JP2016508724A - ２’ヌクレオシド間結合を含有する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子 - Google Patents

２’ヌクレオシド間結合を含有する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子 Download PDF

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Abstract

本発明は、アンチセンス鎖の５’末端において第１位のヌクレオチドと第２位のヌクレオチドとを接続する２’ヌクレオシド間結合を含むＲＮＡｉ分子、およびその組成物に関する。特に、本発明は、可能性のある修飾の中でも特に、２’ヌクレオシド間結合を含む５’修飾ヌクレオチドを含む、ＲＮＡ干渉を媒介する能力のある一本鎖および二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。本発明はさらに、本発明のＲＮＡｉ分子を生成するための試薬として使用される５’修飾ヌクレオチドと、開示されるＲＮＡｉ分子の使用方法とに関する。【選択図】図１A

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によって本明細書中に援用される２０１３年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／７６７，８３７号明細書の利益を主張する。
配列表への参照
３７ＣＦＲ§１．５２（ｅ）（５）に従ってＥＦＳ−Ｗｅｂにより提出された配列表は参照によって本明細書中に援用される。ＥＦＳにより提出された配列表テキストファイルはファイル「２３４４１−ＰＣＴ−ＳＥＱＴＸＴ−０４ＦＥＢ２０１４」を含有し、２０１４年２月４日に作成され、１１８，７８４バイトのサイズである。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、真菌、植物および動物において見られる進化的に保存された転写後遺伝子サイレンシングの細胞機構であり、配列特異的な方法で遺伝子発現を阻害するために小さいＲＮＡ分子を使用する。ＲＮＡｉは、細胞質において短い二本鎖ＲＮＡ分子により開始されるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御される。短い二本鎖ＲＮＡは、結合ＲＮＡに対して相補的である標的ｍＲＮＡを切断する、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノート２（Ａｇｏ２）と相互作用をする。２本のＲＮＡ鎖の一方（ガイド鎖として知られている）はＡｇｏ２タンパク質と結合して、遺伝子サイレンシングを指示する一方、他方の鎖（パッセンジャー鎖として知られている）は、ＲＩＳＣ活性化の間に分解される。例えば、Ｚａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：１５１９−１５２４；Ｖａｕｇｈｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：２５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４２８−４２９；およびＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８を参照されたい。また一本鎖の低分子干渉（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡは、Ａｇｏ２に結合して、切断活性を支持することが示されている（例えば、Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ １５０：８８３−８９４を参照）。重要なことに、一本鎖ＲＮＡｉ分子の活性は、相補的なＲＮＡの翻訳を、それに対する塩基対合によって化学量論的に阻害して、翻訳機構を物理的に妨害する一本鎖アンチセンスＲＮＡの活性と混同されてはならない。
ＲＮＡｉ機構は、既知の配列の任意のｍＲＮＡを破壊するために利用することができる。これにより、それを産生した任意の遺伝子の抑制（ノックダウン）が可能になり、結果的に、標的タンパク質の合成を防止する。ＲＮＡｉ機構による遺伝子発現の調節は、従来の小分子制御により到達できないものを含む、治療的に関連する生化学的経路を調節するために使用することができる。またＲＮＡｉは、製薬産業における標的検証のための非常に重要な手段となっている。
ＲＮＡｉ分子に取り込まれたヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレアーゼ安定性などの物理的および生物学的特性の改善（例えば、Ｄａｍｈａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，１３：８４２−８５５を参照）、免疫刺激の低減（例えば、Ｓｉｏｕｄ，２００６，ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２：１６７−１７６を参照）、結合の増強（例えば、Ｋｏｌｌｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４：４４６７−４４７６を参照）、ならびに細胞取込みおよび細胞質への送達を改善するための親油性の増強をもたらす。従って、化学修飾は、ＲＮＡ化合物の効力を増大させて、より少ない投与量を可能にし、毒性の可能性を低減し、全体的な治療コストを低減する可能性を有する。
ほとんどのＤＮＡおよびＲＮＡの糖−リン酸骨格は、３’−５’ヌクレオシド間ホスホジエステル結合で構成されており、２’−５’連結リボヌクレオチドの生理化学および生化学的特性が研究されてきた。生物学的情報蓄積のために使用されてはいないが、２’−５’連結オリゴリボヌクレオチドはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を支持し、イントロンスプライシングの間に天然に、かつインターフェロン処置細胞において形成される（例えば、Ｊｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０５６８−１０５７２；Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３９：１７３−１８２；Ｐｒｅｍｒａｊ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２５３−２７２；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ａｎｄ Ｔｏｒｒｅｎｃｅ（１９８４）ｉｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．３（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｅｄ．），ｐｐ．１８９−２９８，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照）。２’−５’連結オリゴリボヌクレオチドは、ＤＮＡ補体ではなくそのＲＮＡ補体と選択的にハイブリッド形成する傾向を示す（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｓｗｉｔｃｈｅｒ，１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：６２５５−６２５６；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：６２６５−６２５５を参照）と共に、いくつかの種類のヌクレアーゼに対して改善された耐性を示す（例えば、Ａｌｌｕｌ ａｎｄ Ｈｏｋｅ，１９９５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，５：３−１１；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３７０−３７８；Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，９：２５１５−２５２０を参照）ため、アンチセンスＲＮＡ用途における２’−５’連結オリゴリボヌクレオチドの使用に関心が集まっている。しかしながら、このような２’−５’連結オリゴリボヌクレオチドがＡｇｏ２媒介ＲＮＡｉ経路を介した標的遺伝子発現を適切かつ効率的に低下させる能力に対するＲＮＡｉオリゴヌクレオチド内の２’−５’連結リボヌクレオチドの影響についての研究はごく限られている。
Ｐｒａｋｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（２００６，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ １６：３２３８−３２４０）は、２’−５’連結ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡ二本鎖の、哺乳類細胞における活性について報告している。結果は、２’−５’連結アンチセンス鎖および３’−５’連結センス鎖を含むｓｉＲＮＡ二本鎖がｍＲＮＡ発現の阻害において活性でなく、逆組成物（すなわち、３’−５’連結アンチセンス鎖および２’−５’連結センス鎖）を有するｓｉＲＮＡ二本鎖が活性であることを示した。２’−５’結合はｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖において許容されるが、アンチセンス鎖では許容されないと結論づけられた。特にアンチセンス鎖の５’末端は、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへのロード、ｍＲＮＡとの核形成の位置決め、およびその後の切断のために重要であるため、著者らは、アンチセンス鎖の５’末端が、ＲＩＳＣと適切に相互作用をするために正確な形状をとることが恐らく極めて重要であるとしている。従って、アンチセンス鎖の５’末端の２’−５’ヌクレオシド間結合はその相互作用を支持するために適切な立体構造をとることができない可能性があると結論付けられている。
２０１１年４月２６日に国際公開第２０１１／１３９６９９号パンフレットとして公開されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０３３９６１号明細書には、５’修飾ヌクレオシドと、修飾ヌクレオシドを取り込んだオリゴマー化合物とが開示されている。開示される５’修飾ヌクレオシドは、好ましくは、オリゴヌクレオチドの５’末端に位置し、ヌクレオシドの糖部分の５’炭素における修飾を有し、任意選択で、２’炭素における付加的な修飾を有する。ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０３３９６１号明細書で開示される５’修飾ヌクレオシドは、従来の３’−５’ヌクレオシド間結合によって隣接ヌクレオシドに連結される。
本開示は、核酸標的に対して相補的であり、２’ヌクレオシド間結合（例えば、２’−５’ヌクレオシド間結合）を含む５’末端の修飾ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、ＲＮＡ干渉を媒介する能力のある新規の一本鎖または二本鎖小核酸分子を提供する。本発明の一本鎖または二本鎖の小核酸分子は、より具体的には、本明細書では低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子と呼ばれ、前記分子のアンチセンス鎖の５’末端において修飾されたヌクレオチドは本明細書では５’修飾ヌクレオチドと呼ばれる。５’修飾ヌクレオチドは、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端の第１位（すなわち、鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド）を構成する。本明細書に開示されるｓｉＮＡ分子を生成するための試薬として使用するための新規の５’修飾ヌクレオチドも本発明の一部である。本発明はさらに、本明細書に開示されるｓｉＮＡ分子およびその組成物を用いてインビトロまたはインビボで遺伝子の発現を調節（例えば、阻害）する方法を含む。本発明のｓｉＮＡ分子のいくつかの実施形態は改善された活性を示すことが本明細書において示されている（以下の実施例を参照）。
１つの態様では、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができ、かつ５’修飾ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、核酸標的に対して部分的または完全に相補的である。本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖または二本鎖小核酸分子でよく、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含むがこれらに限定されない、異なるオリゴヌクレオチド形態をとることができる。本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド位置１の５’修飾ヌクレオチドは、２’ヌクレオシド間結合を介して鎖の第２位のヌクレオチドに連結され、修飾５’キャップ（すなわち、５’リン酸キャップ以外）を含有し得る。特に、本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、式ＩＩ：
Figure 2016508724
 の構造を有する５’修飾ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含み、式中、
Ａは、−ＯＣ（Ｒ３）２−、−Ｃ（Ｒ３）２Ｏ−、−Ｃ（Ｒ３）２−、−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−または−ＣＲ３＝ＣＲ３−であり、
Ｂは、任意の複素環塩基部分であり、
Ｄ１およびＤ１’は、ヒドロキシル、−ＯＲ４、−ＳＲ４、または−Ｎ（Ｒ４）２から独立して選択され、
Ｅは、Ｏ、Ｓ、−ＮＲ５、−Ｎ−Ｎ（Ｒ４）２または−Ｎ−ＯＲ４であり、
Ｊは、式ＩＩの５’修飾ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子の隣接ヌクレオチドの糖部分に連結するヌクレオシド間連結基であり、
Ｒ１およびＲ１’はＨ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２から独立して選択されるか、または一緒に、＝Ｏもしくは＝ＣＨ２を形成し、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ２〜６アルケニルであり、
Ｒ３およびＲ５は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１０、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（これは、−ＯＲ７、−ＳＲ７、−Ｎ（Ｒ８）２、もしくは（＝Ｏ）−ＮＲ９、または１〜３個のハロゲンによって任意選択で置換される）、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１０、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソ、−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ７は、メチル、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ８）２または−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は、ＨまたはＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
Ｒ９は、（Ｒ８）２、−Ｒ８−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒ８）２または−Ｒ８−Ｃ（＝ＮＲ８）［Ｎ（Ｒ８）２］であり、および
Ｒ１０は、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。
本発明のｓｉＮＡ分子は、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド分子であり得る。本発明のオリゴヌクレオチド分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構によって、細胞または動物において遺伝子発現を阻害し得る。
１つの態様では、本発明は一本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供しており、一本オリゴヌクレオチド鎖は、遺伝子発現に関連する核酸標的配列の少なくとも一部に対して相補的である配列を含む。本開示の目的のために、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子の一本鎖はアンチセンス鎖と称される。
別の態様では、本発明は二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供しており、二本鎖ｓｉＮＡ分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、遺伝子発現に関連する核酸標的配列の少なくとも一部に対して相補的である配列を含み、センス鎖はアンチセンス鎖の少なくとも一部に対して相補的である。本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、対称または非対称であり得る。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列の一部に対して相補的であるアンチセンス鎖を含み、標的核酸は、標的ｍＲＮＡ、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、標的マイクロＲＮＡ、および標的ノンコーディングＲＮＡから選択される。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子はマイクロＲＮＡ模倣物である。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列に対する配列相補性を有する少なくとも１５ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、約１５〜３０ヌクレオチドの長さである。他の実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、独立して、約１５〜３０ヌクレオチドの長さである。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子はさらに、分子の一方または両方の鎖中に、化学修飾された１つまたは複数の付加的なヌクレオチドを含む。修飾には、核酸糖修飾、塩基修飾、骨格（ヌクレオシド間結合）修飾、非ヌクレオチド修飾、および／またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシド間連結基を含む。ある実施形態では、各ヌクレオシド間連結基は独立して、ホスホジエステルまたはホスホロチオアート連結基である。ある実施形態では、本発明の一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡのいずれかのアンチセンス鎖中の１つまたは複数の付加的な化学修飾ヌクレオチドはどれも２’−５’ヌクレオシド間結合を有さない。ある実施形態では、本発明の一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡのアンチセンス鎖は、２’−５’ヌクレオシド間結合を有する付加的な化学修飾ヌクレオチドを最大９個まで含有し得る。
ある実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、鎖の一方または両方において１、２、３または４個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。他の実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子にはオーバーハングがない（すなわち、平滑末端を有する）。
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つまたは複数の末端キャップ（本明細書では「キャップ」とも呼ばれる）を有する。本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子の場合、キャップは３’末端（３’キャップ）に存在し得る。本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の場合、キャップは、アンチセンス鎖（ガイド鎖）の３’末端（３’キャップ）、センス鎖（パッセンジャー鎖）の５’末端（５’キャップ）、および／またはセンス鎖（パッセンジャー鎖）の３’末端（３’キャップ）に存在し得る。
本発明はさらに、任意選択で薬学的に許容可能な担体または希釈剤と共に、本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子を含む組成物を提供する。組成物の投与は、インビトロまたはインビボで核酸を所望の標的細胞に導入する既知の方法によって実行することができる。
本発明の分子および組成物は、遺伝子発現の調節に関連する幅広い用途（潜在的な治療用途を含む）にわたって有用性を有する。従って、本発明の１つの態様は、細胞においてＲＮＡｉ機構によって遺伝子発現を阻害するための、本発明の分子および組成物の使用に関する。本方法は、細胞を本発明の分子または組成物と接触させることを含む。ある実施形態では、このような方法はさらに、ＲＮＡｉ活性を検出することを含む。ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシング活性の検出および／または測定は直接的であっても間接的であってもよい。
本発明の別の態様は、本発明の分子および組成物の被験者（例えば、動物）への投与に関する。本発明のこの態様では、分子および組成物は、標的核酸またはタンパク質の作用によって、または作用の喪失によって媒介される状態（例えば、癌など）を患っている前記被験者（ヒトなど）を治療する潜在的な使用を有する。ある実施形態では、本発明は、遺伝子発現の阻害による疾患の潜在的治療のための薬剤を製造するための、本発明のｓｉＮＡ分子の使用を提供する。
本開示はさらに、本明細書に開示される一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成するために使用することができる新規の５’修飾ヌクレオチドを提供する。本発明のｓｉＮＡ分子に取り込まれる場合、本明細書では通常５’修飾ヌクレオチドと称される新規の修飾ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端の第１位（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド）を構成し、２’ヌクレオシド間結合によって鎖の第２位のヌクレオチドに連結され、修飾５’キャップ（すなわち、５’リン酸キャップ以外）を含有し得る。特に、本発明は、式Ｉ：
Figure 2016508724
 の構造を有する５’修飾ヌクレオチドを特徴とし、式中、
Ａは、−Ｃ（Ｒ３）２−、−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−または−ＣＲ３＝ＣＲ３−であり、
Ｂは、任意の複素環塩基部分であり、
Ｄ１およびＤ１’は、ヒドロキシル、−ＯＲ４、−ＳＲ４、または−Ｎ（Ｒ４）２から独立して選択され、
ＥおよびＥ’は、Ｏ、Ｓ、−ＮＲ５、−Ｎ−Ｎ（Ｒ４）２または−Ｎ−ＯＲ４から独立して選択され、
Ｇ１は、ヒドロキシルまたは−ＯＲ６であり、
Ｇ１’は、ヒドロキシル、−ＯＲ６または−Ｎ（Ｒ６）２であり、
Ｒ１およびＲ１’は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ７）２から独立して選択されるか、または一緒に、＝Ｏもしくは＝ＣＨ２を形成し、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ２〜６アルケニルであり、
Ｒ３およびＲ５は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ６は独立して、末端炭素原子において任意選択でシアノまたは保護基により置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（これは、−ＯＲ８、−ＳＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、（＝Ｏ）−ＮＲ１０または１〜３個のハロゲンによって任意選択で置換される）、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソ、−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ８は、メチル、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ９）２または−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ９）２であり、
Ｒ９は、ＨまたはＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
Ｒ１０は、（Ｒ９）２、−Ｒ９−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒ９）２または−Ｒ９−Ｃ（＝ＮＲ９）［Ｎ（Ｒ９）２］であり、
Ｒ１１は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、および
ｒは０または１である。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付図面を参照すれば明らかになるであろう。さらに、本明細書に記載される任意の方法または組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実施可能であり、異なる実施形態は結合され得ると考えられる。
さらに、特許、特許出願および他の文献は、本発明の種々の態様を記載し、より具体的に説明するために本明細書全体を通して引用される。本明細書で引用されるこれらの参考文献はそれぞれ、図面を含むその全体が参照によって本明細書に援用される。
異なる濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭ）において、表２に記載される一本鎖ｓｉＮＡ分子のサブセットのノックダウン活性（ｄｄＣＴ）を比較する。ＲＮＡｉＭａｘがトランスフェクトされたＨｅｐａ１−６細胞においてノックダウン活性をスクリーニングした（実施例６を参照）。図１Ａは、通常の３’−５’ヌクレオシド間結合を含む５’−第１位のヌクレオチドを有する一本鎖ｓｉＮＡ分子（ＢＭ、ＢＭｓ、ｄＴ、およびｄＴｓ）の活性と、２’−５’ヌクレオシド間結合を含む５’−第１位のヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子（３ｄＸおよび３ｄＸｓ、ここで、ＸはＴ、Ａ、ＣまたはＧである）の活性とを比較する。図１Ｂは、第１位の２’−５’ヌクレオシド間結合と、その位置における種々の付加的な構造変化とをそれぞれが有する一本鎖ｓｉＮＡ分子の活性を比較する。 異なる濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭ）において、表８に記載される一本鎖ｓｉＮＡ分子のノックダウン活性（ｄｄＣＴ）を比較する。ＲＮＡｉＭａｘがトランスフェクトされたＨｅｐａ１−６細胞においてノックダウン活性をスクリーニングした（実施例６および７を参照）。この図に示されるｓｉＮＡ分子はそれぞれ、２’−５’ヌクレオシド間結合を有する内部ヌクレオチドを含有する。 異なる濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭ）において、表１０に記載される一本鎖ｓｉＮＡ分子のノックダウン活性（ｄｄＣＴ）を比較する。ＲＮＡｉＭａｘがトランスフェクトされたＨｅｐａ１−６細胞においてノックダウン活性をスクリーニングした（実施例６および８を参照）。この図に示されるｓｉＮＡ分子はそれぞれ、第１位の２’−５’ヌクレオシド間結合と、多数のホスホロチオアート結合とを含有する。
Ａ．用語および定義
以下の専門用語および定義は、本出願において使用される際に適用される。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は２つ以上の細胞の組み合わせを含む、などである。
任意の濃度範囲、百分率の範囲、比率の範囲または整数範囲は、他に記載されない限り、記載される範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されるべきである。
「約（Ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、数に関連して本明細書で使用される場合、他に規定されない限り、あるいは文脈から他に明らかでない限り、一般的にその数のいずれかの方向（それよりも大きい、またはそれよりも小さい）の５％の範囲内に入る数を含む（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）と解釈される。範囲が規定される場合、他に規定されない限り、あるいは文脈から他に明らかでない限り、端点はその範囲内に含まれる。
「２’修飾ヌクレオチド」、「２’置換ヌクレオチド」または糖部分の「２’位置」に修飾を有するヌクレオチドという語句は、本明細書で使用される場合、一般的に、糖成分の２’炭素位置にＨまたはＯＨ以外である置換基を含むヌクレオチドを指す。２’修飾ヌクレオチドには、糖環の２つの炭素原子を接続する架橋が糖環の２’炭素および別の炭素を接続する二環式ヌクレオチド；ならびにアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、ＯＣ１〜１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（ここで、各ＲｍおよびＲｎは独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１〜１０アルキルである）などの非架橋２’置換基を有するヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。２’修飾ヌクレオチドはさらに、例えば、糖の他の位置および／または核酸塩基に他の修飾を含み得る。「３’修飾ヌクレオチド」、「３’置換ヌクレオチド」または糖部分の「３’位置」に修飾を有するヌクレオチドという語句は、一般的に、糖成分の３’炭素位置に修飾（置換基を含む）を含むヌクレオチドを指す。
「脱塩基」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、糖部分の１’位置において、核酸塩基を有さないか、あるいは核酸塩基の代わりに水素原子（Ｈ）または他の非核酸塩基化学基を有する糖部分を指す。例えば、Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，９９８，２０３号明細書を参照されたい。一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は脱塩基部分を含有することができ、ここで、脱塩基部分はリボース、デオキシリボース、またはジデオキシリボース糖である。
「非環式ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、非環式リボース糖を有する、例えば、リボースの炭素／炭素結合または炭素／酸素結合のいずれかが独立して、または一緒に、ヌクレオチドに存在しない任意のヌクレオチドを指す。
炭素原子の数が指定されていなければ、「アルキル」という用語は、１〜１０個の炭素原子を含有する分枝状または直鎖の飽和脂肪族炭化水素基を指す。アルキル基は、特定の数の炭素原子を有することができる。例えば、「Ｃ１〜Ｃ１０アルキル」または「Ｃ１〜１０アルキル」などの場合のＣ１〜Ｃ１０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素を線状または分枝状の配列で有する基を含むと定義される。例えば、「Ｃ１〜Ｃ１０アルキル」は、特に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどを含む。「シクロアルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を有する単環式飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、「シクロアルキル」は、シクロプロピル、メチル−シクロプロピル、２，２−ジメチル−シクロブチル、２−エチル−シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含む。
炭素原子の数が指定されていなければ、「アルケニル」という用語は、２〜１０個の炭素原子および少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有する直鎖または分枝状の非芳香族炭化水素ラジカルを指す。好ましくは、１つの炭素−炭素二重結合が存在し、４個までの非芳香族炭素−炭素二重結合が存在し得る。従って、「Ｃ２〜Ｃ６アルケニル」または「Ｃ２〜６アルケニル」は、２〜６個の炭素原子を有するアルケニルラジカルを意味する。アルケニル基は、エテニル、プロペニル、ブテニルおよびシクロヘキセニルを含む。アルケニル基の直鎖、分枝状または環状部分は二重結合を含有することができ、置換アルケニル基が指示される場合には置換され得る。「シクロアルケニル」という用語は、指定される数の炭素原子と、炭素−炭素二重結合による少なくとも１つの内部不飽和点とを有する単環式炭化水素基を意味する。
「アルキニル」という用語は、他に規定されない限り、２〜１０個の炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する直鎖または分枝状の炭化水素ラジカルを指す。３個までの炭素−炭素三重結合が存在し得る。従って、「Ｃ２〜Ｃ６アルキニル」または「Ｃ２〜６アルキニル」は、２〜６個の炭素原子を有するアルキニルラジカルを意味する。アルキニル基は、エチニル、プロピニルおよびブチニルを含む。アルキニル基の直鎖または分枝状部分は三重結合を含有することができ、置換アルキニル基が指示される場合には置換され得る。
「アミノ」という用語は、基（−ＮＨ２）を指す。
「アンチセンス領域」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の例示的な核酸分子に関して、この用語は、標的核酸配列に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。さらに、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、任意選択で、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有する核酸配列を含むことができる。一実施形態では、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、アンチセンス鎖またはガイド鎖と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「アリール」は、各環に７個までの原子を有する任意の安定した単環式または二環式炭素環を意味することが意図され、少なくとも１つの環は芳香族である。このようなアリール要素の例としては、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニルおよびビフェニルが挙げられる。アリール置換基が二環式であり、一方の環が非芳香族である場合、接続は芳香族環によることが理解される。
「生分解性」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、生物系における分解、例えば、酵素分解または化学分解を指す。
「生分解性リンカー」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の核酸分子に関して、この用語は、１つの分子を別の分子に接続するように設計された、生物系における分解の影響を受けやすいリンカー分子を指す。リンカーは、核酸または非核酸ベースのリンカーであり得る。例えば、生分解性リンカーは、リガンドまたは生物活性分子を本発明のｓｉＮＡ分子に取り付けるために使用することができる。あるいは、生分解性リンカーは、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖を接続するために使用することができる。生分解性リンカーは、特定の組織または細胞型への送達などの特定の目的のためにその安定性を調節できるように設計される。核酸ベースの生分解性リンカー分子の安定性は、種々の化学、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および化学修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、および他の２’修飾または塩基修飾ヌクレオチドなど）の組み合わせを使用することによって調節することができる。生分解性核酸リンカー分子は、二量体、３量体、４量体またはそれよりも長い核酸分子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであってもよく、あるいはリンベースの結合、例えばホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）またはホスホジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含むこともできる。また生分解性核酸リンカー分子は、核酸骨格、核酸糖、または核酸塩基修飾を含むこともできる。
「生物活性分子」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の例示的な核酸分子に関して、この用語は、系内の生物学的応答を誘発または調節することができる、ならびに／あるいは他の生物活性分子の薬物動態学および／または薬力学を調節することができる化合物または分子を指す。生物活性分子の例としては、単独のまたは他の分子（例えば、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウィルス薬、ペプチド、タンパク質、化学療法薬、小分子、ビタミン、補助因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、三本鎖形成オリゴヌクレオチド、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、他のポリエーテル、２−５Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイおよびこれらの類似体などの治療的に活性な分子を含むが、これらに限定されない）と組み合わせられたｓｉＮＡ分子が挙げられる。
「生物系」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、ヒトまたは動物を含むがこれらに限定されない生物学的起源からの精製または未精製形態の材料を指し、この系は、ＲＮＡｉ活性に必要とされる成分を含む。従って、この語句は、例えば、細胞、組織、被験者、もしくは生物体、またはこれらの抽出物を含む。またこの用語は、生物学的起源から再構成された材料も含む。
「平滑末端」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の核酸分子に関して、この用語は、オーバーハングヌクレオチドを有さない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を指す。例えば、平滑末端を有する二本鎖ｓｉＮＡ分子の２本の鎖は、末端にオーバーハングヌクレオチドを有することなく、対応された塩基対と互いに整合する。本発明のｓｉＮＡ二本鎖分子は、二本鎖の一方または両方の末端、例えば、アンチセンス鎖の５’端部、センス鎖の５’端部に位置する末端、または二本鎖の両末端などに平滑末端を含むことができる。
「キャップ」（本明細書では「末端キャップ」とも呼ばれる）という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の例示的な核酸分子に関して、この用語は、本発明の核酸分子の１つまたは複数の末端に取り込まれた化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドであり得る部分を指す。これらの末端修飾はエキソヌクレアーゼ分解から核酸分子を保護することができ、核酸分子の細胞内の送達および／または局在化に役立つことができる。キャップは、本発明の核酸分子の鎖の５’末端（５’キャップ）または３’末端（３’キャップ）に存在することができ、あるいは両方の末端に存在することができる。例えば、キャップは、本発明の核酸分子のセンス鎖の５’末端、３’末端、ならびに／または５’および３’末端に存在することができる。さらに、キャップは、本発明の核酸分子のアンチセンス鎖の３’末端に存在することができる。非限定的な例では、５’キャップは、ＬＮＡ；グリセリル；逆位デオキシ脱塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；３’−３’−逆位ヌクレオチド部分；３’−３’−逆位脱塩基部分；３’−２’−逆位ヌクレオチド部分；３’−２’−逆位脱塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミダート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオアート；ホスホロジチオアート；または架橋もしくは非架橋メチルホスホナート部分を含むが、これらに限定されない。３’キャップの非限定的な例としては、ＬＮＡ；グリセリル；逆位デオキシ脱塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分；５’−５’−逆位脱塩基部分；５’−ホスホルアミダート；５’−ホスホロチオアート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミダート；ホスホロチオアートおよび／またはホスホロジチオアート；架橋または非架橋メチルホスホナート；ならびに５’−メルカプト部分が挙げられるが、これらに限定されない（さらなる詳細については、参照によって本明細書中に援用されるＢｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１９２５を参照されたい）。一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ビニルリン酸５’末端キャップを含有し、ここで、糖環の炭素５は、以下の置換基（＝ＣＨ）−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２を含有する。
「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の例示的な核酸分子に関して、この用語はその通常の生物学的意味で使用され、多細胞生物全体を指すのではなく、例えば具体的には、ヒトを指さない。細胞は、生物体、例えば、鳥類、植物および哺乳類（例えば、ヒト、雌ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、およびネコなど）内に存在し得る。細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）または真核細胞（例えば、哺乳類または植物細胞）であり得る。細胞は体細胞起源または生殖系細胞起源、全能性または多能性、分裂細胞または非分裂細胞であり得る。また細胞は、配偶子もしくは胚、幹細胞、または完全分化細胞に由来することもでき、あるいはこれらを含むこともできる。
「化学修飾ヌクレオチド」、「修飾ヌクレオチド」、または本発明のヌクレオチドに関して使用される場合の「化学修飾」という語句は、当該技術分野において一般的に知られているような非修飾（または天然）ヌクレオチドの複素環塩基部分、糖および／またはリン酸の化学構造における修飾（すなわち、天然に存在するＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチドと比べて少なくとも１つの修飾）を含有するヌクレオチドを指す。ある実施形態では、これら用語は、特定の生物系において天然に存在するＲＮＡの特定の形態、例えば２’−Ｏ−メチル修飾またはイノシン修飾を指すことができる。修飾ヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、修飾糖環または糖代替物（ｓｕｇａｒ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を有するヌクレオチドを含む。修飾複素環塩基部分は、本明細書で定義されるような普遍的な塩基、疎水性塩基、乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）塩基、サイズ拡大（ｓｉｚｅ−ｅｘｐａｎｄｅｄ）塩基、およびフッ素化塩基を含むが限定はされない。これらの核酸塩基のいくつかは、本明細書において提供されるｓｉＮＡ分子の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合以外の任意のヌクレオシド間結合を指す。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書および米国特許出願第１２／０６４，０１４号明細書（米国特許出願公開第２００９０１７６７２５号明細書として公開）に記載されている。
「相補性」または「相補的な」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の例示的な核酸分子に関して、これらの用語は、一般的に、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋか、あるいは本明細書に記載される他の非従来型の結合による、１つの核酸配列と別の核酸配列との間の水素結合の形成または存在を指す。本発明の核分子に関して、核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連機能（例えば、ＲＮＡｉ活性）が進行するのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照されたい）。完全に相補的とは、核酸配列の全ての隣接残基が第２の核酸配列中の同数の連続残基と水素結合し得ることを意味する。部分的な相補性は、核酸分子内に、種々のミスマッチまたは非塩基対合ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のミスマッチ、非ヌクレオチドリンカー、または非塩基対合ヌクレオチド）を含むことができ、これにより、核酸分子のセンス鎖もしくはセンス領域とアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域との間に、または核酸分子のアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に、バルジ、ループ、またはオーバーハングがもたらされ得る。このような部分的な相補性は、包含されるヌクレオチドの総数に応じて、非塩基対合ヌクレオチドの数によって決定される相補性％、例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％などによって表すことができる。このような部分的な相補性は、核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）がその機能（例えば、配列特異的ＲＮＡｉを媒介する能力）を保持する範囲内で可能である。
「組成物」または「製剤」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているそれらの意味を指す。これらの用語は、一般的に、薬学的に許容可能な担体または希釈剤中で、細胞または被験者（例えば、ヒトを含む）の投与（例えば、全身または局所投与）に適した形態であるような組成物または製剤を指す。適切な形態は、使用または侵入経路、例えば、経口、経皮、吸入、または注射にある程度依存する。このような形態は、組成物または製剤が標的細胞（すなわち、負に帯電した核酸の送達が望ましい細胞）に到達するのを妨害してはならない。例えば、血流中に注入された組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野において既知であり、毒性などの検討事項、および組成物または製剤がその効果を発揮するのを防止する形態が含まれる。本明細書で使用される場合、医薬品製剤には、人間および獣医学的な使用のための製剤が含まれる。本発明の核酸分子を含む製剤のために適切な薬剤の非限定的な例としては、脂質ナノ粒子（例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８（２）：１７２−６を参照）；Ｐ−糖タンパク質阻害剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５など）；持続放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェアなどの生分解性ポリマー（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）；およびポリブチルシアノアクリレートで作製されたものなどの充填（ｌｏａｄｅｄ）ナノ粒子が挙げられる。本発明の核酸分子の送達戦略のその他の非限定的な例としては、Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；およびＴｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載される材料が挙げられる。「薬学的に許容可能な組成物」または「薬学的に許容可能な製剤」は、本発明の核酸分子の、その所望の活性に最も適した身体の場所への有効な分配を可能にする組成物または製剤を指すことができる。
「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」という用語は、本発明のｓｉＮＡ分子に結合した原子または原子群を指す。一般的に、コンジュゲート基は、それが結合した分子の１つまたは複数の特性（薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取込み、電荷およびクリアランスを含むが、これらに限定されない）を変化させる。コンジュゲート基は、化学分野において日常的に使用され、直接、または任意選択的な連結部分または連結基を介して、親化合物（例えば、ｓｉＮＡ分子など）へ連結される。ある実施形態では、コンジュゲート基は、介入物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素を含むが、限定はされない。ある実施形態では、コンジュゲートは、ｓｉＮＡ分子の３’または５’末端ヌクレオチドまたは内部ヌクレオチドに取り付けられる。本明細書で使用される場合、「コンジュゲート連結基」は、コンジュゲートをｓｉＮＡ分子に取り付けるために使用される任意の原子または原子群を指す。当該技術分野において知られているものなどの連結基または二官能性連結部分は、本発明に適している。
「シアノ」という用語は、基（−ＣＮ）を指す。
「検出する」または「測定する」という用語は、活性、応答または効果と関連して本明細書で使用される場合、このような活性、応答、または効果を検出または測定するための試験が実施されることを示す。このような検出および／または測定は、ゼロの値を含み得る。従って、検出または測定のための試験が、非活性（ゼロの活性）という知見をもたらしても、活性を検出または測定するステップはそれでも実施されている。例えば、ある実施形態では、本発明は、遺伝子サイレンシング活性を検出するステップを含む方法を提供する。このようなステップはどれもゼロの値を含み得る。
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、遺伝子が最終的にタンパク質をもたらすプロセスを指す。発現は、転写、スプライシング、転写後修飾および翻訳を含むが、これらに限定されない。
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、ポリペプチドの生成に必要な部分長または全長コード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。また遺伝子は、核酸配列のＵＴＲまたは非コード領域も含むことができる。また遺伝子は、機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）またはノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば、スモールテンポラル（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびこれらの前駆体ＲＮＡなどもコード化することができる。このようなノンコーディングＲＮＡは、機能性または調節性細胞プロセスに関与するｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性の調節において、ｓｉＮＡ媒介のＲＮＡ干渉のための標的核酸分子としての機能を果たすことができる。従って、疾患につながる異常なｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性は、本発明のｓｉＮＡ分子によって調節され得る。また、ｆＲＮＡおよびｎｃＲＮＡを標的化するｓｉＮＡ分子は、遺伝子刷り込み、転写、翻訳、または核酸プロセシング（例えば、アミノ基転移、メチル化など）などの細胞プロセスに介在することによって、被験者、生物体または細胞の遺伝子型または表現型を操作または変更するために使用することもできる。「遺伝子」という用語は、本発明のｓｉＮＡ分子が直接（すなわち、ｓｉＮＡ分子が、その遺伝子に対して部分的または完全相補性を有するアンチセンス鎖を含む）または間接的（すなわち、ｓｉＮＡ分子が、その遺伝子の発現または活性経路内の遺伝子に対して部分的または完全相補性を有するアンチセンス鎖を含む）に標的化される遺伝子を参照する場合に使用することができる。
当業者によって認識されるように、「ハロ」または「ハロゲン」は、本明細書で使用される場合、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードを含むことが意図される。
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書で使用される場合、各環に７個までの原子を有する安定した単環式または二環式環を表し、少なくとも１つの環は芳香族であり、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１〜４個のへテロ原子を含有する。この定義の範囲内のヘテロアリール基には、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾロニル、ベンゾオキサゾロニル、キノリニル、イソキノリニル、ジヒドロイソインドロニル、イミダゾピリジニル、イソインドロニル、インダゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンが含まれるが、これらに限定されない。また「ヘテロアリール」は、任意の窒素含有ヘテロアリールのＮ−オキシド誘導体も含むと理解される。ヘテロアリール置換基が二環式であり、一方の環が非芳香族であるか、あるいはへテロ原子を含有しない場合、接続はそれぞれ、芳香族環によるか、あるいはヘテロ原子含有環によることが理解される。
「複素環」または「ヘテロシクリル」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１〜４個のへテロ原子を含有する３員〜１０員芳香族または非芳香族複素環を意味することが意図され、二環式基を含む。また、本発明の目的のために、「複素環式」という用語は、「複素環」および「ヘテロシクリル」という用語と同義であると考えられ、本明細書で説明される定義も有すると理解される。従って、「ヘテロシクリル」は、上記のヘテロアリールならびにそのジヒドロおよびテトラヒドロ類似体を含む。「ヘテロシクリル」のさらなる例としては、以下の：アゼチジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキソオキサゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリン、オキソピペラジニル、オキソピロリジニル、オキソモルホリニル、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピリジン−２−オニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、ジオキシドチオモルホリニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびにこれらのＮ−オキシドが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリル置換基の接続は、炭素原子またはヘテロ原子によって生じ得る。
「ヒドロキシル」という用語は、基（−ＯＨ）を指す。
「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などのその任意の形態）、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「有する（ｈａｓ）」または「有する（ｈａｖｅ）」などのその任意の形態）、または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（およびその任意の形態（「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」））という用語は包括的およびオープンエンドであり、記載されていない付加的な要素または方法ステップを排除しない。
「阻害する」、「下方制御する」、または「低減する」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の核酸分子に関して、この用語は、一般的に、遺伝子の発現、または１つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは均等なＲＮＡ分子のレベル、または１つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）が存在しない場合に観察されるレベルよりも低くなることを指す。下方制御は、ＲＮＡｉに媒介される切断などの転写後サイレンシングと関連することができる。
「間欠性」または「間欠的」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。これら用語は、一般的に、規則的または不規則的な間隔で定期的に停止および開始することを指す。
「ヌクレオシド間結合」、「ヌクレオシド間リンカー」、「ヌクレオシド間連結基」、「ヌクレオチド間結合」、「ヌクレオチド間リンカー」または「ヌクレオチド間連結基」という用語は本明細書では互換的に使用され、当該技術分野において知られているように、２つのヌクレオシド（すなわち、複素環塩基部分および糖部分）単位の間の任意のリンカーまたは結合を指し、例えば、リン酸、リン酸の類似体、ホスホン酸、グアニジウム、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシルヒドラジニル、アミド、カルバミン酸、アルキル、および置換されアルキル結合を含むが、これらに限定されない。ヌクレオシド間結合は、核酸分子の骨格を構成する。１つの態様では、本発明のｓｉＮＡ分子のヌクレオチドは、第１のヌクレオチドの糖の３’炭素と、第２のヌクレオチドの糖部分との間の結合（本明細書では、３’ヌクレオシド間結合と称される）を通して、連続したヌクレオチドに連結され得る。３’−５’ヌクレオシド間結合は、本明細書で使用される場合、２つの連続したヌクレオシド単位を連結するヌクレオシド間結合を指し、ここで、結合は、第１のヌクレオシドの糖部分の３’炭素と、第２のヌクレオシドの糖部分の５’炭素との間である。別の態様では、本発明のｓｉＮＡ分子のヌクレオチドは、第１のヌクレオチドの糖の２’炭素と、第２のヌクレオチドの糖部分との間の結合（本明細書では、２’ヌクレオシド間結合と称される）を通して、連続したヌクレオチドに連結され得る。２’−５’ヌクレオシド間結合は、本明細書で使用される場合、２つの連続したヌクレオシド単位を連結するヌクレオシド間結合を指し、ここで、結合は、第１のヌクレオシドの糖部分の２’炭素と、第２のヌクレオシドの糖部分の５’炭素との間である。
「哺乳類の」または「哺乳類」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。これらの用語は、一般的に、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜などの任意の温血脊椎動物種を指す。
「定量吸入器」または「ＭＤＩ」という語句は、缶、缶を覆う固定キャップ、およびキャップ内に位置する製剤計量バルブを含むユニットを指す。ＭＤＩシステムは、適切なチャネリングデバイスを含む。適切なチャネリングデバイスは、例えば、バルブアクチュエータおよび円筒形または円錐形状の通路を含み、これを通して、薬剤は、充満されたキャニスターから計量バルブによって患者の鼻または口へ送達されることが可能である（マウスピースアクチュエータなど）。
「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、ＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害または異質染色質サイレンシングのいずれかによって標的メッセンジャーＲＮＡの発現を制御する低分子ノンコーディングＲＮＡを指す（例えば、Ａｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１０２，３−９；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５，５２２−５３１；Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｅ，３４２，２５−２８；およびＳｅｔｈｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＲＮＡ，１２：１９２−１９７を参照）。ＲＮＡ干渉の現象は、ｍｉＲＮＡの内因的に誘発される遺伝子サイレンシング効果を含む。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ模倣物」は、マイクロＲＮＡの配列と少なくとも部分的に同一である配列を有するｓｉＮＡ分子を指す。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物は、マイクロＲＮＡのマイクロＲＮＡシード領域を含む。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物は、２つ以上の標的核酸の翻訳を調節する。
「調節する」または「調節」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の核酸分子に関して、この用語は、遺伝子の発現、または１つもしくは複数のＲＮＡ分子（コーディングまたはノンコーディング）のレベル、または１つもしくは複数のＲＮＡ分子もしくはタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性を、調節をもたらす分子の非存在下で観察されるよりも発現レベルまたは活性が大きくまたは小さくなるように、上方制御または下方制御する場合を指す。例えば、「調節する」という用語は、例えば遺伝子発現について、いくつかの実施形態では阻害を指すことができ、他の実施形態では増強または上方制御を指すことができる。
「非塩基対合」という語句は、二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域と、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間で塩基対合されていないヌクレオチドを指す。非塩基対合ヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ、オーバーハング、および一本鎖ループを含むことができるが、限定されない。
「非ヌクレオチド」という用語は、例えば、限定されないが脱塩基部分またはアルキル鎖などの、１つまたは複数のヌクレオチド単位の代わりにポリヌクレオチド鎖に取り込むことができる任意の基または化合物を指す。この基または化合物は、一般的に認識されるヌクレオチド塩基（例えば、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなど）を含有せず、従って１’位に核酸塩基がないという点で「脱塩基」である。
「核酸塩基」という用語は、本明細書では、ヌクレオチドの複素環塩基部分を指すために使用される。核酸塩基は天然に存在していてもよく、あるいは修飾されてもよい。ある実施形態では、核酸塩基は、別の核酸の塩基と水素結合をすることができる任意の原子または原子群を含み得る。
「ヌクレオチド」という用語は、当該技術分野において一般的に認識されるように使用される。ヌクレオチドは、一般的に、複素環塩基部分（すなわち、核酸塩基）、糖、およびヌクレオシド間結合（例えば、リン酸）を含む。塩基は、当該技術分野において周知であるように、天然塩基（標準）、修飾塩基、または塩基類似体であり得る。このような塩基は、一般的に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。さらに、ヌクレオチドは、糖、ヌクレオシド間結合、および／または塩基部分において修飾されていなくても修飾されていてもよい（互換的に、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも称される；例えば、米国特許出願第１２／０６４，０１４号明細書（米国特許出願公開第２００９０１７６７２５号明細書として公開）を参照されたい）。天然に存在するヌクレオシド間結合は、３’から５’へのホスホジエステル結合（本明細書では、３’−５’ホスホジエステル結合とも称される）を指す。
「オーバーハング」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。例示的な二本鎖核酸分子に関して、この用語は、一般的に、二本鎖核酸分子の２本の鎖の間で塩基対合されていないヌクレオチド配列の末端部分を指す。オーバーハングは、存在する場合には、通常ｓｉＮＡ二本鎖の一方または両方の鎖の３’末端にある。
「オキソ」という用語は、基（＝Ｏ）を指す。
「非経口」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、消化管を経由する以外の形で分子、薬物、薬剤、または化合物を投与する方法または技術を指し、皮膚上、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、またはくも膜下腔内の注射または注入技術などを含む。
「薬学的に許容可能な担体または希釈剤」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この語句は、一般的に、動物への投与で使用するのに適した任意の物質を指す。ある実施形態では、薬学的に許容可能な担体または希釈剤は、無菌生理食塩水である。ある実施形態では、このような無菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。
「ホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）」という用語は、酸素原子の代わりに１つまたは複数の硫黄原子を含むヌクレオシド間リン酸結合を指す。従って、ホスホロチオアートという用語は、ホスホロチオアートおよびホスホロジチオアートヌクレオシド間結合の両方を指す。
「第１位」という用語は、オリゴヌクレオチド鎖、例えばアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドの位置を指す。本明細書で言及される全ての位置は、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端から数えたヌクレオチドの位置であり、例えば、アンチセンス鎖の第１〜３位は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて１、２、および３番目の位置にある３つのヌクレオチドを指す。「５’−第１位のヌクレオチド」は、５’キャップを含有していてもしていなくてもよいオリゴヌクレオチド鎖の第１位のヌクレオチドを指す。例として、５’−第１位のヌクレオチドの５’キャップは、本明細書で定義されるように、天然に存在する５’リン酸キャップまたは修飾末端キャップであり得る。「第２１位−３’ヌクレオチド」という用語は、３’キャップをさらに含有していてもしていなくてもよいオリゴヌクレオチド鎖の第２１位のヌクレオチドを指す。
「保護基」という用語は、本明細書で使用される場合、合成手順の間の望ましくない反応に対して、ヒドロキシル、アミノおよびチオール基を含むがこれらに限定されない反応基を保護するための当該技術分野において既知の不安定な化学部分を指す。保護基は、通常、他の反応部位における反応中に部位を選択的および／または直交的に保護するために使用され、次に除去されて、保護されていない基をそのまま残すか、あるいは更なる反応に利用可能にし得る。当該技術分野において知られている保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７において一般的に記載されている。基は、前駆体として本明細書で提供されるオリゴマー化合物に選択的に取り込むことができる。例えば、アミノ基は、合成において所望の時点でアミノ基へ化学的に変換され得るアジド基として、本明細書で提供される化合物内に配置することができる。一般的に、基は保護されるか、あるいは適切なときにその最終基へ転換するために親分子の他の領域を修飾する反応に不活性であり得る前駆体として存在する。さらに代表的な保護基または前駆体基は、Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４，２６，１−７２において議論されている。
ヒドロキシル保護基の例としては、アセチル、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ−ニトロベンジル、ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）、２−トリメチルシリルエチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（ＴＯＭ）、ベンゾイルホルマート、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロ−アセチル、ピバロイル、ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、９−フルオレニルメチルカルボナート、メシラート、トシラート、トリフェニルメチル（トリチル）、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、イリメトキシトリチル（Ｉｒｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）、１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＦＰＭＰ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）が挙げられるが、限定されない。ここで、より一般的に使用されるヒドロキシル保護基としては、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ベンゾイル、メシラート、トシラート、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）が挙げられるが、限定されない。
リン酸およびリン基を保護するために一般的に使用される保護基の例としては、メチル、エチル、ベンジル（Ｂｎ）、フェニル、イソプロピル、ｆｅｒｔ−ブチル、アリル、シクロヘキシル（ｃＨｅｘ）、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、４−ニトロベンジル、４−アシルオキシベンジル、２−メチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、２−クロロフェニル、ジフェニルメチル、４−メチルチオ−１−ブチル、２−（Ｓ−アセチルチオ）エチル（ＳＡＴＥ）、２−シアノエチル、２−シアノ−１，１−ジメチルエチル（ＣＤＭ）、４−シアノ−２−ブテニル、２−（トリメチルシリル）エチル（ＴＳＥ）、２−（フェニルチオ）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチル、２−（ベンジルスルホニル）エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，３−ジブロモプロピル、２，２，２−トリフルオロエチル、チオフェニル、２−クロロ−４−トリチルフェニル、２−ブロモフェニル、２−［Ｎ−イソプロピル−Ｎ−（４−メトキシベンゾイル）アミノ］エチル、４−（Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ）ブチル、４−オキソペンチル、４−トリチルアミノフェニル、４−ベンジルアミノフェニルおよびモルホリノが挙げられるが限定されない。ここで、より一般的に使用されるリン酸およびリン保護基としては、メチル、エチル、ベンジル（Ｂｎ）、フェニル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、２−クロロフェニルおよび２−シアノエチルが挙げられるが、限定されない。
アミノ保護基の例としては、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、およびベンジル−オキシカルボニル（Ｃｂｚ）などのカルバマート保護基；ホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、およびニトロフェニルアセチルなどのアミド保護基；２−ニトロベンゼンスルホニルなどのスルホンアミド保護基；ならびにフタルイミドおよびジチアスクシノイルなどのイミンおよび環状イミド保護基が挙げられるが、限定されない。
チオール保護基の例としては、トリフェニルメチル（トリチル）、ベンジル（Ｂｎ）などが挙げられるが、限定されない。ある実施形態では、本明細書で提供されるｓｉＮＡ分子は、１つまたは複数の任意選択で保護されたリン含有ヌクレオシド間結合を含ませて調製することができる。ホスホジエステルおよびホスホロチオアート結合などのリン含有ヌクレオシド間結合の代表的な保護基には、β−シアノエチル、ジフェニルシリルエチル、δ−シアノブテニル、シアノｐ−キシリル（ＣＰＸ）、Ｎ−メチル−Ｎ−トリフルオロアセチルエチル（ＭＥＴＡ）、アセトキシフェノキシエチル（ＡＰＥ）およびブテン−４−イル基が含まれる。例えば、米国特許第４，７２５，６７７号明細書および米国再発行特許第３４，０６９号明細書（β−シアノエチル）；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９（１０），１９２５−１９６３；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９（４６），１０４４１−１０４８８；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８（１２），２２２３−２３１１を参照されたい。
ある実施形態では、例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含むヌクレオシド間結合を形成するために有用である、反応性リン基を有する化合物が提供される。このような反応性リン基は当該技術分野において知られており、ＰＩＩＩまたはＰｖの原子価状態にあるリン原子（ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホナート、リン酸トリエステルおよびリン含有キラル補助基を含むが、これらに限定されない）を含有する。ある実施形態では、反応性リン基は、ジイソプロピルシアノエトキシホスホラミダイト（−Ｏ＊−Ｐ［Ｎ［（ＣＨ（ＣＨ３）２］２］Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮ）およびＨ−ホスホナート（−Ｏ＊−Ｐ（＝Ｏ）（Ｈ）ＯＨ）から選択され、ここで、Ｏ＊は、モノマーから提供される。好ましい合成的な固相合成は、反応性ホスファイトとしてホスホラミダイト（ＰＩＩＩ化学）を利用する。中間体ホスファイト化合物は次に、既知の方法を用いてホスファートまたはチオホスファート（Ｐｖ化学）に酸化されて、ホスホジエステルまたはホスホロチオアートヌクレオシド間結合が得られる。さらなる反応性ホスファートおよびホスファイトは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ３０９（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１）に開示されている。
「リボヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、β−Ｄ−リボフラノース部分の第２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。
「ＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。一般的に、ＲＮＡという用語は、少なくとも１つのリボフラノシド部分を含む分子を指す。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ、例えば、部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生ＲＮＡ、ならびに１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含むことができる。このような改変は、例えば、ｓｉＮＡ分子の末端への、あるいは内部での（例えばＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドにおける）、非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。本発明の核酸分子内のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含むことができる。これらの改変ＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と呼ばれることもある。
「ＲＮＡ干渉」という語句または「ＲＮＡｉ」という用語は、通常、特異的標的ＲＮＡの破壊を引き起こすことによって細胞における遺伝子発現を阻害または下方制御する、当該技術分野において一般的に知られている生物学的プロセスを指し、配列特異的核酸分子（例えば、低分子干渉核酸分子）によって媒介される（例えば、Ｚａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４；Ｖａｕｇｈｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第００／４４８９５号パンフレット；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第０１／３６６４６号パンフレット；Ｆｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開国際公開第９９／３２６１９号パンフレット；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第００／０１８４６号パンフレット；Ｍｅｌｌｏ ａｎｄ Ｆｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際ＰＣＴ公開国際公開第９９／０７４０９号パンフレット；およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第００／４４９１４号パンフレット；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照されたい）。さらに、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティクスなどの配列特異的なＲＮＡ干渉を記述するために使用される他の用語と均等であることを意味する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、転写後レベルまたは転写前レベルのいずれかにおいて遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングすることができる。非限定的な例では、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、遺伝子発現を変更するためのクロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＮＡ媒介の修飾に起因し得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照されたい）。本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、ＲＩＳＣによるＲＮＡ（コーディングまたはノンコーディングＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介の切断に起因し得る。
「シード領域」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。一般的に、この語句は、分子による標的核酸認識のために重要である核酸塩基配列を有するｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端またはその付近の領域を指す。ある実施形態では、シード領域は、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド２〜８（すなわち、第２〜８位に位置する）を含む。ある実施形態では、シード領域は、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド２〜７を含む。ある実施形態では、シード領域は、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド１〜７を含む。ある実施形態では、シード領域は、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド１〜６を含む。ある実施形態では、シード領域は、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド１〜８を含む。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡシード領域」は、マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ模倣物のシード領域を指す。
「センス領域」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の核酸分子に関して、この用語は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。さらに、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列との相同性または配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。一実施形態では、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、センス鎖またはパッセンジャー鎖とも呼ばれる。
「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「ｓｉＮＡ分子」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾された低分子干渉核酸分子」という語句は、配列特異的な形でＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）を媒介することによって遺伝子発現またはウィルス複製を阻害または下方制御することができる任意の核酸分子を指す。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のこのような核酸分子、またはこのような核酸分子のプールをいずれも指すことができる。ｓｉＮＡは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス鎖または領域を含む対称または非対称の二本鎖核酸分子でよく、ここで、アンチセンス鎖／領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖／領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。対称二本鎖は、同じ数のヌクレオチドをそれぞれが含むセンスおよびアンチセンス領域を含むｓｉＮＡ分子を指す。非対称二本鎖は、アンチセンス領域と、アンチセンス領域と塩基対合して二本鎖を形成するために十分に相補的なヌクレオチドをセンス領域が有する範囲で、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域とを含むｓｉＮＡ分子を指す。例えば、本発明の非対称二本鎖ｓｉＮＡ分子は、細胞内またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１５〜約３０）を有するアンチセンス領域と、アンチセンス領域に相補的である約３〜約２５ヌクレオチドを有するセンス領域とを含むことができる。例として、非対称二本鎖ヘアピンｓｉＮＡ分子は、約４〜約１２ヌクレオチドを含むループ領域を含むこともできる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載されるようなヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、またはコンジュゲート分子を含むことができる。また本発明のｓｉＮＡ分子は、標的核酸分子内のヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともできる（例えば、このようなｓｉＮＡ分子が標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列がｓｉＮＡ分子内に存在することを必要としない場合）。一本鎖ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉ機構によって機能するＲＮＡｉ分子である。
「被験者」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、本発明の核酸分子を投与することができる生物体を指す。被験者は、ヒトまたはヒト細胞を含む哺乳類または哺乳類細胞であり得る。この用語は、外植される細胞のドナーもしくはレシピエントまたは細胞自体である生物体も指す。
「糖部分」という用語は、天然または修飾された糖環または糖代替物を意味する。
「糖代替物」という用語は、一般的に、天然に存在するヌクレオチドのフラノース環を置き換えることができる構造を指す。ある実施形態では、糖代替物は、非フラノース（または４’置換されたフラノース）環または環系または開放系である。このような構造は、６員環などの天然フラノース環に対する単純な変化を含むか、あるいはペプチド核酸において使用される非環系と同様、より複雑であってもよい。糖代替物には、モルホリノ、シクロヘキセニルおよびシクロヘキシトールが含まれるが限定されない。糖代替物基を有するほとんどのヌクレオチドにおいて、複素環塩基部分は、一般的に、ハイブリダイゼーションが可能であるように保持される。
「全身投与」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、インビボにおいて血流中の薬物の全身性の吸収または蓄積の後、全身にわたる分配を指す。
「標的」細胞タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド、またはポリヌクレオチドもしくは核酸（例えば、「標的ＤＮＡ」、「標的ＲＮＡ」、「標的核酸」など）という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ、本発明のｓｉＮＡ分子がその発現を阻害または下方制御可能であり得るタンパク質または核酸を指す。ある実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ｐｒｉ−マイクロＲＮＡ、ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ、成熟マイクロＲＮＡ、プロモーター指向性（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＲＮＡ、または天然アンチセンス転写物である。標的遺伝子は、細胞に由来する遺伝子、内在性遺伝子、導入遺伝子、または細胞内にその感染後に存在する病原体（例えば、ウィルス）の遺伝子などの外因性遺伝子であり得る。標的遺伝子を含有する細胞は、任意の生物体、例えば、植物、動物、原生動物、ウィルス、細菌、または真菌に由来することもでき、あるいはこれらに含有され得る。植物の非限定的な例としては、単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物が挙げられる。動物の非限定的な例としては、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。真菌の非限定的な例としては、カビまたは酵母が挙げられる。概説については、例えば、Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，２５８−２６０を参照されたい。例えば、標的核酸は、その発現が特定の障害または病状に関連する細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染性病原体からの核酸分子であり得る。ある実施形態では、標的核酸は、ウィルスまたは細菌の核酸である。本明細書で使用される場合、「標的ｍＲＮＡ」は、タンパク質をコードする事前選択されたＲＮＡ分子を指す。本明細書で使用される場合、「標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」は、ｍＲＮＡに完全にはプロセッシングされていない事前選択ＲＮＡ転写物を指す。特に、ｐｒｅ−ＲＮＡは、１つまたは複数のイントロンを含む。本明細書で使用される場合、「標的マイクロＲＮＡ」は、１つまたは複数のタンパク質またはこのようなノンコーディング分子の前駆体の発現を調節する、約１８〜３０核酸塩基の長さの事前選択ノンコーディングＲＮＡ分子を指す。本明細書で使用される場合、「標的ｐｄＲＮＡ」は、１つまたは複数のプロモーターと相互作用して転写を調節する事前選択ＲＮＡ分子を指す。本明細書で使用される場合、「標的ノンコーディングＲＮＡ」は、タンパク質を産生するように翻訳されない事前選択ＲＮＡ分子を指す。特定のノンコーディングＲＮＡは、発現の制御に関与する。「経路標的」という語句は、遺伝子発現または活性の経路に関与する任意の標的を指す。例えば、所与の任意の標的は、生物学的経路内の上流、下流、または修飾遺伝子を含み得る関連の経路標的を有することができる。これらの経路標的遺伝子は、本明細書における疾患、状態、および形質の治療において相加または相乗効果を提供することができる。
「標的部位」、「標的配列」および「標的核酸部位」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、例えば、標的配列に対して相補的である配列をそのアンチセンス領域内に含有するｓｉＮＡ分子によって媒介される切断のために「標的化される」標的核酸（例えば、ＲＮＡ）内の配列を指す。
「治療的に有効な量」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、研究者、獣医、医師または他の臨床医によって探求される細胞、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発し得る分子、化合物または組成物の量を指す。例えば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータが少なくとも２５％低下する場合に所与の臨床治療が有効であると考えられるとすると、その疾患または障害の治療のための薬物の治療的に有効な量は、そのパラメータの少なくとも２５％の低下をもたらすために必要な量である。
「普遍的な塩基」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。普遍的な塩基という用語は、一般的に、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと、これらをほとんどまたは全く区別することなく塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を指す。普遍的な塩基の非限定的な例としては、当該技術分野で知られているように、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびにニトロアゾール誘導体、例えば３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールなどが挙げられる（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照）。
「上方制御」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の核酸分子に関して、この用語は、遺伝子の発現、または１つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは均等なＲＮＡ分子のレベル、または１つもしくは複数のＲＮＡ、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性のいずれかが、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）が存在しない場合に観察されるレベルよりも高くなることを指す。特定の場合には、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方制御または促進は、不活性または減弱化分子の存在下で観察されるレベルよりも高い。他の場合には、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方制御または促進は、例えば、スクランブル配列またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルよりも高い。さらに他の場合には、本発明の核酸分子による遺伝子発現の上方制御または促進は、核酸分子の非存在下よりも存在下の方が大きい。いくつかの例では、遺伝子発現の上方制御または促進は、上方制御すべき対象の遺伝子の発現を下方制御、阻害、またはサイレンシングする、コーディングまたはノンコーディングＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介切断またはサイレンシングなどの、ＲＮＡ媒介の遺伝子サイレンシングの阻害に関連する。遺伝子発現の下方制御は、例えば、負のフィードバックまたは拮抗作用などを介してコーディングＲＮＡまたはそのコード化タンパク質によって誘発され得る。遺伝子発現の下方制御は、例えば、翻訳阻害、クロマチン構造、メチル化、ＲＩＳＣに媒介されるＲＮＡ切断、または翻訳阻害を介して遺伝子の発現をサイレンシングすることによって、例えば、対象の遺伝子に対する調節制御を有するノンコーディングＲＮＡによって誘発され得る。従って、対象の遺伝子を下方制御、抑制、またはサイレンシングする標的の阻害または下方制御は、治療用途に向けて対象の遺伝子の発現を上方制御するために使用することができる。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。ベクターという用語は、一般的に、１つまたは複数の核酸分子を送達するために使用される任意の核酸および／またはウィルスベースの発現系または技術を指す。
Ｂ．ｓｉＮＡ分子
本発明は、核酸標的に対して相補的であり、２’ヌクレオシド間結合を有する５’修飾ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、ＲＮＡ干渉を媒介する能力のある一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡ分子を特徴とする。５’修飾ヌクレオチドは、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端の第１位（すなわち、鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド）を構成する。本発明のｓｉＮＡ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含むがこれらに限定されない、異なるオリゴヌクレオチド形態をとることができる。
特に、本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、ヌクレオチド位置１に５’修飾ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含み、前記５’修飾ヌクレオチドは、２’ヌクレオシド間結合を介して鎖の第２位のヌクレオチドに連結され、修飾５’キャップ（すなわち、５’リン酸キャップ以外）を含有し得る。一実施形態では、本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、式ＩＩ：
Figure 2016508724
 の構造を有する５’修飾ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含み、式中、
Ａは、−ＯＣ（Ｒ３）２−、−Ｃ（Ｒ３）２Ｏ−、−Ｃ（Ｒ３）２−、−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−または−ＣＲ３＝ＣＲ３−であり、
Ｂは、任意の複素環塩基部分であり、
Ｄ１およびＤ１’は、ヒドロキシル、−ＯＲ４、−ＳＲ４、または−Ｎ（Ｒ４）２から独立して選択され、
Ｅは、Ｏ、Ｓ、−ＮＲ５、−Ｎ−Ｎ（Ｒ４）２または−Ｎ−ＯＲ４であり、
Ｊは、式ＩＩの５’修飾ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子の隣接ヌクレオチドの糖部分に連結するヌクレオシド間連結基であり、
Ｒ１およびＲ１’はＨ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２から独立して選択されるか、または一緒に、＝Ｏもしくは＝ＣＨ２を形成し、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ２〜６アルケニルであり、
Ｒ３およびＲ５は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１０、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（これは、−ＯＲ７、−ＳＲ７、−Ｎ（Ｒ８）２、または（＝Ｏ）−ＮＲ９、または１〜３個のハロゲンによって任意選択で置換される）、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１０、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソ、−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ７は、メチル、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ８）２または−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は、ＨまたはＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
Ｒ９は、（Ｒ８）２、−Ｒ８−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒ８）２または−Ｒ８−Ｃ（＝ＮＲ８）［Ｎ（Ｒ８）２］であり、および
Ｒ１０は、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖分子である。他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は二本鎖分子であり、前記二本鎖分子はアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖に対して部分的または完全に相補的である。
ｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、式ＩＩのＲ３は、Ｈ、ヒドロキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、
Figure 2016508724
 から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキルまたはアリールから選択される。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、式ＩＩのＡは、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ＝ＣＨ−である。さらなる実施形態では、Ａが−ＯＣＨ２−である場合、
Figure 2016508724
 は、
Figure 2016508724
 ではない。さらなる実施形態では、Ａは−ＣＨ＝ＣＨ−である。さらなる実施形態では、Ａは−ＣＨ＝ＣＨ−であり、ＥはＯであり、Ｄ１およびＤ１’はそれぞれヒドロキシルである。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、Ｂはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである。さらなる実施形態では、Ｂはチミンである。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、Ｄ１およびＤ１’は、ヒドロキシル、−ＯＣＨ３または−ＯＣＨ２ＣＨ３から独立して選択される。ある実施形態では、Ｄ１およびＤ１’は独立してヒドロキシルである。ある実施形態では、Ｄ１およびＤ１’は独立して−ＯＣＨ３である。ある実施形態では、Ｄ１およびＤ１’は独立して−ＯＣＨ２ＣＨ３である。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、ＥはＯまたはＳである。他の実施形態では、ＥはＯである。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、Ｊは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結基またはホスホロチオアートヌクレオシド間連結基である。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、Ｒ１はＨまたはヒドロキシルである。ある実施形態では、Ｒ１’はＨ、ヒドロキシル、ハロゲンまたは−ＯＲ６である。ある実施形態では、Ｒ１’は、ハロゲン、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｆ、−ＯＣＨ２ＣＨＦ２、−ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＳＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３または−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２である。ある実施形態では、Ｒ１’はＦまたは−ＯＣＨ３である。
ある実施形態では、Ｒ２はＨである。
ある実施形態では、Ｒ１、Ｒ１’およびＲ２はそれぞれＨである。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、Ｂはチミンであり、Ｒ１、Ｒ１’およびＲ２はそれぞれＨである。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、５’修飾ヌクレオチドは、
Figure 2016508724
 から選択され、式中、Ｂはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである。さらなる実施形態では、Ｂはチミンである。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、５’修飾ヌクレオチドは、
Figure 2016508724
 であり、式中、Ｂはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである。さらなる実施形態では、Ｂはチミンである。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、５’修飾ヌクレオチドは、
Figure 2016508724
 であり、式中、Ｂはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである。さらなる実施形態では、Ｂはチミンである。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、５’修飾ヌクレオチドは、
Figure 2016508724
 であり、式中、Ｂはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである。さらなる実施形態では、Ｂはチミンである。
本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、５’修飾ヌクレオチドは、
Figure 2016508724
 であり、式中、Ｂはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである。さらなる実施形態では、Ｂはチミンである。
本発明のｓｉＮＡ分子は、一本鎖または二本鎖核酸分子であり得る。本発明の核酸分子は、細胞または動物において核酸標的の発現を調節することができる。一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、前記核酸標的の発現を阻害または低減する。
１つの態様では、本発明は、一本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供しており、単一のオリゴヌクレオチド鎖は、遺伝子発現に関連する核酸標的配列の少なくとも一部に対して相補的である配列を含む。本開示のために、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子の一本鎖はアンチセンス鎖と称される。
別の態様では、本発明は二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供しており、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を含む。アンチセンス鎖は、遺伝子発現に関連する核酸標的の少なくとも一部に対して相補的である配列を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖に対して相補的である。本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、対称でも非対称でもよく、かつ相補的である２本の異なる別々の鎖、すなわち２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含むこともでき、あるいは、２つの相補的な部分、例えば、センス領域およびアンチセンス領域（これに関連して、本明細書ではそれぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖とも呼ばれるであろう）が塩基対合され、例えば短いヘアピンポリヌクレオチドをもたらす１つまたは複数の一本鎖「ヘアピン」領域（すなわち、ループ）によって共有結合された１つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含むこともできる。
リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは非ヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、本発明のヘアピンｓｉＮＡ分子は１つまたは複数のループモチーフを含有しており、ｓｉＮＡ分子のループ部分の少なくとも１つは生分解性である。例えば、本発明の短ヘアピンｓｉＮＡ分子は、インビボでのｓｉＮＡ分子のループ部分の分解が、３’末端オーバーハング、例えば、１、２、３または４ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングなどを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子を生じることができるように設計される。
本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的核酸配列の一部に対して相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的ｍＲＮＡ、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、標的マイクロＲＮＡ、および標的ノンコーディングＲＮＡから選択される。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的核酸配列に対して１００％の相補性である領域を含み、１００％の相補性の領域は少なくとも１０核酸塩基である。ある実施形態では、１００％の相補性の領域は少なくとも１５核酸塩基である。ある実施形態では、１００％の相補性の領域は少なくとも２０核酸塩基である。ある実施形態では、１００％の相補性の領域は少なくとも２５核酸塩基である。ある実施形態では、１００％の相補性の領域は少なくとも３０核酸塩基である。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的核酸配列に対して少なくとも８５％相補的である。ある実施形態では、アンチセンス鎖は、標的核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である。ある実施形態では、アンチセンス鎖は、標的核酸配列に対して少なくとも９５％相補的である。ある実施形態では、アンチセンス鎖は、標的核酸配列に対して少なくとも９８％相補的である。ある実施形態では、アンチセンス鎖は、標的核酸配列に対して１００％相補的である。相補的なヌクレオチドは、隣接ヌクレオチドであってもそうでなくてもよい。一実施形態では、相補的なヌクレオチドは隣接ヌクレオチドである。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的核酸分子のヌクレオチド配列に対して相補的であるアンチセンス鎖中に、約１５〜約３０の間（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを有する。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも１５のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも１８のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも１９のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも２０のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも２１のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。本発明のこの態様の特定の実施形態では、相補的なヌクレオチドは隣接ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、オーバーハング領域はどれも除外して、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に完全な相補性を有する。
さらに他の実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に、部分的な相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。従って、いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖核酸分子は、他方の鎖（例えば、アンチセンス鎖）のヌクレオチドに対して相補的である一方の鎖（例えば、センス鎖）中に約１５〜約３０の間（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを有する。ある実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、核酸分子のアンチセンス領域のヌクレオチドに対して相補的であるセンス領域に１７ヌクレオチドを有する。ある実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、核酸分子のアンチセンス領域のヌクレオチドに対して相補的であるセンス領域に１８ヌクレオチドを有する。ある実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、核酸分子のアンチセンス領域のヌクレオチドに対して相補的であるセンス領域に１９ヌクレオチドを有する。ある実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、核酸分子のアンチセンス領域のヌクレオチドに対して相補的であるセンス領域に２０ヌクレオチドを有する。本発明のこの態様の特定の実施形態では、鎖間の相補的なヌクレオチドは隣接ヌクレオチドである。
本発明の対称ｓｉＮＡ分子において、各鎖、センス（パッセンジャー）鎖およびアンチセンス（ガイド）鎖は、独立して、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドの長さである。一般的に、本発明の対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１９〜２４（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、本発明の対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、１９ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、本発明の対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、２０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、本発明の対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、２１ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、本発明の対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、２２ヌクレオチドの長さである。
本発明の非対称ｓｉＮＡ分子において、分子のアンチセンス鎖は、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドの長さであり、センス領域は、約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドの長さである。一般的に、本発明の非対称ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、約１９〜２４（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、本発明の非対称ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、約１９〜２４（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチドの長さであり得る。
さらに他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子はヘアピンｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡ分子は、約２５〜約７０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０）ヌクレオチドの長さである。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、マイクロＲＮＡのシード領域と完全または部分的に同一であるヌクレオチド部分を含むヌクレオチド配列を有するマイクロＲＮＡ模倣物である。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡのシード領域と１００％同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡのシード領域と少なくとも７５％（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡのシード領域と７５％同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡのシード領域と８０％同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡのシード領域と９０％同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡのシード領域と９５％同一であるヌクレオチド部分を有する。
他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つまたは複数のヌクレオチド欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加（標的部位配列に関して、あるいは二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖間に）を含有することができるが、ただし、ｓｉＮＡ分子がその活性、例えばＲＮＡｉを媒介する活性を保持することを条件とする。非限定的な例では、欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加は、ループもしくはバルジ、またはゆらぎもしくは他の代替（非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対をもたらし得る。従って、いくつかの実施形態では、例えば、本発明の二本鎖核酸分子は、他方の鎖または領域（例えば、アンチセンス鎖）とミスマッチであるかまたは塩基対合されない一方の鎖または領域（例えば、センス鎖）中に、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、または６）のヌクレオチドを有する。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、３個以下のミスマッチを含有する。ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチ領域は、相補性の隣接領域の中心に位置しないことが好ましい。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１〜約４（例えば、約１、２、３または４）のヌクレオチドのオーバーハングを含む。オーバーハング中のヌクレオチドは、同一のヌクレオチドでも異なるヌクレオチドでもよい。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、本発明の二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の３’端部（または３’末端）において生じる。例えば、本発明の二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖／領域の３’末端、センス鎖／領域の３’末端、またはアンチセンス鎖／領域およびセンス鎖／領域の両方の３’末端において、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。オーバーハングヌクレオチドは、修飾されていてもされていなくてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分を構成するヌクレオチドは標的核酸配列に基づいた配列を含み、アンチセンス鎖／領域のオーバーハング部分を構成するヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドに相補的であり、および／またはセンス鎖／領域のオーバーハング部分を構成するヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列からのヌクレオチドを含む。従って、いくつかの実施形態では、オーバーハングは、標的ポリヌクレオチド配列の一部に対して相補的である２ヌクレオチドオーバーハングを含む。しかしながら、他の実施形態では、オーバーハングは、標的核酸配列の一部に対して相補的でない２ヌクレオチドオーバーハングを含む。ある実施形態では、オーバーハングは、標的核酸配列の一部に対して相補的でない３’−ＵＵオーバーハングを含む。他の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端のＵＵオーバーハングと、センス鎖の３’末端のＴＴオーバーハングとを含む。
３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有する本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、オーバーハングは、任意選択で、１つまたは複数の核酸糖、塩基、または骨格位置において化学修飾される。本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分の修飾ヌクレオチドの代表的であるが非限定的な例としては、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、普遍的な塩基、非環式、または５−Ｃ−メチルヌクレオチドが挙げられる。より好ましい実施形態では、オーバーハングヌクレオチドはそれぞれ独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの例では、オーバーハングヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオアート結合によって連結される。
さらに他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑末端を有する（すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがない）二本鎖核酸分子を含み、分子の両末端が平滑であるか、あるいは末端の一方が平滑である。いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は１つの平滑末端を含み、この場合、例えば、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端がオーバーハングヌクレオチドを有さないか、あるいはアンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない。他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は２つの平滑末端を含み、この場合、例えば、アンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端、ならびにアンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない。
本発明のｓｉＮＡ分子の実施形態または態様のいずれにおいても、センス鎖および／またはアンチセンス鎖はさらに、本明細書に記載されるかあるいは当該技術分野において知られているようなキャップを有する。キャップは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の５’末端、および／またはセンス鎖の３’末端に存在し得る。ヘアピンｓｉＮＡ分子の場合、キャップは、ポリヌクレオチドの３’末端に存在し得る。本発明のｓｉＮＡのアンチセンス鎖の５’末端のキャップは、式ＩおよびＩＩの構造によって説明されるように、５’修飾ヌクレオチドによって包含される。いくつかの実施形態では、キャップは、二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の一方または両方の末端にある。他の実施形態では、キャップは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端にある。他の実施形態では、キャップは、センス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端にある。このような末端キャップの代表的であるが非限定的な例としては、逆位脱塩基ヌクレオチドおよびその誘導体（例えば、逆位デオキシ脱塩基ヌクレオチド、テトラ−Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシルホスファート逆位脱塩基ヌクレオチド（例えば、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃＬｙｓ−６ａｍｉＬ−ｉＢ−ｏｍｅＣ；以下の表１４を参照）、逆位ヌクレオチド部分、グリセリル修飾、アルキルまたはシクロアルキル基、複素環または当該技術分野において一般的に知られている任意の他のキャップが挙げられる。
本発明のｓｉＮＡ分子の実施形態はいずれも、５’リン酸末端を有することができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子は末端リン酸を含まない。
ある実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、約３〜約３０（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を含む。一般的に、本発明のｓｉＮＡの二本鎖構造は１５〜３０の間の塩基対、より一般的には１８〜２５の間の塩基対、さらにより一般的には１９〜２４の間の塩基対、最も一般的には１９〜２１の間の塩基対の長さである。一実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は１９塩基対を含む。一実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は２０塩基対を含む。一実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は２１塩基対を含む。本発明のこの部分の二本鎖ｓｉＮＡ分子は非対称または対称であり得る。本発明のこの態様の他の実施形態では、ｓｉＮＡ二本鎖分子はヘアピン構造である。
本発明の任意のｓｉＮＡ分子は、上記に詳細に説明されるように、アンチセンス鎖の５’修飾ヌクレオチドに加えて、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含むことができる。修飾は、安定性、活性、毒性、免疫応答（例えば、インターフェロン応答、炎症性もしくは炎症促進性のサイトカイン応答、またはＴｏｌｌ様受容体応答の刺激の阻害）、および／または生物学的利用能などのインビトロまたはインビボ特性を改善するために使用することができる。本明細書に開示される種々の化学修飾ｓｉＮＡモチーフは、非修飾または最小限に修飾された活性ｓｉＲＮＡと実質的に類似したＲＮＡｉ活性を保持する可能性がある（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７−６８８８を参照）が、同時に、治療用途における使用に適したヌクレアーゼ抵抗性および薬物動態特性を提供する。
このようなｓｉＮＡ分子が式ＩＩの構造を有する５’修飾ヌクレオチドを含む、本発明のｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、アンチセンスおよび／またはセンス鎖中に存在する任意の（例えば、１つ、複数または全ての）付加的なヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る（例えば、１つの付加的なヌクレオチドが修飾される、いくつかの付加的なヌクレオチド（すなわち、複数または１つよりも多い）が修飾される、あるいは分子の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである）。修飾には、糖修飾、塩基修飾、骨格（ヌクレオシド間結合）修飾、非ヌクレオチド修飾、および／またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子はさらに、１つまたは複数の付加的な２’ヌクレオシド間結合（例えば、１つまたは複数の付加的な２’−５’ヌクレオシド間結合）を含む。
本発明のｓｉＮＡ分子における使用に適した化学修飾の非限定的な例は、米国特許第８，２０２，９７９号明細書および米国特許出願第１０／９８１，９６６号明細書および米国特許出願第１２／０６４，０１４号明細書（それぞれ米国特許出願公開第２００５０２６６４２２号明細書および米国特許出願公開第２００９０１７６７２５号明細書として公開）ならびにそこに引用される参考文献に開示されており、糖、塩基、および骨格修飾、非ヌクレオチド修飾、および／またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。これらの米国特許および特許出願は、本発明のｓｉＮＡ分子と共に使用するのに適した化学修飾を記述するための参考文献として本明細書に援用される。
単一のｓｉＮＡ分子内に存在するヌクレオチドの化学修飾は同一でも異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つの化学修飾を有する。他の実施形態では、各鎖は、糖、塩基、または骨格（すなわち、ヌクレオチド間結合）修飾などの、同一でも異なっていてもよい少なくとも１つの化学修飾を有する。他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上の化学修飾を含有する。
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、化学修飾により部分的に修飾される（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、または５９のヌクレオチドが修飾される）。いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖の５’修飾ヌクレオチドを除いて、少なくとも約８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０の、修飾ヌクレオチドであるヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、化学修飾により完全に修飾され（１００％修飾）、すなわち、ｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含有しない。実施形態のいくつでは、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖中のヌクレオチドの１つまたは複数が修飾される。いくつかのまたは他の実施形態では、アンチセンス鎖の５’修飾ヌクレオチドを除いて、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖中のヌクレオチドの１つまたは複数が修飾される。いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖において独立して、アンチセンス鎖の５’修飾ヌクレオチドを除いて、ヌクレオチド位置の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）が修飾される。
本発明のｓｉＮＡ分子内に含有される修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖部分の２’炭素および／または糖部分の３’炭素における修飾を有するものを含む。本発明のある特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、当該技術分野において一般的に認識されるように、２’−デオキシ−２−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチド、２’−メトキシエトキシまたはロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである。
本発明のさらに他の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドは、リボ様ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）またはＡ型ヘリックス立体配置を有する（例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ．，１９８４を参照）。ノーザン立体配置を有するヌクレオチドの非限定的な例としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチドｓ）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチルヌクレオチド；２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド；２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド；２’−アジドヌクレオチド；２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド；２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド；２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド；および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。種々の実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数（例えば、５０％よりも多い）は糖修飾を含む。同じおよび／または他の実施形態のいくつかにおいて、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するプリンヌクレオチドの大多数（例えば、５０％よりも多い）は糖修飾を含む。
ある場合には、本発明のｓｉＮＡ分子のプリンおよびピリミジンヌクレオチドは差別的に修飾される。１つの例では、プリンおよびピリミジンヌクレオチドは、糖部分の２’炭素において差別的に修飾され得る（すなわち、少なくとも１つのプリンは、糖部分の２’炭素において、同じまたは異なる鎖中の少なくとも１つのピリミジンとは異なる修飾を有する）。ある実施形態では、プリンは、一方または両方の鎖において非修飾であるが、一方または両方の鎖のピリミジンは修飾される。いくつかの他の場合には、ピリミジンは一方または両方の鎖において非修飾であるが、一方または両方の鎖のプリンは修飾される。ｓｉＮＡ分子が本明細書に記載される１つまたは複数の修飾を含む特定の場合には、アンチセンス（ガイド）鎖の５’末端の第２位および第３位のヌクレオチドは修飾されない。
本発明のｓｉＮＡ分子のいくつかの実施形態では、アンチセンス鎖中のピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドである。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の相補的な領域中のピリミジンヌクレオチドの全てが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。ある実施形態では、アンチセンス鎖の相補的な領域中のプリンの全てが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
本発明のｓｉＮＡ分子の他の実施形態では、センス鎖中のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス鎖中に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。本発明の特定の実施形態では、センス鎖の相補的な領域中のピリミジンヌクレオチドの全てが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。ある実施形態では、センス鎖の相補的な領域中のプリンヌクレオチドの全てが２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
ある実施形態では、センス鎖の相補的な領域中のピリミジンヌクレオチドの全てが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の相補的な領域中のピリミジンヌクレオチドの全てが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス鎖の相補的な領域中のプリンヌクレオチドの全てが２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の相補的な領域中のプリンの全てが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖中のピリミジンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、一方または両方の鎖中のピリミジンヌクレオチド少なくとも５個またはそれ以上が２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、一方または両方の鎖中のプリンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が２’−デオキシ−２’−フルオロプリンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、一方または両方の鎖中のプリンヌクレオチドの少なくとも５個またはそれ以上が２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシド間連結基（すなわち、式ＩＩの５’修飾ヌクレオチドにおいて説明されるように、２’ヌクレオシド間結合以外）を含む。修飾ヌクレオシド間連結基は、２’ヌクレオシド間連結基（例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオアート２’−５’ヌクレオシド間結合）を含むがこれらの限定されないホスホジエステル３’−５’ヌクレオシド間連結基以外の連結基である。ある実施形態では、各ヌクレオシド間連結基は独立して、２’または３’ホスホジエステルまたはホスホロチオアートヌクレオシド間連結基である。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子のいずれかまたは両方の鎖の最５’−ヌクレオシド間連結基は、ホスホロチオアート連結基である。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、３〜１２の隣接ホスホロチオアート連結基を含み、このホスホロチオアート連結基は、２’または３’ヌクレオシド間連結基のいずれかである。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は６〜８の隣接ホスホロチオアート連結基を含み、このホスホロチオアート連結基は、２’または３’ヌクレオシド間連結基のいずれかである。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンスおよび／またはセンス鎖の３’末端は、ホスホロチオアート連結基を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、アンチセンスおよび／またはセンス鎖の３’末端に６〜８の隣接ホスホロチオアート連結基を含み、このホスホロチオアート連結基は、２’または３’ヌクレオシド間連結基のいずれかである。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、２’−５’ヌクレオシド間結合を有する付加的な化学修飾ヌクレオチドを含有しない（すなわち、式ＩＩの５’修飾ヌクレオチドによって記載されるように、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の第１位の５’修飾ヌクレオチドのみが２’ヌクレオシド間結合を有する）。さらなる実施形態では、本発明の一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖および／または任意選択でセンス鎖における１つまたは複数の付加的な化学修飾ヌクレオチドはどれも２’−５’ヌクレオシド間結合を有さない。本発明のｓｉＮＡ分子の一実施形態では、アンチセンス鎖の第２位のヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオシド間結合を含有しない。別の実施形態では、アンチセンス鎖の第３位のヌクレオチドは２’−５’ヌクレオシド間結合を含有しない。さらなる実施形態では、第２位または第３位のヌクレオチドはいずれも２’−５’ヌクレオシド間結合を含有しない。
一実施形態では、式ＩＩの構造の５’修飾ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む本発明のｓｉＮＡ分子は、２’ヌクレオシド間結合を介して近接（隣接）ヌクレオチドへ連結された１つまたは複数の付加的なヌクレオチドを含む。特に、ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子はさらに、式ＩＩＩ：
Figure 2016508724
 の構造を有する１つまたは複数の付加的なヌクレオチドを含み、式中、
Ｂｘは、任意の複素環塩基部分であり、
Ｊｘは、式ＩＩＩのヌクレオチドを、ｓｉＮＡ分子の近接（隣接）ヌクレオチド糖部分に連結するヌクレオシド間連結基であり、
Ｒｘ １およびＲｘ １’はＨ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲｘ ３、−Ｎ（Ｒｘ ３）２から独立して選択されるか、または一緒に、＝Ｏもしくは＝ＣＨ２を形成し、
Ｒｘ ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ２〜６アルケニルであり、
Ｒｘ ３は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（これは、−ＯＲｘ ４、−ＳＲｘ ４、−Ｎ（Ｒｘ ５）２、（＝Ｏ）−ＮＲｘ ６または１〜３個のハロゲンによって任意選択で置換される）、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒｘ ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲｘ ７、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソ、−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒｘ ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒｘ ４は、メチル、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒｘ ５）２または−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｘ ５）２であり、
Ｒｘ ５は、ＨまたはＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
Ｒｘ ６は、（Ｒｘ ５）２、−Ｒｘ ５−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒｘ ５）２または−Ｒｘ ５−Ｃ（＝ＮＲｘ ５）［Ｎ（Ｒｘ ５）２］であり、および
Ｒｘ ７は、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、Ｂｘは、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、Ｊｘは、ホスホジエステルヌクレオシド間連結基またはホスホロチオアートヌクレオシド間連結基である。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、Ｒｘ １はＨである。本発明のこの態様の特定の実施形態では、Ｒｘ １’は、Ｈ、ハロゲンまたは−ＯＲｘ ３である。本発明のこの態様の他の実施形態では、Ｒｘ １’は、ハロゲン、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｆ、−ＯＣＨ２ＣＨＦ２、−ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＳＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３または−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２である。本発明のこの態様の他の実施形態では、Ｒｘ １’は、Ｈ、Ｆ、ヒドロキシルまたは−ＯＣＨ３である。
ある実施形態では、本発明の一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、２’−５’ヌクレオシド間結合を有する付加的な化学修飾ヌクレオチド（式ＩＩＩのヌクレオチドを含むがこれに限定されない）を９個まで（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８または９個）含有し得る。さらなる実施形態では、本発明の一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、２’−５’ヌクレオシド間結合を有する付加的な化学修飾ヌクレオチドを５個まで（例えば、０、１、２、３、４または５個）含有し得る。さらなる実施形態では、本発明の一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、２’−５’ヌクレオシド間結合を有する付加的な化学修飾ヌクレオチドを３個まで（例えば、０、１、２または３個）含有し得る。別の実施形態では、本発明の一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、２’−５’ヌクレオシド間結合を有する付加的な化学修飾ヌクレオチドを１つ含有し得る。
引用される参考文献のものを含む上記の修飾のいずれかまたはその組み合わせは、本発明のｓｉＮＡ分子のいずれかに適用され得る。
Ｃ．５’修飾ヌクレオチド
本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子に取り込まれたときに、分子のアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド位置１にあり、２’ヌクレオシド間結合を介してアンチセンス鎖の第２位のヌクレオチドに連結され、かつ修飾５’キャップ（すなわち、５’リン酸キャップ以外）を含有し得る５’修飾ヌクレオチドを特徴とする。これらの５’修飾ヌクレオチドは、本発明のｓｉＮＡ分子を生成するための試薬として使用することができる。
特に、本発明は、式Ｉ：
Figure 2016508724
 の構造を有する５’修飾ヌクレオチドを特徴とし、式中、
Ａは、−Ｃ（Ｒ３）２−、−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−または−ＣＲ３＝ＣＲ３−であり、
Ｂは、任意の複素環塩基部分であり、
Ｄ１およびＤ１’は、ヒドロキシル、−ＯＲ４、−ＳＲ４、または−Ｎ（Ｒ４）２から独立して選択され、
ＥおよびＥ’は、Ｏ、Ｓ、−ＮＲ５、−Ｎ−Ｎ（Ｒ４）２または−Ｎ−ＯＲ４から独立して選択され、
Ｇ１は、ヒドロキシルまたは−ＯＲ６であり、
Ｇ１’は、ヒドロキシル、−ＯＲ６または−Ｎ（Ｒ６）２であり、
Ｒ１およびＲ１’は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ７）２から独立して選択されるか、または一緒に、＝Ｏもしくは＝ＣＨ２を形成し、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ２〜６アルケニルであり、
Ｒ３およびＲ５は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ６は独立して、末端炭素原子において任意選択でシアノまたは保護基により置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（これは、−ＯＲ８、−ＳＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、（＝Ｏ）−ＮＲ１０または１〜３個のハロゲンによって任意選択で置換される）、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソ、−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
Ｒ８は、メチル、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ９）２または−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ９）２であり、
Ｒ９は、ＨまたはＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
Ｒ１０は、（Ｒ９）２、−Ｒ９−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒ９）２または−Ｒ９−Ｃ（＝ＮＲ９）［Ｎ（Ｒ９）２］であり、
Ｒ１１は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、および
ｒは０または１である。
ある実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、ヒドロキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
Figure 2016508724
 から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル（例えば、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル）、
Figure 2016508724
 から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル）またはアリールから選択される。
ある実施形態では、Ａは、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ＝ＣＨ−である。ある実施形態では、Ａは、ＣＨ＝ＣＨ−である。
ある実施形態では、Ｂは、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンから選択される。ある実施形態では、Ｂはチミンである。
ある実施形態では、Ｄ１およびＤ１’は、ヒドロキシル、−ＯＣＨ３または−ＯＣＨ２ＣＨ３から独立して選択される。ある実施形態では、Ｄ１およびＤ１’は独立して−ＯＣＨ２ＣＨ３である。
ある実施形態では、Ｅは、ＯまたはＳから選択される。ある実施形態では、Ｅは、Ｏである。
ある実施形態では、ｒは１である。ｒが１であるこれらの実施形態のいくつかにおいて、Ｇ１およびＧ１’はヒドロキシルであり、Ｅ’はＯまたはＳである。
ある実施形態では、ｒは０である。ｒが０であるこれらの実施形態のいくつかにおいて、Ｇ１は−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮであり、Ｇ１’は−Ｎ［ＣＨ（ＣＨ３）２］２である。
ある実施形態では、Ｒ１はＨである。
ある実施形態では、Ｒ１’は、Ｈ、ハロゲンまたは−ＯＲ７である。ある実施形態では、Ｒ１’は、ハロゲン、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｆ、−ＯＣＨ２ＣＨＦ２、−ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＳＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３または−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２である。ある実施形態では、Ｒ１’はＦまたは−ＯＣＨ３である。
ある実施形態では、Ｒ２はＨである。
ある実施形態では、Ｒ１、Ｒ１’およびＲ２のそれぞれはＨである。
Ｄ．ｓｉＮＡ分子の生成／合成
本発明のｓｉＮＡ分子は、当業者に知られているいくつかの技術を用いて得ることができる。例えば、ｓｉＮＡ分子は、当該技術分野において知られているプロトコルを用いて化学的に合成することができる（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第９９／５４４５９号パンフレット；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５；Ｂｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号明細書；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；およびＳｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３において記載される）。当該技術分野において記載されているオリゴヌクレオチドの合成は、５’末端のジメトキシトリチル、および３’−または２’末端のホスホラミダイトなどの、一般的な核酸保護およびカップリング基を使用する。これらの合成は、本発明の特定のｓｉＮＡ分子のために使用することもできる。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、米国特許第６，９９５，２５９号明細書、米国特許第６，６８６，４６３号明細書、米国特許第６，６７３，９１８号明細書、米国特許第６，６４９，７５１号明細書、米国特許第６，９８９，４４２号明細書、および米国特許第７，２０５，３９９号明細書に記載される方法に従って、合成、脱保護、および分析される。
非限定的な合成例では、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機において、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分のカップリングステップ、および２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドについては４５秒のカップリングステップによる０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて小規模の合成が実行される。
あるいは、本発明のｓｉＮＡ分子は別々に合成され、例えば、ライゲーション（例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第９３／２３５６９号パンフレット；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；およびＢｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８，２０４）によって、あるいは合成および／または脱保護後のハイブリダイゼーションによって、合成後に結合されてもよい。
Ｅ．担体／送達系
本発明のｓｉＮＡ分子は標的細胞または組織に直接添加されるか、あるいは標的細胞または組織への送達のために種々の成分と複合体化される（例えば、リポソーム内にパッケージングされる；単一の化学物質ターゲティング部分とカップリングされる）。核酸分子を送達するための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５；Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，３９５，７１３号明細書、およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際出願公開国際公開第９４／０２５９５号パンフレットには、さらに、核酸分子の送達のための一般的な方法が記載されている。これらのプロトコルは、実質的にあらゆる核酸分子の送達のために利用することができる。リポソーム内でのカプセル化による、イオントフォレーシスによる、あるいは、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第０３／４７５１８号パンフレットおよび国際公開第０３／４６１８５号パンフレットを参照）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号明細書および米国特許出願公開第２００２１３０４３０号明細書を参照）、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアなどの他の媒体への取込みによる、あるいは、タンパク質性ベクター（例えば、Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎｄ，国際ＰＣＴ公開国際公開第００／５３７２２号パンフレット）によるものなどを含むがこれらに限定されない、当業者に知られている様々な方法によって、核酸分子を細胞に投与することができる。
１つの態様では、本発明は、本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子を含有する担体系を提供する。いくつかの実施形態では、担体系は、脂質ベースの担体系、カチオン性脂質、またはリポソーム核酸複合体、リポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質ナノ粒子またはこれらの混合物である。他の実施形態では、担体系は、カチオン性ポリマー−核酸複合体などのポリマーベースの担体系である。付加的な実施形態では、担体系は、シクロデキストリンポリマー−核酸複合体などのシクロデキストリンベースの担体系である。さらなる実施形態では、担体系は、カチオン性ペプチド−核酸複合体などのタンパク質ベースの担体系である。別の実施形態では、担体系は、脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）製剤である。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国特許第７，５１４，０９９号明細書および米国特許第７，４０４，９６９号明細書、米国特許出願第１３／０５９，４９１号明細書、米国特許出願第１３／３９０，７０２号明細書、米国特許出願第１３／６９９，４５１号明細書、米国特許出願第１３／７０１，６３６号明細書および米国特許出願第１３／５００，７３３号明細書、ならびにＰＣＴ国際特許出願公開国際公開第２０１０／０８０７２４号パンフレット、国際公開第２０１１／０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１０／０２１８６５号パンフレット、国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット、国際公開第２０１０／１０５２０９号パンフレット、国際公開第２０１１／１２７２５５号パンフレット、国際公開第２０１２／０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１２／０４４６３８号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０２２４６０号パンフレットに記載されているものなどの脂質ナノ粒子組成物と共に処方される。
他の実施形態では、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートおよび／または複合体を特徴とする。このようなコンジュゲートおよび／または複合体は、ｓｉＮＡ分子の生物系（例えば、細胞など）への送達を容易にするために使用することができる。本発明によって提供されるコンジュゲートおよび複合体は、細胞膜を越えて治療化合物を移行させ、薬物動態を変化させ、および／または本発明の核酸分子の局在化を調節することによって、治療活性を付与する可能性を有する。このようなコンジュゲートの非限定的な例は、米国特許第８，１３７，６９５号明細書、米国特許第７，８３３，９９２号明細書、米国特許第６，５２８，６３１号明細書、米国特許第６，３３５，４３４号明細書、米国特許第６，２３５，８８６号明細書、米国特許第６，１５３，７３７号明細書、米国特許第５，２１４，１３６号明細書、米国特許第５，１３８，０４５号明細書および米国特許第７，８１６，３３７号明細書、ならびに米国特許出願第１０／２０１，３９４号明細書に記載されている（例えば、ＣＤＭ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−Ｐｉｐ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−ＰＥＧ、ＣＤＭ−ＮＡＧなど）。
種々の実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本発明のｓｉＮＡ化合物に共有結合され得る。結合されるＰＥＧは任意の分子量でよいが、好ましくは、約１００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ）である。
さらに他の実施形態では、本発明は、例えば、国際ＰＣＴ公開国際公開第９６／１０３９１号パンフレット、国際公開第９６／１０３９０号パンフレットおよび国際公開第９６／１０３９２号パンフレットに開示されているものなどの、ポリ（エチレンエチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ−修飾、または長期循環リポソームまたはステルスリポソーム）と、本発明のｓｉＮＡ分子とを含む組成物または製剤を特徴とする。
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体などと共に処方または複合体化することができる。一実施形態では、本発明の核酸分子は、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書に記載されるように処方される。
他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国特許第６，８３５，３９３号明細書に記載されるものなどの膜破壊剤と共に複合体化される。さらに他の実施形態では、膜破壊剤およびｓｉＮＡ分子はまた、米国特許第６，２３５，３１０号明細書に記載される脂質などのカチオン性脂質またはヘルパー脂質分子と共に複合体化される。
ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２８７５５１号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１９１６２７号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１１８５９４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１５３９１９号明細書、米国特許出願公開第２００５／００８５４８６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１５８１３３号明細書、ならびに国際公開第００／０３６８３号パンフレットおよび国際ＰＣＴ公開国際公開第０２／０８７５４１号パンフレットに記載されるような送達系と複合体化される。
いくつかの実施形態では、本発明のリポソーム製剤は、米国特許第６，８５８，２２４号明細書、米国特許第６，５３４，４８４号明細書、米国特許第６，２８７，５９１号明細書、米国特許第６，８３５，３９５号明細書、米国特許第６，５８６，４１０号明細書、米国特許第６，８５８，２２５号明細書、米国特許第６，８１５，４３２号明細書、米国特許第６，５８６，００１号明細書、米国特許第６，１２０，７９８号明細書、米国特許第６，９７７，２２３号明細書、米国特許第６，９９８，１１５号明細書、米国特許第５，９８１，５０１号明細書、米国特許第５，９７６，５６７号明細書、米国特許第５，７０５，３８５号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００６／００１９９１２号明細書、米国特許出願公開第２００６／００１９２５８号明細書、米国特許出願公開第２００６／０００８９０９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２５５１５３号明細書、米国特許出願公開第２００５／００７９２１２号明細書、米国特許出願公開第２００５／０００８６８９号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００５／００６４５９５号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７５６８２号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１１８２５３号明細書、米国特許出願公開第２００４／００７１６５４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２４４５０４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２６５９６１号明細書および米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書に記載される化合物および組成物と共に処方または複合体化された本発明のｓｉＮＡ分子（例えば、ｓｉＮＡ）を含む。
Ｆ．キット
本発明は、キット形態の核酸も提供する。本キットは容器を含み得る。本キットは通常、本発明の核酸をその投与のための説明書と共に含有する。ある場合には、核酸は、ターゲティング部分が結合されていてもよい。ターゲティング部分（例えば、抗体、タンパク質）を結合する方法は、当業者に知られている。ある場合には、核酸は化学修飾される。他の実施形態では、本キットは、２つ以上の本発明のｓｉＮＡ分子を含有する。本キットは、本発明のｓｉＮＡ分子を薬学的に許容可能な担体または希釈剤と共に含んでいてもよい。本キットはさらに賦形剤を含み得る。
Ｇ．使用
本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉ干渉機構によって、標的核酸の発現を調節（例えば、阻害）するために有用である。従って、本発明の１つの態様は、細胞において標的特異的ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を阻害する方法に関し、本方法は、前記細胞をｓｉＮＡ分子、またはその組成物、または本発明と接触させることを含む。本発明の遺伝子発現の阻害方法は、インビトロまたはインビボで起こり得る。ある実施形態では、細胞は、動物細胞（例えば、哺乳類細胞）である。ある実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。さらなる実施形態では、哺乳類細胞は動物の内部にある。
本発明のｓｉＮＡ分子は、標的核酸（すなわち、標的遺伝子）の発現および／または活性を制御するために有用であり、従って、診断目的のためのアッセイにおいて、および／あるいは１つまたは複数の病状を治療するための治療計画において、使用される可能性を有することができる。例えば、本発明のｓｉＮＡを用いて診断および／または治療される可能性を有する１つまたは複数の病状は、ｓｉＮＡが指向される特定の遺伝子標的の発現に関連し得る。従って、この例では、本発明のｓｉＮＡ分子は、その遺伝子発現が特定の病状と関連する標的関連ｍＲＮＡを分解する可能性がある。
一実施形態では、疾患の阻害は、被験者の疾患の進行を直接測定することによって評価され得る。例えば、これは、疾患に関連する状態の変化または回復の観察を通して推測することもできる。本発明のｓｉＮＡ分子は、予防として使用される可能性も有する。従って、本発明のｓｉＮＡ分子および医薬組成物の使用は、特定の標的の遺伝子発現の制御に関連する病状を回復させる、治療する、予防する、および／または治癒させる可能性を有する。
本発明１つの態様は、前記標的遺伝子の作用によって、または作用の喪失によって媒介される状態または疾患を患っている被験者において遺伝子の発現を低下させる方法を含み、本方法は、前記被験者に有効量の本発明のｓｉＮＡ分子を投与することを含む。一実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、遺伝子（すなわち、標的遺伝子）に指向される。別の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、遺伝子（すなわち、経路標的遺伝子）の発現および／または活性経路内の標的に指向される。一実施形態では、被験者はヒト被験者である。
一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子またはその組成物が投与され得る被験者は、癌または癌に関連する状態を患っている。従って、本発明のｓｉＮＡ分子は癌を治療するために有用である可能性を有し、癌細胞の転移および／または癌に関連する状態を調節する可能性を含むが限定されない。本発明の態様に従って治療される可能性のある癌の例は、膀胱癌、膀胱移行細胞癌、尿路上皮癌、脳癌、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、乳癌腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、結腸直腸癌腫、結腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、食道扁平上皮癌、眼黒色腫、ぶどう膜黒色腫、眼球内黒色腫、原発性眼内リンパ腫、腎細胞癌、腎明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性（ＣＭＭＬ）、肝癌、肝細胞腫、肝細胞癌、胆管癌、肺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵癌、膵管腺癌、前立腺癌、前立腺腺癌、横紋筋肉腫、胎児性横紋筋肉腫、皮膚癌、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、粘膜黒色腫、小腸癌、胃癌、胃癌腫、精巣癌、精巣精上皮腫、精巣非精上皮腫、甲状腺癌、甲状腺乳頭癌、および乳頭状腺癌を含み得る。
本発明のｓｉＮＡ分子は、エクスビボ用途における試薬として有用である可能性を有する。例えば、ｓｉＮＡ分子は、潜在的な治療効果のために被験者に移植される組織または細胞内に導入され得る。細胞および／または組織は、後で外植片を受け入れる生物体または被験者に由来することもでき、あるいは移植前の別の生物体または被験者に由来することもできる。これに関連して、細胞または組織が、インビボで移植されたときに、所望の表現型を獲得するか、あるいは機能を実施することができるように、ｓｉＮＡ分子は細胞または組織において１つまたは複数の遺伝子の発現を調節し得る。
Ｈ．医薬組成物
本発明のｓｉＮＡ分子は、様々な治療、予防、獣医学、診断、標的検証、ゲノム発見、遺伝子操作、および薬理ゲノミクス用途に関連する方法で使用するために有用な試薬を提供する可能性を有する。
１．製剤
本発明は、記載されるｓｉＮＡ分子の医薬組成物、すなわち薬学的に許容可能な担体または希釈剤中の組成物を提供する。これらの製剤または組成物は、当該技術分野において一般的に知られているような薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含むことができる。
本発明のｓｉＮＡ分子は、好ましくは、当該技術分野において既知の技術に従って、被験者に投与する前に医薬組成物として処方される。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり、発熱物質を含有しないものとして特徴付けられる。本発明の医薬組成物の調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載されるように当該技術分野の技能の範囲内である。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）はさらに、従来の医薬賦形剤および／または添加剤を含む。適切な医薬賦形剤には、防腐剤、香味剤、安定剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、緩衝液、およびｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性の緩衝液（例えば、トリメチルアミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）、もしくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、または任意選択で、カルシウムもしくはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）の添加が含まれる。さらに、酸化防止剤および懸濁化剤を使用することができる。
局所投与のための種々のタイプの製剤の非限定的な例としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、フォーム、経皮パッチによる送達のための調製物、粉末、スプレー、エアロゾル、吸入器または吸入具において使用するためのカプセルまたはカートリッジまたは点滴剤（例えば、点眼薬または点鼻薬）、噴霧化のための溶液／懸濁液、坐薬、ペッサリー、停留浣腸、および噛むまたは吸うことができる錠剤もしくはペレット（例えば、アフタ性潰瘍の治療のため）、またはリポソームもしくはマイクロカプセル化調製物が挙げられる。
軟膏、クリームおよびゲルは、例えば、適切な増粘剤および／またはゲル化剤および／または溶媒の添加により、水性または油性基剤と共に処方することができる。このような基剤の非限定的な例は、従って、例えば、水および／または油（例えば、流動パラフィンなど）または植物油（例えば、ラッカセイ油またはヒマシ油）、または溶媒（例えば、ポリエチレングリコールなど）を含むことができる。基剤の性質に応じて、種々の増粘剤およびゲル化剤を使用することができる。このような薬剤の非限定的な例には、軟パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、蜜ろう、カルボキシポリメチレンおよびセルロース誘導体、および／またはモノステアリン酸グリセリルおよび／または非イオン性乳化剤が含まれる。
一実施形態では、ローションは、水性または油性基剤と共に処方することができ、一般的に、１つまたは複数の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤または増粘剤も含有し得る。
一実施形態では、外用のための粉末は、任意の適切な粉末基剤、例えば、タルク、ラクトースまたはデンプンを用いて形成することができる。点滴剤は、１つまたは複数の分散剤、可溶化剤、懸濁化剤または防腐剤も含む水性または非水性基剤と共に処方することができる。
経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造のための技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、薬学的に優雅で美味の調製物を提供するために、１つまたは複数のこのような甘味剤、香味剤、着色剤または防腐剤を含有することができる。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなど）、顆粒化および崩壊剤（例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）、ならびに潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）であり得る。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、あるいは既知の技術によってコーティングされてもよい。いくつかの場合には、このようなコーティングは、胃腸管内での崩壊および吸収を遅延し、それにより、より長い期間にわたる持続作用を提供するために、既知の技術によって調製することができる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用することができる。
また経口使用のための製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなど）と混合された硬ゼラチンカプセルとして、あるいは、活性成分が水または油媒体（例えば、ピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油など）と混合された軟ゼラチンカプセルとして提供することができる。
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性材料を含有する。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであり、分散または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアラート）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアート）であり得る。また水性懸濁液は、１つまたは複数の防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｎ−プロピル）、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の香味剤、および１つまたは複数の甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリンなど）を含有することもできる。
油性懸濁液は、活性成分を植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）または鉱油（例えば、流動パラフィン）中に懸濁させることによって処方することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含有することができる。甘味剤および香味剤は、美味の経口調製物を提供するために添加され得る。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって保存され得る。
本発明の医薬組成物は、水中油エマルションの形態でもあり得る。油相は、植物油または鉱油またはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するガム（例えば、アカシアガムまたはトラガカントガム）、天然に存在するホスファチド（例えば、大豆、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導されるエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレアート）、および前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）であり得る。エマルションは、甘味剤および香味剤を含有することもできる。
シロップおよびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースと共に処方することができる。このような製剤は、粘滑薬、防腐剤、ならびに香味および着色剤を含有することもできる。医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、上記のような適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて既知の技術に従って処方することができる。また無菌の注射可能な調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であり得る。使用することができる許容可能な媒体および溶媒としては、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来通りに使用される。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の低刺激性の不揮発性油を使用することができる。さらに、注射剤の調製においてオレイン酸などの脂肪酸の使用が見出される。
本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば薬物の直腸投与のための坐薬の形態をとることができる。これらの組成物は、常温で固体であるが直腸温度では液体であり、従って直腸内で溶融して薬物を放出し得る適切な非刺激性賦形剤と、薬物とを混合することによって調製することができる。このような材料には、ココアバターおよびポリエチレングリコールが含まれる。
本発明のｓｉＮＡ分子は、非経口投与のために無菌媒体中で処方することができる。分子は、使用される媒体および濃度に応じて、媒体中に懸濁または溶解され得る。有利に、局所麻酔薬、防腐剤および緩衝剤などの補助剤が媒体中に溶解され得る。
他の実施形態では、肺送達で使用するために本明細書で提供されるｓｉＮＡ分子製剤はさらに、１つまたは複数の界面活性剤を含む。本発明の組成物の取込みを増強するために適切な界面活性剤または界面活性剤成分には、とりわけ、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｂ、サーファクタントタンパク質Ｃ、サーファクタントタンパク質Ｄおよびサーファクタントタンパク質Ｅ、二飽和ホスファチジルコリン（ジパルミトイル以外）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ユビキノン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、パルミトイル−リゾホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチジン酸（ｓｕｌｆａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、グリセロール−３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール、グリセロ（ｇｌｙｃｅｒｏ）−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミタート、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、および／またはコリンリン酸の合成および天然ならびに完全および切断型；ならびに、界面活性剤の成分、オメガ−３脂肪酸、ポリエン酸（ｐｏｌｙｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ポリエン酸（ｐｏｌｙｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、レシチン、パルミチン酸、エチレンまたはプロピレンオキシドの非イオン性ブロックコポリマー、ポリオキシプロピレン、モノマーおよびポリマー、ポリオキシエチレン、モノマーおよびポリマー、デキストランおよび／またはアルカノイル側鎖を有するポリ（ビニルアミン）、Ｂｒｉｊ ３５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および合成界面活性剤 ＡＬＥＣ、Ｅｘｏｓｕｒｆ、ＳｕｒｖａｎおよびＡｔｏｖａｑｕｏｎｅのための天然担体媒体である天然および人工層状体（ｌａｍｅｌｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ）が含まれる。これらの界面活性剤は、製剤中の単一の界面活性剤または多成分界面活性剤の一部として、あるいは本明細書中の医薬組成物の核酸成分の５’および／または３’末端への共有結合付加として使用することができる。
一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、吸入器またはネブライザーによって投与されるエアロゾルまたは噴霧乾燥製剤の吸入などにより、関連の肺組織への核酸分子の急速な局所的取込みを提供する、肺送達による投与のために処方することができる。微粉化した核酸組成物の呼吸性乾燥粒子を含有する固体微粒子組成物は、乾燥または凍結乾燥した核酸組成物を粉砕し、次に微粉化した組成物を例えば４００メッシュのスクリーンに通過させて、大きい凝集体を破壊または分離除去することによって調製することができる。本発明のｓｉＮＡ組成物を含む固体微粒子組成物は、任意選択で、エアロゾルの形成を容易にする役割を果たす分散剤、および他の治療化合物を含有することができる。適切な分散剤は、任意の適切な比率（例えば、１対１の重量比）で核酸化合物とブレンドすることができるラクトースである。
本発明のｓｉＮＡ分子を含むスプレー組成物は、例えば、適切な液化噴射剤の使用により加圧パック（例えば、定量吸入器など）から送達される、水溶液または懸濁液またはエアロゾルとして処方することができる。一実施形態では、吸入に適した本発明のエアロゾル組成物は懸濁液または溶液のいずれかでよく、一般的に、本発明のｓｉＮＡ分子と、フルオロカーボンまたは水素含有クロロフルオロカーボンまたはこれらの混合物、特にヒドロフルオロアルカン（特に、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパンまたはこれらの混合物）などの適切な噴射剤とを含有する。エアロゾル組成物は、任意選択で、界面活性剤などの当該技術分野において周知の付加的な製剤賦形剤を含有することができる。非限定的な例としては、オレイン酸、レシチンまたはオリゴ乳酸または誘導体、例えば国際公開第９４／２１２２９号パンフレットおよび国際公開第９８／３４５９６号パンフレットに記載されているものなど、および共溶媒、例えばエタノールが挙げられる。一実施形態では、本発明の化合物と、噴射剤としてのフルオロカーボンまたは水素含有クロロフルオロカーボンまたはこれらの混合物とを含む本発明の医薬エアロゾル製剤は、任意選択で、界面活性剤および／または共溶媒と組み合わせられる。
本発明のエアロゾル製剤は、適切な緩衝剤の添加により緩衝され得る。
エアロゾル製剤は、製剤が無菌で調製されていない場合の防腐剤を含む、任意選択の添加剤を含むことができる。非限定的な例としては、ヒドロキシ安息香酸メチル、酸化防止剤、香味剤、揮発性油、緩衝剤および乳化剤、ならびに他の製剤界面活性剤が挙げられる。一実施形態では、分解を低減し、本発明のより安全な生体適合性の非液体微粒子懸濁組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を提供するために、フルオロカーボンまたはペルフルオロカーボン担体が使用される。別の実施形態では、ネブライザーを含むデバイスが、静菌性であるフルオロケミカルを含む本発明の組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を送達し、それにより、互換性のデバイスにおける微生物の増殖の可能性が低減される。
吸入器または吸入具において使用するための例えばゼラチンの、本発明の組成物を含むカプセルおよびカートリッジは、本発明の化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との吸入のための粉末混合物を含有するように処方することができる。一実施形態では、各カプセルまたはカートリッジは、本発明のｓｉＮＡ分子と、１つまたは複数の賦形剤とを含有する。別の実施形態では、本発明の化合物は、ラクトースなどの賦形剤を含まずに調製することができる。
ｓｉＮＡ分子は、国際公開第０５／０４４３５４号パンフレットに記載および説明されるものなどの流体ディスペンサーからの送達のための流体製剤として処方することもできる。
２．組み合わせ
本発明に従うｓｉＮＡ分子および医薬品製剤は、単独で被験者に投与することもでき、あるいは、疾患、障害、状態、および形質を予防または治療するための既知の治療薬、処置、または手順を含む１つまたは複数の他の療法と組み合わせて使用することもできる。当業者は、薬物成分の特定の特徴と、癌を含むが限定されない関連する疾患の兆候／状況とに基づいて、どの治療薬の組み合わせが有用であるかを認識できるであろう。
組み合わせは、医薬組成物の形態で使用するために便利に提供されることが可能であり、医薬組成物は、本発明のｓｉＮＡ分子、薬学的に許容可能な希釈剤または担体、および１つまたは複数の付加的な治療薬を含む組み合わせを含む。あるいは、このような組み合わせの個々の成分は、別々のまたは結合された医薬品製剤において順次または同時に投与することができる。
Ｉ．投与
組成物または製剤は、様々な方法で投与され得る。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子の投与は、単独療法として単独で、あるいは本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において既知の付加的な療法と組み合わせて、局所投与または全身投与によって行われる。
局所投与は、例えば、当該技術分野において一般的に知られているように、吸入、噴霧化、カテーテル法、移植、直接注射、皮膚／経皮適用、パッチ、ステント留置、点耳／点眼薬、または関連組織への門脈投与、または任意の他の局所投与技術、方法または手順を含むことができる。全身投与は、例えば、当該技術分野において一般的に知られているように、肺（吸入、噴霧化など）、静脈内、皮下、筋肉内、カテーテル法、鼻咽頭、経皮、または経口／胃腸投与を含むことができる。本発明の投与方法のさらなる非限定的な例としては、頬側、舌下、非経口（すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内）、局所直腸投与または他の局所投与が挙げられる。一実施形態では、本発明の組成物は、送気および吸入によって投与することができる。
一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、当該技術分野において一般的に知られている方法によって、肝臓に投与される（例えば、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０，２４４−９；Ｍｕｒａｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，１９，１８０８−１４；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０，１８０−７；Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５４，５１−８；Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．，１４９，１６１１−７；およびＭａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０，１５５９−６６を参照）。
一実施形態では、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子およびその組成物を単球およびリンパ球を含む造血細胞へ送達する方法の使用を特徴とする。これらの方法は、Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８５（２），９２０−９２８；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ，９１（３），８５２−８６２；Ｆｉｌｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３２９（２），３４５−３５６；Ｍａ ａｎｄ Ｗｅｉ，１９９６，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２０（１１／１２），９２５−９３０；およびＢｏｎｇａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２），４６８１−８によって詳細に記載されている。
一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、当該技術分野において一般的に知られている方法によって、直接または局所的（例えば、局部的）に皮膚または濾胞へ投与される（例えば、Ｂｒａｎｄ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，２４４−８；Ｒｅｇｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ，５，２７５−８９；Ｋａｎｉｋｋａｎｎａｎ，２００２，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１６，３３９−４７；Ｗｒａｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９０，８９−１０４；およびＰｒｅａｔ ａｎｄ Ｄｕｊａｒｄｉｎ，２００１，ＳＴＰ ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅｓ，１１，５７−６８を参照）。一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、アルコール（例えば、エタノールまたはイソプロパノール）、水を含み、および任意選択で、ミリスチン酸イソプロピルおよびカルボマー９８０などの付加的な薬剤を含むヒドロアルコールゲル製剤を用いて、直接または局所的に投与される。他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子および組成物は、局所的に鼻腔へ投与される。局所調製物は、１日に１回または複数回の適用によって患部に投与することができる。連続または長期の送達は、接着性の貯蔵系（ａｄｈｅｓｉｖｅ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｓｙｓｔｅｍ）によって達成することができる。
一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子またはその組成物は、例えば、特定の臓器または区画（例えば、眼、眼底、心臓、肝臓、腎臓、膀胱、前立腺、腫瘍、ＣＮＳなど）へ、イオン泳動的に投与される。イオン泳動的な送達の非限定的な例は、例えば、参照によってその全体が本明細書中に援用される国際公開第０３／０４３６８９号パンフレットおよび国際公開第０３／０３０９８９号パンフレットに記載されている。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射によって静脈内または腹腔内に投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号明細書を参照）。脂質核酸粒子は、疾患部位における直接注射によって、または疾患部位から遠位の部位における注射によって投与することができる（例えば、Ｃｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４）を参照）。
治療用途のために、薬学的に有効な用量の本発明のｓｉＮＡ分子または医薬組成物が被験者に投与される。薬学的に有効な用量は、発生を予防する、阻害する、または病状を治療（症状をある程度、好ましくは症状の全てを改善）するのに必要とされる用量である。当業者は、例えば、被験者のサイズおよび体重、疾患の進行または侵入の程度、被験者の年齢、健康、および性別、投与経路、ならびに投与が局所であるか全身であるかなどの因子を考慮に入れることによって、所与の被験者に投与すべき本発明のｓｉＮＡ分子の治療的に有効な用量を容易に決定することができる。一般的に、負帯電ポリマーの効力に応じて、０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の活性成分が投与される。最適な投与スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定から算出することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は、単回投与または複数回投与で投与することができる。
本発明のｓｉＮＡ分子は、月１回、週１回、１日１回（ＱＤ）投与することができる。例えば、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）２週間ごとに１回など、毎月、毎週または毎日複数回の投与に分割することもできる。従って、投与は単回投与により達成されてもよく、あるいは分割された投与で達成されてもよい。当業者は、測定された体液または組織内の薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復率を容易に推定することができる。
さらに、投与は、連続的（例えば、毎日）または間欠的であり得る。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子の間欠投与は、週に１〜６日の投与、周期的な投与（例えば、連続した２〜８週間の毎日の投与、次いで最大１週間までの投与を伴わない休止期間）、あるいは１日おきの投与であり得る。
本発明の組成物は単独で、あるいは他の適切な成分と組み合わせて、吸入（例えば、鼻腔内にまたは気管内）により投与されるエアロゾル製剤（すなわち、これらは「噴霧」され得る）に製造され得る（Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）を参照）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容可能な加圧噴射剤中に入れることができる。
本発明のエアロゾル組成物は、呼吸可能なサイズの粒子、例えば、吸入の際に鼻、口および喉頭を通過し、かつ気管支および肺胞を通るために十分に小さいサイズの粒子を含む製剤として、呼吸器系に投与することができる。一般的に、呼吸可能な粒子のサイズは約０．５〜１０ミクロンの範囲である。一実施形態では、微粒子の範囲は、１〜５ミクロンであり得る。別の実施形態では、微粒子の範囲は、２〜３ミクロンであり得る。エアロゾル中に含まれる呼吸可能なサイズでない粒子は喉に蓄積して嚥下される傾向にあり、従って、エアロゾル中の呼吸可能でない粒子の量は最小限にされる。経鼻投与の場合、鼻腔内の保持を保証するために１０〜５００ｕｍの範囲の粒径が好ましい。
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＮＡ組成物は、例えば、鼻炎の治療のために、加圧エアロゾル製剤によって、加圧ポンプまたは噴霧化により鼻に投与される水性製剤によって鼻へ局所的に投与される。
本発明のｓｉＮＡ分子または製剤および界面活性剤を含む固体粒子エアロゾルは、任意の固体微粒子エアロゾル発生器を用いて製造することができる。本発明のｓｉＮＡ分子と共に使用される１つのタイプの固体粒子エアロゾル発生器は吸入具である。第２のタイプの例示的なエアロゾル発生器は定量吸入器（「ＭＤＩ」）を含む。本明細書で教示されるｓｉＮＡ分子または製剤を含有するＭＤＩは、当該技術分野の方法によって調製することができる（例えば、Ｂｙｒｏｎ，上記および国際公開第９６／３２０９９号パンフレットを参照）。
従って、本発明のある実施形態では、意識下で自然呼吸をする被験者のため、および制御された人工呼吸器をつけた全ての年齢層の被験者のための適用においてネブライザーデバイスが使用される。ネブライザーデバイスは、標的化された肺への局所および全身薬物送達のために使用することができる。一実施形態では、ネブライザーを含むデバイスを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を肺または肺組織へ局所的に送達する。別の実施形態では、ネブライザーを含むデバイスを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を全身に送達する。
Ｊ．本発明のｓｉＮＡ分子の他の用途／使用
本発明のｓｉＮＡ分子は、診断用途、研究用途、および／または薬剤の製造のために使用することもできる。
１つの態様では、本発明は、被験者において疾患、形質、または状態を診断するための方法を特徴とし、本方法は、被験者における疾患、形質、または状態の診断に適した条件下で、本発明の組成物を被験者に投与することを含む。
別の実施形態では、本発明は、薬剤の製造において使用するための、本発明に従う二本鎖核酸の使用を含む。実施形態において、薬剤は、遺伝子またはタンパク質の作用、または作用の喪失によって媒介される状態の治療において使用するためのものである。
提供される実施例は、本発明のさらなる理解を補助することが意図される。使用される特定の材料、種および条件は、本発明の説明となるものであり、その妥当な範囲を限定しないことが意図される。特定の出発材料および試薬は市販されているか、あるいは化学、科学または特許文献において知られている。
本明細書において使用される略語は、以下の一覧の意味を有する（表１を参照）。以下の一覧にない略語は、他に特に規定されない限り、一般的に使用される場合のその意味を有する。
Figure 2016508724
一般的スキーム
Figure 2016508724
 一般的スキーム１を使用して、式Ｉの５’修飾ヌクレオチドを生成することができる。式中、Ａは−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−であり、Ｒ３はＨである。Ｂは、任意の複素環塩基部分（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニンなど）であり得る。これらのホスホラミダイトを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子を作製することができる。
Figure 2016508724
 一般的スキーム２を使用して、式Ｉの５’修飾ヌクレオチドを生成することができる。式中、Ａは−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−であり、Ｒ３はＯＡｃである。Ｂは、任意の複素環塩基部分（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニンなど）であり得る。これらのホスホラミダイトを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子を作製することができる。
Figure 2016508724
 一般的スキーム３を使用して、式Ｉの５’修飾ヌクレオチドを生成することができる。式中、Ａは−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−であり、Ｒ３はＯＡｃまたはＨである。Ｂは、任意の複素環塩基部分（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニンなど）であり得る。これらのホスホラミダイトを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子を作製することができる。
Figure 2016508724
 一般的スキーム４を使用して、式Ｉの５’修飾ヌクレオチドを生成することができる。式中、Ａは−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−であり、Ｒ３は−ＯＡｃ、−ＮＨＡｃまたはＦである。Ｂは、任意の複素環塩基部分（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニンなど）であり得る。これらのホスホラミダイトを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子を作製することができる。
Figure 2016508724
 一般的スキーム５を使用して、式Ｉの５’修飾ヌクレオチドを生成することができる。式中、Ａは−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−であり、Ｒ３は−ＯＣ（Ｏ）ｉＰｒ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ３またはＦである。Ｂは、任意の複素環塩基部分（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニンなど）であり得る。これらのホスホラミダイトを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子を作製することができる。
Figure 2016508724
 一般的スキーム６を使用して、式Ｉの５’修飾ヌクレオチドを生成することができる。式中、Ａは−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−であり、Ｒ３は−ＯＴＢＳ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ３またはＦである。Ｂは、任意の複素環塩基部分（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニンなど）であり得る。これらのホスホラミダイトを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子を作製することができる。
Figure 2016508724
 一般的スキーム７を使用して、式Ｉの５’修飾ヌクレオチドを生成することができる。式中、Ａは−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−であり、Ｒ３はＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ３またはＦである。Ｂは、任意の複素環塩基部分（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニンなど）であり得る。これらのホスホラミダイトを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子を作製することができる。
Figure 2016508724
 一般的スキーム８を使用して、式Ｉの５’修飾ヌクレオチドを生成することができる。式中、Ａは−Ｃ（Ｒ３）２−であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ１およびＲ１’はＨ、−ＯＭｅ、−ＯＨであるか、または一緒に＝ＣＨ２である。これらのホスホラミダイトを使用して、本発明のｓｉＮＡ分子を作製することができる。
実施例１：化合物８の合成
化合物８は、分子の第１のヌクレオチド位置（５’キャップを含む第１位；本明細書では「５’−第１位」とも呼ばれる）に「ｖｉｎｙｌＰ３ｄＴ」または「ｖｉｎｙｌＰ３ｄＴｓ」ヌクレオチドを含む一本鎖および／または二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成するために使用することができるホスホラミダイトである。ｖｉｎｙｌＰ３ｄＴおよびｖｉｎｙｌＰ３ｄＴｓの化学構造は、以下の表１４において見出すことができる。一般的に、第１位にｖｉｎｙｌＩＰ３ｄＸまたはｖｉｎｙｌＩＰ３ｄＸｓを含む一本鎖および／または二本鎖ｓｉＮＡ分子（ここで、Ｘは任意の複素環塩基部分である）を生成するために使用されるホスホラミダイトを作製するために、類似の合成手順を使用することができる。
Figure 2016508724
１．１．化合物２の調製
Figure 2016508724
 室温の無水ピリジン（３００ｍＬ）中の５−メチルウリジン（５０ｇ、１９４ｍｍｏｌ）１の溶液に、塩化４，４’−ジメチルオキシトリイル（６６．９ｇ、１９７ｍｍｏｌ）を５分間にわたって添加した。得られた混合物を室温で２時間攪拌した後、ｔ−ブチルジメチルクロロシラン（３０．３ｇ、２０１ｍｍｏｌ）を１０分間かけて添加した。得られた混合物を１２時間攪拌し、１−メチルイミダゾール（３．０９ｍＬ、３８．７ｍｍｏｌ）および過剰のｔ−ブチルジメチルクロロシリアン（ｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌｉａｎｅ）（２０．４ｇ、ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を８時間攪拌してからろ過した。ろ液を濃縮し、ＥｔＯＡＣで希釈し、塩水で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をシリカカラム（Ｈｅｘにより予め平衡化）に載せた。それをＨｅｘ中０〜４０％のＥｔＯＡｃにより溶出させて、ＤＭＴｒ−ＴＢＤＭＳ保護された５−メチルウリジン類似体２を白色の泡状物質として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ＝９．１０（ｓ，１Ｈ）；７．５０（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）；７．４９−７．４２（ｍ，２Ｈ）；７．３４−７．３０（ｍ，６Ｈ）；７．２７−７．２３（ｍ，１Ｈ）；６．９０−６．８６（ｍ，４Ｈ）；５．８９（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）；４．４２（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ）；４．２３（ｄｄ，Ｊ＝８．６，０．８Ｈｚ，１Ｈ）；４．０７−４．０３（ｍ，１Ｈ）；３．７７（ｓ，６Ｈ）；３．３６−３．２９（ｍ，２Ｈ）；３．１２（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ １Ｈ）；１．４１（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，３Ｈ）；０．９１（ｓ，９Ｈ）；０．１３（ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，６Ｈ）
１．２．化合物３の調製
Figure 2016508724
 室温の無水ＤＣＭ（１７０ｍＬ）中の化合物２（２８．１６ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（１５．２９ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、全ての固体が完全に溶解するまで攪拌した。フェニルクロロチオノカルボナート（ｐｈｅｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）（１０．１３ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）を反応混合物に５分間にわたって添加した。得られた混合物を室温で２４時間攪拌した。粗反応を減圧下で濃縮した。粗生成物を最小量のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させ、シリカカラム（Ｈｅｘにより予め平衡化）に載せた。それをＨｅｘ中０〜３０％のＥｔＯＡｃにより溶出させて、化合物３をオフホワイトの泡状物質として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．３９（ｓ，１Ｈ）；７．６８（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）；７．４６−７．４２（ｍ，４Ｈ）；７．３３−７．２９（ｍ，８Ｈ）；７．０９−７．０７（ｍ，２Ｈ）；６．８７−６．８４（ｍ，４Ｈ）；６．１５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）；６．００（ｄｄ，Ｊ＝５．０，３．４Ｈｚ，１Ｈ）；４．７４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）；４．４３−４．４１（ｍ，１Ｈ）；３．８０（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，６Ｈ）；３．５６−３．４９（ｍ，２Ｈ）；１．４５（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ）；０．９３（ｓ，９Ｈ）；０．１５（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，６Ｈ）．
１．３．化合物４の調製
Figure 2016508724
 化合物３（１８．４４ｇ、２２．７４ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（３．８８ｇ、２３．６５ｍｍｏｌ）を無水脱気トルエン（１８０ｍＬ）中に溶解させた。得られた混合物に、水素化トリ−ｎ−ブチルスズ（１１．７ｍＬ、４３．７ｍｍｏｌ）を室温で３分間にわたって添加した。得られた混合物を９５℃に１時間加熱し、室温まで冷却し、濃縮し、シリカカラムに載せた。Ｈｅｘ中０〜４０％のＥｔＯＡｃにより粗生成物を溶出させて、化合物４を白色の泡状物質として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．４４（ｓ，１Ｈ）；７．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）；７．４５−７．４２（ｍ，２Ｈ）；７．３５−７．２５（ｍ，７Ｈ）；６．８７−６．８３（ｍ，４Ｈ）；５．７６（ｄ，Ｊ＝１．５２Ｈｚ，１Ｈ）；４．５８−４．５４（ｍ，１Ｈ）；４．４７−４．４６（ｍ，１Ｈ）；３．８０（ｄ，Ｊ＝０．４Ｈｚ，６Ｈ）；３．６１（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，２．２Ｈｚ，１Ｈ）；３．３１−３．２２（ｍ，１Ｈ）；２．２４−２．１７（ｍ，１Ｈ）；１．８９−１．８４（ｍ，１Ｈ）；１．４０（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，３Ｈ）；０．９０（ｓ，９Ｈ）；０．１７（ｄ，Ｊ＝２２．０Ｈｚ，６Ｈ）．
１．４．化合物５の調製
Figure 2016508724
 無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の化合物４（４．９ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジクロロ酢酸（１．６６ｍＬ、２０．０８ｍｍｏｌ）およびドデカンチオール（１．７８１ｍＬ、７．４４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で２５分間攪拌した後、０．６Ｍの重炭酸ナトリウム溶液（３７．２ｍＬ、２２．３１ｍｍｏｌ）を添加した。水層をＤＣＭにより１回抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカカラム（Ｈｅｘにより予め平衡化）に載せた。それをＨｅｘ中０〜５０％のＥｔＯＡｃにより溶出させて、化合物５を無色の油として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．９５（ｓ，１Ｈ）；７．６１（ｓ，１Ｈ）；５．６２（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ）；４．５０−４．４７（ｍ，２Ｈ）；４．０９（ｄｄ，Ｊ＝１２．２，２．２４Ｈｚ，１Ｈ）；３．７４（ｄｄ，Ｊ＝１２．２，３．１Ｈｚ，１Ｈ）；２．１９−２．１２（ｍ，１Ｈ）；１．８９（ｓ，３Ｈ）；１．８７−１．８１（ｍ，１Ｈ）；０．８８（ｓ，９Ｈ）；０．１１（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，６Ｈ）．
１．５．化合物６ａの調製
Figure 2016508724
 ０〜５℃の無水ＤＭＳＯ（４ｍＬ）中の化合物５（２．１６ｇ、６．０７ｍｍｏｌ）およびピリジン−ＴＦＡ（０．５８６ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＣ（ＤＣＭ中１．０Ｍの溶液、１８．２２ｍＬ、１８．２２ｍｍｏｌ）を３分間にわたって添加した。得られた混合物を室温で１時間攪拌した。粗アルデヒド溶液を、さらに精製することなく以下の反応において使用した。別の反応容器で、テトラエチルメチレンジホスホナート（２．４１１ｍＬ、９．７０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解させ、０℃に冷却した後、カリウムｔ−ブトキシド（１．０Ｍ、９．１０ｍＬ）を添加し、室温で３０分間攪拌してから、０℃に冷却した。アルデヒドを含有する溶液を０℃でこの溶液に添加し、１５分間攪拌した。得られた混合物を塩水およびＥｔＯＡＣの混合物内に入れて反応停止させ、ＮＨ４ＣｌによりｐＨを約８に調整した。有機層を塩水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカカラム（Ｈｅｘにより予め平衡化）に載せた。それをＨｅｘ中０〜８０％のＥｔＯＡｃにより溶出させて、６ａを白色の泡状物質として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．８４（ｓ，１Ｈ）；７．１３（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）；６．９７（ｄｔ，Ｊ＝２２．０，４．３Ｈｚ，１Ｈ）；６．１２（ｄｔ，Ｊ＝１８．９，１．７６Ｈｚ，１Ｈ）；５．７７（ｄ，Ｊ＝０．６ＨＺ，１Ｈ）；５．０１−４．９７（ｍ，１Ｈ）；４．３９（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ）；４．１７−４．０８（ｍ，４Ｈ）；４．０９−４．０５（ｍ，１Ｈ）；２．１１−２．０６（ｍ，２Ｈ）；１．９０（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，３Ｈ）；１．８１−１．７４（ｍ，１Ｈ）；１．３７−１．３３（ｍ，６Ｈ）；０．９０（ｓ，９Ｈ）；０．１６（ｄ，Ｊ＝２１．５Ｈｚ，６Ｈ）．
１．６．化合物７の調製
Figure 2016508724
 ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の化合物６ａ（１０．３ｇ、２１．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．０Ｍ、２５．３ｍＬ、２５．３ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１時間攪拌し、減圧下で油状になるまで濃縮した。粗生成物をＣ１８カラムに載せ、水中５〜５０％のＡＣＮにより溶出させて、化合物７を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１０．６４（ｓ，１Ｈ）；７．２４（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，１Ｈ）；６．９８（ｄｔ，Ｊ＝２１．９，４．４Ｈｚ，１Ｈ）；６．１２（ｄｔ，Ｊ＝１８．８，１．６Ｈｚ，１Ｈ）；５．８５（ｓ，１Ｈ）；５．１０−５．０７（ｍ，１Ｈ）；４．４８−４．５（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ）；４．１６−４．０７（ｍ，４Ｈ）；２．３４−２．２９（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，５．６Ｈｚ，１Ｈ）；１．８７（ｓ，３Ｈ）；１．８３−１．７６（ｍ，１Ｈ）；１．３６−１．３２（ｍ，６Ｈ）．
１．７．化合物８の調製
Figure 2016508724
 ０℃のＤＣＭ（１５ｍＬ）中の化合物７（４．４９ｇ、１８．９７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６．６３ｍＬ、３７．９ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（４．２３ｍＬ、１８．９７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３０分間攪拌し、濃縮し、シアノカラムに載せた。ＴＥＡ（０．１５％）を含むＨＥＸ中０〜５０％のＥｔＯＡＣによりサンプルを溶出させ、化合物８を白色の泡状物質として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．７６（ｓ，１Ｈ）；７．１１（ｔ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ）；６．９５−６．８８（ｍ，１Ｈ）；６．１０−６．０１（ｍ，１Ｈ）；５．９６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）；４．９５−４．９２（ｍ，１Ｈ）；４．６０−４．５７（ｍ，１Ｈ）；４．１６−４．０８（ｍ，４Ｈ）；３．９４−３．７５（ｍ，２Ｈ）；３．６６−３．６０（ｍ，２Ｈ）；２．６８−２．６４（ｍ，２Ｈ）；２．４０−２．２４（ｍ，１Ｈ）；１．９１（ｄｄ，Ｊ＝２．７，１．１Ｈｚ，３Ｈ）；１．３６（ｄｔ，Ｊ＝７．２，１．６Ｈｚ，６Ｈ）；１．３３−１．１７（ｍ，１２Ｈ）．
実施例２：化合物１２の合成
化合物１２は、分子の第１のヌクレオチド位置（５’キャップを含む第１位；本明細書では「５−第１位」とも呼ばれる）に「３ｄａｒａＴ」または「３ｄａｒａＴｓ」ヌクレオチドを含む一本鎖および／または二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成するために使用することができるホスホラミダイトである。３ｄａｒａＴまたは３ｄａｒａＴｓの化学構造は、以下の表１４において見出すことができる。
２．１．化合物９の調製
Figure 2016508724
 ＴＨＦ（１０ｍｌ）中の化合物４（２．２ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中１．０ＭのＴＢＡＦ（４．０１ｍｌ、４．０１ｍｍｏｌ）を室温で入れた。バッチを１時間攪拌してから濃縮した。Ｈｅｘ中０〜９５％のＥｔＯＡＣを用いてシリカにより粗生成物を精製して、化合物９を無色の油として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ＝７．４７−７．４３（ｍ，３Ｈ），７．３４−７．２９（ｍ，６Ｈ），７．２６−７．２２（ｍ，１Ｈ），６．８９−６．８５（ｍ，４Ｈ），５．７０（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４８−４．４３（ｍ，１Ｈ），４．３９−４．３６（ｍ，１Ｈ），３．３４−３．２４（ｍ，２Ｈ），２．２３−２．１５（ｍ，２Ｈ），１．４６（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，３Ｈ）．
２．２．化合物１０の調製
Figure 2016508724
 ２ｍｌのＤＭＦ中の化合物９（４５５ｍｇ、０．８３５ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸ジフェニル（１９７ｍｇ、０．９１９ｍｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（２．１１ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を室温で入れた。それを、全ての固体が溶解するまで攪拌した。バッチを１００℃で１時間加熱してから、ＥｔＯＡｃおよび塩水の混合物に対して反応停止させた。水層をＥｔＯＡＣで２回逆抽出した。合わせた有機物を油状になるまで濃縮し、Ｈｅｘ中０〜１００％のアセトンを用いてシリカにより精製して、化合物１０を白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ＝７．４４−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．３５−７．３３（ｍ，２Ｈ），７．２８−７．１７（ｍ，７Ｈ），６．８２−６．７９（ｍ，４Ｈ），６．０８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４０（ｍ，１Ｈ），４．６０−４．５４（ｍ，１Ｈ），２．９６−２．７７（ｍ，２Ｈ），２．５２−２．４４（ｍ，１Ｈ），２．２２−２．１７（ｍ，１Ｈ），１．８３（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，３Ｈ）．
２．３．化合物１１の調製
Figure 2016508724
 １ｍｌのエタノール中の化合物１０（４１０ｍｇ、０．７７９ｍｍｏｌ）に、１．０ＭのＮａＯＨ溶液（２．３４ｍｌ、２．３４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間攪拌し、酢酸（０．０８０ｍｌ、１．４ｍｍｏｌ）により反応停止させた。粗生成物をＣ１８カラムに直接載せ、水中０〜７５％のＭｅＣＮにより精製して、化合物１１を白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ＝９．２７（ｓ，１Ｈ）７．４８−７．４５（ｍ，３Ｈ），７．３４−７．２９（ｍ，６Ｈ），７．２６−７．２１（ｍ，１Ｈ），６．８９−６．８５（ｍ，４Ｈ），５．９４（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２１−４．１５（ｍ，１Ｈ），３．３３−３．２５（ｍ，２Ｈ），２．２７−２．３０（ｍ，２Ｈ），１．６５（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，３Ｈ）
２．４．化合物１２の調製
Figure 2016508724
 ２ｍｌのＤＣＭ中の化合物１１（３７９ｍｇ、０．６９６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．４８６ｍｌ、２．７８ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．３１０ｍｌ、１．３９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で４０分間攪拌し、Ｈｅｘ（０．１５％Ｅｔ３Ｎ）中０〜８５％のＥｔＯＡＣを用いてシアノカラムによって精製して、化合物１２を白色の泡状物質として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ＝９．００（ｓ，１Ｈ）７．４８−７．４５（ｍ，２Ｈ），７．３７−７．２９（ｍ，７Ｈ），７．２６−７．２２（ｍ，１Ｈ），６．８８−６．８５（ｍ，４Ｈ），６．０５，６．０２（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．６２−４．５５（ｍ，１Ｈ），４．２８−４．１９（ｍ，１Ｈ），３．６７−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．４８−３．３９（ｍ，２Ｈ），３．３５−３．２６（ｍ，２Ｈ），２．５９，２．４２（ｍ，２Ｈ），２．５６−２．２７（ｍ，１Ｈ），２．０７−１．９６（ｍ，１Ｈ），１．６６，１．６４（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，３Ｈ），１．１１−０．９３（ｍ，１２Ｈ）
実施例３：化合物１４の合成
化合物１４は、分子の第１のヌクレオチド位置（５’キャップを含む第１位；本明細書では「５−第１位」とも呼ばれる）に「３ｒＴ」または「３ｒＴｓ」ヌクレオチドを含む一本鎖および／または二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成するために使用することができるホスホラミダイト前駆体である。３ｒＴまたは３ｒＴｓの化学構造は、以下の表１４において見出すことができる。一般的に、第１位に３ｒＸまたは３ｒＸｓを含む一本鎖および／または二本鎖ｓｉＮＡ分子（ここで、Ｘは任意の複素環塩基部分である）を生成するために使用されるホスホラミダイトを作製するために、同じ合成手順を使用することができる。
３．１．化合物２ａの調製
Figure 2016508724
 室温の無水ピリジン（３０ｍｌ）中の１−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン１３（４．００ｇ、７．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＳＣｌ（１．１３ｇ、７．４９ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１．２１ｇ、１７．８４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１８時間攪拌した。次に、それを減圧下で濃縮した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）、飽和クエン酸ナトリウム一塩基水溶液（２０ｍｌ）および水（１０ｍｌ）を添加した。層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（５ｍｌ×２）で抽出した。合わせた有機溶液を塩水（５ｍｌ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、濃縮した。粗生成物を最小量のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させ、シリカカラム（１２０ｇ、Ｈｅｘにより予め平衡化）に載せた。それをＨｅｘ中０〜２５％のＥｔＯＡｃにより溶出させて、２’−ＯＴＢＳ生成物２が得られ、Ｈｅｘ中４０％までのＥｔＯＡｃによりさらに溶出させて、３’−ＯＴＢＳ生成物２ａが得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９７（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．２５（ｍ，９Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，４Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ），４．３８（ｍ，１Ｈ），４．２７（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），３．５４（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ），２．７９（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ），１．４８（ｓ，３Ｈ），０．８６（ｓ，９Ｈ），０．０６（ｓ，３Ｈ），−０．０３（ｓ，３Ｈ）．
３．２．化合物１４の調製
Figure 2016508724
 ０℃のＤＣＭ（１５ｍｌ）中の３’−ＯＴＢＳ−５’−ＯＤＭＴｒ−５−メチルウリジン２ａ（１．３０ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラゾール（５４ｍｇ、０．７７１ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（０．７９５ｍｌ、２．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温まで温め、６０時間攪拌した。次に、ＤＣＭ（３０ｍｌ）および飽和ＮａＨＣＯ３水（２０ｍｌ）を添加した。層を分離させ、水層をＤＣＭ（２×１０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機物を乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、濃縮し、カラムクロマトグラフィ（０〜３５％のＥｔＯＡｃにより溶出）によって精製し、アミダイト１４を固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１８（ｓ，１Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ），７．４２−７．２４（ｍ，９Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，４Ｈ），６．１７（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ），４．２８（ｍ，２Ｈ），４．０９（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），３．７７（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ），２．６０（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｓ，３Ｈ），１．１６−１．１４（ｍ，１２Ｈ），０．８０（ｓ，９Ｈ），０．０７（ｓ，３Ｈ），−０．０３（ｓ，３Ｈ）．
実施例４：化合物１６の合成
化合物１６は、分子の第１のヌクレオチド位置（５’キャップを含む第１位；本明細書では「５−第１位」とも呼ばれる）に「３ｆｌｕＵ」または「３ｆｌｕＵｓ」ヌクレオチドを含む一本鎖および／または二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成するために使用することができるホスホラミダイト前駆体である。３ｆｌｕＵまたは３ｆｌｕＵｓの化学構造は、以下の表１３において見出すことができる。一般的に、第１位に３ｆｌｕＸまたは３ｆｌｕＸｓを含む一本鎖および／または二本鎖ｓｉＮＡ分子（ここで、Ｘは任意の複素環塩基部分である）を生成するために使用されるホスホラミダイトを作製するために、同じ合成手順を使用することができる。
Figure 2016508724
室温の無水脱気ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の１−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−４−フルオロ−３−ヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン１５（０．７８ｇ、１．４２２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５５１ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．６７３ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で３０分間攪拌した。次に、それを減圧下で濃縮した。粗生成物を最小量のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させ、シリカカラム（４０ｇ、Ｈｅｘにより予め平衡化）に載せた。それをＨｅｘ中０〜６０％のＥｔＯＡｃにより溶出させて、アミダイト１６を白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ１．０８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１．１９−１．１８（ｍ，９Ｈ）；２．６２（ｄｔ，Ｊ＝２４．１，６．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．３３（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，３．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．０，７．３，３．３Ｈｚ，１Ｈ）；３．６３−３．６２（ｍ，２Ｈ）；３．７４（ｄｔ，Ｊ＝８．１，６．１Ｈｚ，１Ｈ）；３．７８（ｓ，６Ｈ）；３．８３−３．８２（ｍ，１Ｈ）；４．３１−４．２８，４．３８−４．３５（ｍ，１Ｈ）；１４．６１−４．６０（ｍ，１Ｈ）；５．０９−５．０７，５．２２−５．２０（ｍ，１Ｈ）；１５．４１（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；６．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ）；６．８９−６．８８（ｍ，４Ｈ）；７．３１−７．３０（ｍ，７Ｈ）；７．４１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）；７．５５（ｄｄ，Ｊ＝８．２，４．７Ｈｚ，１Ｈ）；９．０２（ｓ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ１５１．８，１５１．９．
実施例５：オリゴヌクレオチド合成：一般的なプロトコル
２本の相補的なオリゴヌクレオチドセンスおよびアンチセンス鎖を個々に合成することにより、オリゴヌクレオチド二本鎖を調製した。標的配列の各二本鎖の相補鎖は、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）などの固体担体において合成した。各鎖を固体担体から切断し、全てのオリゴヌクレオチド保護基を脱保護した後、逆相（Ｃ１８）またはイオン交換（ＳＡＸ）樹脂によるクロマトグラフィで各鎖を精製した。精製の後、各センス鎖をその対応するアンチセンス鎖とアニールして、凍結乾燥させた。
各センスおよびアンチセンス鎖の合成は、市販の自動オリゴシンセサイザーを用いて、コントロールドポアガラスなどの固体担体において達成した。所望の配列の第１の（３’）ヌクレオチド単位が予め装填された固体担体を入手し、オリゴシンセサイザー用の適切なカラムに入れた。第１のヌクレオチドは、コハク酸結合によって固体担体に連結され、５’末端ヒドロキシル基において適切な酸感受性保護基（例えば、トリチル、ジメトキシトリチル）を含有した。固相のオリゴ合成（ｏｌｉｇｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、当該技術分野において一般的に知られている合成手順を使用した。所望のオリゴマー配列の伸長は４段階のサイクルを経た：１）５’−トリチル保護基の酸性脱保護；２）Ｓ−エチル−テトラゾールなどの活性化剤の存在下、５’−トリチル（またはジメトキシトリチル）保護ホスホラミダイトとしての次のヌクレオチド単位のカップリング；３）ヨウ素などの酸化剤によるＰ（ＩＩＩ）亜リン酸トリエステルのＰ（Ｖ）リン酸トリエステルへの酸化；および４）無水酢酸などのアシル化剤を用いたエステル化による、残存している任意の未反応アルコール基のキャップ形成。使用したホスホラミダイトは、天然に存在するヌクレオチド単位に由来するか、あるいはこれらのヌクレオチドの化学修飾型に由来した。通常、全てのホスホラミダイトは、アセトニトリル（または他の適切な溶媒もしくは溶媒混合物（アセトニトリルと一定の割合のジメチルホルムアミドなど））の溶液中で調製した。ホスホラミダイトのカップリングのための活性化剤は、通常、アセトニトリル中に溶解させた。ヨウ素などの酸化剤は、適切な溶媒混合物（例えば、アセトニトリル、ピリジンおよび水など）中に溶解させた。ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸などの酸性脱トリチル化試薬は、トルエンまたはジクロロメタンなどの適切な溶媒中に溶解させた。アシル化キャッピング試薬は、例えば、アセトニトリル中の無水酢酸、２，６−ルチジンおよびＮ−メチル−イミダゾールの混合物であった。亜リン酸トリエステルからリン酸トリエステルへの酸化の代わりに、Ｐ（ＩＩＩ）中間体は、アセトニトリルおよびピリジンの混合物などの適切な溶媒中、フェニル−アセチル−ジスルフィドなどの硫化試薬により、ホスホロチオアート類似体へ転換されてもよい。オリゴヌクレオチド伸長の各ステップの間に、アセトニトリル（または別の適切な溶媒）を使用して、過剰な試薬を除去し、固体担体を洗浄した。
オリゴヌクレオチド合成サイクルは、最後（５’）のヌクレオチド単位が延長したオリゴマーに導入されるまで続けた。最終サイクルの後、５’−トリチル保護基は、固体担体上にある間に、オリゴヌクレオチドから除去されてもされなくてもよい。いくつかの場合には、酸性溶液による処理によって５’末端トリチルを最初に除去した。この脱保護の後、オリゴヌクレオチドを担体から切断し、リン酸におけるシアノエチル保護基を除去し、ヌクレオチド塩基におけるアシル保護基を脱保護するために、メチルアミン水（室温または穏やかに加熱して）などの適切な塩基で固体担体を処理した。次に、これらのオリゴヌクレオチドの精製は、ＳＡＸクロマトグラフィにより達成され得る。通常、オリゴヌクレオチドは、塩化ナトリウムなどの無機塩のグラジエントによりＳＡＸ樹脂から溶出させた。透析または接線流ろ過によって精製サンプルから塩を除去した。次に、脱塩した材料を凍結乾燥するか、あるいは対応する相補鎖と直接アニールした。あるいは、塩を除去する前に精製一本鎖をアニールし、次いで二本鎖を形成した後に透析した。
他の場合には、固体担体からの塩基性切断およびオリゴヌクレオチド保護基の脱保護の間、５’−トリチル保護基をオリゴヌクレオチド上に残した。この場合、オリゴヌクレオチドは、Ｃ１８などの逆相樹脂を用いて精製した。トリチル基の存在により、所望の全長オリゴヌクレオチドが樹脂上に保持されるが、キャッピング反応中にアシル化された所望されない切断型生成物は樹脂から洗浄されることが可能になった。これらの所望されないオリゴヌクレオチドは、より低い割合のアセトニトリルなどの有機溶媒を用いて樹脂から除去した。この失敗生成物の除去の後、Ｃ１８樹脂上にある間に、酸性処理（トリフルオロ酢酸水）によりトリチル基を除去した。塩交換、および水による樹脂の徹底的な洗浄の後、より高い割合の水中の有機溶媒を用いて所望の脱保護された生成物を溶出させた。次に、これらの精製オリゴヌクレオチドを凍結乾燥させるか、あるいは対応する相補鎖と直接アニールした。
オリゴヌクレオチドが任意のリボース（２’−ヒドロキシル）ヌクレオチドを含有している場合には、シリル２’−ヒドロキシル保護基を除去するために修飾手順が必要とされた。水性塩基によりオリゴヌクレオチドを固体担体から切断した後、ＤＭＳＯなどの適切な溶媒を用いてカラムをさらに洗浄して、カラムに残存する任意の材料を除去した。オリゴヌクレオチドの塩基性脱保護の後、反応混合物を次に適切なフッ化物試薬（例えば、トリエチルアミン−フッ化水素など）で処理し、シリルエーテルを全て切断し、所望のアルコールを露出させた。シリル脱保護が完了したら、精製（ＳＡＸまたはＣ１８のいずれかによる）の前に、溶液を中和するために適切な緩衝液を各サンプルに添加した。
ある場合には、５’−リン酸−３’−ホスホラミダイトをオリゴヌクレオチドの５’末端にカップリングさせた。この取込みのための酸化試薬は、ヨウ素ではなくｔ−ブチルヒドロペルオキシドであった。オリゴヌクレオチドが５’−リン酸部分を含有する場合、オリゴヌクレオチドがまだ固体担体上にある間に、ピリジン／アセトニトリル中のヨードトリメチルシランなどの適切な試薬を用いてメチル（またはエチル）リン酸エステルを脱保護した。アセトニトリルで担体を洗浄した後、トリエチルアミン／アセトニトリル中のβ−メルカプトエタノールによりオリゴヌクレオチドを処理した。アセトニトリルによるさらなる洗浄の後、オリゴヌクレオチド生成物を固体担体から切断し、メチルアミン水溶液により完全に脱保護した。ＳＡＸまたはＣ１８クロマトグラフィのいずれかにより５’−ホスホン酸オリゴヌクレオチドを精製した。
逆相ＨＰＬＣ、ＳＡＸ ＨＰＬＣおよびキャピラリーゲル電気泳動を含む適切な方法によって、各精製オリゴヌクレオチドを純度について分析した。オリゴヌクレオチドの同一性は、ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩなどのイオン化技術を用いる質量分析により確認した。各オリゴヌクレオチドの収率は、理論的に誘導される吸光係数を用いるＵＶ（２６０ｎｍ）によって評価した。
対応するセンスおよびアンチセンス鎖は、等モル量の各材料を混合することによりアニールした。各鎖の適切な量は、ＵＶ（２６０ｎｍ）測定および理論的な吸光係数によって近似した。アニールプロセスの後、ＲＰ−ＨＰＬＣまたはＳＡＸなどの適切なクロマトグラフ法により、二本鎖形成の程度、および任意の過剰な一本鎖材料の存在を評価した。適切な場合には、残存する過剰な一本鎖を完全にアニールするために、２つの鎖の一方を付加的な量で用いてサンプルを調整した。最終の二本鎖材料は、さらなる生化学的または生物学的試験のための送達の前に凍結乾燥した。
実施例６：５’−第１位に修飾を含有する一本鎖ｓｉＮＡ分子
表２は、実施例２〜５に提供されるプロトコルを用いて合成された種々の化学修飾一本鎖ｓｉＮＡ分子を示す。表２の一本鎖ｓｉＮＡ分子は２１ヌクレオチド（第１位（５’）〜第２１位（３’））で構成され、ヌクレオチド位置１には差別的な修飾を含有する。各ｓｉＮＡ分子の名称は第１列に提供され、第１位のヌクレオチドの組成に対応する。表２のｓｉＮＡ分子に命名された「ｓｉＮＡ名」は、他の表および図面において、その特定のｓｉＮＡ分子を表すために使用される。第２列（「５’−第１位ヌクレオチド」）は、５’キャップの付いたヌクレオチドを含む、各ｓｉＮＡ分子の第１位を記述する。５’−第１位のヌクレオチドのそれぞれの化学構造は以下の表１４に提供される。例えば、ベンチマーク（「ＢＭ」）ｓｉＮＡ分子の５’−第１位のヌクレオチド「ｐ−ｏｍｅＵ」は、糖の２’位置のＯ−メチル基と、天然５’リン酸キャップとを有する化学修飾ウラシルヌクレオチドを含む。ｓｉＮＡ分子のそれぞれの第２〜２０位にわたるヌクレオチド配列は表２の第３列に記載されており、個々のヌクレオチドはセミコロンによって隔てられている。第３列に示される各ヌクレオチドの化学構造は以下の表１５に提供される。例えば、ＢＭｓｉＮＡ分子の第２位に位置するヌクレオチドの化学構造「ｆｌｕ」は、糖の２’位置にフルオロ基を有する化学修飾ウラシルヌクレオチドである。表２のｓｉＮＡ分子のそれぞれのヌクレオチド位置２〜２０の配列は同一である（すなわち、「第３列の（同上）」）。表２の第４列の「ヌクレオチド位置２１−３’」は、表２のｓｉＮＡ分子の最３’ヌクレオチドがそれぞれ「ｏｍｅＵＳｕｐ」で表されることを表す。ｏｍｅＵＳｕｐの構造は、表１６に提供される。表２の各ｓｉＮＡ分子（ヌクレオチド位置１−２１）の配列番号は第５列に提供される。
Figure 2016508724
インビトロアッセイターゲティングＣＴＮＮＢ１（９６−ウェルプレートトランスフェクション）−
細胞培養物の調製：
１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１％ピルビン酸ナトリウムが補充されたダルベッコ変法イーグル培地中で、マウスヘパトーマ細胞株Ｈｅｐａ１−６を成長させた。
トランスフェクションおよびスクリーニング：
１００μＬの完全培地中３５００細胞／ウェルの最終カウントで組織培養処理された９６ウェルプレート全てのウェルに細胞をプレーティングした。５％ＣＯ２の存在下３７℃においてプレーティングの後細胞を一晩培養した。
翌日、ｓｉＮＡおよびリポフェクタミンＴＭ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する複合体を以下のように作製した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中に３３倍に希釈したＲＮＡｉＭａｘの溶液を調製した。並行して、試験用のｓｉＮＡの溶液をＯＰＴＩ−ＭＥＭ中１２０ｎＭの最終濃度に調製した。ＲＮＡｉＭａｘ／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液の室温で５分間のインキュベーションの後、ｓｉＮＡのそれぞれについて、等容積のｓｉＮＡ溶液およびＲＮＡｉＭａｘ溶液を一緒に添加した。
混合により、ｓｉＮＡ／ＲＮＡｉＭａｘの溶液が得られた。ここで、ｓｉＮＡの濃度は６０ｎＭであった。この溶液を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションの後、２０μｌの溶液を関連のウェルのそれぞれに添加した。各ウェル内のｓｉＮＡの最終濃度は１０ｎＭであり、各ウェル内のＲＮＡｉＭａｘの最終容積は０．４５μＬであった。
低濃度のスクリーニングのために、ウェルにつき１０００、１００または１０ｐＭでｓｉＮＡをトランスフェクトした。１２ポイント用量反応曲線研究のために、ｓｉＮＡシリーズは、３０ｎＭから始まる６倍連続希釈、または４０ｎＭから始まる４倍連続希釈であった。全てのトランスフェクションは、複数の生物学的複写物として設定した。
ＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡ複合体とのインキュベーションの時間は２４時間であり、トランスフェクションと、スクリーニングおよび用量反応曲線研究のための収集との間で、培地の変化はなかった。
Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔおよび逆転写反応：
所望の時点で、培地を吸引し、培養プレートのウェルから廃棄した。トランスフェクト細胞をウェルあたり１００μＬのＤＰＢＳ溶液で１回洗浄した。デオキシリボヌクレアーゼＩを補充したＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴＴＭ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号４３９９００２）からの溶解溶液をウェルあたり５０マイクロリットルでプレートに直接添加し、細胞を溶解させた。５分後に、ウェルあたり５マイクロリットルの同じキットからの停止溶液をプレートに添加した。溶解プレートを室温で少なくとも２分間インキュベートした。プレートは、４℃で２時間、または−８０℃で２か月間保存することができる。
逆転写プレートの各ウェルは、１０μＬの２Ｘ逆転写酵素緩衝液、１μＬの２０Ｘ逆転写酵素および２μＬのヌクレアーゼを含まない水を必要とした。２Ｘ逆転写緩衝液、２０Ｘ逆転写酵素ミックス、およびヌクレアーゼを含まない水と混合することによって、逆転写マスターミックスを調製した。１３μＬの逆転写マスターミックスを逆転写プレート（セミスカート付）の各ウェル内に分注した。各細胞プレートに対して別の逆転写プレートを調製した。上記の細胞溶解手順からのライセートをそれぞれ数マイクロリットル、逆転写プレートの各ウェルに添加した。プレートを密封し、遠心機で回転させ（１０００ｒｐｍで３０秒間）、逆転写プレートの底に内容物を沈降させた。プレートをサーモサイクラーに入れ、３７℃で６０分間、９５℃で５分間、およびプレートをサーモサイクラーから取り出すまで４℃にした。取り出したら、すぐに使用しない場合には、プレートを−２０℃で凍結させた。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）：
一連のプローブおよびプライマーを用いて、ＣＴＮＮＢ１およびＧＡＰＤＨの遺伝子の種々のｍＲＮＡ転写物を検出した。本明細書に記載される実験のためのＴａｑｍａｎプローブおよびプライマーは全て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により事前に検証されたセットとして提供された（表３を参照）。
Figure 2016508724
アッセイは、ＡＢＩ ７９００ＨＴ機器において製造業者の使用説明書に従って実施した。ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｃｅｌｌｓ−ｔｏＣＴＴＭ Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号４３９９００２で提供される）を使用した。ＰＣＲ反応は、５０℃で２分間、９５℃で２０秒間行った後、９５℃で１分間および６０℃で２０秒間を４０サイクル行った。
各実験において、増幅曲線の対数期にベースラインを設定し、ベースラインと増幅曲線との交差点に基づいて、機器によってＣｔ値が割り当てられた。
計算：
対象となる遺伝子の発現レベルおよび遺伝子発現の阻害％（％ＫＤ）を、比較Ｃｔ法を用いて計算した：
ΔＣｔ＝ＣｔＴａｒｇｅｔ−ＣｔＧＡＰＤＨ
ΔΔＣｔ（ｌｏｇ２（倍率変化））＝ΔＣｔ（Ｔａｒｇｅｔ ｓｉＮＡ）−ΔＣｔ（ＮＴＣ）
相対発現レベル＝２−ΔΔＣｔ
％ＫＤ＝１００×（１−２−ΔΔＣｔ）。
非ターゲティング対照ｓｉＮＡは、最も関連のある対照であるため、他に記載されない限り、対照値として選択し、その値に対して遺伝子発現の阻害（ノックダウン）パーセントを計算した。
さらに、細胞の一般的な健康状態およびＲＮＡ抽出の質を反映する規格化データのみを調査した。これは、処置細胞内の２つの異なるｍＲＮＡ（第１は標的ｍＲＮＡであり、第２は規格化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ）ｍＲＮＡである）のレベルを見ることによって行った。これにより、対象となる遺伝子を単にノックダウンするのではなく、細胞に対して恐らく毒性であり得るｓｉＮＡの排除が可能になった。これは、各ウェル内のＧＡＰＤＨのＣｔを、プレート全体のＧＡＰＤＨのＣｔに対して比較することによって行った。
ＩＣ５０の計算は全て、Ｒ．２．９．２ソフトウェアを用いて実施した。単純なリガンド結合のためのＳ字形用量−反応（可変スロープ）式を用いてデータを分析した。阻害（ノックダウン）パーセントの計算の全てにおいて、計算は、他に記載されない限り．非ターゲティング対照（Ｃｔｒｌ ｓｉＲＮＡ）で処理したサンプルにおける対象となる遺伝子の発現の規格化レベルに対して行った。
結果
表２の一本鎖ｓｉＮＡ分子のサブセットを、ＲＮＡｉＭａｘがトランスフェクトされたＨｅｐａ１−６細胞においてスクリーニングした。表４および図１Ａは、ＢＭ（ベンチマーク）、ＢＭｓ、ｄＴ、およびｄＴｓなどの通常の３’−５’連結一本鎖ｓｉＮＡ分子と、３ｄＸおよび３ｄＸｓ（ここで、ＸはＴ、Ａ、ＣまたはＧである）などの新しい２’−５連結一本鎖ｓｉＮＡ分子のノックダウン活性を要約する。ｓｉＮＡ名における「ｓ」の指定は、分子のヌクレオチド位置１および２の間のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を示す。ｓｉＮＡ名における「ｄ」の指定は、分子のヌクレオチド位置１におけるデオキシ修飾を示す（例えば、ｄＴ ｓｉＮＡは、ヌクレオチド位置１における糖の２番目の炭素位置のデオキシ修飾と、ヌクレオチド位置１および２の間の３’−５’ホスホジエステルヌクレオチド間結合とを有する；３ｄＴ ｓｉＮＡは、ヌクレオチド位置１の糖の３番目の炭素位置に２Ｈと、ヌクレオチド位置１および２の間の２’−５’ホスホジエステルヌクレオチド間結合とを有する）。
２’−５’連結３ｄＸおよび３ｄＸｓ ｓｉＮＡ分子はそれぞれ、このアッセイにおいてノックダウンを示した。特に、２’−５’連結３ｄＴおよび３ｄＴｓ ｓｉＮＡ分子は、４つの濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭ）の全てにおいて、３’−５’連結ＢＭ、ＢＭｓ、ｄＴ、およびｄＴｓよりも高いノックダウン活性を示した。２’−５’連結一本鎖ｓｉＮＡ分子の中で、４つの濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭ）の全てにおいて、ＸがＡ、ＣまたはＧである場合に、３ｄＴおよび３ｄＴｓは、他の３ｄＸおよび３ｄＸｓよりもよりも高いノックダウン活性を示した。３ｄＡ、３ｄＡｓ、３ｄＣおよび３ｄＣｓ ｓｉＮＡ分子は、ベンチマーク分子よりもわずかに良好であるか、あるいはそれと同等であるノックダウン活性を表した。
Figure 2016508724
表５および図１Ｂは、第１位のヌクレオチドに種々の構造変化を有する２’−５’連結一本鎖ｓｉＮＡ分子の活性を比較する、表２に示されるｓｉＮＡ分子の別のサブセットのノックダウン活性を要約する。２’−５’連結一本鎖ｓｉＮＡ分子のそれぞれは、アッセイにおいてノックダウン活性を表した。特に、３ｄＴおよび３ｄＴｓ ｓｉＮＡ分子は、４つの濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭ）の全てにおいて、３ｐｒｉｏｍｅＵ、３ｐｒｉｏｍｅＵｓ、３ｆｌｕＵ、３ｆｌｕＵｓ、３ｄａｒａＴ、３ｄａｒａＴｓ、３ｒＴ、および３ｒＴｓよりも高いノックダウン活性を示した。
Figure 2016508724
表２の一本鎖ｓｉＮＡ分子のサブセットを、１２ポイント用量反応曲線についてさらにアッセイした。表６は、一本鎖ｓｉＮＡ分子のノックダウン活性を要約する。３ｄＴおよび３ｄＴｓは、ＢＭ、ＢＭｓ、ｄＴ、ｄＴｓ、ｖｉｎｙｌＰｍｏｅＴｓ、ｖｉｎｙｌＰ３ｄＴ、およびｖｉｎｙｌＰ３ｄＴｓなどの他の一本鎖ｓｉＮＡ分子よりも低いＩＣ５０値（第２列）および高い最大ノックダウン活性（第３列）を示した。
Figure 2016508724
実施例７：内部３ｄＸヌクレオチド修飾を含有する一本鎖ｓｉＮＡ分子
表７の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（第１位（５’）〜第２１位（３’））で構成され、各分子は単一の３ｄＸヌクレオチドを含有し、ここで、Ｘは、異なるヌクレオチド位置にある塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧである。各ｓｉＮＡ分子の名称は第１列に提供され、３ｄＸヌクレオチドを含有するヌクレオチド位置およびその位置で使用された塩基に対応する（例えば、「２（Ｔ）」は、第２位の３ｄＴヌクレオチドを示す）。表７のｓｉＮＡ分子に命名された「ｓｉＮＡ名」は、他の表および図面において、その特定のｓｉＮＡ分子を表すために使用される。表７の第２列「５’−第１位ヌクレオチド」は、表７のｓｉＮＡ分子の最５’ヌクレオチドを表し、それぞれ「ｐ−ｏｍｅＵ」で表される（ｐ−ｏｍｅＵの構造については以下の表１４を参照）。ｓｉＮＡ分子のそれぞれの第２〜２０位にわたるヌクレオチド配列は表７の第３列に記載されており、個々のヌクレオチドは、セミコロンによって隔てられている。第３列に示される各ヌクレオチドの化学構造は以下の表１５に提供される。第３列の３ｄＸヌクレオチドには下線が引かれている。表７の第４列の「ヌクレオチド位置２１−３’」は表７のｓｉＮＡ分子の最３’ヌクレオチドを表し、それぞれ、「ｏｍｅＵＳｕｐ」によって表される（ｏｍｅＵＳｕｐの構造については以下の表１６を参照）。表７の各ｓｉＮＡ分子（第１〜２１位）の配列番号は第５列に提供される。
Figure 2016508724
結果
表７の一本鎖ｓｉＮＡ分子を、実施例６と同様に、ＲＮＡｉＭａｘがトランスフェクトされたＨｅｐａ１〜６細胞においてスクリーニングした。表８および図２Ａは、内部３ｄＸヌクレオチド修飾を含有するこれらの一本鎖ｓｉＮＡ分子のノックダウン活性を要約する。試験した一本鎖ｓｉＮＡ分子のそれぞれは、アッセイにおいてノックダウン活性を表した。特に、３ｄＴ ｓｉＮＡ分子は、４つの濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭ）の全てにおいて、内部３ｄＸ（ここで、Ｘは塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧである）を有する他の一本鎖ｓｉＮＡ分子よりも高いノックダウン活性を示した。
Figure 2016508724
実施例８：第１位の３ｄＴ関連ヌクレオチドと複数のホスホロチオアートヌクレオチド間結合とを含有する一本鎖ｓｉＮＡ分子
表９は、実施例５に提供されるプロトコルを用いて合成された種々の化学修飾一本鎖ｓｉＮＡ分子を示す。表９の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（第１位（５’）〜第２１位（３’））で構成され、それぞれ、第１位の単一の３ｄＴまたは３ｄＴｓヌクレオチドと、複数のホスホロチオアートヌクレオチド間結合とを含有する。３ｄＴｓヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結基を含有する。各ｓｉＮＡ分子の名称は第１列に提供され、ｓｉＮＡ分子内に含有されるホスホロチオアートヌクレオチド間結合の数に対応する（例えば、「１４Ｓ」ｓｉＮＡ分子は１４のホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含有する）。表９のｓｉＮＡ分子に命名された「ｓｉＮＡ名」は、他の表および図面において、その特定のｓｉＮＡ分子を表すために使用される。表９の第２列「５’−第１位ヌクレオチド」は、表９のｓｉＮＡ分子の最５’ヌクレオチドを表し、それぞれ、「ｐ−３ｄＴ」または「ｐ−３ｄＴｓ」のいずれかで表される（構造については以下の表１４を参照）。ｓｉＮＡ分子のそれぞれの第２〜２０位にわたるヌクレオチド配列は表９の第３列に記載されており、個々のヌクレオチドは、セミコロンによって隔てられている。第３列に示される各ヌクレオチドの化学構造は以下の表１５に提供される。ホスホロチオアートヌクレオチド間連結基は「ｓ」と共に示されており、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合のヌクレオチド位置は第４列に示される。表９の第５列の「ヌクレオチド位置２１−３’」は表９のｓｉＮＡ分子の最３’ヌクレオチドを表し、それぞれ、「ｏｍｅＵＳｕｐ」によって表される。（構造については以下の表１６を参照）。表９の各ｓｉＮＡ分子（第１〜２１位）の配列番号は第６列に提供される。
Figure 2016508724
結果
表９の一本鎖ｓｉＮＡ分子を、実施例６と同様に、ＲＮＡｉＭａｘがトランスフェクトされたＨｅｐａ１〜６細胞においてスクリーニングした。表１０および図２Ｂは、複数のホスホロチオアート取込みおよび第１位の２’−５’結合を含有するこれらの一本鎖ｓｉＮＡ分子のノックダウン活性を要約する。一本鎖ｓｉＮＡ分子のそれぞれは、アッセイにおいて、ベンチマークｓｉＮＡ分子（ＢＭ、ＢＭｓ）と同等またはそれよりも良好であるノックダウン活性を表した。特に、３ｄＴおよび３ｄＴｓ ｓｉＮＡ分子は、４つの濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭ）の全てにおいて、複数のホスホロチオアート取込みを有する任意の他の一本鎖ｓｉＮＡ分子よりも高いノックダウン活性を示した。
Figure 2016508724
実施例９：５’−第１位に修飾を含有する二本鎖ｓｉＮＡ分子
表１１は、実施例１および５に提供されるプロトコルを用いて合成された種々の化学修飾二本鎖ｓｉＮＡ分子を示す。表１１の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、センス鎖（パッセンジャー鎖としても知られている）およびアンチセンス鎖（ガイド鎖としても知られている）を含有し、各鎖は２１ヌクレオチド（第１位（５’）〜第２位（３’））で構成され、第１位に差別的な修飾を含有する。各ｓｉＮＡ分子の名称は第１列に提供され、二本鎖のセンスおよび／またはアンチセンス鎖の第１位のヌクレオチドの組成に対応する。表１１の第２列の「鎖」は、特定の配列が二本鎖のセンス（Ｓ）であるかアンチセンス（Ａ／Ｓ）鎖であるかを示す。表１１の第３列の「５−第１位ヌクレオチド」は、表１１の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の第１位を記述し、それぞれ、５’キャップの付いたヌクレオチドで構成される。５’−第１位のヌクレオチドのそれぞれの化学構造は以下の表１４に提供される。二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖のそれぞれの第２〜２０位にわたるヌクレオチド配列は表１１の第４列に記載されており、個々のヌクレオチドは、セミコロンによって隔てられている。第４列に示される各ヌクレオチドの化学構造は以下の表１５に提供される。表１１の第５列の「ヌクレオチド位置２１−３’」は二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンスまたはアンチセンス鎖の最３’ヌクレオチドを表し、それぞれ、「ｏｍｅＵ―ｉＢＳｕｐ」または「ｏｍｅＵＳｕｐ」によって表される（構造については以下の表１６を参照）。表１１の二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖（第１〜２１位）の配列番号は第６列に提供される。表１１の各ｓｉＮＡ分子は、分子の両末端に３’オーバーハングを有する。
Figure 2016508724
結果
表１１の二本鎖ｓｉＮＡ分子を、実施例６に記載されるように１２ポイント用量反応曲線についてインビトロでアッセイした。表１２は、二本鎖ｓｉＮＡ分子のノックダウン活性を要約する。ｄｓ ３ｄＴｓ、ｄｓ ＴＧＮ ｖｉｎｙｌＰ３ｄＴ、およびｄｓ ＴＧＮ ｖｉｎｙｌＰ３ｄＴｓなどのアンチセンス鎖の第１位に２’−５’連結ヌクレオチドを有する新しいｓｉＮＡ分子はピコモル未満のノックダウン活性（ＩＣ５０）を示した。これは、ｄｓ ＴＧＮ ＢＭｓ、ｄｓ ＢＭｓ、およびｄｓ ｄＴｓなどのアンチセンス鎖の第１位に通常の３’−５’連結ヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子よりも少なくとも１０倍強力であった。アンチセンス鎖の第１位に２’−５’連結ヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子のこの高ノックダウン活性は、さらに、ｄｓ ＴＧＮ ｖｉｎｙｌＰｏｍｅＵおよびｄｓ ＴＧＮ ｖｉｎｙｌＰｏｍｅＵｓなどのアンチセンス鎖の５’末端に非加水分解性ホスホン酸を有する通常の３’−５’連結ｓｉＮＡ分子（アンチセンス鎖の第１位）に匹敵した。
Figure 2016508724
実施例１０：５’−第１位に修飾を含有する二本鎖ｓｉＮＡ分子によるインビボ研究（マウス）
５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ対照またはＧａｌＮＡｃ結合ｓｉＮＡを皮下注射によりマウスに投与した。投与の７２時間後に動物を屠殺した。ＲＮＡ精製のために肝臓パンチ（Ｌｉｖｅｒ ｐｕｎｃｈｅｓ）を採取した。ＲＮｅａｓｙ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１８２）を用いて全ＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号４３６８８１３）を用いて全ＲＮＡから生成される。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号４３０４４３７）を用いて定量的ＰＣＲ反応を実施した。マウスＣＴＮＮＢＩ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｍｍ００４８３０３３＿ｍｌ）およびマウスＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて、肝臓組織における両方の転写物のｍＲＮＡレベルをモニターした。ＣＴＮＮＢ１の発現レベルをＧＡＰＤＨに対して規格化した。
結果
表１１の二本鎖ｓｉＮＡ分子のサブセットをインビボ（マウス）でアッセイした。これらのｓｉＮＡ分子のセンス鎖を、ヘパトーマ細胞株の表面で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ Ｌｙｓに連結した。表１３はｓｉＮＡ分子のノックダウン活性を要約する。非加水分解性リンに連結されないｄｓ ＴＧＮ ＢＭｓは、５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇの両方の用量レジメンにおいて低活性を示した。非加水分解性リンに連結されたｓｉＮＡ分子の中で、ｄｓ ＴＧＮ ｖｉｎｙｌＰｍｏｅＴ、ｄｓ ＴＧＮ ｖｉｎｙｌＰｏｍｅＵ、およびｄｓ ＴＧＮ ｖｉｎｙｌＰｏｍｅＵｓなどの第１位に通常の３’−５’連結オリゴヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子と、ｄｓ ＴＧＮ ｖｉｎｙｌＰ３ｄＴおよびｄｓ ＴＧＮ ｖｉｎｙｌＰ３ｄＴｓなどの新しい２’−５’連結オリゴヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子とはいずれも、５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇの両方の用量レジメンにおいて、同程度に高いノックダウン活性を示した。
Figure 2016508724
実施例１１：実施例６〜１０で例示される一本鎖および二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成するために使用される化学修飾ヌクレオチドの化学構造
Figure 2016508724
Figure 2016508724
Figure 2016508724
Figure 2016508724
Figure 2016508724

Claims (46)

  1. 核酸標的に対して相補的であるアンチセンス鎖を含む、ＲＮＡ干渉を媒介する能力のある低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、前記アンチセンス鎖が、式ＩＩ：
    Figure 2016508724
     （式中、
    Ａは、−ＯＣ（Ｒ３）２−、−Ｃ（Ｒ３）２Ｏ−、−Ｃ（Ｒ３）２−、−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−または−ＣＲ３＝ＣＲ３−であり、
    Ｂは、任意の複素環塩基部分であり、
    Ｄ１およびＤ１’は、ヒドロキシル、−ＯＲ４、−ＳＲ４、または−Ｎ（Ｒ４）２から独立して選択され、
    Ｅは、Ｏ、Ｓ、−ＮＲ５、−Ｎ−Ｎ（Ｒ４）２または−Ｎ−ＯＲ４であり、
    Ｊは、式ＩＩの５’修飾ヌクレオチドを前記ｓｉＮＡ分子の隣接ヌクレオチドの糖部分に連結するヌクレオシド間連結基であり、
    Ｒ１およびＲ１’はＨ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２から独立して選択されるか、または一緒に、＝Ｏもしくは＝ＣＨ２を形成し、
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ２〜６アルケニルであり、
    Ｒ３およびＲ５は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
    Figure 2016508724
     から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、前記アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
    Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
    Figure 2016508724
     から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、前記アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
    Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（これは、−ＯＲ７、−ＳＲ７、−Ｎ（Ｒ８）２、もしくは（＝Ｏ）−ＮＲ９、または１〜３個のハロゲンによって任意選択で置換される）、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
    Figure 2016508724
     から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１０、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソ、−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、前記アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
    Ｒ７は、メチル、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ８）２または−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ８）２であり、
    Ｒ８は、ＨまたはＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
    Ｒ９は、（Ｒ８）２、−Ｒ８−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒ８）２または−Ｒ８−Ｃ（＝ＮＲ８）［Ｎ（Ｒ８）２］であり、および
    Ｒ１０は、ＨまたはＣ１〜４アルキルである）
    を有する５’修飾ヌクレオチドを含む、ｓｉＮＡ分子。
  2. Ｒ３が、Ｈ、ヒドロキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
    Figure 2016508724
     から独立して選択され、ここで、Ｒ’が、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、
    Figure 2016508724
     から選択され、およびＲ”が、Ｈ、Ｃ１〜４アルキルまたはアリールから選択される、請求項１に記載のｓｉＮＡ分子。
  3. Ａが、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ＝ＣＨ−である、請求項１または２に記載のｓｉＮＡ分子。
  4. Ｄ１およびＤ１’が、ヒドロキシル、−ＯＣＨ３または−ＯＣＨ２ＣＨ３から独立して選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  5. Ｄ１およびＤ１’がそれぞれヒドロキシルである、請求項４に記載のｓｉＮＡ分子。
  6. Ａが−ＯＣＨ２−である場合、
    Figure 2016508724
     は
    Figure 2016508724
     ではない、請求項３に記載のｓｉＮＡ分子。
  7. Ｂがウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  8. ＥがＯである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  9. Ｊが、ホスホジエステルヌクレオシド間連結基またはホスホロチオアートヌクレオシド間連結基である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  10. Ｒ１がＨまたはヒドロキシルであり、Ｒ１’がＨ、ヒドロキシル、ハロゲンまたは−ＯＲ６である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  11. Ｒ１’が、ハロゲン、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｆ、−ＯＣＨ２ＣＨＦ２、−ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＳＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３または−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項１０に記載のｓｉＮＡ分子。
  12. Ｒ１’がＦまたは−ＯＣＨ３である、請求項１１に記載のｓｉＮＡ分子。
  13. Ｒ１、Ｒ１’およびＲ２がそれぞれＨである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  14. Ａが−ＣＨ＝ＣＨ−であり、ＥがＯであり、Ｄ１およびＤ１’がそれぞれヒドロキシルである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  15. 前記５’修飾ヌクレオチドが
    Figure 2016508724
     である、請求項１４に記載のｓｉＮＡ分子。
  16. Ｂがチミンである、請求項１５に記載のｓｉＮＡ分子。
  17. 前記ｓｉＮＡ分子が一本鎖アンチセンス分子である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  18. 前記ｓｉＮＡ分子が１つまたは複数の付加的な化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項１７に記載のｓｉＮＡ分子。
  19. 前記１つまたは複数の付加的な化学修飾ヌクレオチドが２’−５’ヌクレオシド間結合を有さない、請求項１８に記載のｓｉＮＡ分子。
  20. 前記分子が、２’−５’ヌクレオシド間結合を有する付加的な化学修飾ヌクレオチドを５個以下で含む、請求項１８に記載のｓｉＮＡ分子。
  21. 前記一本鎖分子が１５〜３０ヌクレオチドの長さである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  22. 前記分子の３’末端上のキャップをさらに含む、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  23. 前記ｓｉＮＡ分子が、前記アンチセンス鎖に対して相補的であるセンス鎖を含む二本鎖分子である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  24. 前記ｓｉＮＡ分子が１つまたは複数の付加的な化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のｓｉＮＡ分子。
  25. 前記アンチセンス鎖内に位置する任意の１つまたは複数の付加的な化学修飾ヌクレオチドが２’−５’ヌクレオシド間結合を有さない、請求項２４に記載のｓｉＮＡ分子。
  26. 前記アンチセンス鎖が、２’−５’ヌクレオシド間結合を有する付加的な化学修飾ヌクレオチドを５個以下で含む、請求項２４に記載のｓｉＮＡ分子。
  27. 前記アンチセンス鎖および前記センス鎖がそれぞれ独立して、１５〜３０ヌクレオチドの長さである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  28. 一方または両方の鎖において１つまたは複数の３’オーバーハングヌクレオチドをさらに含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  29. 少なくとも一方の鎖の前記３’末端上のキャップをさらに含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子。
  30. 薬学的に許容可能な担体または希釈剤中に請求項１〜２９のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子を含む組成物。
  31. 細胞において標的特異的ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子または請求項３０に記載の組成物と接触させることを含む方法。
  32. 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記細胞がインビトロである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記細胞がインビボである、請求項３２に記載の方法。
  35. 標的特異的ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を阻害するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のｓｉＮＡ分子または請求項３０に記載の組成物の使用。
  36. 式Ｉ：
    Figure 2016508724
     （式中、
    Ａは、−Ｃ（Ｒ３）２−、−Ｃ（Ｒ３）２Ｃ（Ｒ３）２−または−ＣＲ３＝ＣＲ３−であり、
    Ｂは、任意の複素環塩基部分であり、
    Ｄ１およびＤ１’は、ヒドロキシル、−ＯＲ４、−ＳＲ４、または−Ｎ（Ｒ４）２から独立して選択され、
    ＥおよびＥ’は、Ｏ、Ｓ、−ＮＲ５、−Ｎ−Ｎ（Ｒ４）２または−Ｎ−ＯＲ４から独立して選択され、
    Ｇ１は、ヒドロキシルまたは−ＯＲ６であり、
    Ｇ１’は、ヒドロキシル、−ＯＲ６または−Ｎ（Ｒ６）２であり、
    Ｒ１およびＲ１’は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ７、−Ｎ（Ｒ７）２から独立して選択されるか、または一緒に、＝Ｏもしくは＝ＣＨ２を形成し、
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ２〜６アルケニルであり、
    Ｒ３およびＲ５は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
    Figure 2016508724
     から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、前記アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
    Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
    Figure 2016508724
     から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソまたは−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、前記アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
    Ｒ６は独立して、末端炭素原子において任意選択でシアノまたは保護基により置換されたＣ１〜６アルキルであり、
    Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル（これは、−ＯＲ８、−ＳＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、（＝Ｏ）−ＮＲ１０または１〜３個のハロゲンによって任意選択で置換される）、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
    Figure 2016508724
     から独立して選択され、ここで、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜４アルキル（これは、−ＳＲ１１、アリール、ヘテロアリール、アミノ、ヒドロキシル、オキソ、−ＮＨ−Ｃ＝（ＮＨ）ＮＨ２から独立して選択される１〜３個の置換基によって任意選択で置換され、前記アリールおよびヘテロアリールはヒドロキシルによって任意選択で置換される）から選択され、Ｒ”は、Ｈ、Ｃ１〜１８アルキルまたはアリールから選択され、
    Ｒ８は、メチル、−ＣＦ３、−Ｎ（Ｒ９）２または−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ９）２であり、
    Ｒ９は、ＨまたはＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
    Ｒ１０は、（Ｒ９）２、−Ｒ９−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒ９）２または−Ｒ９−Ｃ（＝ＮＲ９）［Ｎ（Ｒ９）２］であり、
    Ｒ１１は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、および
    ｒは０または１である）
    の構造を有する修飾ヌクレオチド。
  37. Ｒ３が、Ｈ、ヒドロキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、アリール、
    Figure 2016508724
     から独立して選択され、ここで、Ｒ’が、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、
    Figure 2016508724
     から選択され、Ｒ”が、Ｈ、Ｃ１〜４アルキルまたはアリールから選択される、請求項３６に記載の修飾ヌクレオチド。
  38. Ｂがウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである、請求項３６または３７に記載の修飾ヌクレオチド。
  39. Ａが−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ＝ＣＨ−である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の修飾ヌクレオチド。
  40. Ｄ１およびＤ１’がヒドロキシル、−ＯＣＨ３または−ＯＣＨ２ＣＨ３から独立して選択され、ＥがＯまたはＳである、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の修飾ヌクレオチド。
  41. Ｄ１およびＤ１’が独立して−ＯＣＨ２ＣＨ３であり、ＥがＯである、請求項４０に記載の修飾ヌクレオチド。
  42. ｒが１であり、Ｇ１およびＧ１’がヒドロキシルであり、Ｅ’がＯまたはＳであるか、またはｒが０であり、Ｇ１が−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮであり、Ｇ１’が−Ｎ［ＣＨ（ＣＨ３）２］２である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の修飾ヌクレオチド。
  43. Ｒ１がＨであり、Ｒ１’がＨ、ハロゲンまたは−ＯＲ７である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の修飾ヌクレオチド。
  44. Ｒ１’が、ハロゲン、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｆ、−ＯＣＨ２ＣＨＦ２、−ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＳＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３または−ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項４３に記載の修飾ヌクレオチド。
  45. Ｒ１’がＦまたは−ＯＣＨ３である、請求項４４に記載の修飾ヌクレオチド。
  46. Ｂがチミンであり、Ｒ１、Ｒ１’およびＲ２がそれぞれＨである、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の修飾ヌクレオチド。
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