TW202138558A - 多核苷酸及醫藥組合物 - Google Patents

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本澤慶一
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Abstract

本發明之課題在於提供一種雖然於轉譯區域具有修飾部位但維持有轉譯活性之多核苷酸。上述課題可藉由如下多核苷酸來解決，該多核苷酸包含自起始密碼子至終止密碼子之轉譯區域，上述轉譯區域包含n個密碼子，上述n為2以上之正整數，上述n個密碼子分別包含第1號、第2號及第3號核苷酸，上述n個密碼子中至少2個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸。

Description

多核苷酸及醫藥組合物
本發明係關於一種多核苷酸及包含上述多核苷酸之醫藥組合物。
細胞中之基因資訊藉由如下方式傳遞，即，以DNA作為模板藉由RNA合成酶來轉錄傳訊RNA(以下，有時稱為「mRNA」)，經轉錄之單鏈mRNA與核糖體結合，藉由轉譯而合成蛋白質。該傳遞形式於分子生物學上稱為「中心法則」，係原核生物及真核生物兩者共通之基本原理。 作為基因資訊傳遞之中間物質之mRNA具有用於被核糖體直接識別且轉譯成蛋白質之鹼基序列資訊及結構。
近年來，作為下一代醫藥，對核酸醫藥之期待越來越高。作為mRNA之多核苷酸(以下，亦稱為「人工mRNA」)可用作利用表現增強或表現亢進之蛋白質補充療法型核酸醫藥或利用肽表現之疫苗療法型核酸醫藥。 然而，已知若將僅由天然鹼基構成之人工mRNA從外部導入細胞內，則因與細胞內之Toll樣受體(TLR3、TLR7、TLR8、RIG-I等)結合而迅速引起免疫應答，導致炎症反應及蛋白質之轉譯量降低(非專利文獻1)。為了於細胞內表現蛋白質，必須設法以某些形式降低人工mRNA本身之免疫反應性，且不使轉譯量降低。又，僅由天然鹼基構成之RNA對於核酸分解酶較為脆弱，因此要想賦予穩定性，亦必須導入修飾核苷酸(非專利文獻2)。揭示有包含修飾核苷酸中之2'-O-甲基化RNA、2'-F化RNA或交聯型核酸等糖部修飾核苷酸的多核苷酸對於降低核酸醫藥之免疫反應性、及賦予對於核酸分解酶之耐受性均有效(非專利文獻3)。
近年來，正積極進行如下研究，即藉由體外轉錄法(in vitro transcription，以下稱為「IVT」)於試管內人工合成mRNA，將該人工合成之mRNA作為醫藥品(非專利文獻4)。 亦不斷報告了一定之成果，例如據非專利文獻5中報告，於以黑色素瘤患者作為對象之人工mRNA癌症疫苗之臨床試驗中，開始投予癌症疫苗後，轉移發病率大幅減少。 然而，該等臨床應用之人工mRNA係藉由IVT製作所得。藉由IVT所製造之人工mRNA存在以下2個問題。第1，為了降低免疫反應性、賦予對於核酸分解酶之穩定性而導入之修飾核苷酸之導入位置無法控制。專利文獻1中揭示有如下事例，即，若為藉由IVT導入有2'-F化修飾RNA之人工mRNA，則肽轉譯能力會減弱、消失。第2，除被IVT中所使用之RNA合成酶識別為受質之修飾核苷酸以外，無法導入。同樣地，據專利文獻1中揭示，藉由使用一般之RNA聚合酶之IVT反應，難以製備出包含2'-O-甲基化修飾RNA之人工mRNA。 因此，關於藉由IVT導入修飾核苷酸而製作之人工mRNA，很難說針對修飾核苷酸之位置及種類進行了充分之研究。
報告有使用化學連結複數個RNA之技術來人工合成mRNA之方法(非專利文獻6、7)。若使用該方法，則有可能於包含編碼序列(Coding Sequence，以下有時稱為「CDS」)之人工mRNA之任意位置導入包含糖部修飾之修飾核苷酸。實際上，據非專利文獻6及7中所示，製作於mRNA之CDS中之1個部位上導入有2'-O-甲基化修飾RNA之人工mRNA，其肽轉譯能力得到確認。另一方面，據揭示，根據糖部修飾核苷酸之導入位置不同，肽轉譯能力會顯著減弱，因此為了實現作為核酸醫藥而言充分低之免疫反應性或足夠高之穩定性，需要對修飾核苷酸之修飾率、位置及種類進一步研究。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2014/093574號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]自然-綜述：藥物發現(Nature Reviews Drug Discovery)、第13卷、759-780頁(2014) [非專利文獻2]自然生物科技(Nature Biotechnology)、第35卷、第3號、238-248頁(2017) [非專利文獻3] 今日藥物發現(Drug Discovery Today)、第13卷、第19/20號、842-855頁(2008) [非專利文獻4]自然生物科技(Nature Biotechnology)、第35卷、第3號、193-197頁(2017) [非專利文獻5]自然(Nature)、第547卷、第7662號、222-226頁(2017) [非專利文獻6]核酸研究(Nucleic Acids Research)、第44卷、第2號、852-862頁(2015) [非專利文獻7]基因(Genes)、第10卷、第2號、84頁(2019)
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於提供一種雖然於轉譯區域具有修飾部位但維持有轉譯活性之多核苷酸。 [解決問題之技術手段]
本發明者等人進行銳意研究，結果發現，即便對構成轉譯區域之複數個密碼子所分別包含之第1號、第2號及第3號核苷酸中的第1號核苷酸之糖部進行修飾，轉譯活性亦得到維持。
本發明包含以下實施方式。 [1] 一種多核苷酸，其 包含自起始密碼子至終止密碼子之轉譯區域， 上述轉譯區域包含n個密碼子，上述n為2以上之正整數， 上述n個密碼子分別包含第1號、第2號及第3號核苷酸， 上述n個密碼子中至少2個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [2] 如[1]所記載之多核苷酸，其中上述糖部修飾核苷酸包含至少2'位經修飾之糖部。 [3] 如[2]所記載之多核苷酸，其中 上述至少2'位經修飾之糖部係選自以下糖部： [化1]
Figure 02_image001
。 [4] 如[1]至[3]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述糖部修飾核苷酸包含與選自由腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶所組成之群中之鹼基對應之鹼基部，且 上述鹼基之種類為至少2種。 [5] 如[1]至[4]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述糖部修飾核苷酸之至少1個包含修飾鹼基部。 [6] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子之所有第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [6-1] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為5%以上。 [6-2] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為10%以上。 [6-3] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為15%以上。 [6-4] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為20%以上。 [6-5] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為25%以上。 [6-6] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為30%以上。 [6-7] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為35%以上。 [6-8] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為40%以上。 [6-9] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為45%以上。 [6-10] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為50%以上。 [6-11] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為55%以上。 [6-12] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為60%以上。 [6-13] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為65%以上。 [6-14] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為70%以上。 [6-15] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為75%以上。 [6-16] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為80%以上。 [6-17] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為90%以上。 [6-18] 如[1]至[5]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為95%以上。 [7] 如[1]至[6-18]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述終止密碼子之第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [8] 如[1]至[7]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述起始密碼子之第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [9] 如[1]至[8]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中至少1個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [9-1] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為50%以下。 [9-2] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為45%以下。 [9-3] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為40%以下。 [9-4] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為35%以下。 [9-5] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為30%以下。 [9-6] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為25%以下。 [9-7] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為20%以下。 [9-8] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為15%以下。 [9-9] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為10%以下。 [9-10] 如[1]至[9]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為5%以下。 [9-11] 如[1]至[6-18]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為0%。 [10] 如[1]至[9-11]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中至少1個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [10-1] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為100%。 [10-2] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為90%以下。 [10-3] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為80%以下。 [10-4] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為70%以下。 [10-5] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為60%以下。 [10-6] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為50%以下。 [10-7] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為45%以下。 [10-8] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為40%以下。 [10-9] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為35%以下。 [10-10] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為30%以下。 [10-11] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為25%以下。 [10-12] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為20%以下。 [10-13] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為15%以下。 [10-14] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為10%以下。 [10-15] 如[1]至[10]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為5%以下。 [10-16] 如[1]至[6-18]及[9]至[9-11]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率為0%。 [11] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為2～2000之整數。 [11-1] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為2～1500之整數。 [11-2] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為2～1000之整數。 [11-3] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為2～500之整數。 [11-4] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為5～2000之整數。 [11-5] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為5～1500之整數。 [11-6] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為5～1000之整數。 [11-7] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為5～500之整數。 [11-8] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為10～2000之整數。 [11-9] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為10～1500之整數。 [11-10] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為10～1000之整數。 [11-11] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為10～500之整數。 [11-12] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為50～2000之整數。 [11-13] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為50～1500之整數。 [11-14] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為50～1000之整數。 [11-15] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為50～500之整數。 [11-16] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為100～2000之整數。 [11-17] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為100～1500之整數。 [11-18] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為100～1000之整數。 [11-19] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為100～500之整數。 [11-20] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為200～2000之整數。 [11-21] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為200～1500之整數。 [11-22] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為200～1000之整數。 [11-23] 如[1]至[10-16]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n為200～500之整數。 [12] 如[1]至[11-23]中任一項所記載之多核苷酸，其進而包含5'側非轉譯區域。 [13] 如[12]所記載之多核苷酸，其中 上述5'側非轉譯區域包含具有以下鹼基部之鹼基部修飾核苷酸， [化2]
Figure 02_image003
[式中，R為碳數1～6之烷基]。 [14] 如[12]或[13]所記載之多核苷酸，其中上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [15] 如[12]至[14]中任一項所記載之多核苷酸，其進而包含5'端帽結構。 [16] 如[1]至[15]中任一項所記載之多核苷酸，其進而包含3'側非轉譯區域。 [17] 如[16]所記載之多核苷酸，其中上述3'側非轉譯區域包含聚A鏈。 [18] 如[16]或[17]所記載之多核苷酸，其中上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [19] 如[12]至[18]中任一項所記載之多核苷酸，其中5'側非轉譯區域及/或3'側非轉譯區域包含糖部修飾核苷酸。 [20] 如技術方案[1]至[19]中任一項所記載之多核苷酸，其 包含以下結構： [化3]
Figure 02_image005
[式中， R1 及R2 分別獨立地表示H、OH、F或OCH3 ， B1 及B2 分別獨立地表示鹼基部， X1 表示O、S或NH， X2 表示O、S、NH或以下結構， [化4]
Figure 02_image007
X3 表示OH、SH或其等之鹽， 其中 X1 及X2 不同時為O]。 [21] 如技術方案[1]至[20]中任一項所記載之多核苷酸，其包含硫代磷酸酯結構。 [22] 如[1]至[21]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述n個密碼子中至少1個密碼子中之第1號核苷酸與第2號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。 [23] 如[1]至[22]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第2號核苷酸、第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。 [24] 如[1]至[23]中任一項所記載之多核苷酸，其中上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第2號核苷酸、第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。 [25] 一種醫藥組合物，其包含如技術方案[1]至[24]中任一項所記載之多核苷酸。
本發明進而包含以下實施方式。 [1A] 如[1]至[24]中任一項所記載之多核苷酸或[25]所記載之醫藥組合物，其用於治療疾病。 [1B] 一種治療疾病之方法，其包括對有需要之患者投予治療有效量之如[1]至[24]中任一項所記載之多核苷酸或[25]所記載之醫藥組合物。 [1C] 一種如[1]至[24]中任一項所記載之多核苷酸或[25]所記載之醫藥組合物之用途，其用於治療疾病。 [1D] 一種如[1]至[24]中任一項所記載之多核苷酸之用途，其用於製造用以治療疾病之醫藥。 [1E] 如[1]至[24]中任一項所記載之多核苷酸，其用於製造用以治療疾病之醫藥。 [1F] 一種用於治療疾病之套組，其包含如[1]至[24]中任一項所記載之多核苷酸或[25]所記載之醫藥組合物及使用說明書。
本發明進而包含以下實施方式。 [2A] 一種多核苷酸，其包含轉譯區域及5'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [2B] 一種多核苷酸，其包含轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [2C] 一種多核苷酸，其包含轉譯區域、5'側非轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。 [2D] 一種多核苷酸，其包含轉譯區域及5'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。 [2E] 一種多核苷酸，其包含轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。 [2F] 一種多核苷酸，其包含轉譯區域、5'側非轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。 [2G] 一種多核苷酸，其包含轉譯區域及5'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。 [2H] 一種多核苷酸，其包含轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。 [2I] 一種多核苷酸，其包含轉譯區域、5'側非轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。 [發明之效果]
根據本發明，可提供一種雖然於轉譯區域具有修飾部位但維持有轉譯活性之多核苷酸。
＜多核苷酸＞ 本發明之一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含自起始密碼子至終止密碼子之轉譯區域，上述轉譯區域包含n個密碼子，上述n為2以上之正整數，上述n個密碼子分別包含第1號、第2號及第3號核苷酸，上述n個密碼子中至少2個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
圖1表示任意2個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之轉譯區域之概略圖。
即便對構成轉譯區域之複數個密碼子中之第1號核苷酸之糖部進行修飾，轉譯活性亦得到維持，因此本實施方式之多核苷酸雖然於轉譯區域具有修飾部位但維持有轉譯活性。本說明書中所謂「轉譯活性」意指轉譯mRNA而合成多肽之活性(本說明書中之「多肽」包括蛋白質)。又，本實施方式之多核苷酸亦具有對於酶(例如核酸分解酶(核酸酶))之優異之穩定性。
本說明書中，所謂「維持有轉譯活性」係指複數個密碼子中之第1號核苷酸之糖部經修飾之多核苷酸與未修飾之多核苷酸相比，具有60%以上之轉譯活性。修飾多核苷酸之轉譯活性與未修飾多核苷酸相比，較佳為70%以上、80%以上、90%以上或100%以上。
本實施方式之多核苷酸可理解為，於將轉譯區域轉譯成多肽之方面具有與例如mRNA、小開放閱讀框(smORF，small open reading frame)、非經典開放閱讀框(non-canonical open reading frame)、長鏈非編碼RNA((lncRNA，long noncoding RNA)、pri-microRNA(pri-miRNA)同等之功能的多核苷酸。
(轉譯區域) 本實施方式之多核苷酸包含轉譯區域。轉譯區域亦稱為編碼序列(CDS)。一個多核苷酸可包含複數個轉譯區域。轉譯區域係包含自起始密碼子至終止密碼子(或稱為終結密碼子)之複數個密碼子，且經轉譯而合成多肽之區域。密碼子係編碼構成多肽之各胺基酸之單位，上述單位包含3個核苷酸。
基於天然密碼子表，作為起始密碼子，例如可例舉編碼甲硫胺酸之AUG，但並不限定於天然密碼子表。作為AUG以外之非正規起始密碼子，亦可例舉CUG、GUG、UUG、ACG、AUC、AUU、AAG、AUA、AGG。作為終止密碼子，例如可例舉UAA、UAG及UGA。構成轉譯區域之密碼子之種類並無特別限定，可根據目標之多肽適當選擇。
構成轉譯區域之密碼子之數量(n)較佳為2～2000之整數，更佳為2～1500之整數，進而較佳為2～1000之整數，最佳為2～500之整數。又，亦可將上述數值範圍之下限變更為5、10、50、100、200等。變更下限之情形時之構成轉譯區域之密碼子之數量(n)較佳為5～2000、10～2000、50～2000、100～2000或200～2000之整數，更佳為5～1500、10～1500、50～1500、100～1500或200～1500之整數，進而較佳為5～1000、10～1000、50～1000、100～1000或200～1000之整數，最佳為5～500、10～500、50～500、100～500或200～500之整數。
各密碼子包含第1號、第2號及第3號核苷酸。例如於起始密碼子(AUG)之情形時，第1號核苷酸為A，第2號核苷酸為U，第3號核苷酸為G。
核苷酸通常包含糖部、鹼基部及磷酸部。糖部係核苷酸中所含之與糖對應之部分，鹼基部係核苷酸中所含之與鹼基對應之部分，磷酸部係核苷酸中所含之與磷酸對應之部分。
本說明書中，將修飾糖部之核苷酸稱為「糖部修飾核苷酸」，將修飾鹼基部之核苷酸稱為「鹼基部修飾核苷酸」，將修飾磷酸部之核苷酸稱為「磷酸部修飾核苷酸」。本說明書中所謂「修飾」意指使糖部、鹼基部或磷酸部之結構發生變化。藉由修飾所產生之結構之變化並無特別限定。作為修飾，例如可例舉利用任意取代基進行之任意部位之取代。
本說明書中，將鍵結於糖部之2'位之碳之OH取代為H(即，將核糖部取代為2'-去氧核糖部)、及將鍵結於糖部之2'位之碳之H取代為OH(即，將2'-去氧核糖部取代為核糖部)不屬於糖部之修飾。因此，於以核糖核苷酸作為基準之情形時，與核糖核苷酸對應之2'-去氧核糖核苷酸並非「糖部修飾核苷酸」。又，於以2'-去氧核糖核苷酸作為基準之情形時，與2'-去氧核糖核苷酸對應之核糖核苷酸並非「糖部修飾核苷酸」。
非修飾糖部較佳為與核糖或2'-去氧核糖對應之糖部，更佳為與核糖對應之糖部。即，本實施方式之多核苷酸中，除糖部修飾核苷酸以外之核苷酸較佳為包含與核糖或2'-去氧核糖對應之糖部，更佳為包含與核糖對應之糖部。
[糖部修飾核苷酸] 本實施方式之多核苷酸中，構成轉譯區域之複數個密碼子中所含之第1號核苷酸之至少2個為糖部修飾核苷酸。包含糖部修飾核苷酸之密碼子之位置並無特別限定。第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率較佳為5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上或100%。上述比率為100%係指第1號核苷酸全部為糖部修飾核苷酸。呈現上述比率越大，對於酶之穩定性越優異之趨勢。圖2表示第1號核苷酸全部為糖部修飾核苷酸之轉譯區域之概略圖。於第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之情形時，第1號核苷酸之糖部之2'位之取代基較佳為氟，但並無特別限定。
本實施方式之多核苷酸中，構成轉譯區域之複數個密碼子中所含之第2號核苷酸之至少1個可為糖部修飾核苷酸，但第2號核苷酸之糖部亦可未經修飾。第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率可為50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下、5%以下、或0%。上述比率為0%係指所有第2號核苷酸均非糖部修飾核苷酸。於第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸之情形時，第2號核苷酸之糖部之2'位之取代基較佳為氟，但並無特別限定。
本實施方式之多核苷酸中，構成轉譯區域之複數個密碼子中所含之第3號核苷酸之至少1個可為糖部修飾核苷酸。第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸之比率可為100%、90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下、5%以下、或0%。
本實施方式之多核苷酸中，就提高轉譯活性之觀點而言，終止密碼子之第1號、第2號及第3號核苷酸可為糖部修飾核苷酸。圖3表示所有第1號核苷酸、及所有終止密碼子之核苷酸均為糖部修飾核苷酸之轉譯區域之概略圖。
本實施方式之多核苷酸中，要想提高對於核酸分解酶之穩定性，起始密碼子之第1號、第2號及第3號核苷酸可為糖部修飾核苷酸。較佳為起始密碼子之第1號、第2號及第3號核苷酸之糖部之2'位之取代基均為氟，但並無特別限定。
糖部修飾核苷酸只要是核苷酸之糖部經修飾者，則無特別限定，較佳為包含至少2'位經修飾之糖部。藉由修飾2'位，可提高對於酶之穩定性。至少2'位經修飾之糖部可為2'位與4'位交聯之糖部。
作為修飾糖部，例如可例舉以下修飾糖部。 [化5]
Figure 02_image009
[式中， M為R1 、OR1 、R2 OR1 、SH、SR1 、NH2 、NHR1 、NR1 2 、N3 、CN、F、Cl、Br或I， R1 分別獨立為烷基或芳基，較佳為碳數1～6之烷基，更佳為碳數1～3之烷基， R2 為伸烷基，較佳為碳數1～6之伸烷基]
本說明書中，作為碳數1～6之烷基，例如可例舉碳數1～6之直鏈或支鏈烷基。作為碳數1～6之直鏈烷基，例如可例舉甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及己基。作為碳數1～6之支鏈烷基，例如可例舉異丙基、異丁基、第二丁基、第三丁基、及經甲基取代之戊基。 作為碳數1～3之烷基，例如可例舉甲基、乙基、丙基及異丙基。
本說明書中，作為芳基，例如可例舉可經取代之苯基、及可經取代之萘基。
本說明書中，碳數1～6之伸烷基係將碳數1～6之烷基之碳原子上鍵結之氫原子去除1個而成之基。
本說明書中，所謂修飾糖部，表示糖部修飾核苷酸中所含之經修飾之糖結構。作為修飾糖部之M，亦可進而例舉：2-(甲氧基)乙氧基、3-胺基丙氧基、2-[(N,N-二甲基胺基)氧基]乙氧基、3-(N,N-二甲基胺基)丙氧基、2-[2-(N,N-二甲基胺基)乙氧基]乙氧基、2-(甲基胺基)-2-氧代乙氧基、2-(N-甲基胺甲醯基)乙氧基)、及2-氰基乙氧基。
作為修飾糖部，進而可例舉以下核酸之糖部： ・鎖核酸(LNA)[Tetrahedron Letters, 38, 8735 (1997)及Tetrahedron, 54, 3607 (1998)]； ・伸乙基橋接核酸(ENA)[Nucleic Acids Research, 32, e175 (2004)]； ・約束乙基(cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569 (2010)]； ・醯胺基橋接核酸(AmNA)[Chem Bio Chem 13, 2513 (2012)]； ・2'-O,4'-c-螺伸環丙基橋接核酸(scpBNA)[Chem. Commun., 51, 9737 (2015)]； ・三環DNA(tcDNA)[Nat. Biotechnol., 35, 238 (2017)]； ・解鎖核酸(UNA)[Mol. Ther. Nucleic Acids 2, e103 (2013)]； ・3'-氟己糖醇核酸 (FHNA)[Nat. Biotechnol., 35, 238 (2017)]； ・肽核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]； ・氧基肽核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]； ・肽核糖核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]。
修飾糖部較佳為選自以下修飾糖部，但並無特別限定。 [化6]
Figure 02_image011
糖部修飾核苷酸較佳為包含與選自由腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)所組成之群中之鹼基對應之鹼基部，上述鹼基之種類較佳為至少2種。此處，所謂「鹼基之種類為至少2種」，意指例如一個糖部修飾核苷酸包含與腺嘌呤對應之鹼基部，另一糖部修飾核苷酸包含與鳥嘌呤對應之鹼基部。
糖部修飾核苷酸可為鹼基部修飾核苷酸及/或磷酸部修飾核苷酸(換言之，糖部修飾核苷酸可進而包含修飾鹼基部及/或修飾磷酸部)。糖部修飾核苷酸之至少1個可包含修飾鹼基部。
[鹼基部修飾核苷酸] 轉譯區域亦可包含鹼基部修飾核苷酸。鹼基部修飾核苷酸於轉譯區域中之存在位置並無特別限定。鹼基部修飾核苷酸可為糖部修飾核苷酸及/或磷酸部修飾核苷酸(換言之，鹼基部修飾核苷酸可進而包含修飾糖部及/或修飾磷酸部)。
鹼基部修飾核苷酸只要是核苷酸之鹼基部經修飾者，則無特別限定。作為非修飾鹼基部，例如可例舉與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶對應之鹼基部。作為修飾鹼基部，例如可例舉：非修飾鹼基部之氧經硫取代之鹼基部；非修飾鹼基部之氫經碳數1～6之烷基、鹵素等取代之鹼基部；非修飾鹼基部之甲基經氫、羥基甲基、碳數2～6之烷基等取代之鹼基部；非修飾鹼基部之胺基經碳數1～6之烷基、碳數1～6之烷醯基、側氧基、羥基等取代之鹼基部。
作為鹼基部修飾核苷酸之具體例，例如可例舉：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-氮尿嘧啶、6-氮胞嘧啶、6-氮胸腺嘧啶、5-假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-鹵代腺嘌呤、8-鹵代鳥嘌呤、8-胺基腺嘌呤、8-胺基鳥嘌呤、8-巰基腺嘌呤、8-巰基鳥嘌呤、8-烷基硫代腺嘌呤、8-烷基硫代鳥嘌呤、8-羥基腺嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤、8-氮腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、3-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1,5-a]1,3,5三𠯤酮、9-去氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡𠯤、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡𠯤-2-酮、1,2,4-三𠯤、嗒𠯤、及1,3,5-三𠯤。
[磷酸部修飾核苷酸] 轉譯區域亦可包含磷酸部修飾核苷酸。磷酸部修飾核苷酸於轉譯區域中之存在位置並無特別限定。磷酸部修飾核苷酸可為糖部修飾核苷酸及/又鹼基部修飾核苷酸(換言之，磷酸部修飾核苷酸可進而包含修飾糖部及/或修飾鹼基部)。
磷酸部修飾核苷酸只要是核苷酸之磷酸部(磷酸二酯鍵)經修飾者，則無特別限定。作為修飾磷酸部，例如可例舉硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、膦酸烷基酯鍵、及胺基磷酸酯鍵。
轉譯區域亦可包含修飾磷酸部為光學異構物(Rp，Sp)之磷酸部修飾核苷酸。選擇性地合成硫代磷酸酯鍵之光學異構物之方法例如揭示於J. Am. Chem. Soc., 124, 4962 (2002)、Nucleic Acids Research, 42,13546 (2014)、及Science 361, 1234(2018)。
(5'側非轉譯區域) 本實施方式之多核苷酸亦可進而包含5'側非轉譯區域(5'UTR)。5'側非轉譯區域係存在於轉譯區域之上游(5'末端側)且未進行用於合成多肽之轉譯的區域。構成5'側非轉譯區域之核苷酸之數量較佳為1～1000之整數，更佳為1～500之整數，進而較佳為1～250之整數，尤佳為1～100之整數。
5'側非轉譯區域亦可包含糖部修飾核苷酸。糖部修飾核苷酸之位置並無特別限定，就提高轉譯活性之觀點而言，自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸可為糖部修飾核苷酸。
又，亦可5'側非轉譯區域之所有核苷酸均為糖部修飾核苷酸。
作為糖部修飾核苷酸之修飾糖部之具體例，例如可例舉上述(轉譯區域)之[糖部修飾核苷酸]之項目中所記載者。
5'側非轉譯區域亦可包含鹼基部修飾核苷酸。鹼基部修飾核苷酸於5'側非轉譯區域中之存在位置並無特別限定。鹼基部修飾核苷酸可為糖部修飾核苷酸及/或磷酸部修飾核苷酸(換言之，鹼基部修飾核苷酸可進而包含修飾糖部及/或修飾磷酸部)。
作為鹼基部修飾核苷酸之修飾鹼基部之具體例，例如可例舉上述(轉譯區域)之[鹼基部修飾核苷酸]之項目中所記載者。就提高轉譯活性之觀點而言，5'側非轉譯區域較佳為包含以下修飾鹼基部，但並無特別限定。 [化7]
Figure 02_image013
[式中，R為碳數1～6之烷基] 修飾鹼基部之烷基R較佳為甲基或乙基。
作為碳數1～6之烷基之具體例，例如可例舉上述(轉譯區域)之[糖部修飾核苷酸]之項目中所記載者。
5'側非轉譯區域亦可包含磷酸部修飾核苷酸。磷酸部修飾核苷酸於5'側非轉譯區域中之存在位置並無特別限定。磷酸部修飾核苷酸可為糖部修飾核苷酸及/又鹼基部修飾核苷酸(換言之，磷酸部修飾核苷酸可進而包含修飾糖部及/或修飾鹼基部)。
作為磷酸部修飾核苷酸之修飾磷酸部之具體例，例如可例舉上述(轉譯區域)之[磷酸部修飾核苷酸]之項目中所記載者。
(5'端帽結構) 本實施方式之多核苷酸亦可進而包含5'端帽結構。5'端帽結構存在於5'側非轉譯區域之上游。藉由包含5'端帽結構，呈現轉譯活性提高之趨勢。
(3'側非轉譯區域) 本實施方式之多核苷酸亦可進而包含3'側非轉譯區域(3'UTR)。3'側非轉譯區域係存在於轉譯區域之下游且未進行用於合成多肽之轉譯的區域。
構成3'側非轉譯區域之核苷酸之數量較佳為1～6000之整數，更佳為1～3000之整數，進而較佳為1～1000之整數，尤佳為1～500之整數。
3'側非轉譯區域可包含聚A鏈。3'側非轉譯區域可包含聚A鏈以外之多核苷酸及聚A鏈兩者，亦可僅包含任一者。藉由包含聚A鏈，呈現轉譯活性提高之趨勢。
聚A鏈之長度較佳為1～500個鹼基之長度，更佳為1～200個鹼基之長度，進而較佳為1～40個鹼基之長度。
3'側非轉譯區域亦可包含糖部修飾核苷酸。糖部修飾核苷酸之位置並無特別限定。糖部修飾核苷酸可包含於聚A鏈以外之多核苷酸及聚A鏈兩者，亦可僅包含於任一者。就提高轉譯活性之觀點而言，3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸可為糖部修飾核苷酸。較佳為自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸之糖部之2'位之取代基均為2'-O-甲氧基乙基(MOE)基，但並無特別限定。
作為糖部修飾核苷酸之修飾糖部之具體例，例如可例舉上述(轉譯區域)之[糖部修飾核苷酸]之項目中所記載者。
3'側非轉譯區域亦可包含鹼基部修飾核苷酸。鹼基部修飾核苷酸於3'側非轉譯區域中之存在位置並無特別限定。鹼基部修飾核苷酸可為糖部修飾核苷酸及/或磷酸部修飾核苷酸(換言之，鹼基部修飾核苷酸可進而包含修飾糖部及/或修飾磷酸部)。
作為鹼基部修飾核苷酸之修飾鹼基部之具體例，例如可例舉上述(轉譯區域)之[鹼基部修飾核苷酸]之項目中所記載者。
3'側非轉譯區域亦可包含磷酸部修飾核苷酸。磷酸部修飾核苷酸於3'側非轉譯區域中之存在位置並無特別限定。磷酸部修飾核苷酸可為糖部修飾核苷酸及/又鹼基部修飾核苷酸(換言之，磷酸部修飾核苷酸可包含修飾糖部及/或修飾鹼基部)。
作為磷酸部修飾核苷酸之修飾磷酸部之具體例，例如可例舉上述(轉譯區域)之[磷酸部修飾核苷酸]之項目中所記載者。
由於磷酸部修飾核苷酸可對作為一種核酸分解酶之內核酸酶賦予穩定性，故較佳為自本發明之多核苷酸之5'末端及/或3'末端起含有連續2個以上。
(連結部) 本實施方式之多核苷酸亦可包含以下連結部。 [化8]
Figure 02_image015
[式中， R1 及R2 分別獨立地表示H、OH、F或OCH3 ， B1 及B2 分別獨立地表示鹼基部， X1 表示O、S或NH， X2 表示O、S、NH或以下結構， [化9]
Figure 02_image017
X3 表示OH、SH或其等之鹽(X3 之OH及SH亦可分別表示為O- 及S- )， 其中 X1 及X2 不同時為O]
上述連結部之左側及右側之核苷酸係構成本實施方式之多核苷酸之2個核苷酸。即便包含上述連結部，亦可維持轉譯活性。上述連結部之右側(5'末端側)之核苷酸A及左側(3'末端側)之核苷酸B、以及鄰接於上述核苷酸B之3'末端側之核苷酸C、及鄰接於上述核苷酸C之3'末端側之核苷酸D亦可未經修飾。
作為上述連結部之X3 之OH及SH之鹽，例如可例舉製藥學上可容許之鹽。作為製藥學上可容許之鹽，例如可例舉：鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、銨鹽、有機胺鹽、及胺基酸鹽。作為鹼金屬鹽，例如可例舉鈉鹽、鋰鹽、及鉀鹽。作為鹼土金屬鹽，例如可例舉鈣鹽、及鎂鹽。
作為上述連結部之具體例，例如可例舉以下者。 [化10]
Figure 02_image019
[式中，R1 、R2 、B1 、B2 、及X3 如上所述]
上述連結部存在之位置並無特別限定。連結部可存在於轉譯區域、5'側非轉譯區域、及3'側非轉譯區域之任一者，於存在連結部之情形時，連結部較佳為至少存在於轉譯區域。
上述連結部之數量並無特別限定，可根據多核苷酸之長度而適當選擇。作為連結部之數量，例如可例舉1～200個、1～100個、1～50個、1～20個、1～10個、1～8個、1～6個、1～4個、1～3個、或者1或2個。
本實施方式之多核苷酸中，構成轉譯區域之複數個密碼子中至少1個密碼子中的第1號核苷酸與第2號核苷酸亦可藉由硫代磷酸酯連結。硫代磷酸酯鍵之數量並無特別限定，可根據多核苷酸之長度而適當選擇。作為硫代磷酸酯鍵之數量，例如可例舉1～200個、1～100個、1～50個、1～20個、1～10個、1～8個、1～6個、1～4個、1～3個、或者1或2個。
就提高轉譯活性之觀點而言，5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第2號核苷酸、第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸可藉由硫代磷酸酯連結。再者，例如所謂第1～第3號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結，意指第1號核苷酸與第2號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結，且第2號核苷酸與第3號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
就提高轉譯活性之觀點而言，3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第2號核苷酸、第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸可藉由硫代磷酸酯連結。
本發明之另一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含轉譯區域及5'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
本發明之另一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
本發明之另一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含轉譯區域、5'側非轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
本發明之另一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含轉譯區域及5'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
本發明之另一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
本發明之另一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含轉譯區域、5'側非轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
本發明之另一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含轉譯區域及5'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
本發明之另一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
本發明之另一實施方式係關於一種多核苷酸，其包含轉譯區域、5'側非轉譯區域及3'側非轉譯區域， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸， 上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
(其他序列) 本實施方式之多核苷酸亦可進而包含Kozak序列及/或核糖體結合序列(RBS，Ribosome Binding sequence)。
＜多核苷酸之製造方法＞ 本實施方式之多核苷酸例如可藉由化學合成來製造。具體而言，可藉由如下方式來製造本實施方式之多核苷酸，即，使用公知之化學合成法，一面使多核苷酸鏈伸長，一面於規定位置導入規定糖部修飾核苷酸。作為公知之化學合成法，例如可例舉：亞磷醯胺法、硫代磷酸酯法、磷酸三酯法、及CEM(2-cyanoethoxymethyl ，2-氰基乙氧基甲基)法(參照Nucleic Acids Research,35, 3287 (2007))。又，亦可利用ABI3900高通量核酸合成機(Applied Biosystems公司製造)。
作為公知之化學合成法，更具體而言，可例舉以下文獻等記載之方法： ・四面體(Tetrahedron)，第48卷，第12號，2223-2311頁(1992年)； ・核酸化學實驗室指南(Current Protocols in Nucleic Acids Chemistry)，John Wiley & Sons(2000年)； ・寡核苷酸與類似物之協定(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)，Human Press(1993年)； ・人工核酸之化學及生物學(Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids)，Wiley-VCH(2012年)； ・利用基因組化學人工核酸之科學方法，講談社(2003年)； ・核酸化學之新趨勢，化學同人(2011年)。
可化學合成未市售之亞磷醯胺，使用其作為原材料來製造本實施方式之多核苷酸。 以下揭示作為鹼基部修飾核苷酸之原材料的亞磷醯胺(f)之合成方法。 [化11]
Figure 02_image021
[合成流程中，Ra表示氫原子、F、OMe或OCH2CH2OMe，Rb係例如二第三丁基矽烷基等可利用氟化物離子去除之保護基，Rc表示碳數1～6之烷基，Rd係核酸固相合成中使用之保護基，例如表示p,p'-二甲氧基三苯甲基]
(步驟A) 化合物(b)可藉由在溶劑中於鹼之存在下使化合物(a)與例如相當之矽烷化劑在0℃與80℃之間的溫度下反應10分鐘～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉DMF(Dimethylformamide，二甲基甲醯胺)、DMA(Dimethylacetamide，二甲基乙醯胺)、NMP(N-Methyl pyrrolidone，N-甲基吡咯啶酮)等，該等可單獨使用或混合使用。 作為鹼，例如可例舉咪唑、三乙胺、二異丙基乙基胺等。 作為矽烷化劑，例如可例舉雙(三氟甲磺酸)二第三丁基矽烷基酯等。
(步驟B) 化合物(c)可藉由在溶劑中於鹼之存在下使化合物(b)與相當之烷基化劑在0℃與150℃之間的溫度下反應10分鐘～3天來製造。亦可藉由適當之添加劑來促進反應。 作為溶劑，例如可例舉DMF、吡啶、二氯甲烷、THF(Tetrahydrofuran，四氫呋喃)、乙酸乙酯、1,4-二㗁烷、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。 作為鹼，例如可例舉氫氧化鈉水溶液、碳酸鉀、吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺等。 作為烷基化劑，例如可例舉碘甲烷、碘乙烷、溴甲烷等。 作為添加化劑，例如可例舉溴化四丁基銨。
(步驟C) 化合物(d)可藉由在溶劑中使化合物(c)與氟試劑於-80℃與200℃之間的溫度下反應10秒～72小時來製造。此時，亦可添加鹼。 作為氟試劑，例如可例舉氫氟酸、氫氟酸三乙胺鹽、氟化四丁基銨(TBAF)等。 作為鹼，例如可例舉三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺等。 作為溶劑，例如可例舉二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二㗁烷、DMF、N,N-二甲基乙醯胺(DMA)、NMP、二甲基亞碸(DMSO)等。
(步驟D) 化合物(e)可藉由在溶劑中於鹼之存在下使化合物(d)與相當之烷基化劑於0℃與150℃之間的溫度下反應10分鐘～3天來製造。亦可藉由適當之活化劑來促進反應。 作為溶劑，例如可例舉DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二㗁烷、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。 作為鹼，例如可例舉吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺、2,6-二甲基吡啶等。 作為烷基化劑，例如可例舉三苯氯甲烷、p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷等。 作為活化劑，例如可例舉4-二甲基胺基吡啶等。
(步驟E) 化合物(f)可藉由在溶劑中使化合物(e)與化合物(g)於鹼之存在下於0℃與100℃之間的溫度下反應10秒～24小時來製造。 作為溶劑，例如可例舉二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二㗁烷、DMF、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。 作為鹼，例如可例舉三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、吡啶等，該等可單獨使用或混合使用。
5'端帽結構可使用公知方法(例如酵素法及化學合成法)導入。作為公知方法，例如可例舉Top. Curr. Chem. (Z) (2017) 375:16、及Beilstein J. Org. Chem. 2017, 13, 2819-2832所記載之方法。
於本實施方式之多核苷酸之鹼基長較長之情形時，亦可將複數個多核苷酸單元連結。連結方法並無特別限定，例如可例舉酵素法及化學合成法。
作為利用酵素法進行之連結，例如可例舉使用連接酶之連結。作為連接酶，例如可例舉T4 DNA連接酶、T4 RNA連接酶1、T4 RNA連接酶2、T4 RNA連接酶2、截短型T4 RNA連接酶2、截短型KQ、E. Coli DNA連接酶、Taq. DNA連接酶等，該等可單獨使用或混合使用。酵素法中，一般而言，較佳為構成多核苷酸之5'末端側之多核苷酸單元(以下，稱為「5'末端側多核苷酸單元」)之3'末端之核苷酸A、構成多核苷酸之3'末端側之多核苷酸單元(以下，稱為「3'末端側多核苷酸單元」)之5'末端之核苷酸B(連結之多核苷酸中，核苷酸A及B相互鄰接)、鄰接於上述核苷酸B之核苷酸C、鄰接於上述核苷酸C之核苷酸D未經修飾。另一方面，於使用Molecular Cell, Vol. 16, 211-221, October 22, 2004所記載之T4 RNA連接酶2等之情形時，上述核苷酸A～D亦可未經修飾。
於利用酵素法進行之連結中，為了藉由分子擁擠效應促進連結反應，亦可使用多分散聚乙二醇(PEG)。作為多分散PEG，例如可例舉PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000等，該等可單獨使用或混合使用。
作為利用化學合成法進行之連結(亦稱為「化學連接」)，例如可例舉如下所述使5'末端側多核苷酸單元之3'末端(下述右側)與3'末端側多核苷酸單元之5'末端(下述左側)於縮合劑之存在下縮合之方法。 [化12]
Figure 02_image023
[式中，R1 、R2 、B1 、B2 、X1 、X2 、及X3 如上所述]
作為縮合劑，例如可例舉：1,3-二環己烷碳二醯亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)、羰基二咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基胺基)鏻六氟磷酸鹽、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、及碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓。
上述縮合反應較佳為於包含與5'末端側多核苷酸單元之3'末端側之核苷酸鏈及3'末端側多核苷酸單元之5'末端側之核苷酸鏈互補之核苷酸鏈的模板DNA之存在下實施。模板DNA較佳為與5'末端側多核苷酸單元之3'末端之較佳為2～50個鹼基之長度、更佳為5～40個鹼基之長度之核苷酸鏈，及3'末端側多核苷酸單元之5'末端之較佳為2～50個鹼基之長度、更佳為5～40個鹼基之長度之核苷酸鏈互補的核苷酸鏈。此處所謂「互補」意指鹼基序列之同一性例如為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或100%。
上述縮合反應中亦可加入添加劑。作為添加劑，例如可例舉1-羥基苯并三唑(HOBt)、及4-二甲基胺基吡啶(DMAP)。
上述縮合反應亦可於緩衝液之存在下實施。作為緩衝液，例如可例舉乙酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、及水。
上述縮合反應之溫度並無特別限定，例如可設為室溫～200℃。上述縮合反應之時間並無特別限定，例如可設為5分鐘～100小時。
作為5'末端側多核苷酸單元之3'末端(下述右側)與3'末端側多核苷酸單元之5'末端(下述左側)之縮合反應之具體例，例如可例舉以下者。 [化13]
Figure 02_image025
[式中，R1 、R2 、B1 、B2 、及X3 如上所述，X4 為脫離基]
作為脫離基之具體例，例如可例舉氯基、溴基、碘基、甲磺醯基、對甲苯磺醯基、三氟甲磺醯基。脫離基並無特別限定，較佳為氯基、溴基。
多核苷酸單元之連結亦可根據目標多核苷酸之長度反覆進行複數次。連結之次數並無特別限定，例如可設為1～200次、1～100次、1～50次、1～20次、1～10次、1～8次、1～6次、1～4次、1～3次、或1或2次。
以下例示作為連結中使用之5'末端側多核苷酸單元的化合物(M)及化合物(N)之製造法。 [化14]
Figure 02_image027
[式中，Bp 表示可由保護基保護之鹼基，B表示鹼基，Polymer表示固相支持體；R4 為可選擇性地去保護之保護基，例如為第三丁基二甲基矽烷基、三乙基矽烷基，R3 為核酸固相合成中使用之保護基，例如表示p,p'-二甲氧基三苯甲基，Xa 表示核酸序列，Ya 及Yb 分別獨立為脫離基，例如表示鹵素，較佳為表示氯原子或溴原子；本說明書中，所謂核酸序列係指分別與所結合之化合物一起形成核酸的核酸中之部分結構；再者，於分子中存在複數個B之情形時，各B可相同亦可不同]
(步驟1) 化合物(B)可藉由使化合物(A)在溶劑中於60℃與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉甲苯、二甲苯、1,2-二氯乙烷、1,4-二㗁烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、1,2-二氯苯、水等，該等可單獨使用或混合使用。 化合物(A)例如可藉由J.Am.Chem.Soc.(1999),121,5661-5665.所記載之方法等來製造。
化合物(A)中之Bp 並無特別限定，較佳為下述結構之任一者。
[化15]
Figure 02_image029
R6 係構成鹼基之保護基之一部分之基，例如表示甲基、異丙基、可具有取代基之苯基等。作為可具有取代基之苯基中之取代基，例如表示甲基、異丙基或第三丁基。
(步驟2) 化合物(C)可藉由使化合物(B)在溶劑中於1～100當量之氧化劑之存在下於0℃與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下，與較佳為1～100當量之添加劑反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉氯仿或二氯甲烷等非質子性溶劑等，該等可單獨使用或混合使用。 作為氧化劑，例如可例舉瓊斯試劑、鉻酸、二鉻酸吡啶鎓、四氧化釕、亞氯酸鈉、戴斯-馬丁(Dess-Martin)試劑等有機系氧化劑或氯鉻酸吡啶鎓等無機系氧化劑等，該等可單獨使用或混合使用。 作為添加劑，例如可例舉吡啶、三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺等，該等可單獨使用或混合使用。
(步驟3) 化合物(D)可藉由使化合物(C)在吡啶等溶劑中於羥胺鹽酸鹽之存在下，於0℃與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下反應10秒～3天來製造。
(步驟4) 化合物(E)可藉由使化合物(D)在溶劑中於1～100000當量之去保護劑之存在下，於0℃與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉甲苯、二甲苯、水等，該等可單獨使用或混合使用。 作為去保護劑，例如可例舉三氟乙酸、三氯乙酸、乙酸、鹽酸等，該等可單獨使用或混合使用。
(步驟5) 化合物(F)可藉由使化合物(E)在溶劑中於還原劑之存在下，於0℃與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉三氟乙酸、三氯乙酸、乙酸、鹽酸、甲苯、二甲苯、甲苯、二甲苯、四氫呋喃、甲醇、乙醇、1,4-二㗁烷、水等，該等可單獨使用或混合使用。 作為還原劑，例如可例舉硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、硼氫化鋰、三乙醯氧基硼氫化鈉等。
(步驟6) 化合物(G)可藉由使化合物(F)在溶劑中於觸媒之存在下，於氫氣氛圍下於0℃與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉三氟乙酸、乙酸、稀鹽酸、甲醇、乙醇、異丙醇、水等，該等可單獨使用或混合使用。 觸媒例如可例舉鈀碳、釕碳等。 化合物(G)例如亦可藉由國際公開第2017/123669號所記載之方法等來製造。
(步驟7) 化合物(H)可藉由使化合物(G)在溶劑中於1～100當量之化合物(G')及鹼之存在下，於0℃與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下，與較佳為1～1000當量之鹼反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃(THF)、1,4-二㗁烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、水等，該等可單獨使用或混合使用。 作為鹼，例如可例舉：吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺、2,6-二甲基吡啶等，該等可單獨使用或混合使用。 化合物(G')可使用市售品。
(步驟8) 化合物(I)可藉由使化合物(H)與p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷於吡啶等溶劑中，視需要於共溶劑之存在下，於0℃與100℃之間的溫度下反應5分鐘～100小時來製造。 作為共溶劑，例如可例舉甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二㗁烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、水等，該等可單獨使用或混合使用。
(步驟9) 化合物(J)可藉由使化合物(I)在溶劑中於0℃與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下，與1～10當量之添加劑反應10分鐘～10天來製造。 作為溶劑，例如可例舉二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二㗁烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。 作為添加劑，例如可例舉氟化四丁基銨、三乙胺三氫氟酸鹽等，該等可單獨使用或混合使用。
(步驟10) 化合物(K)可藉由使化合物(J)與琥珀酸酐在溶劑中於1～30當量之鹼之存在下，於室溫與200℃之間的溫度下反應5分鐘～100小時來製造。 作為溶劑，例如可例舉甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二㗁烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、吡啶、水等，該等可單獨使用或混合使用。 作為鹼，例如可例舉：碳酸銫、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)、N,N-二甲基-4-胺基吡啶(DMAP)等，該等可單獨使用或混合使用。
(步驟11) 化合物(L)可藉由如下方式製造，即，使化合物(K)與末端經胺基化之固相支持體於無溶劑下或溶劑中，在1～30當量之鹼、縮合劑及視需要而定之0.01～30當量之添加劑之存在下，於室溫～200℃之間的溫度下反應5分鐘～100小時反應後，於乙酸酐/吡啶溶液中，於室溫與200℃之間的溫度下反應5分鐘～100小時。 作為溶劑，可例舉步驟4中所例示者。 作為鹼，例如可例舉：碳酸銫、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)、N,N-二甲基-4-胺基吡啶(DMAP)等，該等可單獨使用或混合使用。 作為縮合劑，例如可例舉：1,3-二環己烷碳二醯亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)、羰基二咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基胺基)鏻六氟磷酸鹽、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓等。 作為添加劑，例如可例舉1-羥基苯并三唑(HOBt)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP)等，該等可單獨使用或混合使用。 作為固相支持體，只要在進行固相合成後使用公知之經胺基化之固相支持體，則無特別限定，例如可例舉經長鏈烷基胺基修飾之CPG(controlled pore glass，可控孔徑玻璃)或PS(polystyrene resin，聚苯乙烯樹脂)等固相支持體。 例如長鏈烷基胺細孔性玻璃(LCAA-CPG)可使用市售品。
(步驟12) 化合物(M)可藉由如下方式製造，即，使用化合物(L)，藉由公知之寡核苷酸化學合成法使對應之核苷酸鏈伸長後，進行自固相之脫離、保護基之去保護及純化。 自固相之脫離、去保護可藉由在化學合成寡核苷酸後，於溶劑或無溶劑中，於-80℃～200℃之間的溫度下，利用鹼處理10秒～72小時來製造。 作為鹼，例如可例舉：氨水、甲胺、二甲胺、乙胺、二乙胺、異丙胺、二異丙胺、哌啶、三乙胺、乙二胺、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)、碳酸鉀等，該等可單獨使用或混合使用。 作為溶劑，例如可例舉水、甲醇、乙醇、THF等，該等可單獨使用或混合使用。 寡核苷酸之純化可藉由C18逆相管柱或陰離子交換管柱、較佳為上述2種方法之組合來進行。 純化後之核酸複合體純度較佳為90%以上，更佳為95%以上。
(步驟13) 化合物(N)可藉由使用化合物(M)，於緩衝液中，於1～1000當量之化合物(O)之存在下，於室溫～100℃之間的溫度下反應5分鐘～100小時來製造。 作為緩衝液，例如可例舉乙酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、水等，該等可單獨使用或混合使用。 化合物(O)可使用市售品。
以下揭示作為連結中使用之3'末端側多核苷酸單元的化合物(W)之製造方法。 [化16]
Figure 02_image031
[式中，Bp 表示可經保護基保護之鹼基，B表示鹼基，R7 為保護基，表示例如第三丁基二甲基矽烷基、三乙基矽烷基，Yc表示例如氯原子、溴原子、甲苯磺酸酯基，Xb 表示核酸序列；再者，於分子中存在複數個B之情形時，各B可相同亦可不同]
(步驟14) 化合物(Q)可藉由使化合物(P)在溶劑中於添加劑及鹼之存在下，於0℃與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二㗁烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。 作為添加劑，例如可例舉對甲苯磺酸酐、甲苯磺醯氯、亞硫醯氯、草醯氯等，該等可單獨使用或混合使用。 作為鹼，例如可例舉：吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺、碳酸鉀等，該等可單獨使用或混合使用。 化合物(P)可使用市售品。
(步驟15) 化合物(R)可藉由使化合物(Q)在溶劑中於疊氮化劑及視需要而定之鹼之存在下，於室溫與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二㗁烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。 作為疊氮化劑，例如可例舉疊氮化鈉等。 作為鹼，例如可例舉吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺、碳酸鉀等，該等可單獨使用或混合使用。
(步驟16) 化合物(S)可藉由使化合物(R)在溶劑中於矽烷化劑及鹼之存在下，於室溫與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下，反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二㗁烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。 作為矽烷化劑，例如可例舉第三丁基二甲基氯矽烷、第三丁基二甲基矽烷基三氟甲磺酸鹽、三乙基氯矽烷等。 作為鹼，例如可例舉：吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)、N,N-二甲基-4-胺基吡啶(DMAP)等，該等可單獨使用或混合使用。
(步驟17) 化合物(T)可藉由在溶劑中添加還原劑，使化合物(S)於室溫與所使用之溶劑之沸點之間的溫度下反應10秒～3天來製造。 作為溶劑，例如可例舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二㗁烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、乙酸、水等，該等可單獨使用或混合使用。 作為還原劑，例如可例舉硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、硼氫化鋰、三乙醯氧基硼氫化鈉、氫氣氛圍下之鈀碳等。
(步驟18) 化合物(U)可使用化合物(T)，與步驟7同樣地進行製造。
(步驟19) 化合物(V)可藉由在溶劑中使化合物(U)與化合物(AA)於鹼之存在下，於0℃與100℃之間的溫度下反應10秒～24小時來製造。 作為溶劑，例如可例舉二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二㗁烷、DMF、NMP等，該等可單獨使用或混合使用。 作為鹼，例如可例舉三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、吡啶等，該等可單獨使用或混合使用。 化合物(AA)可使用市售品。
(步驟20) 化合物(W)可使用化合物(V)，以與步驟12相同之方式製造。
於連結複數個多核苷酸單元來製造本實施方式之多核苷酸的情形時，可包含一部分藉由IVT所製造之多核苷酸單元。連結藉由IVT所製造之多核苷酸之方法並無特別限定，例如可例舉上述酵素法及化學合成法。作為使用IVT來製造多核苷酸單元之方法，可例舉使用RNA聚合酶自具有啟動子序列之模板DNA轉錄RNA之方法。作為公知之IVT，更具體而言，可例舉以下文獻等中記載之方法。 ・RNA：分子生物學方法(方法與協定)(RNA, Methods in Moleculer Biology (Methods and Protocols))，第703卷，第3章(2011年)； ・心臟基因治療：分子生物學方法(方法與協定)(Cardiac Gene Therapy: Methods in Moleculer Biology (Methods and Protocols))，第1521卷，第8章(2016年)； ・分子生物學期刊(Journal of Molecular Biology)，第249卷，398頁～408頁(1995)
作為用於IVT之模板DNA，例如可例舉：藉由化學合成所製造者；藉由聚合酶連鎖反應所製造者；質體DNA；利用限制酶使質體DNA線狀化而製造者等，其等可單獨使用或混合使用。作為RNA聚合酶，可例舉T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶等，其等可單獨使用或混合使用。轉錄時使用之核糖核苷三磷酸可經修飾，亦可混合複數種核糖核苷三磷酸使用。如心臟基因治療：分子生物學方法(方法與協定)、第1521卷、第8章(2016年)所記載，可使用m7G(5')ppp(5')G(TriLink公司製造，目錄編號S1404)或Anti Reverse Cap Analog, 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(TriLink公司製造，目錄編號N-7003)等化合物來賦予5'端帽結構。如分子生物學期刊、第249卷、398頁～408頁(1995)所記載，藉由預先於模板DNA中插入D型肝炎病毒(HDV)核酶等序列，而可於轉錄後切割RNA之5'末端或3'末端。
＜醫藥組合物＞ 本發明之一實施方式係關於一種包含上述多核苷酸之醫藥組合物。藉由向具有疾病之患者投予本實施方式之醫藥組合物，可轉譯多核苷酸，合成上述多核苷酸編碼之多肽，從而治療上述疾病。
本發明提供一種針對特徵在於特定之蛋白質之功能或活性消失或異常之疾病的治療方法，其藉由利用自上述多核苷酸轉譯之多肽來彌補其功能或活性而進行治療，但並無特別限定。或者，還可提供一種治療方法，其藉由利用自上述多核苷酸轉譯之多肽使外來之抗原肽及其相關物於生物體內表現，而人工控制免疫應答。又，還可提供一種治療方法，其藉由利用自上述多核苷酸轉譯之多肽使轉錄因子等生物體中之特定蛋白質或生物體中原本不存在之多肽於生物體內表現，亦可人為地控制、改變細胞之功能、分化、增殖等，藉此，針對特徵在於組織或細胞產生損傷、或者其功能或活性降低或異常之疾病，使組織或細胞之功能恢復。
作為疾病，例如可例舉：癌及增殖性疾病、感染病及寄生蟲病、血液及造血系統疾病、自體免疫疾病、內分泌、營養及代謝疾病(包括先天性代謝異常)、精神神經系統疾病、皮膚及皮下組織疾病、眼部疾病、耳部疾病、呼吸系統疾病、消化系統疾病、腎泌尿生殖系統疾病、心血管疾病、腦血管疾病、肌肉骨骼系統及結締組織疾病、流產、圍產期疾病、先天畸形、後天損傷、及中毒等，但並無特別限定。
醫藥組合物可以規定製劑之形態投予。作為製劑，例如可例舉用於經口投予或非經口投予之液體劑形，作為液體劑形，例如可例舉藥學上可容許之乳劑、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿劑、及酏劑。液體劑形除活性成分以外，亦可包含該技術領域通常使用之惰性稀釋劑(例如水或其他溶劑)、助溶劑及乳化劑(例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油(尤其是棉籽、花生類、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻及芝麻之油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及山梨醇酐之脂肪酸酯、以及該等之混合物)。經口投予用製劑亦可包含佐劑(例如濕潤劑、乳化劑及懸浮化劑)、甜味料、香味料、及著香劑中之至少任一者。非經口投予用製劑亦可包含助溶劑(例如Cremophor(註冊商標)、酒精、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、環糊精、聚合物、及該等之組合)。
作為醫藥組合物之投予方法，例如可例舉：淋巴結局部投予、腫瘤內局部投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、氣管內投予、脊椎內投予、腦室內投予、眼內投予、鼓室內投予、對冠動脈之導管投予、對肝門脈之導管投予、對心肌之導管投予、經尿道之導管投予及靜脈內投予。
醫藥組合物除上述多核苷酸以外，亦可包含任意成分。作為任意成分，例如可例舉選自溶劑、水性溶劑、非水性溶劑、分散介質、稀釋劑、分散物、懸浮助劑、界面活性劑、等張劑、增黏劑、乳化劑、防腐劑、脂質、類脂質脂質體、脂質奈米粒子、核殼型奈米粒子、聚合物、脂複合體(lipoplexe)、肽、蛋白質、細胞、玻尿酸酶、及該等之混合物之1種以上之藥學上可容許之添加劑。 [實施例]
以下，使用實施例及參考例更詳細地說明本發明，但本發明之技術範圍並不限定於此。
化合物合成中使用之試劑係使用自Sigma-Aldrich公司、東京化成工業股份有限公司、和光純藥工業股份有限公司、關東化學股份有限公司購入者且不進行純化。無水溶劑係藉由在經活化之分子篩4Å上乾燥12小時來製備、或使用市售之無水級溶劑。反應之追蹤係藉由薄層矽膠層析法(Silicagel 70F254 TLC Plate-Wako，和光純藥工業股份有限公司)進行。化合物之純化係使用急速層析用矽膠60N(球狀、中性、粒徑40～50 μm)(關東化學股份有限公司)。NMR係以氘代溶劑(CDCl3 、CD3 OD、DMSO-d6 )(關東化學股份有限公司)作為測定溶劑，使用JEOL ECS 400MHz(日本電子股份有限公司)進行測定。所獲取之NMR之資料解析係使用JEOL Delta(日本電子股份有限公司)作為軟體進行，化學偏移值係使用氘代溶劑中之殘留訊號(CDCl3 ：7.26，CD3 OD：3.31，DMSO-d6 ：2.50)(Organometallics 2010, 29, 2176-2179)進行修正。1 H NMR之資料以化學偏移值(δ)、積分值(H)、訊號之分裂樣式、偶合常數(Hz)之形式記載(s：Singlet，d：Doublet，t：Triplet，sept.：Septet，m：Multiplet，br.：Broad)。高解析度質譜分析係使用micrOTOF-QII ESI(Bruker Daltonics公司)進行測定，以ESI TUNING MIX(Agilent Technologies公司)作為內部標準進行精密質量之修正。
作為多核苷酸之原料的化合物12之合成按照下述流程進行合成。 [化17]
Figure 02_image033
步驟1 化合物4之合成 N-(9-((2R,3S,4S,5R)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷氧基)甲基)-4-羥基-四氫呋喃-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺 使用藉由文獻記載之方法(J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 5661-5665)等所獲得之化合物3，使其溶解於1,2-二氯苯(2.0 mL)，於油浴上(160℃)攪拌4小時。於使反應液恢復至室溫後，不進行濃縮而藉由急速管柱層析法(中性矽膠、二氯甲烷/甲醇＝40：1)進行純化，獲得作為白色固體之化合物4(0.31 g，產率53%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 12.01 (1H, s), 8.50 (1H, s), 8.07 (1H, s), 5.86 (1H, d, J = 6.0 Hz), 4.47 (1H, s), 4.24 - 4.23 (1H, m), 4.22 - 4.21 (1H, m), 3.93 (1H, dd, J = 11.6, 2.0 Hz), 3.82 (1H, dd, J = 11.6, 2.0 Hz), 2.66 (1H, sept., J = 6.8 Hz), 1.27 (3H, d, J = 6.8 Hz), 1.25 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.93 (9H, s), 0.82 (9H, s), 0.13 (3H, s), 0.12 (3H, s), -0.07 (3H, s), -0.20 (3H, s)13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 179.0, 155.7, 148.5, 148.7, 147.8, 136.8, 121.0, 87.4, 85.4, 77.6, 71.8, 63.6, 36.2, 25.9, 25.4, 19.1, 18.7, 18.3, 17.8, -5.3, -5.4, -5.5, -5.6 ESI-HRMS：calcd for C26 H48 N5 O6 Si2 582.31[M+H]+ , found : 582.31[M+H]+
步驟2 化合物5之合成 N-(9-((2R,3S,5S)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷氧基)甲基)-4-(羥基亞胺基)-四氫呋喃-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺 於鉻酸(129 mg，1.29 mmol)之無水二氯甲烷(2.0 mL)溶液中添加分子篩3Å(粉末狀)(258 mg)，於冰浴上冷卻。於該溶液中在攪拌下滴加無水吡啶(207 μL，1.29 mmol)，於冰浴上攪拌。30分鐘後，滴加乙酸酐(122 μL，1.29 mmol)，於冰浴上攪拌。30分鐘後，滴加化合物4(250 mg，0.43 mmol)之二氯甲烷(1.3 mL)溶液，於室溫下攪拌2小時。藉由薄層層析法確認原料消失後，利用乙酸乙酯對反應液進行稀釋，利用二氧化矽墊(2 cm厚)進行過濾，並對濾液進行減壓濃縮，而獲得無色固體。該粗產物4'直接用於下一反應。 於粗產物4'(以0.43 mmol計)之吡啶(4 mL)溶液中添加羥胺鹽酸鹽(299 mg，4.30 mmol)，於室溫下攪拌。24小時後，對反應液進行減壓濃縮，於殘渣中添加水，用乙酸乙酯進行萃取。用飽和食鹽水清洗有機層，於無水硫酸鈉上乾燥。對有機層進行減壓濃縮，藉由急速管柱層析法(中性矽膠、二氯甲烷/甲醇＝40：1)對殘渣進行純化，獲得作為白色固體之化合物5(255 mg，產率68% for 2 steps)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 12.14 (1H, s), 9.27 (1H, s), 8.78 (1H, s), 8.11 (1H, s), 5.78 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.09 (1H, s), 4.92 (1H, d, J = 7.2 Hz), 4.14 (1H, d, J = 11.4 Hz), 3.92 (1H, d, J = 11.4 Hz), 2.79 - 2.74 (1H, m), 1.27 - 1.21 (6H, m), 0.91 (9H, s), 0.71 (9H, s), 0.10 (3H, s), 0.07 (3H, s), -0.10 (3H, s), -0.23 (3H, s)13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 178.9, 157.8, 155.6, 148.7, 147.8, 136.8, 120.8, 87.5, 86.5, 62.2, 36.3, 25.9, 25.5, 25.2, 19.1, 18.8, 18.3, 18.0, -5.0, -5.5, -5.6, -5.7 ESI-HRMS : calcd for C26 H47 N6 O6 Si2 595.31[M+H]+ , found : 595.31[M+H]+
步驟3 化合物6之合成 N-(9-((2R,3S,5S)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-4-(羥基亞胺基)-5-(羥甲基)-四氫呋喃-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺 於化合物5(129 mg，0.22 mmol)中添加經冰浴冷卻之90%三氟乙酸水溶液(1.0 mL)，於冰浴上攪拌30分鐘。對反應液進行減壓濃縮，於甲苯與水(1：1，v/v)中使所獲得之殘渣於減壓下共沸3次。藉由急速管柱層析法(中性矽膠、二氯甲烷/甲醇＝50：1～40：1)對所獲得之殘渣進行純化，獲得作為白色固體之化合物6(96 mg，產率92%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ 8.36 (1H, s), 5.87 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.18 (1H, dd, J = 7.6, 2.0 Hz), 5.02 (1H, d, J = 2.0 Hz), 4.11 (1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz), 3.92 (1H, d, J = 12.0, 2.0 Hz), 2.71 (1H, sept., J = 7.2 Hz), 1.21 (6H, d, J = 7.2 Hz), 0.72 (9H, s), 0.00 (3H, s), -0.16 (3H, s)13 C NMR (100 MHz, CD3 OD) δ 181.8, 157.4, 156.8, 151.0, 150.0, 139.8, 121.3, 88.4, 79.7, 76.5, 61.6, 36.9, 25.9, 19.4, 19.2, -4.5, -5.5 ESI-HRMS : calcd forC20 H32 N6 NaO6 Si  503.21[M+Na]+ , found : 503.20[M+Na]+
步驟4 化合物7之合成 N-(9-((2R,3S,4S,5S)-4-胺基-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-5-(羥甲基)-四氫呋喃-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺 於化合物6(93 mg，0.19 mmol)之乙酸(1.9 mL)溶液中添加硼氫化鈉(15 mg，0.38 mmol)，於室溫下攪拌1小時。藉由薄層層析法確認原料消失後，對反應液進行減壓濃縮，使殘渣溶解於乙酸乙酯，用飽和食鹽水進行清洗，於無水硫酸鈉上乾燥。對有機層進行減壓濃縮，藉由急速管柱層析法(中性矽膠、二氯甲烷/甲醇＝20：1)對所獲得之殘渣進行純化，獲得作為白色固體之化合物7(51 mg，產率55%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ 8.34 (1H, s), 6.06 (1H, d, J = 6.0 Hz), 4.75 (1H, t, J = 6.4  Hz), 4.27 (1H, d, J = 2.8 Hz), 3.86 (1H, dd, J = 12.4, 2.0 Hz), 3.73 (1H, d, J = 12.4, 2.0 Hz), 3.62 - 3.60 (1H, m), 2.71 (1H, sept., J = 6.8 Hz), 1.21 (6H, d, J = 6.8 Hz), 0.82 (9H, s), -0.02 (3H, s), -0.23 (3H, s)13 C NMR (100 MHz, CD3 OD) δ 181.8, 157.4, 150.8, 149.8, 139.6, 139.4, 121.1, 89.7, 84.5, 77.7, 65.4, 65.2, 36.9, 26.0, -5.2, -5.3 ESI-HRMS : calcd for C20 H35 N6 O6 Si  483.24[M+H]+ , found : 483.23[M+H]+
步驟5 化合物8之合成 N-(9-((2R,3S,4S,5S)-4-胺基-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-5-(羥甲基)-四氫呋喃-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺 於化合物7(50 mg，0.10 mmol)之90%乙酸水溶液(1.5 mL)溶液中添加10%鈀碳(20 mg)，於氫氣氛圍下，於室溫下攪拌18小時。藉由薄層層析法確認原料消失後，利用甲醇對反應液進行稀釋，利用矽藻土過濾將鈀碳去除。對濾液進行減壓濃縮，藉由急速管柱層析法(中性矽膠、二氯甲烷/甲醇＝15：1～10 :1)對所獲得之殘渣進行純化，獲得作為白色固體之化合物8(以乙酸鹽計為41 mg，產率75%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ 8.32 (1H, s), 5.99 (1H, s), 4.60 (1H, s), 3.95 - 3.68 (4H, m), 2.73 (1H, br. s), 1.22 (6H, br. s), 0.05 (3H, s), -0.06 (3H, s) ESI-HRMS : calcd for  C20 H34 N6 NaO5 Si  489.2258[M+Na]+ , found : 489.2231[M+Na]+
步驟6 化合物9之合成 N-(9-((2R,3S,4R,5S)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-5-(羥甲基)-4-(2,2,2-三氟乙醯胺基)-四氫呋喃-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺 於文獻已知(WO2017/123669)之化合物8(40 mg，0.076 mmol)及三乙胺(45 L, 0.38 mmol)之甲醇溶液(0.76 mL)溶液中添加三氟乙酸乙酯(0.76 mL)，於室溫下攪拌24小時。藉由薄層層析法確認原料消失後，對反應液進行減壓濃縮，藉由急速管柱層析法(中性矽膠、二氯甲烷/甲醇＝20：1～12：1)對所獲得之殘渣進行純化，獲得作為白色固體之化合物9(12 mg，產率28%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 12.26 (1H, s), 10.11 (1H, s), 7.76 (1H, s), 7.26 (1H, d, J = 3.6 Hz), 5.71 (1H, d, J = 3.6 Hz), 4.98 (1H, dd, J = 6.8 Hz), 4.78 (1H, dd, J = 6.8, 3.6 Hz), 4.21 (1H, d, J = 6.8 Hz), 4.03 (1H, dd, J =11.2 Hz), 3.82 (1H, dd, J =11.2 Hz), 2.79 (1H, sept., J = 6.8 Hz), 1.26 (3H, d, J = 6.8 Hz), 1.24 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.85 (9H, s), -0.01 (3H, s), -0.11 (3H, s)13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 179.8, 158.0, 157.7, 157.3, 156.9, 155.2, 148.3, 147.3, 138.6, 122.0, 120.0, 117.1, 114.2, 111.3, 91.6, 83.7, 74.5, 61.3, 51.0, 36.1, 25.2, 18.9, 17.7, -5.0, -5.4 ESI-HRMS : calcd for C22 H33 F3 N6 NaO6 Si  585.21[M+Na]+ , found : 585.21[M+Na]+
步驟7 化合物10之合成 N-(9-((2R,3S,4R,5S)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-4-(2,2,2-三氟乙醯胺基)-四氫呋喃-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺 於化合物9(10 mg，0.017 mmol)之無水吡啶(1 mL)溶液中添加二甲氧基三苯甲基氯(18 mg，0.053 mmol)，於室溫下攪拌1.5小時。其後，追加二甲氧基三苯甲基氯(18 mg，0.053 mmol)，於室溫下攪拌30分鐘。藉由薄層層析法確認原料消失後，於反應液中添加甲醇(1 mL)後，進行減壓濃縮。使殘渣溶解於乙酸乙酯，用水清洗，繼而用飽和食鹽水清洗。使有機層於無水硫酸鈉上乾燥，進行減壓濃縮後，藉由急速管柱層析法(中性矽膠、己烷/乙酸乙酯＝5：1～2 :1)對所獲得之殘渣進行純化，獲得作為白色固體之化合物10(15.2 mg，產率99%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 11.99 (1H, s), 10.11 (1H, s), 8.07 (1H, s), 7.81 (1H, s), 7.45 (2H, dd, J = 8.2, 2.0 Hz), 7.32 (4H, dd, J = 9.2, 3.6 Hz), 7.24 - 7.29 (3H, m), 7.01 (1H, d, J = 7.2 Hz), 6.76 (4H, J = 9.2, 3.6 Hz), 5.71 (1H, d, J = 4.2 Hz), 5.16 (1H, dd, J = 6.4, 4.2 Hz), 4.20 - 4.17 (1H, m), 3.76 (3H, s), 3.75 (3H, s), 3.56 (1H, dd, J = 11.2, 2.8 Hz), 3.22 (1H, dd, J = 11.2, 2.8 Hz), 1.82 (1H, d, J = 6.8 Hz), 0.97 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.68 (9H, s), 0.79 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.04 (3H, s), -0.06 (3H, s)13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 171.2, 158.7, 158.0, 157.6, 157.2, 156.8, 155.4, 147.6, 147.2, 144.8, 139.2, 135.9, 135.4, 130.0, 127.9, 127.1, 122.6, 120.0, 117.0, 114.1, 111.2, 90.1, 86.3, 81.7, 73.4, 62.4, 60.4, 55.2, 51.4, 36.1, 25.4, 18.4, 17.8, -5.0, -5.3 ESI-HRMS : calcd for C43 H52 F3 N6 O8 Si  865.36[M+H]+ , found : 865.35[M+H]+
步驟8 化合物11之合成 N-(9-((2R,3S,4S,5S)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-羥基-4-(2,2,2-三氟乙醯胺基)-四氫呋喃-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺 於化合物10(14 mg，0.016 mmol)之四氫呋喃(1 mL)溶液中添加氟化四丁基銨(1 M四氫呋喃溶液，19 μL，0.019 mmol)，於室溫下攪拌1小時。藉由薄層層析法確認原料消失後，對反應液進行減壓濃縮。藉由急速管柱層析法(中性矽膠、二氯甲烷/甲醇＝30：1～15：1)對所獲得之殘渣進行純化，獲得作為白色固體之化合物11(10.8 mg，產率83%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 12.12 (1H, br. s), 8.76 (1H, br. s), 7.74 (1H, s), 7.81 (1H, s), 7.68 (1H, d, J = 5.4 Hz), 7.48 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.37 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.34 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.25 - 7.21 (2H, m), 7.17 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.81 (2H, d, J = 9.2 Hz), 6.78 (2H, d, J = 9.2 Hz), 5.80 (1H, d, J = 4.0 Hz), 5.35 (1H, br. s), 5.08 (1H, dd, J = 12.4, 6.4 Hz), 4.30 - 4.29 (1H, m), 3.76 (3H, s), 3.74 (3H, s), 3.57 - 3.53 (1H, m), 3.29 - 3.26 (1H, m), 1.84 - 1.57 (1H, m), 0.94 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.68 (3H, d, J = 6.8 Hz)13 C NMR (100 MHz, CDCl3 ) δ 179.4, 158.6, 158.4, 158.0, 157.6, 157.3, 147.8, 147.2, 144.8, 139.4, 136.3, 135.7, 130.1, 129.9, 128.1, 128.0, 127.0, 121.0, 120.0, 117.1, 114.2, 111.3, 91.2, 86.1, 82.5, 71.5, 62.7, 55.1, 51.2, 35.9, 18.5, 18.2 ESI-HRMS : calcd for C37 H38 F3 N6 O8 751.27[M+H]+ , found : 751.27[M+H]+
步驟9 化合物12之合成 於化合物11(0.90 g，1.20 mmol)、三乙胺(0.42 mL，3.0 mmol)之乙腈(12 mL)溶液中添加琥珀酸酐(0.24 g，2.40 mmol)、二甲基胺基吡啶(29 mg，0.24 mmol)，於室溫下攪拌1小時。藉由薄層層析法確認原料消失後，對反應液進行減壓濃縮。使殘渣溶解於乙酸乙酯，用飽和碳酸氫鈉水溶液清洗2次，繼而用飽和食鹽水清洗。使有機層於無水硫酸鈉上乾燥，進行減壓濃縮。對於殘渣，利用二氯甲烷/甲醇溶液(1：1，v/v)進行減壓濃縮下之共沸操作，藉此獲得白色泡狀固體(以三乙基胺鹽計1.11 g，97%)。該化合物12直接用於下一反應。
化合物12亦可由下述起始原料13獲得中間體6後進行合成。 [化18]
Figure 02_image035
步驟10 化合物14之合成 N-(9-((2R,3R,5S)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-(羥基亞胺基)四氫呋喃-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺 於氬氣氛圍下，使化合物13(ChemGenes公司製造，5.0 g，6.5 mmol)溶解於脫水二氯甲烷(50 mL)，一面於冰浴中冷卻一面攪拌。一面使反應液冷卻一面添加碳酸氫鈉(8.2 g，97.3 mmol)、nor-AZADO(36 mg，0.260 mmol)，注意內溫上升且分批添加二乙酸碘苯(3.14 g，9.73 mmol)，一面升溫至室溫一面攪拌21小時10分鐘。確認原料消失後，將異丙醇(7.5 mL)添加至反應液中，攪拌4小時(過量氧化劑之驟冷)。將反應液添加至冰水中，進而添加氯仿進行分液，再次用氯仿對水層進行萃取。與有機層合二為一後，用水清洗1次，用飽和食鹽水清洗1次後，利用無水硫酸鈉進行脫水。過濾分離乾燥劑後，將濾液濃縮，藉此，獲得作為橙色固體之粗產物(9.01 g，包含一部分DMTr基去保護後之化合物)。 於氬氣氛圍下，將粗產物(9.01 g)溶解於脫水吡啶(40 mL)，一面於冰浴中冷卻一面進行攪拌。一面使反應液冷卻一面添加羥胺鹽酸鹽(4.06 g，58.7 mmol)，一面升溫至室溫一面攪拌17小時25分鐘。確認原料消失後，對於反應液，一面用氯仿(含有1%三乙胺)沖洗一面轉移至茄形燒瓶中，並進行濃縮。將殘渣添加至飽和碳酸氫鈉水中攪拌15分鐘後，用氯仿萃取2次。與有機層合二為一後，用飽和食鹽水清洗1次後，利用無水硫酸鈉進行脫水。過濾分離乾燥劑後，將濾液濃縮，藉此，獲得作為橙色泡狀物質之化合物14(4.13 g，非鏡像異構物混合物，2階段產率81%)。1 H NMR (400MHz, CDCl3 ) δ: 12.04 (1H, d, J = 23.3 Hz), 9.23 (1H, s), 8.49 (1H, s), 7.89 (1H, s), 7.79 (1H, s), 7.66-7.58 (2H, m), 7.49-7.39 (4H, m), 7.31-7.14 (5H, m), 6.81-6.76 (2H, m), 6.73-6.68 (2H, m), 5.92 (1H, dd, J = 8.0, 1.6 Hz), 5.83 (1H, d, J = 3.7 Hz), 5.64 (1H, d, J = 8.2 Hz), 5.54 (1H, dd, J = 3.9, 1.1 Hz), 5.01 (1H, t, J = 7.3 Hz), 3.80-3.73 (6H, m), 3.54-3.46 (2H, m), 1.28 (1H, m), 1.08 (1H, d, J = 6.9 Hz), 0.99 (1H, d, J = 6.9 Hz), 0.86-0.76 (9H, m), 0.47 (2H, m), 0.11 (1H, s), 0.02--0.02 (3H, m), -0.07 (2H, s)[非鏡像異構物混合物] ESI-HRMS : calcd for C41 H50 N6 O8 Si  781.97[M-H]- , found : 781.84[M-H]-
步驟11 由化合物14合成化合物6 使用步驟10中獲得之化合物14(3.80 g)，以與步驟3相同之方式獲得化合物6(2.12 g，4.41 mmol，產率91%)。 再者，關於化合物6之詳細資料，如步驟3所記載。
化合物15之合成 [化19]
Figure 02_image037
於化合物12(380 mg，0.50 mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(2.5 mL)溶液中，添加Native amino lcaa CPG(1000Å，ChemGenes公司)(84 μmol/g，1.20 g，0.10 mmol)，繼而添加HOBt(136 mg，1.01 mmol)、EDC-HCl(193 mg，1.01 mmol)之DMF(2.5 mL)溶液，於室溫下振盪。20小時後，去除反應液，用N,N-二甲基甲醯胺(5 mL、4次)清洗固相載體，繼而用二氯甲烷(5 mL、4次)清洗。固相載體上之未反應胺基利用10%乙酸酐/吡啶溶液(5 mL)進行封端(室溫、振盪16小時)。去除反應液，用吡啶(5 mL、1次)清洗固相載體，繼而用二氯甲烷(5 mL、4次)清洗後，於真空下使其乾燥，藉此獲得於固相載體擔載有化合物12之化合物15(1.20 g)。 化合物12於固相上之擔載量藉由以下所示之方法來算出。取規定量之所獲得之固相載體，藉由添加去保護試劑(3 w/v%三氯乙酸/二氯甲烷溶液)而產生4,4'-二甲氧基三苯甲基陽離子之顯色，藉由紫外可見吸光光度測定(石英槽、槽長：10 mm)對上述顯色進行測定。藉由Lambert-Beer式，根據504 nm下之吸光度與4,4'-二甲氧基三苯甲基陽離子之莫耳吸光係數(波長504 nm：76,000)算出化合物12於固相上之擔載量。即，於2 mL容量瓶中量取所獲得之固相載體(2.0 mg)，添加去保護試劑使總量為2 mL且進行倒置混合，將所獲得者作為測定樣品。使用3 w/v%三氯乙酸/二氯甲烷溶液進行空白樣品測定後，使用測定樣品進行測定。根據504 nm下之吸光度：0.377，算出擔載量：24.8 μmol/g。
化合物24之合成係按照下述流程進行。 [化20]
Figure 02_image039
步驟12 化合物17之合成 N-(9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺 於氬氣氛圍下，於10 L之四口燒瓶中依序添加市售之N6-苄腺苷(化合物16)(100 g，269 mmol，1.0 eq.)、丙酮(2.70 L)、二甲氧基丙烷(166 mL，1.35 mol，5.0 eq.)。於反應溶液中添加濃硫酸(1.44 mL，26.9 mmol，0.10 eq.)，於室溫下攪拌15小時。由於確認到原料殘存，故追加濃硫酸(1.44 mL，26.9 mmol，0.10 eq.)，攪拌24小時。由於確認到原料殘存，故添加濃硫酸(1.44 mL，26.9 mmol，0.10 eq.)，攪拌1小時30分鐘後，添加濃硫酸(2.87 mL，53.8 mmol，0.20 eq.)，攪拌4小時。 藉由LC/MS(Liquid chromatography-mass spectrometry，液相色譜-質譜聯用法)確認反應進行後，對反應液進行冰浴冷卻，以內溫成為3～5℃之方式花5分鐘滴加飽和碳酸氫鈉水溶液(400 mL)，使溶液為中性。於減壓下，將反應液濃縮，對殘渣添加蒸餾水(2.0 L)。利用氯仿(1.0 L)對溶液萃取3次，利用無水硫酸鈉對有機層進行脫水。過濾後，於減壓下蒸餾去除溶劑，獲得化合物17(222 g)。所獲得之化合物17不實施進一步之純化操作而用於下一步驟。
步驟13 化合物18之合成 ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基甲磺酸酯 於氬氣氛圍下，於2 L之四口燒瓶中添加步驟12中所獲得之化合物17(222 g)、吡啶(520 mL)，對反應液進行冰浴冷卻，以內溫成為4℃～9℃之方式花15分鐘滴加甲磺醯氯(25.0 mL，321 mmol，1.2 eq.)，攪拌2小時。 藉由LC/MS確認反應進行後，於反應液中添加蒸餾水(500 mL)，利用乙酸乙酯(1.0 L)對溶液萃取3次後，依序用1N鹽酸(1.0 L×1, 500 mL×2)、飽和碳酸氫鈉水溶液(500 mL×2)、飽和食鹽水(500 mL×2)清洗有機層，用無水硫酸鈉進行脫水。過濾後，於減壓下蒸餾去除溶劑，使所獲得之殘渣於甲苯中共沸，藉此獲得化合物18(150 g，含有17.6wt %甲苯)。所獲得之化合物18不實施進一步之純化操作而用於下一步驟。
步驟14 化合物19之合成 N-(9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(疊氮基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺 於氬氣氛圍下，於3 L之四口燒瓶中添加步驟13中所獲得之化合物18(150 g)及脫水DMF(1.26 L)。於反應液中添加疊氮化鈉(82.8 g，1.26 mol，5.0 eq.)，花30分鐘升溫至60℃，於60℃下攪拌3小時30分鐘。 藉由LC/MS確認反應進行後，使反應液緩冷至室溫，添加蒸餾水(1.0 L)及乙酸乙酯(600 mL)。於所獲得之溶液中添加蒸餾水(3.0 L)，利用乙酸乙酯(500 mL)對水層萃取6次。用蒸餾水(800 mL)清洗有機層2次，用飽和食鹽水(800 mL)清洗2次，用無水硫酸鈉進行脫水。過濾後，於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(SiO2 700 g，乙酸乙酯)對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得化合物19(55.7 g, 128 mmol，產率48%(3 steps from化合物16))。
步驟15 化合物20之合成 N-(9-((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-((2,2,2-三氟乙醯胺基)甲基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺 於氬氣氛圍下，於3 L之四口燒瓶中添加步驟14中所獲得之化合物19(55.7 g，128 mmol，1.0 eq.)、甲醇(1.28 L)。於反應液中添加10%Pd/C(76.8 g，21.2 mmol，0.17 eq.)，將反應液中進行氫氣置換，於室溫下攪拌16小時。 藉由LC/MS確認反應進行後，將反應液中進行氬氣置換，以矽藻土對反應液進行過濾。於將濾液減壓濃縮後，將所獲得之殘渣溶解於甲醇(985 mL)，轉移至3 L之四口燒瓶。對溶液進行冰浴冷卻，以內溫成為2～4℃之方式花15分鐘滴加1-(三氟乙醯基)咪唑(17.0 mL，149 mmol，1.2 eq.)，於4℃下攪拌2小時。藉由LC/MS確認反應進行後，將反應液減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法(SiO2 800 g，庚烷/乙酸乙酯＝1：4)對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得化合物20(21.4 g，42.2 mmol，產率33%)。
步驟16 化合物21之合成 N-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-((2,2,2-三氟乙醯胺基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺 於1 L之茄形燒瓶中添加步驟15中獲得之化合物20(10.0 g，19.8 mmol，10 eq.)、蒸餾水(50.0 mL)，對溶液進行冰浴冷卻。於冰浴冷卻下，花5分鐘滴加三氟乙酸(50.0 mL，640 mmol，32.4 eq.)，將反應液升溫至室溫，攪拌4小時30分鐘。 藉由LC/MS確認反應進行後，將反應液進行減壓濃縮，使殘渣於甲苯中共沸。對所獲得之殘渣添加異丙醚，使固體析出，過濾去除。使所獲得之固體於減壓、室溫下乾燥，獲得化合物21(8.86 g，19.0 mmol，產率96%)。
步驟17 化合物22之合成 N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-羥基-5-((2,2,2-三氟乙醯胺基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺 於氬氣氛圍下，於500 mL之茄形燒瓶中添加步驟16中獲得之化合物21(15.6 g，33.6 mmol，1.0 eq.)、脫水DMF(111 mL)，對溶液進行冰浴冷卻。於冰浴冷卻下，以內溫未達6℃之方式添加咪唑(9.16 g，134 mmol，4.0 eq.)、第三丁基二甲基氯矽烷(15.2 g，101 mmol，3.0 eq.)，於該溫度下攪拌30分鐘。 藉由LC/MS確認反應進行後，於反應液中添加冰水。用乙酸乙酯對水層萃取3次，用飽和食鹽水進行清洗，用無水硫酸鈉進行脫水。過濾後，於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(SiO2 800 g，氯仿/2-丁酮＝100：0～85：15)對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得化合物22與化合物23之混合物(10.9 g)。所獲得之化合物22與化合物23之混合物未實施進一步之純化操作而用於下一步驟。
步驟18 化合物24之合成 (2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-2-((2,2,2-三氟乙醯胺基)甲基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯 於氬氣氛圍下，於200 mL之茄形燒瓶中添加步驟17中獲得之化合物22與化合物23之混合物(1.19 g，2.05 mmol，化合物22：化合物23＝9：1)、脫水二氯甲烷(6.83 mL)，對溶液進行冰浴冷卻。於冰浴冷卻下，滴加二異丙基乙基胺(0.537 mL，3.07 mmol，1.5 eq.)、3-((氯(二異丙基胺基)膦基)氧基)丙腈(0.857 mL，3.07 mmol，1.5 eq.)之二氯甲烷混合溶液後，將反應液升溫至室溫，於室溫下攪拌2小時。 藉由TLC確認原料消失後，於反應液中添加蒸餾水，用氯仿(50 mL)萃取2次，用無水硫酸鈉對有機層進行脫水。過濾後，於減壓下蒸餾去除溶劑，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝50：50～30：70，含有0.5%三乙胺)對所獲得之殘渣進行複數次純化，藉此獲得作為淡黃色非晶狀物質之目標之化合物24(608 mg，0.779 mmol，產率38%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ: 9.82 (1H, d, J = 8.8 Hz), 9.07 (1H, s), 8.83-8.80 (1H, m), 8.06-8.01 (3H, m), 7.66-7.52 (3H, m), 5.86 (1H, d, J = 7.8 Hz), 4.88 (1H, dd, J = 7.8, 5.2 Hz), 4.50 (1H, br s), 4.39-4.29 (1H, m), 4.21-3.88 (3H, m), 3.74-3.63 (1H, m), 3.48-3.35 (1H, m), 2.73-2.66 (2H, m), 1.28-1.23 (12H, m), 1.08-1.04 (1H, m), 0.72-0.68 (9H, m), -0.17 (3H, s), -0.45 (3H, s).31 P NMR(CDCl3) δ: 149.95
作為多核苷酸之原料的化合物6a之合成按照下述流程進行合成。 [化21]
Figure 02_image041
步驟1 化合物2a之合成 N-(9-((3aR,5R,6R,6aS)-2,2-二-第三丁基-6-甲氧基四氫呋喃并[2,3-d][1,3,2]二氧雜噻咯(dioxasilol)-5-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺 於市售之化合物1a(30.0 g，78.0 mmol)之DMF(300 mL)溶液中，於冰浴冷卻下，慢慢地添加二第三丁基矽烷基雙(三氟甲磺酸酯)(68.6 g，156 mmol)。於冰浴冷卻下，攪拌1小時後，將反應液添加至飽和碳酸氫鈉水溶液中，並添加庚烷/乙酸乙酯之混合溶劑，萃取2次。用水清洗有機層2次，用飽和食鹽水清洗1次後，用無水硫酸鈉進行乾燥。過濾後，藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝7/3→3/7)對濃縮殘渣進行純化，獲得作為無色固體之化合物2a(38.7 g，73.7 mmol)(產率95%)。 ESI-MS：計算值：524.23[M-H]- ，實測值：524.5[M-H]- 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 9.32 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 8.03 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 7.60 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.51 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 6.01 (s, 1H), 4.66 (dd, J = 9.6, 5.0 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 8.9, 4.8 Hz, 1H), 4.31 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.20 (ddd, J = 10.1, 5.0, 5.0 Hz, 1H), 4.03 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 3.70 (s, 3H), 1.10 (s, 9H), 1.06 (s, 9H).
步驟2 化合物3a之合成 N-(9-((3aR,5R,6R,6aS)-2,2-二-第三丁基-6-甲氧基四氫呋喃并[2,3-d][1,3,2]二氧雜噻咯-5-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲醯胺 將化合物2a(10.0 g，19.0 mmol)溶解於二氯甲烷(50 mL)，添加溴化四丁基銨(9.20 g，28.5 mmol)、1 M氫氧化鈉水溶液(50 ml)。慢慢地滴加碘甲烷(4.76 ml，76.0 mmol)。其後，於室溫下攪拌1小時10分鐘。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之水/氯仿＝1/1，進行驟冷。用水清洗有機層2次後，用無水硫酸鈉進行脫水，過濾分離乾燥劑後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝90/10→50/50)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物3a(6.25 g，11.6 mmol)(產率61%)。 ESI-MS：計算值：540.26[M+H]+ ，實測值：540.4[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.56 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.49-7.46 (m, 2H), 7.34-7.29 (m, 1H), 7.21 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 5.94 (s, 1H), 4.61 (dd, J = 9.6, 5.0 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 9.2, 5.0 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.17 (ddd, J = 10.0, 5.2, 5.0 Hz, 1H), 4.00 (dd, J = 10.5, 9.2 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.67 (s, 3H), 1.08 (s, 9H), 1.05 (s, 9H).
步驟3 化合物4a之合成 N-(9-((2R,3R,4S,5S)-4,5-二羥基-3-甲氧基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲醯胺 將化合物3a(6.25 g，11.6 mmol)溶解於四氫呋喃(63 mL)，於冰浴中冷卻。添加三乙胺(8.07 ml，57.9 mmol)、三乙胺三氫氟酸鹽(1.89 ml，11.6 mmol)，一面於冰浴中冷卻一面攪拌1小時5分鐘。確認原料消失後，添加三乙胺(10 ml，76.0 mmol)進行驟冷，利用氯仿進行稀釋後，將反應液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝100/0→90/10)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物4a(4.25 g，10.6 mmol)(產率quant.)。 ESI-MS：計算值：400.16[M+H]+ ，實測值：400.3[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.56 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.50-7.48 (m, 2H), 7.35-7.31 (m, 1H), 7.22 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 5.87 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.86 (dd, J = 11.4, 2.3 Hz, 1H), 4.63 (dd, J = 7.3, 4.6 Hz, 1H), 4.57-4.56 (m, 1H), 4.36-4.34 (m, 1H), 3.99-3.94 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.77 (td, J = 12.3, 1.7 Hz, 1H), 3.31 (s, 3H), 2.77 (d, J = 1.4 Hz, 1H).
步驟4 化合物5a之合成 N-(9-((2R,3R,4S,5S)-5-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-4-羥基-3-甲氧基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲醯胺 將化合物4a(4.25 g，10.6 mmol)溶解於吡啶(43 mL)，於冰浴中進行攪拌。於反應液中添加4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(5.41 g，20.0 mmol)，於室溫下攪拌2小時25分鐘。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之碳酸氫鈉水中進行驟冷，利用乙酸乙酯進行萃取。用飽和食鹽水清洗有機層後，用無水硫酸鈉使其乾燥，過濾分離後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯(含有1%三乙胺)＝70/30→50/50)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物5a(5.35 g，7.62 mmol)(產率71%)。 ESI-MS：計算值：702.29[M+H]+ ，實測值：702.6[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.50 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.45-7.40 (m, 4H), 7.33-7.22 (m, 8H), 7.16 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 6.81 (dd, J = 8.9, 1.1 Hz, 4H), 6.15 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 11.9, 5.0 Hz, 1H), 4.35 (dd, J = 5.3, 3.9 Hz, 1H), 4.21-4.19 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.53 (s, 3H), 3.50 (dd, J = 10.8, 3.0 Hz, 1H), 3.40 (dd, J = 10.8, 4.4 Hz, 1H), 2.66 (d, J = 6.4 Hz, 1H).
步驟5 胺基酸酯6a之合成 (2S,3S,4R,5R)-2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-4-甲氧基-5-(6-(N-甲基苯甲醯胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯 將化合物5a(5.30 g，7.55 mmol)溶解於二氯甲烷(48 mL)，添加二異丙基乙基胺(2.64 mL，15.1 mmol)，於冰浴中冷卻。花5分鐘滴加溶解於二氯甲烷(5 mL)之2-氰基乙基二異丙基氯胺基磷酸酯(2.68 g，11.3 mmol)。其後，一面升溫至室溫一面攪拌1小時10分鐘。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之飽和碳酸氫鈉水中進行驟冷。添加乙酸乙酯進行萃取。用飽和食鹽水清洗有機層後，用無水硫酸鈉使其乾燥，過濾分離乾燥劑後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯(含有1%三乙胺)＝70/30→50/50)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之胺基酸酯6a(6.22 g，6.90 mmol)(產率91%)。 ESI-MS：計算值：902.40[M+H]+ ，實測值：902.5[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.47 (s, 0.35H), 8.47 (s, 0.65H), 8.14 (s, 0.35H), 8.09 (s, 0.65H), 7.44-7.39 (m, 4H), 7.33-7.21 (m, 8H), 7.16-7.12 (m, 2H), 6.93-6.78 (m, 4H), 6.12 (d, J = 5.5, 0.65H), 6.10 (d, J = 5.0, 0.35H), 4.66-4.53 (m, 2H), 4.41-4.38 (m, 0.35H), 4.34-4.32 (m, 0.65H), 3.97-3.78 (m, 10H), 3.70-3.44 (m, 7H), 3.36-3.30 (m, 1H), 2.64 (t, J = 6.2 Hz, 1.3H), 2.38 (t, J = 6.4 Hz, 0.70H), 1.22-1.17 (m, 8H), 1.06 (d, J = 6.9 Hz, 4H).31 P-NMR(CDCl3 , 162 MHz) δ: 150.70, 150.94.
作為多核苷酸之原料之化合物6b之合成按照下述流程進行合成。 [化22]
Figure 02_image043
步驟1 化合物2b之合成 N-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二-第三丁基-7-氟四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜噻咯啉(dioxasilin)-6-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺 於市售之化合物1b(30.0 g，80.4 mmol)之DMF(300 mL)溶液中，於冰浴冷卻下，慢慢地添加二第三丁基矽烷基雙(三氟甲磺酸酯)(70.8 g，161 mmol)。於冰浴冷卻下攪拌1小時後，將反應液添加至飽和碳酸氫鈉水溶液中，添加庚烷/乙酸乙酯之混合溶劑，萃取2次。用水清洗有機層2次，用飽和食鹽水清洗有機層1次後，用無水硫酸鈉進行乾燥。過濾後，以庚烷/乙酸乙酯＝9/1對濃縮殘渣進行漿料純化，獲得作為無色固體之化合物2b(38.7 g，75.4 mmol)(產率94%)。 ESI-MS：計算值：514.23[M+H]+ ，實測值：514.5[M+H]+ 1 H-NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ: 11.27 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.04 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.65 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.55 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 23 Hz, 1H), 5.71 (dd, J = 54.5, 4.1 Hz, 1H), 5.03 (m, 1H), 4.44 (q, J = 3.7 Hz, 1H), 4.09 (m, 2H), 1.11 (s, 9H), 1.02 (s, 9H).
步驟2 化合物3b之合成 N-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二-第三丁基-7-氟四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜噻咯啉-6-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲醯胺 將化合物2b(10.0 g，19.5 mmol)溶解於二氯甲烷(50 mL)中，添加溴化四丁基銨(9,41 g，29.2 mmol)、1 M氫氧化鈉水溶液(50 ml)。慢慢地滴加碘甲烷(1.83 ml，29.2 mmol)。其後，於室溫下攪拌1小時。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之水/氯仿＝1/1中進行驟冷。用水清洗有機層2次後，用無水硫酸鈉進行脫水，過濾分離乾燥劑後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝90/10→50/50)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物3b(6.86 g，12.8 mmol)(產率65%)。 ESI-MS：計算值：528.24[M+H]+ ，實測值：538.6[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.54 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.47 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.21 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 6.10 (d, J = 22.0 Hz, 1H), 5.46 (dd, J = 54.5, 4.1 Hz, 1H), 4.86 (ddd, J = 27.2, 9.8, 4.1 Hz, 1H), 4.47 (dd, J = 9.2, 5.0 Hz, 1H), 4.14 (m, 1H), 4.03 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 1.11 (s, 9H), 1.05 (s, 9H).
步驟3 化合物4b之合成 N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羥基-5-(羥甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲醯胺 將化合物3b(6.67 g，12.6 mmol)溶解於四氫呋喃(66 mL)，於冰浴中冷卻。添加三乙胺(8.81 ml，63.2 mmol)、三乙胺三氫氟酸鹽(2.05 ml，12.6 mmol)，一面於冰浴中冷卻一面攪拌1小時5分鐘。確認原料消失後，添加三乙胺(10.6 ml，76.0 mmol)進行驟冷，利用氯仿稀釋後，將反應液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝100/0→90/10)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物4b(4.98 g，12.9 mmol)(產率quant.)。 ESI-MS：計算值：388.14[M+H]+ ，實測值：388.4[M+H]+ 1 H-NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ: 8.70 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 7.30 (m, 5H), 6.31 (dd, J = 16.9, 2.3 Hz, 1H), 5.75 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.41 (m, 1H), 5.15 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.46 (m, 1H), 3.98 (m, 1H), 3.75 (dq, J = 12.4, 2.6 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.61 - 3.56 (m, 1H).
步驟4 化合物5b之合成 N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-氟-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲醯胺 將化合物4b(4.93 g，12.7 mmol)溶解於吡啶(49 mL)，於冰浴中攪拌。於反應液中添加4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(6.47 g，29.2 mmol)，於室溫下攪拌1小時20分鐘。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之碳酸氫鈉水中進行驟冷，利用乙酸乙酯進行萃取。用飽和食鹽水清洗有機層後，用無水硫酸鈉使其乾燥，過濾分離後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯(含有1%三乙胺)＝70/30→50/50)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物5b(8.34 g，12.1 mmol)(產率95%)。 ESI-MS：計算值：690.27[M+H]+ ，實測值：690.7[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.51 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.43 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 2H), 7.37 (dd, 8.2, 1.4 Hz, 2H), 7.28-7.20 (m, 8H), 7.12 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.7 Hz), 6.23 (dd, J = 17.1, 2.5 Hz, 1H), 5.58 (dq, J = 52.9, 2.3 Hz, 1H), 4.78 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.47 (ddd, J = 57.9, 10.6, 3.5 Hz, 2H), 2.44 (dd, J = 7.5, 2.5 Hz, 1H).
步驟5 胺基酸酯6b之合成 (2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-5-(6-(N-甲基苯甲醯胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯 將化合物5b(10.0 g，14.6 mmol)溶解於二氯甲烷(80 mL)，添加二異丙基乙基胺(5.08 mL，29.1 mmol)，於冰浴中冷卻。花5分鐘滴加溶解於二氯甲烷(15 mL)之2-氰基乙基二異丙基氯胺基磷酸酯(4.18 g，21.8 mmol)。其後，一面升溫至室溫一面攪拌1小時。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之飽和碳酸氫鈉水中進行驟冷。添加乙酸乙酯進行萃取。用飽和食鹽水清洗有機層後，用無水硫酸鈉使其乾燥，過濾分離乾燥劑後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯(含有1%三乙胺)＝70/30→50/50)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之胺基酸酯6b(12.1 g，13.6 mmol)(產率93%)。 ESI-MS：計算值：890.38[M+H]+ ，實測值：890.8[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.53 (s, 0.49H), 8.50 (s, 0.51H), 8.14 (s, 1H), 7.43-7.39 (m, 2H), 7.37-7.33 (m, 2H), 7.27-7.20 (m, 8H), 7.09-7.04 (m, 2H), 6.77 (t, J = 9.1 Hz, 4H), 6.28-6.19 (m, 1H), 5.74 (dq, J = 18.5, 2.2 Hz, 0.50H), 5.61 (dq, J = 19.2, 2.3 Hz, 0.50H), 5.10-5.00 (m, 0.47H), 4.94-4.85 (m, 0.53H), 4.31 (m, 1H), 3.97-3.82 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.63-3.53 (m, 4H), 3.31-3.27 (m, 1H), 2.59 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.41 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 1.20-1.15 (m, 9H), 1.04 (d, J = 6.4 Hz, 3H).31 P-NMR(CDCl3 , 162 MHz) δ: 151.97, 151.92, 151.19, 151.11.
作為多核苷酸之原料之化合物6c之合成按照下述流程進行合成。 [化23]
Figure 02_image045
步驟1 化合物3c之合成 N-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二-第三丁基-7-甲氧基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜噻咯啉-6-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-乙基苯甲醯胺 將化合物2a(11.7 g，22.3 mmol)溶解於二氯甲烷(58.5 mL)，添加溴化四丁基銨(10.8 g，33.4 mmol)、1 M氫氧化鈉水溶液(58.5 ml)。慢慢地滴加碘乙烷(10.8 ml，134 mmol)。其後，於室溫下攪拌2小時。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之水/氯仿＝1/1中進行驟冷。用水清洗有機層2次後，用無水硫酸鈉使其乾燥。過濾後，將濾液濃縮。藉由甲苯對濃縮殘渣進行漿料純化，再次將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝90/10→70/30)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物3c(6.14 g，11.1 mmol)(產率49%)。 ESI-MS：計算值：554.28[M+H]+ ，實測值：554.6[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.56 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.47-7.45 (m, 2H), 7.31-7.27 (m, 1H), 7.19 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 5.94 (s, 1H), 4.61 (dd, J = 9.6, 4.6 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 9.1, 5.0 Hz, 1H), 4.40 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 4.22 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.16 (ddd, J = 10.1, 4.9, 4.8 Hz, 1H), 4.00 (dd, J = 10.5, 9.6 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.09 (s, 9H), 1.05 (s, 9H).
步驟2 化合物4c之合成 N-乙基-N-(9-((2R,3R,4R,5R)-4-羥基-5-(羥甲基)-3-甲氧基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺 將化合物3c(6.14 g，11.1 mmol)溶解於四氫呋喃(61.4 mL)，於冰浴中冷卻。添加三乙胺(7.73 ml，55.4 mmol)、三乙胺三氫氟酸鹽(1.81 ml，11.1 mmol)，一面於冰浴中冷卻一面攪拌2小時。確認原料消失後，添加三乙胺(10 ml，76.0 mmol)進行驟冷，利用氯仿稀釋後，將反應液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇＝100/0→90/10)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物4c(4.60 g，11.1 mmol)(產率quant.)。 ESI-MS：計算值：414.18[M+H]+ ，實測值：414.3[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.56 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.50-7.46 (m, 2H), 7.32-7.28 (m, 1H), 7.20 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 5.89 (dd, J = 11.6, 2.1 Hz, 1H), 5.85 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 4.62 (dd, J = 7.3, 4.6 Hz, 1H), 4.57-4.56 (m, 1H), 4.45-4.39 (m, 2H), 4.36-4.34 (m, 1H), 3.96 (dt, J = 12.9, 1.9, 1H), 3.80-3.73 (m, 1H), 3.29 (s, 3H), 2.70 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 1.37 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
步驟3 化合物5c之合成 N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基-3-甲氧基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-乙基苯甲醯胺 將化合物4c(4.58 g，11.1 mmol)溶解於吡啶(46 mL)，於冰浴中攪拌。於反應液中添加4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(5.63 g，16.6 mmol)，於室溫下攪拌2小時。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之碳酸氫鈉水中進行驟冷，利用乙酸乙酯進行萃取。用飽和食鹽水清洗有機層後，用無水硫酸鈉進行乾燥。過濾分離後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯(含有1%三乙胺)＝70/30→50/50)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物5c(7.55 g，10.6 mmol)(產率95%)。 ESI-MS：計算值：716.31[M+H]+ ，實測值：716.2[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.51 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.43-7.40 (m, 4H), 7.32-7.22 (m, 8H), 7.13 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.81 (dd, J = 9.1, 1.4 Hz, 4H), 6.14 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.47 (dd, J = 5.7, 5.6 Hz, 1H), 4.41 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 4.34 (dd, J = 8.4, 4.1 Hz, 1H), 4.21-4.17 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.53 (s, 3H), 3.50 (dd, J = 10.5, 3.2 Hz, 1H), 3.39 (dd, J = 10.7, 4.3 Hz, 1H), 2.64 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
步驟4 胺基酸酯6c之合成 (2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(N-乙基苯甲醯胺基)-9H-嘌呤-9-基)-4-甲氧基四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯 將化合物5c(8.83 g，12.3 mmol)溶解於二氯甲烷(74 mL)，添加二異丙基乙基胺(4.31 mL，24.7 mmol)，於冰浴中冷卻。花9分鐘滴加溶解於脫水二氯甲烷(14 mL)之2-氰基乙基二異丙基氯胺基磷酸酯(4.40 g，18.6 mmol)。其後，一面升溫至室溫一面攪拌1小時。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之飽和碳酸氫鈉水中進行驟冷。添加乙酸乙酯進行萃取。用飽和食鹽水清洗有機層後，用無水硫酸鈉使其乾燥。過濾分離後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯(含有1%三乙胺)＝70/30→50/50)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之胺基酸酯6c(10.4 g，11.3 mmol)(產率92%)。 ESI-MS：計算值：916.42[M+H]+ ，實測值：917.3[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.49 (s, 0.37H), 8.48 (s, 0.63H), 8.11 (s, 0.34H), 8.05 (s, 0.66H), 7.43-7.38 (m, 4H), 7.32-7.21 (m, 8H), 7.11 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 6.80 (m, 4H), 6.10 (m, 1H), 4.64-4.52 (m, 2H), 4.43-4.32 (m, 3H), 3.94-3.83 (m, 1H), 3.79-3.78 (m, 6H), 3.67 -3.46 (m, 4H), 3.35-3.29 (m, 1H), 2.64 (t, J = 6.4 Hz, 1.3H), 2.37 (t, J = 6.4 Hz, 0.70H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.18 (m, 8H), 1.06 (d, J = 6.9 Hz, 4H).31 P-NMR(CDCl3 , 162 MHz) δ: 151.67, 150.92.
作為多核苷酸之原料之化合物6d之合成按照下述流程進行合成。 [化24]
Figure 02_image047
步驟1 化合物3d之合成 N-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二-第三丁基-7-氟四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧雜噻咯啉-6-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-乙基苯甲醯胺 將化合物2b(1.00 g，1.95 mmol)溶解於二氯甲烷(5.0 mL)，添加溴化四丁基銨(0.942 g，2.92 mmol)、1 M氫氧化鈉水溶液(5.0 ml)。慢慢地滴加碘甲烷(0.942 ml，11.7 mmol)。其後，於室溫下攪拌2小時。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之水/氯仿＝1/1中進行驟冷。用水清洗有機層2次後，用無水硫酸鈉進行脫水，過濾分離乾燥劑後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯＝80/20→70/30)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之化合物3d(629 mg，1.16 mmol)(產率60%)。 ESI-MS：計算值：542.26[M+H]+ ，實測值：542.6[M+H]+ 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.55 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.46 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.30 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.19 (t, J = 7.8 hz, 2H), 6.09 (d, J = 22.4 Hz, 1H), 5.45 (dd, J = 54.1, 3.9 Hz, 1H), 4.86 (ddd, J = 27.2, 9.8, 4.1 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 9.1, 5.0, 1H), 4.40 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.11 (s, 9H), 1.05 (s, 9H).
步驟2 化合物4d之合成 N-乙基-N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羥基-5-(羥甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺 以與獲得化合物4c之步驟相同之方式獲得化合物4d。 ESI-MS：計算值：401.40[M+H]+ ，實測值：402.1[M+H]+
步驟3 化合物5d之合成 N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-氟-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-乙基苯甲醯胺 以與獲得化合物5c之步驟相同之方式獲得化合物5d。 ESI-MS：計算值：738.25[M+Cl]- ，實測值：738.7[M+Cl]- 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.52 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.43-7.41 (m, 2H), 7.38-7.35 (m, 2H), 7.30-7.20 (m, 8H), 7.10 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 6.22 (dd, J = 17.4, 2.3 Hz, 1H), 5.58 (ddd, J = 53.0, 2.4, 1.2 Hz, 1H), 4.93-4.74 (m, 1H), 4.40 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.19-4.16 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.54 (dd, J = 11.0, 3.2 Hz, 1H), 3.40 (dd, J = 10.5, 3.1 Hz, 1H), 2.23 (dd, J = 6.9, 2.3 Hz, 1H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
步驟4 胺基酸酯6d之合成 (2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(N-乙基苯甲醯胺基)-9H-嘌呤-9-基)-4-氟四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯 將化合物5d(1.93 g，2.74 mmol)溶解於二氯甲烷(16 mL)，添加二異丙基乙基胺(0.958 mL，5.48 mmol)，於冰浴中冷卻。滴加溶解於脫水二氯甲烷(3.8 mL)之2-氰基乙基二異丙基氯胺基磷酸酯(970 mg，4.11 mmol)。其後，一面升溫至室溫一面攪拌1小時。確認原料消失後，將反應液添加至經冰浴冷卻之飽和碳酸氫鈉水中進行驟冷。添加乙酸乙酯進行萃取。用飽和食鹽水清洗有機層後，用無水硫酸鈉使其乾燥。過濾分離後，將濾液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(庚烷/乙酸乙酯(含有1%三乙胺)＝90/10→60/40)對濃縮殘渣進行純化，藉此獲得作為無色非晶質之胺基酸酯6d(2.29 g，2.53 mmol)(產率92%)。 ESI-MS：計算值：938.36[M+Cl]- ，實測值：938.7[M+Cl]- 1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ: 8.53 (s, 0.5H), 8.51 (s, 0.5H), 8.11 (s, 1H), 7.41-7.33 (m, 4H), 7.27-7.16 (m, 8H), 7.03 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 6.79-6.75 (m, 4H), 6.27-6.18 (m, 1H), 5.78-5.58 (m, 1H), 5.10-4.85 (m, 1H), 4.42-4.38 (m, 2H), 4.31-4.30 (m, 1H), 3.96-3.72 (m, 7H), 3.68-3.51 (m, 4H), 3.29-3.27 (m, 1H), 2.59 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.40 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 1.33-1.31 (m, 3H), 1.19-1.15 (m, 9H), 1.04 (d, J = 6.9 Hz, 3H).31 P-NMR(CDCl3 , 162 MHz) δ: 151.94, 151.89, 151.20, 151.11.
RNA寡核苷酸係使用2'-TOM(三異丙基矽烷氧基甲基)保護β-氰基乙基亞磷醯胺(DMT-2'-O-TOM-rA(Ac)、DMT-2'-O-TOM-rG(Ac)、DMT-2'-O-TOM-rC(Ac)、DMT-2'-O-TOM-rU)(分別由Glen Research公司或ChemGenes公司製造)，DNA寡核苷酸係使用β-氰基乙基亞磷醯胺(DMT-dA(Bz)、DMT-dG(iBu)、DMT-dC(Ac)、DMT-T)。各亞磷醯胺單體係製備0.05 mol/L乙腈溶液，使用0.2 μmol或0.8 μmol固相載體，藉由DNA/RNA固相合成裝置(NTS M-2-MX，NIHON TECHNO SERVICE公司)進行合成。 DNA寡核苷酸係使用CPG 1000Å(dA-CPG、dG-CPG、Ac-dC-CPG、dT-CPG)(Glen Research公司)作為固相載體，縮合時間設為2分鐘。 5'末端具有磷酸基之RNA(5'-單磷酸RNA)係使用Universal UnyLinker Support 2000Å(ChemGenes公司)作為固相載體，第1鹼基之縮合時間設為15分鐘，此後設為各3分鐘。5'末端之羥基之磷酸化係使用化學磷酸化試劑(0.05 mol/L乙腈溶液)(Glen Research公司或ChemGenes公司)進行。 3'-胺基鳥苷單體導入至3'末端之RNA寡核苷酸之固相合成係使用化合物15進行。第1鹼基之縮合時間設為15分鐘，此後設為各3分鐘。
關於固相合成裝置中使用之試劑，使用以下者。5'末端之羥基之二甲氧基三苯甲基之去除係藉由使用市售之去保護試劑(Deblocking Solution-1，3 w/v%三氯乙酸/二氯甲烷溶液)(和光純藥股份有限公司)進行10秒反應而進行。作為亞磷醯胺之活化劑，使用市售之活化劑溶液(活化劑溶液3)(和光純藥股份有限公司)。未反應之5'末端之羥基之封端係藉由使用市售之封端溶液(Cap A溶液-2及Cap B溶液-2)(和光純藥股份有限公司)進行10秒反應而進行。作為製造磷酸酯時之氧化劑，使用含有吡啶、THF、水及碘之溶液(氧化劑，0.01 M碘，29.2%水，6.3%吡啶，64.5%乙腈)(Honeywell公司)，進行10秒反應。於固相合成後，RNA寡核苷酸之5'末端之羥基之二甲氧基三苯甲基於固相載體上去保護。所合成之DNA及RNA寡核苷酸全部依照慣例進行脫樹脂、去保護(濃氨水，55℃，12小時)。DNA寡核苷酸係使用卡套柱(MicroPure II Column，LGC Biosearch Technology公司)，依照製品試驗方案進行純化。RNA寡核苷酸於利用離心蒸發器將藉由脫樹脂所獲得之溶液濃縮至完全乾固後，使用氟化四丁基銨(1 M四氫呋喃溶液)(1 mL)去除2'羥基之TOM保護基(於50℃下10分鐘，繼而於室溫下12小時；或於50℃下10分鐘，繼而於35℃下6小時)。於溶液中添加三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液(以下為Tris-HCl)(1 M，pH值7.4)(1 mL)並進行溶混後，藉由利用離心蒸發器進行濃縮而去除四氫呋喃。對於所獲得之溶液，使用藉由超純水進行平衡化之凝膠過濾管柱(NAP-25，GE Healthcare公司)，依照製品試驗方案進行處理。利用離心蒸發器將所獲得之包含RNA寡核苷酸之組分濃縮後，使用改性聚丙烯醯胺凝膠(以下為dPAGE)進行純化。
(使用dPAGE之RNA片段之純化) 於丙烯醯胺凝膠溶液(包含7 M脲作為改性劑)中添加過硫酸銨(以下為APS)之水溶液及N,N,N',N'-四甲基乙二胺(以下為TEMED)作為聚合劑，使其固形化(室溫、6～12小時)，藉此製作凝膠。RNA樣品係與凝膠上樣緩衝液(80%甲醯胺、TBE)混合，於90℃下加熱3分鐘後，上樣至凝膠。電泳後，RNA之帶藉由UV光照射(254 nm)而檢測出，使用剃刀之刃自凝膠切出。切出之凝膠片被微細地粉碎後，利用超純水自凝膠進行萃取(於室溫下振盪6～12小時)。RNA之萃取液使用Amicon Ultra 10K(Millipore公司)進行脫鹽、濃縮，進行乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉(pH值5.2)/70%乙醇)，藉此獲得RNA之顆粒。RNA顆粒利用80%乙醇進行沖洗後，於室溫下風乾1小時。使所獲得之RNA顆粒溶解於超純水中，稀釋至適當之濃度後，藉由紫外可見吸光光度測定(NanoDrop，Thermo scientific公司)測定260 nm之吸光度，根據各RNA序列之莫耳吸光係數決定濃度(使用以下數值作為各鹼基之莫耳吸光係數：A＝15300，G＝11800，C＝7400，T＝9300，U＝9900)。 純化之寡核苷酸之結構決定係藉由使用MALDI-TOF MS(Ultraflex III，Bruker Daltonics公司)(基質：3-羥基吡啶甲酸)之質譜法或使用改性聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析進行。
(使用dPAGE之化學連接反應之分析) 於化學連接反應之分析中，使用藉由超純水將反應液適當稀釋所得者作為樣品。稀釋之樣品係與凝膠上樣緩衝液(80%甲醯胺/TBE)混合，於90℃下加熱3分鐘後，上樣至凝膠。於電泳後，使用以超純水稀釋10,000倍後之SYBR(註冊商標)Green II Nucleic Acid Stain(Lonza公司)進行凝膠染色(室溫、15分鐘)，藉此檢測出RNA之帶(使用機器：ChemiDoc，BIORAD公司)。 化學連接反應之產率係藉由以利用dPAGE進行單離純化後之連結產物作為基準物質來比較RNA連結產物之帶強度而算出。
(使用dPAGE之化學連接產物之純化) 藉由化學連接反應所獲得之RNA連結產物自反應液藉由乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉(pH值5.2)/70%乙醇)以RNA顆粒之形式回收後，藉由dPAGE進行純化。
以下表示實施例1～4中使用之化合物(多核苷酸)之序列資訊。表1及2中之各核苷酸N表示RNA，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-F化修飾RNA，dN表示DNA。p表示3'或5'末端被磷酸化。標有下劃線之「AUG」表示起始密碼子，標有下劃線之「UGA」表示終止密碼子。序列中之斜線(/)表示多核苷酸彼此以該部分連結。 [表1]
實施例 編號 化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
實施例1 E1 GG(F)GAG(F)AAU(F)ACA(F)AGC(F)UAC(F)UUG(F)UUC(F)UUU(F)UUG(F)CAG(F)CCA(F)CC A(F)UG G(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG/A CGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)AC U(F)GA 1
E1-1 GG(F)GAG(F)AAU(F)ACA(F)AGC(F)UAC(F)UUG(F)UUC(F)UUU(F)UUG(F)CAG(F)CCA(F)CCA(F)UGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 2
E1-2 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GA 3
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
實施例2 E2 GG(F)GAG(F)AAU(F)ACA(F)AGC(F)UAC(F)UUG(F)UUC(F)UUU(F)UUG(F)CAG(F)CCA(F)CC A(F)UG G(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG/A CGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)AC U(F)GA A(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)A 5
E2-1 GG(F)GAG(F)AAU(F)ACA(F)AGC(F)UAC(F)UUG(F)UUC(F)UUU(F)UUG(F)CAG(F)CCA(F)CCA(F)UGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 6
E2-2 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)A 7
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
[表2]
實施例 編號 化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
實施例3 E3 GG(F)GAG(F)AAU(F)ACA(F)AGC(F)UAC(F)UUG(F)UUC(F)UUU(F)UUG(F)CAG(F)CCA(F)CC A(F)UG G(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG/A CGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)AC U(F)GA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 8
E3-1 GG(F)GAG(F)AAU(F)ACA(F)AGC(F)UAC(F)UUG(F)UUC(F)UUU(F)UUG(F)CAG(F)CCA(F)CCA(F)UGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 9
E3-2 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 10
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
實施例4 E4 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG G(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG/A CGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)AC U(M)G(M)A(M) 11
   E4-1 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 12
   E4-2 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 13
   模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
實施例1 製備3批藉由化學合成獲得之作為序列2之RNA片段E1-1(10 nmol)以及作為序列3之5'磷酸RNA片段E1-2(10 nmol)、模板DNA1(10 nmol)之超純水溶液(200 μL，核酸終濃度：50 μM)。於各製備溶液中添加T4 RNA連接酶2反應緩衝液(10X)(New England BioLabs公司製造)100 μL以及超純水440 μL，於90℃下加熱5分鐘後，歷經30分鐘以上恢復至室溫。於上述各溶液中以終濃度成為15%之方式添加60% PEG6000水溶液。於該溶液中添加T4 RNA連接酶2(New England BioLabs公司製造)(10 units/μL)(10 μL)並進行混合後，靜置於溫度經控制之加熱塊上(37℃、16小時)。於反應液中添加相同體積之氯仿，藉由漩渦混合器進行混合、離心分離後，採集上層，藉由乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉水溶液(pH值5.2)/70%乙醇)獲得RNA之顆粒。匯合各批次中獲得之RNA，利用7.5%改性聚丙烯醯胺凝膠進行純化，藉此獲得RNA連結產物E1(9.7 nmol，產率32%)。
實施例2 使用藉由化學合成獲得之作為序列6之RNA片段E2-1以及作為序列7之5'磷酸RNA片段E2-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物E2(10.9 nmol，產率36%)。
實施例3 使用藉由化學合成獲得之作為序列9之RNA片段E3-1以及作為序列10之5'磷酸RNA片段E3-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物E3(13.4 nmol，產率45%)。
實施例4 使用藉由化學合成獲得之作為序列12之RNA片段E4-1以及作為序列13之5'磷酸RNA片段E4-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物E4(6.8 nmol，產率34%)。
以下表示參考例1～18中使用之化合物(多核苷酸)之序列資訊。表3～8中之各核苷酸N表示RNA，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-F化修飾RNA，N(L)表示LNA，N(MOE)表示2'-O-甲氧基乙基修飾RNA，dN表示DNA。A(m6)表示鹼基部為N6-甲基腺嘌呤。P表示3'或5'末端被磷酸化，p(S)表示3'或5'末端被硫代磷酸酯化。NH2表示3'或5'末端之羥基被取代為胺基。-N/P-及-P/N-表示核苷酸之磷酸鍵被取代為磷醯胺鍵，-NHAc/S-表示核苷酸之磷酸鍵被取代為-NHC(O)-CH2-S-P(O)(OH)-O-。標有下劃線之「AUG」表示起始密碼子，標有下劃線之「UGA」表示終止密碼子。序列中之斜線(/)表示多核苷酸以該部分連結。 [表3]
參考例 編號 化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
參考例1 R1 AUUAUUAAGGAGAUAUAUCCG AUG AUUAUUGACUACAAGGACGACGAUGACAAAAUUAUUGACUACAAGG-N/P-A CGACGAUGACAAACUGCUGAUUAUUGACUACAAGGACGACGAUGACAAAAUUAUU 14
R1-1 AUUAUUAAGGAGAUAUAUCCGAUGAUUAUUGACUACAAGGACGACGAUGACAAAAUUAUUGACUACAAGG-NH2 15
R1-2 pACGACGAUGACAAACUGCUGAUUAUUGACUACAAGGACGACGAUGACAAAAUUAUU 16
模板 DNA2 dCdAdGdCdAdGdTdTdTdGdTdCdAdTdCdGdTdCdGdTdCdCdTdTdGdTdAdGdTdCdAdAdTdAdAdTdTdTdTdG 17
參考例2 R2 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG-N/P-A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 18
R2-1 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG-NH2 19
R2-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 20
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例3 R3 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAG-N/P-G ACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 21
R3-1 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAG-NH2 22
R3-2 pGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 23
模板 DNA3 dGdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdCdTdTdGdTdAdGdTdCdCdAdT 24
[表4]
參考例 編號 化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
參考例4 R4 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUG-N/P-C AGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG-N/P-A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGA CGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 25
R4-1 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUG-NH2 26
R4-2 pCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG-NH2 27
R4-3 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 28
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
模板 DNA4 dGdTdCdCdAdTdGdGdTdGdGdCdTdGdCdAdAdAdAdAdGdAdAdCdAdAdGdT 29
參考例5 R5 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG-NHAc/S-A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 30
R5-1 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG-NH2 31
R5-2 p(S)ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 32
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例6 R6 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 33
R6-1 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 34
R6-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 35
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
[表5]
參考例 編號 化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
參考例7 R7 G(F)G(F)G(F)A(F)G(F)A(F)A(F)U(F)A(F)C(F)A(F)A(F)G(F)C(F)U(F)A(F)C(F)U(F)U(F)G(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)U(F)U(F)U(F)G(F)C(F)A(F)GCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 36
R7-1 G(F)G(F)G(F)A(F)G(F)A(F)A(F)U(F)A(F)C(F)A(F)A(F)G(F)C(F)U(F)A(F)C(F)U(F)U(F)G(F)U(F)U(F)C(F)U(F)U(F)U(F)U(F)U(F)G(F)C(F)A(F)GCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 37
R7-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 38
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例8 R8 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)A(M)U(M)A(M)C(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)A(M)C(M)U(M)U(M)G(M)U(M)U(M)C(M)U(M)U(M)U(M)U(M)U(M)G(M)C(M)A(M)GCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 39
R8-1 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)A(M)U(M)A(M)C(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)A(M)C(M)U(M)U(M)G(M)U(M)U(M)C(M)U(M)U(M)U(M)U(M)U(M)G(M)C(M)A(M)GCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 40
R8-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 41
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例9 R9 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)A(F)C(M)A(F)A(M)G(F)C(M)U(F)A(M)C(F)U(M)U(F)G(M)U(F)U(M)C(F)U(M)U(F)U(M)U(F)U(M)G(F)C(M)A(F)GCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 42
R9-1 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)A(M)A(F)U(M)A(F)C(M)A(F)A(M)G(F)C(M)U(F)A(M)C(F)U(M)U(F)G(M)U(F)U(M)C(F)U(M)U(F)U(M)U(F)U(M)G(F)C(M)A(F)GCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 43
R9-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 44
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
[表6]
參考例 編號 化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
參考例10 R10 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)A(M)U(M)A(M)C(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)A(M)C(M)U(M)U(M)G(M)U(M)U(M)C(M)U(M)U(M)U(M)U(M)U(M)G(M)C(M)A(M)G(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)U(M)G(M) G(M)A(M)C(M)U(M)A(M)C(M)A(M)A(M)G(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)A(M)A(M)G(M)A(M)U(M)C(M)A(M)U(M)C(M)G(M)A(M)C(M)U(M)A(M)U(M)A(M)A(M)A(M)G/A CGA(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)U(M)A(M)A(M)A(M)G(M)G(M)U(M)G(M)G(M)C(M)G(M)A(M)C(M)U(M)A(M)U(M)A(M)A(M)G(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)A(M)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M) U(M)G(M)A(M) 45
R10-1 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)A(M)U(M)A(M)C(M)A(M)A(M)G(M)C(M)U(M)A(M)C(M)U(M)U(M)G(M)U(M)U(M)C(M)U(M)U(M)U(M)U(M)U(M)G(M)C(M)A(M)G(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)U(M)G(M)G(M)A(M)C(M)U(M)A(M)C(M)A(M)A(M)G(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)A(M)A(M)G(M)A(M)U(M)C(M)A(M)U(M)C(M)G(M)A(M)C(M)U(M)A(M)U(M)A(M)A(M)A(M)G 46
R10-2 pACGA(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)U(M)A(M)A(M)A(M)G(M)G(M)U(M)G(M)G(M)C(M)G(M)A(M)C(M)U(M)A(M)U(M)A(M)A(M)G(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)G(M)A(M)C(M)A(M)A(M)A(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)C(M)A(M)C(M)U(M)G(M)A(M) 47
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例11 R11 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(F)-P/N-A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 48
R11-1 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(F)-p 49
R11-2 NH2-ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACG ACAAACACCACCACCACCACCACUGA 50
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例12 R12 G(M)G(M)G(M)AGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC U(M)G(M)A(M) 51
R12-1 G(M)G(M)G(M)AGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 52
R12-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 53
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
[表7]
參考例 編號 化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
參考例13 R13 G(F)G(F)G(F)AGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC U(F)G(F)A(F) 54
R13-1 G(F)G(F)G(F)AGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 55
R13-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(F)G(F)A(F) 56
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例14 R14 G(L)G(L)G(L)AGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC U(L)G(L)A(L) 57
R14-1 G(L)G(L)G(L)AGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 58
R14-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(L)G(L)A(L) 59
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例15 R15 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC U(MOE)G(MOE)A(MOE) 60
R15-1 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 61
R15-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 62
模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
[表8]
參考例 編號 化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
參考例16 R16 GGGA(m6)GA(m6)A(m6)UA(m6)CA(m6)A(m6)GCUA(m6)CUUGUUCUUUUUGCA(m6)GCCA(m6)CC A(m6)UG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 63
   R16-1 GGGA(m6)GA(m6)A(m6)UA(m6)CA(m6)A(m6)GCUA(m6)CUUGUUCUUUUUGCA(m6)GCCA(m6)CCA(m6)UGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 64
   R16-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 65
   模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例17 R17 AUUAUUAAGGAGAUAUAUCCG AUG AUUAUUGACUACAAGG/A CGACGAUGACAAAAUUAUUGACUACAAGGACGACGAUGACAAA/C UGCUGAUUAUUGACUACAAGGACGACGAUGACAAAAUUAUU 66
   R17-1 AUUAUUAAGGAGAUAUAUCCGAUGAUUAUUGACUACAAGG 67
   R17-2 pACGACGAUGACAAAAUUAUUGACUACAAGGACGACGAUGACAAA 68
   R17-3 pCUGCUGAUUAUUGACUACAAGGACGACGAUGACAAAAUUAUU 69
   模板 DNA5 dGdTdCdAdTdCdGdTdCdGdTdCdCdTdTdGdTdAdGdTdC 70
模板 DNA6 dCdAdAdTdAdAdTdCdAdGdCdAdGdTdTdTdGdTdCdAdTdCdG 71
參考例18 R18 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACC AUG GACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG/A CGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCAC UGA 72
   R18-1 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 73
   R18-2 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 74
   模板 DNA1 dCdCdTdTdTdAdTdCdGdTdCdGdTdCdGdTdCdTdTdTdAdTdAdGdTdCdGdAdTdG 4
參考例1 將藉由化學合成獲得之作為序列15之3'-胺基RNA片段R1-1(200 μM)以及作為序列16之5'磷酸RNA片段R1-2(200 μM)、模板DNA2(200 μM)之超純水溶液於90℃下加熱3分鐘後，歷經30分鐘以上恢復至室溫。於該溶液中，添加相同體積之另外製備之縮合劑之緩衝溶液(1 M EDC-HCl/1 M HOBt之500 mM HEPES-NaOH(pH值8.5)，200 mM NaCl，200 mM MgCl2 )，並進行溶混，藉此開始連結反應。反應液(核酸濃度：100 μM，0.5M EDC-HCl/0.5M HOBt，250 mM HEPES-NaOH(pH值8.5)，100 mM NaCl，100 mM MgCl2 )靜置於溫度經控制之加熱塊(25℃)上一整夜。反應後，藉由乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉水溶液(pH值5.2)/70%乙醇)獲得RNA之顆粒。 利用7.5%改性聚丙烯醯胺凝膠對該RNA進行解析，算出反應產率(產率52%)。
參考例2 使用藉由化學合成獲得之R2-1、R2-2、模板DNA1，以與參考例1相同之方式算出RNA連結產物R2之生成產率(73%)。
參考例3 使用藉由化學合成獲得之R3-1(100 μM)、R3-2(100 μM)、模板DNA3(100 μM)，以與參考例1相同之方式獲得RNA連結產物R3(7.7 nmol，產率26%)。
參考例4 使用藉由化學合成獲得之R4-1(100 μM)、R4-2(100 μM)、R4-3(100 μM)、模板DNA1(100 μM)、模板DNA4(100 μM)，以與參考例1相同之方式獲得RNA連結產物R4(2.4 nmol，產率5.6%)。
參考例5 於藉由化學合成獲得之R5-1(100 μM)中添加磷酸緩衝液(50 mM)、MiliQ水，並添加碘乙酸NHS酯(5 mM)之DMF溶液，於30度下保溫2小時。繼而，藉由乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉水溶液(pH值5.2)/70%乙醇)獲得經碘乙醯基化之R5-1之顆粒。將藉由化學合成獲得之R5-2(50 μM)、模板DNA1(50 μM)、氯化鈉水溶液(100 mM)、磷酸緩衝液(20 mM，pH值7.5)進行溶混，於90℃下加熱3分鐘後，歷經30分鐘以上恢復至室溫。對該溶液添加上述經碘乙醯基化之R5-1(50 μM)，於30度下保溫6小時。反應後，藉由乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉水溶液(pH值5.2)/70%乙醇)獲得RNA之顆粒。利用7.5%改性聚丙烯醯胺凝膠對該RNA進行純化，藉此獲得RNA連結產物R5(2.32 nmol，產率7.3%)。
參考例6 使用藉由化學合成獲得之R6-1、R6-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物R6(11.1 nmol，產率37%)。
參考例7 使用藉由化學合成獲得之R7-1、R7-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物R7(3.1 nmol，產率10%)。
參考例8 使用藉由化學合成獲得之R8-1、R8-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物R8(2.6 nmol，產率9%)。
參考例9 使用藉由化學合成獲得之R9-1、R9-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物R9(5.9 nmol，產率20%)。
參考例10 使用藉由化學合成獲得之R10-1、R10-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物R10(2.1 nmol，產率9%)。
參考例11 將藉由化學合成獲得之作為序列49之RNA片段R11-1(200 μM)以及作為序列50之5'-胺基RNA片段R11-2(200 μM)、模板DNA1(200 μM)之超純水溶液於90℃下加熱3分鐘後，歷經30分鐘以上恢復至室溫。於該溶液中添加相同體積之另外製備之縮合劑之緩衝溶液(1 M EDC-HCl/1 M HOBt之500 mM HEPES-NaOH(pH值8.5)，200 mM NaCl，200 mM MgCl2 )，並進行溶混，藉此開始連結反應。使反應液(核酸濃度：100 μM，0.5M EDC-HCl/0.5M HOBt，250 mM HEPES-NaOH(pH值8.5)，100 mM NaCl，100 mM MgCl2 )靜置於溫度經控制之加熱塊(25℃)上(7小時)。反應後，藉由乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉水溶液(pH值5.2)/70%乙醇)獲得RNA之顆粒。利用7.5%改性聚丙烯醯胺凝膠對該NA進行純化，藉此獲得RNA連結產物R11(1.2 nmol，產率15%)。
參考例12 將藉由化學合成獲得之R12-1(10 μM)、R12-2(10 μM)、模板DNA1(10 μM)之1x T4 DNA連接酶緩衝溶液(66 mM Tris-HCl(pH值7.6)，6.6 mM MgCl2 ，10 mM DTT，0.1 mM ATP)(塔卡拉生物)(計2.1 mL)於90℃下加熱5分鐘後，緩冷至室溫。於該溶液中以終濃度成為15%之方式添加60%PEG6000。於該溶液中添加T4 DNA連接酶(塔卡拉生物)(350 units/μL)(135 μL)並進行混合後，靜置於溫度經控制之加熱塊上(25℃、16小時)。於反應液中添加相同體積之氯仿，利用漩渦混合器進行混合、離心分離後，取上層，藉由乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉水溶液(pH值5.2)/70%乙醇)獲得RNA之顆粒。利用7.5%改性聚丙烯醯胺凝膠對該RNA進行純化，藉此獲得RNA連結產物R12(1.4 nmol，產率27%)。
參考例13 使用藉由化學合成獲得之R13-1、R13-2、模板DNA1，以與參考例12相同之方式獲得RNA連結產物R13(1.3 nmol，產率26%)。
參考例14 使用藉由化學合成獲得之R14-1、R14-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物R14(9.4 nmol，產率31%)。
參考例15 使用藉由化學合成獲得之R15-1、R15-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物R15(8.6 nmol，產率29%)。
參考例16 使用藉由化學合成獲得之R16-1(10 μM)、R16-2(10 μM)、模板DNA1(10 μM)，以與參考例12相同之方式獲得RNA連結產物R16(1.1 nmol，產率37%)。
參考例17 將藉由化學合成獲得之R17-1(50 μM)、R17-2(50 μM)、模板DNA5(100 μM)之1x T4 DNA連接酶緩衝溶液(66 mM Tris-HCl(pH值7.6)，6.6 mM MgCl2 ，10 mM DTT，0.1 mM ATP)(塔卡拉生物)(計2.1 mL)於90℃下加熱5分鐘後，緩冷至室溫。於該溶液中以終濃度成為10%之方式添加50%PEG6000。於該溶液中添加T4 DNA連接酶(塔卡拉生物)(350 units/μL)(135 μL)並進行混合後，靜置於溫度經控制之加熱塊上(25℃、16小時)。於反應液中添加相同體積之氯仿，利用漩渦混合器進行混合、離心分離後，取上層，藉由乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉水溶液(pH值5.2)/70%乙醇)獲得RNA之顆粒。利用7.5%改性聚丙烯醯胺凝膠對該RNA進行純化，藉此獲得RNA連結產物L84(P-O)(30 nmol，產率22%)。 將L84(P-O)(50 μM，20 μL)、R17-3(160 μM，12.5 μL)、模板DNA6(160 μM，12.5 μL)之1x T4 DNA連接酶緩衝溶液(66 mM Tris-HCl(pH值7.6)，6.6 mM MgCl2 ，10 mM DTT，0.1 mM ATP)(塔卡拉生物)(計80 μL)於90℃下加熱5分鐘後，緩冷至室溫。於該溶液中以終濃度成為10%之方式添加50%PEG6000。於該溶液中添加T4 DNA連接酶(塔卡拉生物)(350 units/μL)(5 μL)並進行混合後，靜置於溫度經控制之加熱塊上(25℃、16小時)。於反應液中添加相同體積之氯仿，利用漩渦混合器進行混合、離心分離後，取上層，藉由乙醇沈澱(0.3 M乙酸鈉水溶液(pH值5.2)/70%乙醇)獲得RNA之顆粒。利用7.5%改性聚丙烯醯胺凝膠對該RNA進行純化，藉此獲得RNA連結產物R17(360 pmol，產率36%)。
參考例18 使用藉由化學合成獲得之R18-1、R18-2、模板DNA1，以與實施例1相同之方式獲得RNA連結產物R18(11.9 nmol，產率40%)。
試驗例1 (mRNA樣品之轉譯反應) 轉譯反應係使用市售之轉譯套組依照製品試驗方案進行。原核細胞系中之轉譯反應係以化合物R1及化合物R17作為受質RNA，使用PURExpress(註冊商標)(New England BioLabs公司)作為試劑來進行。 真核細胞系中之轉譯反應係以化合物R2及化合物R18作為受質RNA，使用Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated(以下稱為RRL)(Promega公司)作為試劑來進行。
(轉譯反應中之樣品之製備) 依照各套組之推薦試驗方案進行製備。將包含受質RNA以外之材料之反應液作為轉譯反應液。對於包含利用離心蒸發器乾固後之RNA樣品的管，添加轉譯反應液並進行混合後，置於適當溫度之加熱塊上，藉此開始轉譯反應。轉譯產物係藉由使用抗FLAG抗體之西方墨點法進行檢測。使用抗FLAG抗體(anti FLAG antibody)(F1804，Sigma公司)作為一次抗體，使用抗小鼠IgG抗體(anti-mouse IgG-HRP)(A9044，Sigma公司)作為二次抗體。
(原核細胞系中之轉譯反應) 將PURExpress(註冊商標)套組中包含之Solution A(2 μL)、Solution B(1.5 μL)、RNase抑制劑(Murine RNase Inhibitor，New England BioLabs)(0.1 μL)、超純水(1.4 μL)混合物作為轉譯反應液。將該溶液添加至包含RNA樣品之管中進行混合，藉此進行轉譯反應(37℃，2小時)。
(真核細胞系中之轉譯反應) 將兔網狀紅血球裂解物系統套組中包含之兔網狀紅血球裂解物(14.0 μL)、Amino Acid Mixture - Met(0.20 μL)、Amino Acid Mixture - Leu(0.20 μL)、Murine RNase Inhibitor(New England BioLabs)(0.4 μL)、超純水(5.2 μL) 混合物作為轉譯反應液。將該溶液添加至包含RNA樣品之管中進行混合，藉此進行轉譯反應(30℃，2小時)。
(轉譯產物之SDS-PAGE分析) 於SDS-PAGE中使用不連續緩衝液系。以下表示所使用之凝膠之組成。上層使用5%聚丙烯醯胺(丙烯醯胺：雙丙烯醯胺＝29：1)(0.125 M Tris-HCl(pH值6.8)，0.1%SDS)作為濃縮凝膠區域(約1.5 cm)，下層使用15%聚丙烯醯胺(丙烯醯胺：雙丙烯醯胺＝29：1)(0.375 M Tris-HCl(pH值8.8)，0.1%SDS)作為分離凝膠區域，添加APS之水溶液及TEMED作為聚合劑，使其固形化(室溫、30分鐘)，藉此製作凝膠。將轉譯反應之反應液與2x SDS-PAGE用上樣緩衝液(125 mM Tris-HCl(pH值6.8)、30(v/v)%甘油、4%十二烷基硫酸鈉(以下稱為SDS)、0.03%溴酚藍(以下稱為BPB))進行混合後，於90℃下加熱3分鐘，將所獲得者作為SDS-PAGE分析用樣品。SDS-PAGE分析用樣品直接用SDS-PAGE凝膠進行泳動(作為泳動用緩衝液，使用25 mM Tris、192 mM Glycine、0.1% SDS)。
(藉由西方墨點法檢測轉譯產物) 於電泳後，凝膠上之轉譯產物藉由半乾法轉錄至西方墨點法用膜片(Immobilon(註冊商標)-P)(IPVH00010，Millipore公司)(膜片使用以甲醇進行親水化作為預處理後浸漬於墨點緩衝液(25 mM Tris，192 mM Glycine，20% MeOH)中所得者)。於轉錄中使用恆定電流條件(通電時間：1小時)，根據膜片尺寸決定所使用之電流值。即，以成為膜片面積(cm2 )×2之方式設定電流值(mA)。 以下操作中使用之5%ECL Prime之TBS-T溶液係藉由將Amersham ECL Prime(GE Healthcare)與TBS-T(0.05M Tris-HCl(pH值7.4)，150 mM NaCl，0.05% tween20)混合而製備。轉錄了轉譯產物之膜片於進行了阻斷處理(5% ECL Prime之TBS-T溶液、室溫、振盪1小時)後，進行一次抗體處理(4,000倍稀釋、0.5% ECL Prime之TBS-T溶液、4℃、振盪12小時)、清洗(TBS-T、振盪5分鐘×5次)、二次抗體處理(50,000倍稀釋、0.5% ECL Prime之TBS-T溶液、室溫、振盪1小時)、清洗(TBS-T、5分鐘×5)。於抗體處理後，膜片上之轉譯產物使用化學發光試劑(SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Scientific公司)，依照製品推薦之試驗方案進行檢測。於利用化學發光試劑進行處理後，使用ChemiDoc(BIORAD公司)檢測轉譯產物之訊號(檢測模式：化學發光、曝光時間：90-300秒)。將結果示於圖4及圖5。
根據以上述化合物R1及化合物R17作為受質之使用PURExpress(註冊商標)進行之轉譯反應產物之西方墨點解析結果、以及以化合物R2及化合物R18作為受質之使用RRL進行之轉譯反應產物之西方墨點解析，可知自包含非天然型連結部之化合物R1及化合物R2之轉譯產物量與自天然型化合物R17及化合物R18之轉譯產物量於原核生物系以及真核生物系中毫不遜色。
試驗例2 (真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗) 關於實施例1～3及參考例6～10、14、15、18中所獲得之各化合物，使用兔網狀紅血球裂解物系統核酸酶處理套組(Promega公司製造，目錄編號L4960)，評估於真核細胞系中之轉譯活性。首先，將以各化合物之終濃度成為0.3 μM之方式利用THE RNA storage solution(Thermo Fisher Scientific公司，目錄編號AM7001)稀釋後之各mRNA樣品於96孔PCR培養板(AS ONE公司製造)中逐一分注2 μL。繼而，將每一次反應為7.0 μL之經過核酸酶之網狀紅血球裂解物、每一次反應為0.1 μL之Amino Acid Mixture Minus Leucine、每一次反應為0.1 μL之Amino Acid Mixture Minus Methionine、每一次反應為0.4 μL之Murine RNase Inhibitor(New England Biolabs公司製造，目錄編號M0314)及每一次反應為0.4 μL之純化水進行混合，製備預混料，於添加了mRNA樣品之PCR培養板中逐一分注8 μL，添加並混合後，於37℃下靜置1小時，藉此進行轉譯反應。 轉譯反應後之反應溶液中之轉譯產物藉由以下所記載之夾心ELISA法進行檢測。首先，將6*His, His-Tag抗體(Proteintech公司，目錄編號66005-1-Ig)利用0.1 M碳酸鹽緩衝液(pH值9.4)稀釋至3 μg/mL，以50 μL/孔分注至96孔ELISA用培養板(NUNC公司製造)，於4℃下靜置一晩，藉此製作進行了抗體之固定化之培養板。繼而，利用以純化水稀釋至1倍濃度之Tris Buffered Saline with Tween 20(Santa Cruz公司，目錄編號sc-24953)(以下記載為清洗溶液)清洗培養板後，以200 μL/孔分注將牛血清白蛋白(和光純藥公司，目錄編號017-22231)以終濃度成為3%之方式稀釋後之清洗溶液(以下記載為封閉溶液)，於室溫下靜置1小時。用清洗溶液清洗培養板後，以50 μL/孔分注利用封閉溶液稀釋100倍之轉譯反應溶液，於室溫下靜置1小時。此時，將轉譯產物多肽標準品(Scrum公司製造)同樣利用封閉溶液稀釋至各濃度並分注至培養板中。用清洗溶液清洗培養板後，以50 μL/孔分注利用封閉溶液稀釋至10,000倍之Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase (HRP) Ab produced in mouse(SIGMA公司製造，目錄抗體A8592-1MG)，於室溫下靜置1小時。用清洗溶液清洗培養板後，以50 μL/孔分注1-Step Ultra TMB-ELISA(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號34028)，於室溫下靜置數分鐘。其後，以50 μL/孔分注0.5 M硫酸(和光純藥工業公司製造)，使反應停止後，使用吸光光度計(Bio-Rad公司製造)，測得測定波長450 nm、參照波長570 nm之吸光度。將使用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(μM)、及不具有糖部修飾之R18設為1時之相對轉譯產物量記載於表9～11。
[表9] 由各化合物獲得之轉譯產物之濃度及相對轉譯產物量
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(μM) 相對轉譯產物量
E1 1 2.83 0.83
R10 45 0.03 0.01
R18 72 3.41 1
[表10] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度及相對轉譯產物量
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(μM) 相對轉譯產物量
E2 5 16.53 3.22
E3 8 12.37 2.41
R6 33 9.63 1.88
R14 57 12.31 2.40
R15 60 25.45 4.96
R18 72 5.13 1
[表11] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度及相對轉譯產物量
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(μM) 相對轉譯產物量
R7 36 10.45 2.94
R8 39 6.79 1.91
R9 42 7.87 2.21
R18 72 3.56 1
由表9～11可知，各化合物於添加至兔紅血球裂解物後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之多肽。
(使用mRNA樣品之Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗) 關於實施例1～4及參考例6、10、14、15、18中獲得之各化合物，使用1-Step Human Coupled IVT Kit(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號88882)評估於人類細胞系中之轉譯活性。首先，將以各化合物之終濃度成為0.3 μM之方式利用THE RNA storage solution(Thermo Fisher Scientific公司，目錄編號AM7001)稀釋後之各化合物於96孔PCR培養板(AS ONE公司製造)中逐一分注1 μL。繼而，將每一次反應為5.0 μL之Hela Lysate、每一次反應為1.0 μL之Accessory Proteins、每一次反應為2.0 μL之Reaction Mix、每一次反應為0.2 μL之Murine RNase Inhibitor(New England Biolabs公司製造，目錄編號M0314)及每一次反應為0.8 μL之純化水進行混合，製備預混料，於添加了mRNA樣品之PCR培養板中逐一分注9 μL，添加並混合後，於37℃下靜置45分鐘，藉此進行轉譯反應。 轉譯反應後之反應溶液中之轉譯產物藉由試驗例2(真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法，將轉譯反應溶液利用封閉溶液稀釋20倍後添加至培養板中，除此以外，藉由完全相同之方法實施。將測定結果記載於表12～14，該測定結果係利用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(μM)、及不具有糖部修飾之化合物R18設為1時之相對轉譯產物量。
[表12] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度及相對轉譯產物量
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(μM) 相對轉譯產物量
E1 1 0.066 0.60
R10 45 0.008 0.07
R18 72 0.111 1
[表13] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度及相對轉譯產物量
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(μM) 相對轉譯產物量
E2 5 1.532 3.35
E3 8 1.809 3.96
R6 33 1.413 3.09
R14 57 0.231 0.50
R15 60 2.777 6.07
R18 72 0.457 1
[表14] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度及相對轉譯產物量
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(μM) 相對轉譯產物量
E4 11 2.37 3.82
R18 72 0.62 1
由表12～14可知，各化合物於添加至Hela細胞裂解物後，藉由人類細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之多肽。
(使用mRNA樣品之Hela細胞株之體外轉譯反應試驗) 關於實施例2、3及參考例6、15中獲得之各化合物，使用Hela細胞株評估體外轉譯活性。首先，將含有10%胎牛血清之RPMI培養基(Nacalai Tesque公司製造)中懸浮之Hela細胞以每一孔之細胞數成為10,000 cells/100 μL之方式接種至96孔接著細胞用培養板中，於37℃、5%CO2 條件下培養一晩。自培養一晩後之細胞去除培養上清液，以40 μL/孔添加含有10%胎牛血清之RPMI培養基後，以各化合物之終濃度成為0.3 μM之方式將各化合物與Lipofectamin MessengerMAX Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：LMRNA008)利用OptiMem(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：31985-070)稀釋後混合，將混合液以10 μL/孔添加至各培養板，於37℃、5%CO2 條件下培養6小時。自培養6小時後之細胞去除培養上清液，利用經冰浴冷卻之D-PBS(-)(Nacalai Tesque公司製造)清洗1次後，以20 μL/孔添加含有2%之蛋白酶抑制劑混合物(動物細胞萃取物用)之NP-40(Invitrogen公司，FNN0021)，充分浸透5分鐘使細胞溶解。 所獲得之細胞溶解液中之轉譯產物藉由試驗例2(真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法，將細胞溶解液利用封閉溶液稀釋10倍後添加至培養板中，除此以外，藉由完全相同之方法實施。將測定結果記載於表15，該測定結果係利用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)、及不具有糖部修飾之化合物R6設為1時之相對轉譯產物量。
[表15] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度及相對轉譯產物量
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E2 5 25.86 2.94
E3 8 20.59 2.34
R6 33 8.79 1
R15 60 29.30 3.33
由表15可知，各化合物於添加至Hela細胞後，產生被基因序列編碼之多肽。
試驗例3 (各化合物之利用I型磷酸二酯酶進行之穩定性試驗) 使用實施例1及參考例10、18中製作之各化合物(RNA溶液)，藉由以下方法評估對於I型磷酸二酯酶(SVPD)之穩定性。添加MQ水10 μL、5 μM RNA溶液4 μL、5x反應緩衝液(Tris-HCl pH值8.0 0.1 M，NaCl 0.5M，MgCl2 0.075 M)4 μL、5.5 U/μL之SVPD(warthington，目錄編號3926)4 μL，於37℃下保溫。反應開始後，於15、30、60分鐘之時刻每次取樣6 μL。 (利用PAGE進行之RNA分解評估) 應用取樣於5%dPAGE(5%丙烯醯胺，7 M脲，小凝膠，8 cm×8 cm)上之全部量之檢體，於300 V之恆定電壓下泳動18 min。以SYBR Green II進行染色，並進行拍攝及定量。以相對於酶未反應(0分鐘)之相對殘存量算出各試樣中之各化合物之殘存量，記載於表16。
[表16] 各反應時間點之相對於酶未反應(0分鐘)之各化合物之相對殘存量
化合物名 序列編號 0分鐘 15分鐘 30分鐘 60分鐘
E1 1 1 0.18 0.04 0.00
R10 45 1 0.55 0.44 0.35
R18 72 1 0.03 0.00 0.0
由表16可知，具有糖部修飾之化合物與不具有糖部修飾之化合物R18相比，對於I型磷酸二酯酶之耐受性提高。
試驗例4 (mRNA樣品之利用I型磷酸二酯酶進行之穩定性試驗) 關於實施例1～4及參考例6、14、15、18中獲得之各化合物，使用I型磷酸二酯酶(warthington，目錄編號3926)來評估酶穩定性。首先，利用SVPD儲備溶液(110 mM Tris-HCl(NIPPON GENE，目錄編號314-90401)、110 mM NaCl(Ambion，目錄編號AM9759)、15 mM MgCl2 (Nacalai Tesque，目錄編號20942-34))將I型磷酸二酯酶製備成終濃度為55 U/mL，將其進而利用5×SVPD反應緩衝液(100 mM Tris-HCl(Ambion，目錄編號AM9855G)、500 mM NaCl、75 mM MgCl2 )稀釋10倍而製備5.5 U/mL SVPD酶溶液。各化合物以終濃度成為5 μM之方式利用THE RNA storage solution(Thermo Fisher Scientific公司，目錄編號AM7001)進行稀釋。 於96孔PCR培養板中依序添加蒸餾水30 μL、5 μM mRNA 12 μL、5×SVPD反應緩衝液12 μL，製作酶反應預混溶液。於另一96孔PCR培養板中分注酶反應預混溶液9 μL，添加SVPD溶液1 μL與25mM EDTA(Ambion，目錄編號AM9260G)2.5 μL之混合溶液3.5 μL，並於-30℃下保存，用於酶未反應(0 min)之情形。於又一96孔PCR培養板中分注酶反應預混溶液40.5 μL，添加5.5 U/mL SVPD酶溶液4.5 μL，充分混合，用於酶反應之情形。將其分注至4個新的96孔PCR培養板中各10 μL，各培養板於37℃下反應規定之時間(15 min、30 min、60 min)後，添加25 mM EDTA 2.5 μL，於測定之前保存於-30℃。 酶反應後之反應溶液中之殘存mRNA量係藉由以下所記載之RT-qPCR法來檢測。首先，關於校準曲線，使用化合物E4，藉由THE RNA storage solution自4 μM稀釋4倍後，取11點濃度，製作稀釋系列。校準曲線及酶反應後之樣品2.5 μL係使用含有終濃度為0.2 U/mL之核糖核酸酶抑制劑(塔卡拉生物，目錄編號2311B)之蒸餾水稀釋1071倍。使用該稀釋後之試樣5 μL及2 μM RT引子(Sigma-Aldrich公司)2 μL，藉由iScript Select cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD，目錄編號1708897)來製作逆轉錄產物cDNA。實施時，關於反應溫度，為25℃ 5 min→42℃ 30 min→85℃ 5 min。將cDNA 2 μL、TaqMan Gene Expression Master Mix 10 μL、Fw引子(Sigma-Aldrich公司)0.28 μL、Rv引子(Sigma-Aldrich公司)0.33 μL、TaqMan MGB探針(Thermo Fisher Scientific公司，目錄編號4316033)0.38 μL及蒸餾水7.01 μL進行混合，進行qPCR測定。機器使用Quantstudio12K Flex(Applied Biosystems)。又，所使用之引子及Taqman MGB探針之DNA序列如下。將測定結果記載於表17，該測定結果係基於標準品之CT值，使用校準曲線，對各試樣中之各化合物之濃度進行定量，以相對於酶未反應(0分鐘)之相對殘存量所算出。 RT引子：5'-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG-3'  (序列編號75) Fw引子：5'-ATCTTGTCGTCGTCGTCCTT-3'     (序列編號76) Rv引子：5'-GAATACAAGCTACTTGTTCTTTT-3'   (序列編號77) Taqman MGB探針：5'-CAGCCACCATG-3'      (序列編號78)
[表17] 各反應時間點之相對於酶未反應(0分鐘)之各化合物之相對殘存量
化合物名 序列編號 0分鐘 15分鐘 30分鐘 60分鐘
E1 1 1 0.329 0.091 0.010
E2 5 1 0.542 0.277 0.101
E3 8 1 0.517 0.273 0.040
E4 11 1 0.475 0.134 0.016
R6 33 1 0.341 0.161 0.009
R14 57 1 0.474 0.207 0.018
R15 60 1 0.399 0.123 0.010
R18 72 1 0.239 0.045 0.002
由表17可知，具有糖部修飾之E1、E4、R14及R15與不具有糖部修飾之化合物R18相比，對於I型磷酸二酯酶之耐受性提高。 同樣，具有糖部修飾之E2及E3與不具有糖部修飾之化合物R6相比，對於I型磷酸二酯酶之耐受性提高。
試驗例5 (真核細胞系中之轉譯反應) 關於參考例3～5、11～13、16、18中獲得之各化合物(RNA)，藉由以下方法評估於真核細胞系中之轉譯反應。將Rabbit-Reticulocyte-Lysate-System_-Nuclease-Treated(Promega L4960)中所含之溶液、RNase inhibitor Murine(New England Biolab，M0314S)及RNA按照以下組成進行混合。RRL 7.0 μL，1 mM AA-Leu 0.1 μL，1 mM AA-Met 0.1 μL，Rnase Inhibitor 0.4 μL，RNA 5μM 2.0 μL，MQ 0.4 μL。將該溶液於37℃下保溫1小時。分取保溫後之溶液5 μL，利用封閉緩衝液(3%BSA/TBST)495 μL稀釋100倍。將稀釋轉譯液100 μL用於ELISA。
(藉由夾心ELISA進行之轉譯產物之檢測) 於96孔培養板中添加100 μL/孔之Anti-Histag溶液(Proteintech公司，目錄編號66005-1-Ig)(3 μg/mL in 0.1 M碳酸鹽緩衝液 pH值9.4)。用封口膜覆蓋，於4℃下保溫12小時。去除培養板內之溶液，以200 μL/孔之TBST清洗3次。添加200 μL/孔之封閉緩衝液(3%BSA/TBST)，於室溫下保溫1小時。去除培養板內之溶液，以200 μL/孔之TBST清洗3次。以100 μL/孔添加轉譯反應溶液，於室溫下保溫1小時。去除培養板內之轉譯反應溶液，以200 μL/孔之TBST清洗3次。添加100 μL/孔之Anti-Flag溶液(Cell Signaling Tecnorogy公司，目錄編號2368)(1:1000 in bloking buffer)。用封口膜覆蓋以不會發生乾燥濃縮，於4℃下保溫一整夜。去除培養板內之溶液，以200 μL/孔之TBST清洗3次。添加100 μL/孔之Anti-rabbit IgG HRP溶液(Sigma-Aldrich公司)(1:10000 in bloking buffer)，於室溫下保溫1小時。去除培養板內之溶液，以200 μL/孔之TBST清洗4次。添加100 μL/孔之TMB substrate溶液，於室溫下保溫5分鐘。於添加了TBM subustrate溶液之孔中添加100 μL/孔之2 M H2 SO4 溶液。使用讀板儀(Mithras LB940(Berthold))測定450 nm之吸光度，評估轉譯效率。將測定結果記載於表18～20，該測定結果係利用基於多肽標準品之吸光度所製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(μM)、及將不具有糖部修飾之R18設為1時之相對轉譯產物量。
[表18] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(μM) 相對轉譯產物量
R3 21 4.14 1.18
R4 25 2.65 0.75
R5 30 4.01 1.14
R11 48 2.24 0.64
R18 72 3.52 1
[表19] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(μM) 相對轉譯產物量
R12 51 7.63 2.17
R13 54 7.90 2.25
R18 72 3.52 1
[表20] mRNA轉譯產物之濃度
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(μM) 相對轉譯產物量
R16 63 8.97 3.29
R18 72 2.73 1
由表18～20可知，各化合物於添加至兔紅血球裂解物後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之多肽。
以下表示實施例化合物(多核苷酸)之序列資訊。 以下表中之各核苷酸N(大寫字母)表示RNA，各核苷酸n(小寫字母)表示DNA，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-F化修飾RNA，N(L)表示LNA，N(MOE)表示2'-O-甲氧基乙基修飾RNA。Am6表示鹼基部為N6-甲基腺嘌呤，Ae6表示鹼基部為N6-乙基腺嘌呤。p表示3'或5'末端經磷酸化。^表示連接糖部間之磷酸基為硫代磷酸酯。N(B)表示包含下述所示之糖部之2',4'-BNANC (Me)。 [化25]
Figure 02_image049
BDBD表示具有以下結構之人工懸端。 [化26]
Figure 02_image051
[表21]
化合物名 合成法 序列(5'⇒3') 序列 編號
E5 與實施例1相同 GGGAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGCCAUUAAUAGUGACUCUGAGUGUCCCCUGUCCCACGACGGGUACUGCCUCCACGACGGUGUGUGCAUGUAUAUUGAAGCAUUGGACAAGUACGCCUGCAACUGUGUUGUUGGCUACAUCGGGGAGCGCUGUCAGUACCGAGACCUGAAGUGGUGGGAACUGCGCCU 79
E5-1 固相合成 GGGAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGAC 80
E5-2 固相合成 pAAAGCCAUUAAUAGUGACUCUGAGUGUCCCCUGUCCCACGACGGGUACUGCCUCCACGACGGUGUGUGCAUGUAUAUUGAAGCAU 81
E5-3 固相合成 pUGGACAAGUACGCCUGCAACUGUGUUGUUGGCUACAUCGGGGAGCGCUGUCAGUACCGAGACCUGAAGUGGUGGGAACUGCGCCU 82
E6 與實施例1相同 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAAGUAUAAUAAACUUUGAAAAACUGCACCACCACCACCACCACUGA 83
E6-1 固相合成 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACG 84
E6-2 固相合成 pAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAAGUAUAAUAAACUUUGAAAAACUGCACCACCACCACCACCACUGA 85
E7 與參考例1相同 GG(F)GAG(F)AAU(F)ACA(F)AGC(F)UAC(F)UUG(F)UUC(F)UUU(F)UUG(F)CAG(F)CCA(F)CCA(F)UGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(amino)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GA 86
E7-1 固相合成 GG(F)GAG(F)AAU(F)ACA(F)AGC(F)UAC(F)UUG(F)UUC(F)UUU(F)UUG(F)CAG(F)CCA(F)CCA(F)UGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(amino) 87
E7-2 固相合成 pACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GA 88
E8 與參考例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(amino)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GA 89
E8-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(amino) 90
E8-2 固相合成 pACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GA 91
[表22]
E9 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAC(M)ACC(M)ACC(M)ACC(M)ACC(M)ACC(M)ACU(M)G(M)A(M) 92
E9-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 93
E9-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAC(M)ACC(M)ACC(M)ACC(M)ACC(M)ACC(M)ACU(M)G(M)A(M) 94
E10 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUA(M)AAGACGACGACGAUA(M)AAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACA(M)AACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 95
E10-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUA(M)AAG 96
E10-2 固相合成 pACGACGACGAUA(M)AAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACA(M)AACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M)  97
E11 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAG(M)GACGACGACGACAAG(M)AUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAG(M)GACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 98
E11-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAG(M)GACGACGACGACAAG(M)AUCAUCGACUAUAAAG 99
E11-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAG(M)GACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M)  100
E12 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAU(M)AAAGACGACGACGAU(M)AAAGGU(M)GGCGACUAU(M)AAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 101
E12-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAU(M)AAAG 102
E12-2 固相合成 pACGACGACGAU(M)AAAGGU(M)GGCGACUAU(M)AAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 103
E13 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGAC(M)UACAAGGAC(M)GAC(M)GAC(M)GAC(M)AAGAUCAUCGAC(M)UAUAAAGACGAC(M)GAC(M)GAUAAAGGUGGCGAC(M)UAUAAGGAC(M)GAC(M)GAC(M)GAC(M)AAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 104
E13-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGAC(M)UACAAGGAC(M)GAC(M)GAC(M)GAC(M)AAGAUCAUCGAC(M)UAUAAAG 105
E13-2 固相合成 pACGAC(M)GAC(M)GAUAAAGGUGGCGAC(M)UAUAAGGAC(M)GAC(M)GAC(M)GAC(M)AAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 106
[表23]
E14 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAU(M)AAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 107
E14-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 108
E14-2 固相合成 pACGACGACGAU(M)AAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 109
E15 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACUACAAGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAGAUCAUCG(F)ACUAUAAAGACGACG(F)ACG(F)AUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACUAUAAGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 110
E15-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACUACAAGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAGAUCAUCG(F)ACUAUAAAG 111
E15-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACUAUAAGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 112
E16 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 113
E16-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 114
E16-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 115
E17 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACA(F)AGGACGACGACGACA(F)AGA(F)UCA(F)UCGACUAUA(F)AAGACGACGACGAUA(F)AAGGUGGCGACUAUA(F)AGGACGACGACGACA(F)AACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 116
E17-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACA(F)AGGACGACGACGACA(F)AGA(F)UCA(F)UCGACUAUA(F)AAG 117
E17-2 固相合成 pACGACGACGAUA(F)AAGGUGGCGACUAUA(F)AGGACGACGACGACA(F)AACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 118
E18 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACU(F)ACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACU(F)AUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACU(F)AUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 119
E18-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACU(F)ACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACU(F)AUAAAG 120
E18-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACU(F)AUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 121
[表24]
E19 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACUACAAGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAGAUCAUCG(F)ACUAUAAAGACGACG(F)ACGAUAAAGGUGGCG(F)ACUAUAAGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 122
E19-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACUACAAGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAGAUCAUCG(F)ACUAUAAAG 123
E19-2 固相合成 pACGACG(F)ACGAUAAAGGUGGCG(F)ACUAUAAGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 124
E20 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGAC(F)UAC(F)AAG(F)GAC(F)GAC(F)GAC(F)GAC(F)AAG(F)AUC(F)AUC(F)GAC(F)UAU(F)AAA(F)GACGAC(F)GAC(F)GAU(F)AAA(F)GGU(F)GGC(F)GAC(F)UAU(F)AAG(F)GAC(F)GAC(F)GAC(F)GAC(F)AAA(F)CAC(F)CAC(F)CAC(F)CAC(F)CAC(F)CAC(F)U(M)G(M)A(M) 125
E20-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGAC(F)UAC(F)AAG(F)GAC(F)GAC(F)GAC(F)GAC(F)AAG(F)AUC(F)AUC(F)GAC(F)UAU(F)AAA(F)G 126
E20-2 固相合成 pACGAC(F)GAC(F)GAU(F)AAA(F)GGU(F)GGC(F)GAC(F)UAU(F)AAG(F)GAC(F)GAC(F)GAC(F)GAC(F)AAA(F)CAC(F)CAC(F)CAC(F)CAC(F)CAC(F)CAC(F)U(M)G(M)A(M) 127
E21 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)AC(F)U(F)AC(F)A(F)AG(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)A(F)AG(F)A(F)UC(F)A(F)UC(F)G(F)AC(F)U(F)AU(F)A(F)AA(F)GACGAC(F)G(F)AC(F)G(F)AU(F)A(F)AA(F)G(F)GU(F)G(F)GC(F)G(F)AC(F)U(F)AU(F)A(F)AG(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)A(F)AA(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)U(M)G(M)A(M) 128
E21-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)AC(F)U(F)AC(F)A(F)AG(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)A(F)AG(F)A(F)UC(F)A(F)UC(F)G(F)AC(F)U(F)AU(F)A(F)AA(F)G 129
E21-2 固相合成 pACGAC(F)G(F)AC(F)G(F)AU(F)A(F)AA(F)G(F)GU(F)G(F)GC(F)G(F)AC(F)U(F)AU(F)A(F)AG(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)A(F)AA(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)C(F)AC(F)U(M)G(M)A(M) 130
E22 與實施例1相同 GGGA(M)GA(M)A(M)UA(M)CA(M)A(M)GCUA(M)CUUGUUCUUUUUGCA(M)GCCA(M)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 131
E22-1 固相合成 GGGA(M)GA(M)A(M)UA(M)CA(M)A(M)GCUA(M)CUUGUUCUUUUUGCA(M)GCCA(M)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 132
E22-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 133
[表25]
E23 與實施例1相同 GGGA(F)GA(F)A(F)UA(F)CA(F)A(F)GCUA(F)CUUGUUCUUUUUGCA(F)GCCA(F)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 134
E23-1 固相合成 GGGA(F)GA(F)A(F)UA(F)CA(F)A(F)GCUA(F)CUUGUUCUUUUUGCA(F)GCCA(F)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 135
E23-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 136
E24 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(F)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 137
E24-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 138
E24-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(F)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 139
E25 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(F)GAC(F)GACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 140
E25-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 141
E25-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(F)GAC(F)GACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 142
E26 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 143
E26-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 144
E26-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 145
E27 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACG(M)ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 146
E27-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 147
E27-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACG(M)ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 148
[表26]
E28 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(M)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 149
E28-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 150
E28-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(M)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 151
E29 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACG(M)ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 152
E29-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 153
E29-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(M)GAC(M)GACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 154
E30 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGgACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 155
E30-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 156
E30-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGgACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 157
E31 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAcGAcGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 158
E31-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 159
E31-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAcGAcGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 160
E32 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(L)ACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 161
E32-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 162
E32-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(L)ACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 163
[表27]
E33 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(L)ACG(L)ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 164
E33-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 165
E33-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(L)ACG(L)ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 166
E34 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(L)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 167
E34-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 168
E34-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(L)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 169
E35 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(L)GAC(L)GACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 170
E35-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 171
E35-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(L)GAC(L)GACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 172
E36 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGA(M)CGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 173
E36-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 174
E36-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGA(M)CGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 175
E37 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGA(F)CGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 176
E37-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 177
E37-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGA(F)CGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 178
[表28]
E38 與參考例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino)ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(F)ACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 179
E38-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino) 180
E38-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(F)ACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 181
E39 與參考例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino)ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(F)ACG(F)ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 182
E39-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino) 183
E39-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(F)ACG(F)ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 184
E40 與參考例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino)ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(F)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 185
E40-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino) 186
E40-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(F)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 187
E41 與參考例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino)ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(F)GAC(F)GACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 188
E41-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino) 189
E41-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(F)GAC(F)GACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 190
E42 與參考例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino)ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 191
E42-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino) 192
E42-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 193
[表29]
E43 與參考例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino)ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACG(M)ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 194
E43-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino) 195
E43-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACG(M)ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 196
E44 與參考例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino)ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(M)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 197
E44-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino) 198
E44-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(M)GACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 199
E45 與參考例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino)ACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(M)GAC(M)GACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 200
E45-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG(amino) 201
E45-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGAC(M)GAC(M)GACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 202
E46 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 203
E46-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 204
E46-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 205
[表30]
E47 與實施例1相同 G(L)G(L)G(L)A(L)G(L)A(L)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(L)G(L)A(L) 206
E47-1 固相合成 G(L)G(L)G(L)A(L)G(L)A(L)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 207
E47-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(L)G(L)A(L) 208
E48 與實施例1相同 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 209
E48-1 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 210
E48-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 211
E49 與實施例1相同 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 212
E49-1 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 213
E49-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 214
[表31]
E50 與實施例1相同 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AA(MOE)A(MOE)A(MOE) 215
E50-1 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 216
E50-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AA(MOE)A(MOE)A(MOE) 217
E51 與實施例1相同 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE)A(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AA(MOE)A(MOE)A(MOE) 218
E51-1 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 219
E51-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE)A(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AA(MOE)A(MOE)A(MOE) 220
E52 與實施例1相同 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AA(MOE)^A(MOE)^A(MOE) 221
E52-1 固相合成 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 222
E52-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)GAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AA(MOE)^A(MOE)^A(MOE) 223
[表32]
E53 與實施例1相同 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)^G(MOE)^A(MOE)A(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AA(MOE)^A(MOE)^A(MOE) 224
E53-1 固相合成 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 225
E53-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)^G(MOE)^A(MOE)A(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AAA(F)AA(MOE)^A(MOE)^A(MOE) 226
E54 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 227
E54-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 228
E54-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 229
E55 與實施例1相同 GGGAm6(M)GAm6(M)Am6(M)UAm6(M)CAm6(M)Am6(M)GCUAm6(M)CUUGUUCUUUUUGCAm6(M)GCCAm6(M)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 230
E55-1 固相合成 GGGAm6(M)GAm6(M)Am6(M)UAm6(M)CAm6(M)Am6(M)GCUAm6(M)CUUGUUCUUUUUGCAm6(M)GCCAm6(M)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 231
E55-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 232
E56 與實施例1相同 GGGAm6(F)GAm6(F)Am6(F)UAm6(F)CAm6(F)Am6(F)GCUAm6(F)CUUGUUCUUUUUGCAm6(F)GCCAm6(F)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 233
E56-1 固相合成 GGGAm6(F)GAm6(F)Am6(F)UAm6(F)CAm6(F)Am6(F)GCUAm6(F)CUUGUUCUUUUUGCAm6(F)GCCAm6(F)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 234
E56-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 235
[表33]
E57 與實施例1相同 GGGAe6(M)GAe6(M)Ae6(M)UAe6(M)CAe6(M)Ae6(M)GCUAe6(M)CUUGUUCUUUUUGCAe6(M)GCCAe6(M)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 236
E57-1 固相合成 GGGAe6(M)GAe6(M)Ae6(M)UAe6(M)CAe6(M)Ae6(M)GCUAe6(M)CUUGUUCUUUUUGCAe6(M)GCCAe6(M)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 237
E57-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 238
E58 與實施例1相同 GGGAe6(F)GAe6(F)Ae6(F)UAe6(F)CAe6(F)Ae6(F)GCUAe6(F)CUUGUUCUUUUUGCAe6(F)GCCAe6(F)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 239
E58-1 固相合成 GGGAe6(F)GAe6(F)Ae6(F)UAe6(F)CAe6(F)Ae6(F)GCUAe6(F)CUUGUUCUUUUUGCAe6(F)GCCAe6(F)CCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 240
E58-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 241
E59 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)Am6(M)G(M)Am6(M)Am6(M)UAm6(M)CAm6(M)Am6(M)GCUAm6(M)CUUGUUCUUUUUGCAm6(M)GCCAm6(M)CCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 242
E59-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)Am6(M)G(M)Am6(M)Am6(M)UAm6(M)CAm6(M)Am6(M)GCUAm6(M)CUUGUUCUUUUUGCAm6(M)GCCAm6(M)CCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 243
E59-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 244
E60 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)Am6(F)G(M)Am6(F)Am6(F)UAm6(F)CAm6(F)Am6(F)GCUAm6(F)CUUGUUCUUUUUGCAm6(F)GCCAm6(F)CCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 245
E60-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)Am6(F)G(M)Am6(F)Am6(F)UAm6(F)CAm6(F)Am6(F)GCUAm6(F)CUUGUUCUUUUUGCAm6(F)GCCAm6(F)CCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 246
E60-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 247
[表34]
E61 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)UGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 248
E61-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 249
E61-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)UGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 250
E62 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 251
E62-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 252
E62-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 253
E63 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCC(F)CCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 254
E63-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 255
E63-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCC(F)CCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 256
E64 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCCCCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 257
E64-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 258
E64-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCCCCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 259
[表35]
E65 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCA(F)CCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 260
E65-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 261
E65-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCA(F)CCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 262
E66 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCACCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 263
E66-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 264
E66-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCACCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 265
E67 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)CCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 266
E67-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 267
E67-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)CCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 268
E68 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGCCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 269
E68-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 270
E68-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGCCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 271
[表36]
E69 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCC(F)AGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 272
E69-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 273
E69-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCC(F)AGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 274
E70 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCCAGGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 275
E70-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 276
E70-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCCAGGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 277
E71 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCU(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 278
E71-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 279
E71-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCU(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 280
E72 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCUGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 281
E72-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 282
E72-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCUGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 283
[表37]
E73 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCA(F)GAG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 284
E73-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 285
E73-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCA(F)GAG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 286
E74 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCAGAGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 287
E74-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 288
E74-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCAGAGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 289
E75 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCU(F)GGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 290
E75-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 291
E75-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCU(F)GGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 292
E76 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCUGGGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 293
E76-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 294
E76-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCUGGGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 295
[表38]
E77 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 296
E77-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 297
E77-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 298
E78 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 299
E78-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 300
E78-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 301
E79 固相合成 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCCACCACCACCACCACCACUGA 302
E80 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCCACCACCACCACCACCACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 303
E81 固相合成 G(F)^G(M)^G(F)^A(M)^G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCCACCACCACCACCACCACU(M)^G(F)^A(M) 304
E82 固相合成 GGGAGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACUGA 305
E83 固相合成 GGGAGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCCACCACCACCACCACCACUGA 306
E84 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 307
E85 固相合成 G(F)^G(M)^G(F)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)^G(F)^A(M) 308
[表39]
E86 與實施例1相同 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 309
E86-1 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 310
E86-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 311
E87 與實施例1相同 G(F)G(F)G(F)A(F)G(F)A(F)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)G(F)A(F) 312
E87-1 固相合成 G(F)G(F)G(F)A(F)G(F)A(F)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 313
E87-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(F)G(F)A(F) 314
E88 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AG(M)G(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AG(M)A(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AG(M)G(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 315
E88-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AG(M)G(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AG(M)A(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 316
E88-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AG(M)G(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 317
E89 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACA(F)AG(M)GACGACGACGACA(F)AG(M)AUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUA(F)AG(M)GACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 318
E89-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACA(F)AG(M)GACGACGACGACA(F)AG(M)AUCAUCGACUAUAAAG 319
E89-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUA(F)AG(M)GACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 320
[表40]
E90 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACA(F)AGGACGACGACGACA(F)AGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUA(F)AGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 321
E90-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACA(F)AGGACGACGACGACA(F)AGAUCAUCGACUAUAAAG 322
E90-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUA(F)AGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 323
E91 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)AC(M)UACAAGGACGACGACG(F)AC(M)AAGAUCAUCG(F)AC(M)UAUAAAGACGACG(F)AC(M)GAUAAAGGUGGCG(F)AC(M)UAUAAGGACGACGACG(F)AC(M)AAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 324
E91-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)AC(M)UACAAGGACGACGACG(F)AC(M)AAGAUCAUCG(F)AC(M)UAUAAAG 325
E91-2 固相合成 pACGACG(F)AC(M)GAUAAAGGUGGCG(F)AC(M)UAUAAGGACGACGACG(F)AC(M)AAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 326
E92 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACU(F)AU(M)AAAGACGACGACG(F)AU(M)AAAG(F)GU(M)GGCGACU(F)AU(M)AAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 327
E92-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACU(F)AU(M)AAAG 328
E92-2 固相合成 pACGACGACG(F)AU(M)AAAG(F)GU(M)GGCGACU(F)AU(M)AAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 329
E93 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACU(F)AU(M)AAAGACGACGACGAUAAAG(F)GU(M)GGCGACU(F)AU(M)AAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 330
E93-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACU(F)AU(M)AAAG 331
E93-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAG(F)GU(M)GGCGACU(F)AU(M)AAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 332
E94 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(M)ACUACAAGGACGACGACG(M)ACAAGAUCAUCG(M)ACUAUAAAGACGACG(M)ACGAUAAAGGUGGCG(M)ACUAUAAGGACGACGACG(M)ACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 333
E94-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(M)ACUACAAGGACGACGACG(M)ACAAGAUCAUCG(M)ACUAUAAAG 334
E94-2 固相合成 pACGACG(M)ACGAUAAAGGUGGCG(M)ACUAUAAGGACGACGACG(M)ACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 335
[表41]
E95 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGG(M)ACG(M)ACG(M)ACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACG(M)ACG(M)ACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 336
E95-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGG(M)ACG(M)ACG(M)ACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 337
E95-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(M)ACG(M)ACG(M)ACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 338
E96 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(L)ACUACAAGGACGACGACG(L)ACAAGAUCAUCG(L)ACUAUAAAGACGACG(L)ACGAUAAAGGUGGCG(L)ACUAUAAGGACGACGACG(L)ACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 339
E96-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(L)ACUACAAGGACGACGACG(L)ACAAGAUCAUCG(L)ACUAUAAAG 340
E96-2 固相合成 pACGACG(L)ACGAUAAAGGUGGCG(L)ACUAUAAGGACGACGACG(L)ACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 341
E97 與實施例1相同 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(F)A(M) 342
E97-1 固相合成 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 343
E97-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(F)A(M)  344
E98 與實施例1相同 G(F)^G(M)^G(F)^A(M)^G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)^G(F)^A(M) 345
E98-1 固相合成 G(F)^G(M)^G(F)^A(M)^G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 346
E98-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)^G(F)^A(M) 347
[表42]
E99 與實施例1相同 G(B)G(B)G(B)A(B)G(B)A(B)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(B)G(B)A(B) 348
E99-1 固相合成 G(B)G(B)G(B)A(B)G(B)A(B)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 349
E99-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(B)G(B)A(B) 350
E100 與實施例1相同 G(M)^G(M)^G(M)^A(M)^G(M)^A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)^G(M)^A(M) 351
E100-1 固相合成 G(M)^G(M)^G(M)^A(M)^G(M)^A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 352
E100-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)^G(M)^A(M) 353
E101 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)C(M)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAUUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(M)G(M)A(M) 354
E101-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)C(M)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AC 355
E101-2 固相合成 pAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAU 356
E101-3 固相合成 pUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(M)G(M)A(M) 357
[表43]
E102 與實施例1相同 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)C(MOE)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAUUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(MOE)^G(MOE)^A(MOE) 358
E102-1 固相合成 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)C(MOE)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AC 359
E102-2 固相合成 pAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAU 360
E102-3 固相合成 pUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(MOE)^G(MOE)^A(MOE) 361
E103 與實施例1相同 G(F)^G(M)^G(F)A(M)G(F)C(M)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAUUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(M)^G(F)^A(M) 362
E103-1 固相合成 G(F)^G(M)^G(F)A(M)G(F)C(M)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AC 363
E103-2 固相合成 pAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAU 364
E103-3 固相合成 pUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(M)^G(F)^A(M) 365
[表44]
E104 與實施例1相同 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)C(MOE)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAUUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(MOE)G(MOE)A(MOE) 366
E104-1 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)C(MOE)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AC 367
E104-2 固相合成 pAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAU 368
E104-3 固相合成 pUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(MOE)G(MOE)A(MOE) 369
E105 與實施例1相同 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)C(M)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAUUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(M)G(F)A(M) 370
E105-1 固相合成 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)C(M)CACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AC 371
E105-2 固相合成 pAAAGCCA(F)UUA(F)AUA(F)GUG(F)ACU(F)CUG(F)AGU(F)GUC(F)CCC(F)UGU(F)CCC(F)ACG(F)ACG(F)GGU(F)ACU(F)GCC(F)UCC(F)ACG(F)ACG(F)GUG(F)UGU(F)GCA(F)UGU(F)AUA(F)UUG(F)AAG(F)CAU 372
E105-3 固相合成 pUGGACA(F)AGU(F)ACG(F)CCU(F)GCA(F)ACU(F)GUG(F)UUG(F)UUG(F)GCU(F)ACA(F)UCG(F)GGG(F)AGC(F)GCU(F)GUC(F)AGU(F)ACC(F)GAG(F)ACC(F)UGA(F)AGU(F)GGU(F)GGG(F)AAC(F)UGC(F)GCU(M)G(F)A(M) 373
[表45]
E106 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACGAUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAA(F)GUA(F)UAA(F)UAA(F)ACU(F)UUG(F)AAA(F)AAC(F)UGC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 374
E106-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG 375
E106-2 固相合成 pAUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAA(F)GUA(F)UAA(F)UAA(F)ACU(F)UUG(F)AAA(F)AAC(F)UGC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M) 376
E107 與實施例1相同 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACGAUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAA(F)GUA(F)UAA(F)UAA(F)ACU(F)UUG(F)AAA(F)AAC(F)UGC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)^G(MOE)^A(MOE) 377
E107-1 固相合成 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG 378
E107-2 固相合成 pAUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAA(F)GUA(F)UAA(F)UAA(F)ACU(F)UUG(F)AAA(F)AAC(F)UGC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)^G(MOE)^A(MOE) 379
E108 與實施例1相同 G(F)^G(M)^G(F)A(M)G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACGAUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAA(F)GUA(F)UAA(F)UAA(F)ACU(F)UUG(F)AAA(F)AAC(F)UGC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)^G(F)^A(M) 380
E108-1 固相合成 G(F)^G(M)^G(F)A(M)G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG 381
E108-2 固相合成 pAUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAA(F)GUA(F)UAA(F)UAA(F)ACU(F)UUG(F)AAA(F)AAC(F)UGC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)^G(F)^A(M) 382
[表46]
E109 與實施例1相同 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACGAUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAA(F)GUA(F)UAA(F)UAA(F)ACU(F)UUG(F)AAA(F)AAC(F)UGC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(F)A(M) 383
E109-1 固相合成 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG 384
E109-2 固相合成 pAUAAAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAA(F)GUA(F)UAA(F)UAA(F)ACU(F)UUG(F)AAA(F)AAC(F)UGC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(F)A(M) 385
E110 與實施例1相同 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)^A(MOE)^G(MOE)^A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)^G(MOE)^A(MOE) 386
E110-1 固相合成 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)^A(MOE)^G(MOE)^A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 387
E110-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)^G(MOE)^A(MOE) 388
E111 與實施例1相同 BDBDG(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 389
E111-1 固相合成 BDBDG(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 390
E111-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(M)G(M)A(M)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 391
E112 與實施例1相同 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 392
E112-1 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 393
E112-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 394
[表47]
E113 與實施例1相同 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACT(MOE)G(MOE)A(MOE)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 395
E113-1 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 396
E113-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACT(MOE)G(MOE)A(MOE)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 397
E114 與實施例1相同 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAGACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACT(MOE)^G(MOE)^A(MOE)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 398
E114-1 固相合成 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)ACA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AGA(F)UCA(F)UCG(F)ACU(F)AUA(F)AAG 399
E114-2 固相合成 pACGACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACT(MOE)^G(MOE)^A(MOE)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 400
E115 固相合成 G(M)G(M)G(M)A(M)G(M)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGaCGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(M)A(M) 401
E116 固相合成 GGGAGAAUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCAGCCACCACCACCACCACCACUGA 402
E117 固相合成 GGGAGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCAGCCACCACCACCACCACCACUGA 403
E118 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCCACCACCACCACCACCACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 404
E119 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)A(MOE)UACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCAGCCACCACCACCACCACCACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 405
E120 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCAGCCACCACCACCACCACCACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 406
E121 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCA(F)UGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAG(F)GUG(F)GCC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 407
[表48]
E122 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)UGG(F)ACU(F)AUA(F)AAG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)AUA(F)AAG(F)GUG(F)GCG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 408
E123 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)UGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAG(F)GUG(F)GCC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 409
E124 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)A(MOE)UACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCA(F)UGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAG(F)GUG(F)GCA(F)GCC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 410
E125 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)UGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAG(F)GUG(F)GCA(F)GCC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 411
E126 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)G(MOE)A(MOE)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGG(F)ACU(F)AUA(F)AGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACA(F)AAG(F)GUG(F)GCC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACU(MOE)G(MOE)A(MOE) 412
E127 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)UGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 413
E128 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)UG(F)GACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 414
E129 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)UG(M)GACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 415
E130 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)UgGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 416
E131 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)U(F)GGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 417
E132 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)U(F)G(F)GACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 418
E133 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)U(F)G(M)GACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 419
E134 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)U(F)gGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 420
E135 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)tGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 421
[表49]
E136 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)tG(F)GACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 422
E137 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)tG(M)GACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 423
E138 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCA(F)tgGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 424
E139 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGCGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 425
E140 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)GCG(F)GCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 426
E141 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)GC(F)G(F)GC(F)GACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 427
E142 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)GC(M)G(F)GC(M)GACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 428
E143 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)GcG(F)GcGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 429
E144 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)G(F)CG(F)G(F)CGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 430
E145 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)G(F)C(F)G(F)G(F)C(F)GACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 431
E146 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)gCG(F)gCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 432
E147 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGUGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 433
E148 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)GUG(F)GUGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 434
E149 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)GU(M)G(F)GU(M)GACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 435
E150 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)GT(L)G(F)GT(L)GACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 436
[表50]
E151 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)G(F)UG(F)G(F)UGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 437
E152 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)G(F)U(M)G(F)G(F)U(M)GACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 438
E153 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAG(F)gUG(F)gUGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 439
E154 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACC(F)ACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 440
E155 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACAUCAUCAUCAUCAUCAUT(MOE)G(MOE)A(MOE) 441
E156 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAC(F)AUC(F)AUC(F)AUC(F)AUC(F)AUC(F)AUT(MOE)G(MOE)A(MOE) 442
E157 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCG(F)ACUAUAAGG(F)ACG(F)ACG(F)ACG(F)ACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 443
E158 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCG(F)AC(F)UAUAAGG(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)G(F)AC(F)AAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 444
E159 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCG(F)A(F)CUAUAAGG(F)A(F)CG(F)A(F)CG(F)A(F)CG(F)A(F)CAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 445
E160 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGGAUGAUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 446
E161 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)AUGAUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 447
E162 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)AU(M)GAUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 448
E163 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)AT(MOE)GAUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 449
E164 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)AT(L)GAUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 450
E165 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)A(F)UGAUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 451
[表51]
E166 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)A(F)U(M)GAUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 452
E167 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)aUGAUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 453
E168 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)AUG(F)AUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 454
E169 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)AU(M)G(F)AU(M)GAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 455
E170 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)AT(L)G(F)AT(L)GAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 456
E171 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)A(F)UG(F)A(F)UGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 457
E172 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)A(F)U(M)G(F)A(F)U(M)GAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 458
E173 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGG(F)aUG(F)aUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 459
E174 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCG(F)AUUAUAAGG(F)AUG(F)AUG(F)AUG(F)AUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 460
E175 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCG(F)A(F)UUAUAAGG(F)A(F)UG(F)A(F)UG(F)A(F)UG(F)A(F)UAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 461
E176 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGGAUG(F)A(F)U(M)GAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 462
E177 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGAUUAUAAGGAUG(F)aUGAUGAUAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 463
E178 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACU(F)AUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 464
E179 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACU(F)AU(M)AAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 465
E180 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACU(F)AT(L)AAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 466
[表52]
E181 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACU(F)A(F)UAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 467
E182 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAGCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 468
E183 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUA(F)AGGACGACGACGACA(F)AGCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 469
E184 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUA(F)AG(M)GACGACGACGACA(F)AG(M)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 470
E185 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUA(F)AG(L)GACGACGACGACA(F)AG(L)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 471
E186 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUA(F)A(F)GGACGACGACGACA(F)A(F)GCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 472
E187 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)GC(F)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 473
E188 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)GC(M)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 474
E189 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)GcCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 475
E190 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)GCCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 476
E191 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)G(F)C(F)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 477
E192 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)G(F)CCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 478
E193 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)gCCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 479
E194 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCAGUCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 480
E195 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)GU(F)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 481
E196 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)GU(M)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 482
E197 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)GtCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 483
E198 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)GUCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 484
[表53]
E199 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)G(F)UCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 485
E200 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCUGGCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 486
E201 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GG(F)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 487
E202 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GG(M)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 488
E203 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GGCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 489
E204 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)G(F)GCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 490
E205 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCUGUCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 491
E206 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GU(F)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 492
E207 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GU(M)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 493
E208 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GUCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 494
E209 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)G(F)UCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 495
E210 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCUGCCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 496
E211 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GC(F)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 497
E212 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GC(M)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 498
E213 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GcCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 499
E214 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCU(F)GCCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 500
E215 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCAUCCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 501
E216 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)UC(F)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 502
E217 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)UC(M)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 503
E218 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)UcCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 504
[表54]
E219 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)UCCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 505
E220 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)U(F)CCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 506
E221 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)UUCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 507
E222 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)UU(F)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 508
E223 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)UU(M)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 509
E224 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)UtCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 510
E225 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)UUCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 511
E226 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)U(F)U(M)CACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 512
E227 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)U(F)UCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 513
E228 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAGGACGACGACGACAAAGGUGGCA(F)tUCACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 514
E229 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGG(F)A(F)CUAUAAAG(F)A(F)CG(F)A(F)CG(F)A(F)CGAUAAAGGUGGCG(F)A(F)CUAUAAGG(F)A(F)CG(F)A(F)CG(F)A(F)CGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 515
E230 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGG(F)ACUAUAAAGACGACG(F)A(F)CGAUAAAGGUGGCG(F)A(F)CUAUAAGGACGACG(F)ACG(F)ACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 516
E231 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAG(F)A(F)CG(F)A(F)CGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(F)A(F)CG(F)A(F)CGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 517
E232 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGA(F)CUAUAAAGA(F)CGA(F)CGA(F)CGAUAAAGGUGGCGA(F)CUAUAAGGA(F)CGA(F)CGA(F)CGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 518
E233 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGA(F)CUAUAAAGACGACGA(F)CGAUAAAGGUGGCG(F)ACUAUAAGGACGACGA(F)CGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 519
E234 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGA(F)CGA(F)CGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGA(F)CGA(F)CGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 520
E235 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGA(F)CGA(F)CGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 521
[表55]
E236 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGA(L)CGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 522
E237 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGA(L)CGA(L)CGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 523
E238 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(F)^ACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 524
E239 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(F)^ACG(F)^ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 525
E240 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGG(F)^ACUAUAAAG(F)^ACG(F)^ACG(F)^ACGAUAAAGGUGGCG(F)^ACUAUAAGG(F)^ACG(F)^ACG(F)^ACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 526
E241 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGG(F)^ACUAUAAAGACGACG(F)^ACGAUAAAGGUGGCG(F)^ACUAUAAGGACGACG(F)^ACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 527
E242 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAG(F)^ACG(F)^ACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGG(F)^ACG(F)^ACGACGACAAACACCACCACCACCACCACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 528
E243 固相合成 G(MOE)G(MOE)G(MOE)AGCCACCAUGGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAAC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACT(MOE)G(MOE)A(MOE) 529
E244 固相合成 G(M)G(M)G(M)AGCCACCA(F)^UGG(F)^ACU(F)^AUA(F)^AAG(F)^ACG(F)^ACG(F)^ACG(F)^AUA(F)^AAG(F)^GUG(F)^GCG(F)^ACU(F)^AUA(F)^AGG(F)^ACG(F)^ACG(F)^ACG(F)^ACA(F)^AAC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACU(M)G(M)A(M) 530
E245 固相合成 G(MOE)^G(MOE)^G(MOE)AGCCACCA(F)^UGG(F)^ACU(F)^AUA(F)^AAG(F)^ACG(F)^ACG(F)^ACG(F)^AUA(F)^AAG(F)^GUG(F)^GCG(F)^ACU(F)^AUA(F)^AGG(F)^ACG(F)^ACG(F)^ACG(F)^ACA(F)^AAC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACC(F)^ACT(MOE)^G(MOE)^A(MOE) 531
E246 固相合成 G(M)^G(M)^G(M)^A(M)^G(M)^C(M)^C(M)^A(M)^C(M)^C(M)^A(M)^U(M)^G(M)^G(M)^A(M)^C(M)^U(M)^A(M)^U(M)^A(M)^A(M)^A(M)^G(M)^A(M)^C(M)^G(M)^A(M)^C(M)^G(M)^A(M)^C(M)^G(M)^A(M)^U(M)^A(M)^A(M)^A(M)^G(M)^G(M)^U(M)^G(M)^G(M)^C(M)^G(M)^A(M)^C(M)^U(M)^A(M)^U(M)^A(M)^A(M)^G(M)^G(M)^A(M)^C(M)^G(M)^A(M)^C(M)^G(M)^A(M)^C(M)^G(M)^A(M)^C(M)^A(M)^A(M)^A(M)^C(M)^A(M)^C(M)^C(M)^A(M)^C(M)^C(M)^A(M)^C(M)^C(M)^A(M)^C(M)^C(M)^A(M)^C(M)^C(M)^A(M)^C(M)^U(M)^G(M)^A 532
[表56]
E247 酶 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)^G(F)^A(M) 533
E247-1 固相合成 G(F)G(M)G(F)A(M)G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 534
E247-2 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)^G(F)^A(M) 535
E248 酶 G(F)^G(M)^G(F)^A(M)^G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAGACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(F)A(M) 536
E248-1 固相合成 G(F)^G(M)^G(F)^A(M)^G(F)A(M)AUACAAGCUACUUGUUCUUUUUGCAGCCACCAUGGACUACAAGGACGACGACGACAAGAUCAUCGACUAUAAAG 537
E248-1 固相合成 pACGACGACGAUAAAGGUGGCGACUAUAAGGACGACGACGACAAACACCACCACCACCACCACU(M)G(F)A(M) 538
[表57]
化合物名 序列編號 產率 (%) MS 實測 MS 計算
E5 79 22
E5-1 80    30561 30556
E5-2 81 27305 27301
E5-3 82 27550 27546
E6 83 50
E6-1 84 28682 28677
E6-2 85 25826 25822
E7 86 44
E7-1 87
E7-2 88
E8 89 31
E8-1 90 25851 25848
E8-2 91 21065 21063
E9 92 39
E9-1 93    25826 25823
E9-2 94 21149 21147
E10 95 36
E10-1 96 25840 25839
E10-2 97 21093 21091
E11 98 36
E11-1 99
E11-2 100
E12 101 40
E12-1 102
E12-2 103
E13 104 40
E13-1 105
E13-2 106
E14 107 40
E14-1 108
E14-2 109
E15 110 34
E15-1 111
E15-2 112
E16 113 33
E16-1 114
E16-2 115
E17 116 34
E17-1 117
E17-2 118
E18 119 33
E18-1 120
E18-2 121
[表58]
E19 122 31
E19-1 123
E19-2 124
E20 125 27
E20-1 126
E20-2 127
E21 128 23
E21-1 129
E21-2 130
E22 131 7
E22-1 132
E22-2 133
E23 134 7
E23-1 135
E23-2 136
E24 137 38
E24-1 138
E24-2 139
E25 140 31
E25-1 141 25826 25823
E25-2 142 21070 21067
E26 143 36
E26-1 144
E26-2 145
E27 146 44
E27-1 147 25826 25823
E27-2 148 21093 21091
E28 149 37
E28-1 150
E28-2 151
E29 152 40
E29-1 153 25826 25823
E29-2 154 21094 21091
E30 155 33
E30-1 156
E30-2 157
E31 158 35
E31-1 159 25824 25823
E31-2 160 21032 21031
E32 161 45
E32-1 162
E32-2 163
E33 164 48
E33-1 165 25826 25823
E33-2 166 21089 21087
[表59]
E34 167 48
E34-1 168
E34-2 169
E35 170 37
E35-1 171 25826 25823
E35-2 172 21118 21115
E36 173 24
E36-1 174
E36-2 175
E37 176 31
E37-1 177
E37-2 178
E38 179 25
E38-1 180
E38-2 181
E39 182 27
E39-1 183 25825 25822
E39-2 184 21069 21067
E40 185 27
E40-1 186
E40-2 187
E41 188 27
E41-1 189 25826 25822
E41-2 190 21070 21067
E42 191 38
E42-1 192
E42-2 193
E43 194 38
E43-1 195 25825 25822
E43-2 196 21094 21091
E44 197 27
E44-1 198
E44-2 199
E45 200 30
E45-1 201 25825 25822
E45-2 202 21094 21091
E46 203 34
E46-1 204 25826 25823
E46-2 205 27651 27647
E47 206 35
E47-1 207
E47-2 208
E48 209 34
E48-1 210 26116 26113
E48-2 211 21249 21247
[表60]
E49 212 31
E49-1 213 26116 26113
E49-2 214 27835 27831
E50 215 31
E50-1 216 26116 26113
E50-2 217 27834 27831
E51 218 33
E51-1 219 26116 26113
E51-2 220 28023 28017
E52 221 30
E52-1 222 26149 26145
E52-2 223 27867 27863
E53 224 31
E53-1 225 26148 26145
E53-2 226 28088 28082
E54 227 34
E54-1 228 25852 25849
E54-2 229 27688 27685
E55 230 25
E55-1 231 25995 25991
E55-2 232 21024 21021
E56 233 36
E56-1 234 25887 25883
E56-2 235 21024 21021
E57 236 28
E57-1 237 26121 26117
E57-2 238 21023 21021
E58 239 30
E58-1 240 26013 26009
E58-2 241 21024 21021
E59 242 33
E59-1 243 26077 26073
E59-2 244 21103 21101
E60 245 40
E60-1 246 25968 25965
E60-2 247 21103 21101
E61 248 49
E61-1 249 25852 25849
E61-2 250 22102 22099
E62 251 52
E62-1 252
E62-2 253
E63 254 30
E63-1 255 25852 25849
E63-2 256 22021 22018
[表61]
E64 257 42
E64-1 258
E64-2 259
E65 260 20
E65-1 261 25852 25849
E65-2 262 22045 22042
E66 263 26
E66-1 264
E66-2 265
E67 266 42
E67-1 267 25850 25849
E67-2 268 22059 22058
E68 269 44
E68-1 270
E68-2 271
E69 272 42
E69-1 273 25850 25849
E69-2 274 22083 22082
E70 275 41
E70-1 276
E70-2 277
E71 278 46
E71-1 279 25851 25849
E71-2 280 22060 22059
E72 281 42
E72-1 282
E72-2 283
E73 284 34
E73-1 285 25850 25849
E73-2 286 22109 22106
E74 287 38
E74-1 288
E74-2 289
E75 290 40
E75-1 291 25850 25849
E75-2 292 22100 22099
E76 293 45
E76-1 294
E76-2 295
E77 296 28
E77-1 297 25850 25849
E77-2 298 22099 22098
E78 299 43
E78-1 300
E78-2 301
E79 302
[表62]
E80 303
E81 304
E82 305
E83 306
E84 307
E85 308
E86 309 37
E86-1 310 26091 26087
E86-2 311 21212 21209
E87 312 39
E87-1 313
E87-2 314
E88 315 37
E88-1 316 25878 25877
E88-2 317 21115 21115
E89 318 44
E89-1 319 25856 25855
E89-2 320 21080 21079
E90 321 39
E90-1 322
E90-2 323
E91 324 44
E91-1 325 25872 25871
E91-2 326 21112 21111
E92 327 41
E92-1 328 25840 25839
E92-2 329 21112 21111
E93 330 42
E93-1 331 25840 25839
E93-2 332 21096 21095
E94 333 37
E94-1 334
E94-2 335
E95 336 44
E95-1 337
E95-2 338
E96 339 35
E96-1 340 25860 25859
E96-2 341 21100 21099
E97 342 46
E97-1 343 25788 25787
E97-2 344 21051 21051
E98 345 41
E98-1 346 25852 25851
E98-2 347 21084 21083
[表63]
E99 348 33
E99-1 349
E99-2 350
E100 351 31
E100-1 352 25926 25929
E100-2 353 21132 21133
E101 354 6
E101-1 355 30697 30695
E101-2 356 27355 27353
E101-3 357 28012 28010
E102 358 6
E102-1 359 31007 31005
E102-2 360 27356 27353
E102-3 361 28191 28188
E103 362 1
E103-1 363
E103-2 364
E103-3 365
E104 366 2
E104-1 367 30975 30973
E104-2 368 27357 27353
E104-3 369 28160 28156
E105 370 8
E105-1 371
E105-2 372
E105-3 373
E106 374 38
E106-1 375 28796 28793
E106-2 376 25913 25912
E107 377 36
E107-1 378 29091 29090
E107-2 379 26081 26090
E108 380 37
E108-1 381
E108-2 382
E109 383 47
E109-1 384
E109-2 385
E110 386 34
E110-1 387 26193 26193
E110-2 388 21280 21279
E111 389 30
E111-1 390
E111-2 391
E112 392 38
E112-1 393
E112-2 394
[表64]
E113 395 29
E113-1 396 26114 26113
E113-2 397 34417 34415
E114 398 25
E114-1 399 26146 26145
E114-2 400 34446 34448
E115 401
E116 402 30183 30178
E117 403 21600 21599
E118 404 20983 20982
E119 405 30778 30773
E120 406 21964 21962
E121 407 29762 26769
E122 408 28852 28848
E123 409 21018 21016
E124 410 30814 30809
E125 411 21999 21998
E126 412 29773 29767
E127 413 28804 28800
E128 414 28804 28802
E129 415 28815 28814
E130 416 28785 28784
E131 417 28805 28802
E132 418 28806 28804
E133 419 28818 28816
E134 420 28791 28786
E135 421 28799 28798
E136 422 28801 28800
E137 423 28813 28812
E138 424 28783 28782
E139 425 28798 28797
E140 426 28803 28801
E141 427 28808 28805
E142 428 28831 28829
E143 429 28770 28769
E144 430 28806 28805
E145 431 28811 28809
E146 432 28770 28769
E147 433 28800 28799
E148 434 28804 28803
E149 435 28832 28831
E150 436 28856 28855
E151 437 28808 28807
E152 438 28836 28835
E153 439 28772 28771
E154 440 28812 28810
[表65]
E155 441 28807 28804
E156 442 28818 28816
E157 443 28810 28808
E158 444 28820 28818
E159 445 28820 28818
E160 446 28805 28803
E161 447 28807 28805
E162 448 28821 28819
E163 449 28882 28877
E164 450 28834 28831
E165 451 28809 28807
E166 452 28823 28821
E167 453 28791 28789
E168 454 28808 28807
E169 455 28837 28835
E170 456 28861 28859
E171 457 28811 28811
E172 458 28842 28839
E173 459 28777 28775
E174 460 28815 28813
E175 461 28826 28823
E176 462 28822 28821
E177 463 28791 28789
E178 464 28801 28800
E179 465 28816 28814
E180 466 28829 28826
E181 467 28804 28802
E182 468 28816 28814
E183 469 28820 28818
E184 470 28847 28846
E185 471 28844 28842
E186 472 28824 28822
E187 473 21966 21966
E188 474 21979 21978
E189 475 21949 21948
E190 476 21965 21964
E191 477 21969 21968
E192 478 21966 21966
E193 479 21948 21948
E194 480 21964 21963
E195 481 21967 21967
E196 482 21980 21979
E197 483 21964 21963
E198 484 21965 21965
E199 485 21967 21967
E200 486 21979 21979
[表66]
E201 487 21983 21983
E202 488 21996 21995
E203 489 21981 21981
E204 490 21984 21983
E205 491
E206 492
E207 493
E208 494
E209 495
E210 496
E211 497
E212 498
E213 499
E214 500
E215 501
E216 502
E217 503
E218 504
E219 505
E220 506
E221 507
E222 508
E223 509
E224 510
E225 511
E226 512
E227 513
E228 514
E229 515
E230 516
E231 517
E232 518
E233 519
E234 520
E235 521
E236 522
E237 523
E238 524
E239 525
E240 526
E241 527
E242 528
E243 529
E244 530
[表67]
E245 531
E246 532
E247 533 23
E247-1 534 25788 25787
E247-2 535 21084 21083
E248 536 30
E248-1 537 25852 25851
E248-1 538 21051 21051
試驗例6 (mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗) 關於表21～56所示之各化合物，使用1-Step Human Coupled IVT Kit(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號88882)評估人類細胞系中之轉譯活性。轉譯反應於與試驗例2(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)相同之條件下進行。 轉譯反應後之反應溶液中之轉譯產物藉由以下所記載之夾心ELISA法進行檢測。首先，將6*His, His-Tag抗體(Proteintech公司，目錄編號66005-1-Ig)以0.1 M碳酸鹽緩衝液(pH值9.4)稀釋至3 μg/mL，以50 μL/孔分注至96孔ELISA用培養板(NUNC公司製造)中，於4℃下靜置一晩，藉此製作進行了抗體之固定化之培養板。繼而，利用以純化水稀釋至1倍濃度之Tris Buffered Saline with Tween 20(Santa Cruz公司，目錄編號sc-24953)(以下記載為清洗溶液)對培養板進行清洗後，以200 μL/孔分注將牛血清白蛋白(和光純藥公司，目錄編號017-22231)以終濃度成為3%之方式稀釋之清洗溶液(以下記載為封閉溶液)，於室溫下靜置1小時。於用清洗溶液清洗培養板後，以50 μL/孔分注利用封閉溶液稀釋之轉譯反應溶液，於室溫下靜置1小時。此時，將序列編號539所示之轉譯產物多肽標準品(Cosmo Bio公司製造)同樣利用封閉溶液稀釋至各濃度後分注至培養板。於用清洗溶液清洗培養板後，以50 μL/孔分注利用封閉溶液稀釋至10,000倍之Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase (HRP) Ab produced in mouse (SIGMA公司製造，目錄抗體A8592-1MG)，於室溫下靜置1小時。於用清洗溶液清洗培養板後，以50 μL/孔分注1-Step Ultra TMB-ELISA(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號34028)，於室溫下靜置數分鐘。其後，以50 μL/孔分注0.5 M硫酸(和光純藥工業公司製造)使反應停止後，使用吸光光度計(Bio-Rad公司製造)測得測定波長450 nm、參照波長570 nm之吸光度。將使用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)、及不具有糖部修飾之R18設為1時之相對轉譯產物量記載於下述表中。 轉譯產物多肽標準品：NH2-MDYKDDDDKIID YKDDDDKGGDY KDDDDKHHHHHH-COOH(序列編號539)
[表68] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E1 1 0.233 0.51
R6 33 0.553 1.22
E2 5 0.580 1.28
E3 8 0.587 1.29
R14 57 0.307 0.68
R15 60 2.220 4.90
R18 72 0.453 1.00
[表69]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 2.560 3.92
E15 110 1.877 2.87
E16 113 2.486 3.80
E17 116 1.918 2.93
E18 119 2.089 3.20
E19 122 1.780 2.72
R18 72 0.654 1.00
[表70]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E11 98 1.866 13.00
E12 101 1.527 10.65
E13 104 0.755 5.26
R18 72 0.143 1.00
[表71]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 1.200 6.97
E8 89 0.225 1.30
E38 179 0.929 5.40
E39 182 0.934 5.43
R18 72 0.172 1.00
[表72]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E11 98 2.727 11.69
E12 101 2.827 12.11
E13 104 0.873 3.74
E14 107 1.860 7.97
R18 72 0.233 1.00
[表73]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E26 143 1.227 8.76
E27 146 1.807 12.90
E32 161 2.060 14.71
E33 164 1.673 11.95
E42 191 1.307 9.33
E43 194 0.633 4.52
R18 72 0.140 1.00
[表74]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E1 1 0.240 1.71
E7 86 0.353 2.52
R18 72 0.140 1.00
[表75]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E39 182 0.647 0.79
E40 185 0.727 0.89
E41 188 0.640 0.78
E44 197 0.913 1.11
E45 200 0.540 0.66
R18 72 0.820 1.00
[表76]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
R6 33 0.507 0.80
E46 203 6.387 10.08
R18 72 0.633 1.00
[表77]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E33 164 1.493 1.33
E34 167 2.027 1.80
E35 170 1.120 0.99
E36 173 0.373 0.33
E37 176 1.373 1.22
R18 72 1.127 1.00
[表78]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E28 149 1.767 1.02
E29 152 1.440 0.83
E44 197 1.367 0.79
E45 200 1.460 0.85
R18 72 1.727 1.00
[表79]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
R15    2.267 1.73
E48 209 2.327 1.77
E86 309 2.200 1.68
R18 72 1.313 1.00
[表80]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E24 137 3.613 2.40
E25 140 3.247 2.15
E40 185 1.360 0.90
E41 188 1.720 1.14
R18 72 1.507 1.00
[表81]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E48 209 2.507 2.54
E49 212 5.540 5.61
E50 215 3.067 3.11
E51 218 7.687 7.79
E52 221 3.653 3.70
E53 224 9.520 9.65
R18 72 0.987 1.00
[表82]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 2.047 1.84
E54 227 7.100 6.38
R18 72 1.113 1.00
[表83]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 2.420 2.16
E59 242 2.820 2.52
E60 245 2.627 2.35
R18 72 1.120 1.00
[表84]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E22 131 0.173 1.30
E23 134 0.073 0.55
E55 230 0.260 1.95
E56 233 0.073 0.55
E57 236 0.367 2.75
E58 239 0.147 1.10
R18 72 0.133 1.00
[表85]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 1.353 10.68
E61 248 3.067 24.21
E62 251 3.080 24.32
E63 254 1.340 10.58
E64 257 0.847 6.68
R18 72 0.127 1.00
[表86]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 3.807 2.86
E65 260 4.607 3.46
E66 263 7.433 5.58
E67 266 3.727 2.80
E68 269 7.140 5.36
R18 72 1.333 1.00
[表87]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 3.153 3.09
E69 272 3.987 3.91
E70 275 4.240 4.16
E71 278 0.847 0.83
E72 281 2.013 1.97
R18 72 1.020 1.00
[表88]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 3.547 3.97
E30 155 3.127 3.50
E31 158 3.527 3.75
E73 284 4.527 3.95
E74 287 3.527 5.07
R18 72 0.893 1.00
[表89]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 3.313 5.85
E75 290 2.073 3.66
E76 293 3.487 6.15
E77 296 2.540 4.48
E78 299 3.900 6.88
R18 72 0.567 1.00
[表90]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 1.947 4.00
E11 98 2.487 5.11
E88 315 1.900 3.90
E89 318 2.580 5.30
E90 321 2.640 5.42
R18 72 0.487 1.00
[表91]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E13 104 1.733 4.19
E28 149 2.293 5.55
E29 152 2.640 6.39
E91 324 1.233 2.98
R18 72 0.413 1.00
[表92]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E12 101 3.340 7.83
E92 327 2.173 5.09
E93 330 2.453 5.75
R18 72 0.427 1.00
[表93]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E27 146 1.793 1.58
E94 333 2.453 2.16
E95 336 1.100 0.97
E96 339 5.633 4.97
E115 401 0.787 0.69
R18 72 1.133 1.00
[表94]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 2.860 2.86
E48 209 3.153 3.15
E100 351 3.853 3.85
E110 386 4.393 4.39
R18 72 1.000 1.00
[表95]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 2.560 3.92
E47 206 0.313 0.48
E48 209 2.180 3.34
E87 312 1.207 1.85
E99 348 0.100 0.15
E110 386 3.240 4.96
R18 72 0.653 1.00
[表96]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E4 11 2.187 2.54
E48 209 2.460 2.86
E86 309 3.240 3.77
E97 342 1.813 2.11
E112 392 3.720 4.33
R18 72 0.853 1.00
[表97]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E86 309 2.487 2.86
E97 342 1.487 1.71
E98 345 4.647 5.34
E247 533 1.580 1.82
E248 536 4.620 5.31
R18 72 0.887 1.00
[表98]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
R6 33 3.133 15.67
E54 227 37.333 186.67
E111 389 57.400 287.00
R18 72 0.200 1.00
[表99]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E48 209 2.867 14.33
E49 212 40.667 203.33
E113 395 41.933 209.67
E114 398 101.667 508.33
R18 72 0.200 1.00
[表100]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E11 98 2.800 4.77
E12 101 2.873 4.90
E92 327 3.340 5.69
E112 392 3.013 5.14
R18 72 0.587 1.00
[表101]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E11 98 2.547 2.63
E4 11 2.613 2.70
E20 125 0.453 0.47
E21 128 0.047 0.05
E88 315 2.367 2.45
E112 392 2.980 3.08
R18 72 0.967 1.00
[表102]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E9 92 1.187 3.12
E10 95 0.940 2.47
R18 72 0.380 1.00
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各化合物於添加至Hela細胞裂解物後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之多肽。
試驗例7 (mRNA樣品之使用Hela細胞株之體外轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用Hela細胞株評估體外轉譯活性。首先，將含有10%胎牛血清之RPMI培養基(Nacalai Tesque公司製造)中懸浮之Hela細胞以每一孔之細胞數成為10,000 cells/100 μL之方式接種至96孔接著細胞用培養板，於37℃、5%CO2 條件下培養一晩。自培養一晩後之細胞去除培養上清液，以40 μL/孔添加含有10%胎牛血清之RPMI培養基後，以各化合物之終濃度成為0.1 μM之方式將各化合物與終濃度0.3%之Lipofectamin MessengerMAX Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：LMRNA008)利用OptiMem(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：31985-070)稀釋後混合，以10 μL/孔將混合液添加至各培養板，於37℃、5%CO2 條件下培養5小時。自培養5小時後之細胞去除培養上清液，利用經冰浴冷卻之D-PBS(-)(Nacalai Tesque公司製造)清洗1次後，關於表103，以20 μL/孔添加含有2%之蛋白酶抑制劑混合物(動物細胞萃取物用)之NP-40(Invitrogen公司，FNN0021)，充分浸透30秒使細胞溶解。關於表104及表105，以20 μL/孔添加含有2%之蛋白酶抑制劑混合物(動物細胞萃取物用)之iScript RT-qPCR樣品製備試劑(Bio-Rad公司，1708898)，充分浸透30秒使細胞溶解。 所獲得之細胞溶解液中之轉譯產物藉由與試驗例6(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法相同之方法實施。將測定結果記載於以下表中，該測定結果係利用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)。
[表103]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
E2 5 0.030
E51 218 1.970
E53 224 2.387
R18 72 0.010
[表104]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
E4 11 0.003
E48 209 0.010
E100 351 0.100
E110 386 0.060
R18 72 0.000
[表105]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
R6 33 0.020
E54 227 0.373
[表106]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
E97 342 0.010
E98 345 0.563
E247 533 0.020
E248 536 0.440
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA於添加至Hela細胞後，產生被基因序列編碼之多肽，其活性與不具有糖部修飾之mRNA同等或高於不具有糖部修飾之mRNA。
試驗例8 (mRNA樣品之使用小鼠初代肝細胞之體外轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用小鼠初代肝細胞(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號MSCP10)評估體外轉譯活性。首先，將含有Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號CM3000)之William's E Medium, no phenol red(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號A1217601)中懸浮之小鼠初代肝細胞以每一孔之細胞數成為10,000 cells/100 μL之方式接種至96孔之塗佈有I型膠原蛋白之培養板(康寧公司製造，目錄編號：356407)，於37℃、5%CO2 條件下培養5小時。自培養後之細胞去除培養上清液，以100 μL/孔添加含有Primary Hepatocyte Maintenance Supplements(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號CM4000)之William's E Medium, no phenol red，進而於37℃、5%CO2 條件下培養5小時。自培養一晩後之細胞去除培養上清液，以40 μL/孔添加含有Primary Hepatocyte Maintenance Supplements之William's E Medium, no phenol red後，以各化合物之終濃度成為0.1 μM之方式將各化合物與終濃度0.3%之Lipofectamin MessengerMAX Transfection Reagent利用OptiMem稀釋後加以混合，以10 μL/孔將混合液添加至各培養板，於37℃、5%CO2 條件下培養5小時。自培養5小時後之細胞去除培養上清液，以100 μL/孔添加含有Primary Hepatocyte Maintenance Supplements之William's E Medium, no phenol red後，進而於37℃、5%CO2 條件下培養1小時。自培養1小時後之細胞去除培養上清液，利用經冰浴冷卻之D-PBS(-)(Nacalai Tesque公司製造)清洗1次後，以20 μL/孔添加含有2%之蛋白酶抑制劑混合物(動物細胞萃取物用)之NP-40(Invitrogen公司，FNN0021)，充分浸透30秒使細胞溶解。 所獲得之細胞溶解液中之轉譯產物藉由與試驗例6(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法相同之方法實施。將測定結果記載於以下表中，該測定結果係利用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)。
[表107]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
R18 72 0.000
R6 33 0.010
E2 5 0.030
E46 203 0.170
[表108]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
R18 72 0.000
E48 209 0.013
E49 212 0.570
E50 215 0.080
E51 218 0.977
E52 221 0.140
E53 224 1.143
E54 227 0.033
E86 309 0.043
[表109]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
R18 72 0.000
R6 33 0.001
E4 11 0.001
E48 209 0.008
E53 224 0.181
E100 351 0.018
E110 386 0.012
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA於添加至小鼠肝細胞後，產生被基因序列編碼之多肽，其活性與不具有糖部修飾之mRNA同等或高於不具有糖部修飾之mRNA。
試驗例9 (mRNA樣品之使用Hela細胞株之體外轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用Hela細胞株評估體外轉譯活性。 首先，利用THE RNA Storage Solution(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號AM7000)將各化合物稀釋至20 μM。Hela細胞株以200,000 cells/19 μL懸浮於SE Cell Line 96-well Nucleofector Kit(Lonza公司製造，目錄編號V4SC-1096)中包含之SE Cell Line Nucleofector Solution及Supplement 1之混合液中。於將所製備之核酸溶液與Hela細胞懸浮液以體積比1：19混合後，使用Nucleofector™ 96-well Shuttl system(Lonza公司製造)，於脈衝條件FF-137下實施電穿孔。使電穿孔10分鐘後之細胞懸浮於含有10%胎牛血清之RPMI培養基(Nacalai Tesque公司製造)中，以每一孔之細胞數成為50,000 cells/145 μL之方式接種至96孔接著細胞用培養板，於37℃、5%CO2 之條件下培養3小時。自培養3小時後之細胞去除培養上清液，利用經冰浴冷卻之D-PBS(-)(Nacalai Tesque公司製造)清洗1次後，以20 μL/孔添加含有2%之蛋白酶抑制劑混合物(動物細胞萃取物用)之iScript RT-qPCR樣品製備試劑(Bio-Rad公司，1708898)，充分浸透30秒使細胞溶解。 所獲得之細胞溶解液中之轉譯產物藉由與試驗例6(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法相同之方法實施。將測定結果記載於以下表中，該測定結果係利用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)。
[表110] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
R6 33 0.000
E53 224 0.133
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之mRNA電穿孔至Hela細胞後，產生被基因序列編碼之多肽，其活性優於轉譯區域不具有糖部修飾之mRNA。
試驗例10 (mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用1-Step Human Coupled IVT Kit(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號88882)評估於人類細胞系中之轉譯活性。轉譯反應藉由與試驗例2(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)相同之方法，於核酸濃度之終濃度成為1 μM之條件下進行。 轉譯反應後之反應溶液中之轉譯產物依照試驗例6(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法，使用序列編號540所示之肽(Cosmo Bio公司製造)作為轉譯產物多肽標準品，除此以外，藉由相同之方法實施。將使用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)、及轉譯區域不具有糖部修飾之表中之各化合物設為1時之相對轉譯產物量記載於以下表中。 轉譯產物多肽標準品：NH2-MDYKDDDDKGGHHHHHH-COOH (序列編號540)
[表111]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E79 302 0.779 1.00
E80 303 5.567 7.14
E121 407 3.633 4.66
E126 412 3.938 5.05
[表112]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E83 306 0.782 1.00
E118 404 5.055 6.46
E123 409 3.884 4.96
[表113]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E116 402 0.577 1.00
E119 405 4.672 8.10
E124 410 2.909 5.04
[表114]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E117 403 0.836 1.00
E120 406 4.820 5.76
E125 411 4.541 5.43
[表115]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E79 302 5.033 1.00
E80 303 96.233 19.12
E81 304 71.667 14.24
[表116]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E187 473 20.901 5.35
E188 474 12.683 3.24
E189 475 14.535 3.72
E190 476 13.642 3.49
E191 477 5.424 1.39
E192 478 12.415 3.18
E193 479 9.485 2.43
E194 480 13.019 3.33
E195 481 13.292 3.40
E196 482 15.400 3.94
E197 483 6.598 1.69
E117 403 3.909 1.00
E120 406 17.240 4.41
[表117]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E198 484 14.951 2.92
E199 485 22.911 4.47
E200 486 36.407 7.11
E201 487 10.375 2.03
E202 488 9.028 1.76
E203 489 32.056 6.26
E117 403 5.123 1.00
E120 406 27.522 5.37
[表118]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E204 490 20.103 4.23
E117 403 4.752 1.00
E120 406 21.482 4.52
[表119]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E205 491 26.627 3.17
E206 492 11.000 1.31
E207 493 22.453 2.68
E208 494 18.787 2.24
E209 495 31.427 3.75
E117 403 8.387 1.00
E120 406 35.800 4.27
[表120]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E210 496 6.653 1.28
E211 497 7.267 1.39
E212 498 5.707 1.09
E213 499 7.453 1.43
E214 500 7.773 1.49
E117 403 5.213 1.00
[表121]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E120 406 28.507 5.47
E215 501 17.773 2.44
E216 502 9.933 1.36
E217 503 10.547 1.45
E218 504 22.253 3.05
E219 505 14.867 2.04
E220 506 11.147 1.53
E117 403 7.293 1.00
E120 406 29.160 4.00
[表122]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E221 507 30.333 4.06
E222 508 31.573 4.23
E223 509 28.000 3.75
E224 510 28.347 3.80
E225 511 31.093 4.16
E226 512 12.493 1.67
E227 513 30.280 4.06
E228 514 25.293 3.39
E117 403 7.467 1.00
E120 406 23.427 3.14
由上述試驗結果可知，各mRNA化合物於添加至Hela細胞裂解物後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之多肽。
試驗例11 (mRNA樣品之使用Hela細胞株之體外轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用Hela細胞株評估體外轉譯活性。各化合物向細胞株之轉染及細胞溶解液之製備藉由與試驗例7(mRNA樣品之使用Hela細胞株之體外轉譯反應試驗)相同之方法實施，細胞之溶解使用含有2%之蛋白酶抑制劑混合物(動物細胞萃取物用)之iScript RT-qPCR樣品製備試劑實施。 所獲得之細胞溶解液中之轉譯產物藉由與試驗例10(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法相同之方法實施。將測定結果記載於以下表中，該測定結果係利用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)。
[表123] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
E79 302 0.000
E80 303 0.010
E81 304 0.147
由試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA於添加至Hela細胞後，產生被基因序列編碼之多肽，其活性優於轉譯區域不具有糖部修飾之mRNA。
試驗例12 (mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用1-Step Human Coupled IVT Kit(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號88882)評估人類細胞系中之轉譯活性。轉譯反應係於與試驗例2(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)相同之條件下，於核酸濃度之終濃度成為1 μM之條件下進行。 轉譯反應後之反應溶液中之轉譯產物依照試驗例6(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法，使用序列編號541所示之肽(Cosmo Bio公司製造)作為轉譯產物多肽標準品，除此以外，藉由相同之方法實施。將使用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)、及轉譯區域不具有糖部修飾之E82設為1時之相對轉譯產物量記載於表124～133。 轉譯產物多肽標準品：NH2-MDYKD DDDKGGDY KDDDDK HHHHHH-COOH (序列編號541)
[表124]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E82 305 2.427 1.00
E84 307 24.560 10.12
E122 408 17.427 7.18
[表125]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E82 305 20.067 1.00
E84 307 130.000 6.48
E85 308 75.867 3.78
[表126]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E127 413 5.473 3.93
E128 414 4.367 3.14
E129 415 2.943 2.11
E130 416 4.874 3.50
E131 417 5.633 4.05
E132 418 4.076 2.93
E133 419 4.005 2.88
E134 420 4.515 3.24
E135 421 4.956 3.56
E136 422 1.973 1.42
E137 423 2.191 1.57
E138 424 4.254 3.06
E139 425 4.375 3.14
E140 426 4.238 3.04
E141 427 4.327 3.11
E142 428 3.403 2.44
E143 429 3.230 2.32
E82 305 1.392 1.00
E84 307 7.319 5.26
[表127]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E144 430 7.639 3.94
E145 431 3.165 1.63
E146 432 5.721 2.95
E147 433 16.501 8.50
E148 434 14.451 7.45
E149 435 19.020 9.80
E150 436 14.615 7.53
E151 437 16.500 8.50
E152 438 6.457 3.33
E153 439 12.027 6.20
E82 305 1.941 1.00
E84 307 10.832 5.58
[表128]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E154 440 26.333 12.91
E155 441 11.240 5.51
E156 442 5.000 2.45
E82 305 2.040 1.00
E84 307 29.707 14.56
[表129]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E157 443 15.827 9.27
E158 444 4.107 2.41
E159 445 7.720 4.52
E160 446 22.453 13.16
E161 447 19.747 11.57
E162 448 19.760 11.58
E163 449 15.920 9.33
E164 450 17.173 10.06
E165 451 20.120 11.79
E166 452 16.627 9.74
E167 453 10.533 6.17
E82 305 1.707 1.00
E84 307 15.947 9.34
[表130]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E168 454 17.867 7.44
E169 455 18.093 7.54
E170 456 8.267 3.44
E171 457 16.120 6.72
E172 458 3.120 1.30
E173 459 5.373 2.24
E174 460 18.480 7.70
E175 461 3.667 1.53
E176 462 12.493 5.21
E177 463 10.653 4.44
E82 305 2.400 1.00
E84 307 14.893 6.21
[表131]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E178 464 9.347 4.35
E179 465 7.573 3.53
E180 466 5.493 2.56
E181 467 5.120 2.39
E182 468 10.773 5.02
E183 469 10.693 4.98
E184 470 7.800 3.63
E185 471 9.453 4.40
E186 472 8.680 4.04
E82 305 2.147 1.00
E84 307 8.680 4.04
[表132]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E229 515 9.867 3.15
E230 516 17.387 5.55
E231 517 14.387 4.59
E232 518 17.427 5.56
E233 519 16.107 5.14
E234 520 15.667 5.00
E235 521 16.907 5.40
E236 522 16.680 5.32
E237 523 14.627 4.67
E238 524 15.840 5.06
E239 525 16.160 5.16
E240 526 14.840 4.74
E241 527 16.653 5.31
E242 528 17.760 5.67
E243 529 15.000 4.79
E246 532 0.000 0.00
E82 305 3.133 1.00
E84 307 20.987 6.70
[表133]
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E82 305 3.040 1.00
E84 307 26.427 8.69
E122 408 10.093 3.32
E243 529 16.107 5.30
E244 530 7.813 2.57
E245 531 7.987 2.63
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA化合物於添加至Hela細胞裂解物後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之多肽。
試驗例13 (mRNA樣品之使用Hela細胞株之體外轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用Hela細胞株評估體外轉譯活性。各化合物向細胞株之轉染及細胞溶解液之製備藉由與試驗例7(mRNA樣品之使用Hela細胞株之體外轉譯反應試驗)相同之方法實施，細胞之溶解使用含有2%之蛋白酶抑制劑混合物(動物細胞萃取物用)之iScript RT-qPCR樣品製備試劑實施。 所獲得之細胞溶解液中之轉譯產物藉由與試驗例12(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法相同之方法實施。將測定結果記載於以下表中，該測定結果係利用基於多肽標準品之吸光度製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)。
[表134] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM)
E82 305 0.117
E84 307 3.277
E85 308 0.930
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA於添加至Hela細胞後，產生被基因序列編碼之多肽，其活性優於不具有糖部修飾之mRNA。
試驗例14 (真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用兔網狀紅血球裂解物系統核酸酶處理套組評估於真核細胞系中之轉譯活性。轉譯反應藉由與試驗例2(真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗)相同之方法實施。 轉譯反應後之反應溶液中之轉譯產物藉由以下所記載之夾心ELISA法進行檢測。首先，將Anti-Human EGF抗體(Peprotech公司製造，目錄編號500-P45)利用0.1 M碳酸鹽緩衝液(pH值9.4)稀釋至3 μg/mL，以50 μL/孔分注至96孔ELISA用培養板(NUNC公司製造)，於4℃下靜置一晩，藉此製作進行了抗體之固定化之培養板。繼而，利用以純化水稀釋至1倍濃度之Tris Buffered Saline with Tween 20(以下記載為清洗溶液)清洗培養板後，以200 μL/孔分注將牛血清白蛋白以終濃度成為3%之方式稀釋之清洗溶液(以下記載為封閉溶液)，於室溫下靜置1小時。用清洗溶液清洗培養板後，以50 μL/孔分注利用封閉溶液稀釋100倍之轉譯反應溶液，於室溫下靜置1小時。用清洗溶液清洗培養板後，以50 μL/孔分注利用封閉溶液稀釋至10,000倍之Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase (HRP) Ab produced in mouse(SIGMA公司製造，目錄抗體A8592-1MG)，於室溫下靜置1小時。用清洗溶液清洗培養板後，以50 μL/孔分注1-Step Ultra TMB-ELISA(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號34028)，於室溫下靜置數分鐘。其後，以50 μL/孔分注0.5 M硫酸(和光純藥工業公司製造)使反應停止後，使用吸光光度計(Bio-Rad公司製造)測得測定波長450 nm、參照波長570 nm之吸光度。將測定各轉譯反應溶液時之吸光度(自測定波長之吸光度減去參照波長之吸光度所得者)記載於以下表中。
[表135] 藉由ELISA測定各化合物時之吸光度
化合物名 序列編號 吸光度
E5 79 1.19
E101 354 1.25
E102 358 1.21
E103 362 1.30
E104 366 1.02
E105 370 1.25
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA化合物於添加至兔紅血球裂解物後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之FLAG-EGF肽。
試驗例15 (mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用1-Step Human Coupled IVT Kit(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號88882)評估於人類細胞系中之轉譯活性。轉譯反應係於與試驗例2(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)相同之條件下，於核酸濃度之終濃度成為1 μM之條件下進行。 轉譯反應後之反應溶液中之轉譯產物依照試驗例14(真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法，將轉譯反應液利用封閉溶液稀釋至20倍，除此以外，藉由相同之方法實施。將測定各轉譯反應溶液時之吸光度(自測定波長之吸光度減去參照波長之吸光度所得者)記載於以下表中。
[表136] 藉由ELISA測定各化合物時之吸光度
化合物名 序列編號 吸光度
E5 79 1.12
E101 354 1.41
E102 358 1.37
E103 362 1.49
E104 366 1.37
E105 370 1.44
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA化合物於添加至Hela細胞裂解物後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之FLAG-EGF肽。
試驗例16 (mRNA樣品之使用Hela細胞株之體外轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用Hela細胞株來評估體外轉譯活性。各化合物向細胞株之轉染及細胞溶解液之製備係藉由與試驗例7(mRNA樣品之使用Hela細胞株之體外轉譯反應試驗)相同之方法實施，細胞之溶解係使用含有2%之蛋白酶抑制劑混合物(動物細胞萃取物用)之iScript RT-qPCR樣品製備試劑來實施。 所獲得之細胞溶解液中之轉譯產物係依照試驗例14(真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法，將細胞溶解液液利用封閉溶液稀釋至30倍，除此以外，藉由相同之方法實施。將測定各細胞溶解液時之吸光度(自測定波長之吸光度減去參照波長之吸光度所得者)記載於以下表中。
[表137] 藉由ELISA測定各化合物時之吸光度
化合物名 序列編號 吸光度
E5 79 0.01
E101 354 0.03
E102 358 0.11
E104 366 0.11
E105 370 0.04
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA化合物於添加至Hela細胞後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之FLAG-EGF肽，其活性優於不具有糖部修飾之mRNA。
試驗例17 (真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用兔網狀紅血球裂解物系統核酸酶處理套組來評估於真核細胞系中之轉譯活性。轉譯反應係藉由與試驗例2(真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗)相同之方法實施。 轉譯反應後之反應溶液中之轉譯產物依照試驗例6(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法，使用序列編號542所示之肽(Cosmo Bio公司製造)作為轉譯產物多肽標準品，除此以外，藉由相同之方法實施。將使用基於多肽標準品之吸光度所製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)、及將轉譯區域不具有糖部修飾之E6設為1時之相對轉譯產物量記載於以下表中。 轉譯產物多肽標準品：NH2-MDYKDDDDK IIDYKDDDDKGGD YKDDDDKSIINFEKLHHHHHH-COOH (序列編號542)
[表138] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E6 83 1.333 1.00
E106 374 2.800 2.10
E107 377 4.467 3.35
E108 380 5.500 4.13
E109 383 4.433 3.33
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA化合物於添加至兔紅血球裂解物後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之肽。
試驗例18 (mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用1-Step Human Coupled IVT Kit(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號88882)評估於人類細胞系中之轉譯活性。轉譯反應係於與試驗例2(mRNA樣品之使用Hela細胞株裂解物之轉譯反應試驗)相同之條件下，於核酸濃度之終濃度成為1 μM之條件下進行。 轉譯反應後之反應溶液中之轉譯產物依照試驗例17(真核細胞系中之轉譯反應：使用兔紅血球裂解物之轉譯反應試驗)所記載之夾心ELISA法，將轉譯反應液利用封閉溶液稀釋至10倍，除此以外，藉由相同之方法實施。將使用基於多肽標準品之吸光度所製作之校準曲線而定量所得之各轉譯反應溶液中之轉譯產物濃度(nM)、及將轉譯區域不具有糖部修飾之E6設為1時之相對轉譯產物量記載於以下表中。
[表139] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度
化合物名 序列編號 轉譯產物濃度(nM) 相對轉譯產物量
E6 83 0.500 1.00
E106 374 0.120 0.24
E107 377 0.867 1.73
E108 380 0.507 1.01
E109 383 0.407 0.81
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之各mRNA化合物於添加至Hela細胞裂解物後，藉由真核細胞之轉譯系統而產生被基因序列編碼之肽。
試驗例19 (mRNA樣品之血清中穩定性試驗) 關於表21～56所記載之各化合物，使用市售小鼠血清(塔卡拉生物，目錄編號2311B，lot編號AJ10759A)評估血清中核酸穩定性。首先，將小鼠血清用UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water(DW)(invitrogen，目錄編號10977-015)稀釋15倍，製備稀釋血清溶液。各化合物利用THE RNA storage solution(Thermo Fisher Scientific公司，目錄編號AM7001)稀釋至終濃度成為5 μM。 於另一96孔PCR培養板中添加稀釋血清溶液8 μL、6 U/μL核糖核酸酶抑制劑(塔卡拉生物，目錄編號2311B)2.5 μL之混合溶液10.5 μL、及5 μM mRNA 2 μL，於-30℃下保存，用於酶未反應(0 min)之情形。於又一96孔PCR培養板中添加稀釋血清溶液28 μL及5 μM mRNA 7 μL並充分混合，用於酶反應之情形。將其分注至4個新的96孔PCR培養板中各10 μL，於各培養板中在37℃下反應規定之時間(5 min、15 min、30 min、60 min)後，添加6 U/μL核糖核酸酶抑制劑2.5 μL，於測定之前保存於-30℃。 酶反應後之反應溶液中之殘存mRNA量藉由以下所記載之RT-qPCR法進行檢測。首先，對於校準曲線，關於表140使用化合物R18，關於表141分別使用對應之化合物，藉由THE RNA storage solution自4 μM稀釋4倍後，取11點濃度，製作稀釋系列。校準曲線及酶反應後之樣品2.5 μL使用含有終濃度為0.2 U/mL之核糖核酸酶抑制劑之DW稀釋1071倍。使用該稀釋之試樣5 μL及2μM RT引子(Sigma-Aldrich公司)1 μL，藉由TaqMan Micro RNA RT kit(Thermo Fisher Scientific，目錄編號4366597)製作逆轉錄產物cDNA。實施時，關於反應溫度，為16℃ 30 min→42℃ 30 min→85℃ 5 min。將cDNA 5 μL、TaqMan Gene Expression Master Mix 10 μL、Fw引子(Sigma-Aldrich公司)0.28 μL、Rv引子(Sigma-Aldrich公司)0.33 μL、TaqMan MGB探針(Thermo Fisher Scientific公司，目錄編號4316033)0.38 μL及蒸餾水4.01 μL加以混合，進行qPCR測定。機器使用Quantstudio12K Flex(Applied Biosystems)。又，所使用之Primer及Taqman MGB探針之DNA序列如下。將測定結果記載於以下表中，該測定結果係基於標準品之CT值使用校準曲線定量各試樣中之各化合物之濃度，以相對於酶未反應(0分鐘)之相對殘存量所算出。 RT引子：5'-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG-3'  (序列編號75) Fw引子：5'-ATCTTGTCGTCGTCGTCCTT-3'     (序列編號76) Rv引子：5'-GAATACAAGCTACTTGTTCTTTT-3'   (序列編號77) Taqman MGB探針：5'-CAGCCACCATG-3'      (序列編號78) [表140] 各反應時間點之相對於酶未反應(0分鐘)之各化合物之相對殘存量
化合物名 序列編號 0分鐘 15分鐘 30分鐘 60分鐘
R18 72 1.000 0.005 0.003 0.003
E1 1 1.000 0.106 0.004 0.004
R6 33 1.000 0.002 0.004 0.003
E2 5 1.000 0.195 0.005 0.005
E3 8 1.000 0.227 0.005 0.003
[表141] 各反應時間點之相對於酶未反應(0分鐘)之各化合物之相對殘存量
化合物名 序列編號 0分鐘 5分鐘 15分鐘 30分鐘
R18 72 1.000 0.000 0.000 0.000
E1 1 1.000 0.185 0.000 0.000
E4 11 1.000 0.019 0.000 0.000
E21 128 1.000 0.749 0.009 0.000
E48 209 1.000 0.026 0.000 0.000
E110 386 1.000 0.017 0.006 0.000
由上述試驗結果可知，具有糖部修飾之mRNA與不具有糖部修飾之mRNA相比，於血清中之耐分解性提高。
試驗例20(VEGF蛋白質之轉譯反應) ＜比較化合物RN之合成＞ 以下表示用於合成轉譯成VEGF蛋白質之比較化合物RN的材料(多核苷酸)之序列資訊。表中之各核苷酸N表示RNA，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-F化修飾RNA，N(MOE)表示2'-O-甲氧基乙基修飾RNA，dN表示DNA。
[表142]
化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
FW引子 dAdAdGdCdTdAdAdTdAdCdGdAdCdTdCdAdCdTdAdTdAdGdGdGdTdGdCdAdTdTdGdGdAdGdCdCdTdTdGdCdCdTdTdGdCdTdGdCdTdC 543
RV引子1 dCdTdAdGdAdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdTdGdCdCdGdCdCdCdAdCdTdCdAdGdAdCdTdTdTdAdTdTdCdAdAdAdGdAdCdC 544
5'末端多核苷酸序列 RN-1 GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGAACUUUCUGCUGUCUU 545
人工合成基因序列GN TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGA 546
模板DNA-A dGdGdCdTdCdCdAdAdTdGdCdAdCdCdCdAdAdGdAdCdAdGdCdAdGdAdAdAdGdT 547
藉由以下一系列操作獲得比較化合物RN。 (利用PCR反應之雙鏈DNA之製備及利用體外轉錄之3'末端側多核苷酸片段之製備) 質體DNA使用在市售之pUC19載體之Sma I部位插入上述序列編號546所示之人工合成基因序列GN所得者(FASMAC股份有限公司製造)。 使用質體DNA、FW引子及RV引子進行PCR。 PCR溶液之終濃度如下所述：模板DNA 0.2 ng/μL，dNTP 250 μM，引子0.3 μM，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara) 0.025 U/μL，PrimeSTAR Buffer(Mg2+ plus)(Takara)1x；溫度循環如下所述：94 ℃ 5 min，[98℃ 10 sec，55℃ 30 sec，72℃ 60 sec]×30次循環。藉由苯酚氯仿萃取、異丙醇沈澱進行部分純化。繼而，藉由DpnI處理進行模板質體之分解去除。反應液之終濃度為PCR產物3.43 μg/μL、Dpn I(Takara)1 U/μL、T buffer(Takara)1x，於37度下進行1小時保溫。藉由苯酚氯仿萃取、異丙醇沈澱進行部分純化。
繼而，藉由T7 RNA聚合酶進行轉錄反應。反應液之終濃度如下所述：DNA 10 ng/μL，DTT 5 mM，ATP、CTP、UTP各2 mM，GMP 2 mM，GTP 0.5 mM，T7 RNA聚合酶(Takara)2.5 U/μL，T7 RNA聚合酶緩衝液(Takara)1x，Murine RNase Inhibitor(NEB)0.2 U/μL。於37度下進行2小時保溫。繼而，添加DNase(recombinant，RNase-free，Takara)使終濃度為0.1 U/μL，於37度下進行30分鐘保溫。藉由苯酚氯仿萃取、異丙醇沈澱進行部分純化，獲得3'末端側多核苷酸片段RN-2。
(藉由RNA連接進行之RNA連結產物之製備) 使用依照慣例藉由化學合成獲得之3'末端側多核苷酸片段RN-1以及藉由體外轉錄獲得之RNA片段RN-2、模板DNA-A，藉由RNA連接酶2進行連結反應。終濃度為RN-1 2 μM，RN-2 2 μM，DNAN 4 μM，PEG8000 10%(v/v)，T4 RNA連接酶2(NEB)1 U/μL，T4 RNA連接酶2緩衝液(NEB)1x，RNase inhibitor Murine (NEB) 1 U/μL。於管中添加PEG8000、T4 RNA連接酶2、RNase inhibitor以外之受質/試劑後，於90度下加熱3分鐘，自然散熱至室溫。添加剩餘之試劑、酶，於45度下保溫1小時。添加DNase使終濃度為0.33 U/μL，於37度下保溫15分鐘。藉由苯酚氯仿萃取、異丙醇沈澱進行部分純化，獲得連結RNA。反應樣品藉由dPAGE(5%丙烯醯胺，7 M脲)進行解析。凝膠純化如下所述。利用dPAGE(6%丙烯醯胺，7.5 M脲，25%甲醯胺)進行泳動後，切出相應之帶，利用MQ水進行12小時萃取。藉由AMICON 10K(Merck Millipore)處理、異丙醇沈澱獲得凝膠萃取產物。
(RNA連結產物之連結部序列解析) 藉由以下一系列操作，使用Smarter RACE 5' 3' Kit(Takara Bio公司製造，目錄編號634859對RNA連結產物RN之連結部之序列進行分析。首先，取1 μL製備成100 ng/μL之RN，與5'CDS引子A 1 μL及無核酸酶之水9 μL混合，於72℃下加熱4分鐘，於4℃下冷卻2分鐘。於反應液中混合1 μL之SMARTER II A Oligo、4 μL之5x First Strand Buffer、0.5 μL之100 mM DTT、1 μL之20 mM dNTPs、0.5 μL之40 U/μL RNase Inhibitor、2 μL之SMARTScribe逆轉錄酶，於42℃下加熱90分鐘，於72℃下加熱10分鐘，於4℃下冷卻後，添加240 μL之TE Buffer並進行混合，藉此合成模板cDNA。繼而，使用所獲得之模板cDNA如下所述實施PCR反應。具體而言，將2.5 μL之模板cDNA、5 μL之10x UPM、0.1 μL之100 μM RV引子2(序列編號548)、25 μL之SeqAmp Buffer、1 μL之SeqAmp DNA聚合酶、16.4 μL之無核酸酶之水進行混合，使用溫控循環機於94℃下加熱30秒，其後於68℃下加熱30秒，於72℃下加熱60秒，反覆進行20次，其後於4℃下冷卻。利用1.5%瓊脂糖-TAE凝膠對所獲得之PCR產物進行電泳，切出相應之帶，利用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司製造，目錄編號28704)對PCR產物進行純化。將所獲得之PCR產物1 μL與Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing(Invitrogen公司製造，目錄編號45-0031)中所含之TOPO vector 0.5 μL、Salt solution 0.5 μL、無核酸酶之水1 μL進行混合，於室溫下反應5分鐘。將所獲得之反應物轉形為Competent Quick DH5α(東洋紡公司製造，目錄編號DNA-913)，接種至含有100 μg/mL之安比西林之LB瓊脂培養基培養板，於37℃下培養一晩，藉此獲得單菌落。將單菌落植菌至含有100 μg/mL之安比西林之LB液體培養基，於37℃下培養一晩，使用PureYield Plasmid Miniprep System(Promega公司製造，目錄編號A1222)自所獲得之大腸桿菌萃取出質體DNA。
將所獲得之質體DNA 500 ng與6.4 pmol之序列引子(M13FW或M13RV，分別為序列編號549、550)進行混合，利用無核酸酶之水製備成14 μL，依靠FASMAC公司實施基於桑格法之毛細管序列解析。自獨立之3個單菌落進行序列解析，結果確認RNA連結產物RN之連結部之序列與序列編號546所示之基因序列之相應部位一致。 RV引子2：5'-GATTACGCCAAGCTTTGG CTTGAAGATGTA CTCGATCTCATCAGG-3'・・・序列編號548 序列引子M13FW：5'-CTCGATCTCATCAGG-3'・・・序列編號549 序列引子M13RV：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'・・・序列編號550
＜比較化合物RN'之合成＞ 以下表示用於合成轉譯成VEGF蛋白質之比較化合物RN'的材料(多核苷酸)之序列資訊。表中之各核苷酸N表示RNA，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-F化修飾RNA，N(MOE)表示2'-O-甲氧基乙基修飾RNA，dN表示DNA。 [表143]
化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
5'末端多核苷酸序列 RN'-1 GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGAACUUUCUGCUGUCUU 551
人工合成基因序列GN' AATTCAGTACTTAATACGACTCACTATAGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAT 552
模板DNA-B dGdGdCdTdCdCdAdAdTdGdCdAdCdCdCdAdAdGdAdCdAdGdCdAdGdAdAdAdGdT 553
藉由以下一系列操作獲得比較化合物RN'。 (線狀化質體DNA之製備及藉由體外轉錄之RNA片段之製備) 質體DNA使用在市售之pUC19載體之EcoRV部位及XbaI部位插入序列編號552所示之人工合成基因序列GN'所得者(GENEWIZ股份有限公司製造)。使用限制酶XbaI對質體DNA進行直鏈化。反應液之終濃度為質體DNA 20 ng/μL，XbaI(Takara)0.75 U/μL，M buffer(Takara)1x，BSA 0.01%，於37度下保溫1小時。藉由苯酚氯仿萃取、異丙醇沈澱進行部分純化。使用所獲得之直鏈化DNA進行轉錄反應。反應液之終濃度如下所述：DNA 10 ng/μL，DTT 5 mM，ATP、CTP、UTP各2 mM，GMP 2 mM，GTP 0.5 mM，T7 RNA聚合酶(Takara)2.5 U/μL，T7 RNA聚合酶緩衝液(Takara)1x，RNase Inhibitor，Murine (NEB) 0.2 U/μL。於37度下進行2小時保溫。繼而，添加DNase(recombinant，RNase-free，Takara)使終濃度為0.1 U/μL，於37度下進行30分鐘保溫。藉由苯酚氯仿萃取、異丙醇沈澱進行部分純化，獲得3'末端側多核苷酸片段RN'-2。
(藉由RNA連接之RNA連結產物之製備) 使用依照慣例藉由化學合成獲得之5'末端側多核苷酸片段RN'-1以及藉由體外轉錄獲得之3'末端側多核苷酸片段RN'-2、模板DNA-B，利用RNA連接酶2進行連結反應。終濃度為RN-1 2 μM，RN-2 2 μM，DNAN 4 μM，PEG8000 10%(v/v)，T4 RNA連接酶2(NEB)1 U/μL，T4 RNA連接酶2緩衝液(NEB)1x，RNase inhibitor Murine(NEB) 1 U/μL。於管中添加PEG8000、T4 RNA連接酶2、RNase inhibitor以外之受質/試劑後，於90度下加熱3分鐘，自然散熱至室溫。添加剩餘之試劑、酶，於45度下保溫1小時。添加DNase使終濃度為0.33 U/μL，於37度下保溫15分鐘。藉由苯酚氯仿萃取、異丙醇沈澱進行部分純化，獲得連結RNA。反應樣品藉由dPAGE(5%丙烯醯胺，7 M脲)進行解析。凝膠純化如下所述。利用dPAGE(6%丙烯醯胺，7.5 M脲，25%甲醯胺)進行泳動後，切出相應之帶，利用MQ水進行12小時萃取。藉由AMICON 10K(Merck Millipore)處理、異丙醇沈澱獲得凝膠萃取產物。
＜具有糖部修飾之化合物EN之合成＞ 以下表示用於合成轉譯成VEGF蛋白質之化合物EN的材料(多核苷酸)之序列資訊。表中之各核苷酸N表示RNA，N(M)表示2'-O-甲基修飾RNA，N(F)表示2'-F化修飾RNA，N(MOE)表示2'-O-甲氧基乙基修飾RNA，dN表示DNA。
[表144]
化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
EN-1 G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)A(MOE)A(MOE)UAA(F)GAG(F)AGA(F)AAA(F)GAA(F)GAG(F)UAA(F)GAA(F)GAA(F)AUA(F)UAA(F)GAG(F)CCA(F)CCA(F)UGA(F)ACU(F)UUC(F)UGC(F)UGU(F)CUU 554
模板DNA-C dGdGdCdTdCdCdAdAdTdGdCdAdCdCdCdAdAdGdAdCdAdGdCdAdGdAdAdAdGdT 555
藉由以下一系列操作獲得具有糖部修飾之化合物EN。 (線狀化質體DNA之製備及藉由體外轉錄之RNA片段之製備) 3'側之片段藉由與上述RN'-2製備法相同之方法實施。
(藉由RNA連接之RNA連結產物之製備) 使用藉由化學合成獲得之RNA片段EN-1以及RNA片段RN'-2、模板DNA-C，利用RNA連接酶2進行連結反應。終濃度為EN-1 2 μM，RN'-2 2 μM，模板DNA 4 μM，PEG8000 10%(v/v)，T4 RNA連接酶2(NEB) 1 U/μL，T4 RNA連接酶2緩衝液(NEB)1x，RNase inhibitor Murine(NEB) 1 U/μL。於管中添加PEG8000、T4 RNA連接酶2、RNase inhibitor以外之受質/試劑後，於90度下加熱3分鐘，自然散熱至室溫。添加剩餘之試劑、酶，於45度下保溫1小時。添加DNase(recombinant，RNase-free，Takara)使終濃度為0.33 U/μL，於37度下保溫15分鐘。藉由苯酚氯仿萃取、異丙醇沈澱進行部分純化，獲得連結RNA。反應樣品利用dPAGE(5%丙烯醯胺，7 M脲)進行解析。凝膠純化如下所述。利用dPAGE(6%丙烯醯胺，7.5 M脲，25%甲醯胺)進行泳動後，切出相應之帶，利用MQ水進行12小時萃取。藉由AMICON 10K(Merck Millipore)處理、異丙醇沈澱獲得凝膠萃取產物。
(mRNA樣品之轉譯反應) 將上述中所獲得之RN、RN'及EN之序列資訊示於表145。表145中，各核苷酸N(大寫字母)表示RNA，各核苷酸N(F)表示2'-F化修飾RNA，N(MOE)表示2'-O-甲氧基乙基修飾RNA。 [表145]
化合物名 序列(5'⇒3') 序列 編號
RN及RN' GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGAACUUUCUGCUGUCUUGGGUGCAUUGGAGCCUUGCCUUGCUGCUCUACCUCCACCAUGCCAAGUGGUCCCAGGCUGCACCCAUGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAAUCAUCACGAAGUGGUGAAGUUCAUGGAUGUCUAUCAGCGCAGCUACUGCCAUCCAAUCGAGACCCUGGUGGACAUCUUCCAGGAGUACCCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCAAGCCAUCCUGUGUGCCCCUGAUGCGAUGCGGGGGCUGCUGCAAUGACGAGGGCCUGGAGUGUGUGCCCACUGAGGAGUCCAACAUCACCAUGCAGAUUAUGCGGAUCAAACCUCACCAAGGCCAGCACAUAGGAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAAAGAAAGAUAGAGCAAGACAAGAAAAUCCCUGUGGGCCUUGCUCAGAGCGGAGAAAGCAUUUGUUUGUACAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUUCCUGCAAAAACACAGACUCGCGUUGCAAGGCGAGGCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACUUGCAGAUGUGACAAGCCGAGGCGGUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG 556
EN G(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)A(MOE)A(MOE)UAA(F)GAG(F)AGA(F)AAA(F)GAA(F)GAG(F)UAA(F)GAA(F)GAA(F)AUA(F)UAA(F)GAG(F)CCA(F)CCA(F)UGA(F)ACU(F)UUC(F)UGC(F)UGU(F)CUUGGGUGCAUUGGAGCCUUGCCUUGCUGCUCUACCUCCACCAUGCCAAGUGGUCCCAGGCUGCACCCAUGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAAUCAUCACGAAGUGGUGAAGUUCAUGGAUGUCUAUCAGCGCAGCUACUGCCAUCCAAUCGAGACCCUGGUGGACAUCUUCCAGGAGUACCCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCAAGCCAUCCUGUGUGCCCCUGAUGCGAUGCGGGGGCUGCUGCAAUGACGAGGGCCUGGAGUGUGUGCCCACUGAGGAGUCCAACAUCACCAUGCAGAUUAUGCGGAUCAAACCUCACCAAGGCCAGCACAUAGGAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAAAGAAAGAUAGAGCAAGACAAGAAAAUCCCUGUGGGCCUUGCUCAGAGCGGAGAAAGCAUUUGUUUGUACAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUUCCUGCAAAAACACAGACUCGCGUUGCAAGGCGAGGCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACUUGCAGAUGUGACAAGCCGAGGCGGUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG 557
關於RN、RN'、EN，使用Hela細胞株評估體外轉譯活性。首先，將含有10%胎牛血清之RPMI培養基(Nacalai Tesque公司製造)中懸浮之Hela細胞以每一孔之細胞數成為10,000 cells/100 μL之方式接種至96孔接著細胞用培養板，於37℃、5%CO2 之條件下培養一晩。自培養一晩後之細胞去除培養上清液，以40 μL/孔添加含有10%胎牛血清之RPMI培養基後，以各化合物之終濃度成為0.3、1、3、及10 nM之方式將各化合物與終濃度0.3%之Lipofectamin MessengerMAX Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：LMRNA008)利用OptiMem(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：31985-070)稀釋後混合，以10 μL/孔將混合液添加至各培養板，於37℃、5%CO2 之條件下培養4小時。自培養4小時後之細胞回收培養上清液，以50 μL/孔添加含有10%胎牛血清之RPMI培養基，於37℃、5%CO2 之條件下進一步培養一晩。自培養24小時後之細胞回收培養上清液。
所獲得之培養上清液中之VEGF蛋白質量使用Human VEGE Quantikine ELISA(R＆D公司製造，目錄編號DVE00)，依照套組附帶之指南進行測定。將測定結果即定量之各培養上清液中之VEGF蛋白質濃度(ng/mL)記載於以下表中。
[表146] 由各化合物獲得之轉譯產物濃度
化合物名 上清液回收時間點 轉譯產物濃度(nM)
      核酸0.3 nM 核酸1 nM 核酸3 nM 核酸10 nM
RN 4 hr 0.21 0.26 1.20 1.73
RN' 4 hr 0.24 0.39 1.38 1.93
EN 4 hr 0.34 0.79 5.50 6.68
RN 24 hr 2.67 3.29 8.46 10.64
RN' 24 hr 3.05 3.91 9.23 11.12
EN 24 hr 3.94 10.51 54.81 62.74
由上述評估結果可知，具有糖部修飾之EN於添加至Hela細胞後，產生被基因序列編碼之VEGF蛋白質，其效率優於不具有糖部修飾之RN及RN'。 [序列表非關鍵文字]
序列編號1：化合物E1 序列編號2：化合物E1-1 序列編號3：化合物E1-2 序列編號4：模板DNA1 序列編號5：化合物E2 序列編號6：化合物E2-1 序列編號7：化合物E2-2 序列編號8：化合物E3 序列編號9：化合物E3-1 序列編號10：化合物E3-2 序列編號11：化合物E4 序列編號12：化合物E4-1 序列編號13：化合物E4-2 序列編號14：化合物R1 序列編號15：化合物R1-1 序列編號16：化合物R1-2 序列編號17：模板DNA2 序列編號18：化合物R2 序列編號19：化合物R2-1 序列編號20：化合物R2-2 序列編號21：化合物R3 序列編號22：化合物R3-1 序列編號23：化合物R3-2 序列編號24：模板DNA3 序列編號25：化合物R4 序列編號26：化合物R4-1 序列編號27：化合物R4-2 序列編號28：化合物R4-3 序列編號29：模板DNA4 序列編號30：化合物R5 序列編號31：化合物R5-1 序列編號32：化合物R5-2 序列編號33：化合物R6 序列編號34：化合物R6-1 序列編號35：化合物R6-2 序列編號36：化合物R7 序列編號37：化合物R7-1 序列編號38：化合物R7-2 序列編號39：化合物R8 序列編號40：化合物R8-1 序列編號41：化合物R8-2 序列編號42：化合物R9 序列編號43：化合物R9-1 序列編號44：化合物R9-2 序列編號45：化合物R10 序列編號46：化合物R10-1 序列編號47：化合物R10-2 序列編號48：化合物R11 序列編號49：化合物R11-1 序列編號50：化合物R11-2 序列編號51：化合物R12 序列編號52：化合物R12-1 序列編號53：化合物R12-2 序列編號54：化合物R13 序列編號55：化合物R13-1 序列編號56：化合物R13-2 序列編號57：化合物R14 序列編號58：化合物R14-1 序列編號59：化合物R14-2 序列編號60：化合物R15 序列編號61：化合物R15-1 序列編號62：化合物R15-2 序列編號63：化合物R16 序列編號64：化合物R16-1 序列編號65：化合物R16-2 序列編號66：化合物R17 序列編號67：化合物R17-1 序列編號68：化合物R17-2 序列編號69：化合物R17-3 序列編號70：模板DNA5 序列編號71：模板DNA6 序列編號72：化合物R18 序列編號73：化合物R18-1 序列編號74：化合物R18-2 序列編號75：RT引子 序列編號76：Fw引子 序列編號77：Rv引子 序列編號78：Taqman MGB探針 序列編號79～538：化合物E5～E248-1 序列編號539～542：轉譯產物多肽標準品 序列編號543：FW引子 序列編號544：RV引子1 序列編號545：5'末端多核苷酸序列RN-1 序列編號546：人工合成基因序列GN 序列編號547：模板DNA-A 序列編號548：RV引子2 序列編號549：序列引子M13FW 序列編號550：序列引子M13RV 序列編號551：5'末端多核苷酸序列RN'-1 序列編號552：人工合成基因序列GN' 序列編號553：模板DNA-B 序列編號554：EN-1 序列編號555：模板DNA-C 序列編號556：化合物RN及RN' 序列編號557：化合物EN
圖1係2個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸之轉譯區域之概略圖。 圖2係所有密碼子中之第1號核苷酸均為糖部修飾核苷酸之轉譯區域之概略圖。 圖3係所有密碼子中之第1號核苷酸、及終止密碼子中所含之3個核苷酸均為糖部修飾核苷酸之轉譯區域之概略圖。 圖4表示以化合物R1及化合物R17作為受質，使用PURExpress(註冊商標)進行之轉譯反應之西方墨點解析結果。各區帶如下所述(1-3：化合物R17)(各反應液中之濃度為1、3、5 μM)，4-6：化合物R1(各反應液中之濃度為1、3、5 μM)，7：無RNA，M：蛋白質大小標記(Precision Plus Protein Dual Extra Standards (BIORAD公司)))。圖左之數字表示蛋白質之分子量，箭頭表示所生成之轉譯產物。 圖5表示以化合物R2及化合物R18作為受質，使用RRL進行之轉譯反應之西方墨點解析結果。各區帶如下所述(1：無RNA，2：化合物R18(5 μg)，3：化合物R2(5 μg)，M：蛋白質大小標記(Precision Plus Protein Dual Extra Standards (BIORAD公司)))。圖左之數字表示蛋白質之分子量，箭頭表示所生成之轉譯產物。
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Claims (25)

  1. 一種多核苷酸，其 包含自起始密碼子至終止密碼子之轉譯區域， 上述轉譯區域包含n個密碼子，上述n為2以上之正整數， 上述n個密碼子分別包含第1號、第2號及第3號核苷酸， 上述n個密碼子中至少2個密碼子中之第1號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
  2. 如請求項1之多核苷酸，其中上述糖部修飾核苷酸包含至少2'位經修飾之糖部。
  3. 如請求項2之多核苷酸，其中 上述至少2'位經修飾之糖部係選自以下糖部： [化1]
    Figure 03_image053
    。
  4. 如請求項1至3中任一項之多核苷酸，其中上述糖部修飾核苷酸包含與選自由腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶所組成之群中之鹼基對應之鹼基部，且 上述鹼基之種類為至少2種。
  5. 如請求項1至4中任一項之多核苷酸，其中上述糖部修飾核苷酸之至少1個包含修飾鹼基部。
  6. 如請求項1至5中任一項之多核苷酸，其中上述n個密碼子中之所有第1號核苷酸均為糖部修飾核苷酸。
  7. 如請求項1至6中任一項之多核苷酸，其中上述終止密碼子之第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
  8. 如請求項1至7中任一項之多核苷酸，其中上述起始密碼子之第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
  9. 如請求項1至8中任一項之多核苷酸，其中上述n個密碼子中至少1個密碼子中之第2號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
  10. 如請求項1至9中任一項之多核苷酸，其中上述n個密碼子中至少1個密碼子中之第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
  11. 如請求項1至10中任一項之多核苷酸，其中上述n為2～2000之整數。
  12. 如請求項1至11中任一項之多核苷酸，其進而包含5'側非轉譯區域。
  13. 如請求項12之多核苷酸，其中 上述5'側非轉譯區域包含具有以下鹼基部之鹼基部修飾核苷酸， [化2]
    Figure 03_image055
    [式中，R為碳數1～6之烷基]。
  14. 如請求項12或13之多核苷酸，其中上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
  15. 如請求項12至14中任一項之多核苷酸，其進而包含5'端帽結構。
  16. 如請求項1至15中任一項之多核苷酸，其進而包含3'側非轉譯區域。
  17. 如請求項16之多核苷酸，其中上述3'側非轉譯區域包含聚A鏈。
  18. 如請求項16或17之多核苷酸，其中上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1號、第2號及第3號核苷酸為糖部修飾核苷酸。
  19. 如請求項12至18中任一項之多核苷酸，其中5'側非轉譯區域及/或3'側非轉譯區域包含糖部修飾核苷酸。
  20. 如請求項1至19中任一項之多核苷酸，其 包含以下結構： [化3]
    Figure 03_image057
    [式中， R1 及R2 分別獨立地表示H、OH、F或OCH3 ， B1 及B2 分別獨立地表示鹼基部， X1 表示O、S或NH， X2 表示O、S、NH或以下結構， [化4]
    Figure 03_image059
    X3 表示OH、SH或其等之鹽， 其中 X1 及X2 不同時為O]。
  21. 如請求項1至20中任一項之多核苷酸，其包含硫代磷酸酯結構。
  22. 如請求項1至21中任一項之多核苷酸，其中上述n個密碼子中至少1個密碼子中之第1號核苷酸與第2號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
  23. 如請求項1至22中任一項之多核苷酸，其中上述5'側非轉譯區域之自5'末端起第1～第2號核苷酸、第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
  24. 如請求項1至23中任一項之多核苷酸，其中上述3'側非轉譯區域之自3'末端起第1～第2號核苷酸、第1～第3號核苷酸、第1～第4號核苷酸、或第1～第5號核苷酸係藉由硫代磷酸酯連結。
  25. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至24中任一項之多核苷酸。
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