下表1B中。

表 1A ： 4-7 內皮細胞中敲除基因和基因轉殖的 DNA/mRNA/ 蛋白質表現

KO / TG	KO / TG 是否在細胞水準上表現
DNA	mRNA( 全長 )	蛋白質 (FACS)
GGTA (KO)	√	NA	√
CMAH (KO)	√	NA	√
B4Gal (KO)	√	NA	NA
CD46	√	√	√
CD55	√	√	√
CD59	√	√	√
THBD	√	一點也沒檢測到	一點也沒檢測到
TFPI	√	√	NA
CD39	√	√	√ (高)
B2M-HLAE	√	√	√ (HLAE)
CD47	√	√	√
A20	√	√ 非常低	一點也沒檢測到
PDL1	√	√ 低	一點也沒檢測到
FasL	√	√ 低	一點也沒檢測到

表1B顯示了依據免疫組織化學（IHC）染色結果的4-7豬組織中各種基因轉殖的表現。

表 1B ： 4-7 內皮細胞上基因轉殖的 IHC 染色

靶標	4-7 豬	人	WT 豬
CD46	+	++	-
CD55	++	+++	-
CD59	+	+++	-
B2M	+/-	++	-
TFPI	+/-	++	-
CD39	+	++	-
HO-1	+++	++	+
A20	-	++	-
EPCR	-	++	-
CD47	+	+++	-
HLA-E	+	+	-
GGTA	-	-	+++

基因敲除 / 敲入的後果的功能表征

GGTA/CMAH/B4Gal

結合野生型豬組織的預先形成的抗體已經被認為是異種移植的主要初始免疫學障礙，並且這三個基因已經被鑒定為主要負責產生由這些抗體靶向的異種抗原（Byrne 2014，Lai 2002，Lutz 2013，Martens 2017，Tseng 2006）。因此，預測這些基因的功能喪失將在很大程度上消除預先形成的抗豬抗體與豬移植物內皮的結合。通過流式細胞術結果證實了這一點，所述結果顯示出宿主抗體與靶豬臍靜脈內皮細胞（命名為“4-7”，含有GGTA1、CMAH、B4GalNT2基因敲除，參見圖1）的減少的結合。為了證明抗體結合減少，將經基因工程化的豬內皮細胞與合併的人血清一起培育，並且用綴合的第二抗人抗體檢測結合的人IgM和IgG並通過流式細胞術進行分析。與野生型豬臍靜脈內皮細胞（PUVEC）（紅色等高線圖）形成對比，消除這三個基因導致抗體結合顯著降低（比較藍色和黃色等高線圖，結合減少約1 log）。

補體調節蛋白（ CD46 、 CD55 和 CD59 ）

為了維持豬移植物功能並保護供體器官免受補體介導的毒性影響，過表現了人補體調節蛋白。簡而言之，將經基因工程化的豬成纖維細胞和豬脾細胞與25%人補體一起培育一小時。用碘化丙啶對細胞進行染色，並且通過流式細胞術進行分析以定量細胞死亡（參見圖2）。圖2的左圖是說明測定工作流程的圖，而右圖是說明與各種濃度的人補體（“HC”）一起培育後人臍靜脈內皮細胞（“HUVEC”）、基因轉殖4-7豬臍靜脈內皮細胞（“4-7 PUVEC”）或正常豬臍靜脈內皮細胞（“WT PUVEC”）的死亡的圖表。類似於人HUVEC細胞，攜帶全部三個基因轉殖的4-7細胞相比于其正常豬對應物顯示出顯著降低的回應於人補體的死亡。

凝血反應基因

當將血管化的WT豬器官移植到人中時，預先形成的抗體、補體和先天免疫細胞可以誘導內皮細胞啟動並觸發凝血和炎症。來自豬內皮細胞的凝血調節因子與人血之間的不相容性導致異常的血小板啟動和凝血酶形成，從而加劇損害。此外，豬與人之間的凝血調節劑（例如，組織因子途徑抑制劑，TFPI）的分子不相容性使得外部凝血調節無效。

為了解決這些異種凝血問題，我們在4-7 PUVEC中過表現了以下兩者：a) 人CD39（抵消ADP在凝血級聯中的血栓形成效應的ADP水解酶）和b) 人TFPI（在內皮細胞啟動後易位到細胞表面的因子），然後進行了各種體外和離體測定以驗證這些基因轉殖正確起作用和調節血小板和凝血級聯的能力。圖3描繪了用於驗證CD39在4-7基因轉殖內皮臍靜脈豬細胞（PUVEC）中的表現/功能而進行的分析的結果。所述圖表顯示了在HUVEC、4-7 PUVEC或WT PUVEC上進行的比色CD39 ADP水解基的活性測定的結果；4-7細胞顯示出增強的CD39活性，表明所述基因轉殖是功能性的且被過表現。體外ADP酶生化測定顯示了在4-7 PUVEC中相比於在WT PUVEC或HUVEC中顯著更高的CD39活性。類似地，啟動的4-7 PUVEC顯示出有效結合並中和人Xa的能力，其可以減輕凝血並減少凝血酶-抗凝血酶（TAT）複合物的形成（圖5）。在圖5中用與4-7 PUVEC共培養的人全血進行的離體凝血測定證明形成了最少的TAT（凝血酶抗凝血酶），並且TAT的形成水準與HUVEC的TAT形成水準相似（圖5），表明4-7 PUVEC獲得了增強的與人因子的凝血相容性。

圖6顯示了用於評價這些基因修飾對血小板啟動的影響而進行的測定的結果。圖6描繪了在4-7基因轉殖細胞上進行的血小板裂解測定的結果。顯示了FACS跡線，其定量了與HUVEC、4-7 PUVEC或WT PUVEC一起培育45或60分鐘後人血中剩餘的血小板數量（畫出輪廓的簇）。4-7細胞繼續顯示出相對於豬WT EC，剩餘的血小板數升高，這與當與HUVEC細胞一起培育時剩餘的血小板分數相當。

HLA 組分（ HLA-E/B2M ）

靶細胞上的MHC I與自然殺傷（NK）細胞上的殺傷抑制受體（KIR）連接抑制NK細胞介導的靶細胞殺傷。豬MHC I無法通過人NK KIR傳遞信號，因此豬細胞對NK細胞的靶向細胞殺傷敏感。為了克服NK介導的細胞死亡，使連接人NK KIR受體的人HLA-E在豬細胞中過表現。此外，也過表現了MHC異二聚化配偶體B2M的人拷貝。

然後進行功能測定以驗證4-7內皮細胞由於基因修飾而對NK介導的細胞殺傷具有抗性。WT PUVEC、4-7 PUVEC和HUVEC在體外測定中被人NK細胞靶向殺傷（圖7）。圖7描繪到4-7 PUVEC展現出的NK介導的細胞毒性顯著低於其WT對應物（未配對的雙尾學生t檢定）。實例 2. - 從基因轉殖動物分離胰島

在出生後0-7天，將基因轉殖雄性巴馬小型豬（如實例1中生產的）麻醉，並且進行剖腹手術和放血。切除胰腺，並且將其用手術刀在無菌條件下切成小片段。對胰腺片段進行膠原酶V消化（1 mg/ml）並轉移到透氣的培養袋（OriGen PermaLife™細胞培養袋）中，並且在22-24dC下保持，以運輸到培養實驗室。將胰島在EGM-2培養基（含FGF-B、VEGF、R3-IGF、抗壞血酸、hEGF、肝素、D-葡萄糖、菸鹼醯胺、10%豬血清、50 µM IBMX、120 µM阿米卡星和60 µM胺比西林的EGM-2）、EGM-2培養基加皮質類固醇（EGM-2加1 µM甲潑尼龍）或Ham’s F-10培養基中在袋子或皮氏培養皿中培養7天。在培養的7天內量測胰島當量（IEQ）並繪製圖表（參見圖14、圖15和圖16）。在3種條件下，含皮質類固醇的EGM-2培養基與提高的胰島產量相關。

在一些情況下，在機械或酶消化之後，可以通過沈降（例如，ficoll梯度沈澱）純化胰腺片段。在其他情況下，可能不需要或不必需要經由沈降進行這種純化步驟。在此類情況下，可以在移植之前培養胰腺片段（例如，在培養皿中培養約7天），在此期間非胰島細胞（例如，外分泌細胞）可能相繼死亡。

實例 3. 來自基因轉殖動物的胰島的分析

如在實例2中的從正常和基因轉殖巴馬小型豬分離胰島細胞之後，進行測定以評價4-7胰島細胞的異種相容性（xenocompatibility）方面，這類似於在實例1中對4-7內皮細胞進行的實驗方案。

首先，進行實驗以評價基因修飾對調節血小板和凝血級聯的影響。圖11（FIGURE 11/FIG. 11）描繪了在如圖9/實例2中分離的胰島細胞上進行的血小板裂解或TAT複合物形成測定的結果。顯示了描繪如圖6中的在作為陰性對照（NC）的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）、WT或4-7胰島上進行的血小板裂解測定（左圖）和如圖5中的在HUVEC NC、WT或4-7胰島上進行的TAT複合物形成測定。當與人血組分一起培育時，4-7胰島顯示出減少的血小板裂解和降低的TAT複合物形成。

其次，進行實驗以評價基因修飾對調節人免疫系統對移植的豬組織的短期IBMIR反應的影響。圖12描繪了在如圖9中所得到的4-7胰島上用人血進行的血液介導的即刻炎性反應（IBMIR）測定的結果。簡而言之，將人全血與如本文所公開的豬胰島細胞一起培育，隨後檢查至少部分由人全血與豬胰島細胞之間的接觸（或相互作用）引起的凝血或凝固。在一些情況下，量測凝塊大小和/或重量。圖9中顯示了放大200倍的IHC顯微照片，其顯示了在4-7胰島切片與人血一起培育後抗體（IgG和IgM，左圖）和補體（C3a和C4d，右圖）灶的染色。4-7胰島細胞顯示出與IgG、IgM、C3a和C4d相關的減少的染色和灶，表明胰島細胞顯示出降低的IBMIR；並且在初始移植後應當顯示出增強的對死亡的抵抗。

第三，進行實驗以評價基因修飾對調節人嗜中性粒細胞活性的影響。圖13描繪了與4-7胰島一起培育的人全血中剩餘的嗜中性粒細胞數。當與人全血一起培育時，與WT胰島相比，4-7胰島展現更高的剩餘嗜中性粒細胞數。實例 4. - 將胰島移植到受體小鼠中

為了測試異種移植後4-7豬基因轉殖胰島細胞的功能，建立了基於STZ的小鼠糖尿病胰島過繼轉移模型。圖19中描繪了使用該模型程序的小鼠的示例性血糖。該模型使用毒素（鏈尿素佐菌素，STZ）殺傷免疫缺陷小鼠中的胰島細胞，導致血糖水準急劇升高。胰島細胞的移植導致截止移植後約60天血糖水準正常化。

為了評估4-7胰島細胞在治療糖尿病方面的功效，首先通過如下方式在n = 12 NCD（NOD-Prkdc^em26Cd52 Il2rg^em26Cd22 /NjuCrl）小鼠中誘導糖尿病：用單劑量的鏈脲佐菌素（STZ，125 mg/kg）處理，接著是3天的洗脫期，其中保留3只未經處理的年齡匹配的小鼠作為對照。然後對未經處理的小鼠和3只經STZ處理的小鼠進行假移植手術，而3只STZ小鼠接受如圖9/實例2中分離的野生型豬胰島（3000 IEQ）並且3只STZ小鼠接受如圖9/實例2中分離的4-7基因轉殖豬胰島（3000 IEQ）。在移植胰島的情況下，它們被移植到左腎被膜下。簡而言之，將4-7胰島細胞混合或分散在溶液（例如，緩衝液）中，並且經由注射器和軟管在腎被膜下注射（例如，緩慢注射）。

圖20顯示了接受包含本文提供的主題4-7豬基因轉殖胰島細胞的胰島樣細胞簇（NICC）的NCG小鼠（作為T1D齧齒動物模型）的血糖。包含野生型豬胰島細胞的NICC用作對照。將各種量的NICC移植到NCG小鼠：4000 IEQ、2000 IEQ和1000 IEQ。資料表明，與WT豬胰島細胞相比，4-7豬基因轉殖胰島細胞在控制小鼠血糖水準升高方面展現出相似的功效。移植後約兩周，4-7豬基因轉殖胰島細胞在體內變成功能性的（例如，在控制血糖水準方面）。

在一些情況下，可以在更長的時間內（例如，長於5、6、7、8、9、10、11、12個月或更長時間）監測移植的豬細胞的異常生長。在一些情況下，人成年胰島細胞可以例如以臨床人成年胰島治療劑量用作陽性對照。在一些情況下，非肥胖糖尿病（NOD）T1D小鼠模型可以用作二級體內模型。在一些情況下，可以經由門靜脈內注射投予豬基因轉殖胰島細胞以測試其相容性和安全性。

實例 5. - 將胰島移植到受體猴中

為了測試異種移植到靈長類後4-7豬基因轉殖胰島細胞的功能，建立了基於STZ的NHP糖尿病胰島過繼轉移（使用門靜脈內胰島細胞移植）模型。將如圖9/實例2中分離的4-7胰島和WT經由通過超聲引導的經皮穿肝門靜脈插管移植到食蟹猴。這些實驗的方案呈現於圖21中。

用於豬細胞移植的免疫抑制方案如下：

在第-7d（± 2d）、-6d（± 2d）、-4d（± 2d）天以5 mg/kg的劑量靜脈內給予ATG，並且如果達到血液中淋巴細胞消耗至＜基線水準的5%，則在第-1d投予另外劑量的ATG。

在第-4d（± 1d）、0d、4d、7d、10d、14d靜脈內給予抗CD40，然後在之後每周以50 mg/kg和30 mg/kg的第一劑量給予。

在第0d（± 2d）以375 mg/m2的劑量靜脈內給予抗CD20單株抗體利妥昔單抗，如果B細胞計數上升高於基線的5%，則最多每三個月重複一次。

雷帕黴素和他克莫司在第-3d（± 1d）開始分別以0.3 mg/kg QD和0.02 mg/kg BID的起始劑量口服，並且根據血漿濃度進行調整。

從第-7d（± 2d）開始以5 mg/kg的劑量肌內給予更昔洛韋。

在ATG、抗CD40和抗CD20投予之前，投予撲爾敏0.4 mg/kg IM和甲潑尼龍10 mg/kg IV的預防性使用以預防輸液反應。

用於支援健康而向STZ誘導的動物支援性投予胰島素提供如下：

每天投予一次甘精胰島素，並且最初以2 U每天投予一次。當FBG ＞ 150 mg/dl時，劑量增加2 U，並且當FBG ＜ 100 mg/dl時，劑量減少2 U。

根據記錄的動物血糖水準，在早上和晚上每天投予兩次胰島素。對於早晨劑量，＜ 200 mg/dl不接受胰島素，200-350 mg/dl接受4 U胰島素，350-400 mg/dl接受6 U胰島素，400-600 mg/dl接受8 U胰島素，並且＞ 600 mg/dl接受10 U胰島素。對於夜間劑量，＜ 300mg/dl不接受胰島素，300-350 mg/dl接受4 U胰島素，350-400 mg/dl接受6 U胰島素，400-600 mg/dl接受8 U胰島素，並且＞ 600 mg/dl接受10 U胰島素。

圖22中顯示了在猴（MB-1）上使用STZ糖尿病誘導方案的預實驗，其中根據圖21中的方案管理動物。在投予50%右旋糖1 ml/kg iv後評估動物的血糖、C肽和胰島素以量測移植細胞的功能輸出；圖22中的資料表明，由於STZ處理後血糖的增加以及C肽和胰島素的減少導致糖尿病誘導方案是成功的。使用該方案誘導另外的動物MA-1、MA-2、MB-2、MC-1、MD-1和ME-1患有糖尿病，並且根據下表2向其移植了移植物。在移植後監測動物的白細胞計數、淋巴細胞計數、CD4+細胞類型、CD8+細胞類型、B細胞、NK細胞和雷帕黴素水準（圖23、圖24和圖25）。

隨後在移植後12小時和1個月，分析動物MA-1和MA-2的肝臟活檢的免疫組織化學，以證明存在移植的4-7胰島。進行肝臟活檢，並且對其進行蘇木精/曙紅（在MA-1和MA-2的情況下）和染色胰島細胞的神經上皮標記嗜鉻粒蛋白A（在MA2的情況下）染色，表明存在胰島樣結構並且4-7細胞被植入動物肝臟中（參見圖26）。

在表2中的所有動物中，將繼續監測免疫組織化學、血糖、C肽（猴和豬兩者）和胰島素水準，以評估在較長時間段內移植物在非人靈長類中的功能。

表 2 ：用於 NHP 異種移植受體研究而生產的動物

受體猴編號	Tx 前的處理	來自供體豬的胰島	活力 (β 細胞 %)	純度， IEQ/ml	內毒素， EU/ml	Tx 日期
MA-1	IS	4-7胰島, 29k IEQ/kg	-	-	＜0.005	2018.10.3
MA-2	IS	4-7胰島, 2k IEQ/kg	80% (13%)	1000	＜0.005	2018.10.16
MB-1	STZ+IS	4-7胰島, 39k IEQ/kg	79.4% (16%)	2600	＜0.005	2018.12.14
MB-2	STZ+IS	4-7胰島, 35k IEQ/kg	78.1% (23.8%)	3500	＜0.005	2019.2.17
MC-1	STZ+IS	WT胰島, 39k IEQ/kg	81.6% (24.9%)	3900	＜0.005	2019.1.11
MB-11	STZ+IS	WT胰島, 50k IEQ/kg	約80% (約25%)	約5000	＜0.005	2019.10.29
MD-1	STZ+IS	空白
ME-1	STZ	空白

雖然在本文已經顯示和描述了本發明的較佳實施例，但對於熟習此項技術者而言將明顯的是，此類實施例僅通過舉例的方式來提供。在不背離本發明的情況下，熟習此項技術者現在將想到許多變化、改變和替換。應當理解的是，本文所述的本發明的實施例的各種替代方案可以用於實踐本發明。以下申請專利範圍旨在限定本發明的範圍，並且由此覆蓋這些申請專利範圍及其等同物範圍內的方法和結構。

無

本發明的新穎特徵在隨附申請專利範圍中具體闡述。將通過參考闡述了利用本發明原理的說明性實施例的以下實施方式和附圖獲得對本發明的特徵和優點的更好的理解，在所述附圖中。圖1描繪了在人血清中培育的4-7基因轉殖內皮臍靜脈豬細胞（PUVEC）的FACS免疫染色結果。頂圖是FACS圖，其顯示人臍靜脈內皮細胞（“HUVEC”）、基因轉殖4-7豬臍靜脈內皮細胞（“4-7 PUVEC”）或正常豬臍靜脈內皮細胞（“WT PUVEC”）的IgG或IgM染色。類似于HUVEC細胞，基因轉殖4-7 PUVEC相比于其正常豬對應物顯示出來自人血清的IgG和IgM抗體的減少的結合。資料顯示為平均值 ± 標準差。誤差條指示標準差，並且P值源自未配對的雙尾學生t檢定。* 表示P ＜ 0.05；** 表示P ＜ 0.01。圖2描繪了在4-7基因轉殖內皮臍靜脈豬細胞（PUVEC）上進行的人補體毒性測定的結果。左圖是說明測定工作流程的圖，而右圖是說明與各種濃度的人補體（“HC”）一起培育後人臍靜脈內皮細胞（“HUVEC”）、基因轉殖4-7豬臍靜脈內皮細胞（“4-7 PUVEC”）或正常豬內皮細胞（“WT PUVEC”）的死亡的圖表。類似於人HUVEC細胞，4-7細胞相比于其正常豬對應物顯示出顯著降低的回應於人補體的死亡。圖3描繪了用於驗證CD39在4-7基因轉殖豬臍靜脈內皮豬細胞（PUVEC）中的表現/功能而進行的分析的結果。與HUVEC和WT PUVEC相比，基因轉殖4-7豬臍靜脈內皮細胞（“4-7 PUVEC”）具有顯著更高的hCD39 ADP酶生化活性，如通過與ADP一起培育時的磷酸鹽產生所量測的。資料顯示為平均值 ± 標準差。誤差條指示標準差，並且P值源自未配對的雙尾學生t檢定。** 表示P ＜ 0.01。圖4顯示了使用人蛋白C和人凝血酶在異種細胞中的啟動蛋白C測定的示意圖。圖5顯示了在4-7細胞上的凝血酶-抗凝血酶III（TAT）形成測定的結果。左圖是顯示使用人血量測凝血酶-抗凝血酶III（TAT）複合物形成的工作流程的圖，而右圖是描繪用HUVEC、4-7 PUVEC或WT PUVEC進行相應測定的結果的圖表。與WT PUVEC相比，4-7細胞顯示出減少的TAT形成，這與HUVEC細胞相當。圖6描繪了在4-7基因轉殖細胞上進行的血小板裂解測定的結果。顯示了FACS跡線，其定量了與HUVEC、4-7 PUVEC或WT PUVEC一起培育45或60分鐘後人血中剩餘的血小板數量（畫出輪廓的簇）。4-7細胞繼續顯示出相對於豬WT PUVEC，剩餘的血小板分數升高，這與當與HUVEC細胞一起培育時剩餘的血小板分數相當。圖7將圖6所示的實驗結果在另外的時間點（5分鐘、15分鐘）定量為剩餘的CD41陽性血小板（MFI指示通過FACs分析得到的在CD41通道中的平均螢光強度）。圖8描繪了在4-7基因轉殖細胞上進行的NK細胞毒性測定的結果。顯示了描繪在HUVEC、4-7 PUVEC或WT PUVEC上以效應物 : 靶細胞比率為10進行的NK毒性測定的結果的圖表。4-7 PUVEC顯示出在正常PUVEC與HUVEC細胞之間的中間細胞殺傷值。圖9是描繪加工豬胰島細胞以進行移植的示例性工作流程的圖表。在示例性實施例中，對新生豬進行胰腺切除術（“獲取”），之後將胰腺切碎並在膠原酶中消化（“胰島分離”）。然後將經消化的胰島細胞轉移到透氣不透水的袋子中，並且在22-24dC下保持直到它們可以進行培養（“運輸”）。然後將胰島細胞培養一段時間（視情況用EGM2培養基和胱冬肽酶抑制劑，“培養”），之後進行品質控制程序，如功能性胰島當量定量（IEQ）、內毒素測定、革蘭氏染色、活力測定和細胞純度測定。圖10描繪了在基因轉殖（4-7）或正常（WT）巴納（Bana）小型豬上進行的根據圖9的胰島分離程序的結果。圖11描繪了在如圖9中分離的胰島細胞上進行的血小板裂解或TAT複合物形成測定的結果。左圖顯示與WT胰島和實驗對照（NC，僅鹽水）相比，當與人全血一起培育時4-7胰島展現減少的血小板裂解。右圖顯示與WT胰島和實驗對照（NC，僅鹽水）相比，當與人全血一起培育時4-7胰島展現降低的TAT複合物形成。圖12描繪了在如圖9中所得到的4-7胰島上用人血進行的血液介導的即刻炎性反應（IBMIR）測定的結果。顯示了放大200倍的IHC顯微照片，其顯示了在4-7胰島切片與人血一起培育後抗體（IgG和IgM，左圖）和補體（C3a和C4d，右圖）灶的染色。4-7胰島細胞顯示出與IgG、IgM、C3a和C4d相關的減少的染色和灶，表明胰島細胞顯示出降低的IBMIR。圖13描繪了在如圖12中的與人血一起培育後，嗜中性粒細胞向4-7胰島、WT胰島和實驗對照（NC，僅鹽水）中的浸潤。與WT胰島和實驗對照相比，4-7胰島展現更高的剩餘嗜中性粒細胞數。圖14描繪了在2種不同的培養條件下，如圖9中分離的胰島細胞隨時間的變化。顯示了描繪在EGM-2培養基或標準培養基（“F-10”，表示Ham’s F-10）培養基中培養7天的胰島當量（IEQ）的圖。EGM-2培養基與提高的胰島產量相關。圖15描繪了在2種不同的培養條件（即F-10培養基和NEO培養基）下，如圖9中分離的胰島細胞隨時間的變化。圖16比較了如圖9中分離的胰島在沒有皮質類固醇的培養基（左圖）中相比於在具有皮質類固醇的培養基（右圖）中的培養。皮質類固醇與提高的胰島產量相關。圖17比較了在初始（頂行，在F-10培養基中）或改善的（EGM-2培養基 + 皮質類固醇，底行）培養條件下，如圖9中分離的胰島中的細胞分數。顯示了比較兩種條件之間完整胰島細胞（左）、β細胞（中）或活β細胞（右）的FACS跡線。改善的條件與增加的完整胰島細胞數和增加的β細胞數相關。圖18顯示了通過免疫螢光染色進行的4-7基因轉殖在腎臟冷凍切片中的蛋白質表現驗證。比例尺（白色），75 μm。圖19顯示了接受STZ接著在60天的時間內用WT新生豬胰島進行胰島移植的NCG小鼠的血糖，證明血糖在約40天后正常。3個敲除和9個基因轉殖在4-7腎臟冷凍切片中的免疫螢光染色驗證。抗體比例尺（白色），75 μm。圖20顯示了接受STZ接著用WT豬胰島細胞（“WT Tx”）、4-7胰島細胞（“4-7 Tx”）或假手術（“假手術Tx”）進行胰島移植的NCG小鼠在126天的時間內的血糖。“4-7 Tx”和“WT Tx”兩個實驗組均應用了不同的胰島劑量，包括4,000 IEQ、2,000 IEQ和1,000 IEQ。圖21顯示了根據本文所述的方法用胰島移植的NHP的典型誘導、免疫抑制、移植和管理方案。圖22顯示了根據本文所述的方法在STZ誘導糖尿病之前和之後在血糖、胰島素和C肽方面的NHP葡萄糖耐量試驗的示例性反應，證明所述方案在動物中成功地誘導了糖尿病。圖23、圖24和圖25顯示了在胰島移植後長達70天內表2中所述動物的WBC和淋巴細胞計數（圖23）、CD4+細胞類型/CD8+細胞類型/B細胞/NK細胞計數（圖24）和雷帕黴素水準（圖25）。圖26顯示了在移植後12小時和1個月，動物MA-1和MA-2的肝臟活檢的蘇木精/曙紅染色和抗嗜鉻粒蛋白A染色，證明在肝臟組織中存在胰島。圖27顯示了在移植後24小時，動物MB-11的肝臟活檢的免疫螢光染色分析，證明在肝臟組織中存在胰島（如通過胰島素和胰高血糖素染色的陽性信號所揭示的）。在胰島素陽性WT豬胰島周圍還檢測到猴IgG、CD41（血小板的標記）、纖維蛋白原（用於指示凝血的標記）和CD68（巨噬細胞的標記），表明在MB-11中在移植後24小時發生血液介導的即刻炎性反應（IBMIR）。該結果還表明，基因修飾對於提高豬胰島在體內的存活是必不可少的。圖28顯示了使用WT豬胰島在不同的移植後時間點，猴受體的豬c肽、猴c肽、空腹血糖和外源性胰島素攝入的血清濃度。在豬胰島移植後55天內可以在動物血清中穩定地檢測到豬c肽。

Claims

一種分離的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述細胞： (a)基本上不含至少一種糖基轉移酶的酶活性，其中所述糖基轉移酶是GGTA、B4GALNT2或CMAH； (b)表現源自非豬哺乳動物物種的至少兩個多肽序列，其中所述至少兩個多肽序列包括CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1中的至少兩個；並且 (c)展現出以下中的一種或多種：來自源自所述非豬哺乳動物物種的補體的降低的毒性、源自所述非豬哺乳動物物種的啟動蛋白C凝血的降低的誘導、源自所述非豬哺乳動物物種的凝血酶-抗凝血酶複合物的降低的誘導或來自源自所述非豬物種的NK細胞的降低的毒性。
如請求項1所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述細胞基本上不含選自GGTA、B4GALNT2和CMAH的至少兩種或全部三種糖基轉移酶的酶活性。
如請求項1或2所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述細胞表現CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1中的至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個或全部。
一種分離的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述胰島細胞： (a)基本上不含至少兩種糖基轉移酶的酶活性，其中所述糖基轉移酶包括GGTA、B4GALNT2或CMAH中的至少兩種； (b)表現源自非豬哺乳動物物種的多肽序列，其中所述多肽序列是CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1；並且 (c)展現出來自源自所述非豬哺乳動物物種的補體的降低的毒性、源自所述非豬物種的啟動蛋白C凝血的降低的誘導、源自所述非豬物種的凝血酶-抗凝血酶複合物的降低的誘導或來自源自所述非豬物種的NK T細胞的降低的毒性。
如請求項4所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述細胞基本上不含GGTA、B4GALNT2和CMAH的酶活性。
如請求項4或5所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述細胞表現CD46、CD55、CD59、THBD、TFPI、CD39、B2M、HLAE、CD47、A20、PD-L1、FASL或HO-1中的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個或全部。
如請求項1-6中任一項所述的基因轉殖豬胰島細胞，其表現CD46、CD55、CD59、CD39、B2M、HLAE和CD47。
如請求項1-6中任一項所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述細胞基本上不含所述一種或多種糖基轉移酶的表現。
如請求項8所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述細胞在所述一種或多種糖基轉移酶中包含導致轉譯過早終止的移碼突變，從而去除所述糖基轉移酶的活性。
如請求項1-9中任一項所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中將編碼源自非豬哺乳動物物種的所述一個或多個多肽序列的一個或多個核酸序列插入所述豬直系同源物的非直系同源基因座內。
如請求項1-10中任一項所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中編碼源自非豬哺乳動物物種的所述一個或多個多肽序列的一個或多個核酸序列與所述豬直系同源物的非直系同源啟動子可操作地連接。
如請求項11所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述非直系同源啟動子是非豬啟動子。
如請求項1-12中任一項所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述胰島細胞是通過豬胰腺的分解而得到的。
如請求項1-13中任一項所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述胰島細胞是α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、胰多肽（PP）細胞或其任何組合。
如請求項1-14中任一項所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中所述非豬哺乳動物物種是靈長類物種。
如請求項1-15中任一項所述的基因轉殖豬胰島細胞，其中當移植到所述非豬哺乳動物物種中時，所述細胞展現出大於8天的存活。
如請求項1-16中任一項所述的基因轉殖豬細胞，其中所述細胞展現出對從所述非豬哺乳動物物種分離的PBMC的降低的IBMIR。
一種組合物，其包含治療有效量的如請求項1-17中任一項所述的分離的豬胰島細胞。
如請求項18所述的組合物，其中所述等滲緩衝溶液還包含肝素或TNF-α抑制劑。
如請求項18或19所述的組合物，其包含至少約12%至約25% β細胞或至少約15%至約30% α細胞。
如請求項18-20中任一項所述的組合物，其中所述組合物是如請求項35-42中任一項來製備的。
一種治療有需要的非豬哺乳動物的胰島素抗性或缺乏性病症的方法，其包括向所述哺乳動物投予治療有效劑量的如請求項1-17中任一項所述的分離的基因轉殖豬胰島細胞或如請求項18-21中任一項所述的組合物。
如請求項22所述的方法，其包括經由所述哺乳動物的頸內靜脈或肝門靜脈集中投予所述細胞。
如請求項22-23中任一項所述的方法，其中所述胰島素抗性病症包括1型糖尿病。
如請求項22-23中任一項所述的方法，其中所述胰島素抗性病症包括2型糖尿病。
如請求項22-25中任一項所述的方法，其中在投予所述基因轉殖豬胰島細胞或所述組合物之前，所述非豬哺乳動物已經接受過誘導方案，所述誘導方案包括治療有效劑量的抗胸腺細胞球蛋白、抗CD40抗體、抗CD20抗體、雷帕黴素類似物、鈣調磷酸酶抑制劑、更昔洛韋或其前驅藥、抗組胺藥和皮質類固醇。
如請求項22-26中任一項所述的方法，其包括在投予所述基因轉殖豬胰島細胞或所述組合物之後投予治療有效劑量的抗CD40抗體、雷帕黴素類似物、鈣調磷酸酶抑制劑和更昔洛韋或其前驅藥。
如請求項22-27中任一項所述的方法，其包括在投予所述基因轉殖豬胰島細胞或所述組合物之後投予治療有效劑量的中效或長效胰島素類似物、甘精胰島素、地特胰島素或NPH胰島素。
如請求項22-28中任一項所述的方法，其中所述治療有效劑量是至少5,000 IEQ/kg非豬哺乳動物體重。
一種分離的豬胰島，其包含如請求項1-17中任一項所述的分離的豬胰島細胞。
一種分離的豬胰腺類器官，其包含如請求項1-17中任一項所述的分離的豬胰島細胞。
如請求項30或31所述的分離的豬胰島或分離的豬胰腺類器官，其中所述胰島或類器官基本上不含胰腺外分泌細胞。
如請求項31或32所述的分離的豬胰腺類器官；其中所述胰腺類器官是通過以下方式製備的： (a)在新生的第7天或更早從新生豬動物分離胰腺；以及 (b)對所述胰腺進行機械或酶消化以產生類器官片段，以及視情況： (c)通過ficoll梯度沈降純化步驟 (b) 的類器官片段。
一種分離的豬胰腺，其包含如請求項1-17中任一項所述的豬胰島細胞。
一種在移植到非豬哺乳動物受體之前提高來自豬供體的胰島產量的方法，其包括： (a)提供已經經受純化程序的來自新生豬動物的胰腺類器官； (b)在所述純化之後，在存在有效濃度的胱冬肽酶抑制劑的情況下將所述類器官培養至少90分鐘；以及 (c)在存在有效濃度的皮質類固醇的情況下繼續培養至少7天。
如請求項35所述的方法，其中所述純化程序包括： (a)在新生的第7天或更早從基因轉殖新生豬動物分離胰腺；以及 (b)對所述胰腺進行機械或酶消化以產生類器官片段，以及視情況： (c)通過ficoll梯度沈降從所述經消化的胰腺中純化類器官片段。
如請求項35或36所述的方法，其中所述新生豬動物是包含至少一種如請求項1-17中任一項所述的豬細胞的基因轉殖豬。
如請求項35-37中任一項所述的方法，其中所述胱冬肽酶抑制劑是Z-VAD-FMK。
如請求項35-38中任一項所述的方法，其中所述皮質類固醇是甲潑尼龍。
如請求項35-39中任一項所述的方法，其中在存在IBMX、磷酸二酯酶抑制劑或腺苷受體拮抗劑的情況下培養所述胰腺類器官。
如請求項35-40中任一項所述的方法，其中在存在菸鹼醯胺或其代謝可接受的類似物的情況下培養所述胰腺類器官。
一種治療有需要的非豬哺乳動物的胰島素抗性或缺乏性病症的方法，其包括當如請求項35-41中任一項所述的類器官滿足以下標準中的任何一種時，將所述類器官移植到所述非豬哺乳動物中： (a)內毒素小於約5 EU/kg； (b)革蘭氏染色陰性； (c)活力大於約70%；或 (d)胰島濃度大於或等於約20,000 IEQ/mL總沈降體積。