JP2004175708A - 二環性ナフチリジンヌクレオシド - Google Patents

Abstract

【課題】核酸の高次構造をより安定化しうる塩基対モチーフを形成するための新規ヌクレオシド誘導体を提供すること。
【解決手段】塩基対形成に関与しうる４個の水素結合性官能基を有するヌクレオシド類似体であって、式Ｉ：
【化１】

式ＩＩ：
【化２】

式ＩＩＩ：
【化３】

および式ＩＶ：
【化４】

からなる群より選択される構造を有するヌクレオシド類似体、ならびに該ヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチド。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ヌクレオシド誘導体、ならびに当該ヌクレオシド誘導体を組み込んだオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡは遺伝情報の担い手としてその保存、伝達を行なっている。ＤＮＡ二本鎖構造は主に、１）二組の相補的な塩基対（Ａ：Ｔ， Ｇ：Ｃ）による水素結合の形成、２）この塩基対の積み重なりによる隣接塩基対でのスタッキング相互作用、および３）親水性官能基、疎水性官能基間や周りの環境との間での相互作用により、二重らせん構造を形成し、その熱的安定性を維持している。またＤＮＡ二本鎖に見られるような相互作用はＤＮＡ−ＲＮＡや核酸−蛋白質間などの分子認識にも関与しており、生体内における様々な機能の調節や発現に深く関与している。
【０００３】
近年、核酸合成技術の進歩により様々な配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡが容易に合成可能となり、分子生物学の飛躍的な進歩がもたらされた。さらに非天然型の人工核酸が数多く開発され、アンチセンス法、アンチジーン法あるいはデコイ法をはじめとする核酸医薬品への応用が検討されている。このような用途に用いるために、これまでに多くの塩基部修飾ヌクレオシド誘導体が化学合成されＤＮＡ鎖に組み込んだ場合の諸性質が報告されている。例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらは下記に示すような種々のヌクレオシド類を合成し、これらがＤＮＡ鎖中、相補鎖のグアニン塩基との塩基対によってＤＮＡ二本鎖を安定化することを見い出している（Ｌｉｎ， Ｋ． Ｙ．； Ｊｏｎｅｓ， Ｒ． Ｊ．； Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， Ｍ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９５， １１７， ３８７３−３８７４， Ｌｉｎ，Ｋ． Ｙ．； Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， Ｍ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９８， １２０， ３５３１−３５３２）。
【化８】

【０００４】
Ｇ−クランプはグアニン塩基と４本の水素結合を形成し、１残基の導入によりＴｍ値を１８度も上昇させることが報告されており、現在、アンチセンス法への応用が検討されている。
【化９】

【０００５】
また、非天然型の塩基対モチーフを考案する試みとしては、Ｂｅｎｎｅｒらによってπ：κなどの塩基対モチーフが考案され、ジェネティック・アルファベットの拡張の試みが行なわれている（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ， Ｊ． Ａ．； Ｋｒａｕｃｈ， Ｔ．； Ｍｏｒｏｎｅｙ， Ｓ． Ｅ．；Ｂｅｎｎｎｅｒ， Ｓ． Ａ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９０， ３４３， ３３−３７， Ｌｅａｃｈ， Ａ． Ｒ．； Ｋｏｌｌｍａｎ， Ｐ． Ａ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９２， １１４， ３６７５−３６８３）。
【化１０】

【０００６】
一方、本発明者らは、これまでに４本の水素結合能を有する４種の三環性イミダゾピリドピリミジンヌクレオシド類（Ｉｍ−Ｎ^Ｎ， Ｉｍ−Ｏ^Ｏ， Ｉｍ−Ｎ^Ｏ， Ｉｍ−Ｏ^Ｎ）の合成を行なった（Ｋｏｊｉｍａ， Ｎ．； Ｕｅｎｏ， Ｙ．； Ｍｉｎａｋａｗａ， Ｎ．； Ｎ．Ｍａｔｓｕｄａ， Ａ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．， １９９７， ３７， ２３−２４）。
【化１１】

【０００７】
これらヌクレオシド類はＤＮＡオリゴマーに組み込んだ場合、Ｉｍ−Ｎ^Ｎ：Ｉｍ−Ｏ^Ｏ間およびＩｍ−Ｎ^Ｏ：Ｉｍ−Ｏ^Ｎ間でそれぞれ４本の水素結合による塩基対を形成し二本鎖構造を安定化する。
【化１２】

【０００８】
実際にこれら塩基対モチーフを組み込んだＤＮＡ二本鎖の熱的安定性を評価したところ、１塩基対のみの導入ではＤＮＡ二本鎖が不安定化することが分かった。さらに不連続で導入部位がふえると、その不安定化は増加した。ところが連続して３塩基対導入したところＤＮＡ二本鎖は極めて安定となり例えば、Ｉｍ−Ｏ^Ｎ：Ｉｍ−Ｎ^Ｏの塩基対導入では１塩基対あたり約６度安定化することが分かった。以上の結果から三環性イミダゾピリドピリミジンヌクレオシドは４本の水素結合および芳香環のひろがりによるスタッキング効果によってＤＮＡ二本鎖を熱的に安定化するが、同時にその塩基対導入部位前後の塩基対形成を妨げるためＤＮＡ二本鎖を不安定化させる効果もあわせもつと考えられた。１塩基対のみの導入ではその不安定効果が安定化効果を上回り、結果としてＤＮＡ二本鎖の熱的安定性が低下する（図１Ａ）。さらに不連続で導入箇所がふえるとその不安定効果は増加する（図１Ｂ）。一方、連続して３残基導入した場合では、導入部前後に生じる不安定化よりも安定化効果が相対的に大きくなり、全体としてＤＮＡ二本鎖の熱的安定性が増加したものと考えられる（図１Ｃ）。
【０００９】
したがって、当該技術分野においては、核酸の高次構造をより安定化しうる新規塩基対モチーフが求められている。
【００１０】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【非特許文献１】
Ｌｉｎ， Ｋ． Ｙ．； Ｊｏｎｅｓ， Ｒ． Ｊ．； Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， Ｍ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９５， １１７， ３８７３−３８７４
【非特許文献２】
Ｌｉｎ， Ｋ． Ｙ．； Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， Ｍ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９８， １２０， ３５３１−３５３２
【非特許文献３】
Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ， Ｊ． Ａ．； Ｋｒａｕｃｈ， Ｔ．； Ｍｏｒｏｎｅｙ， Ｓ． Ｅ．； Ｂｅｎｎｎｅｒ， Ｓ． Ａ． Ｎａｔｕｒｅ， １９９０， ３４３， ３３−３７
【非特許文献４】
Ｌｅａｃｈ， Ａ． Ｒ．； Ｋｏｌｌｍａｎ， Ｐ． Ａ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９２， １１４， ３６７５−３６８３
【非特許文献５】
Ｋｏｊｉｍａ， Ｎ．； Ｕｅｎｏ， Ｙ．； Ｍｉｎａｋａｗａ， Ｎ．； Ｎ．Ｍａｔｓｕｄａ， Ａ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．， １９９７， ３７， ２３−２４
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核酸の高次構造をより安定化しうる塩基対モチーフを形成するための新規ヌクレオシド誘導体、ならびにそのようなヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、塩基対形成に関与しうる４個の水素結合性官能基を有するヌクレオシド類似体であって、式Ｉ：
【化１３】

式ＩＩ：
【化１４】

式ＩＩＩ：
【化１５】

および式ＩＶ：
【化１６】

からなる群より選択される構造を有するヌクレオシド類似体を提供する。
【００１３】
ここで、水素結合性官能基とは、水素結合に関与しうる官能基および原子をいい、例えば、水素、第１、第２および第３アミンまたはアミドのＮ、芳香族性のＮ、カルボニルまたはカルボン酸のＯ、水分子のＨおよびＯ等が含まれるが、これに限定されない。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも１つの上述の本発明のヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明はまた、式ＩＩＩ：
【化１７】

で表されるヌクレオシド類似体を製造する方法を提供する。該方法は、式：
【化１８】

［式中、Ｒ_１は水酸基の保護基である］
で表される化合物を、パラジウムの存在下で式：
【化１９】

［式中、Ｒ_２はアミン基の保護基であり、Ｌは脱離基である］
で表される化合物と反応させ、次に脱保護することを含む。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の新規二環性ナフチリジンヌクレオシド類（Ｎａ−Ｎ^Ｎ， Ｎａ−Ｏ^Ｏ， Ｎａ−Ｎ^Ｏ， Ｎａ−Ｏ^Ｎ）は、核酸の高次構造をより安定化できる新規塩基対モチーフである。これら化合物は先の三環性イミダゾピリドピリミジンヌクレオシド同士の塩基対のようにＤＮＡ二本鎖に歪みを生じさせることなく４本の水素結合を形成し、ＤＮＡ二本鎖をさらに安定化させることができる。
【化２０】

【００１７】
本発明のヌクレオシド類似体は、４本の水素結合によって塩基対を形成する新規な塩基対モチーフであり、これをＤＮＡに組み込むことにより極めて有用な機能性人工核酸を創製することができる。したがって、二重らせん構造をはじめとする核酸の高次構造の調節および安定化をはかり、核酸医薬品への応用に有用である。例えば、先の三環性ヌクレオシドと組み合わせることにより、熱的に極めて安定なＤＮＡ二本鎖を得ることが出来、デコイ分子として利用できることが期待できる。またこのナフチリジン塩基は天然の核酸塩基とも塩基対を形成することが期待でき、アンチセンス分子としての利用も可能と考えられる。
【００１８】
さらにこの化合物は先の三環性ヌクレオシドと同様、蛍光性ヌクレオシドである。これら化合物が相補鎖側の核酸塩基によって異なる応答性をしめせばＳＮＰｓの検出法にも利用可能と考えられる。なおこのような塩基応答性蛍光ヌクレオシドとしてはＢＰＰや^ＢＤＡなどがＳａｉｔｏらのグループによって報告されている（Ｏｋａｍｏｔｏ， Ａ．； Ｔａｉｎａｋａ， Ｋ．； Ｓａｉｔｏ， Ｉ． 第１７回生体機能関連化学シンポジウム， ９０−９１， Ｏｋａｍｏｔｏ， Ａ．； Ｔａｎａｋａ， Ｋ； Ｆｕｋｕｔａ， Ｔ．； Ｓａｉｔｏ， Ｉ． 第１７回生体機能関連化学シンポジウム， ２７４−２７５）。
【化２１】

【００１９】
しかし、本発明では先の三環性ヌクレオシドとあわせて計８種類の蛍光ヌクレオシドが得られることから、より汎用性の高いＳＮＰｓ検出やハイブリダイゼーション検出の蛍光プローブとして用いることができる。
【００２０】
本発明のヌクレオシド誘導体は、以下のようにして合成することができる。
【００２１】
目的化合物であるナフチリジンヌクレオシド類はＣ−ヌクレオシドであり塩基部と糖部をそれぞれ構築した後、パラジウム触媒を用いるＣ−グリコシレーションを行ない合成する。
【００２２】
まず、糖部は文献記載の方法に従い、チミジンの糖部水酸基をＴＢＳ基で保護した後、ＨＭＤＳ、硫酸アンモニウムで処理してグリカール体２を得る（Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｒ． Ｓ．； Ｍａｄａｒａｓ， Ｍ． Ｌ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９９８， ６３， ５７００−５７０３）。その後、ＴＢＡＦで処理し、５位のＴＢＳ基を選択的に脱保護して化合物３とする（スキーム １）。
【化２２】

【００２３】
また、塩基部は文献記載の方法に従い、２，６−ジアミノピリミジンを硫酸中リンゴ酸と反応させ、アンモニア水で中和してナフチリジン誘導体４を得る（Ｎｅｗｋｏｍｅ， Ｇ． Ｒ．； Ｇａｒｂｉｓ， Ｓ． Ｊ．； Ｍａｊｅｓｔｉｃ， Ｖ． Ｋ．； Ｆｒｏｎｃｚｅｋ， Ｆ． Ｒ．； Ｃｈｉａｒｉ， Ｇ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９８１， ４６， ８３３−８３９）。その後、化合物４を当量のＮＩＳで処理し、アミノ基をジメチルアミジン基で保護し、６−位ヨード体５とする（スキーム ２）。
【化２３】

【００２４】
続いて、グリカール誘導体３とナフチリジン誘導体５とのＨｅｃｋ反応により化合物６とした後、ＴＢＡＦで処理し３’−位ケトン体７を得る。次にこれを還元し、ジメチルアミジン基を脱保護後、二環性ナフチリジンヌクレオシド （Ｎａ−Ｎ^Ｏ）を合成することができる（スキーム ３）（Ｚｈａｎｇ， Ｈ． Ｃ．； Ｄａｖｅｓ， Ｇ． Ｄ．， Ｊｒ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９９２， ５７， ４６９０−４６９６）。
【化２４】

【００２５】
すなわち、本発明はまた、式ＩＩＩ：
【化２５】

で表されるヌクレオシド類似体を製造する方法に関し、該方法は、式：
【化２６】

［式中、Ｒ_１は水酸基の保護基である］
で表される化合物を、パラジウムの存在下で式：
【化２７】

［式中、Ｒ_２はアミン基の保護基であり、Ｌは脱離基である］
で表される化合物と反応させ、次に脱保護することを含む。
【００２６】
式：
【化２８】

の化合物は、天然のヌクレオシド、例えばチミジンの３’−ＯＨを適当な保護基Ｒ_１で保護した後に、常法により塩基を除去することにより製造することができる。また、式：
【化２９】

の化合物は、２，６−ジアミノピリジンをリンゴ酸と反応させてナフチリジン環を形成し、次に、６位に適当な脱離基Ｌを導入するとともに、アミノ基を適当な保護基Ｒ_２で保護することにより製造することができる。
【００２７】
他の二環性ナフチリジンヌクレオシド（Ｎａ−Ｎ^Ｎ， Ｎａ−Ｏ^Ｏ， Ｎａ−Ｏ^Ｎ）についても同様な方法により合成することができる。
【００２８】
本発明のヌクレオシド類似体は、当該技術分野において知られる方法によりアミダイト体に変換して、オリゴヌクレオシド中に取り込ませることができる。具体的には、得られたＮａ−Ｎ^Ｏ体を、塩基部のアミノ基をジブチルアミジン基で保護して化合物９とした後、常法に従い５’−水酸基をジメトキシトリチル化し、続いて３’−位水酸基をホスホロアミダイト化によりアミダイト体１１へと変換する（スキーム ４）。得られたアミダイト体１１は、固相ホスホロアミダイト法に従って、ＤＮＡオリゴマーに導入することができる。
【化３０】

【００２９】
すなわち、別の観点においては、本発明は上述の二環性ナフチリジンヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。このようにして得られる本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プライマー、アプタマー、アンチジーン、プローブ等として、診断、治療および研究試薬として使用することができる。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは約６から約１００ヌクレオチドの長さである。本発明のより好適な実施態様においては、オリゴヌクレオチドは約１２から約２０ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、修飾された糖、例えば２’位に置換基を有する糖を含んでいてもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル以外の核酸塩基、例えばヒポキサンチン、５−アルキルシトシン、５−アルキルウラシル、５−ハロウラシル、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン等を含んでいてもよい。また、ホスホジエステル以外のヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエート結合を含んでいてもよい。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【００３１】
実施例１
３’，５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン （１）
Ａｒ雰囲気下、チミジン（９．７ ｇ， ４０．０ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５０ ｍＬ）に溶解し、イミダゾール（１３．６ ｇ， ２００．０ ｍｍｏＬ）、ＴＢＳＣｌ（１５．０ ｇ， １００．０ ｍｍｏＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル（６００ ｍＬ）に溶解し、水（２００ ｍＬ）で２回、飽和食塩水（２００ ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣を少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲルを加え減圧下乾固しシリカゲルに吸着させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ７．８ ｘ （１５．０＋３．０） ｃｍ， ヘキサン ： 酢酸エチル ＝ ３ ： １ ￣ １ ： １）で分離、精製して、化合物１（１８．６ ｇ， ３９．６ ｍｍｏｌ， ９９％）を白色固体として得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３） δ； ８．４４ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ， ＮＨ）， ７．４５ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−６， Ｊ_{６，５−Ｍｅ} ＝ １．３ Ｈｚ）， ６．３１ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−１’， Ｊ_{１’，２’ａ} ＝ ５．９， Ｊ_{１’，２’ｂ} ＝ ７．９ Ｈｚ）， ４．３８ （ｄｄｄ，１ Ｈ， Ｈ−３’， Ｊ_{３’，２’ａ} ＝ ２．６， Ｊ_{３’，２’ｂ} ＝ ５．９， Ｊ_{３’，４’} ＝ ５．２ Ｈｚ）， ３．９０ （ｄｄｄ， １Ｈ， Ｈ−４’， Ｊ_{４’，３’} ＝ ５．２， Ｊ_{４’，５’ａ} ＝ ２．６， Ｊ_{４’，５’ｂ} ＝ ２．０ Ｈｚ）， ３．８５ （ｄｄ， １ Ｈ，Ｈ−５’ａ， Ｊ_{５’ａ，４’} ＝ ２．６， Ｊ_{５’ａ．５’ｂ} ＝ １１．２ Ｈｚ）， ３．７３ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−５’ｂ， Ｊ_{５’ｂ，４’} ＝ ２．０， Ｊ_{５’ｂ，５’ａ} ＝ １１．２ Ｈｚ）， ２．２２ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−２’ａ， Ｊ_{２’ａ，１’} ＝ ５．９， Ｊ_{２’ａ，２’ｂ} ＝ １３．２， Ｊ_{２’ａ，３’} ＝ ２．６ Ｈｚ）， １．９７ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−２’ｂ， Ｊ_{２’ｂ，１’} ＝ ７．９， Ｊ_{２’ｂ，２’ａ} ＝ １１．２， Ｊ_{２’ｂ，３’} ＝ ５．９ Ｈｚ）， １．８９ （ｄ， ３ Ｈ， ５−Ｍｅ， Ｊ_{５−Ｍｅ，６} ＝ １．３ Ｈｚ），０．９１ ａｎｄ ０．８７ （ｅａｃｈ ｓ， ｅａｃｈ ９ Ｈ， ｔｅｒｔ−Ｂｕ）， ０．０９ （ｓ， ６ Ｈ， Ｍｅｘ２）， ０．０６ ａｎｄ ０．０５ （ｅａｃｈ ｓ， ｅａｃｈ ３ Ｈ， Ｍｅ）
【００３２】
実施例２
１，４−アンヒドロ−３，５−ビス−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デオキシ−Ｄ−エリスロ−ペント−１−エニトール（２）
化合物１（１０．３ ｇ， ２１．０ ｍｍｏｌ）をＨＭＤＳ（１００ ｍＬ）に溶解し、硫酸アンモニウム（５．５ ｇ， ４２．０ ｍｍｏｌ）を加え１３５℃で２時間加熱撹拌した。溶媒を留去し、残渣をヘキサン（３００ ｍＬ）に溶解し、水（１５０ ｍＬ）で２回、飽和食塩水（１５０ ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ４ ｘ ８ ｃｍ， ヘキサン ： エーテル ＝ ７ ： １）で分離、精製して、化合物２（５．３ ｇ， １５．０ ｍｍｏｌ， ７２％）を無色液状物質として得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３） δ； ６．４５ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−１， Ｊ_１，２ ＝ ２．６ Ｈｚ）， ４．９９ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−２， Ｊ_２，１ ＝ ２．６， Ｊ_２，３ ＝ ５．３ Ｈｚ）， ４．８４ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−３， Ｊ_３，２ ＝ ５．３， Ｊ_３，４ ＝ ２．６ Ｈｚ）， ４．２７ （ｄｔ， １ Ｈ， Ｈ−４， Ｊ_４，３ ＝ ２．６， Ｊ_４，５ａ ＝ Ｊ_４，５ｂ ＝ ５．９ Ｈｚ）， ３．６８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−５ａ， Ｊ_５ａ，４ ＝ ５．９， Ｊ_{５ａ，５ｂ} ＝ １０．６ Ｈｚ）， ３．４８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−５ｂ， Ｊ_５ｂ，４ ＝ ５．９， Ｊ_{５ｂ，５ａ} ＝ １０．６ Ｈｚ）， ０．８８ ａｎｄ ０．８７ （ｅａｃｈ ｓ， ｅａｃｈ ９ Ｈ， ｔｅｒｔ−Ｂｕ）， ０．０７ ａｎｄ ０．０５ （ｅａｃｈ ｓ， ｅａｃｈ ６ Ｈ， ｅａｃｈ Ｍｅｘ２）
【００３３】
実施例３
１，４−アンヒドロ−３−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デオキシ−５−ヒドロキシ−Ｄ−エリスロ−ペント−１−エニトール（３）
Ａｒ雰囲気下、化合物２（５．３ ｇ， １５．０ ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ ｍＬ）に溶解し、氷冷下ＴＢＡＦ（１５．７ ｍＬ， １５．７ ｍｍｏｌ）を滴下し、同温度にて１時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣を少量のエーテルに溶解し、シリカゲルを加え減圧下乾固しシリカゲルに吸着させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ４ ｘ （１０．０＋３．０） ｃｍ， ヘキサン ： エーテル ＝ ５ ： １ ￣ ３ ： １）で分離、精製して、化合物３（２．２ ｇ， ９．３ ｍｍｏｌ， ６２％）を無色液状物質として得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３） δ； ６．４７ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−１， Ｊ_１，２ ＝ １．９ Ｈｚ）， ５．０４ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−２， Ｊ_２，１ ＝ １．９， Ｊ_２，３ ＝ ５．３ Ｈｚ）， ４．７９ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−３， Ｊ_３，２ ＝ ５．３， Ｊ_３，４ ＝ ３．３Ｈｚ）， ４．３３ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−４， Ｊ_４，３ ＝ ３．３， Ｊ_４，５ａ ＝ ６．６， Ｊ_４，５ｂ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ３．６８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−５ａ， Ｊ_５ａ，４ ＝ ６，６， Ｊ_{５ａ，５ｂ} ＝ １１．２ Ｈｚ）， ３．６０ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−５ｂ， Ｊ_５ｂ，４ ＝ ７．３， Ｊ_{５ｂ，５ａ} ＝ １１．２ Ｈｚ）， ０．８８ （ｓ， ９ Ｈ， ｔｅｒｔ−Ｂｕ）， ０．０７ （ｓ， ６ Ｈ， Ｍｅｘ２）
【００３４】
実施例４
２−アミノ−７−ヒドロキシ−１，８−ナフチリジン（４）
２，６−ジアミノピリミジン（１１．０ｇ， ０．１０ ｍｍｏｌ）、リンゴ酸（１５．０ ｇ， ０．１１ ｍｍｏｌ）に氷冷下、硫酸（５０ ｍＬ）を加えた後、１１０℃で２時間加熱撹拌した。反応液に氷を加えアンモニア水で中和した。析出した沈澱をろ取し、水、エタノール、アセトンで洗浄して、化合物４（１４．５ ｇ， ０．０９ ｍｍｏｌ， ９０％）を黄褐色固体として得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ； １１．８６ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ， Ｈ−１）， ７．６３ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−４， Ｊ_４，３ ＝ ９．２ Ｈｚ）， ７．６２ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−５， Ｊ_５，６ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ７．０３ （ｓ， ２ Ｈ， Ｈ−４， ＮＨ_２）， ６．３３（ｄ， １ Ｈ， Ｈ−６， Ｊ_６，５ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ６．１０ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−３， Ｊ_３，４ ＝ ９．２ Ｈｚ）
【００３５】
実施例５
２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジノ）アミノ−７−ヒドロキシ−６−ヨード−１，８−ナフチリジン（５）
Ａｒ雰囲気下、化合物４（５．０ ｇ， ３１ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ ｍＬ）に懸濁し、ＮＩＳ（８．４ ｇ， ３７ ｍｍｏｌ）を加え２４時間撹拌した。沈澱をろ取し、ＤＭＦ、エタノール、アセトンで洗浄し、６−ヨード体と化合物４の混合物（１．３ ｇ， ６−ヨード体 ＝ ３．５ ｍｍｏｌ， ４
＝ １．４ ｍｍｏｌ）を黄褐色固体として得た。
Ａｒ雰囲気下、６−ヨード体と化合物４の混合物（５００ ｍｇ， ６−ヨード体 ＝ １．３０ ｍｍｏｌ， ４ ＝ ０．６０ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ ｍＬ）に懸濁し、１，１−ジメトキシトリメチルアミン（０．２８ ｍＬ， ２．１ ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で加熱撹拌した。１２時間後、１，１−ジメトキシトリメチルアミン（０．１２ ｍＬ， ０．９０ ｍｍｏｌ）を追加してさらに１２時間加熱撹拌した。反応液を放冷した後、沈澱をろ取し、得られた固体を少量のクロロホルム ：メタノール ＝ １ ： １の混合溶媒に溶解し、シリカゲルを加え減圧下乾固しシリカゲルに吸着させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ１．８ ｘ （１１．０＋３．０） ｃｍ， ０￣５％ ＥｔＯＨ ｉｎ ＣＨＣｌ_３）で分離、精製して、化合物５（３２７ ｍｇ， ０．９５ ｍｍｏｌ， ７３％）を黄色固体として得た。
ｍｐ ２４４−２４６ ℃
ＥＩ−ＭＳ （ＬＲ）： ｍ／ｚ ３４２ （Ｍ^＋）
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ； １２．０１ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ， ＮＨ）， ８．５０ （ｓ， １ Ｈ， ＣＨ）， ８．４９ （ｓ， １ Ｈ， Ｈ−５）， ７．７９ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−３， Ｊ_３，４ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ６．６７ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−４， Ｊ_４，３ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ３．１０ （ｓ， ３ Ｈ， Ｍｅ） ３．０２ （ｓ， ３ Ｈ， Ｍｅ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ； １６２．９５， １５９．７２， １５６．１１， １４９．６３， １４７．１６， １３６．４２， １１３．３７， １１０．５７， ９０．３０， ３４．４９
計算値：Ｃ_１１Ｈ_１１ＩＮ_４Ｏ： Ｃ， ３８．６２； Ｈ， ３．２４； Ｎ， １６．３８； Ｉ， ３７．０９．
実測値：Ｃ， ３８．４２； Ｈ， ３．３２； Ｎ， １５．９５； Ｉ， ３６．７２．
【００３６】
実施例６
６−（β−Ｄ−グリセロ−ペントフラン−３’−ウロス−１’−イル）−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジノ）アミノ−７−ヒドロキシ−１，８−ナフチリジン（７）
Ａｒ雰囲気下、酢酸パラジウム（０．０９ｇ ， ０．４ ｍｍｏｌ）、トリフェニルアルシン（０．２５ ｇ， ０．８ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ ｍＬ）に溶解し室温で２０分間撹拌した。Ａｒ雰囲気下、化合物５（１．３７ ｇ， ４．０ ｍｍｏｌ）、化合物３（１．０１ ｇ， ４．４ ｍｍｏｌ）、トリブチルアミン（１．１ ｍＬ， ４．５ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ ｍＬ）に溶解し、ここに先に調整したパラジウム溶液を加え、６０℃で３０時間加熱撹拌した。化合物６の生成をＴＬＣにて確認後、反応液を氷冷し酢酸（１．０ ｍＬ）を加え、続いてＴＢＡＦ（８．０ ｍＬ， ８．０ ｍｍｏｌ）を加え、同温度下で４５分間撹拌した。溶媒を留去し残渣を少量のメタノールに溶解し、シリカゲルを加え減圧下乾固しシリカゲルに吸着させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ３．０ ｘ （１３．０＋３．０） ｃｍ， ０￣１０％ ＭｅＯＨ ｉｎ ＣＨＣｌ_３）で分離、精製して、化合物７（１．０９ ｇ， ３．３ ｍｍｏｌ， ８２％）を黄色固体として得た。
ＦＡＢ−ＭＳ （ＬＲ）： ｍ／ｚ ３３０ （Ｍ^＋）
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ； ８．４９ （ｓ， １ Ｈ， ＣＨ）， ８．００ （ｓ， １ Ｈ， Ｈ−５）， ７．８４ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−４， Ｊ_４，３ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ６．７０ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−３， Ｊ_３，４ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ５．２１ （ｄｄ， １ Ｈ，Ｈ−１’， Ｊ_{１’，２’ａ} ＝ ６．０， Ｊ_{１’，２’ｂ} ＝ １０．６ Ｈｚ）， ４．９６ （ｓ， １ Ｈ， ＯＨ）， ４．０２ （ｍ， １ Ｈ， Ｈ−４’）， ３．７０ （ｍ， ２ Ｈ， Ｈ−５’ａ ａｎｄ Ｈ−５’ｂ）， ２．８５ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−２’ａ， Ｊ_{２’ａ，１’} ＝ ６．０， Ｊ_{２’ａ，２’ｂ} ＝ １８．５ Ｈｚ）， ２．３０ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｈ−２’ｂ， Ｊ_{２’ｂ，１’} ＝ １０．６， Ｊ_{２’ｂ，２’ａ} ＝ １８．５ Ｈｚ）
【００３７】
実施例７
２−アミノ−６−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−ヒドロキシ−１，８−ナフチリジン（Ｎａ−Ｎ^Ｏ）
Ａｒ雰囲気下、化合物７（１．０８ ｇ， ３．２６ ｍｍｏｌ）を氷冷し酢酸（５０ ｍＬ）とアセトニトリル（５０ ｍＬ）に溶解し、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３（１．０４ ｇ， ４．９ ｍｍｏｌ）を加え同温度下で１時間撹拌した。溶媒を留去し、メタノールで共沸した後、残渣を少量のメタノールに溶解し、シリカゲルを加え減圧下乾固しシリカゲルに吸着させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ３．０ ｘ （１３．０＋４．０） ｃｍ， ５￣２５％ ＭｅＯＨ ｉｎ ＣＨＣｌ_３）で分離、精製して、化合物８（１．１６ ｇ， ３．４ ｍｍｏｌ， ｑｕａｎｔ．）を黄色固体として得た。
化合物８（１．１６ ｇ， ３．４ ｍｍｏｌ）を少量のメタノールに懸濁し、スチール封管にとりメタノール性アンモニア（１００ ｍＬ）を加え、８０℃で２４時間加熱撹拌した。溶媒を留去し、残渣を少量のメタノールに溶解し、シリカゲルを加え減圧下乾固しシリカゲルに吸着させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ３．４ ｘ （１０．０＋２．０） ｃｍ， １０￣２５％ ＭｅＯＨ ｉｎ ＣＨＣｌ_３）で分離、精製して、化合物Ｎａ−Ｎ^Ｏ（０．６７ ｇ， ２．４ ｍｍｏｌ， ７２％）を黄色固体として得た。
ｍｐ ＞ ２８０℃
ＦＡＢ−ＭＳ （ＬＲ）： ｍ／ｚ ２７８ （Ｍ^＋）
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ； １１．７２ （ｂｓ ｓ， １ Ｈ， ＮＨ）， ７．６９ （ｓ， １ Ｈ， Ｈ−５）， ７．８４ （ｄ，１ Ｈ， Ｈ−４， Ｊ_４，３ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ６．７７ （ｓ， ２ Ｈ， ＮＨ_２）， ６．３３ （ｄ， １ Ｈ， Ｈ−３， Ｊ_３，４ ＝８．６ Ｈｚ）， ４．９８ （ｍ， ２ Ｈ， Ｈ−１’ ａｎｄ ＯＨ）， ４．７７ （ｍ， １ Ｈ， ＯＨ）， ４．１２ （ｍ， １ Ｈ， Ｈ−３’）， ３．７５ （ｍ， １ Ｈ， Ｈ−４’）， ３．４５ （ｍ， ２ Ｈ， Ｈ−５’ａ ａｎｄ Ｈ−５’ｂ）， ２．３１ （ｍ， １ Ｈ，Ｈ−２’ａ）， １．６５ （ｍ， １ Ｈ， Ｈ−２’ｂ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６） δ； １６２．１５， １５９．９５， １４９．２１， １３７．００， １３３．７３， １２７．５１， １０５．１２， １０４．６８， ８７．１２， ７４．６８， ７２．３２， ６２．４２， ４１．２２
計算値：Ｃ_１３Ｈ_１５Ｎ_３Ｏ_４・０．７２Ｈ_２Ｏ： Ｃ， ５３．８０； Ｈ， ５．７１； Ｎ， １４．４８．
実測値：Ｃ， ５３．６６； Ｈ， ５．３５； Ｎ， １４．３６．
【００３８】
実施例８
ＤＮＡ二本鎖の熱的安定性の測定
実施例７で得られた２−アミノ−６−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−ヒドロキシ−１，８−ナフチリジン（Ｎａ−Ｎ^Ｏ）を、塩基部のアミノ基をジブチルアミジン基で保護して化合物９とした後、常法に従い５’−水酸基をジメトキシトリチル化し、続いて３’−位水酸基をホスホロアミダイト化によりアミダイト体１１へと変換した（スキーム ４）。
【化３１】

【００３９】
得られたアミダイト体１１を、固相ホスホロアミダイト法に従ってＤＮＡオリゴマーに導入し、三環性イミダゾピリドピリミジンヌクレオシドＩｍ−Ｏ^Ｎを組み込んだＤＮＡオリゴマーを相補鎖として、ＤＮＡ二本鎖中での熱的安定性について評価した。その結果、Ｉｍ−Ｏ^Ｎ：Ｎａ−Ｎ^Ｏ塩基対を１塩基対導入した場合でも、三環性イミダゾピリドピリミジン同士の塩基対と異なり、ＤＮＡ二本鎖は極めて安定となり、Ｇ：Ｃ塩基対と比較して８．６度安定化することが分かった（図２Ａ）。また、連続して３塩基対導入した場合、Ｔｍ値は９５．７℃となり、ＤＮＡ二本鎖が２６．７℃安定化されることが明らかとなった。これは１塩基対あたり、８．９度の安定化であり、１塩基対導入した場合にも３塩基対導入した場合にもＤＮＡ二本鎖を安定化することができた（図２Ｂ）。
【００４０】
以上のことから、新規二環性ナフチリジンヌクレオシドは三環性イミダゾピリドピリミジンの相補塩基として機能し、ＤＮＡ二本鎖に歪みを生じさせることなく４本の水素結合を形成し、ＤＮＡ二本鎖をさらに安定化させることが明らかになった。
【００４１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、三環性イミダゾピリドピリミジンヌクレオシドを含むＤＮＡ二本鎖の模式図を示す。
【図２】図２は、本発明の二環性ナフチリジンヌクレオシドを含むＤＮＡと三環性イミダゾピリドピリミジンヌクレオシドを含むＤＮＡとの二本鎖の熱的安定性を示す。

Claims (3)

1. 塩基対形成に関与しうる４個の水素結合性官能基を有するヌクレオシド類似体であって、式Ｉ：
   

   

   式ＩＩ：
   

   

   式ＩＩＩ：
   

   

   および式ＩＶ：
   

   

   からなる群より選択される構造を有するヌクレオシド類似体。
2. 少なくとも１つの請求項１記載のヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチド。
3. 式ＩＩＩ：
   

   

   で表されるヌクレオシド類似体を製造する方法であって、式：
   

   

   ［式中、Ｒ_１は水酸基の保護基である］
   で表される化合物を、パラジウムの存在下で式：
   

   

   ［式中、Ｒ_２はアミノ基の保護基であり、Ｌは脱離基である］
   で表される化合物と反応させ、次に脱保護することを含む方法。

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