CN117769598A - 多核苷酸及医药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多核苷酸，其包含从起始密码子至终止密码子的翻译区、5’侧非翻译区、及多聚A链，构成所述多聚A链的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸。

Description

多核苷酸及医药组合物

技术领域

本发明涉及多核苷酸及包含所述多核苷酸的医药组合物。

背景技术

细胞中的遗传信息通过下述方式传递：以DNA为模板，利用RNA合成酶来转录信使RNA(以下，称为“mRNA”)；核糖体与经转录的单链mRNA结合，通过翻译而合成蛋白质。该传递形式在分子生物学中被称为“中心法则”，是原核生物及真核生物两者共通的基本原理。

作为遗传信息传递的中间物质的mRNA具有用于被核糖体直接识别且翻译成蛋白质的碱基序列信息和结构。

近年来，对核酸医药作为下一代医药的期待高涨。作为mRNA的人工多核苷酸(以下，在背景技术一栏中，称为“人工mRNA”)通过表达增强或表达亢进而产生所期望的肽及蛋白质，能够用作蛋白质补充疗法型核酸医药或疫苗疗法型核酸医药。

然而，已知若将仅由天然碱基构成的人工mRNA从外部导入细胞内，则因与细胞内的Toll样受体(TLR3、TLR7、TLR8、RIG-I等)结合而迅速引起免疫响应，导致炎症反应及蛋白质翻译量的下降(非专利文献1)。为了在细胞内表达蛋白质，需要设法以某种形式降低人工mRNA自身的免疫反应性、并且不使翻译量下降。另外，仅由天然碱基构成的RNA对于核酸分解酶脆弱，因此从赋予稳定性的观点考虑，也需要导入修饰核苷酸(非专利文献2)。修饰核苷酸中，包含2’-O-甲基修饰RNA、2’-F化RNA、2’-O-甲氧基乙基修饰RNA、LNA等交联型核酸等糖修饰核苷酸的多核苷酸显示在降低核酸医药的免疫反应性、赋予对核酸分解酶的耐受性方面均有效(非专利文献3)。

近年来，正积极进行如下研究：将利用体外转录法(in vitro transcription，以下，称为“IVT”)制作的人工mRNA用作药品(非专利文献4)。

在将人工mRNA作为药品的方面的也持续报道了一定的成果，例如，非专利文献5中报道在以黑色素瘤患者为对象的人工mRNA癌症疫苗的临床试验中，从开始施予癌症疫苗起转移发病率大幅减少。

然而，这些临床应用的人工mRNA通过IVT来制作。由IVT制作的人工mRNA存在以下2个问题。第一，出于降低免疫反应性、赋予对核酸分解酶的稳定性的目的而导入的修饰核苷酸的导入位置无法控制。专利文献1中公开了下述事例：就通过IVT而导入有2’-F化RNA的人工mRNA而言，肽翻译能力减弱·消失。第二，除了被IVT中使用的RNA合成酶识别为底物的修饰核苷酸以外，无法导入。另外，专利文献1中公开了包含2’-O-甲基修饰RNA的人工mRNA难以通过使用了通常RNA聚合酶的IVT反应来制备。

因此，就通过IVT导入修饰核苷酸而制作的人工mRNA而言，难以说对于修饰核苷酸的位置及种类进行了充分的研究。

报道了利用将多个RNA化学连结的技术来人工合成mRNA的方法(非专利文献6、7)。使用该方法时，能够将糖修饰核苷酸导入至包含翻译区及非翻译区的人工mRNA的任意位置。另外，专利文献2及3中公开了下述概念：通过使用将多个RNA化学连结的技术来合成人工mRNA的方法，在mRNA的非翻译区导入糖修饰核苷酸而稳定化。非专利文献6及7中公开了确认到在mRNA的翻译区中的一处导入了2’-O-甲基修饰RNA的人工mRNA的肽翻译能力。其另一方面，还公开了肽翻译能力由于糖修饰核苷酸的导入位置而显著减弱(非专利文献6及7)。

由此，为了作为人工mRNA核酸医药实现充分低的免疫反应性、高的稳定性和优异的翻译能力，与修饰核苷酸的修饰率、位置及种类相关的进一步知识是必要的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2014/093574号

专利文献2：国际公开第1999/014346号

专利文献3：国际公开第2016/022914号

非专利文献

非专利文献1：Nature Reviews Drug Discovery、第13卷、759-780页(2014)

非专利文献2：Nature Biotechnology、第35卷、第3号、238-248页(2017)

非专利文献3：Drug Discovery Today、第13卷、第19/20号、842-855页(2008)

非专利文献4：Nature Biotechnology、第35卷、第3号、193-197页(2017)

非专利文献5：Nature、第547卷、第7662号、222-226页(2017)

非专利文献6：Nucleic Acids Research、第44卷、第2号、852-862页(2015)

非专利文献7：Genes、第10卷、第2号、84页(2019)

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供具有优异的翻译能力的多核苷酸。

用于解决课题的手段

本申请的发明人进行了深入研究，结果发现构成3’-非翻译区中的多聚A链的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸时，显示出优异的翻译能力。

本发明包含以下的实施方式。

[1]多核苷酸，其包含：

从起始密码子至终止密码子的翻译区；

5’侧非翻译区；及

多聚A链，

构成上述多聚A链的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸。

[2]如[1]所述的多核苷酸，其中，构成上述多聚A链的核苷酸全部为糖修饰核苷酸。

[3]如[1]或[2]所述的多核苷酸，其中，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式1]

[4]如[1]～[3]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式2]

[5]如[1]～[4]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多聚A链包含至少一个磷酸修饰核苷酸。

[6]如[1]～[5]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多聚A链的自3’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

[7]如[1]～[6]中任一项所述的多核苷酸，其中，构成上述多聚A链的全部核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

[8]如[1]～[7]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多聚A链为2～40个碱基长度。

[9]如[1]～[8]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的核苷酸各自独立地选自2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子(spacer)修饰或糖修饰核苷酸。

[10]如[1]～[9]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的自5’末端起第1～6个核苷酸为糖修饰核苷酸，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部为以下的结构，

[化学式3]

[11]如[10]所述的多核苷酸，其在上述5’侧非翻译区的5’末端的5’侧还包含由1～10个糖非修饰核苷酸形成的部分。

[12]如[1]～[11]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的除了自5’末端起第1～6个核苷酸外的核苷酸包含2’-脱氧核糖核苷酸及/或间隔子修饰。

[13]如[1]～[12]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区及/或3’侧非翻译区包含间隔子修饰，优选地，上述5’侧非翻译区及/或3’侧非翻译区包含间隔子修饰，且上述间隔子修饰各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式4]

[式中，

Rx为乙炔基、氢原子或OH，

M为氢原子或OH，

n1为1、2或5，

n2为1、2或3。]。

需要说明的是，作为[13]中的间隔子修饰，最左边的结构中，5元环的氧原子可以被NH替换。

[14]如[1]～[13]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的自5’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

[15]如[1]～[14]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区包含碱基修饰核苷酸，上述碱基修饰核苷酸的修饰碱基部为以下的结构，

[化学式5]

[式中，R为碳原子数1～6的烷基。]。

[16]如[1]～[15]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含至少两个第1个核苷酸为糖修饰核苷酸的密码子。

[17]如[1]～[16]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含4个以上的密码子，全部密码子的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸。

[18]如[1]～[17]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区中，除了终止密码子外的全部密码子的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部为以下的结构，

[化学式6]

[19]如[1]～[18]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含2000个以下的密码子。

[19-1]如[1]～[19]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含4以上2000以下(4～2000)的密码子。

[20]如[1]～[19-1]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述终止密码子的全部核苷酸为糖修饰核苷酸。

[21]如[1]～[20]中任一项所述的多核苷酸，其包含以下的结构，

[化学式7]

[式中，

R¹及R²各自独立地为H、OH、F、OCH₂CH₂OCH₃或OCH₃，

B¹及B²各自独立地为碱基部，

X¹为O、S或NH，

X²为O、S、NH或以下的结构，

[化学式8]

X³为OH、SH或它们的盐，

其中，X¹及X²不同时为O]。

[22]医药组合物，其包含[1]～[21]中任一项所述的多核苷酸。

本发明还包含以下的实施方式。

[101]多核苷酸，其包含：

从起始密码子至终止密码子的翻译区；

5’侧非翻译区；及

多聚A链，

上述5’侧非翻译区的核苷酸各自独立地选自2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸。

[101-1]如[101]所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的核苷酸包含至少一个以上的糖修饰核苷酸。

[102]如[101]或[101-1]所述的多核苷酸，其中，构成上述多聚A链的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸，优选构成上述多聚A链的核苷酸全部为糖修饰核苷酸。

[103]如[101]～[102]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式9]

[104]如[101]～[103]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式10]

[105]如[101]～[104]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多聚A链包含至少一个磷酸修饰核苷酸。

[106]如[101]～[105]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多聚A链的自3’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

[107]如[101]～[106]中任一项所述的多核苷酸，其中，构成上述多聚A链的全部核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

[108]如[101]～[107]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多聚A链为2～40个碱基长度。

[109]如[101]～[108]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的自5’末端起第1～6个核苷酸为糖修饰核苷酸，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部为以下的结构，

[化学式11]

[110]如[109]所述的多核苷酸，其在上述5’侧非翻译区的5’末端的5’侧还包含由1～10个糖非修饰核苷酸形成的部分。

[111]如[101]～[110]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的除了自5’末端起第1～6个核苷酸外的核苷酸包含2’-脱氧核糖核苷酸及/或间隔子修饰。

[112]如[101]～[111]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区及/或3’侧非翻译区包含间隔子修饰，优选地，上述5’侧非翻译区及/或3’侧非翻译区包含间隔子修饰，且上述间隔子修饰各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式12]

[式中，

Rx为乙炔基、氢原子或OH，

M为氢原子或OH，

n1为1、2或5，

n2为1、2或3。]。

需要说明的是，作为[112]中的间隔子修饰，最左边的结构中，5元环的氧原子可以被NH替换。

[113]如[101]～[112]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的自5’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

[114]如[101]～[113]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区包含碱基修饰核苷酸，上述碱基修饰核苷酸的修饰碱基部为以下的结构，

[化学式13]

[式中，R为碳原子数1～6的烷基。]。

[115]如[101]～[114]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含至少两个第1个核苷酸为糖修饰核苷酸的密码子。

[116]如[101]～[115]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含4个以上的密码子，全部密码子的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸。

[116-1]如[101]～[116]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含4以上2000以下(4～2000)的密码子。

[117]如[101]～[116-1]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区中，除了终止密码子外的全部密码子的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部为以下的结构，

[化学式14]

[118]如[101]～[117]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含2000个以下的密码子。

[118-1]如[101]～[118]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含4～2000个密码子。

[119]如[101]～[118-1]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述终止密码子的全部核苷酸为糖修饰核苷酸。

[120]如[101]～[119]中任一项所述的多核苷酸，其包含以下的结构，

[化学式15]

[式中，

R¹及R²各自独立地为H、OH、F、OCH₂CH₂OCH₃或OCH₃，

B¹及B²各自独立地为碱基部，

X¹为O、S或NH，

X²为O、S、NH或以下的结构，

[化学式16]

X³为OH、SH或它们的盐，

其中，X¹及X²不同时为O]。

[121]

医药组合物，其包含[101]～[120]中任一项所述的多核苷酸。

作为与上述[1]～[22]不同的方式，本发明还包含以下的实施方式。

[201]多核苷酸，其包含：

从起始密码子至终止密码子的翻译区；

5’侧非翻译区；及

多聚A链，

构成上述多聚A链的核苷酸各自独立地选自2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸。

[201-1]如[201]所述的多核苷酸，其中，构成上述多聚A链的核苷酸包含至少一个以上的糖修饰核苷酸。

[202]如[201]或[202-1]所述的多核苷酸，其中，构成上述多聚A链的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸，优选构成上述多聚A链的核苷酸全部为糖修饰核苷酸。

[203]如[201]～[202]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式17]

[204]如[201]～[203]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式18]

[205]如[201]～[204]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多聚A链包含至少一个磷酸修饰核苷酸。

[206]如[201]～[205]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多聚A链的自3’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

[207]如[201]～[206]中任一项所述的多核苷酸，其中，构成上述多聚A链的全部核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

[208]如[201]～[207]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多聚A链为2～40个碱基长度。

[209]如[201]～[208]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的自5’末端起第1～6个核苷酸为糖修饰核苷酸，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部为以下的结构，

[化学式19]

[210]如[209]所述的多核苷酸，其中，在上述5’侧非翻译区的5’末端的5’侧还包含由1～10个糖非修饰核苷酸形成的部分。

[211]如[201]～[210]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的除了自5’末端起第1～6个核苷酸外的核苷酸包含2’-脱氧核糖核苷酸及/或间隔子修饰。

[212]如[201]～[211]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区及/或3’侧非翻译区包含间隔子修饰，优选地，上述5’侧非翻译区及/或3’侧非翻译区包含间隔子修饰，且上述间隔子修饰各自独立地选自以下的结构中的任一者、

[化学式20]

[式中，

Rx为乙炔基、氢原子或OH，

M为氢原子或OH，

n1为1、2或5，

n2为1、2或3。]。

需要说明的是，作为[212]中的间隔子修饰，最左边的结构中，5元环的氧原子可以被NH替换。

[213]如[201]～[212]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区的自5’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

[214]如[201]～[213]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述5’侧非翻译区包含碱基修饰核苷酸，上述碱基修饰核苷酸的修饰碱基部为以下的结构，

[化学式21]

[式中，R为碳原子数1～6的烷基。]。

[215]如[201]～[214]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含至少两个第1个核苷酸为糖修饰核苷酸的密码子。

[216]如[201]～[215]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含4个以上的密码子，全部密码子的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸。

[216-1]如[201]～[216]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含4以上2000以下(4～2000)的密码子。

[217]如[201]～[216-1]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区中，除了终止密码子外的全部密码子的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸，上述糖修饰核苷酸的修饰糖部为以下的结构，

[化学式22]

[218]如[201]～[217]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含2000个以下的密码子。

[218-1]如[201]～[218]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述翻译区包含4～2000个密码子。

[219]如[201]～[218-1]中任一项所述的多核苷酸，其中，上述终止密码子的全部核苷酸为糖修饰核苷酸。

[220]如[201]～[219]中任一项所述的多核苷酸，其包含以下的结构，

[化学式23]

[式中，

R¹及R²各自独立地为H、OH、F、OCH₂CH₂OCH₃或OCH₃，

B¹及B²各自独立地为碱基部，

X¹为O、S或NH，

X²为O、S、NH或以下的结构，

[化学式24]

X³为OH、SH或它们的盐，

其中，X¹及X²不同时为O]。

[221]医药组合物，其包含[201]～[220]中任一项所述的多核苷酸。

本发明还包含以下的实施方式。

[1A][1]～[21]、[101]～[120]及[201]～[220]中任一项所述的多核苷酸或者[22]、[121]及[221]中任一项所述的医药组合物，其用于治疗疾病。

[1B]治疗疾病的方法，其包括将治疗有效量的[1]～[21]、[101]～[120]及[201]～[220]中任一项所述的多核苷酸或者[22]、[121]及[221]中任一项所述的医药组合物向需要其的患者施予的步骤。

[1C][1]～[21]、[101]～[120]及[201]～[220]中任一项所述的多核苷酸或[22]、[121]及[221]中任一项所述的医药组合物用于治疗疾病的用途。

[1D][1]～[21]、[101]～[120]及[201]～[220]中任一项所述的多核苷酸在制造用于治疗疾病的医药中的用途。

[1E][1]～[21]、[101]～[120]及[201]～[220]中任一项所述的多核苷酸，其用于制造用于治疗疾病的医药。

[1F]用于疾病的治疗的试剂盒，其包含[1]～[21]、[101]～[120]及[201]～[220]中任一项所述的多核苷酸或者[22]、[121]及[221]中任一项所述的医药组合物、及使用说明书。

具体实施方式

＜多核苷酸＞

本发明的一实施方式中，多核苷酸包含：

从起始密码子至终止密码子的翻译区；

5’侧非翻译区；及

多聚A链，

构成上述多聚A链的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸。

本发明中，在多核苷酸中，构成多聚A链的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸，由此显示出优异的翻译能力。

本实施方式的多核苷酸包含翻译区、及多聚A链，优选从多核苷酸的5’侧至3’侧，排列5’侧非翻译区、翻译区、多聚A链，翻译区与多聚A链可以直接连结，在它们之间可以存在别的区域、不包含在多聚A链中的序列。所谓翻译区与多聚A链直接连结，是指多聚A链接着翻译区的终止密码子而结合，该情况下，3’侧非翻译区为多聚A链。

多聚A链存在于3’侧非翻译区内，多核苷酸包含5’侧非翻译区、翻译区、3’侧非翻译区。该情况下，多聚A链存在于3’侧非翻译区的3’末端。

从翻译区被翻译为多肽(本说明书中的“多肽”包含蛋白质)这样的方面考虑，本实施方式的多核苷酸可理解为具有与例如mRNA、小开放阅读框(small open reading frame，smORF)、非经典开放阅读框(non-canonical open reading frame)，长链非编码RNA(longnoncoding RNA(lncRNA))、pri-microRNA(pri-miRNA)同等功能的多核苷酸。

多核苷酸可以为单链多核苷酸，也可以是多核苷酸的末端彼此连结而成的环状的多核苷酸。

本实施方式的多核苷酸是多个核苷酸结合而成的，构成多核苷酸的各核苷酸通常包含糖部、碱基部及磷酸部。糖部是核苷酸中包含的与糖对应的部分，碱基部是核苷酸中包含的与碱基对应的部分，磷酸部是核苷酸中包含的与磷酸对应的部分。

通常，核苷酸中，碱基部选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)，糖部选自核糖或2’-脱氧核糖。核糖和2’-脱氧核糖各自优选为D体。

核苷酸由上述碱基部与上述糖部的组合形成，优选为具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)作为碱基部、具有D-核糖作为糖部的核糖核苷酸。

构成本实施方式的多核苷酸的核苷酸可以是作为非修饰核苷酸的核糖核苷酸(AUGC)，也可以是作为非修饰核苷酸的脱氧核糖核苷酸(ATGC)，还可以是在糖部、碱基部及磷酸部的至少一部分中具有不来源于非修饰核苷酸的结构的修饰核苷酸。

本说明书中，将修饰了糖部的核苷酸称为“糖修饰核苷酸”，将修饰了碱基部的核苷酸称为“碱基修饰核苷酸”，将修饰了磷酸部的核苷酸称为“磷酸修饰核苷酸”。本说明书中，“修饰”是指使糖部、碱基部或磷酸部的结构发生变化。由修饰带来的结构变化没有特别限定。作为修饰，例如，可举出任意取代基对任意部位的取代。

将具有修饰糖部、修饰碱基部或修饰磷酸部中的任一者的核苷酸称为修饰核苷酸，糖部、碱基部或磷酸部中均不具有修饰的核苷酸为非修饰核苷酸。

修饰核苷酸可以具有修饰糖部、修饰碱基部或修饰磷酸部中的1个修饰部，也可以具有任意组合的2种修饰部，还可以具有3种修饰部。

非修饰糖部为与核糖或2’-脱氧核糖对应的糖部，更优选为与核糖对应的糖部。即，在本实施方式的多核苷酸中，糖修饰核苷酸以外的核苷酸优选包含与核糖或2’-脱氧核糖对应的糖部，更优选包含与核糖对应的糖部。

(糖修饰核苷酸)

糖修饰核苷酸只要是核苷酸的糖部被修饰的物质即可，没有特别限定，优选包含至少2’位被修饰的糖部。通过修饰2’位，能够提高对酶的稳定性。至少2’位被修饰的糖部可以为2’位与4’位交联的糖部。

作为修饰糖部，例如，可举出以下的糖部。

[化学式25]

[式中，

M为R¹、OR¹、R²OR¹、SH、SR¹、NH₂、NHR¹、NR¹ ₂、N₃、CN、F、Cl、Br或I，

R¹各自独立地为烷基或芳基，优选为碳原子数1～6的烷基，更优选为碳原子数1～3的烷基，

R²为亚烷基，优选为碳原子数1～6的亚烷基]

需要说明的是，M为H或OH的情况是非修饰糖部，具有M为H的非修饰糖部的核苷酸为2’-脱氧核糖核苷酸，具有M为OH的非修饰糖部的核苷酸为核糖核苷酸。

本说明书中，作为碳原子数1～6的烷基，例如，可举出碳原子数1～6的直链或支链的烷基。作为碳原子数1～6的直链烷基，例如，可举出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及己基。作为碳原子数1～6的支链烷基，例如，可举出异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、及被甲基取代的戊基。

作为碳原子数1～3的烷基，例如，可举出甲基、乙基、丙基及异丙基。

本说明书中，作为芳基，例如，可举出可被取代的苯基、及可被取代的萘基。

本说明书中，碳原子数1～6的亚烷基是将碳原子数1～6的烷基的碳原子上所键合的氢原子去除1个而得的基团。

本说明书中，修饰糖部表示糖修饰核苷酸中包含的经修饰的糖结构。作为修饰糖部的M，此外也可举出：2-(甲氧基)乙氧基、3-氨基丙氧基、2-[(N,N-二甲基氨基)氧基]乙氧基、3-(N,N-二甲基氨基)丙氧基、2-[2-(N,N-二甲基氨基)乙氧基]乙氧基、2-(甲基氨基)-2-氧代乙氧基、2-(N-甲基氨基甲酰基)乙氧基)、及2-氰基乙氧基。

作为修饰糖部，此外，可举出以下的核酸的糖部：

·锁核酸(LNA)[Tetrahedron Letters,38,8735(1997)及Tetrahedron,54,3607(1998)]；

·亚乙基桥连核酸(ENA)[Nucleic Acids Research,32,e175(2004)]；

·约束型乙基(cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75,1569(2010)]；

·酰胺基桥连核酸(AmNA)[Chem Bio Chem 13,2513(2012)]；

·2’-O,4’-c-螺亚环丙基桥连核酸(scpBNA)[Chem.Commun.,51,9737(2015)]；

·三环DNA(tcDNA)[Nat.Biotechnol.,35,238(2017)]；

·解锁核酸(UNA)[Mol.Ther.Nucleic Acids 2,e103(2013)]；

·3’-氟己糖醇核酸(FHNA)[Nat.Biotechnol.,35,238(2017)]；

·肽核酸(PNA)[Acc.Chem.Res.,32,624(1999)]；

·氧基肽核酸(OPNA)[J.Am.Chem.Soc.,123,4653(2001)]；

·肽核糖核酸(PRNA)[J.Am.Chem.Soc.,122,6900(2000)]。

修饰糖部没有特别限定，优选选自以下的糖部。

[化学式26]

糖修饰核苷酸优选包含与选自由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)组成的组中的碱基对应的碱基部，上述碱基的种类优选为至少2种。此处，所谓“碱基的种类为至少2种”，例如是指1个糖修饰核苷酸包含与腺嘌呤对应的碱基部、另一糖修饰核苷酸包含与鸟嘌呤对应的碱基部。

糖修饰核苷酸可以为碱基修饰核苷酸及/或磷酸修饰核苷酸(换言之，糖修饰核苷酸可以还包含修饰碱基部及/或修饰磷酸部。)。糖修饰核苷酸的至少一个可以包含修饰碱基部。

(碱基修饰核苷酸)

碱基修饰核苷酸只要是核苷酸的碱基部被修饰的物质即可，没有特别限定。作为非修饰碱基部，例如，可举出与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶对应的碱基部。作为修饰碱基部，例如，可举出非修饰碱基部的氧原子被硫原子替换的碱基部、非修饰碱基部的氢原子被碳原子数1～6的烷基、卤素等取代的碱基部、非修饰碱基部的甲基被氢原子、羟基甲基、碳原子数2～6的烷基等替换的碱基部、非修饰碱基部的氨基被碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷酰基、氧代基、羟基等替换的碱基部。

作为碱基修饰核苷酸所具有的修饰碱基部的具体例，例如，可举出5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-氮尿嘧啶、6-氮胞嘧啶、6-氮胸腺嘧啶、5-假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-烷基硫代腺嘌呤、8-烷基硫代鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤、8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1,5-a]1,3,5三嗪酮、9-脱氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡嗪、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、哒嗪、及1,3,5-三嗪。

碱基修饰核苷酸可以为糖修饰核苷酸及/或磷酸修饰核苷酸(换言之，碱基修饰核苷酸可以还包含修饰糖部及/或修饰磷酸部。)。

(磷酸修饰核苷酸)

磷酸修饰核苷酸只要是核苷酸的磷酸部(磷酸二酯键)被修饰的物质即可，没有特别限定。作为修饰磷酸部，例如，可举出硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、膦酸烷基酯键、及氨基磷酸酯键。

翻译区可以包含修饰磷酸部为光学异构体(Rp,Sp)的磷酸修饰核苷酸。选择性地合成硫代磷酸酯键的光学异构体的方法例如公开于J.Am.Chem.Soc.,124,4962(2002)、Nucleic Acids Research,42,13546(2014)、及Science 361,1234(2018)中。

磷酸修饰核苷酸可以为糖修饰核苷酸及/或碱基修饰核苷酸(换言之，磷酸修饰核苷酸可以还包含修饰糖部及/或修饰碱基部。)。

＜翻译区＞

本实施方式的多核苷酸包含翻译区。翻译区也称为编码序列(CDS)。翻译区是由从起始密码子至终止密码子(或称为终结密码子)为止的多个密码子构成、并且被翻译而合成多肽的区域。密码子是编码构成多肽的各氨基酸的单元，上述单元由3个核苷酸构成。

本实施方式的多核苷酸中，一个多核苷酸可以包含多个翻译区，包含多个翻译区的多核苷酸中，含有一个翻译区的多核苷酸中的翻译区部分可以包含多个翻译区。

基于天然的密码子表时，作为起始密码子，例如，可举出编码蛋氨酸的AUG，但不限于天然的密码子表。作为AUG以外的非正规的起始密码子，也可举出CUG、GUG、UUG、ACG、AUC、AUU、AAG、AUA、AGG。作为终止密码子，例如，可举出UAA、UAG及UGA。构成翻译区的密码子的种类没有特别限定，可以根据目标多肽而适当选择。

构成翻译区的密码子的数目(n)优选为2～2000的整数，更优选为2～1500的整数，进一步优选为2～1000的整数，最优选为2～500的整数。另外，也可以将上述数值范围的下限变更为5、10、50、100、200等。下限被变更时的构成翻译区的密码子的数目(n)优选为5～2000、10～2000、50～2000、100～2000或200～2000的整数，更优选为5～1500、10～1500、50～1500、100～1500或200～1500的整数，进一步优选为5～1000、10～1000、50～1000、100～1000或200～1000的整数，最优选为5～500、10～500、50～500、100～500或200～500的整数。

构成翻译区的核苷酸的数目成为密码子的数目(n)的3倍数目。

各密码子包含第1个、第2个及第3个核苷酸。例如，起始密码子(AUG)的情况下，第1个核苷酸为A，第2个核苷酸为U，第3个核苷酸为G。

翻译区包含n个密码子，上述n为2以上的正整数，上述n个密码子各自包含第1个、第2个及第3个核苷酸的情况下，优选上述n个密码子中的至少两个密码子中的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸。

换言之，翻译区优选包含至少两个下述密码子，所述密码子中第1个核苷酸为糖修饰核苷酸，密码子中的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸的至少两个密码子可以为翻译区的任意位置的密码子。

由于即使对构成翻译区的多个密码子中的第1个核苷酸的糖部进行修饰也可维持翻译活性，因此，本实施方式的多核苷酸能够在翻译区具有修饰部位的同时还维持翻译活性。本说明书中，“翻译活性”是指mRNA被翻译而合成多肽的活性。另外，本实施方式的多核苷酸也具有对酶(例如核酸分解酶(核酸酶))的优异稳定性。

就本实施方式的多核苷酸而言，只要翻译区维持翻译活性，通过使构成多聚A链的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸，从而显示出优异的翻译能力。

本说明书中，所谓“维持翻译活性”，是指：多个密码子中的第1个核苷酸的糖部经修饰的多核苷酸与糖部未修饰的多核苷酸相比，具有60％以上的翻译活性。与未修饰多核苷酸相比，修饰多核苷酸的翻译活性优选为70％以上、80％以上、90％以上或100％以上。

本实施方式的多核苷酸中，构成翻译区的密码子所包含的第1个核苷酸中的至少两个可以为糖修饰核苷酸。包含糖修饰核苷酸的密码子的位置没有特别限定。第1个核苷酸为糖修饰核苷酸的比例优选为5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或100％。上述比例为100％是指第1个核苷酸全部为糖修饰核苷酸。上述比例越大，有对酶的稳定性越优异的倾向。可以第1个核苷酸全部为糖修饰核苷酸翻译区。第1个核苷酸为糖修饰核苷酸的情况下，第1个核苷酸的糖部的2’位取代基优选为氟，但没有特别限定。

本实施方式的多核苷酸中，构成翻译区的密码子所包含的第2个核苷酸中的至少1个可以为糖修饰核苷酸，第2个核苷酸的糖部可以不被修饰。第2个核苷酸为糖修饰核苷酸的比例可以为50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下、或0％。上述比例为0％是指第2个核苷酸的全部不是糖修饰核苷酸。第2个核苷酸为糖修饰核苷酸的情况下，第2个核苷酸的糖部的2’位取代基优选为氟，但没有特别限定。

本实施方式的多核苷酸中，构成翻译区的密码子所包含的第3个核苷酸中的至少1个可以为糖修饰核苷酸。第3个核苷酸为糖修饰核苷酸的比例可以为100％、90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下、或0％。

本实施方式的多核苷酸中，从提高翻译活性的观点考虑，终止密码子的第1个、第2个及第3个核苷酸可以为糖修饰核苷酸。可以是第1个核苷酸的全部、及终止密码子的核苷酸全部为糖修饰核苷酸的翻译区。

本实施方式的多核苷酸中，从提高对核酸分解酶的稳定性的观点考虑，起始密码子的第1个、第2个及第3个核苷酸可以为糖修饰核苷酸。优选起始密码子的第1个、第2个及第3个核苷酸的糖部的2’位取代基均为氟，但没有特别限定。

本实施方式的多核苷酸中，除了终止密码子外的剩余全部密码子中的第1个核苷酸可以为糖修饰核苷酸。优选除了终止密码子外的全部密码子的第1个核苷酸的糖部的2’位取代基均为氟，但没有特别限定。

翻译区可以包含碱基修饰核苷酸。翻译区中碱基修饰核苷酸所存在的位置没有特别限定。

翻译区可以包含磷酸修饰核苷酸。翻译区中磷酸修饰核苷酸所存在的位置没有特别限定，将密码子的第1个核苷酸与第2个核苷酸连结的磷酸基优选为硫代磷酸酯键。

＜5’侧非翻译区＞

本实施方式的多核苷酸包含5’侧非翻译区(5’UTR)。5’侧非翻译区是存在于翻译区的上游(5’末端侧)、不进行用于多肽合成的翻译的区域。构成5’侧非翻译区的核苷酸的数目优选为1以上，可以为6以上。另外，构成5’侧非翻译区的核苷酸的数目优选为1000以下，可以为500以下、250以下、100以下。

构成5’侧非翻译区的核苷酸的数目可以是从上述上限和下限选择的任意范围的数目，优选为1～1000的整数，更优选为1～500的整数，进一步优选为6～250的整数，特别优选为6～100的整数。

本实施方式的多核苷酸以5’侧非翻译区、翻译区的顺序连结。

5’侧非翻译区可以包含2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸。

这些核苷酸的位置只要在5’侧非翻译区内即可，没有特别限定。

从提高翻译活性的观点考虑，从5’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸可以为糖修饰核苷酸，优选从5’末端起第1～6个核苷酸全部为糖修饰核苷酸。

另外，5’侧非翻译区的全部核苷酸可以为糖修饰核苷酸。糖修饰核苷酸中，糖部的2’位的取代基优选为甲氧基乙氧基(OCH₂CH₂OCH₃)或氟(F)。

本发明的一实施方式为下述多核苷酸，所述多核苷酸包含：

从起始密码子至终止密码子的翻译区；

5’侧非翻译区；及

多聚A链，

上述5’侧非翻译区的核苷酸各自独立地选自2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸。

本发明中，在多核苷酸中，5’侧非翻译区的核苷酸各自独立地选自2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸，由此显示出优异的翻译能力。

5’侧非翻译区的核苷酸由2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸构成的情况下，优选包含糖修饰核苷酸。

本实施方式的多核苷酸还包含在原本的5’侧末端附加1～10个碱基长度的适当的非糖修饰核苷酸而成的多核苷酸。

(5’帽状结构)

本实施方式的多核苷酸可以在原本的5’侧末端还包含5’帽状结构。5’帽状结构可以以附加于5’侧非翻译区的形式存在。通过包含5’帽状结构，有翻译活性提高的趋势。

本申请中的5’帽状结构是指对7-甲基鸟苷酸(m7G)赋予三磷结构而成的、以下的结构。

[化学式27]

5’帽状结构中，除了上述7-甲基鸟苷酸(m7G)帽状以外，还可以使用以下的论文公开的这样的5’帽状类似物。

·ARCA：RNA、第7卷、1486-1495页(2001),Cell Cycle、第17卷、第13号、1624-1636页(2018)；

·LNA：Journal of American Chemical Society、第131卷、第18号、6364-6365页(2009)；

·S化Cap：RNA、第14卷、1119-1131页(2008)；

·Nature Reviews Drug Discovery、第13卷、759-780页(2014)。

5’侧非翻译区可以包含碱基修饰核苷酸。5’侧非翻译区中碱基修饰核苷酸所存在的位置没有特别限定。碱基修饰核苷酸可以为糖修饰核苷酸及/或磷酸修饰核苷酸(换言之，碱基修饰核苷酸可以还包含修饰糖部及/或修饰磷酸部。)。

从提高翻译活性的观点考虑，5’侧非翻译区优选包含以下的修饰碱基部，但没有特别限定。

[化学式28]

[式中，R为碳原子数1～6的烷基]

修饰碱基部的烷基R优选为甲基或乙基。

5’侧非翻译区可以包含磷酸修饰核苷酸。5’侧非翻译区中磷酸修饰核苷酸所存在的位置没有特别限定。磷酸修饰核苷酸可以为糖修饰核苷酸及/或碱基修饰核苷酸(换言之，磷酸修饰核苷酸可以还包含修饰糖部及/或修饰碱基部。)。

5’侧非翻译区可以包含2’-脱氧核糖核苷酸或间隔子修饰。5’侧非翻译区中2’-脱氧核糖核苷酸或间隔子修饰所存在的位置没有特别限定，优选除了从5’末端起第1～6个外的任意位置的核苷酸包含2’-脱氧核糖核苷酸或间隔子修饰。

本实施方式中，间隔子修饰不包含在翻译区中是优选的实施方式。

(间隔子修饰)

5’侧非翻译区中包含的间隔子修饰只要是不包含碱基部、作为核苷酸的替代使用的结构即可，没有特别限定，例如可举出以下的结构。

[化学式29]

[式中，

Rx为碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烯基、碳原子数1～6的炔基、氢原子或OH，

M为R¹、OR¹、R²OR¹、OR²OR¹、SH、SR¹、NH₂、NHR¹、NR¹ ₂、N₃、氢原子、OH、CN、F、Cl、Br或I，

X为O、S或NR¹，

R¹各自独立地烷基或芳基，优选为碳原子数1～6的烷基，更优选为碳原子数1～3的烷基，

R²为亚烷基，优选为碳原子数1～6的亚烷基，

n1及n2各自为1至10的整数]

需要说明的是，作为间隔子修饰，最左边的结构中，5元环的氧原子可以被NH替换。

关于作为间隔子修饰使用的结构，公开于以下的论文中。

·M.Takeshita,C.N.Chang,F.Johnson,S.Will,and A.P.Grollman,J.Biol.Chem.,1987,262,10171-10179.

·M.W.Kalnik,C.N.Chang,A.P.Grollman,and D.J.Patel,Biochemistry,1988,27,924-931.

·I.G.Shishkina and F.Johnson,Chem Res Toxicol,2000,13,907-912.

·K.Groebke,and C.J.Leumann,Helv Chim Acta,1990,73,608-617.

·T.Kuboyama,M.Nakahara,M.Yoshino,Y.Cui,T.Sako,Y.Wada,T.Imanishi,S.Obika,Y.Watanabe,M.Suzuki,H.Doi,Bioorg.Med.Chem.2011,19,249-255.

·M.Salunkhe,T.F.Wu,and R.L.Letsinger,J.Amer.Chem.Soc.,1992,114,8768-8772.

间隔子修饰没有特别限定，优选为以下的结构。

[化学式30]

[式中，

Rx为乙炔基、氢原子或OH，

M为氢原子或OH，

n1为1、2或5，

n2为1、2或3。]

＜多聚A链＞

本实施方式的多核苷酸包含多聚A链。

就本实施方式的一方式中的多聚A链而言，构成的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸。多聚A链包含在3’侧非翻译区中。

本实施方式中的多聚A链在3’侧非翻译区中包含至少1个以上。

多聚A链为由2个以上的AMP构成的多聚腺苷酸。

本申请中的AMP包含相当于AMP的核苷酸(例如，包含AMP的糖修饰核苷酸、AMP的2’-脱氧核糖核苷酸、AMP的磷酸修饰核苷酸及AMP的碱基修饰核苷酸)。以下，本申请中，将AMP或相当于AMP的核苷酸一并记载为AMP。

多聚A链只要具有包含2个以上AMP的多聚腺苷酸结构，则可以包含AMP以外的核糖核苷酸(例如，CMP、GMP、UMP或者与它们各自相当的核苷酸)。多聚A链包含AMP以外的核糖核苷酸的情况下，多聚A链的5’末端的核苷酸被理解为是2个以上AMP连续的序列的起点。

多聚A链包含AMP以外的核糖核苷酸的情况下，构成多聚A链的核苷酸之中，AMP以外的核糖核苷酸的比例为40％以下、30％以下、20％以下或10％以下，优选为30％以下，更优选为20％以下，进一步优选为10％以下。

就本实施方式的多核苷酸而言，多聚A链的核苷酸中，65％以上的核苷酸不是核糖核苷酸，也不是2’-脱氧核糖核苷酸。

作为多聚A链包含AMP以外的核糖核苷酸的事例，例如公开在Nature Medicine、第23卷、第7号、815-817页(2017)；Science、第361卷、701-704页(2018)；RNA、第25卷、507-518页(2019)中。

本说明书中，作为多聚A链而言，用任意的接头将存在于2处以上的、2个以上AMP连续的区域连结而成的序列也意指多聚A链。作为接头，例如，可举出聚乙二醇、多肽、烷基链等，没有特别限定。例如，国际公开第2016/011306号中公开了以特定的接头将核苷酸间连结的方法。

本实施方式的一方式中的多聚A链可以包含2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸。

这些核苷酸的位置只要在3’侧非翻译区内即可，没有特别限定。

就本方式的多聚A链而言，尽管也存在不包含AMP的情况，但也可适用与作为上述方式记载的多聚A链有关的记载。

多聚A链可以包含65％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％的2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸，多聚A链优选由2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸构成。

多聚A链的核苷酸由2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸构成的情况下，优选包含糖修饰核苷酸。多聚A链由2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸构成的情况下，糖修饰核苷酸可以为构成多聚A链的核苷酸的65％以上。

(3’侧非翻译区)

3’侧非翻译区(3’UTR)是存在于翻译区的下游(3’末端侧)、且不进行用于多肽合成的翻译的区域。构成3’侧非翻译区的核苷酸的数目优选为2～6000的整数，更优选为2～3000的整数，进一步优选为2～1000的整数，特别优选为2～500的整数。

3’侧非翻译区中的多聚A链以外的区域可以为任意的核苷酸，3’侧非翻译区的多聚A链以外的区域的各核苷酸可以为非修饰核苷酸，也可以为修饰核苷酸。

本实施方式的多核苷酸以翻译区、3’侧非翻译区的顺序连结。

多聚A链的长度优选为2～500个碱基长度，更优选为2～200个碱基长度，进一步优选为2～80个碱基长度，进一步优选为2～40个碱基长度，进一步优选为3～40个碱基长度，进一步优选为5～40个碱基长度，进一步优选为10～40个碱基长度，特别优选为20～40个碱基长度。

多聚A链中，构成的核苷酸的65％以上的核苷酸为糖修饰核苷酸。糖修饰核苷酸的位置只要是在多聚A链内即可，没有特别限定。

在多聚A链内，糖修饰核苷酸的比例优选为65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或100％。上述比例为100％是指多聚A链的核苷酸全部为糖修饰核苷酸。

多聚A链由2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸构成的情况下，优选包含糖修饰核苷酸。

多聚A链由2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰及糖修饰核苷酸构成的情况下，构成多聚A链的核苷酸之中，优选糖修饰核苷酸为50％以上、2’-脱氧核糖核苷酸为30％以下、间隔子修饰为20％以下。

多聚A链由2’-脱氧核糖核苷酸及糖修饰核苷酸构成的情况下，构成多聚A链的核苷酸之中，优选糖修饰核苷酸为50％以上、2’-脱氧核糖核苷酸为50％以下。

多聚A链由间隔子修饰及糖修饰核苷酸构成的情况下，构成多聚A链的核苷酸之中，优选糖修饰核苷酸为80％以上、间隔子修饰为20％以下。

从提高翻译活性的观点考虑，3’侧非翻译区的自3’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸可以为糖修饰核苷酸。优选自3’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸的糖部的2’位的取代基为甲氧基乙氧基(OCH₂CH₂OCH₃)，但没有特别限定。

作为糖修饰核苷酸的修饰糖部的具体例，例如，优选各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式31]

优选各自独立地选自以下的结构中的任一者。

[化学式32]

多聚A链可以包含碱基修饰核苷酸。多聚A链中碱基修饰核苷酸所存在的位置没有特别限定。碱基修饰核苷酸可以为糖修饰核苷酸及/或磷酸修饰核苷酸(换言之，碱基修饰核苷酸可以还包含修饰糖部及/或修饰磷酸部。)。

就3’侧非翻译区而言，优选可以在多聚A链以外的3’侧非翻译区包含2’-脱氧核糖核苷酸或间隔子修饰。作为间隔子修饰的具体结构，例如，可举出上述(5’侧非翻译区)的(间隔子修饰)的项目中记载的结构。

本实施方式的多核苷酸还包含在原本的3’侧末端附加1～10个碱基长度的适当的非糖修饰核苷酸而成的多核苷酸。

多聚A链可以包含磷酸修饰核苷酸。多聚A链中磷酸修饰核苷酸所存在的位置没有特别限定。磷酸修饰核苷酸可以为糖修饰核苷酸及/或碱基修饰核苷酸(换言之，磷酸修饰核苷酸可以包含修饰糖部及/或修饰碱基部。)。

多聚A链中包含的修饰磷酸部优选为硫代磷酸酯。多聚A链中以硫代磷酸酯连结的核苷酸所存在的位置优选从3’侧末端侧起连续。

多聚A链中的磷酸键之中，以硫代磷酸酯连结的核苷酸的比例为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或100％以上，优选为50％以上，更优选为80％以上，特别优选为100％。上述比例为100％是指多聚A链的全部核苷酸以硫代磷酸酯进行连结。

优选从本发明的多核苷酸的5’末端及/或3’末端起包含连续2个以上的磷酸修饰核苷酸，原因在于磷酸修饰核苷酸能够赋予对核酸内切酶(其为核酸降解酶之一)的稳定性。

(连结部)

本实施方式的多核苷酸可以包含以下的连结部。

[化学式33]

[式中，

R¹及R²各自独立地为H、OH、F、OCH₂CH₂OCH₃或OCH₃，

B¹及B²各自独立地为碱基部，

X¹为O、S或NH，

X²为O、S、NH或以下的结构，

[化学式34]

X³为OH、SH或它们的盐(X³的OH及SH可以分别表述为O-及S-)，

其中，X¹及X²不同时为O。]

碱基部可以为非修饰碱基部，也可以为修饰碱基部。

上述连结部中的左侧及右侧的核苷酸为构成本实施方式的多核苷酸的2个核苷酸。即使包含上述连结部，也能够维持翻译活性。上述连结部中的右侧(5’末端侧)的核苷酸A及左侧(3’末端侧)的核苷酸B、以及与上述核苷酸B邻接的3’末端侧的核苷酸C、及与上述核苷酸C邻接的3’末端侧的核苷酸D可以未被修饰。

作为上述连结部的X³的OH及SH的盐，例如，可举出制药学上可允许的盐。作为制药学上可允许的盐，例如，可举出碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、有机胺盐、及氨基酸盐。作为碱金属盐，例如，可举出钠盐、锂盐、及钾盐。作为碱土金属盐，例如，可举出钙盐、及镁盐。

作为上述连结部的具体例，例如，可举出以下的连结部。

[化学式35]

[式中，R¹、R²、B¹、B²、及X³如上所述]

上述连结部所存在的位置没有特别限定。连结部可以存在于翻译区、5’侧非翻译区、及3’侧非翻译区(包含多聚A链)中的任意位置，在存在连结部的情况下，优选连结部至少存在于翻译区。

上述连结部的数目没有特别限定，可以根据多核苷酸的长度来适当选择。作为连结部的数目，例如，可举出1～200个、1～100个、1～50个、1～20个、1～10个、1～8个、1～6个、1～4个、1～3个、或者1或2个。

本实施方式的多核苷酸中，构成翻译区的多个密码子中至少1个密码子中的第1个核苷酸与第2个核苷酸可以通过硫代磷酸酯连结。硫代磷酸酯键的数目没有特别限定，可以根据多核苷酸的长度来适当选择。作为硫代磷酸酯键的数目，例如，可举出1～200个、1～100个、1～50个、1～20个、1～10个、1～8个、1～6个、1～4个、1～3个、或者1或2个。

从提高翻译活性的观点考虑，5’侧非翻译区的自5’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸可以通过硫代磷酸酯连结。需要说明的是，所谓5’侧非翻译区的自5’末端起第1～2个核苷酸通过硫代磷酸酯连结，与5’侧非翻译区的自5’末端起第1个核苷酸与第2个核苷酸通过硫代磷酸酯连结的含义相同，所谓第1～3个核苷酸通过硫代磷酸酯连结，是指：第1个核苷酸与第2个核苷酸通过硫代磷酸酯连结，并且，第2个核苷酸与第3个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。第1～3个核苷酸通过硫代磷酸酯连结的情况下，第1个核苷酸的5’侧及第3个核苷酸的3’侧的结构可以为任意。

从提高翻译活性的观点考虑，3’侧非翻译区的自3’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸可以通过硫代磷酸酯连结。

从提高翻译活性的观点考虑，多聚A链的自3’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸可以通过硫代磷酸酯连结。另外，多聚A链的全部核苷酸可以通过硫代磷酸酯连结。

本发明的另一实施方式涉及多核苷酸，其中，5’侧非翻译区的自5’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸为糖修饰核苷酸。

本发明的另一实施方式涉及多核苷酸，其中，多聚A链的自3’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸为糖修饰核苷酸。

本发明的另一实施方式涉及多核苷酸，其中，5’侧非翻译区的自5’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸为糖修饰核苷酸，

多聚A链的自3’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸为糖修饰核苷酸。

本发明的另一实施方式涉及多核苷酸，其中，5’侧非翻译区的自5’末端起第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

本发明的另一实施方式涉及多核苷酸，其中，多聚A链的自3’末端起第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

本发明的另一实施方式涉及多核苷酸，其中，5’侧非翻译区的自5’末端起第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结，多聚A链的自3’末端起第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

本发明的另一实施方式涉及多核苷酸，其中，5’侧非翻译区的自5’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸为糖修饰核苷酸，5’侧非翻译区的自5’末端起第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

本发明的另一实施方式涉及多核苷酸，其中，多聚A链的自3’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸为糖修饰核苷酸，多聚A链的自3’末端起第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

本发明的另一实施方式涉及多核苷酸，其中，5’侧非翻译区的自5’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸为糖修饰核苷酸，5’侧非翻译区的自5’末端起第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结，

多聚A链的自3’末端起第1个、第2个及第3个核苷酸为糖修饰核苷酸，多聚A链的自3’末端起第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

本发明中，在记载为5’侧非翻译区、翻译区及多聚A链的各说明中，记载了示例的方式和优选的方式，但5’侧非翻译区、翻译区及多聚A链可以以各方式的任意组合存在，可以是5’侧非翻译区、翻译区及多聚A链中的任一个或二个中优选的方式的任意组合。另外，作为5’侧非翻译区、翻译区及多聚A链记载的以外的区域也可以从示例的方式及优选的方式适当组合。

即，本说明书中，记载为5’侧非翻译区、翻译区及多聚A链的各说明中的、示例的方式与优选的方式的所有组合作为本说明书中的方式被记载、示例。

(其他序列)

本实施方式的多核苷酸可以还包含Kozak序列及/或核糖体结合序列(RibosomeBinding sequence)(RBS)。

＜多核苷酸的制造方法＞

本实施方式的多核苷酸例如可通过化学合成而制造。具体而言，使用已知的化学合成法，在使多核苷酸链伸长的同时，于规定的位置导入规定的糖修饰核苷酸，由此能够制造本实施方式的多核苷酸。作为已知的化学合成法，例如，可举出亚磷酰胺法、硫代磷酸酯法、磷酸三酯法、及CEM法(参见Nucleic Acids Research,35,3287(2007))。另外，也可以利用ABI3900高通量核酸合成机(Applied Biosystems公司制)。

作为已知的化学合成法，更具体而言，可举出以下的文献等中记载的方法：

·Tetrahedron、第48卷、第12号、2223-2311页(1992年)；

·Current Protocols in Nucleic Acids Chemistry、John Wiley&Sons(2000年)；

·Protocols for Oligonucleotides and Analogs、Human Press(1993年)；

·Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids、Wiley-VCH(2012年)；

·基因化学利用人工核酸的科学方法(ゲノムケミストリー人工核酸を活用する科学的アプローチ)、讲谈社(2003年)；

·核酸化学的新趋势(核酸化学のニュートレンド)、化学同人(2011年)。

可以化学合成未市售的亚磷酰胺，使用其作为原材料来制造本实施方式的多核苷酸。

关于作为碱基修饰核苷酸的原材料的亚磷酰胺(f)的合成方法，如下所示。

[化学式36]

[合成路径中，R^a为氢原子、F、OCH₂CH₂OCH₃或OCH₃，R^b为例如二叔丁基甲硅烷基等能够被氟化物离子除去的保护基，R^c为碳原子数1～6的烷基，R^d为核酸固相合成中使用的保护基，例如为p,p’-二甲氧基三苯甲基。]

(工序A)

化合物(b)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在碱存在下，于0℃与80℃之间的温度，使化合物(a)与例如相应的甲硅烷基化剂反应10分钟至3天。

作为溶剂，例如可举出DMF、DMA、NMP等，这些单独使用或混合而使用。

作为碱，例如可举出咪唑、三乙胺、二异丙基乙基胺等。

作为甲硅烷基化剂，例如，可举出双(三氟甲磺酸)二叔丁基甲硅烷基酯等。

(工序B)

化合物(c)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在碱存在下，于0℃与150℃之间的温度，使化合物(b)与相应的烷基化剂反应10分钟至3天。通过适当的添加剂，也能够促进反应。

作为溶剂，例如可举出DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二氧杂环己烷、NMP等，可将这些单独使用或混合而使用。

作为碱，例如，可举出氢氧化钠水溶液、碳酸钾、吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二异丙基胺等。

作为烷基化剂，例如，可举出碘甲烷、碘乙烷、溴甲烷等。

作为添加剂，例如，可举出四丁基溴化铵。

(工序C)

化合物(d)可以通过下述方式制造：在溶剂中，于-80℃与200℃之间的温度，使化合物(c)与氟试剂反应10秒至72小时。此时，也可以加入碱。

作为氟试剂，例如可举出氟化氢、氢氟酸三乙胺盐、四丁基氟化铵(TBAF)等。

作为碱，例如，可举出三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺等。

作为溶剂，例如可举出二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二氧杂环己烷、DMF、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、NMP、二甲基亚砜(DMSO)等。

(工序D)

化合物(e)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在碱存在下，于0℃与150℃之间的温度，使化合物(d)与相应的烷基化剂反应10分钟至3天。通过适当的活化剂，也能够促进反应。

作为溶剂，例如可举出DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二氧杂环己烷、NMP等，可将这些单独使用或混合而使用。

作为碱，例如，可举出吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二异丙基胺、2,6-二甲基吡啶等。

作为烷基化剂，例如，可举出三苯氯甲烷、p,p’-二甲氧基三苯氯甲烷等。

作为活化剂，例如，可举出4-二甲基氨基吡啶等。

(工序E)

化合物(f)可通过下述方式制造：在溶剂中，在碱存在下，于0℃与100℃之间的温度，使化合物(e)与化合物(g)反应10秒至24小时。

作为溶剂，例如可举出二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二氧杂环己烷、DMF、NMP等，可将这些单独使用或混合而使用。

作为碱，例如，可举出三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺、吡啶等，可将这些单独使用或混合而使用。

5’帽状结构可以利用已知的方法(例如，酶法及化学合成法)而导入。作为已知的方法，例如，可举出Top.Curr.Chem.(Z)(2017)375:16、及Beilstein J.Org.Chem.2017,13,2819-2832中记载的方法。

本实施方式的多核苷酸的碱基长度长的情况下，可以将多个多核苷酸单元连结。连结方法没有特别限定，例如，可举出酶法及化学合成法。

作为基于酶法的连结，例如，可举出使用了连接酶的连结。作为连接酶，例如，可举出T4 DNA Ligase、T4 RNA Ligase1、T4 RNA Ligase2、T4 RNA Ligase2、truncated T4 RNALigase2、truncated KQ、E.Coli DNA Ligase、Taq.DNA Ligase等，可以将这些单独使用或混合而使用。酶法中，通常，优选的是构成多核苷酸的5’末端侧的多核苷酸单元(以下称为“5’末端侧多核苷酸单元”。)的3’末端的核苷酸A、构成多核苷酸的3’末端侧的多核苷酸单元(以下称为“3’末端侧多核苷酸单元”。)的5’末端的核苷酸B(连结的聚多核苷酸中，核苷酸A及B彼此邻接。)、与上述核苷酸B邻接的核苷酸C、和与上述核苷酸C邻接的核苷酸D未被修饰。另一方面，使用Molecular Cell,Vol.16,211-221,October 22,2004中记载的T4 RNAligase 2等的情况下，上述核苷酸A～D可以被修饰。

在基于酶法的连结中，为了利用分子推挤效应来促进连结反应，可以使用多分散聚乙二醇(PEG)。作为多分散PEG，例如，可举出PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为基于化学合成法的连结(也称为“化学连接”)，例如可举出如下所示这样在缩合剂的存在下将5’末端侧多核苷酸单元的3’末端(下述的右侧)与3’末端侧多核苷酸单元的5’末端(下述的左侧)缩合的方法。

[化学式37]

[式中，R¹、R²、B¹、B²及X³如前文所述，

X¹为O、S或NH，

X²为O、S、NH或以下的结构。]

[化学式38]

作为缩合剂，例如，可举出1,3-二环己烷碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(EDC)、羰基二咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻鎓六氟磷酸盐、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷鏻鎓六氟磷酸盐、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓、1H-咪唑-1-甲腈、1-氰基-1H-苯并咪唑、1-氰基-1H-苯并三唑。

上述缩合反应优选在包含下述核苷酸链的模板DNA的存在下实施，所述核苷酸链与5’末端侧多核苷酸单元的3’末端侧的核苷酸链及3’末端侧多核苷酸单元的5’末端侧的核苷酸链互补。模板DNA优选为与5’末端侧多核苷酸单元的自3’末端起优选2～50个碱基长度、更优选5～40个碱基长度的核苷酸链、以及3’末端侧多核苷酸单元的自5’末端起优选2～50个碱基长度、更优选5～40个碱基长度的核苷酸链互补的核苷酸链。此处，所谓“互补”，是指碱基序列的同一性例如为50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％。

在上述缩合反应中，可以加入添加剂。作为添加剂，例如，可举出1-羟基苯并三唑(HOBt)、及4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。

在上述缩合反应中，可以加入金属盐。作为金属盐，例如，可举出氯化锌(II)、溴化锌(II)、乙酸锌(II)、氯化镍(II)、氯化锰(II)等。

上述缩合反应可以在缓冲液的存在下实施。作为缓冲液，例如，可举出乙酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、及水。

上述缩合反应的温度没有特别限定，例如，可以为室温～200℃。上述缩合反应的时间没有特别限定，例如，可以为5分钟～100小时。

作为5’末端侧多核苷酸单元的3’末端(下述的右侧)、与3’末端侧多核苷酸单元的5’末端(下述的左侧)的缩合反应的具体例，例如，可举出以下的反应。

[化学式39]

[式中，R¹、R²、B¹、B²、及X³如前文所述，X⁴为脱离基团。]

作为脱离基团的具体例，例如，可举出氯基、溴基、碘基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三氟甲磺酰基。脱离基团没有特别限定，优选为氯基、溴基。

多核苷酸单元的连结可以根据目标多核苷酸的长度而重复多次。连结的次数没有特别限定，例如，可以为1～200次、1～100次、1～50次、1～20次、1～10次、1～8次、1～6次、1～4次、1～3次、或者1或2次。

以下示出作为连结中使用的5’末端侧多核苷酸单元的、化合物(M)及化合物(N)的制造方法。

[化学式40]

[式中，B^p为可被保护基保护的碱基，B为碱基，Polymer为固相支承体。R⁴为可选择性地脱保护的保护基，例如，为叔丁基二甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基，R³为核酸固相合成中使用的保护基，例如，表示p,p’-二甲氧基三苯甲基，X^a为核酸序列，Y^a及Y^b各自独立地为脱离基团，例如为卤素，优选为氯原子或溴原子。本说明书中，所谓核酸序列，是指各自与所结合的化合物一起形成核酸的、核酸中的部分结构。需要说明的是，分子中存在多个B的情况下，各个B可以相同，也可以不同。]

(工序1)

化合物(B)可以通过下述方式制造：在溶剂中，于60℃与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(A)反应10秒至3天。

作为溶剂，例如，可举出甲苯、二甲苯、1,2-二氯乙烷、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、1,2-二氯苯、水等，可以将这些单独使用或混合而使用。

化合物(A)例如可利用J.Am.Chem.Soc.(1999)，121，5661-5665.中记载的方法等来制造。

化合物(A)中的B^p没有特别限定，优选为下述结构中的任一者。

[化学式41]

R⁶为构成碱基的保护基的一部分的基团，例如，表示甲基、异丙基、可具有取代基的苯基等。作为可具有取代基的苯基中的取代基，例如，表示甲基、异丙基或叔丁基。

(工序2)

化合物(C)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在1～100当量的氧化剂的存在下，于0℃与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(B)与优选1～100当量的添加剂反应10秒至3天。

作为溶剂，例如，可举出氯仿、二氯甲烷等非质子性溶剂等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为氧化剂，例如，可举出琼斯试剂、铬酸、二铬酸吡啶鎓、四氧化钌、亚氯酸钠、戴斯-马丁(Dess-Martin)试剂等有机系氧化剂或氯铬酸吡啶鎓等无机系氧化剂等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为添加剂，例如，可举出吡啶、三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺等，可以将这些单独使用或混合而使用。

(工序3)

化合物(D)可以通过下述方式制造：在吡啶等溶剂中，在羟基胺盐酸盐的存在下，于0℃与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(C)反应10秒至3天。

(工序4)

化合物(E)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在1～100000当量的脱保护剂的存在下，于0℃与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(D)反应10秒至3天。

作为溶剂，例如，可举出甲苯、二甲苯、水等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为脱保护剂，例如，可举出三氟乙酸、三氯乙酸、乙酸、盐酸等，可以将这些单独使用或混合而使用。

(工序5)

化合物(F)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在还原剂的存在下，于0℃与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(E)反应10秒至3天。

溶剂例如可举出三氟乙酸、三氯乙酸、乙酸、盐酸、甲苯、二甲苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、甲醇、乙醇、1,4-二氧杂环己烷、水等，可以将这些单独使用或混合而使用。

还原剂例如可举出硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化锂、三乙酰氧基硼氢化钠等。

(工序6)

化合物(G)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在催化剂的存在下，在氢气氛下，于0℃与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(F)反应10秒至3天。

溶剂例如可举出三氟乙酸、乙酸、稀盐酸、甲醇、乙醇、异丙醇、水等，可以将这些单独使用或混合而使用。

催化剂例如可举出钯碳、钌碳等。

化合物(G)例如也可以利用国际公开第2017/123669号中记载的方法等来制造。

(工序7)

化合物(H)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在1～100当量的化合物(G’)及碱的存在下，于0℃与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(G)与优选1～1000当量的碱反应10秒至3天。

作为溶剂，例如，可举出甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、1,4-二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为碱，例如，可举出吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二异丙基胺、2,6-二甲基吡啶等，可以将这些单独使用或混合而使用。

化合物(G’)可以使用市售品。

(工序8)

化合物(I)可以通过下述方式制造：在吡啶等溶剂中，在根据需要加入的共溶剂的存在下，于0℃与100℃之间的温度，使化合物(H)与p,p’-二甲氧基三苯氯甲烷反应5分钟～100小时。

作为共溶剂，例如，可举出甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺、水等，这些可以单独使用或者混合而使用。

(工序9)

化合物(J)可以通过下述方式制造：在溶剂中，于0℃与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(I)与1～10当量的添加剂反应10分钟至10天。

作为溶剂，例如，可举出二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二氧杂环己烷、DMF、DMA、NMP等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为添加剂，例如可举出四丁基氟化铵、三乙胺三氢氟酸盐等，可以将这些单独使用或混合而使用。

(工序10)

化合物(K)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在1～30当量的碱存在下，于室温与200℃之间的温度，使化合物(J)与琥珀酸酐反应5分钟～100小时。

作为溶剂，例如，可举出甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、水等，这些可以单独使用或者混合而使用。

作为碱，例如，可举出碳酸铯、碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、吡啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)等，可以将这些单独使用或混合而使用。

(工序11)

化合物(L)可以通过下述方式制造：在无溶剂的条件下或在溶剂中，在1～30当量的碱、缩合剂及根据需要加入的0.01～30当量的添加剂的存在下，于室温与200℃之间的温度，使化合物(K)与末端经氨基化的固相支承体反应5分钟～100小时后，在乙酸酐/吡啶溶液中，于室温与200℃之间的温度，反应5分钟～100小时。

作为溶剂，可举出工序4中示例的溶剂。

作为碱，例如，可举出碳酸铯、碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、吡啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为缩合剂，例如，可举出1,3-二环己烷碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(EDC)、羰基二咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻鎓六氟磷酸盐、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻鎓六氟磷酸盐、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)

-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)

-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓等。

作为添加剂，例如，可举出1-羟基苯并三唑(HOBt)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为固相支承体，只要使用在进行固相合成的方面已知的经氨基化的固相支承体即可，没有特别限定，例如，可举出经长链烷基氨基修饰的CPG(可控多孔玻璃，controlledpore glass)、PS(聚苯乙烯树脂，polystyrene resign)等固相支承体。

例如，长链烷基胺细孔性玻璃(LCAA-CPG)可以使用市售品。

(工序12)

化合物(M)可以通过下述方式制造：使用化合物(L)，利用已知的寡核苷酸化学合成法，将对应的核苷酸链伸长，然后进行自固相的脱离、保护基的脱保护及纯化。

自固相的脱离、脱保护可以通过下述方式进行：在化学合成寡核苷酸后，在溶剂中或无溶剂的条件下，于-80℃至200℃之间的温度，用碱处理10秒至72小时。

作为碱，例如，可举出氨、甲基胺、二甲基胺、乙基胺、二乙胺、异丙基胺、二异丙基胺、哌啶、三乙胺、乙二胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)、碳酸钾等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为溶剂，例如，可举出水、甲醇、乙醇、THF等，可以将这些单独使用或混合而使用。

寡核苷酸的纯化可以通过C18反相柱或阴离子交换柱、优选上述2个方法的组合来进行。

纯化后的核酸复合体纯度优选为90％以上，更优选为95％以上。

(工序13)

化合物(N)可以通过下述方式制造：使用化合物(M)，在缓冲液中，在1～1000当量的化合物(O)的存在下，于室温与100℃之间的温度，反应5分钟～100小时。

作为缓冲液，例如，可举出乙酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、水等，可以将这些单独使用或混合而使用。

化合物(O)可以使用市售品。

关于作为连结中使用的3’末端侧多核苷酸单元的、化合物(W)的制造方法，如下所示。

[化学式42]

[式中，B^p为可被保护基保护的碱基，B为碱基，R⁷为保护基，例如为叔丁基二甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基，Y^c为例如氯原子、溴原子、甲苯磺酸酯基，X^b为核酸序列。需要说明的是，分子中存在多个B的情况下，各个B可以相同，也可以不同。]

(工序14)

化合物(Q)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在添加剂及碱的存在下，于0℃与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(P)反应10秒至3天。

作为溶剂，例如，可举出二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二氧杂环己烷、DMF、DMA、NMP等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为添加剂，例如，可举出甲苯磺酸酐、甲苯磺酰氯、亚硫酰氯、草酰氯等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为碱，例如，可举出吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二异丙基胺、碳酸钾等，可以将这些单独使用或混合而使用。

化合物(P)可以使用市售品。

(工序15)

化合物(R)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在叠氮化剂和根据需要加入的碱的存在下，于室温与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(Q)反应10秒至3天。

作为溶剂，例如，可举出二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二氧杂环己烷、DMF、DMA、NMP等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为叠氮化剂，例如，可举出叠氮化钠等。

作为碱，例如，可举出吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二异丙基胺、碳酸钾等，可以将这些单独使用或混合而使用。

(工序16)

化合物(S)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在甲硅烷基化剂和碱的存在下，于室温与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(R)反应10秒至3天。

作为溶剂，例如，可举出二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二氧杂环己烷、DMF、DMA、NMP等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为甲硅烷基化剂，例如，可举出叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐、三乙基氯硅烷等。

作为碱，例如，可举出吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二异丙基胺、碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、吡啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)等，可以将这些单独使用或混合而使用。

(工序17)

化合物(T)可以通过下述方式制造：在溶剂中，加入还原剂，于室温与所使用的溶剂的沸点之间的温度，使化合物(S)反应10秒至3天。

作为溶剂，例如，可举出甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺、乙酸、水等，这些可以单独使用或者混合而使用。

作为还原剂，例如，可举出硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化锂、三乙酰氧基硼氢化钠、氢气氛下的钯碳等。

(工序18)

化合物(U)可以使用化合物(T)、与工序7同样地制造。

(工序19)

化合物(V)可以通过下述方式制造：在溶剂中，在碱存在下，于0℃与100℃之间的温度，使化合物(U)与化合物(AA)反应10秒至24小时。

作为溶剂，例如，可举出二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二氧杂环己烷、DMF、NMP等，可以将这些单独使用或混合而使用。

作为碱，例如，可举出三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺、吡啶等，可以将这些单独使用或混合而使用。

化合物(AA)可以使用市售品。

(工序20)

化合物(W)可以使用化合物(V)、与工序12同样地制造。

将多个多核苷酸单元连结来制造本实施方式的多核苷酸的情况下，可以包含一部分由IVT制造的多核苷酸单元。将由IVT制造的多核苷酸连结的方法没有特别限定，例如，可举出上述的酶法及化学合成法。作为使用IVT来制造多核苷酸单元的方法，可举出使用RNA聚合酶从具有启动子序列的模板DNA转录RNA的方法。作为已知的IVT，更具体而言，可举出以下的文献等中记载的方法。

·RNA,Methods in Moleculer Biology(Methods and Protocols))、第703卷、第3章(2011年)；

·Cardiac Gene Therapy:Methods in Moleculer Biology(Methods andProtocols)、第1521卷、第8章(2016年)；

·Journal ofMolecular Biology、第249卷、398页～408页(1995)。

作为IVT中使用的模板DNA，例如可举出通过化学合成而制造的DNA、通过聚合酶链式反应而制造的DNA、质粒DNA、利用限制性内切酶使质粒DNA线性化而制造的DNA等，可以将这些单独使用或混合而使用。作为RNA聚合酶，可举出T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶等，可以将这些单独使用或混合而使用。转录时使用的核糖核苷三磷酸可以被修饰，也可以混合多种核糖核苷三磷酸而使用。可以如Cardiac Gene Therapy:Methods inMoleculer Biology(Methods and Protocols)、第1521卷、第8章(2016年)中记载的这样，使用m7G(5’)ppp(5’)G(TriLink公司制，目录号S1404)、Anti Reverse Cap Analog,3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G(TriLink公司制，目录号N-7003)等化合物来赋予5’Cap结构。可以如Journal of Molecular Biology、第249卷、398页～408页(1995)中记载这样，通过预先向模板DNA中插入丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus，HDV)核酶等序列，从而在转录后将RNA的5’末端、3’末端切断。

＜医药组合物＞

本发明的一个实施方式涉及包含上述多核苷酸的医药组合物。通过向具有疾病的患者施予本实施方式的医药组合物，从而多核苷酸被翻译，合成上述多核苷酸所编码的多肽，治疗上述疾病。

本发明提供针对特征在于特定的蛋白质的功能或活性丧失或异常的疾病的治疗方法，其通过利用自上述多核苷酸翻译来的多肽来弥补其功能、活性，但无特别限定。或者，还提供治疗方法，其通过利用自上述多核苷酸翻译来的多肽使外来的抗原肽及其相关物在生物体内表达，从而人工控制免疫响应。另外，也提供治疗方法，其通过利用自上述多核苷酸翻译来的多肽使转录因子等生物体中的特定蛋白质或生物体中原本不存在的多肽在生物体中表达，也可人为地控制、改变细胞的功能、分化、增殖等，由此，针对特征在于组织、细胞损伤、或者其功能、活性下降或异常的疾病，使组织、细胞的功能恢复。

作为疾病，例如可举出癌及增殖性疾病、感染病及寄生虫病、血液及造血系统疾病、自身免疫疾病、内分泌，营养及代谢疾病(包括先天性代谢异常症)、精神、神经系统疾病、皮肤及皮下组织疾病、眼科疾病、耳科疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、肾泌尿生殖系统疾病、心血管疾病、脑血管疾病、肌肉骨骼系统及结缔组织疾病、流产、围产期疾病、先天畸形、后天损伤、及中毒等，但无特别限定。

医药组合物可以以规定的制剂形态施予。作为制剂，例如，可举出用于经口施予或非经口施予的液体剂型，作为液体剂型，例如，可举出药学上可允许的乳剂、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆剂、及酏剂。液体剂型除了包含活性成分外，还可以包含本技术领域中通常使用的非活性的稀释剂(例如，水或其他溶剂)、增溶剂及乳化剂(例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽、花生类、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻及芝麻的油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇及山梨醇酐的脂肪酸酯、以及这些混合物)。经口施予用的制剂可以包含佐剂(例如，湿润剂、乳化剂及悬浮化剂)、甜味料、香味料、及着香剂中的至少任一者。非经口施予用的制剂可以包含增溶剂(例如，Cremophor(注册商标)、醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物、及它们的组合)。

作为医药组合物的施予方法，例如，可举出淋巴节局部施予、肿瘤内局部施予、肌肉内施予、皮内施予、皮下施予、气管内施予、脊椎内施予、脑室内施予、眼内施予、鼓室内施予、向冠动脉的导管施予、向肝门静脉的导管施予、向心肌的导管施予、经尿道的导管施予及静脉内施予。

医药组合物除了包含上述多核苷酸外，还可以包含任选成分。作为任选成分，例如，可举出选自溶剂、水性溶剂、非水性溶剂、分散介质、稀释剂、分散物、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、脂质、类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、核壳型纳米粒子、聚合物、脂质复合物(lipoplexe)、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、及这些混合物中的1种以上的药学上可允许的添加剂。

实施例

以下，使用实施例及参考例来更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不限于此。

化合物的合成中使用的试剂使用从Sigma-Aldrich公司、东京化成工业株式会社、和光纯药工业株式会社、关东化学株式会社购入的试剂而不经纯化。无水溶剂通过在经活化的分子筛4A上干燥12小时来制备、或使用市售的无水级溶剂。反应的跟踪通过薄层硅胶色谱(Silicagel70F254 TLC Plate-Wako,和光纯药工业株式会社)进行。化合物的纯化使用快速色谱用硅胶60N(球状，中性，粒径40～50μm))关东化学株式会社)。NMR以氘代溶剂(CDCl₃,CD₃OD,DMSO-d₆)(关东化学株式会社)为测定溶剂、使用JEOL ECS 400MHz(日本电子株式会社)测定。取得的NMR的数据分析使用JEOL Delta(日本电子株式会社)作为软件进行，化学位移值使用氘代溶剂中的残留信号(CDCl₃：7.26,CD₃OD：3.31,DMSO-d₆：2.50)(Organometallics 2010,29,2176-2179)进行校正。¹H NMR的数据以化学位移值(δ)、积分值(H)、信号的分裂形式、偶合常数(Hz)的形式记载(s：Singlet,d：Doublet,t：Triplet,sept.：Septet,m：Multiplet,br.：Broad)。高分辨率质谱使用micrOTOF-QII ESI(BrukerDaltonics公司)进行测定，以ESI TUNING MIX(Agilent Technologies公司)作为内部标准进行精密质量的校正。

作为多核苷酸的原料的、化合物12的合成按照下述路径进行合成。

[化学式43]

工序1化合物4的合成

N-(9-((2R,3S,4S,5R)-3-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)-4-羟基-四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺

使用由文献记载的方法(J.Am.Chem.Soc.,1999,121,5661-5665)等得到的化合物3，使其溶解于1,2-二氯苯(2.0mL)中，在油浴上(160℃)搅拌4小时。将反应液恢复至室温后，在不进行浓缩的情况下利用快速柱色谱(中性硅胶，二氯甲烷/甲醇＝40：1)纯化，以白色固体的形式得到化合物4(0.31g，收率53％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.01(1H,s),8.50(1H,s),8.07(1H,s),5.86(1H,d,J＝6.0Hz),4.47(1H,s),4.24-4.23(1H,m),4.22-4.21(1H,m),3.93(1H,dd,J＝11.6,2.0Hz),3.82(1H,dd,J＝11.6,2.0Hz),2.66(1H,sept.,J＝6.8Hz),1.27(3H,d,J＝6.8Hz),1.25(3H,d,J＝6.8Hz),0.93(9H,s),0.82(9H,s),0.13(3H,s),0.12(3H,s),-0.07(3H,s),-0.20(3H,s)

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ179.0,155.7,148.5,148.7,147.8,136.8,121.0,87.4,85.4,77.6,71.8,63.6,36.2,25.9,25.4,19.1,18.7,18.3,17.8,-5.3,-5.4,-5.5,-5.6

ESI-HRMS：calcd for C₂₆H₄₈N₅O₆Si₂ 582.31[M+H]⁺,found：582.31[M+H]⁺

工序2化合物5的合成

N-(9-((2R,3S,5S)-3-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)-4-(羟基亚氨基)-四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺

向铬酸(129mg,1.29mmol)的无水二氯甲烷(2.0mL)溶液中加入分子筛3A(粉末状)(258mg)，在冰浴上冷却。在搅拌下，向该溶液中滴加无水吡啶(207μL,1.29mmol)，在冰浴上搅拌。30分钟后，滴加乙酸酐(122μL,1.29mmol)，在冰浴上搅拌。30分钟后，滴加化合物4(250mg,0.43mmol)的二氯甲烷(1.3mL)溶液，于室温搅拌2小时。通过薄层色谱确认原料的消失后，利用乙酸乙酯将反应液稀释，用二氧化硅垫(2cm厚)进行过滤，将滤液减压浓缩，得到无色固体。该粗产物4’直接用于下一反应。

向粗产物4’(0.43mmol)的吡啶(4mL)溶液中加入羟胺盐酸盐(299mg,4.30mmol)，于室温搅拌。24小时后，将反应液减压浓缩，向残余物中加入水，用乙酸乙酯萃取。用饱和食盐水对有机层进行清洗，在无水硫酸钠上干燥。将有机层减压浓缩，用快速柱色谱(中性硅胶，二氯甲烷/甲醇＝40：1)将残余物纯化，以白色固体的形式得到化合物5(255mg,两步的收率为68％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.14(1H,s),9.27(1H,s),8.78(1H,s),8.11(1H,s),5.78(1H,d,J＝7.6Hz),5.09(1H,s),4.92(1H,d,J＝7.2Hz),4.14(1H,d,J＝11.4Hz),3.92(1H,d,J＝11.4Hz),2.79-2.74(1H,m),1.27-1.21(6H,m),0.91(9H,s),0.71(9H,s),0.10(3H,s),0.07(3H,s),-0.10(3H,s),-0.23(3H,s)

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ178.9,157.8,155.6,148.7,147.8,136.8,120.8,87.5,86.5,62.2,36.3,25.9,25.5,25.2,19.1,18.8,18.3,18.0,-5.0,-5.5,-5.6,-5.7

ESI-HRMS：calcd for C₂₆H₄₇N₆O₆Si₂ 595.31[M+H]⁺,found：595.31[M+H]+

工序3化合物6的合成

N-(9-((2R,3S,5S)-3-(叔丁基二甲基硅氧基)-4-(羟基亚氨基)-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺

向化合物5(129mg,0.22mmol)中加入经冰冷却的90％三氟乙酸水溶液(1.0mL)，在冰浴上搅拌30分钟。将反应液减压浓缩，在甲苯与水(1：1，v/v)中，将得到的残余物在减压下共沸3次。利用快速柱色谱(中性硅胶，二氯甲烷/甲醇＝50：1至40：1)将得到的残余物纯化，以白色固体的形式得到化合物6(96mg，收率92％)。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.36(1H,s),5.87(1H,d,J＝7.6Hz),5.18(1H,dd,J＝7.6,2.0Hz),5.02(1H,d,J＝2.0Hz),4.11(1H,dd,J＝12.0,2.0Hz),3.92(1H,d,J＝12.0,2.0Hz),2.71(1H,sept.,J＝7.2Hz),1.21(6H,d,J＝7.2Hz),0.72(9H,s),0.00(3H,s),-0.16(3H,s)

¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ181.8,157.4,156.8,151.0,150.0,139.8,121.3,88.4,79.7,76.5,61.6,36.9,25.9,19.4,19.2,-4.5,-5.5

ESI-HRMS：calcd forC₂₀H₃₂N₆NaO₆Si 503.21[M+Na]⁺,found：503.20[M+Na]⁺

工序4化合物7的合成

N-(9-((2R,3S,4S,5S)-4-氨基-3-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺

向化合物6(93mg,0.19mmol)的乙酸(1.9mL)溶液中加入硼氢化钠(15mg,0.38mmol)，于室温搅拌1小时。通过薄层色谱确认原料的消失后，将反应液减压浓缩，使残余物溶解于乙酸乙酯中，用饱和食盐水进行清洗，在无水硫酸钠上干燥。将有机层减压浓缩，利用快速柱色谱(中性硅胶，二氯甲烷/甲醇＝20：1)将得到的残余物纯化，以白色固体的形式得到化合物7(51mg，收率55％)。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.34(1H,s),6.06(1H,d,J＝6.0Hz),4.75(1H,t,J＝6.4Hz),4.27(1H,d,J＝2.8Hz),3.86(1H,dd,J＝12.4,2.0Hz),3.73(1H,d,J＝12.4,2.0Hz),3.62-3.60(1H,m),2.71(1H,sept.,J＝6.8Hz),1.21(6H,d,J＝6.8Hz),0.82(9H,s),-0.02(3H,s),-0.23(3H,s)

¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ181.8,157.4,150.8,149.8,139.6,139.4,121.1,89.7,84.5,77.7,65.4,65.2,36.9,26.0,-5.2,-5.3

ESI-HRMS：calcd for C₂₀H₃₅N₆O₆Si 483.24[M+H]⁺,found：483.23[M+H]⁺

工序5化合物8的合成

N-(9-((2R,3S,4S,5S)-4-氨基-3-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺

向化合物7(50mg,0.10mmol)的90％乙酸水溶液(1.5mL)中加入10％钯碳(20mg)，在氢气氛下，于室温搅拌18小时。通过薄层色谱确认原料的消失后，利用甲醇将反应液稀释，通过硅藻土过滤，将钯碳除去。将滤液减压浓缩，用快速柱色谱(中性硅胶，二氯甲烷/甲醇＝15：1至10：1)将得到的残余物纯化，以白色固体的形式得到化合物8(作为乙酸盐，为41mg，收率75％)。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.32(1H,s),5.99(1H,s),4.60(1H,s),3.95-3.68(4H,m),2.73(1H,br.s),1.22(6H,br.s),0.05(3H,s),-0.06(3H,s)

ESI-HRMS：calcd for C₂₀H₃₄N₆NaO₅Si 489.2258[M+Na]⁺,found：489.2231[M+Na]⁺

工序6化合物9的合成

N-(9-((2R,3S,4R,5S)-3-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-(羟基甲基)-4-(2,2,2-三氟乙酰氨基)-四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺

向文献已知(WO2017/123669)的化合物8(40mg,0.076mmol)和三乙胺(45L,0.38mmol)的甲醇溶液(0.76mL)溶液中加入三氟乙酸乙酯(0.76mL)，于室温搅拌24小时。通过薄层色谱确认原料的消失后，对反应液进行减压浓缩，利用快速柱色谱(中性硅胶，二氯甲烷/甲醇＝20：1至12：1)将得到的残余物纯化，以白色固体的形式得到化合物9(12mg，收率28％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.26(1H,s),10.11(1H,s),7.76(1H,s),7.26(1H,d,J＝3.6Hz),5.71(1H,d,J＝3.6Hz),4.98(1H,dd,J＝6.8Hz),4.78(1H,dd,J＝6.8,3.6Hz),4.21(1H,d,J＝6.8Hz),4.03(1H,dd,J＝11.2Hz),3.82(1H,dd,J＝11.2Hz),2.79(1H,sept.,J＝6.8Hz),1.26(3H,d,J＝6.8Hz),1.24(3H,d,J＝6.8Hz),0.85(9H,s),-0.01(3H,s),-0.11(3H,s)

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ179.8,158.0,157.7,157.3,156.9,155.2,148.3,147.3,138.6,122.0,120.0,117.1,114.2,111.3,91.6,83.7,74.5,61.3,51.0,36.1,25.2,18.9,17.7,-5.0,-5.4

ESI-HRMS：calcd for C₂₂H₃₃F₃N₆NaO₆Si 585.21[M+Na]⁺,found：585.21[M+Na]⁺

工序7化合物10的合成

N-(9-((2R,3S,4R,5S)-5-((双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)甲基)-3-(叔丁基二甲基硅氧基)-4-(2,2,2-三氟乙酰氨基)-四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺

向化合物9(10mg,0.017mmol)的无水吡啶(1mL)溶液中加入二甲氧基三苯基氯(18mg,0.053mmol)，于室温搅拌1.5小时。然后追加二甲氧基三苯基氯(18mg,0.053mmol)，于室温搅拌30分钟。通过薄层色谱确认原料的消失后，向反应液中加入甲醇(1mL)，然后减压浓缩。使残余物溶解于乙酸乙酯中，用水进行清洗，接着用饱和食盐水进行清洗。在无水硫酸钠上使有机层干燥，进行减压浓缩，用快速柱色谱(中性硅胶，己烷/乙酸乙酯＝5：1至2：1)将得到的残余物纯化，以白色固体的形式得到化合物10(15.2mg，收率99％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.99(1H,s),10.11(1H,s),8.07(1H,s),7.81(1H,s),7.45(2H,dd,J＝8.2,2.0Hz),7.32(4H,dd,J＝9.2,3.6Hz),7.24-7.29(3H,m),7.01(1H,d,J＝7.2Hz),6.76(4H,J＝9.2,3.6Hz),5.71(1H,d,J＝4.2Hz),5.16(1H,dd,J＝6.4,4.2Hz),4.20-4.17(1H,m),3.76(3H,s),3.75(3H,s),3.56(1H,dd,J＝11.2,2.8Hz),3.22(1H,dd,J＝11.2,2.8Hz),1.82(1H,d,J＝6.8Hz),0.97(3H,d,J＝6.8Hz),0.68(9H,s),0.79(3H,d,J＝6.8Hz),0.04(3H,s),-0.06(3H,s)

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ171.2,158.7,158.0,157.6,157.2,156.8,155.4,147.6,147.2,144.8,139.2,135.9,135.4,130.0,127.9,127.1,122.6,120.0,117.0,114.1,111.2,90.1,86.3,81.7,73.4,62.4,60.4,55.2,51.4,36.1,25.4,18.4,17.8,-5.0,-5.3

ESI-HRMS：calcd for C₄₃H₅₂F₃N₆O₈Si 865.36[M+H]⁺,found：865.35[M+H]⁺

工序8化合物11的合成

N-(9-((2R,3S,4S,5S)-5-((双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)甲基)-3-羟基-4-(2,2,2-三氟乙酰氨基)-四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺

向化合物10(14mg,0.016mmol)的四氢呋喃(1mL)溶液中加入四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，19μL,0.019mmol)，于室温搅拌1小时。通过薄层色谱确认原料的消失后，将反应液减压浓缩。用快速柱色谱(中性硅胶，二氯甲烷/甲醇＝30：1至15：1)将得到的残余物纯化，以白色固体的形式得到化合物11(10.8mg，收率83％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ12.12(1H,br.s),8.76(1H,br.s),7.74(1H,s),7.81(1H,s),7.68(1H,d,J＝5.4Hz),7.48(2H,d,J＝7.6Hz),7.37(2H,d,J＝9.2Hz),7.34(2H,d,J＝9.2Hz),7.25-7.21(2H,m),7.17(1H,t,J＝7.2Hz),6.81(2H,d,J＝9.2Hz),6.78(2H,d,J＝9.2Hz),5.80(1H,d,J＝4.0Hz),5.35(1H,br.s),5.08(1H,dd,J＝12.4,6.4Hz),4.30-4.29(1H,m),3.76(3H,s),3.74(3H,s),3.57-3.53(1H,m),3.29-3.26(1H,m),1.84-1.57(1H,m),0.94(3H,d,J＝6.8Hz),0.68(3H,d,J＝6.8Hz)

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ179.4,158.6,158.4,158.0,157.6,157.3,147.8,147.2,144.8,139.4,136.3,135.7,130.1,129.9,128.1,128.0,127.0,121.0,120.0,117.1,114.2,111.3,91.2,86.1,82.5,71.5,62.7,55.1,51.2,35.9,18.5,18.2

ESI-HRMS：calcd for C₃₇H₃₈F₃N₆O₈ 751.27[M+H]⁺,found：751.27[M+H]⁺

工序9化合物12的合成

向化合物11(0.90g,1.20mmol)、三乙胺(0.42mL,3.0mmol)的乙腈(12mL)溶液中加入琥珀酸酐(0.24g,2.40mmol)、二甲基氨基吡啶(29mg,0.24mmol)，于室温搅拌1小时。通过薄层色谱确认原料的消失后，将反应液减压浓缩。使残余物溶解于乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠水溶液清洗2次，接着用饱和食盐水进行清洗。使有机层在无水硫酸钠上干燥，进行减压浓缩。在二氯甲烷/甲醇溶液(1：1,v/v)中，对残余物进行基于减压浓缩的共沸操作，由此得到白色泡状固体(作为三乙胺盐为1.11g，97％)。该化合物12直接用于下一反应。

化合物12也可以由下述起始原料13得到中间体6后进行合成。

[化学式44]

工序10化合物14的合成

N-(9-((2R,3R,5S)-5-((双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)甲基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-(羟基亚氨基)四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺

在氩气氛下，使化合物13(ChemGenes公司制,5.0g，6.5mmol)溶解于脱水二氯甲烷(50mL)中，一边用冰浴进行冷却一边进行搅拌。将反应液冷却的同时加入碳酸氢钠(8.2g,97.3mmol)、nor-AZADO(36mg,0.260mmol)，注意内温上升且分批添加二乙酸碘苯(3.14g,9.73mmol)，一边升温至室温，一边搅拌21小时10分钟。确认原料的消失后，将异丙醇(7.5mL)加入至反应液中，搅拌4小时(过量氧化剂的淬灭)。将反应液加入至冰水中，进一步加入氯仿而进行分液，再次用氯仿萃取水层。将有机层合二为一后，用水清洗1次，用饱和食盐水清洗1次，然后用无水硫酸钠进行脱水。将干燥剂过滤后，将滤液浓缩，由此以橙色固体的形式得到粗产物(9.01g，包含一部分DMTr基脱保护的化合物)。

在氩气氛下，将粗产物(9.01g)溶解于脱水吡啶(40mL)中，一边用冰浴进行冷却一边搅拌。在将反应液冷却的同时加入羟基胺盐酸盐(4.06g,58.7mmol)，一边升温至室温一边搅拌17小时25分钟。确认原料的消失后，针对反应液，一边用氯仿(含有1％三乙胺)冲洗一边转移至茄形瓶中，并进行浓缩。将残余物加入饱和碳酸氢钠水溶液中，搅拌15分钟后，用氯仿萃取2次。将有机层合二为一后，用饱和食盐水清洗1次后，用无水硫酸钠进行脱水。将干燥剂过滤后，将滤液浓缩，由此以橙色泡状物质的形式得到化合物14(4.13g,非对映异构体混合物，2阶段收率为81％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:12.04(1H,d,J＝23.3Hz),9.23(1H,s),8.49(1H,s),7.89(1H,s),7.79(1H,s),7.66-7.58(2H,m),7.49-7.39(4H,m),7.31-7.14(5H,m),6.81-6.76(2H,m),6.73-6.68(2H,m),5.92(1H,dd,J＝8.0,1.6Hz),5.83(1H,d,J＝3.7Hz),5.64(1H,d,J＝8.2Hz),5.54(1H,dd,J＝3.9,1.1Hz),5.01(1H,t,J＝7.3Hz),3.80-3.73(6H,m),3.54-3.46(2H,m),1.28(1H,m),1.08(1H,d,J＝6.9Hz),0.99(1H,d,J＝6.9Hz),0.86-0.76(9H,m),0.47(2H,m),0.11(1H,s),0.02--0.02(3H,m),-0.07(2H,s)[非对映异构体混合物]

ESI-HRMS：calcd for C₄₁H₅₀N₆O₈Si 781.97[M-H]^-,found：781.84[M-H]^-

工序11从化合物14向化合物6的合成

使用工序10中得到的化合物14(3.80g)，与工序3同样地操作，得到化合物6(2.12g,4.41mmol，收率91％)。

需要说明的是，关于化合物6的详细数据，如工序3中记载。

化合物15的合成

[化学式45]

向化合物12(380mg,0.50mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2.5mL)溶液中，添加Nativeamino lcaa CPG(1000A,ChemGenes公司)(84μmol/g,1.20g,0.10mmol)、接着添加HOBt(136mg,1.01mmol)、EDC-HCl(193mg,1.01mmol)的DMF(2.5mL)溶液，于室温振荡。20小时后，舍去反应液，针对固相载体，用N,N-二甲基甲酰胺(5mL，4次)进行清洗、接着用二氯甲烷(5mL，4次)进行清洗。固相载体上的未反应的氨基由10％乙酸酐/吡啶溶液(5mL)封端(于室温振荡16小时)。舍去反应液，针对固相载体，用吡啶(5mL，1次)进行清洗、接着用二氯甲烷(5mL，4次)进行清洗，然后，在真空下使其干燥，由此得到在固相载体上负载有化合物12的化合物15(1.20g)。

化合物12向固相上的负载量由以下所示的方法算出。取规定量的所得的固相载体，通过添加脱保护试剂(3w/v％三氯乙酸/二氯甲烷溶液)而产生4,4’-二甲氧基三苯甲基阳离子的显色，利用紫外可见吸光光度测定(石英比色皿，比色皿长度：10mm)来进行测定。根据504nm处的吸光度和4,4’-二甲氧基三苯甲基阳离子的摩尔吸光系数(波长504nm：76,000)，利用Lambert-Beer式，算出化合物12在固相上的负载量。即，在2mL容量瓶中量取得到的固相载体(2.0mg)，加入脱保护试剂，使总量为2mL，进行倒置混合，将得到的物质作为测定样品。使用3w/v％三氯乙酸/二氯甲烷溶液进行空白测定后，使用测定样品进行测定。根据504nm处的吸光度0.377，算出负载量24.8μmol/g。

化合物24的合成按下述路径进行。

[化学式46]

工序12化合物17的合成

N-(9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羟基甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺

在氩气氛下，向10L的四颈烧瓶中依次加入市售的N6-苄基腺苷(化合物16)(100g,269mmol,1.0eq.)、丙酮(2.70L)、二甲氧基丙烷(166mL,1.35mol,5.0eq.)。向反应溶液中加入浓硫酸(1.44mL,26.9mmol,0.10eq.)，于室温搅拌15小时。确认到原料的残留，因此追加浓硫酸(1.44mL,26.9mmol,0.10eq.)，搅拌24小时。确认到原料的残留，因此添加浓硫酸(1.44mL,26.9mmol,0.10eq.)，搅拌1小时30分钟后，添加浓硫酸(2.87mL,53.8mmol,0.20eq.)，搅拌4小时。

用LC/MS确认反应的进行后，用冰浴将反应液冷却，以内温成为3～5℃的方式，经5分钟滴加饱和碳酸氢钠水溶液(400mL)，使溶液为中性。在减压下，将反应液浓缩，向残余物中加入蒸馏水(2.0L)。用氯仿(1.0L)将溶液萃取3次，用无水硫酸钠将有机层脱水。过滤后，将溶剂减压蒸馏除去，得到化合物17(222g)。得到的化合物17未实施进一步的纯化操作，用于下一工序。

工序13化合物18的合成

甲磺酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)甲酯

在氩气氛下，向2L的四颈烧瓶中加入工序12中得到的化合物17(222g)、吡啶(520mL)，用冰浴将反应液冷却，以内温成为4℃～9℃的方式，经15分钟滴加甲磺酰氯(25.0mL,321mmol,1.2eq.)，搅拌2小时。

用LC/MS确认反应的进行后，向反应液中加入蒸馏水(500mL)，用乙酸乙酯(1.0L)将溶液萃取3次后，依次用1N盐酸(1.0L×1,500mL×2)、饱和碳酸氢钠水溶液(500mL×2)、饱和食盐水(500mL×2)对有机层进行清洗，用无水硫酸钠进行脱水。过滤后，将溶剂减压蒸馏除去，用甲苯将得到的残余物共沸，由此得到化合物18(150g,含有17.6wt％甲苯)。得到的化合物18未实施进一步的纯化操作，用于下一工序。

工序14化合物19的合成

N-(9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(叠氮基甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺

在氩气氛下，向3L的四颈烧瓶中，加入工序13中得到的化合物18(150g)和脱水DMF(1.26L)。向反应液中添加叠氮化钠(82.8g,1.26mol,5.0eq.)，经30分钟升温至60℃，于60℃搅拌3小时30分钟。

用LC/MS确认反应的进行后，将反应液缓慢冷却至室温，加入蒸馏水(1.0L)和乙酸乙酯(600mL)。向得到的溶液中加入蒸馏水(3.0L)，用乙酸乙酯(500mL)将水层萃取6次。用蒸馏水(800mL)将有机层清洗2次，用饱和食盐水(800mL)将有机层清洗2次，用无水硫酸钠进行脱水。过滤后，将溶剂减压蒸馏除去，用硅胶柱色谱(SiO₂ 700g,乙酸乙酯)将得到的残余物纯化，由此得到化合物19(55.7g,128mmol，收率48％(从化合物16起，经三步))。

工序15化合物20的合成

N-(9-((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-((2,2,2-三氟乙酰氨基)甲基)四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺

在氩气氛下，向3L的4口烧瓶中，加入工序14中得到的化合物19(55.7g,128mmol,1.0eq.)、甲醇(1.28L)。向反应液中添加10％ Pd/C(76.8g,21.2mmol,0.17eq.)，用氢气将反应液中置换，于室温搅拌16小时。

用LC/MS确认反应的进行后，用氩气将反应液中置换，对反应液进行硅藻土过滤。将滤液进行减压浓缩后，将得到的残余物溶解于甲醇(985mL)中，转移至3L的四颈烧瓶中。用冰浴将溶液冷却，以内温成为2～4℃的方式经15分钟滴加1-(三氟乙酰基)咪唑(17.0mL,149mmol,1.2eq.)，于4℃搅拌2小时。用LC/MS确认反应的进行后，将反应液减压浓缩。用硅胶柱色谱(SiO₂ 800g,庚烷/乙酸乙酯＝1：4)将得到的残余物纯化，由此得到化合物20(21.4g,42.2mmol，收率33％)。

工序16化合物21的合成

N-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-((2,2,2-三氟乙酰氨基)甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺

向1L的茄形瓶中，加入工序15中得到的化合物20(10.0g,19.8mmol,10eq.)、蒸馏水(50.0mL)，用冰浴将溶液冷却。在冰冷却下，经5分钟滴加三氟乙酸(50.0mL,640mmol,32.4eq.)，将反应液升温至室温，搅拌4小时30分钟。

用LC/MS确认反应的进行后，将反应液减压浓缩，对残余物进行甲苯共沸。向得到的残余物中加入异丙基醚，使固体析出，过滤去除。在减压下，于室温将得到的固体干燥，得到化合物21(8.86g,19.0mmol，收率96％)。

工序17化合物22的合成

N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-羟基-5-((2,2,2-三氟乙酰氨基)甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺

在氩气氛下，向500mL的茄形瓶中，加入工序16中得到的化合物21(15.6g,33.6mmol,1.0eq.)、脱水DMF(111mL)，用冰浴将溶液冷却。在冰冷却下，以内温成为小于6℃的方式添加咪唑(9.16g,134mmol,4.0eq.)、叔丁基二甲基氯硅烷(15.2g,101mmol,3.0eq.)，于该温度搅拌30分钟。

用LC/MS确认反应的进行后，向反应液中加入冰水。用乙酸乙酯将水层萃取3次，用饱和食盐水进行清洗，用无水硫酸钠进行脱水。过滤后，将溶剂减压蒸馏除去，用硅胶柱色谱(SiO₂ 800g,氯仿/2-丁酮＝100：0至85：15)将得到的残余物纯化，由此得到化合物22与化合物23的混合物(10.9g)。得到的化合物22与化合物23的混合物未实施进一步的纯化操作，用于下一工序。

工序18化合物24的合成

(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-((2,2,2-三氟乙酰氨基)甲基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺

在氩气氛下，向200mL的茄形瓶中，加入工序17中得到的化合物22与化合物23的混合物(1.19g,2.05mmol,化合物22：化合物23＝9：1)、脱水二氯甲烷(6.83mL)，用冰浴将溶液冷却。在冰冷却下，滴加二异丙基乙基胺(0.537mL,3.07mmol,1.5eq.)、3-((氯(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(0.857mL,3.07mmol,1.5eq.)的二氯甲烷混合溶液后，将反应液升温至室温，于室温搅拌2小时。

用TLC确认原料的消失后，向反应液中加入蒸馏水，用氯仿(50mL)萃取2次，用无水硫酸钠将有机层脱水。过滤后，将溶剂减压蒸馏除去，用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯＝50：50至30：70，含有0.5％三乙胺)将得到的残余物多次纯化，由此以淡黄色无定形状物质的形式得到目标化合物24(608mg,0.779mmol，收率38％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:9.82(1H,d,J＝8.8Hz),9.07(1H,s),8.83-8.80(1H,m),8.06-8.01(3H,m),7.66-7.52(3H,m),5.86(1H,d,J＝7.8Hz),4.88(1H,dd,J＝7.8,5.2Hz),4.50(1H,br s),4.39-4.29(1H,m),4.21-3.88(3H,m),3.74-3.63(1H,m),3.48-3.35(1H,m),2.73-2.66(2H,m),1.28-1.23(12H,m),1.08-1.04(1H,m),0.72-0.68(9H,m),-0.17(3H,s),-0.45(3H,s).

³¹P NMR(CDCl₃)δ:149.95

作为多核苷酸的原料的、化合物6a的合成按照下述路径进行合成。

[化学式47]

工序1化合物2a的合成

N-(9-((3aR,5R,6R,6aS)-2,2-二叔丁基-6-甲氧基四氢呋喃并[2,3-d][1,3,2]二氧杂噻咯(dioxasilol)-5-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺

向市售的化合物1a(30.0g,78.0mmol)的DMF(300mL)溶液中，在冰冷却下，缓慢加入二叔丁基甲硅烷基双(三氟甲磺酸酯)(68.6g,156mmol)。在冰冷却下，搅拌1小时后，将反应液加入饱和碳酸氢钠水溶液中，加入庚烷/乙酸乙酯的混合溶剂，萃取2次。用水将有机层清洗2次，用饱和食盐水将有机层清洗1次后，用无水硫酸钠干燥。过滤后，用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯＝7/3→3/7)将浓缩残余物纯化，以无色固体的形式得到化合物2a(38.7g,73.7mmol)(收率95％)。

ESI-MS：计算值：524.23[M-H]^-,实测值：524.5[M-H]^-

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:9.32(s,1H),8.76(s,1H),8.05(s,1H),8.03(t,J＝6.6Hz,2H),7.60(t,J＝7.3Hz,1H),7.51(t,J＝7.8Hz,2H),6.01(s,1H),4.66(dd,J＝9.6,5.0Hz,1H),4.48(dd,J＝8.9,4.8Hz,1H),4.31(d,J＝4.6Hz,1H),4.20(ddd,J＝10.1,5.0,5.0Hz,1H),4.03(t,J＝9.8Hz,1H),3.70(s,3H),1.10(s,9H),1.06(s,9H).

工序2化合物3a的合成N-(9-((3aR,5R,6R,6aS)-2,2-二叔丁基-6-甲氧基四氢呋喃并[2,3-d][1,3,2]二氧杂噻咯-5-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲酰胺

将化合物2a(10.0g,19.0mmol)溶解于二氯甲烷(50mL)中，加入四丁基溴化铵(9.20g,28.5mmol)、1M氢氧化钠水溶液(50ml)。缓慢滴加碘甲烷(4.76ml,76.0mmol)。然后，于室温搅拌1小时10分钟。确认原料消失后，将反应液加入经冰冷却的水/氯仿＝1/1中，进行淬灭。用水将有机层清洗2次后，用无水硫酸钠进行脱水，将干燥剂过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯＝90/10→50/50)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物3a(6.25g,11.6mmol)。(收率61％)

ESI-MS：计算值：540.26[M+H]⁺,实测值：540.4[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.56(s,1H),7.94(s,1H),7.49-7.46(m,2H),7.34-7.29(m,1H),7.21(t,J＝7.6Hz,2H),5.94(s,1H),4.61(dd,J＝9.6,5.0Hz,1H),4.46(dd,J＝9.2,5.0Hz,1H),4.22(d,J＝4.6Hz,1H),4.17(ddd,J＝10.0,5.2,5.0Hz,1H),4.00(dd,J＝10.5,9.2Hz,1H),3.79(s,3H),3.67(s,3H),1.08(s,9H),1.05(s,9H).

工序3化合物4a的合成

N-(9-((2R,3R,4S,5S)-4,5-二羟基-3-甲氧基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲酰胺

将化合物3a(6.25g,11.6mmol)溶解于四氢呋喃(63mL)中，用冰浴进行冷却。加入三乙胺(8.07ml,57.9mmol)、三乙胺三氢氟酸盐(1.89ml,11.6mmol)，一边用冰浴冷却，一边搅拌1小时5分钟。确认原料消失后，加入三乙胺(10ml,76.0mmol)进行淬灭，用氯仿进行稀释后，将反应液浓缩。用硅胶柱色谱(氯仿/甲醇＝100/0→90/10)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物4a(4.25g,10.6mmol)。(收率quant.)

ESI-MS：计算值：400.16[M+H]⁺,实测值：400.3[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.56(s,1H),7.97(s,1H),7.50-7.48(m,2H),7.35-7.31(m,1H),7.22(t,J＝7.8Hz,2H),5.87(d,J＝7.3Hz,1H),5.86(dd,J＝11.4,2.3Hz,1H),4.63(dd,J＝7.3,4.6Hz,1H),4.57-4.56(m,1H),4.36-4.34(m,1H),3.99-3.94(m,1H),3.81(s,3H),3.77(td,J＝12.3,1.7Hz,1H),3.31(s,3H),2.77(d,J＝1.4Hz,1H).

工序4化合物5a的合成

N-(9-((2R,3R,4S,5S)-5-(双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)-4-羟基-3-甲氧基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲酰胺

将化合物4a(4.25g,10.6mmol)溶解于吡啶(43mL)中，在冰浴的条件下搅拌。向反应液中加入4,4’-二甲氧基三苯基氯(5.41g,20.0mmol)，于室温搅拌2小时25分钟。确认原料消失后，将反应液加入经冰冷却的碳酸氢钠水溶液中，进行淬灭，用乙酸乙酯萃取。用饱和食盐水将有机层清洗后，用无水硫酸钠进行干燥，过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯(含有1％三乙胺)＝70/30→50/50)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物5a(5.35g,7.62mmol)。(收率71％)

ESI-MS：计算值：702.29[M+H]⁺,实测值：702.6[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.50(s,1H),8.14(s,1H),7.45-7.40(m,4H),7.33-7.22(m,8H),7.16(t,J＝7.6Hz,2H),6.81(dd,J＝8.9,1.1Hz,4H),6.15(d,J＝3.7Hz,1H),4.48(dd,J＝11.9,5.0Hz,1H),4.35(dd,J＝5.3,3.9Hz,1H),4.21-4.19(m,1H),3.80(s,3H),3.79(s,6H),3.53(s,3H),3.50(dd,J＝10.8,3.0Hz,1H),3.40(dd,J＝10.8,4.4Hz,1H),2.66(d,J＝6.4Hz,1H).

工序5酰胺化物(amidite)6a的合成

(2S,3S,4R,5R)-2-(双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)-4-甲氧基-5-(6-(N-甲基苯甲酰氨基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺

将化合物5a(5.30g,7.55mmol)溶解于二氯甲烷(48mL)中，加入二异丙基乙基胺(2.64mL,15.1mmol)，用冰浴进行冷却。经5分钟滴加溶解于二氯甲烷(5mL)中的2-氰基乙基二异丙基氯亚磷酰胺(2.68g,11.3mmol)。然后，一边升温至室温，一边搅拌1小时10分钟。确认原料消失后，将反应液加入至经冰冷却的饱和碳酸氢钠水溶液中，进行淬灭。加入乙酸乙酯进行萃取。用饱和食盐水将有机层清洗后，用无水硫酸钠进行干燥，将干燥剂过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯(含有1％三乙胺)＝70/30→50/50)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到酰胺化物6a(6.22g,6.90mmol)。(收率91％)

ESI-MS：计算值：902.40[M+H]⁺,实测值：902.5[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.47(s,0.35H),8.47(s,0.65H),8.14(s,0.35H),8.09(s,0.65H),7.44-7.39(m,4H),7.33-7.21(m,8H),7.16-7.12(m,2H),6.93-6.78(m,4H),6.12(d,J＝5.5,0.65H),6.10(d,J＝5.0,0.35H),4.66-4.53(m,2H),4.41-4.38(m,0.35H),4.34-4.32(m,0.65H),3.97-3.78(m,10H),3.70-3.44(m,7H),3.36-3.30(m,1H),2.64(t,J＝6.2Hz,1.3H),2.38(t,J＝6.4Hz,0.70H),1.22-1.17(m,8H),1.06(d,J＝6.9Hz,4H).

³¹P-NMR(CDCl₃,162MHz)δ:150.70,150.94.

作为多核苷酸的原料的、化合物6b的合成按照下述路径进行合成。

[化学式48]

工序1化合物2b的合成

N-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二叔丁基-7-氟四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂噻咯啉(dioxasilin)-6-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺

向市售的化合物1b(30.0g,80.4mmol)的DMF(300mL)溶液中，在冰冷却下，缓慢加入二叔丁基甲硅烷基双(三氟甲磺酸酯)(70.8g,161mmol)。在冰冷却下，搅拌1小时后，将反应液加入饱和碳酸氢钠水溶液中，加入庚烷/乙酸乙酯的混合溶剂，萃取2次。用水将有机层清洗2次，用饱和食盐水将有机层清洗1次后，用无水硫酸钠干燥。过滤后，用庚烷/乙酸乙酯＝9/1对浓缩残余物进行浆料纯化，以无色固体的形式得到化合物2b(38.7g,75.4mmol)(收率94％)。

ESI-MS：计算值：514.23[M+H]⁺,实测值：514.5[M+H]⁺

¹H-NMR(DMSO-d 6,400MHz)δ:11.27(s,1H),8.74(s,1H),8.65(s,1H),8.04(d,J＝8.7Hz,2H),7.65(t,J＝7.5Hz,1H),7.55(t,J＝7.5Hz,2H),6.45(d,J＝23Hz,1H),5.71(dd,J＝54.5,4.1Hz,1H),5.03(m,1H),4.44(q,J＝3.7Hz,1H),4.09(m,2H),1.11(s,9H),1.02(s,9H).

工序2化合物3b的合成

N-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二叔丁基-7-氟四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂噻咯啉-6-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲酰胺

将化合物2b(10.0g,19.5mmol)溶解于二氯甲烷(50mL)中，加入四丁基溴化铵(9,41g,29.2mmol)、1M氢氧化钠水溶液(50ml)。缓慢滴加碘甲烷(1.83ml,29.2mmol)。然后，于室温搅拌1小时。确认原料消失后，将反应液加入经冰冷却的水/氯仿＝1/1中，进行淬灭。用水将有机层清洗2次后，用无水硫酸钠进行脱水，将干燥剂过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯＝90/10→50/50)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物3b(6.86g,12.8mmol)。(收率65％)

ESI-MS：计算值：528.24[M+H]⁺,实测值：538.6[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.54(s,1H),7.94(s,1H),7.47(d,J＝8.1Hz,2H),7.32(t,J＝7.3Hz,2H),7.21(t,J＝7.6Hz,2H),6.10(d,J＝22.0Hz,1H),5.46(dd,J＝54.5,4.1Hz,1H),4.86(ddd,J＝27.2,9.8,4.1Hz,1H),4.47(dd,J＝9.2,5.0Hz,1H),4.14(m,1H),4.03(t,J＝9.8Hz,1H),3.78(s,3H),1.11(s,9H),1.05(s,9H).

工序3化合物4b的合成

N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲酰胺

将化合物3b(6.67g,12.6mmol)溶解于四氢呋喃(66mL)中，用冰浴进行冷却。加入三乙胺(8.81ml,63.2mmol)、三乙胺三氢氟酸盐(2.05ml,12.6mmol)，一边用冰浴进行冷却一边搅拌1小时5分钟。确认原料消失后，加入三乙胺(10.6ml,76.0mmol)进行淬灭，用氯仿进行稀释后，将反应液浓缩。用硅胶柱色谱(氯仿/甲醇＝100/0→90/10)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物4b(4.98g,12.9mmol)。(收率quant.)

ESI-MS：计算值：388.14[M+H]⁺,实测值：388.4[M+H]⁺

¹H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.70(s,1H),8.58(s,1H),7.30(m,5H),6.31(dd,J＝16.9,2.3Hz,1H),5.75(d,J＝6.4Hz,1H),5.41(m,1H),5.15(t,J＝5.3Hz,1H),4.46(m,1H),3.98(m,1H),3.75(dq,J＝12.4,2.6Hz,1H),3.67(s,3H),3.61-3.56(m,1H).

工序4化合物5b的合成

N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)甲基)-3-氟-4-羟基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-甲基苯甲酰胺

将化合物4b(4.93g,12.7mmol)溶解于吡啶(49mL)中，在冰浴的条件下搅拌。向反应液中加入4,4’-二甲氧基三苯基氯(6.47g,29.2mmol)，于室温搅拌1小时20分钟。确认原料消失后，将反应液加入经冰冷却的碳酸氢钠水溶液，进行淬灭，用乙酸乙酯萃取。用饱和食盐水将有机层清洗后，用无水硫酸钠进行干燥，过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯(含有1％三乙胺)＝70/30→50/50)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物5b(8.34g,12.1mmol)。(收率95％)

ESI-MS：计算值：690.27[M+H]⁺,实测值：690.7[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.51(s,1H),8.10(s,1H),7.43(dd,J＝8.2,1.4Hz,2H),7.37(dd,8.2,1.4Hz,2H),7.28-7.20(m,8H),7.12(t,J＝7.5Hz,2H),6.79(d,J＝8.7Hz),6.23(dd,J＝17.1,2.5Hz,1H),5.58(dq,J＝52.9,2.3Hz,1H),4.78(m,1H),4.19(m,1H),3.78(s,6H),3.47(ddd,J＝57.9,10.6,3.5Hz,2H),2.44(dd,J＝7.5,2.5Hz,1H).

工序5酰胺化物6b的合成

(2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-5-(6-(N-甲基苯甲酰氨基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺

将化合物5b(10.0g,14.6mmol)溶解于二氯甲烷(80mL)中，加入二异丙基乙基胺(5.08mL,29.1mmol)，用冰浴进行冷却。经5分钟滴加溶解于二氯甲烷(15mL)中的2-氰基乙基二异丙基氯亚磷酰胺(4.18g,21.8mmol)。然后，一边升温至室温，一边搅拌1小时。确认原料消失后，将反应液加入至经冰冷却的饱和碳酸氢钠水溶液中，进行淬灭。加入乙酸乙酯进行萃取。用饱和食盐水将有机层清洗后，用无水硫酸钠进行干燥，将干燥剂过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯(含有1％三乙胺)＝70/30→50/50)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到酰胺化物6b(12.1g,13.6mmol)。(收率93％)

ESI-MS：计算值：890.38[M+H]⁺,实测值：890.8[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.53(s,0.49H),8.50(s,0.51H),8.14(s,1H),7.43-7.39(m,2H),7.37-7.33(m,2H),7.27-7.20(m,8H),7.09-7.04(m,2H),6.77(t,J＝9.1Hz,4H),6.28-6.19(m,1H),5.74(dq,J＝18.5,2.2Hz,0.50H),5.61(dq,J＝19.2,2.3Hz,0.50H),5.10-5.00(m,0.47H),4.94-4.85(m,0.53H),4.31(m,1H),3.97-3.82(m,1H),3.79(s,3H),3.79(s,3H),3.63-3.53(m,4H),3.31-3.27(m,1H),2.59(t,J＝6.2Hz,1H),2.41(t,J＝6.4Hz,1H),1.20-1.15(m,9H),1.04(d,J＝6.4Hz,3H).

³¹P-NMR(CDCl₃,162MHz)δ:151.97,151.92,151.19,151.11.

作为多核苷酸的原料的、化合物6c的合成按照下述路径进行合成。

[化学式49]

工序1化合物3c的合成

N-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二叔丁基-7-甲氧基四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂噻咯啉-6-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-乙基苯甲酰胺

将化合物2a(11.7g,22.3mmol)溶解于二氯甲烷(58.5mL)中，加入四丁基溴化铵(10.8g,33.4mmol)、1M氢氧化钠水溶液(58.5ml)。缓慢滴加碘乙烷(10.8ml,134mmol)。然后，于室温搅拌2小时。确认原料消失后，将反应液加入经冰冷却的水/氯仿＝1/1中，进行淬灭。用水将有机层清洗2次后，用无水硫酸钠进行干燥。过滤后，将滤液浓缩。通过甲苯，对浓缩残余物进行浆料纯化，再次将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯＝90/10→70/30)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物3c(6.14g,11.1mmol)。(收率49％)

ESI-MS：计算值：554.28[M+H]⁺,实测值：554.6[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.56(s,1H),7.91(s,1H),7.47-7.45(m,2H),7.31-7.27(m,1H),7.19(t,J＝7.5Hz,2H),5.94(s,1H),4.61(dd,J＝9.6,4.6Hz,1H),4.46(dd,J＝9.1,5.0Hz,1H),4.40(q,J＝7.0Hz,2H),4.22(d,J＝4.6Hz,1H),4.16(ddd,J＝10.1,4.9,4.8Hz,1H),4.00(dd,J＝10.5,9.6Hz,1H),3.67(s,3H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H),1.09(s,9H),1.05(s,9H).

工序2化合物4c的合成

N-乙基-N-(9-((2R,3R,4R,5R)-4-羟基-5-(羟基甲基)-3-甲氧基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺

将化合物3c(6.14g,11.1mmol)溶解于四氢呋喃(61.4mL)中，用冰浴进行冷却。加入三乙胺(7.73ml,55.4mmol)、三乙胺三氢氟酸盐(1.81ml,11.1mmol)，一边用冰浴冷却一边搅拌2小时。确认原料消失后，加入三乙胺(10ml,76.0mmol)进行淬灭，用氯仿稀释后，将反应液浓缩。用硅胶柱色谱(氯仿/甲醇＝100/0→90/10)，将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物4c(4.60g,11.1mmol)。(收率quant.)

ESI-MS：计算值：414.18[M+H]⁺,实测值：414.3[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.56(s,1H),7.92(s,1H),7.50-7.46(m,2H),7.32-7.28(m,1H),7.20(t,J＝7.5Hz,2H),5.89(dd,J＝11.6,2.1Hz,1H),5.85(d,J＝7.3Hz,1H),4.62(dd,J＝7.3,4.6Hz,1H),4.57-4.56(m,1H),4.45-4.39(m,2H),4.36-4.34(m,1H),3.96(dt,J＝12.9,1.9,1H),3.80-3.73(m,1H),3.29(s,3H),2.70(d,J＝1.4Hz,1H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H).

工序3化合物5c的合成

N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基-3-甲氧基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-乙基苯甲酰胺

将化合物4c(4.58g,11.1mmol)溶解于吡啶(46mL)中，在冰浴的条件下搅拌。向反应液中加入4,4’-二甲氧基三苯基氯(5.63g,16.6mmol)，于室温搅拌2小时。确认原料消失后，将反应液加入经冰冷却的碳酸氢钠水溶液中，进行淬灭，用乙酸乙酯萃取。用饱和食盐水将有机层清洗后，用无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯(含有1％三乙胺)＝70/30→50/50)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物5c(7.55g,10.6mmol)。(收率95％)

ESI-MS：计算值：716.31[M+H]⁺,实测值：716.2[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.51(s,1H),8.11(s,1H),7.43-7.40(m,4H),7.32-7.22(m,8H),7.13(t,J＝7.5Hz,2H),6.81(dd,J＝9.1,1.4Hz,4H),6.14(d,J＝3.7Hz,1H),4.47(dd,J＝5.7,5.6Hz,1H),4.41(q,J＝7.0Hz,2H),4.34(dd,J＝8.4,4.1Hz,1H),4.21-4.17(m,1H),3.79(s,6H),3.53(s,3H),3.50(dd,J＝10.5,3.2Hz,1H),3.39(dd,J＝10.7,4.3Hz,1H),2.64(d,J＝6.4Hz,1H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H).

工序4酰胺化物6c的合成

(2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(N-乙基苯甲酰氨基)-9H-嘌呤-9-基)-4-甲氧基四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺

将化合物5c(8.83g,12.3mmol)溶解于二氯甲烷(74mL)中，加入二异丙基乙基胺(4.31mL,24.7mmol)，用冰浴进行冷却。经9分钟滴加溶解于脱水二氯甲烷(14mL)中的2-氰基乙基二异丙基氯亚磷酰胺(4.40g,18.6mmol)。然后，一边升温至室温，一边搅拌1小时。确认原料消失后，将反应液加入至经冰冷却的饱和碳酸氢钠水溶液中，进行淬灭。加入乙酸乙酯进行萃取。用饱和食盐水将有机层清洗后，用无水硫酸钠进行干燥。过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯(含有1％三乙胺)＝70/30→50/50)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到酰胺化物6c(10.4g,11.3mmol)。(收率92％)

ESI-MS：计算值：916.42[M+H]⁺,实测值：917.3[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.49(s,0.37H),8.48(s,0.63H),8.11(s,0.34H),8.05(s,0.66H),7.43-7.38(m,4H),7.32-7.21(m,8H),7.11(t,J＝7.8Hz,2H),6.80(m,4H),6.10(m,1H),4.64-4.52(m,2H),4.43-4.32(m,3H),3.94-3.83(m,1H),3.79-3.78(m,6H),3.67 -3.46(m,4H),3.35-3.29(m,1H),2.64(t,J＝6.4Hz,1.3H),2.37(t,J＝6.4Hz,0.70H),1.33(t,J＝7.1Hz,3H),1.18(m,8H),1.06(d,J＝6.9Hz,4H).

³¹P-NMR(CDCl₃,162MHz)δ:151.67,150.92.

作为多核苷酸的原料的、化合物6d的合成按照下述路径进行合成。

[化学式50]

工序1化合物3d的合成

N-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二叔丁基-7-氟四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂噻咯啉-6-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-乙基苯甲酰胺

将化合物2b(1.00g,1.95mmol)溶解于二氯甲烷(5.0mL)中，加入四丁基溴化铵(0.942g,2.92mmol)、1M氢氧化钠水溶液(5.0ml)。缓慢滴加碘甲烷(0.942ml,11.7mmol)。然后，于室温搅拌2小时。确认原料消失后，将反应液加入经冰冷却的水/氯仿＝1/1中，淬灭。用水将有机层清洗2次后，用无水硫酸钠进行脱水，将干燥剂过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯＝80/20→70/30)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到化合物3d(629mg,1.16mmol)。(收率60％)

ESI-MS：计算值：542.26[M+H]⁺,实测值：542.6[M+H]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.55(s,1H),7.91(s,1H),7.46(d,J＝7.3Hz,2H),7.30(t,J＝7.1Hz,1H),7.19(t,J＝7.8hz,2H),6.09(d,J＝22.4Hz,1H),5.45(dd,J＝54.1,3.9Hz,1H),4.86(ddd,J＝27.2,9.8,4.1Hz,1H),4.48(dd,J＝9.1,5.0,1H),4.40(q,J＝7.2Hz,2H),4.04(t,J＝9.8Hz,1H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H),1.11(s,9H),1.05(s,9H).

工序2化合物4d的合成

N-乙基-N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺

与得到化合物4c的工序同样地，得到化合物4d。

ESI-MS：计算值：401.40[M+H]⁺,实测值：402.1[M+H]⁺

工序3化合物5d的合成

N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)甲基)-3-氟-4-羟基四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N-乙基苯甲酰胺

与得到化合物5c的工序同样地，得到化合物5d。

ESI-MS：计算值：738.25[M+Cl]^-,实测值：738.7[M+Cl]^-

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.52(s,1H),8.07(s,1H),7.43-7.41(m,2H),7.38-7.35(m,2H),7.30-7.20(m,8H),7.10(t,J＝7.8Hz,2H),6.79(d,J＝8.2Hz,4H),6.22(dd,J＝17.4,2.3Hz,1H),5.58(ddd,J＝53.0,2.4,1.2Hz,1H),4.93-4.74(m,1H),4.40(q,J＝7.2Hz,2H),4.19-4.16(m,1H),3.78(s,6H),3.54(dd,J＝11.0,3.2Hz,1H),3.40(dd,J＝10.5,3.1Hz,1H),2.23(dd,J＝6.9,2.3Hz,1H),1.33(t,J＝7.1Hz,3H).

工序4酰胺化物6d的合成

(2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基))苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(N-乙基苯甲酰氨基)-9H-嘌呤-9-基)-4-氟四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺

将化合物5d(1.93g,2.74mmol)溶解于二氯甲烷(16mL)中，加入二异丙基乙基胺(0.958mL,5.48mmol)，用冰浴进行冷却。滴加溶解于脱水二氯甲烷(3.8mL)中的2-氰基乙基二异丙基氯亚磷酰胺(970mg,4.11mmol)。然后，一边升温至室温一边搅拌1小时。确认原料消失后，将反应液加入至经冰冷却的饱和碳酸氢钠水溶液中，进行淬灭。加入乙酸乙酯进行萃取。用饱和食盐水将有机层清洗后，用无水硫酸钠进行干燥。过滤后，将滤液浓缩。用硅胶柱色谱(庚烷/乙酸乙酯(含有1％三乙胺)＝90/10→60/40)将浓缩残余物纯化，由此以无色无定形的形式得到酰胺化物6d(2.29g,2.53mmol)。(收率92％)

ESI-MS：计算值：938.36[M+Cl]^-,实测值：938.7[M+Cl]^-

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ:8.53(s,0.5H),8.51(s,0.5H),8.11(s,1H),7.41-7.33(m,4H),7.27-7.16(m,8H),7.03(t,J＝7.8Hz,2H),6.79-6.75(m,4H),6.27-6.18(m,1H),5.78-5.58(m,1H),5.10-4.85(m,1H),4.42-4.38(m,2H),4.31-4.30(m,1H),3.96-3.72(m,7H),3.68-3.51(m,4H),3.29-3.27(m,1H),2.59(t,J＝6.2Hz,1H),2.40(t,J＝6.4Hz,1H),1.33-1.31(m,3H),1.19-1.15(m,9H),1.04(d,J＝6.9Hz,3H).

³¹P-NMR(CDCl₃,162MHz)δ:151.94,151.89,151.20,151.11.

RNA寡核苷酸使用2’-TOM(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)保护β-氰基乙基亚磷酰胺(DMT-2’-O-TOM-rA(Ac)、DMT-2’-O-TOM-rG(Ac)、DMT-2’-O-TOM-rC(Ac)、DMT-2’-O-TOM-rU)(各自为Glen Research公司或ChemGenes公司)，DNA寡核苷酸使用β-氰基乙基亚磷酰胺(DMT-dA(Bz)、DMT-dG(iBu)、DMT-dC(Ac)、DMT-T)。各亚磷酰胺单体制成0.05mol/L乙腈溶液，使用0.2μmol或0.8μmol固相载体，利用DNA/RNA固相合成装置(NTS M-2-MX,NihonTechno Service公司)进行合成。

DNA寡核苷酸使用CPG 1000A(dA-CPG,dG-CPG,Ac-dC-CPG,dT-CPG)(GlenResearch公司)作为固相载体，缩合时间为2分钟。

在5’末端具有磷酸基的RNA(5’-单磷酸RNA)使用Universal UnyLinker Support2000A(ChemGenes公司)作为固相载体，第1个碱基的缩合时间为15分钟，之后的碱基的缩合时间各为3分钟。5’末端的羟基的磷酸化使用化学磷酸化试剂(0.05mol/L乙腈溶液)(GlenResearch公司或ChemGenes公司)进行。

3’末端导入有3’-氨基鸟苷单体的RNA寡核苷酸的固相合成使用化合物15进行。第1个碱基的缩合时间为15分钟，之后的碱基的缩合时间各为3分钟。

关于固相合成装置中使用的试剂，使用以下的物质。5’末端的羟基的二甲氧基三苯甲基的除去通过使用市售的脱保护试剂(Deblocking Solution-1,3w/v％三氯乙酸/二氯甲烷溶液)(和光纯药株式会社)、反应10秒而进行。作为亚磷酰胺的活化剂，使用市售的活化剂溶液(活化剂溶液3)(和光纯药株式会社)。未反应的5’末端的羟基的封端通过使用市售的封端溶液(Cap A溶液-2及Cap B溶液-2)(和光纯药株式会社)、反应10秒来进行。作为制造磷酸酯时的氧化剂，使用含有吡啶、THF、水及碘的溶液(氧化剂,0.01M碘,29.2％水,6.3％吡啶,64.5％乙腈)(Honeywell公司)，反应10秒。固相合成后，RNA寡核苷酸的5’末端的羟基的二甲氧基三苯甲基在固相载体上进行脱保护。合成的DNA及RNA寡核苷酸均按照常规方法进行脱树脂·脱保护(浓氨水,55℃,12小时)。DNA寡核苷酸使用筒形柱(MicroPureIIColumn,LGC Biosearch Technology公司)，按照制品说明书进行纯化。就RNA寡核苷酸而言，利用离心蒸发器将由脱树脂而得到的溶液浓缩，由此完全地干固，然后使用四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液)(1mL)将2’羟基的TOM保护基除去(于50℃10分钟，接着于室温12小时。或者，于50℃10分钟，接着于35℃6小时)。向溶液中加入Tris盐酸缓冲液(以下，记为Tris-HCl)(1M,pH7.4)(1mL)，进行混合后，通过利用离心蒸发器进行的浓缩，将四氢呋喃除去。针对得到的溶液，使用经超纯水平衡化的凝胶过滤柱(NAP-25,GE Healthcare公司)，按照制品说明书进行处理。用离心蒸发器将得到的包含RNA寡核苷酸的级分浓缩后，使用改性聚丙烯酰胺凝胶(以下，记为dPAGE)进行纯化。

(使用了dPAGE的RNA片段的纯化)

向丙烯酰胺凝胶溶液(作为改性剂，含有7M尿素)中添加过硫酸铵(以下，记为APS)的水溶液和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(以下，记为TEMED)作为聚合剂，使其固形化(室温，6～12小时)，由此制作了凝胶。RNA样品与凝胶上样缓冲液(80％甲酰胺，TBE)混合，于90℃加热3分钟后，上样至凝胶。电泳后，RNA的带通过UV光照射(254nm)进行检测，使用剃刀的刃从凝胶中切出。切出的凝胶片微细地粉碎后，用超纯水从凝胶中进行提取(于室温振荡6～12小时)。RNA的提取液使用Amicon Ultra 10K(Millipore公司)进行脱盐·浓缩，进行乙醇沉淀(0.3M乙酸钠(pH5.2)/70％乙醇)，由此得到RNA的沉淀物。RNA沉淀物用80％乙醇漂洗后，于室温风干1小时。得到的RNA沉淀物溶解于超纯水中，稀释为合适的浓度后，通过紫外可见吸光光度测定(NanoDrop,Thermo scientific公司)测定260nm处的吸光度，根据各RNA序列的摩尔吸光系数确定浓度(作为各碱基的摩尔吸光系数，使用以下的数值。A＝15300,G＝11800,C＝7400,T＝9300,U＝9900)。

经纯化的寡核苷酸的结构确定通过使用了MALDI-TOF MS(Ultraflex III,BrukerDaltonics公司)(基质：3-羟基吡啶甲酸)的质谱法或使用了改性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析而进行。

(使用了dPAGE的化学连接反应的分析)

在化学连接反应的分析中，用超纯水将反应液适当地稀释，将得到的物质用作样品。经稀释的样品与凝胶上样缓冲液(80％甲酰胺/TBE)混合，于90℃加热3分钟后，上样至凝胶。电泳后，使用经超纯水稀释10,000倍的SYBR(注册商标)Green II Nucleic AcidStain(Lonza公司)，进行凝胶染色(室温，15分钟)，由此检测RNA的带(使用设备：ChemiDoc,BIORAD公司)。

化学连接反应的收率通过下述方式算出：以利用dPAGE进行分离纯化而得的连结产物作为基准物质，将RNA连结产物的带强度进行比较。

(使用了dPAGE的化学连接产物的纯化)

通过化学连接反应而得到的RNA连结产物通过乙醇沉淀(0.3M乙酸钠(pH5.2)/70％乙醇)而从反应液中以RNA沉淀物的形式回收，然后利用dPAGE进行纯化。

以下表1～表27-5中的各核苷酸N(大写)表示RNA，各核苷酸n(小写)表示DNA，N(M)表示2’-O-甲基修饰RNA，N(F)表示2’-F化修饰RNA，N(L)表示LNA，N(MOE)表示2’-O-甲氧基乙基修饰RNA。Am6表示碱基部为N6-甲基腺嘌呤。需要说明的是，DNA有时也记载为dN。p表示3’末端或5’末端被磷酸化。^表示将糖部间连接的磷酸基为硫代磷酸酯。画下划线的“AUG”表示起始密码子，画下划线的“UGA”或“TGA”表示终止密码子。

以下表1中示出实施例1及实施例2中使用的化合物(多核苷酸)的序列信息。

表1：[表1]

实施例1(基于酶的连结)

分3批制备通过固相合成而得到的RNA片段E1-1(10nmol及5’磷酸RNA片段E1-2(10nmol)、模板DNA1(10nmol)的超纯水溶液(200μL、核酸终浓度；50μM)。向各制备溶液中，加入T4 RNA Ligase2Reaction Buffer(10X)(New England BioLabs公司制)100μL以及超纯水440μL，于90℃加热5分钟后，经30分钟以上恢复至室温。向该各溶液中，以终浓度成为15％的方式加入60％ PEG6000水溶液。向该溶液中加入T4 RNA Ligase 2(New EnglandBioLabs公司制)(10units/μL)(10μL)并混合后，静置于经温度控制的热块(Heat block)上(37℃，16小时)。向反应液中加入相同体积的氯仿，用漩涡混合器进行混合，离心分离后，取上层，通过醇沉淀(0.3M乙酸钠水溶液(pH5.2)/70％乙醇)得到RNA的沉淀物。将各批次中得到的RNA汇合，利用7.5％改性聚丙烯酰胺凝胶进行纯化，由此得到RNA连结产物E1(9.7nmol，收率32％)。

实施例2(基于化学反应的连结)

向通过固相合成而得到的3’磷酸RNA片段E2-1(10nmol)以及作为序列7得到的RNA片段E2-2(10nmol)、模板DNA1(20nmol)的核酸混合溶液中加入1M氯化钠水溶液和超纯水，制备100mM氯化钠水溶液(180μL)。将制备溶液于90℃加热5分钟后，经30分钟以上恢复至室温。向该溶液中，以终浓度成为5mM的方式加入100mM氯化锌(II)水溶液。向该溶液中，以终浓度成为5mM的方式加入100mM 1H-咪唑-1-甲腈(Apollo Scientific公司制)/DMSO溶液并混合后，在经温度控制的热块上静置(30℃，20小时)。向反应液中加入50μL 2M三乙胺·乙酸(TEAA)溶液，使用NAP-10Columns(cytiva公司制)进行简易纯化，对具有A260的吸收波长的级分进行离心浓缩或冷冻干燥。将经简易纯化而得到的粗产物RNA汇合，用7.5％改性聚丙烯酰胺凝胶进行纯化，由此得到RNA连结产物E2(2.5nmol，收率25％)。

实施例3

就以下表2-1～2-60中的rSpacer、dSpacer、Pyrrolidine、Ethynyl-dSpacer、C3、C2及Spacer9而言，核苷酸的糖部的替代的间隔子修饰为下图结构。

[化学式51]

在以下表2-1～表2-60中，示出实施例3中使用的化合物(多核苷酸)的序列信息及其合成法。以下表3-1～3-14中，示出实施例3的化合物(多核苷酸)的收率(％)及MS(实测值)。

需要说明的是，MS(实测值)使用Agilent Technologies公司的LC(1260InfinityII)/MSD XT(G6135B)来测定。

表2-1～表2-60：

[表2-1]

[表2-2]

[表2-3]

[表2-4]

[表2-5]

[表2-6]

[表2-7]

[表2-8]

[表2-9]

[表2-10]

[表2-11]

[表2-12]

[表2-13]

[表2-14]

[表2-15]

[表2-16]

[表2-17]

[表2-18]

[表2-19]

[表2-20]

[表2-21]

[表2-22]

[表2-23]

[表2-24]

[表2-25]

[表2-26]

[表2-27]

[表2-28]

[表2-29]

[表2-30]

[表2-31]

[表2-32]

[表2-33]

[表2-34]

[表2-35]

[表2-36]

[表2-37]

[表2-38]

[表2-39]

[表2-40]

[表2-41]

[表2-42]

[表2-43]

[表2-44]

[表2-45]

[表2-46]

[表2-47]

[表2-48]

[表2-49]

[表2-50]

[表2-51]

[表2-52]

[表2-53]

[表2-54]

[表2-55]

[表2-56]

[表2-57]

[表2-58]

[表2-59]

[表2-60]

表3-1～表3-14：

[表3-1]

化合物名	序列号	收率(％)	MS(实测值)	MS(计算值)
					E3	8	42
E3-1	9		25741.90	25738.44
					E3-2	10		21023.11	21020.70
E4	11	35
					E4-1	12		25742.31	25738.44
E4-2	13		27607.82	27604.90
					E5	14	35
E5-1	15		25851.38	25848.62
					E5-2	16		21104.22	21100.79
E6	17	38
					E6-1	18		26032.49	26028.98
E6-2	19		21023.19	21020.70
					E7	20	34
E7-1	21		25826.35	25822.62
					E7-2	22		27650.91	27646.99
E8	23	39
					E8-1	24		25826.58	25822.62
E8-2	25		27769.59	27765.23
					E9	26	35
E9-1	27		25826.44	25822.62
					E9-2	28		27752.63	27747.17
E10	29	34
					E10-1	30		26116.33	26112.92
E10-2	31		21249.39	21246.97
					E11	32	31
E11-1	33		26116.06	26112.92
					E11-2	34		27834.62	27831.17
E12	35	31
					E12-1	36		26148.32	26145.06
E12-2	37		28088.14	28081.69

[表3-2]

E13	38	34
					E13-1	39		25851.92	25848.62
E13-2	40		27688.31	27684.99
					E14	41	34
E14-1	42		25851.92	25848.62
					E14-2	43		27728.18	27724.99
E15	44	34
					E15-1	45		25851.99	25848.62
E15-2	46		27968.93	27965.59
					E16	47	26
E16-1	48		25852.02	25848.62
					E16-2	49		27848.67	27845.29
E17	50	27
					E17-1	51		25851.88	25848.62
E17-2	52		28169.48	28166.69
					E18	53	36
E18-1	54		26203.38	26199.37
					E18-2	55		21103.36	21100.79
E19	56	40
					E19-1	57		26315.40	26311.53
E19-2	58		21103.32	21100.79
					E20	59	42
E20-1	60		26218.93	26215.29
					E20-2	61		21103.24	21100.79
E21	62	40
					E21-1	63		25968.41	25964.74
E21-2	64		21103.18	21100.79
					E22	65	37
E22-1	66		25985.36	25980.74
					E22-2	67		21103.28	21100.79
E23	68	17
					E23-1	69		26287.55	2628355
E23-2	70		21103.34	21100.79

[表3-3]

E24	71	27
					E24-1	72		26413.24	26409.73
E24-2	73		21103.10	21100.79
					E25	74	42
E25-1	75		26304.89	26301.46
					E25-2	76		21103.24	21100.79
E26	77	36
					E26-1	78		25822.79	25822.62
E26-2	79		27745.91	27745.17
					E27	80	35
E27-1	81		25823.15	25822.62
					E27-2	82		27735.83	27735.14
E28	83	33
					E28-1	84		25822.86	25822.62
E28-2	85		27723.52	27723.11
					E29	86	24
E29-1	87		25822.85	25822.62
					E29-2	88		27763.43	27763.23
E30	89		29201.49	29198.50
					E31	90			29375.25
E32	91	23
					E32-1	92		26092.95	26091.07
E32-2	93		21101.35	21100.79
					E33	94	38
E33-1	95		26128.89	26127.16
					E33-2	96		21101.26	21100.79
E34	97	32
					E34-1	98			26199.34
E34-2	99			21100.79
					E35	100	40
E35-1	101			26247.46
					E35-2	102			21100.79

[表3-4]

E36	103	41
					E36-1	104		26357.11	26355.37
E36-2	105		21248.01	21246.97
					E37	106	38
E37-1	107			26683.82
					E37-2	108			21246.97
E38	109	38
					E38-1	110			27410.87
E38-2	111			21246.97
					E39	112	37
E39-1	113			27837.49
					E39-2	114			21246.97
E40	115	38
					E40-1	116			27002.21
E40-2	117			21100.79
					E41	118	41
E41-1	119			27246.77
					E41-2	120			21100.79
E42	121	37
					E42-1	122		26060.05	26054.98
E42-2	123		21101.34	21100.79
					E43	124	30
E43-1	125		26151.59	26151.40
					E43-2	126		21101.31	21100.79
E44	127	20
					E44-1	128		26247.81	26247.82
E44-2	129		21101.31	21100.79
					E45	130	34
E45-1	131			25848.62
					E45-2	132			27756.99
E46	133	32
					E46-1	134		25849.38	25848.62
E46-2	135		28847.69	28846.59

[表3-5]

E47	136			47580.38
					E48	137			47628.47
E49	138			47658.53
					E50	139			47692.59
E51	140	35
					E51-1	141			25934.17
E51-2	142			21246.97
					E52	143	22
E52-1	144			26711.98
					E52-2	145			21246.97
E53	146	13
					E53-1	147		26150.66	26145.06
E53-2	148		29341.39	29346.31
					E54	149	25
E54-1	150		26145.49	26145.06
					E54-2	151		28582.21	28597.46
E55	152	25
					E55-1	153		26145.43	26145.06
E55-2	154		28491.66	28489.19
					E56	155	24
E56-1	156		26390.31	26387.51
					E56-2	157		28490.44	28489.19
E57	158	24
					E57-1	159			26688.90
E57-2	160			28489.19
					E58	161	29
E58-1	162		26113.95	26112.92
					E58-2	163		34417.04	34415.37
E59	164	17
					E59-1	165			26145.06
E59-2	166			35555.09

[表3-6]

E60	167	23
					E60-1	168			26592.48
E60-2	169			28794.52
					E61	170		29760.87	29769.25
E62	171	34
					E62-1	172			26329.37
E62-2	173			28097.65
					E63	174	33
E63-1	175			26522.21
					E63-2	176			28451.19
E64	177	19
					E64-1	178		26438.71	26437.35
E64-2	179		28059.72	28057.67
					E65	180	17
E65-1	181		26438.81	26439.35
					E65-2	182		28059.00	28057.67
E66	183	34
					E66-1	184		26482.87	26481.44
E66-2	185		28115.38	28113.79
					E67	186	35
E67-1	187		26633.16	26632.19
					E67-2	188		28413.40	28411.21
E68	189	28
					E68-1	190		26858.18	26857.17
E68-2	191		28731.35	28732.61
					E69	192	35
E69-1	193		26357.11	26355.37
					E69-2	194		27834.62	27831.17
E70	195	28
					E70-1	196		26390.31	26387.51
E70-2	197		28088.14	28081.69
					E71	198		30044.72	30043.84
E72	199		28597.28	29596.55

[表3-7]

E73	200		29533.43	29532.55
					E74	201		29365.19	29364.39
E75	202		29529.48	29524.55
					E76	203		29629.31	29628.63
E77	204			29510.45
					E78	205			29510.39
E79	206	41
					E79-1	207		26473.07	26469.49
E79-2	208		28413.80	28411.21
					E80	209	39
E80-1	210		26473.07	26469.49
					E80-2	211		27468.04	27465.33
E81	212	35
					E81-1	213		26473.07	26469.49
E81-2	214		27788.89	27786.73
					E82	215	39
E82-1	216		26473.07	26469.49
					E82-2	217		28251.61	28249.21
E83	218	36
					E83-1	219		26473.07	26469.49
E83-2	220		28162.29	28159.12
					E84	221	34
E84-1	222		26551.48	26549.47
					E84-2	223		28413.80	28411.21
E85	224			29801.39
					E86	225			29590.50
E87	226			30029.79
					E88	227			29508.41
E89	228			29063.16
					E90	229			29061.12
E91	230			28553.80
					E92	231			28472.50
E93	232			30011.70

[表3-8]

E94	233			30606.29
					E95	234	37
E95-1	235		26473.07	26469.49
					E95-2	236		29271.38	29268.33
E96	237		29789.00	29788.24
					E97	238		29644.33	29643.40
E98	239		30036.67	30035.84
					E99	240			29833.53
E100	241			30075.98
					E101	242			30638.43
E102	243			30542.01
					E103	244			30172.40
E104	245		28940.81	28939.66
					E105	246			29487.04
E106	247		28829.04	28827.66
					E107	248			29455.04
E108	249		28534.84	28533.38
					E109	250			29370.96
E110	251			29789.25
					E1 11	252			29789.25
E112	253			29791.25
					E113	254			29909.55
E114	255			29909.55
					E115	256			29923.58
E116	257			29637.34
					E117	258			29679.40
E118	259			29649.38
					E119	260			30420.20
E120	261			29959.40
					E121	262			28945.66
E122	263			29503.04
					E123	264			28833.66
E124	265			28539.38

[表3-9]

E125	266			29809.25
					E126	267			29929.55
E127	268		29812.73	29811.25
					E128	269			29943.58
E129	270			29951.55
					E130	271		30081.52	30083.88
E131	272		29964.62	29963.58
					E132	273			29831.25
E133	274			29929.55
					E134	275			30049.85
E135	276			29931.55
					E136	277			30063.88
E137	278			30071.85
					E138	279			30204.18
E139	280			30083.88
					E140	281			29951.55
E141	282		29241.57	29240.29
					E142	283		29121.04	29119.99
E143	284		29008.69	29007.99
					E144	285		28714.90	28713.71
E145	286			30027.76
					E146	287			29931.52
E147	288			29845.37
					E148	289			29821.31
E149	290			30027.76
					E150	291			29931.52
E151	292			30027.76
					E152	293			29931.52
E153	294			29657.77
					E154	295		29933.20	29931.97
E155	296		29702.81	29701.82
					E156	297			29427.62
E157	298			29929.98

[表3-10]

E158	299			29974.03
					E159	300			29699.83
E160	301			29967.96
					E161	302			29773.81
E162	303			29936.85
					E163	304			29741.75
E164	305	29
					E164-1	306		25935.53	25934.17
E164-2	307		34415.78	34415.37
					E165	308	38
E165-1	309		26277.38	26277.25
					E165-2	310		28410.45	28411.21
E166	311	22
					E166-1	312		26502.04	26502.23
E166-2	313		28732.35	28732.61
					E167	314	25
E167-1	315		26519.56	26519.70
					E167-2	316		28410.62	28411.21
E168	317	30
					E168-1	318		26744.10	26744.68
E168-2	319		28732.31	28732.61
					E169	320	9
E169-1	321		26098.47	26098.50
					E169-2	322		28411.47	28411.21
E170	323	11
					E170-1	324		26324.51	26323.48
E170-2	325		28733.32	28732.61
					E171	326	18
E171-1	327		26745.90	26744.68
					E171-2	328		28841.81	28840.88
E172	329	14
					E172-1	330		26197.62	26196.90
E172-2	331		28412.69	28411.21

[表3-11]

E173	332	13
					E173-1	333		26439.77	28439.35
E173-2	334		28411.59	28411.21
					E174	335	10
E174-1	336		26018.71	26018.15
					E174-2	337		28410.90	28411.21
E175	338
					E176	339
E177	340
					E178	341
E179	342
					E180	343	39
E180-1	344		25848.81	25848.42
					E180-2	345		27801.90	27801.40
E181	346	38
					E181-1	347		26072.74	26073.40
E181-2	348		28122.75	28122.80
					E182	349
E183	350	28
					E183-1	351		29930.55	29930.73
E183-2	352		28410.81	28411.21
					E184	353	38
E184-1	354		30252.99	30253.33
					E184-2	355		28410.44	28411.21
E185	356	37
					E185-1	357		30172.51	30172.98
E185-2	358		28410.83	28411.21
					E186	359
E187	360	26
					E187-1	361		30824.36	30824.47
E187-2	362		28410.35	28411.21

[表3-12]

E188	363	33
					E188-1	364		30743.93	30744.12
E188-2	365		28410.48	28411.21
					E189	366
E190	367	25
					E190-1	368		17525.61	17525.85
E190-2	369		28410.36	28411.21
					E191	370	26
E191-1	371		17493.47	17493.71
					E191-2	372		28410.96	28411.21
E192	373
					E193	374	20
E193-1	375		26216.77	26216.90
					E193-2	376		27940.07	27939.43
E194	377	32
					E194-1	378		25373.27	25373.31
E194-2	379		27940.10	27939.43
					E195	380	32
E195-1	381		25930.83	25930.69
					E195-2	382		27940.27	27939.43
E196	383	30
					E196-1	384		25930.59	25930.69
E196-2	385		27940.25	27939.43
					E197	386	32
E197-1	387		26216.56	26216.90
					E197-2	388		27637.91	27637.23
E198	389	37
					E198-1	390		26216.96	26216.90
E198-2	391		27669.13	27669.21
					E199	392	44
E199-1	393		26216.79	26216.90
					E199-2	394		27129.39	27128.77
E200	395		29860.16	29859.70

[表3-13]

E201	396		29677.75	29676.50
					E202	397		29589.55	29588.58
E203	398		29629.67	29628.60
					E204	399			29969.69
E205	400			29837.46
					E206	401			29885.67
E207	402			29855.57
					E208	403			29649.19
E209	404			29753.17
					E210	405		29637.84	29637.01
E211	406		29685.10	29685.22
					E212	407		29623.80	29622.98
E213	408		29450.09	29448.74
					E214	409		31162.10	31160.07
E215	410
					E215-1	411
E215-2	412
					E216	413
E216-1	414
					E216-2	415

[表3-14]

E220	448	51
						E220-1	449		25738.08		25738.44
E220-2	450		22666.65		22666.75
						E221	451	42
E221-1	452		25738.02		25738.44
						E221-2	453		24312.63		24312.80
E222	454	35
						E222-1	455		26438.06		26439.35
E222-2	456		23128.13		23129.83
						E223	457	32
E223-1	458		26438.10		26439.35
						E223-2	459		24925.92		24926.38
E224	460	31
						E224-1	461		26438.89		26439.35
E224-2	462		28409.93		28411.21
						E225	463	34
E225-1	464		26354.29		26355.37
						E225-2	465		28583.28		28597.46
E226	466		21600.06		21599.05
						E227	467		21684.46		21683.23
E228	468		21720.56		21719.23
						E229	469		21719.88		21719.23
E230	470		29325.79		29324.77
						E231	471		29360.60		29358.77
E232	472		29359.83		29358.77
						E233	473		29359.41		29358.77
E234	474		29067.47		29066.87
						E235	475		29736.14		29735.25
E236	476		29217.34		29216.50
						E237	477		29069.55		29068.58
E238	478		29389.66		29389.05
						E239	479		29800.31		29799.53
E240	480		29133.00		29132.86

以下4-1～表4-3中示出实施例4使用的化合物(多核苷酸)的序列信息。

表4-1～表4-3：

[表4-1]

[表4-2]

[表4-3]

实施例4(3片段的酶连结)

同时使用通过固相合成而得到的RNA片段E217-1、E217-2、E217-3、模板DNA2及模板DNA3，除此以外，与实施例1同样地操作，得到RNA连结产物E217(8.9nmol，收率45％)。

同时使用通过固相合成而得到的RNA片段E218-1、E218-2、E218-3、模板DNA2及模板DNA3，除此以外，与实施例1同样地操作，得到RNA连结产物E218(2.6nmol，收率13％)。

同时使用通过固相合成而得到的RNA片段E219-1、E219-2、E219-3、模板DNA2及模板DNA3，除此以外，与实施例1同样地操作，得到RNA连结产物E219(1.4nmol，收率7％)。

试验例1

(mRNA样品的使用了Hela细胞株裂解物(lysate)的翻译反应试验)

针对以下表5-1～表5-25中记载的各mRNA，使用1-Step Human Coupled IVT Kit(Thermo Fisher Scientific公司制，目录号88882)对人细胞系中的翻译活性进行评价。首先，以各mRNA的终浓度成为0.3μM的方式，利用THE RNA storage solution(Thermo FisherScientific公司，目录号AM7001)进行稀释，将得到的各mRNA以各1μL的量分注至96孔PCR板(As ONE公司)中。接着，将每一反应5.0μL的Hela Lysate、每一反应1.0μL的AccessoryProteins、每一反应2.0μL的Reaction Mix、每一反应0.2μL的RNase Inhibitor,Murine(New England Biolabs公司制，目录号M0314)及每一反应0.8μL的纯化水混合，制备预混液，以各9μL的量分注至添加了mRNA样品的PCR板中，在添加、混合后，于37℃静置45分钟，由此进行翻译反应。

翻译反应后的反应溶液中的翻译产物利用以下记载的夹心ELISA法检测。首先，用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.4)将6*His,His-Tag抗体(Proteintech公司，目录号66005-1-Ig)稀释为3μg/mL，以每一孔50μL的方式分注至96孔ELISA用板(NUNC公司制)，于4℃静置一晚，由此制作进行了抗体的固定化的板。接着，利用以纯化水稀释为1倍浓度的Tris BufferedSaline with Tween 20(Santa Cruz公司，目录号sc-24953)(以下，记载为清洗溶液)对板进行清洗后，以每一孔200μL分注将牛血清白蛋白(和光纯药公司，目录号017-22231)以终浓度成为3％的方式进行稀释而得的清洗溶液(以下，记载为封闭溶液)，于室温静置1小时。用清洗溶液将板清洗后，将利用封闭溶液进行稀释而得的翻译反应溶液以每一孔50μL的方式进行分注，于室温静置1小时。此时，同样利用封闭溶液将以下所示的翻译产物多肽标准品(COSMO BIO公司制)稀释为各浓度，然后分注至板。用清洗溶液将板清洗后，将利用封闭溶液稀释至10,000倍的Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP)Ab produced inmouse(SIGMA公司制，目录抗体A8592-1MG)以每一孔50μL的方式进行分注，于室温静置1小时。用清洗溶液将板清洗后，以每一孔50μL分注1-Step Ultra TMB-ELISA(Thermo FisherScientific公司制，目录号34028)，于室温静置数分钟。然后，以每一孔50μL的方式分注0.5M硫酸(和光纯药工业公司制)而使反应停止后，使用吸光光度计(Bio-Rad公司制)，对测定波长450nm、参照波长570nm处的吸光度进行测定。将使用基于多肽标准品的吸光度制作的标准曲线进行定量而得的、各翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)、以及不具有糖修饰的化合物E3设为1时的相对翻译产物量记载于下述表5。

翻译产物多肽标准品：NH₂-MDYKDDDDKIIDYKDDDDKGGDYKDDDDKHHHHHH-COOH(序列号430)

表5-1～表5-25：

[表5-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E5	14	2.047	1.84
E13	38	7.100	6.38
				E14	41	7.700	6.92
E15	44	6.713	6.03
				E16	47	7.420	6.66
E17	50	11.187	10.05
				E3	8	1.113	1.00

[表5-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E5	14	2.420	2.16
E18	53	0.860	0.77
				E19	56	1.693	1.51
E20	59	1.613	1.44
				E3	8	1.120	1.00

[表5-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E5	14	0.867	8.67
E21	62	2.653	26.53
				E22	65	3.293	32.93
E3	8	0.100	1.00

[表5-4]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E5	14	0.980	8.17
E18	53	0.333	2.78
				E20	59	0.727	6.06
E23	68	0.133	1.11
				E24	71	0.420	3.50
E25	74	0.407	3.39
				E3	8	0.120	1.00

[表5-5]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.973	1.48
E7	20	3.807	2.86
				E26	77	4.607	3.46
E27	80	7.433	5.58
				E28	83	3.727	2.80
E29	86	7.140	5.36
				E3	8	1.333	1.00

[表5-6]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E5	14	3.740	3.17
E23	68	0.687	0.58
				E32	91	1.240	1.05
E33	94	1.800	1.53
				E34	97	0.960	0.81
E35	100	0.767	0.65
				E3	8	1.180	1.00

[表5-7]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E10	29	2.813	1.91
E32	91	1.040	0.71
				E36	103	0.953	0.65
E37	106	0.313	0.21
				E38	109	0.027	0.02
E39	112	0.020	0.01
				E3	8	1.473	1.00

[表5-8]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E6	17	0.720	0.96
E40	115	0.287	0.38
				E41	118	0.073	0.10
E42	121	1.487	1.99
				E43	124	3.467	4.64
E44	127	3.800	5.09
				E3	8	0.747	1.00

[表5-9]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E10	29	3.087	2.91
E36	103	0.993	0.94
				E47	136	0.373	0.35
E48	137	0.227	0.21
				E49	138	0.953	0.90
E50	139	0.620	0.58
				E3	8	1.060	1.00

[表5-10]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	3.133	15.67
E15	44	67.533	337.67
				E45	130	35.400	177.00
E46	133	77.333	386.67
				E3	8	0.200	1.00

[表5-11]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA.名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	0.933	4.67
E12	35	119.467	597.33
				E55	152	84.067	420.33
E56	155	34.800	174.00
				E57	158	76.200	381.00
E60	167	51.800	259.00
				E3	8	0.200	1.00

[表5-12]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E11	32	40.667	203.33
E55	152	73.600	368.00
				E58	161	41.933	209.67
E59	164	72.867	364.33
				E3	8	0.200	1.00

[表5-13]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E10	29	6.333	12.67
E36	103	0.667	1.33
				E47	136	0.333	0.67
E49	138	0.500	1.00
				E51	140	16.667	33.33
E52	143	0.833	1.67
				E3	8	0.500	1.00

[表5-14]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E10	29	5.500	11.00
E11	32	39.000	78.00
				E12	35	118.167	236.33
E53	146	78.000	156.00
				E54	149	104.167	208.33
E55	152	83.167	166.33
				E3	8	0.500	1.00

[表5-15]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.833	3.67
E12	35	228.167	456.33
				E55	152	87.000	174.00
E56	155	49.333	98.67
				E70	195	72.333	144.67
E3	8	0.500	1.00

[表5-16]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.833	2.75
E11	32	75.000	112.50
				E69	192	15.167	22.75
E3	8	0.667	1.00

[表5-17]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mmRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	111	1.167	2.33
E56	155	51.500	103.00
				E62	171	99.333	198.67
E63	174	98.333	196.67
				E64	177	43.833	87.67
E65	180	48.833	97.67
				E3	8	0.500	1.00

[表5-18]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.333	2.67
E10	29	6.167	12.33
				E47	136	0.500	1.00
E51	140	19.667	39.33
				E58	161	59.000	118.00
E164	305	109.000	218.00
				E3	8	0.500	1.00

[表5-19]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.500	3.00
E64	177	25.833	51.67
				E65	180	23.333	46.67
E66	183	14.833	29.67
				E67	186	25.000	50.00
E68	189	10.667	21.33
				E3	8	0.500	1.00

[表5-20]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.500	3.00
E56	155	32.500	65.00
				E2	5	22.000	44.00
E67	188	21.333	42.67
				E79	206	16.833	33.67
E95	234	20.833	41.67
				E3	8	0.500	1.00

[表5-21]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.500	3.00
E79	206	22.500	45.00
				E80	209	12.667	25.33
E81	212	19.500	39.00
				E82	215	21.833	43.67
E83	218	23.167	46.33
				E3	8	0.500	1.00

[表5-22]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.000	-
E165	308	42.000	-
				E166	311	29.667	-
E167	314	19.167	-
				E169	320	37.167	-
E172	329	28.833	-
				E3	8	0.000	-

[表5-23]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.167	-
E166	311	35.833	-
				E167	314	22.000	-
E168	317	8.833	-
				E171	326	9.667	-
E173	332	7.333	-
				E3	8	0.000	-

[表5-24]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.667	5.00
E165	308	63.667	191.00
				E167	314	21.833	65.50
E169	320	55.500	166.50
				E170	323	35.833	107.50
E174	335	38.167	114.50
				E3	8	0.333	1.00

[表5-25]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E4	11	1.000	2.00
E84	221	11.167	22.33
				E3	8	0.500	1.00

由上述表5-1～表5-25所示的试验结果可知，具有糖修饰的各mRNA添加于Hela细胞裂解物中后，通过真核细胞的翻译系统而产生由基因序列编码的多肽。

试验例2

(mRNA样品的使用了Hela细胞株的体外(in vitro)翻译反应试验)

针对以下6-1～表6-9中记载的各mRNA，使用Hela细胞株来评价体外的翻译活性。首先，将含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Nacalai Tesque公司制)中悬浮的Hela细胞以每一孔的细胞数成为10,000个细胞/100μL的方式接种于96孔贴壁细胞用培养板，在37℃、5％CO₂条件下培养一晚。从培养一晚后的细胞中将培养上清液除去，以每一孔40μL添加含有10％胎牛血清的RPMI培养基，然后，以各mRNA的终浓度成为3nM、10nM及30nM的方式，用Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific公司制，目录号:31985-070)将各mRNA与终浓度0.3％的Lipofectamin MessengerMAX Transfection Reagent(Thermo FisherScientific公司制，目录号:LMRNA008)稀释后混合，将混合液以成为每一孔10μL的方式添加于各培养板中，在37℃、5％CO₂条件下培养5小时。从培养5小时后的细胞中将培养上清液除去，用经冰冷却的D-PBS(-)(Nacalai Tesque公司制)清洗一次后，以每一孔20μL加入包含2％的蛋白酶抑制剂混合物(动物细胞提取物用，Nacalai Tesque公司制)的iScript RT-qPCR Sample Preparation Reagent(Bio-Rad公司，1708898)，充分渗透30秒而将细胞溶解。

得到的细胞溶解液中的翻译产物利用与试验例1中记载的夹心ELISA法同样的方法实施。关于测定的结果，将使用基于多肽标准品的吸光度制作的标准曲线进行定量而得的各翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表6。

表6-1～表6-9：

[表6-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表6-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表6-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表6-4]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表6-5]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表6-6]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表6-7]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表6-8]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表6-9]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

由上述表6-1～表6-9所示的试验结果可知，具有糖修饰的各mRNA添加于Hela细胞中后，产生由基因序列编码的多肽，其翻译量优于不具有糖修饰的mRNA。

试验例3

(mRNA样品的使用了Hela细胞株的体外翻译反应试验)

针对下述表7-1～表7-4中记载的各mRNA，使用Hela细胞株对体外的翻译活性的持续性进行评价。就细胞的培养和mRNA的导入而言，除了以各mRNA的终浓度成为30nM的方式进行制备以外，利用与试验例2同样的方法实施。添加各mRNA并培养4小时后，从细胞除去培养上清液，以每一孔50μL加入含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Nacalai Tesque公司制)，在37℃、5％ CO₂条件下继续培养。在从各mRNA的添加时间点起5小时后、8小时后、及24小时后分别从培养后的细胞除去培养上清液，利用与试验例2同样的方法将细胞溶解。

关于得到的细胞溶解液中的翻译产物，利用与试验例1中记载的夹心ELISA法同样的方法实施。关于测定的结果，将使用基于多肽标准品的吸光度制作的标准曲线进行定量而得的各翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表7。

表7-1～表7-4：

[表7-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表7-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表7-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表7-4]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

由上述表7-1～表7-4所示的试验结果可知，具有糖修饰的各mRNA添加于Hela细胞中后，产生由基因序列编码的多肽，其翻译量优于不具有糖修饰的mRNA。

试验例4

(mRNA样品的使用了Hela细胞株的体外翻译反应试验)

针对下述表8-1～表8-8中记载的各mRNA，使用Hela细胞株来评价体外的翻译活性。

首先，将各mRNA以成为19μM的方式用THE RNA Storage Solution(Thermo FisherScientific公司制，目录号AM7000)进行稀释。Hela细胞株悬浮于含有终浓度1％的牛血清白蛋白(和光纯药公司，目录号017-22231)的Opti-MEM I Reduced Serum Media(ThermoFisher Scientific公司制，目录号31985070)中后，以90xg于室温离心10分钟，小心除去上清液后，以成为200,000个细胞/19μL的方式悬浮于1％SE Cell Line 96-wellNucleofector Kit(Lonza公司制，目录号V4SC-1096)附带的SE Cell Line NucleofectorSolution及Supplement 1的混合液中。将制备的mRNA溶液与Hela细胞悬浮液以1:19的体积比混合，然后使用Nucleofector ^TM 96-well Shuttle系统(Lonza公司制)，在FF-150的脉冲条件下实施电穿孔。将电穿孔10分钟后的细胞悬浮于含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Nacalai Tesque公司制)中，以每一孔的细胞数成为50,000个细胞/145μL的方式接种于96孔贴壁细胞用培养板，在37℃、5％ CO₂条件下进行培养。针对培养后3小时、8小时、24小时后的各细胞，除去培养上清液，用经冰冷却的D-PBS(-)(Nacalai Tesque公司制)清洗一次后，以每一孔20μL加入包含2％的蛋白酶抑制剂混合物(动物细胞提取物用，NacalaiTesque公司制)的iScript RT-qPCR Sample Preparation Reagent(Bio-Rad公司，1708898)，充分渗透30秒而将细胞溶解。

关于得到的细胞溶解液中的翻译产物，利用与试验例1中记载的夹心ELISA法同样的方法实施。关于测定的结果，将使用基于多肽标准品的吸光度制作的标准曲线进行定量而得的各翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表8。

表8-1～表8-8：

[表8-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.000	0.000
					E12	35	0.627	0.318	0.020
E55	180	0.633	0.577	0.370
					E56	183	0.730	0.733	0.663
E70	195	0.403	0.240	0.037

[表8-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.010	0.000	0.010
					E62	171	1.270	0.997	0.203
E63	174	1.027	0.873	0.453
					E64	177	0.840	0.747	0.283
E67	186	1.017	0.890	0.597
					E68	189	0.460	0.477	0.237

[表8-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA 3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.010	0.0oo	0.007
					E79	206	0.543	0.540	0.300
E80	209	0.047	0.027	0.010
					E81	212	0.620	0.500	0.280
E82	215	0.507	0.507	0.273
					E95	234	0.640	0.567	0.297

[表8-4]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.010	0.010	0.010
					E13	38	0.037	0.010	0.007
E14	41	0.010	0.010	0.007
					E15	44	0.517	0.183	0.020
E16	47	0.050	0.010	0.000
					E17	50	0.670	0.380	0.037

[表8-5]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.000	0.000
					E7	20	0.043	0.000	0.000
E26	77	0.537	0.183	0.000
					E27	80	0.317	0.050	0.000
E28	83	0.183	0.040	0.000
					E29	86	0.093	0.017	0.000

[表8-6]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.000	0.000
					E7	20	0.023	0.000	0.000
E9	26	0.413	0.123	0.000
					E26	77	0.397	0.117	0.000
E27	80	0.230	0.037	0.000
					E28	83	0.137	0.030	0.000

[表8-7]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.000	0.000
					E56	155	0.613	0.537	0.343
E79	206	0.360	0.373	0.190
					E95	234	0.407	0.447	0.203

[表8-8]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mmRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E58	161	0.130	0.100	0.000
					E164	305	0.143	0.147	0.010

由上述8-1～表8-8所示的试验结果可知，具有糖修饰的mRNA电穿孔至Hela细胞后，产生由基因序列编码的多肽，其活性较之不具有糖修饰的mRNA更优异。其中，根据表8-5所示的试验结果可知，与构成多聚A链的核苷酸的50％进行了糖修饰的E29相比，构成多聚A链的核苷酸的65％以上进行了糖修饰的E26、E27及E28显示出更优异的翻译活性。

试验例5

(mRNA样品的使用了人大动脉平滑肌细胞的体外翻译反应试验)

针对表9-1～表9-3中记载的各mRNA，使用人大动脉平滑肌细胞(Human AorticSmooth Muscle Cells，Lonza公司制，CC-2571。以下，有时也记载为hAoSMC)，评价体外的翻译活性。首先，使用SmGM-2BulletKit培养基(Lonza公司制，CC-3182)，如制造者手册记载进行培养，使用得到的hAoSMC，将SmGM-2BulletKit培养基中悬浮的hAoSMC以每一孔的细胞数成为10,000个细胞/100μL的方式接种于96孔贴壁细胞用培养板，在37℃、5％ CO₂条件下培养一晚。从培养一晚后的细胞除去培养上清液，以每一孔40μL添加SmGM-2BulletKit培养基后，以各mRNA的终浓度成为3nM、10nM及30nM的方式，用Opti-MEM(Thermo FisherScientific公司制，目录号:31985-070)将各mRNA与终浓度0.3％的LipofectaminMessengerMAX Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific公司制，目录号:LMRNA008)稀释后混合，将混合液以成为每一孔10μL的方式添加于各培养板中，在37℃、5％CO₂条件下培养5小时。从培养5小时后的细胞除去培养上清液，用经冰冷却的D-PBS(-)(Nacalai Tesque公司制)清洗一次后，以每一孔20μL加入包含2％的蛋白酶抑制剂混合物(动物细胞提取物用，Nacalai Tesque公司制)的iScript RT-qPCR Sample PreparationReagent(Bio-Rad公司，1708898)，充分渗透30秒而将细胞溶解。

关于得到的细胞溶解液中的翻译产物，利用与试验例1中记载的夹心ELISA法同样的方法实施。关于测定的结果，将使用基于多肽标准品的吸光度制作的标准曲线进行定量而得的各翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表9。

表9-1～表9-3：

[表9-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

/>

[表9-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表9-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

由上述表9-1～表9-3所示的试验结果可知，具有糖修饰的各mRNA添加至hAoSMC中后，产生由基因序列编码的多肽，其翻译量优于不具有糖修饰的mRNA。

试验例6

(mRNA样品的使用了人大动脉平滑肌细胞的体外翻译反应试验)

针对下述表10-1～表10-5中记载的各mRNA，使用人大动脉平滑肌细胞来评价体外的翻译活性。

首先，将各mRNA以成为19μM的方式用THE RNA Storage Solution(Thermo FisherScientific公司制，目录号AM7000)进行稀释。hAoSMC悬浮于含有终浓度1％的牛血清白蛋白(和光纯药公司，目录号017-22231)的Opti-MEM I Reduced Serum Media(ThermoFisherScientific公司制，目录号31985070)中后，以90xg于室温离心10分钟，小心除去上清液后，以成为100,000个细胞/19μL的方式悬浮于P1 Primary Cell 96-well Nucleofector Kit(Lonza公司制，目录号V4SP-1096)附带的P1 Primary Cell Nucleofector Solution及Supplement 1的混合液中。将制备的mRNA溶液与hAoSMC悬浮液以1:19的体积比混合后，使用Nucleofector ^TM 96-well Shuttle系统(Lonza公司制)，在FF-130的脉冲条件下实施电穿孔。将电穿孔10分钟后的细胞悬浮于SmGM-2BulletKit培养基(Lonza公司制，CC-3182)中，以每一孔的细胞数成为20,000个细胞/145μL的方式接种于96孔贴壁细胞用培养板，在37℃、5％ CO₂条件下进行培养。针对培养后4小时、8小时、24小时后的各细胞，除去培养上清液，用经冰冷却的D-PBS(-)(Nacalai Tesque公司制)清洗一次后，以每一孔20μL加入包含2％的蛋白酶抑制剂混合物(动物细胞提取物用，Nacalai Tesque公司制)的iScript RT-qPCR Sample Preparation Reagent(Bio-Rad公司，1708898)，充分渗透30秒而将细胞溶解。

关于得到的细胞溶解液中的翻译产物，利用与试验例1中记载的夹心ELISA法同样的方法实施。关于测定的结果，将使用基于多肽标准品的吸光度制作的标准曲线进行定量而得的各翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表10。

表10-1～表10-5：

[表10-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA4小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.003	0.000	0.000
					E13	38	0.007	0.003	0.000
E14	41	0.003	0.000	0.000
					E15	44	0.023	0.027	0.010
E16	47	0.023	0.023	0.003
					E17	50	0.017	0.017	0.007

[表10-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA4小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.ooo	0.000
					E12	35	0.027	0.033	0.010
E55	152	0.033	0.050	0.027
					E56	155	0.027	0.043	0.043
E70	195	0.023	0.033	0.013

[表10-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA4小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.000	0.000
					E65	180	0.043	0.077	0.047
E66	183	0.040	0.083	0.060
					E68	189	0.010	0.010	0.010
E67	186	0.020	0.030	0.023

[表10-4]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA4小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.003	0.003	0.000
					E79	206	0.124	0.122	0.079
E80	209	0.030	0.023	0.007
					E81	212	0.127	0.142	0.085
E95	234	0.139	0.170	0.094

[表10-5]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA4小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.000	0.000
					E56	155	0.197	0.220	0.163
E79	206	0.103	0.120	0.093

由上述表10-1～表10-5所示的试验结果可知，具有糖修饰的mRNA电穿孔至hAoSMC后，产生由基因序列编码的多肽，其活性较之在翻译区不具有糖修饰的mRNA更优异。

试验例7

(mRNA样品的血清中稳定性试验)

针对下述表11中记载的各mRNA，使用市售小鼠血清(kohjin-bio，目录号12081001)来评价血清中核酸稳定性。首先，利用UltraPure DNase/RNase-Free DistilledWater(DW)(invitrogen，目录号10977-015)将小鼠血清稀释50倍，制备稀释血清溶液。用THE RNA storage solution(Thermo Fisher Scientific公司，目录号AM7001)将各mRNA稀释成为5μM。

作为用于酶未反应(0min)的情况，向另一96孔PCR板添加稀释血清溶液8μL、6U/μL核糖核酸酶抑制剂(TAKARA BIO，目录号2311B)2.5μL的混合溶液10.5μL、及5μM mRNA 2μL，于-30℃保存。作为用于酶反应的情况，向又一96孔PCR板中添加稀释血清溶液8μL和5μMmRNA 2μL，充分混合。使PCR板于37℃反应规定的时间(15min、30min、60min)后，添加2.5μL的6U/μL Rnase inhibitor，于-30℃保存至测定为止。

酶反应后的反应溶液中的残留mRNA量利用以下记载的RT-qPCR法进行检测。对每个评价的mRNA分别制作标准曲线，针对各mRNA，利用THE RNA storage solution从4μM按照4倍稀释取11点浓度，制作稀释系列。使用加入有终浓度为0.2U/mL的核糖核酸酶抑制剂的DW，将标准曲线及酶反应后的样品2.5μL稀释1071倍。使用该稀释的试样5μL及2μM RT引物(Sigma-Aldrich公司)1μL，通过TaqMan Micro RNA RT kit(Thermo Fisher Scientific，目录号4366597)制作逆转录产物cDNA。就反应温度而言，以16℃ 30min→42℃ 30min→85℃ 5min实施。将cDNA 5μL、TaqMan Gene Expression Master Mix10μL、Fw引物(Sigma-Aldrich公司)0.28μL、Rv引物(Sigma-Aldrich公司)0.33μL、TaqMan MGB探针(ThermoFisher Scientific公司，目录号4316033)0.38μL及蒸馏水4.01μL混合，进行qPCR测定。设备使用Quantstudio 12K Flex(Applied Biosystems)。另外，使用的Primer及Taqman MGB探针的DNA序列如下。关于测定的结果，基于标准品的CT值，使用标准曲线而将各试样中的各mRNA的浓度定量，作为相对于酶未反应(0分钟)而言的相对残留量进行计算，将算出的结果记载于下表。

RT引物：5’-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG-3’(序列号431)

Fw引物：5’-ATCTTGTCGTCGTCGTCCTT-3’(序列号432)

Rv引物：5’-GAATACAAGCTACTTGTTCTTTT-3’(序列号433)

Taqman MGB探针：5’-CAGCCACCATG-3’(序列号434)

表11：

[表11]

各反应时间点的、相对于酶未反应(0分钟)而言的各mRNA的相对残留量

mRNA名	序列号	0分钟	15分钟	30分钟	60分钟
						E4	11	1.000	0.387	0.199	0.062
E12	35	1.000	0.516	0.330	0.149
						E55	152	1.000	0.788	0.644	0.550
E56	155	1.000	0.854	0.805	0.772

由上述表11所示的试验结果可知，与不具有糖修饰的mRNA相比，具有糖修饰的mRNA在血清中的耐分解性提高。

试验例8

(mRNA样品的使用了Hela细胞株裂解物的翻译反应试验)

针对下述表12-1～表12-7中记载的各mRNA，使用1＝Step Human Coupled IVTKit(Thermo Fisher Scientific公司制，目录号88882)来对人细胞系中的翻译活性进行评价。翻译反应利用与试验例1同样的方法，在mRNA成为终浓度1μM的条件下进行。

就翻译反应后的反应溶液中的翻译产物而言，按照试验例1中记载的夹心ELISA法的方法，使用以下所示的肽(COSMO BIO公司制)作为翻译产物多肽标准品，除此以外，利用同样的方法实施。将使用基于多肽标准品的吸光度制作的标准曲线进行定量而得的、各翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)、以及不具有糖修饰的E30设为1时的相对翻译产物量记载于以下表12。

翻译产物多肽标准品：NH₂-MDYKDDDDKGGHHHHHH-COOH(序列号435)

表12-1～表12-7：

[表12-1]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E31	90	25.993	4.71
E71	198	10.892	1.97
				E72	199	19.436	3.52
E73	200	20.622	3.73
				E74	201	19.338	3.50
E75	202	8.980	1.63
				E76	203	15.411	2.79
E77	204	15.536	2.81
				E78	205	10.471	1.90
E85	224	19.894	3.60
				E86	225	13.435	2.43
E87	226	11.132	2.02
				E88	227	12.522	2.27
E89	228	18.310	3.32
				E90	229	11.413	2.07
E91	230	14.883	2.69
				E92	231	21.319	3.86
E30	89	5.523	1.00
				E61	170	16.168	2.93

[表12-2]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E93	232	3.464	0.61
E94	233	6.309	1.11
				E96	237	14.861	2.60
E97	238	22.251	3.90
				E98	239	9.450	1.66
E99	240	14.573	2.55
				E100	241	8.723	1.53
E101	242	13.510	2.37
				E102	243	11.197	1.96
E103	244	4.959	0.87
				E104	245	25.710	4.50
E105	246	12.564	2.20
				E106	247	16.057	2.81
E107	248	13.531	2.37
				E108	249	20.671	3.62
E30	89	5.709	1.00
				E61	170	11.057	1.94

[表12-3]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E019	250	18.672	4.04
E110	251	12.976	2.81
				E111	252	13.883	3.00
E112	253	11.138	2.41
				E113	254	13.333	2.88
E114	255	11.570	2.50
				E115	256	13.348	2.89
E116	257	20.125	4.35
				E117	258	14.713	3.18
E118	259	19.148	4.14
				E119	260	7.051	1.52
E120	261	1.294	0.28
				E121	262	22.516	4.87
E122	263	16.092	3.48
				E123	264	22.733	4.92
E124	265	23.290	5.04
				E125	266	10.663	2.31
E30	89	4.625	1.00
				E61	170	13.887	3.00

[表12-4]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E126	267	7.770	1.84
E127	268	7.617	1.81
				E128	269	6.520	1.55
E129	270	4.105	0.97
				E130	271	4.843	1.15
E131	272	3.846	0.91
				E132	273	2.425	0.58
E133	274	6.694	1.59
				E134	275	8.231	1.95
E135	276	6.688	1.59
				E136	277	7.887	1.87
E137	278	6.767	1.61
				E138	279	4.118	0.98
E139	280	2.913	0.69
				E140	281	6.503	1.54
E141	282	17.884	4.24
				E142	283	18.111	4.30
E30	89	4.216	1.00
				E61	170	9.462	2.24

[表12-5]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E143	284	11.167	3.13
E144	285	15.514	4.34
				E145	286	5.484	1.53
E146	287	5.053	1.41
				E147	288	13.516	3.78
E148	289	12.278	3.44
				E149	290	4.911	1.37
E150	291	4.017	1.12
				E151	293	3.751	1.05
E152	293	3.476	0.97
				E153	294	16.010	4.48
E154	295	12.791	3.58
				E155	296	14.127	3.95
E156	297	15.781	4.42
				E157	298	10.380	2.90
E158	299	10.570	2.96
				E159	300	16.523	4.62
E30	89	3.574	1.00
				E61	170	10.746	3.01

[表12-6]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E160	301	9.461	3.65
E161	302	10.070	3.88
				E162	303	8.835	3.41
E163	304	13.862	5.35
				E30	89	2.593	1.00
E61	170	7.277	2.81

[表12-7]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E71	198	11.680	2.31
E72	199	20.707	4.10
				E74	201	22.307	4.41
E85	224	24.987	4.94
				E98	239	10.253	2.03
E200	395	19.160	3.79
				E201	396	i9.480	3.85
E202	397	16.533	3.27
				E203	394	15.347	3.04
E30	89	5.053	1.00

由上述表12-1～12-7所示的试验结果可知，各mRNA添加于Hela细胞裂解物中后，通过真核细胞的翻译系统而产生由基因序列编码的多肽。

实施例5

(翻译VEGF的mRNA的合成)

示出翻译成VEGF蛋白质的mRNA的合成中使用的材料(多核苷酸)的序列信息。

表13：

[表13]

通过以下的一系列操作，得到mRNA(VEGF-1,VEGF-2,VEGF-3)。

(工序1：线性化质粒DNA的制备和利用体外转录进行的RNA片段的制备)

质粒DNA使用将表13所示的人工合成基因序列GN插入至市售的pUC19载体的EcoRV位点及XbaI位点而得的DNA(株式会社GENEWIZ制)。使用限制性内切酶XbaI对质粒DNA进行直链化。反应液的终浓度设为质粒DNA 20ng/μL,0.01％ BSA,Xba I 0.15U/μL(Takara1093A),1x附带缓冲液。于37度进行2小时孵育后，进行苯酚氯仿提取、异丙醇沉淀，得到直链化质粒的粗产物。使用得到的模板DNA和T7 RNA Polymerase进行转录反应。反应液的终浓度如以下所示。模板DNA 10ng/μL,DTT 5mM,ATP 2mM,CTP 2mM,UTP 2mM,GMP 2mM,GTP0.5mM,Murine RNase inhibitor 0.2U/μL(NEB,M0314),T7 RNA Polymerase 2.5U/μL(Takara,2540A),1x附带缓冲液。于37度进行2小时孵育后，添加DNase(Takara,2270A)终浓度为0.1U/μL的分量，于该温度进行30分钟孵育。进行苯酚氯仿提取、Amicon 10K处理(Merck Millipore)、异丙醇沉淀，得到转录产物的粗产物。在改性聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动后，切出相应的条带，用MQ水进行提取，通过Amicon纯化及异丙醇沉淀而得到纯化RNA。接着，通过RNA 5’Pyrophosphohydrolase(RppH)处理，进行末端三磷酸体向单磷酸体的转变。反应溶液的终浓度如下所示；RNA 0.1μg/μL,RppH 0.1U/μL,Murine RNase inhibitor1U/μL(NEB,M0314),1x NEBuffer 2(NEB,B7992S)。于37度进行30分钟孵育后，进行苯酚氯仿提取、异丙醇沉淀，得到作为目标的3’末端侧多核苷酸片段的多核苷酸的粗产物。

(工序2：利用RNA连接进行的RNA连结产物的制备)

使用按照常规方法利用化学合成得到的表13所示的各5’末端侧多核苷酸片段(N1,N2,N3)、通过工序1的体外转录而得到的3’末端侧多核苷酸片段、及模板DNA-4，进行基于RNA ligase 2的连结反应。终浓度如下所示。5’末端侧RNA 2μM,3’末端侧RNA 1μM,模板DNA 4μM,PEG8000 10％,T4 RNA ligase 2 1U/μL(NEB,M0239),1x附带缓冲液、MurineRNase inhibitor 1U/μL(NEB,M0314)。将酶及PEG添加前的混合物于90度加热3分钟，逐渐恢复至室温，添加酶及PEG，于45度进行1小时孵育。进行苯酚氯仿提取、Amicon 10K处理(Merck Millipore)、异丙醇沉淀，得到转录产物的粗产物。在改性聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行泳动后，切出相应的条带，用MQ水进行提取，通过Amicon纯化及异丙醇沉淀，得到纯化mRNA。

试验例9

(mRNA样品的翻译反应)

将上述实施例5中得到的mRNA序列信息示于表14-1～表14-2。

表14-1～表14-2：

[表14-1]

[表14-2]

针对各mRNA，使用Hela细胞株来评价体外的翻译活性。首先，将含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Nacalai Tesque公司制)中悬浮的Hela细胞以每一孔的细胞数成为10,000个细胞/100μL的方式接种于96孔贴壁细胞用培养板，在37℃、5％ CO₂条件下培养一晚。从培养一晚后的细胞将培养上清液除去，以每一孔40μL添加含有10％胎牛血清的RPMI培养基，然后，以各化合物的终浓度成为0.3、1、3、及10nM的方式，用Opti-MEM(Thermo FisherScientific公司制，目录号:31985-070)将各化合物与终浓度0.3％的LipofectaminMessengerMAX Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific公司制，目录号:LMRNA008)进行稀释后混合，将混合液以成为每一孔10μL的方式添加于各培养板中，在37℃、5％ CO₂条件下培养24小时。从24小时培养后的细胞中回收培养上清液，使用HumanVEGE Quantikine ELISA(R&D公司制，目录号DVE00)，按照试剂盒附带的说明书，对得到的培养上清液中的VEGF蛋白质量进行测定。关于测定的结果，将定量的各培养上清液中的VEGF蛋白质浓度(ng/mL)记载于以下表15。

表15：

[表15]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

由上述表15所示的评价结果可知，具有糖修饰的mRNA添加于Hela细胞中后，产生由基因序列编码的VEGF蛋白质，其效率较之不具有糖修饰的mRNA更优异。

实施例6

(基于IVT的mRNA的合成)

示出基于IVT的mRNA的合成中使用的材料(多核苷酸)的序列信息。

表16：[表16]

通过以下的一系列操作，得到mRNA(IVT-1)。

(工序1：线性化DNA的制备)

质粒DNA使用将表16所示的人工合成基因序列GO插入至市售的pUC57载体的BamHI位点及PstI位点而得的DNA。使用质粒DNA，如下所示实施PCR反应。具体而言，将终浓度250ng/μl的质粒DNA,终浓度各250nM的引物P1及P2、200μL的Primestar MAX(Takara Bio公司制，目录号R045B)混合，用Nuclease-free water制备成400μL，使用热循环仪，于98℃加热30秒，然后将98℃10秒、55℃5秒、72℃5秒的加热重复30次，然后于72℃加热5分钟后，于4℃进行冷却。对于得到的PCR产物400μL，添加10μL的Dpn I(New England BioLab公司制，目录号R0176L)、50μL的CutSmart Buffer(New England Biolab公司制)、40μL的Nuclease-free water并混合，于37℃静置30分钟。将得到的反应溶液在3.0％琼脂糖-TAE凝胶中进行电泳，切出相应的条带，利用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Midi(MACHEREY-NAGEL公司制，目录号740986.20)将PCR产物纯化后，进行苯酚氯仿提取、乙醇沉淀，得到PCR DNA。

(工序2：利用体外转录进行的RNA片段的制备))

使用得到的PCR DNA进行转录反应。反应液的终浓度如下所示；PCR DNA 4ng/μL,ATP,CTP,UTP,GTP各9mM,MEGAScript T7Transcription Kit(Invitrogen公司制，目录号AMB13345)附带的T7Enzyme 10％,MEGAScript T7 Transcription Kit附带的T7 ReactionBuffer 10％。反应液量设为400μL，于37℃进行6小时孵育。接着，将MEGAScript T7Transcription Kit附带的Trubo DNase以反应液量的1/20vol量进行添加并混合，于37℃震荡15分钟。通过苯酚氯仿提取、乙醇沉淀进行粗纯化，得到RNA片段。使用得到的RNA片段，使用Vaccinia Capping System(New England Biolab公司制，目录号MB2080S)及ScriptCap 2’-O-Methyltransferase Kit(CELLSCRIPT公司制，目录号C-SCMT0625)，如下所示进行Cap化反应。反应液的终浓度如下所示，500ng/μL RNA片段、10％的CappingBuffer、0.5mM GTP、0.2mM SAM、0.5U/μL Vaccinia capping enzyme、1U/μL RNaseinhibitor、2.5U/μL 2’-O-Methyltransferase。用Nuclease-free water使反应液量为2000μL，于37℃静置1小时。通过苯酚氯仿提取、乙醇沉淀进行纯化，得到Cap化RNA片段。然后，对于得到的Cap化RNA片段105μl，添加7μL的Antarctic Phosphatase(New EnglandBiolab公司制，目录号M0289S)、14μL的10x Antarctic Phosphatase Buffer、14μL的Nuclease-free water并混合，于37℃静置1小时，由此实施碱性磷酸酶反应。反应样品利用与实施例1(使用了dPAGE的RNA片段的纯化)同样的方法进行纯化，得到3.04nmol的Cap化mRNA IVT-1。将得到的IVT-1的序列示于表17。

表17的各核苷酸N(大写)表示RNA，N(M)表示2’-O-甲基修饰RNA，m7Gppp表示下述结构式。

[化学式52]

[表17]

试验例10

(mRNA样品的使用了Hela细胞株裂解物的翻译反应试验)

针对以下表18-1～表18-10中记载的各mRNA，利用与试验例1同样的方法，对人细胞系中的翻译活性进行评价。将添加了0.3μM的各mRNA的翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)记载于下述表18。

表18-1～表18-10：

[表18-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E4	11	2.167
E193	374	50.167
			E194	377	71.333
E195	380	90.833
			E196	383	4.500
E197	386	2.167

[表18-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E4	11	0.500
E193	374	27.833
			E194	377	44.333
E195	380	37.667
			E198	389	49.000
E199	392	43.833

[表18-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E4	11	0.833
E65	180	24.500
			E67	186	20.667
E68	189	8.167
			E180	343	13.500
E181	346	21.833

[表18-4]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E4	11	1.000
E175	338	17.333
			E177	340	15.167
E178	341	17.333
			E180	343	21.167
E165	308	70.500

[表18-5]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E4	11	1.000
E176	339	5.500
			E177	340	17.333
E179	342	8.167
			E180	343	22.000
E167	314	25.667

[表18-6]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E58	161	61.167
E59	164	66.000
			E164	305	108.167
E192	373	1.333

[表18-7]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E182	349	1.167
E183	350	57.167
			E184	353	75.167
E185	356	69.000

[表18-8]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E186	359	0.000
E187	360	0.500
			E188	363	0.500

[表18-9]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E189	366	1.667
E190	367	10.000
			E191	370	6.333

[表18-10]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E217	416	0.000
E218	422	1.000
			E219	426	1.000

由上述表18-1～表18-10所示的试验结果可知，具有糖修饰的各mRNA添加于Hela细胞裂解物中后，通过真核细胞的翻译系统而产生由基因序列编码的多肽。

试验例11

(mRNA样品的使用了Hela细胞株的体外翻译反应试验)

针对以下表19-1～表19-13中记载的各mRNA，利用与试验例2同样的方法，使用人细胞系Hela细胞株来评价体外的翻译活性。将从添加3～30nM的各mRNA 5小时后的细胞得到的细胞溶解液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表19。

表19-1～表19-13：

[表19-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-4]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-5]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-6]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-7]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-8]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-9]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-10]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-11]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-12]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表19-13]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

由上述表19-1～表19-13所示的试验结果可知，具有糖修饰的各mRNA添加于Hela细胞中后，产生由基因序列编码的多肽，其翻译量优于不具有糖修饰的mRNA。

试验例12

(mRNA样品的使用了Hela细胞株的体外翻译反应试验)

针对下述表20-1～表20-8中记载的各mRNA，利用与试验例3同样的方法，使用Hela细胞株对体外的翻译活性的持续性进行评价。将从添加了30nM的各mRNA的细胞得到的细胞溶解液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表20。

表20-1～表20-8：

[表20-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

/>

[表20-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表20-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表20-4]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表20-5]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表20-6]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表20-7]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

[表20-8]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

由上述表20-1～表20-8所示的试验结果可知，具有糖修饰的各mRNA添加于Hela细胞中后，产生由基因序列编码的多肽，其翻译量优于不具有糖修饰的mRNA。

试验例13

(mRNA样品的使用了Hela细胞株的体外翻译反应试验)

针对下述表21-1～表21-4中记载的各mRNA，利用与试验例4同样的方法，使用Hela细胞株来评价体外的翻译活性。将从添加了各mRNA的细胞得到的细胞溶解液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表21。

表21-1～表21-4：

[表21-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.000	0.000
					E165	308	0.323	0.337	0.117
E167	314	0.343	0.403	0.207
					E169	320	0.300	0.350	0.130
E173	332	0.220	0.300	0.147
					E174	335	0.187	0.223	0.097

[表21-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.000	0.000
					E165	308	0.440	0.447	0.187
E166	311	0.367	0.397	0.150
					E172	329	0.317	0.363	0.133
E180	343	0.007	0.000	0.000
					E181	346	0.010	0.000	0.000

[表21-3]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E4	11	0.000	0.000	0.000
					E175	338	0.020	0.010	0.000
E177	340	0.113	0.290	0.207
					E178	341	0.063	0.097	0.057
E180	343	0.013	0.000	0.000
					E165	308	0.460	0.497	0.233
E181	346	0.010	0.000	0.000

[表21-4]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
							导入mRNA3小时后	导入mRNA8小时后	导入mRNA24小时后
E79	206	0.437	0.533	0.343
					IVT-1	447	0.000	0.000	0.000

由上述表21-1～表21-4所示的试验结果可知，具有糖修饰的mRNA电穿孔至Hela细胞后，产生由基因序列编码的多肽，其活性较之在翻译区不具有糖修饰的mRNA更优异。

试验例14

(mRNA样品的使用了Hela细胞株裂解物的翻译反应试验)

针对下述表22-1～表22-2中记载的各mRNA，利用与试验例8同样的方法，对人细胞系中的翻译活性进行评价。将添加了1μM的各mRNA的翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)记载于下述表22。

表22-1～表22-2：

[表22-1]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E61	170	24.693	5.02
E71	198	15.920	3.24
				E85	224	33.347	6.78
E204	399	15.040	3.06
				E205	400	16.013	3.25
E206	401	20.107	4.09
				E207	402	14.013	2.85
E208	403	10.827	2.20
				E30	89	4.920	1.00

[表22-2]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mmRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E61	170	25.067	5.47
E127	268	25.253	5.51
				E209	404	27.840	6.07
E210	405	16.213	3.53
				E211	406	36.120	7.88
E212	407	14.000	3.05
				E213	408	10.493	2.29
E214	409	14.840	3.24
				E30	89	4.587	1.00

由上述表22-1～表22-2所示的试验结果可知，各mRNA添加于Hela细胞裂解物中后，通过真核细胞的翻译系统而产生由基因序列编码的多肽。

试验例15

(mRNA样品的使用了Hela细胞株的细胞内核酸稳定性试验)

针对下述表23中记载的各mRNA，使用Hela细胞株来评价细胞内的核酸稳定性。就细胞的培养和mRNA的导入而言，利用与试验例3同样的方法，以各mRNA的终浓度成为30nM的方式进行制备而导入。从添加各mRNA并培养4小时后的细胞除去培养上清液，以每一孔50μL加入含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Nacalai Tesque公司制)，在37℃、5％ CO2条件下继续培养。在添加mRNA 4小时后、8小时后、24小时后，分别如下所示进行细胞的溶解操作。具体而言，从细胞除去培养上清液后，用经冰冷却的D-PBS(-)(Nacalai Tesque公司制)清洗一次后，以每一孔20μL加入包含2％的蛋白酶抑制剂混合物(动物细胞提取物用，NacalaiTesque公司制)的iScript RT-qPCR Sample Preparation Reagent(Bio-Rad公司，1708898)，充分渗透30秒而将细胞溶解。

得到的细胞溶解液中的残留mRNA量利用以下记载的RT-qPCR法检测。首先，作为检体稀释溶液，制备了以0.2U/mL的终浓度加入核糖核酸酶抑制剂的DW。对每个评价的mRNA分别制作标准曲线，用检体稀释溶液将由未添加核酸的细胞制备的细胞溶解液稀释10倍，利用得到的溶液对各mRNA进行稀释，由此从1μM按照4倍稀释取11点浓度，制作稀释系列。要测定的各细胞溶解液用检体稀释溶液稀释10倍。使用加入有终浓度为0.2U/mL的核糖核酸酶抑制剂的DW，将这些标准曲线及要测定的细胞溶解液稀释1071倍。后续的逆转录反应和RT-qPCR反应利用与试验例7同样的方法实施。关于测定的结果，使用以标准品的CT值为基础的标准曲线，将各试样中的各mRNA的浓度定量，将得到的结果记载于以下表23。

表23：

[表23]

各时间点的细胞溶解液中的mRNA残留浓度

由上述表23所示的试验结果可知，与利用IVT法制备的mRNA相比，具有糖修饰的mRNA在细胞中的耐分解性提高。

试验例16

(mRNA样品的使用了Hela细胞株裂解物的翻译反应试验)

针对以下表24中记载的各mRNA，利用与试验例1同样的方法，对人细胞系中的翻译活性进行评价。将添加了0.3μM的各mRNA的翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)记载于下述表24。

[表24]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E3	8	0.500
E36	103	0.500
			E220	448	0.333
E222	454	0.833
			E221	451	0.500
E223	457	11.833
			E4	11	1.333
E65	180	29.333
			E224	460	7.167
E225	463	32.000

由上述表24所示的试验结果可知，具有糖修饰的各mRNA添加于Hela细胞裂解物中后，通过真核细胞的翻译系统而产生由基因序列编码的多肽。

试验例17

(mRNA样品的使用了Hela细胞株的体外翻译反应试验)

针对以下表25中记载的各mRNA，利用与试验例2同样的方法，使用人细胞系Hela细胞株来评价体外的翻译活性。将从添加3～30nM的各mRNA 5小时后的细胞得到的细胞溶解液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表25。

[表25]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

对于糖修饰多聚A链的链长为5的E222、糖修饰多聚A链的链长为10的E223、糖修饰多聚A链的链长为20的E65、E224及E225、糖修饰多聚A链的链长为40的E59而言，分别与具有相同长度的未修饰多聚A链的mRNA相比，显示出优异的翻译能力。

试验例18

(mRNA样品的使用了Hela细胞株的体外翻译反应试验)

针对下述表26中记载的各mRNA，利用与试验例3同样的方法，使用Hela细胞株对体外的翻译活性的持续性进行评价。将从添加了30nM的各mRNA的细胞得到的细胞溶解液中的翻译产物浓度(nM)记载于以下表26。

[表26]

从各mRNA得到的翻译产物浓度

由上述表26所示的试验结果可知，具有糖修饰的各mRNA添加于Hela细胞中后，产生由基因序列编码的多肽，其翻译量相应于多聚A链长，相对于不具有糖修饰的mRNA而言是优异的。

试验例19

(mRNA样品的使用了Hela细胞株裂解物的翻译反应试验)

针对下述表27-1～表27-5中记载的各mRNA，利用与试验例8同样的方法，对人细胞系中的翻译活性进行评价。将添加了1μM的mRNA的翻译反应溶液中的翻译产物浓度(nM)、以及作为不具有糖修饰的mRNA的E226或E30设为1时的相对翻译产物量记载于以下表27-1～27-5。

表27-1～表27-5：

[表27-1]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E226	466	0.987	1.00
E227	467	1.787	1.81
				E228	468	2.560	2.59
E229	469	2.347	2.38

[表27-2]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E30	89	0.333	1.00
E230	470	1.347	4.04
				E231	471	1.520	4.56
E232	472	1.173	3.52
				E233	473	0.640	1.92

[表27-3]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E30	89	0.680	1.00
E230	470	2.347	3.45
				E231	471	2.080	3.06
E234	474	1.333	1.96

[表27-4]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)	相对翻译产物量
				E30	89	0.720	1.00
E230	470	2.307	3.20
				E235	475	1.867	2.59
E236	476	1.000	1.39
				E237	477	2.107	2.93

[表27-5]

mRNA名	序列号	翻译产物浓度(nM)
			E230	470	2.227
E235	475	1.453
			E237	477	2.040
E238	478	2.253
			E239	479	1.587
E240	480	2.413

由上述表27-1～27-5所示的试验结果可知，各mRNA添加于Hela细胞裂解物中后，通过真核细胞的翻译系统而产生由基因序列编码的多肽，其翻译量优于不具有糖修饰的mRNA。

Claims (22)

1.多核苷酸，其包含：

从起始密码子至终止密码子的翻译区；

5’侧非翻译区；及

多聚A链，

构成所述多聚A链的核苷酸的65％以上为糖修饰核苷酸。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中，构成所述多聚A链的核苷酸全部为糖修饰核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其中，所述糖修饰核苷酸的修饰糖部各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式1]

4.如权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸，其中，所述糖修饰核苷酸的修饰糖部各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式2]

5.如权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多聚A链包含至少一个磷酸修饰核苷酸。

6.如权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多聚A链的自3’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

7.如权利要求1～6中任一项所述的多核苷酸，其中，构成所述多聚A链的全部核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

8.如权利要求1～7中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多聚A链为2～40个碱基长度。

9.如权利要求1～8中任一项所述的多核苷酸，其中，所述5’侧非翻译区的核苷酸各自独立地选自2’-脱氧核糖核苷酸、间隔子修饰或糖修饰核苷酸。

10.如权利要求1～9中任一项所述的多核苷酸，其中，所述5’侧非翻译区的自5’末端起第1～6个核苷酸为糖修饰核苷酸，所述糖修饰核苷酸的修饰糖部为以下的结构，

[化学式3]

11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中，在所述5’侧非翻译区的5’末端的5’侧还包含由1～10个糖非修饰核苷酸形成的部分。

12.如权利要求1～11中任一项所述的多核苷酸，其中，所述5’侧非翻译区的除了自5’末端起第1～6个核苷酸外的核苷酸包含2’-脱氧核糖核苷酸及/或间隔子修饰。

13.如权利要求9或12所述的多核苷酸，其中，所述5’侧非翻译区包含间隔子修饰，所述间隔子修饰各自独立地选自以下的结构中的任一者，

[化学式4]

式中，

Rx为乙炔基、氢原子或OH，

M为氢原子或OH，

n1为1、2或5，

n2为1、2或3。

14.如权利要求1～13中任一项所述的多核苷酸，其中，所述5’侧非翻译区的自5’末端起第1～2个核苷酸、第1～3个核苷酸、第1～4个核苷酸、或第1～5个核苷酸通过硫代磷酸酯连结。

15.如权利要求1～14中任一项所述的多核苷酸，其中，所述5’侧非翻译区包含碱基修饰核苷酸，所述碱基修饰核苷酸的修饰碱基部为以下的结构，

[化学式5]

式中，R为碳原子数1～6的烷基。

16.如权利要求1～15中任一项所述的多核苷酸，其中，所述翻译区包含至少两个第1个核苷酸为糖修饰核苷酸的密码子。

17.如权利要求1～16中任一项所述的多核苷酸，其中，所述翻译区包含4个以上的密码子，全部密码子的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸。

18.如权利要求1～16中任一项所述的多核苷酸，其中，所述翻译区中，除了终止密码子外的全部密码子的第1个核苷酸为糖修饰核苷酸，所述糖修饰核苷酸的修饰糖部为以下的结构，

[化学式6]

19.如权利要求1～18中任一项所述的多核苷酸，其中，所述翻译区包含2000个以下的密码子。

20.如权利要求1～19中任一项所述的多核苷酸，其中，所述终止密码子的全部核苷酸为糖修饰核苷酸。

21.如权利要求1～20中任一项所述的多核苷酸，其包含以下的结构，

[化学式7]

式中，

R¹及R²各自独立地为H、OH、F、OCH₂CH₂OCH₃或OCH₃，

B¹及B²各自独立地为碱基部，

X¹为O、S或NH，

X²为O、S、NH或以下的结构，

[化学式8]

X³为OH、SH或它们的盐，

其中，X¹及X²不同时为O。

22.医药组合物，其包含权利要求1～21中任一项所述的多核苷酸。