TW202130802A - 分離基材、細胞分離過濾器及血小板之製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明的課題在於提供一種巨核細胞的去除率及血小板的回收率均高並且過濾壽命長的分離基材以及使用了該分離基材之細胞分離過濾器及血小板之製造方法。本發明的分離基材由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸浮液分離血小板之多孔體構成,前述分離基材中,分離基材具有從細胞懸浮液的流入側依序配置有粗過濾層及精密過濾層之區域,粗過濾層包含1片以上的粗過濾膜,精密過濾層包含1片以上的精密過濾膜,粗過濾膜中的至少1片為平均孔徑成為5.0μm以上且30.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為小於30%之粗過濾膜X,精密過濾膜中的至少1片為平均孔徑成為2.0μm以上且20.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為30%以上之精密過濾膜Y。
Description
本發明涉及一種分離基材、細胞分離過濾器及血小板之製造方法。
血小板係在血栓的形成中發揮主導作用且在活體內顯現止血功能之細胞,因此若出血時或使用抗癌劑時血小板減少,則嚴重的情況下有時導致死亡。
而且,對血小板的減少之唯一的確定治療法係輸注血小板製劑。目前的血小板製劑依賴於來自志願者的獻血,儘管保存有效期間為4天之極短的天數,但隨著因少子化而能夠獻血的年齡層的人口減少及血液製劑血的需求高之高齡人的人口增加,預測醫療現場中的需求與供給的平衡難以保持。
因此,代替獻血之血小板來源的開發備受關注。
近年來,已報導了藉由將多能性乾細胞、造血祖細胞、間充質細胞等作為來源培養巨核細胞來在體外大量生產血小板之技術。
在該技術中,血小板藉由巨核細胞的細胞質被切割而產生,因此在血小板生產後的培養液中含有大量的巨核細胞。
因此,從抑制免疫原性之觀點考慮,需要開發分離巨核細胞及從巨核細胞生產之血小板之技術。
作為這樣的分離技術,例如在專利文獻1中記載有:“一種分離基材,其由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸浮液分離血小板之不織布構成,前述分離基材中,前述分離基材的平均孔徑為2.0μm以上且15.0μm以下,前述分離基材的厚度為10μm以上且500μm以下。”([請求項1])。
[專利文獻1]國際公開第2018/207564號
本發明人等對專利文獻1中所記載之分離基材進行了研究,其結果得知巨核細胞的去除率(阻止率)高且血小板的回收率(透過率)高,但是明確了對過濾壽命存在改善的空間。
因此,本發明的課題在於提供一種巨核細胞的去除率及血小板的回收率均高並且過濾壽命長的分離基材以及使用了該分離基材之細胞分離過濾器及血小板之製造方法。
本發明人等為了實現上述課題進行了深入研究之結果,發現了如下而完成了本發明:在分離基材中,從細胞懸浮液的流入側設置依序配置有粗過濾層及精密過濾層之區域,藉此巨核細胞的去除率及血小板的回收率均高並且過濾壽命變長,前述粗過濾層包含滿足既定參數之粗過濾膜,前述精密過濾層包含滿足既定參數之精密過濾膜。
亦即,本發明人等發現了藉由以下的構成能夠實現上述課題。
[1]一種分離基材,其係由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸浮液分離血小板之多孔體構成,前述分離基材中,
分離基材具有從細胞懸浮液的流入側依序配置有粗過濾層及精密過濾層之區域,
粗過濾層包含1片以上的粗過濾膜,
精密過濾層包含1片以上的精密過濾膜,
粗過濾膜中的至少1片為藉由半乾法測量之平均孔徑成為5.0μm以上且30.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為小於30%之粗過濾膜X,
精密過濾膜中的至少1片為藉由半乾法測量之平均孔徑成為2.0μm以上且20.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為30%以上之精密過濾膜Y。
[2]如[1]所述之分離基材,其中
粗過濾膜X為滿足下述式(1)之膜。
150≤平均孔徑(μm)的數值×厚度(μm)的數值≤1500 (1)
[3]如[1]或[2]所述之分離基材,其中
精密過濾膜Y的孔隙率為40%以上且90%以下。
[4]如[1]至[3]之任一項所述之分離基材,其中
粗過濾膜X的孔隙率為40%以上且90%以下。
[5]如[1]至[4]之任一項所述之分離基材,其中
粗過濾層包含3片以上的粗過濾膜。
[6]如[1]至[5]之任一項所述之分離基材,其中
粗過濾層中所包含之所有粗過濾膜及精密過濾層中所包含之所有精密過濾膜為臨界潤濕表面張力為72mN/m以上的膜。
[7]如[1]至[6]之任一項所述之分離基材,其中
多孔體為不織布。
[8]如[7]所述之分離基材,其中
不織布包含選自包括纖維素樹脂及聚烯烴樹脂之群組中之至少1種樹脂。
[9]如[8]所述之分離基材,其中
纖維素樹脂為纖維素醯化物或纖維素。
[10]如[8]所述之分離基材,其中
聚烯烴樹脂為聚丙烯。
[11]如[10]所述之分離基材,其中
聚丙烯為經親水化處理之聚丙烯。
[12]一種細胞分離過濾器,其係具備配置有第1通液口及第2通液口之容器及填充於第1通液口與第2通液口之間之濾材,前述分離過濾器中,
濾材為[1]至[11]之任一項所述之分離基材。
[13]一種血小板之製造方法,其係包括:
使至少包含巨核細胞之培養液與[1]至[11]之任一項所述之分離基材接觸之步驟;
培養步驟,在接觸步驟之前及之後的至少一方中,培養巨核細胞而產生血小板;及
回收步驟,在接觸步驟及培養步驟之後,回收包含所產生之血小板之培養液。
[發明效果]
依據本發明,本發明能提供一種巨核細胞的去除率及血小板的回收率均高並且過濾壽命長的分離基材以及使用了該分離基材之細胞分離過濾器及血小板之製造方法。
以下,對本發明進行了詳細的說明。
以下所記載之構成要件的說明係根據本發明的代表性的實施態樣而完成者,但是本發明並不限定於該種實施態樣。
另外,在本說明書中,用“~”來表示之數值範圍係指將記載於“~”前後之數值作為下限值及上限值而包括之範圍。
又,本說明書中,各成分可以使用單獨1種相當於各成分之物質,亦可以併用2種以上。在此,針對各成分併用2種以上的物質之情況下,除非另有說明,否則其成分的含量係指所併用之物質的合計的含量。
通常,分離基材係指在內部具有大量小孔隙之結構體,例如可舉出纖維結構體、多孔膜、滾珠填充管柱及由該等積層體構成者。
其中,纖維結構體係指纏結纖維而成為一個結構者,例如可舉出織物(網狀物(mesh))、編物、編織繩、不織布及將纖維填充到管柱中者等,其中,從寬的孔徑分布、複雜的流路、製作容易性的方面考慮,尤其不織布為較佳。又,作為不織布的製法,例如可舉出乾式法、濕式法、紡黏法、熔噴法、靜電紡絲法、針刺法等,其中,從生產性及通用性的方面考慮,濕式法及熔噴法、靜電紡絲法為較佳。
多孔膜係指在整個塑膠體具有無數連通孔者,作為製法可舉出相分離法、發泡法、照射放射線或雷射光等之蝕刻法、成孔法、冷凍乾燥法、塑膠燒結法等,但是從複雜的流路、製作容易性的方面考慮,尤其使用了相分離法之多孔膜為較佳。
滾珠填充管柱係指藉由在管柱內填充滾珠而在滾珠之間形成孔隙者。期望滾珠的粒徑為均勻者,藉由滾珠的粒徑而容易控制滾珠之間的孔隙作為孔徑。
作為構成本發明的分離基材之多孔體,例如可舉出不織布、纖維結構體、海綿體、多孔膜等,其中,從生產性及過濾性能的控制性的觀點考慮,不織布為較佳。
[分離基材]
本發明的分離基材係由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液分離血小板之多孔體構成之分離基材。
又,本發明的分離基材具有從細胞懸浮液的流入側依序配置粗過濾層及精密過濾層之區域,粗過濾層包含1片以上的粗過濾膜,精密過濾層為1片以上的精密過濾膜。
又,本發明的分離基材中,粗過濾膜中的至少1片為藉由半乾法測量之平均孔徑成為5.0μm以上且30.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為小於30%之粗過濾膜X,精密過濾膜中的至少1片為藉由半乾法測量之平均孔徑成為2.0μm以上且20.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為30%以上之精密過濾膜Y。
在此,“藉由半乾法測量之平均孔徑”係指在使用了perm-porometer(Seika Corporation製造 CFE-1200AEX)之細孔直徑分布測量試驗中,對在GALWICK(Porous Materials,Inc製造)中完全潤濕之樣品吹送空氣,一邊以1kPa/min升壓一邊進行了評價之值。
具體而言,相對於在GALWICK中完全潤濕之膜狀樣品,在膜的一側吹送空氣,以使壓力上升成為1kPa/min,一邊測量其壓力,一邊測量向與膜的相反的一側透過之空氣的流量。
在該方法中,首先關於在GALWICK中潤濕之膜狀樣品,得到壓力與透氣流量的數據(以下,亦稱為“濕曲線”。)。接著,對與未潤濕之乾燥狀態的膜狀樣品相同的數據(以下,亦稱為“乾曲線”。)進行測量,並求出相當於乾曲線的流量的一半之曲線(半乾曲線)與濕曲線的交點的壓力。之後,能夠將GALWICK的表面張力(γ)、與基材的接觸角(θ)及空氣壓(P)導入到下述式(I),計算平均孔徑。
平均孔徑=4γcosθ/P……(I)
又,“細孔直徑分布的峰值”係指使用利用在計算上述之平均孔徑時的細孔直徑分布測量試驗中獲得之濕曲線及乾曲線來計算之細孔直徑分布並且藉由以下所示之方法進行了評價之值。
細孔直徑分布為將x軸設為孔徑,將y軸設為孔徑分布之直方圖,將x軸設為對數軸,將數據區間的間隔為0.05、亦即將x軸的孔徑進行10倍化為止的區間設為對數值以等間隔分為20個區分而設定,進而描繪直方圖,以使全區間的度數的總和成為100%,並且將該直方圖的最大度數的評價值作為峰值。
本發明的分離基材如上述,藉由設置從細胞懸浮液的流入側依序配置包含滿足既定參數之粗過濾膜X之粗過濾層及包含滿足既定參數之精密過濾膜Y之精密過濾層之區域,巨核細胞的去除率及血小板的回收率均高並且過濾壽命變長。
發揮該種效果之理由的詳細雖不明確,但是本發明人等推測如下。
首先,粗過濾膜X中,藉由半乾法測量之平均孔徑為5.0μm以上且30.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值小於30%,因此可以說與後述之精密過濾膜Y相比,大量具有具有各種孔徑之細孔。
而且,藉由包含粗過濾膜X之粗過濾層設置於比包含精密過濾膜Y之精密過濾層更靠細胞懸浮液的流入側,認為能夠減少到達精密過濾層之巨核細胞的數,因此一邊較高地維持巨核細胞的去除率及血小板的回收率,一邊能夠延長過濾壽命。尤其,藉由設置包含粗過濾膜X之粗過濾層,在積層膜中的膜與膜的界面中充分產生向膜面平行方向的液體流動,將過濾對象物有效地分散於各個膜的膜面,其結果認為能夠最大限利用膜的有效空隙,因此能夠延長過濾壽命。
〔粗過濾層〕
本發明的分離基材所具有之粗過濾層為包含1片以上的粗過濾膜之過濾層。
在此,粗過濾膜係指細孔直徑分布的峰值成為小於30%之過濾膜,本發明中,粗過濾膜中的至少1片為藉由半乾法測量之平均孔徑成為5.0μm以上且30.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為小於30%之粗過濾膜X,粗過濾層中所包含之所有粗過濾膜為粗過濾膜X為較佳。
又,粗過濾層包含2片以上的粗過濾膜之情況下,可以積層相同的粗過濾膜,亦可以積層不同之粗過濾膜。另外,積層不同之粗過濾膜之情況下,相鄰之粗過濾膜的積層順序為以配置於細胞懸浮液的流入側之粗過濾膜的平均孔徑成為配置於流出側之粗過濾膜的平均孔徑以上的方式積層為較佳。
粗過濾膜1片的厚度並無特別限定,10~1000μm為較佳,15~400μm為更佳,20~200μm為進一步較佳。
在此,“粗過濾膜的厚度”係指使用測微儀(Mitutoyo Corporation製造)在10處測量粗過濾膜的膜厚,並將各測量值進行平均之值。
本發明中,從分離基材的過濾壽命變得更長之理由考慮,粗過濾層包含3片以上的粗過濾膜為較佳,包含3~20片粗過濾膜為更佳。
<粗過濾膜X>
粗過濾膜X為如上述藉由半乾法測量之平均孔徑成為5.0μm以上且30.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為小於30%之粗過濾膜。
又,粗過濾膜X的平均孔徑為7.5μm以上且26.0μm以下為較佳,9.0μm以上且23.0μm以下為更佳。
又,粗過濾膜X的細孔直徑分布的峰值為5%以上且小於30%為較佳,10%以上且小於30%為更佳。
從分離基材的過濾壽命變得更長之理由考慮,粗過濾膜X為滿足下述式(1)之膜為較佳,滿足下述式(2)之膜為更佳。
150≤平均孔徑(μm)的數值×厚度(μm)的數值≤1500 (1)
150≤平均孔徑(μm)的數值×厚度(μm)的數值≤1200 (2)
從血小板的回收率變得更高且分離基材的過濾壽命變得更長之理由考慮,粗過濾膜X的孔隙率為40%以上且90%以下為較佳,50%以上且90%以下為更佳。
在此,“孔隙率”係指藉由下述式計算之值。
孔隙率(%)=[1-{m/ρ/(S×d)}]×100
m:薄片重量(g)
ρ:樹脂密度(g/cm3
)
S:薄片面積(cm2
)
d:薄片膜厚(cm)
〔精密過濾層〕
本發明的分離基材所具有之精密過濾層為包含1片以上的精密過濾膜之過濾層。
在此,精密過濾膜係指細孔直徑分布的峰值成為30%以上之過濾膜,本發明中,精密過濾膜中的至少1片為藉由半乾法測量之平均孔徑成為2.0μm以上且20.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為30%以上之精密過濾膜Y,精密過濾層中所包含之所有精密過濾膜為精密過濾膜Y為較佳。
又,精密過濾層包含2片以上的精密過濾膜之情況下,可以積層相同的精密過濾膜,亦可以積層不同之精密過濾膜。另外,積層不同之精密過濾膜之情況下,相鄰之精密過濾膜的積層順序為以配置於細胞懸浮液的流入側之精密過濾膜的平均孔徑成為配置於流出側之精密過濾膜的平均孔徑以上的方式積層為較佳。
精密過濾膜1片的厚度並無特別限定,10~500μm為較佳,10~250μm為更佳,10~200μm為進一步較佳。
在此,“精密過濾膜的厚度”係指使用測微儀(Mitutoyo Corporation製造)在10處測量精密過濾膜的膜厚,並將各測量值進行平均之值。
本發明中,從分離基材的過濾壽命變得更長之理由考慮,精密過濾層包含2片以上的精密過濾膜為較佳,包含2~10片精密過濾膜為更佳。
<精密過濾膜Y>
精密過濾膜Y為如上述藉由半乾法測量之平均孔徑成為2.0μm以上且20.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為30%以上之精密過濾膜。
又,精密過濾膜Y的平均孔徑為2.0μm以上且17.5μm以下為較佳,2.0μm以上且15.0μm以下為更佳。
又,精密過濾膜Y的細孔直徑分布的峰值為30%以上且99%以下為較佳,45%以上且99%以下為更佳。
從血小板的回收率變得更高且分離基材的過濾壽命變得更長之理由考慮,精密過濾膜Y的孔隙率為40%以上且90%以下為較佳,50%以上且90%以下為更佳。
本發明中,從分離基材的過濾壽命變得更長之理由考慮,上述之粗過濾層中所包含之所有粗過濾膜及上述之精密過濾層中所包含之所有精密過濾膜的臨界潤濕表面張力(Critical Wetting Surface Tension:CWST)為72mN/m以上的膜為較佳,72~110mN/m的膜為更佳。
在此,“臨界潤濕表面張力”係指藉由以下順序計算之值。
首先,使用具有不同表面張力之溶液,將1滴溶液輕輕地滴加於水平之過濾膜上,放置10分鐘。
過濾膜潤濕之情況下,使用具有高於進行潤濕之溶液之表面張力之溶液同樣地進行滴加,重複進行直至不再潤濕。
接著,關於在經潤濕之溶液中具有最大表面張力之溶液及在未經潤濕之溶液中具有最小表面張力之溶液,將兩種溶液的表面張力的平均值作為臨界潤濕表面張力而計算。
作為將臨界潤濕表面張力調節為上述之範圍內之方法,能夠採用各種表面處理法。
作為表面處理法,例如可舉出親水性原材料的表面塗佈、基於鹼皂化等之至親水性官能基的轉換或者賦予等。
又,關於塗佈材料,能夠使用公知的材料,不具有血小板吸附性為特佳。
本發明中,關於上述之粗過濾層及精密過濾層,粗過濾層的流出側的平均孔徑成為精密過濾層的流入側的平均孔徑以上為較佳。
本發明的分離基材係具有從細胞懸浮液的流入側依序配置有上述之粗過濾層及精密過濾層之區域者,但是該區域的總體積相對於分離基材的總體積為50%以上為較佳,65~100%為更佳。
本發明的分離基材的厚度為100~3000μm為較佳,150~1000μm為更佳。
在此,“分離基材的厚度”係指使用測微儀(Mitutoyo Corporation製造)在10處測量分離基材的膜厚,並將各測量值進行平均之值。
本發明中,從能夠兼顧充分的纖維強度及良好的分離性能之理由考慮,構成多孔體(尤其,不織布)之纖維的平均纖維直徑為800nm以上且3500nm以下為較佳。
又,從使用分離基材時(例如過濾時等)能夠防止纖維的剝離之理由考慮,構成不織布之纖維的平均纖維長度為1mm以上且1m以下為較佳。
另外,平均纖維直徑及平均纖維長度能夠藉由調節製作不織布時的原料(例如乙酸纖維素等)溶液的濃度等的製造條件來調節。
在此,平均纖維直徑係指如下測量之值。
關於由纖維構成之不織布的表面,觀察透射型電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope:TEM)像或掃描型電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope:SEM)像。
依據所構成之纖維的大小,在從1000~5000倍選擇之倍率下進行基於電子顯微鏡圖像之觀察。其中,試樣、觀察條件或倍率調節為滿足下述的條件。
(1)在觀察圖像內的任意部位畫出一根直線X,20根以上的纖維與該直線X交叉。
(2)在相同的圖像內畫出與直線X垂直交叉之直線Y,20根以上的纖維與直線Y交叉。
對與如上述的電子顯微鏡觀察圖像,關於各個與直線X相交之纖維、與直線Y相交之纖維分別讀取至少20根(亦即,合計為至少40根)的寬度(纖維的短直徑)。如此觀察至少3組以上如上述的電子顯微鏡圖像,讀取至少40根×3組(亦即,至少120本)的纖維直徑。
如上所述,對讀取之纖維直徑進行平均來求出平均纖維直徑。
又,平均纖維長係指如下測量之值。
亦即,纖維的纖維長度能夠藉由分析測量上述之平均纖維直徑時所使用之電子顯微鏡觀察圖像來求出。
具體而言,對與如上述的電子顯微鏡觀察圖像,關於各個與直線X相交之纖維、與直線Y相交之纖維分別讀取至少20根(亦即,合計為至少40根)的纖維長度。
如此觀察至少3組以上如上述的電子顯微鏡圖像,讀取至少40根×3組(亦即,至少120根)的纖維長度。
如上所述,對讀取之纖維長度進行平均來求出平均纖維長度。
本發明的分離基材包含樹脂材料為較佳。
作為樹脂材料,具體而言,例如可舉出纖維素醯化物、纖維素等纖維素樹脂;聚丙烯腈樹脂;聚碸樹脂;氟樹脂;聚醚碸樹脂;聚醯胺樹脂;聚丙烯等聚烯烴樹脂等,可以使用單獨一種該等,亦可以併用2種以上。
該等中,包含選自包括纖維素樹脂及聚烯烴樹脂之群組中之至少1種樹脂為較佳。
作為上述纖維素樹脂,纖維素醯化物或纖維素為較佳。
又,纖維素醯化物可以為一部分被皂化之纖維素醯化物。
又,作為纖維素醯化物所具有之醯基,具體而言,例如可舉出乙醯基、丙醯基及丁醯基等。另外,經取代之醯基可以僅為1種(例如,僅為乙醯基),亦可以為2種以上。
作為上述聚烯烴樹脂,聚丙烯為較佳,經親水化處理之聚丙烯為更佳。
本發明中,從抑制血小板吸附於分離基材並且更加提高血小板的透過率之觀點考慮,亦可以對分離基材的表面實施親水化處理而化學或物理改質血小板低吸附材料。
作為血小板低吸附材料,在側鏈具有親水性基之聚合物為較佳,例如可舉出2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼、乙二醇、甲基丙烯酸甲酯、羥基乙基甲基丙烯酸酯、乙烯醇、N-乙烯-2-吡咯烷酮、磺基甜菜鹼單體的聚合物等。
作為親水性基,具體而言,例如可舉出羥基、醚基、硝基、亞胺基、羰基、磷酸基、甲氧基二乙二醇基、甲氧基三乙二醇基、乙氧基二乙二醇基、乙氧基三乙二醇基、胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、羧基、磷醯基、磷酸膽鹼基、硫酸基或該等的鹽等。
又,作為血小板低吸附材料及其改質方法,能夠利用WO87/05812、日本特開平4-152952、日本特開平5-194243、WO2010/113632等中所記載之材料及方法。
〔細胞懸濁液〕
使用本發明的分離基材供於血小板的分離之細胞懸濁液係包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液。
其中,巨核細胞及血小板並無特別限定,例如可舉出從成體組織採取之巨核細胞及血小板;從具有多能性乾細胞、造血祖細胞及間充質細胞等分化全能性之細胞分化之巨核細胞及血小板;在通常的方法中在不具有至巨核細胞的分化全能性之細胞藉由使用直接重新編程技術製作之巨核細胞及血小板;組合該等之巨核細胞及血小板;等。
作為多能性乾細胞,例如可舉出胚性乾細胞〔ES(embryonic stem)細胞〕、核移植胚性乾細胞〔nt(nuclear transfer)ES細胞〕及人工多能性乾細胞〔iPS(induced pluripotent stem)細胞〕等,其中,人工多能性乾細胞(iPS細胞)為較佳。
作為造血祖細胞,例如可舉出來自於骨髓、來自於臍帶血、動員〔G-CSF(Granulocyte-colony stimulating factor,顆粒性白血球群落刺激因子)〕末梢血、來自於ES細胞的中肺葉系細胞及來自於末梢血的細胞等,但是並不限定於該等。作為該等造血祖細胞,例如可舉出分化抗原群(cluster of differentiation:CD)34陽性者(例如,CD34+細胞、CD133+細胞、SP細胞、CD34+CD38-細胞、c-kit+細胞或者CD3-、CD4-、CD8-及CD34+細胞者)(國際公開WO2004/110139)。
作為間充質細胞,例如可舉出間充質乾細胞、脂肪祖細胞、骨髓細胞、脂肪細胞及滑膜細胞等,其中,脂肪祖細胞為較佳。
在通常的方法中,作為不具有至巨核細胞的分化全能性之細胞,例如可舉出纖維芽細胞等,但是並不限定於該等。
[細胞分離過濾器]
本發明的細胞分離過濾器具備:容器,配置有第1通液口及第2通液口;及過濾材料,填充於第1通液口及第2通液口之間,其中在過濾材料中使用了上述之本發明的分離基材。
細胞分離過濾器中所使用之容器的形態、大小、材質並無特別限定。
作為容器的形態,例如可以為球、容器、盒狀、袋狀、管狀、管柱狀等、任意的形態。
作為容器的型(類型),亦能夠使用橫向類型及管柱狀類型中的任一個類型。
[血小板之製造方法]
本發明的血小板之製造方法具有:
接觸步驟,使至少包含巨核細胞之培養液與上述之本發明的分離基材接觸;
培養步驟,在接觸步驟之前及/或之後,培養巨核細胞而產生血小板;及
回收步驟,在接觸步驟及培養步驟之後,回收包含所產生之血小板之培養液。
其中,接觸步驟中的接觸機構能夠依據培養液的量及巨核細胞的濃度等來適當選擇,但是例如可舉出在填充有本發明的分離基材之塔或管柱等供給細胞懸濁液之方法等。
又,培養步驟中的產生血小板之方法,例如可舉出藉由流體供給剪切應力之方法,具體而言可舉出攪拌包含巨核細胞之培養液之方法等。另外,培養步驟中培養之巨核細胞可以為在接觸步驟之後具有培養步驟之情況下藉由本發明的分離基材中補充之巨核細胞。又,認為接觸步驟之後具有培養步驟之情況下如後述之實施例那樣使包含巨核細胞及血小板之細胞懸濁液與分離基材接觸時在初期階段補充之巨核細胞,藉由基於之後接觸之細胞懸濁液(亦即流體)之剪切應力,亦產生血小板。
又,作為回收步驟中的回收方法,例如可舉出在填充有本發明的分離基材之塔或管柱狀等使包含所產生之血小板之培養液通液之方法等。
[實施例]
以下,根據實施例對本發明進行進一步詳細的說明。以下的實施例中所示之材料、使用量、比例、處理內容、處理步驟等只要不脫離本發明的宗旨,則能夠適當變更。然而,本發明的範圍並非係被以下所示之實施例限定地解釋者。
〔粗過濾膜的製作〕
將聚丙烯(PP)用於原料,使用熔噴法製作不織布,依據需要進行壓光處理之後,進行親水化塗佈處理,從而製作了由不織布構成之粗過濾膜R1~R13。
在此,關於壓光處理,調節溫度、壓力、輸送速度來進行,以使成為下述表1所記載之孔隙率。
又,關於親水化塗佈,調節日本專利第3250833號記載的條件對甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯的大分子單體進行接枝聚合來進行,以使成為下述表1所示之CWST。
另外,關於平均孔徑、厚度、細孔分布的峰值及孔隙率不同之粗過濾膜,藉由調節重量、聚合物吐出速度或溫度等的不織布的製造條件,獲得了下述表1所記載之粗過濾膜。
另外,關於經製作之粗過濾膜R1~R13,藉由上述之方法測量平均孔徑、厚度、CWST、細孔直徑分布的峰值及孔隙率,又計算了平均孔徑與厚度的乘積(上述式(1)的值)。將該等結果示於下述表1中。
[表1]
多孔體 | 原材料 | 壓光處理 | 塗佈處理 | 平均孔徑 (μm) | 厚度 (μm) | CWST (mN/m) | 細孔直徑分布峰值 | 孔隙率 | 平均孔徑×厚度 | |
粗過濾膜R1 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 4.0 | 75 | 73 | 11% | 41% | 300 |
粗過濾膜R2 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 5.2 | 28 | 73 | 22% | 49% | 146 |
粗過濾膜R3 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 5.1 | 30 | 73 | 16% | 63% | 153 |
粗過濾膜R4 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 11.0 | 85 | 75 | 23% | 81% | 935 |
粗過濾膜R5 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 17.0 | 66 | 76 | 19% | 80% | 1122 |
粗過濾膜R6 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 28.0 | 53 | 74 | 19% | 77% | 1484 |
粗過濾膜R7 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 27.2 | 56 | 74 | 25% | 68% | 1523 |
粗過濾膜R8 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 32.0 | 44 | 78 | 27% | 57% | 1408 |
粗過濾膜R9 | 不織布 | PP | 有 | 有 | 10.6 | 60 | 73 | 19% | 36% | 636 |
粗過濾膜R10 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 12.3 | 120 | 73 | 19% | 91% | 1476 |
粗過濾膜R11 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 17.0 | 66 | 70 | 19% | 67% | 1122 |
粗過濾膜R12 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 10.9 | 70 | 73 | 21% | 42% | 763 |
粗過濾膜R13 | 不織布 | PP | 無 | 有 | 11.2 | 125 | 73 | 20% | 89% | 1400 |
〔精密過濾膜的製作〕
使用電紡法,在下述表2所示之條件下,製作了由不織布構成之精密過濾膜P1~P10。
具體而言,藉由與專利文獻1(國際公開第2018/207564號)的實施例1相同的方法,製作了由乙酸纖維素(以下,亦簡稱為“CA”。)及/或乙酸丙酸纖維素(以下,亦簡稱為“CAP”。)構成之不織布。另外,關於平均孔徑、厚度、細孔分布的峰值及孔隙率不同之精密過濾膜,藉由調節重量、加熱處理溫度及加熱處理時間,獲得了下述表2中所記載之精密過濾膜。
接著,使用氫氧化鈉的水/乙醇溶液,實施鹼皂化處理,進行了CWST的調節。
接著,浸漬於純水中,取出並且進行風乾,藉此製作了精密過濾膜P1~P10。
另外,關於所製作之精密過濾膜P1~P10,藉由上述之方法測量了平均孔徑、厚度、CWST、細孔直徑分布的峰值及孔隙率。將該等結果示於下述表2中。
[表2]
多孔體 | 原材料 | 平均孔徑 (μm) | 厚度 (μm) | CWST (mN/m) | 細孔直徑分布峰值 | 孔隙率 | |
精密過濾膜P1 | 不織布 | CAP | 7.0 | 45 | 78 | 80% | 70% |
精密過濾膜P2 | 不織布 | CAP | 1.5 | 30 | 75 | 32% | 74% |
精密過濾膜P3 | 不織布 | CAP | 2.0 | 150 | 73 | 32% | 63% |
精密過濾膜P4 | 不織布 | CA/ CAP | 18.0 | 80 | 80 | 66% | 65% |
精密過濾膜P5 | 不織布 | CA/ CAP | 21.0 | 70 | 80 | 66% | 66% |
精密過濾膜P6 | 不織布 | CAP | 5.4 | 20 | 77 | 80% | 33% |
精密過濾膜P7 | 不織布 | CAP | 7.0 | 100 | 85 | 39% | 91% |
精密過濾膜P8 | 不織布 | CAP | 7.0 | 45 | 69 | 80% | 70% |
精密過濾膜P9 | 不織布 | CAP | 6.5 | 25 | 74 | 78% | 40% |
精密過濾膜P10 | 不織布 | CAP | 6.7 | 90 | 73 | 63% | 88% |
〔細胞懸浮液的製備〕
培養基:使用了向RPMI1640(Thermo Fisher Scientific製造)450ml添加了牛血清(Thermo Fisher Scientific製造)50ml者。
巨核細胞:將MEG-01(ATCC公司製造)用作巨核細胞。將其與培養基混合,藉此製備了巨核細胞液(6×105
cells/ml)。
血小板懸濁液:將從鼠末梢血單離者用作血小板。具體而言,在裝入有檸檬酸-葡萄糖溶液(ACD)(sigma-aldrich公司)之15ml離心分離用錐形管狀(Falcon公司)回收了從鼠採血之全血10ml。在300×g、室溫下進行7分鐘離心,回收了離心後的Plasma層及Buffy coat層。相同地對回收液進行離心分離,僅回收了Plasma層之後,在1800×g、室溫下進行5分鐘離心,回收上清液,藉此測到了血小板。將其與培養基進行混合,藉此製備了血小板懸濁液(2×108
cells/ml)。
等量混合巨核細胞液及血小板懸濁液,藉此製備了細胞懸濁液。
[實施例1~26及比較例1~10]
〔評價1〕
將所製作之各粗過濾膜及各精密過濾膜切成25mmφ圓形,將以成為下述表3所記載之積層構成的方式積層而製作之分離基材組裝於市售的過濾器支撐架上。
接著,在過濾器支撐架的流入側及流出側連接有內徑3mm、長度30cm的聚氯乙烯製的軟管。
將拆卸活塞之注射器連接於流入側的軟管的末端,用夾具固定注射器部而懸掛成注射器、軟管、過濾器支撐架沿鉛錘方向排列。
又,於連接有軟管之狀態下,以過濾器支撐架的流入側成為下側、流出側成為上側的方式進行上下反轉,以免軟管破裂,並且夾具固定於從注射器底部至20cm下的位置。
又,對靠近軟管的注射器底部之部位進行夾具固定且封閉之後,將細胞懸浮液導入注射器中。
接著,開放夾子,將細胞懸浮液導入過濾器中,使之與分離基材接觸。
接著,確認到濾液從過濾器支撐架的流出側流出之後,從夾具上拆卸過濾器支撐架,注射器、軟管、過濾器支撐架返回到沿鉛錘方向排列之配置,回收了所流出之濾液。
濾液以一定液量分小部分回收,對各個液體測量了血小板的回收率及巨核細胞的去除率。
過濾時,將流量成為過濾開始時的一半的值為止的通液量作為過濾壽命而進行了評價。
又,關於血小板的回收率及巨核細胞的去除率,用該過濾壽命為止的平均性能進行了評價。
將該等結果示於下述表3中。另外,下述表3中,“粗過濾膜等”中所記載之膜設置於細胞懸浮液的流入側,“精密過濾膜等”中所記載之膜設置於“粗過濾膜等”中所記載之膜的流出側。又,“粗過濾膜等”及“精密過濾膜等”中所記載之膜中,分為上下2層者中將上層的膜設置於細胞懸浮液的流入側、將下層的膜設置於上層的膜的流出側。
[表3]
粗過濾膜等 | 精密過濾膜等 | 血小板的回收率 | 巨核細胞的去除率 | 過濾壽命 | |||
種類 | 片數 | 種類 | 片數 | (ml) | |||
實施例1 | R5 | 3 | P1 | 3 | 93.1% | 99.9% | 56 |
實施例2 | R5 | 6 | P1 | 3 | 95.6% | 99.9% | 60 |
實施例3 | R5 | 12 | P1 | 3 | 93.8% | 99.9% | 67 |
實施例4 | R5 | 18 | P1 | 3 | 92.6% | 99.9% | 66 |
實施例5 | R5 | 6 | P1 | 3 | 92.7% | 99.9% | 47 |
R4 | 3 | ||||||
實施例6 | R5 | 6 | P1 | 3 | 92.2% | 99.9% | 50 |
R4 | 5 | ||||||
實施例7 | R5 | 18 | P1 | 3 | 91.4% | 99.9% | 50 |
R4 | 5 | ||||||
實施例8 | R5 | 6 | P3 | 3 | 90.2% | 99.9% | 46 |
實施例9 | R5 | 6 | P4 | 3 | 97.2% | 99.3% | 66 |
實施例10 | R3 | 4 | P1 | 3 | 93.1% | 99.9% | 52 |
實施例11 | R6 | 6 | P1 | 3 | 94.0% | 99.9% | 53 |
實施例12 | R5 | 6 | P1 | 3 | 91.8% | 99.9% | 48 |
R3 | 3 | ||||||
實施例13 | R6 | 6 | P1 | 3 | 94.7% | 99.9% | 57 |
R5 | 6 | ||||||
實施例14 | R2 | 3 | P1 | 3 | 90.6% | 99.9% | 29 |
實施例15 | R7 | 6 | P1 | 3 | 93.4% | 99.9% | 30 |
實施例16 | R5 | 6 | P9 | 3 | 93.2% | 99.9% | 46 |
實施例17 | R5 | 6 | P10 | 3 | 93.5% | 99.9% | 53 |
實施例18 | R12 | 6 | P1 | 3 | 92.9% | 99.9% | 41 |
實施例19 | R13 | 6 | P1 | 3 | 93.5% | 99.9% | 44 |
實施例20 | R5 | 6 | P6 | 3 | 93.0% | 99.9% | 28 |
實施例21 | R5 | 6 | P7 | 3 | 93.5% | 99.9% | 36 |
實施例22 | R9 | 4 | P1 | 3 | 90.9% | 99.9% | 34 |
實施例23 | R10 | 4 | P1 | 3 | 91.0% | 99.9% | 35 |
實施例24 | R5 | 2 | P1 | 3 | 93.0% | 99.9% | 24 |
實施例25 | R5 | 6 | P8 | 3 | 91.1% | 99.9% | 15 |
實施例26 | R11 | 6 | P1 | 3 | 90.4% | 99.9% | 16 |
比較例1 | - | - | P1 | 1 | 95.4% | 99.3% | 4 |
比較例2 | - | - | P1 | 3 | 92.3% | 99.9% | 2 |
比較例3 | R5 | 6 | - | - | 79.6% | 55.6% | 124 |
比較例4 | R5 | 6 | - | - | 94.6% | 84.9% | 88 |
R4 | 5 | ||||||
比較例5 | P1 | 3 | R5 | 6 | 92.0% | 99.9% | 2 |
比較例6 | P1 | 3 | R5 | 6 | 91.9% | 99.9% | 2 |
R4 | 5 | ||||||
比較例7 | R5 | 6 | P2 | 3 | 5.4% | 99.9% | 1 |
比較例8 | R5 | 6 | P5 | 3 | 95.3% | 86.4% | 20 |
比較例9 | R1 | 4 | P1 | 3 | 11.5% | 99.9% | 1 |
比較例10 | R8 | 6 | P1 | 3 | 94.8% | 99.9% | 2 |
從上述表3所示之結果可知,僅設置有精密過濾膜之分離基材的巨核細胞的去除率及血小板的回收率均高,但是過濾壽命短(比較例1及2)。
又,可知僅設置有粗過濾膜之分離基材的巨核細胞的去除率降低(比較例3及4)。
又,可知從細胞懸浮液的流入側依序配置有精密過濾層及粗過濾層之分離基材的過濾壽命短(比較例5及6)。
又,可知作為精密過濾膜使用平均孔徑小於2.0μm的過濾膜之情況下,血小板的回收率變低且過濾壽命亦短(比較例7)。
又,可知作為精密過濾膜使用平均孔徑超過20μm的過濾膜之情況下,巨核細胞的去除率變低且過濾壽命亦短(比較例8)。
又,可知作為粗過濾膜使用平均孔徑小於5.0μm的過濾膜之情況下,血小板的回收率變低且過濾壽命亦短(比較例9)。
又,可知作為粗過濾膜使用平均孔徑超過30μm的過濾膜之情況下,過濾壽命短(比較例10)。
相對於此,可知從細胞懸浮液的流入側依序配置有包含粗過濾膜X之粗過濾層及包含精密過濾膜Y之精密過濾層之分離基材的巨核細胞的去除率及血小板的回收率均高並且過濾壽命長(實施例1~26)。
又,從實施例2、11及15的對比可知,若粗過濾膜X為滿足上述式(1)之膜,則分離基材的過濾壽命變得更長。
又,從實施例10、22及23的對比可知,若粗過濾膜X的孔隙率為40%以上且90%以下,則血小板的回收率變得更高且分離基材的過濾壽命變得更長。
又,從實施例2、16、17、20及21的對比可知,若精密過濾膜Y的孔隙率為40%以上且90%以下,則血小板的回收率變得更高且分離基材的過濾壽命變得更長。
又,從實施例1及24的對比可知,若粗過濾層包含3片以上的粗過濾膜,則分離基材的過濾壽命變得更長。
[實施例2、3及5~7]
〔評價2〕
參閱非專利文獻〔Life Support and Anesthesia、vol.8、no.11、2001-11,p.1010-p.1013〕,製作過濾器外殼,將在實施例2、3及5~7的評價1中製作之積層體(分離基材)切成圓形組裝於過濾器外殼內。
將分離基材組裝於過濾器外殼時,將填充劑封入過濾器外殼內部空間中的分離基材外周部分,將分離基材固定於過濾器外殼內。
接著,將與評價1相同的細胞懸浮液移液到輸液袋中,連結於放大過濾器的流入側。此時,使用軟管夾具,以免輸液袋內的細胞懸浮液流入放大過濾器。
接著,從輸液袋的上部懸掛於支架上,開放軟管夾具,藉此進行了細胞懸浮液的過濾。
關於濾液的回收及分離性、過濾壽命的評價,以與使用市售的過濾器支撐架之評價相同的方式進行了實施。將結果示於下述表4中。
[表4]
粗過濾膜等 | 精密過濾膜等 | 血小板的回收率 | 巨核細胞的去除率 | 過濾壽命 | |||
種類 | 片數 | 種類 | 片數 | (ml) | |||
實施例2 | R5 | 6 | P1 | 3 | 96.5% | 99.9% | 730 |
實施例3 | R5 | 12 | P1 | 3 | 95.2% | 99.9% | 780 |
實施例5 | R5 | 6 | P1 | 3 | 94.2% | 99.9% | 540 |
R4 | 3 | ||||||
實施例6 | R5 | 6 | P1 | 3 | 94.1% | 99.9% | 600 |
R4 | 5 | ||||||
實施例7 | R5 | 18 | P1 | 3 | 93.0% | 99.9% | 610 |
R4 | 5 |
從上述表4所示之結果可知,實施例2、3及5~7中,經放大之評價中,巨核細胞的去除率及血小板的回收率均高並且過濾壽命長。
無。
Claims (13)
- 一種分離基材,其係由用於從包含巨核細胞及血小板之細胞懸浮液分離血小板之多孔體構成,前述分離基材中, 前述分離基材具有從前述細胞懸浮液的流入側依序配置有粗過濾層及精密過濾層之區域, 前述粗過濾層包含1片以上的粗過濾膜, 前述精密過濾層包含1片以上的精密過濾膜, 前述粗過濾膜中的至少1片為藉由半乾法測量之平均孔徑成為5.0μm以上且30.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為小於30%之粗過濾膜X, 前述精密過濾膜中的至少1片為藉由半乾法測量之平均孔徑成為2.0μm以上且20.0μm以下並且細孔直徑分布的峰值成為30%以上之精密過濾膜Y。
- 如請求項1所述之分離基材,其中 前述粗過濾膜X為滿足下述式(1)之膜, 150≤平均孔徑(μm)的數值×厚度(μm)的數值≤1500 (1)。
- 如請求項1或請求項2所述之分離基材,其中 前述精密過濾膜Y的孔隙率為40%以上且90%以下。
- 如請求項1或請求項2所述之分離基材,其中 前述粗過濾膜X的孔隙率為40%以上且90%以下。
- 如請求項1或請求項2所述之分離基材,其中 前述粗過濾層包含3片以上的粗過濾膜。
- 如請求項1或請求項2所述之分離基材,其中 前述粗過濾層中所包含之所有粗過濾膜及前述精密過濾層中所包含之所有精密過濾膜為臨界潤濕表面張力為72mN/m以上的膜。
- 如請求項1或請求項2所述之分離基材,其中 前述多孔體為不織布。
- 如請求項7所述之分離基材,其中 前述不織布包含選自包括纖維素樹脂及聚烯烴樹脂之群組中之至少1種樹脂。
- 如請求項8所述之分離基材,其中 前述纖維素樹脂為纖維素醯化物或纖維素。
- 如請求項8所述之分離基材,其中 前述聚烯烴樹脂為聚丙烯。
- 如請求項10所述之分離基材,其中 前述聚丙烯為經親水化處理之聚丙烯。
- 一種細胞分離過濾器,其具備: 容器,配置有第1通液口及第2通液口;及 過濾材料,填充於前述第1通液口及前述第2通液口之間,前述細胞分離過濾器中, 前述過濾材料係如請求項1至請求項11之任一項所述之分離基材。
- 一種血小板之製造方法,其具有: 接觸步驟,其為使至少包含巨核細胞之培養液與如請求項1至請求項11之任一項所述之分離基材接觸之步驟; 培養步驟,在前述接觸步驟之前及之後的至少一者中,培養巨核細胞而產生血小板;及 回收步驟,在前述接觸步驟及前述培養步驟之後,回收含有所產生之血小板之培養液。
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CN117757628A (zh) * | 2024-02-22 | 2024-03-26 | 深圳市合川医疗科技有限公司 | 一种血小板体外培养装置 |
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