TW202129006A - 自植物細胞表面獲得材料的方法 - Google Patents

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約納斯 科赫
安德烈亞斯 布胥
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Abstract

本發明關於一種用以自植物細胞的該表面或該質外體分離表現的材料的方法，其中，該植物細胞係於一液態培養基中被以一定轉子處理，其中，該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的該比熱具有一最大值為3千焦耳/公斤的該液態培養基/克/公升的該植物細胞的乾重，且被誘導進入該培養基的該熱比容具有一最大值為1.5千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘/克/公升的該植物細胞的乾重。

Description

自植物細胞表面獲得材料的方法
本發明關於將蛋白質自細胞中分離。
用以自細胞或細胞複合物分離蛋白質的方法包含滲透性裂解（osmotic lysis）、酵素性或化學性裂解（enzymatic or chemical lysis）、超音波處理及機械性消化，一般而言，為了機械性消化的目的，以一均質機（homogenizer）或混合器將細胞粉碎。
為了劃分細胞複合物及為了使細胞形成懸浮液，亦可以使用較短的處理時間，因而僅有該總細胞數量的部分發生裂解（Orellana-Escobedo et al., Plant Cell Rep. 2015, 34(3):425-33）。
每當自個別的胞器（organelle）或細胞區室（cell compartment）分離一蛋白質，通常在消化之前分離該細胞胞器，續使用該分離物進行消化。
Witzel et al., Plant Methods 2011, 7:48、Leary et al., J Vis Exp. 2014; (94): 52113及Córdoba-Pedregosa et al., Plant Physiology 1996, 112(3):1119-1125等期刊文獻描述自植物細胞的該質外體（apoplast）萃取蛋白質的方法，該質外體係指該原生質體（protoplast）以外的空間，其由該細胞壁及該細胞間隙（intercellular space）所組成。於該些公開文獻所描述的方法包含使用不同滲透溶液（infiltration solution，例如鹽類）的一滲透性萃取及離心；然而，該方法的缺點為只可以萃取能夠藉由滲透作用進行萃取的材料。
美國公開第2015/0140644 A1號專利案及澳洲公告第2017 202473 B2號專利案描述用以自該質外體獲得蛋白質的方法，具有裂解該細胞壁、孵育及萃取等步驟，在其中對該蛋白質進行酵素性或化學性修飾是可能的。
本發明的一目的為提供用以自該質外體分離或萃取該材料的改進的選擇，特別是分泌進入該質外體的材料。
本發明關於一種用以自植物細胞的該表面或該質外體（apoplast）分離表現的材料的方法，其中，該植物細胞係於一液態培養液中被以一定轉子進行處理，其中，該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的該比熱（specific heat）的一最大值為3千焦耳/公斤的該液態培養基/克/公升的該植物細胞的乾重，且被誘導進入該培養基的該熱比容（specific heat capacity）的一最大值為1.5千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘/克/公升的該植物細胞的乾重。
相似地，於另一面向中，本發明關於一種用以自一或多個植物細胞的該表面或該質外體中分離表現的材料，其中， 該一或多個植物細胞於一液態培養基中被以一定轉子處理，其中，該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的該熱的一最大值為30千焦耳/公斤的液態培養基，且被誘導進入該培養基的該熱容的一最大值為1.5千焦耳/公斤的液態培養基/分鐘。
可以組合二面向的參數，特別是因為僅涉及參考值，且於二情況下均可以使用本發明的精神。於此描述的本發明的所有詳細描述及較佳實施例與本發明的所有面向有關。
本發明關於植物或植物細胞的保守性（conservational）定轉子處理，與一般使用的均質化處理相反，該保守性定轉子處理可以自該細胞或植物的質外體分離材料。於此方面，該原生質體基本上保持完整，且可以避免要分離的該表現的材料受到該原生質體的細胞的內部的細胞成分汙染。於此方面，依據本發明，必須限制使用該定轉子的處理的強度及期間（duration），且已經顯示，藉由使用低能量（定義為比熱或熱容）輸入的定轉子處理可以令人滿意地分離所需的表現的材料。藉由該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的一比熱的一最大值為3千焦耳/公斤的該液態培養基/克/公升的該植物細胞的乾重，及藉由該轉子的旋轉所誘導的進入該培養基的一熱比容的一最大值為1.5千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘/克/公升的該植物細胞的乾重，可以獲得優秀的結果。當該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的該熱的一最大值為30千焦耳/公斤的該液態培養基時，及當被誘導進入該培養基的該熱容的一最大值為1.5千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘時，同樣可以獲得好的結果。依據本發明，並非對該植物或植物細胞進行均質化，而僅是對分離自該表面或自該質外體分離出的表面的材料進行處理。
依據本發明的方法，可以自該細胞的表面或該質外體（細胞壁及細胞間隙的總和）獲得表現的材料，此類的材料通常藉由分泌到達此些部位，且通常可以在該植物細胞的培養基中發現。然而，在開發本發明時，已知大量的分泌的材料附著於該表面，特別是附著於該細胞壁或附著於該質外體，依據本發明可以獲得附著的材料，因而可以藉由本發明的方法提升產量，與未進行定轉子處理的方法（即，分離該分泌的表面的材料）相比，大約可以提升10倍的產量。
自依據本發明的參數最大值內選擇該定轉子的處理強度、期間及負載量，以獲得足量的該表現的材料（期望的產物）；然而，由於在能量的輸入會發生產物的汙染，必須限制該處理的強度、期間及負載量（其代表被誘導的能量，量化為熱量或比熱）。
較佳地，該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的該比熱的最大值為3千焦耳/公斤的該液態培養基/克/公升的該植物細胞的乾重（縮寫為3千焦耳/公斤/（克/公升）或3千焦耳/公斤/克/公升）；特別較佳地，該比熱可以維持較低，以進一步減少所有的殘留汙染。因此，較佳地，來自該定轉子的誘導的該比熱的最大值為2.75千焦耳/公斤/（克/公升），或更佳的一最大值為2.5千焦耳/公斤/（克/公升）、一最大值為2.25千焦耳/公斤/（克/公升）、一最大值為2千焦耳/公斤/（克/公升）、一最大值為1.75千焦耳/公斤/（克/公升）、一最大值為1.5千焦耳/公斤/（克/公升）、一最大值為1.25千焦耳/公斤/（克/公升）或一最大值為1千焦耳/公斤/（克/公升）。
依據本發明，該被誘導的熱量的可選的參數獨立於該植物的數量的任何參數。於部分實施例中，由於該定轉子獨立於該植物細胞地將能量傳遞至該細胞培養基（使該細胞培養基升溫），這是有意義的。較佳地，該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的該熱的一最大值為30千焦耳/公斤的該液態培養基（縮寫為千焦耳/公斤），較佳的一最大值為25千焦耳/公斤、一最大值為20千焦耳/公斤、一最大值為15千焦耳/公斤或一最大值為10千焦耳/公斤。
也可以調整被誘導的比熱或被誘導的熱量，例如藉由該處理的時間受限的處理時間及/或強度（及基於相同的原因，熱比容或熱容的參數）：
在本發明的方法中，該定轉子以低強度（例如低轉速）運行，可以於比較實驗中測定在具有選定參數的特定強度下誘導的特定方法的熱量（或熱容），例如藉由使已知熱容的水或另一培養基的溫度升高。當確定該方法的熱量時，可以排除或考量影響溫度的其他影響（特別是熱量損失），以於此一方式下獲得該定轉子的熱量或熱容；較佳地，於杜瓦瓶（Dewar flask）中測定該熱量或熱容。
與設備無關地，該被誘導的熱比容或該被誘導的熱容是相關的（如上所述，〝特定〞係指該植物材料的數量的可選參考）。較佳地，被誘導進入該培養基的該熱比容的一最大值為1.5千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘/克/公升的該植物細胞的乾重（縮寫為千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）或千焦耳/公斤/分鐘/克/公升）。特別較佳地，此一熱比容的一最大值為1.25 千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）、一最大值為1 千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）、一最大值為0.8千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）、一最大值為0.6千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）、一最大值為0.5千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）、一最大值為0.4千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）、一最大值為0.3千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）、一最大值為0.2千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）、一最大值為0.15千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）、一最大值為0.125千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）或一最大值為0.1千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）。與此類似地，被誘導進入該培養基的該熱容的一最大值為1.5千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘（縮寫為 千焦耳/公斤/分），較佳地，此一熱容的一最大值為1.25千焦耳/公斤/分鐘、一最大值為1千焦耳/公斤/分鐘、一最大值為0.8千焦耳/公斤/分鐘、一最大值為0.6千焦耳/公斤/分鐘、一最大值為0.5千焦耳/公斤/分鐘或一最大值為0.4千焦耳/公斤/分鐘。
該處理的強度越強，或時間越長，則可以獲得更多的材料。較佳地，（該定轉子的）該轉子的旋轉所誘導的該熱為至少1千焦耳/公斤的該液態培養基，特別較佳地為至少2千焦耳/公斤，及/或來自該定轉子的該比熱為至少0.1千焦耳/公斤的該液態培養基/克/公升的該植物細胞的乾重，特別較佳為至少0.2千焦耳/公斤/（克/公升）。
較佳地，該轉子的旋轉所誘導進入該培養基的該熱容為至少0.2千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘，較佳為至少0.4千焦耳/公斤/分鐘，及/或進入該培養基的該熱比容為至少0.02千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘/克/公升的該植物細胞的乾重，較佳為至少0.04 千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）。
該表現的材料較佳地包含蛋白質。蛋白質（特別是重組的表現的蛋白質）能夠以適當的訊息序列（signal sequence）專一性地引導至該分泌路徑（secretion pathway），因此可以引導朝向該表面或於該質外體內的濃度。較佳地，藉由本發明的方法，可以於該植物細胞的質外體中獲得該表現的材料；更佳地，該表現的材料為分泌的材料，較佳為通過該細胞膜或細胞壁所分泌的蛋白質。
依據本發明，使用一定轉子，以於該液態培養基中處理該植物細胞，以獲得該表現的材料。
一定轉子包含至少一轉子，藉由其旋轉運動對該植物細胞施予剪切力（shart force），且藉由該剪切力，該植物細胞的表面或該質外體及該細胞壁係（結構性地）鬆弛、機械性地影響或自該表面擦去或部分地去除。
該轉子相對一定子旋轉，該定子可以為一外殼或該轉子的一對應部分，該轉子可以具有切割或剪切元件，其具有邊緣或剪切表面，一般構造具有一梳狀結構（comb structure），其中，通常設置有平行該旋轉軸線的數個剪切凸起（例如，齒或尖齒）來進行剪切或切割作用。舉例而言，數個可以為2、3、4、5、6、7、8或更多的剪切凸起。
該定子可以為該轉子的對應部分，特別是對應其切割或剪切元件。可選地，類似於該轉子，該定子可以具有自己的切割或剪切元件，且例如亦具有一梳狀結構。如德國公開第10 2005 031 459 A1專利案所描述的，此一類型的構造在棒均質機（rod homogenizer）中為已知的。
在其他實施例中，如在連續式均質機（flow-through homogenizer）中常見的，該定子可以為一殼結構。舉例而言，連續式定轉子（flow-through rotor-stator）係如PCT公開第2009/062610 A1號專利案所描述。
定轉子的範例為一棒均質機或一剪切泵（shear pump），剪切泵特別常用於連續式系統。
較佳地，該轉子及定子之間存在一間隙（gap），例如至少是一或多個植物細胞的尺寸，使至少呈原生質體形式的植物細胞可以通過該轉子及該定子之間，合適的間隙尺寸為50 µm、70 µm、80 µm、100 µm、150 µm或更大，以及介於此些距離之間的任何區間，較佳地一最大值為至多500 µm或至多300 µm或至多200 µm。
如所指出的，保持該強度為低的，以使該植物細胞可以保持呈原生質體的形式，進而預防或減少要收穫的分泌的表面的材料受到細胞內部的汙染。為此，在正常的定轉子模式中，係降低該轉速，例如於實施例中，以轉速最大值為15,000轉/分鐘（revolutions per minute，簡稱為rpm），較佳為1,000～15,000轉/分鐘，可能的轉速為3,000～14,000、4,000～13,000、5,000～12,000或6,000～11,000轉/分鐘。
該植物細胞可以位於一容器，且該定轉子被引入該容器中，為此，該定轉子可以被引入具有該培養基的一容器中，此種〝分批（batch）〞構造（用於不連續的操作）特別適用於棒均質機。在較大規模上，較佳選用順流定轉子（flow-through rotor-stator）。根據本實施例，該定轉子可以具有一內部，其具有至少一入口及出口，藉此可以將該液態培養基連續性地注入該內部，此一案例的一實例為用於連續性方法的剪切泵（shear pump）。
較佳地，該定子定義出的一體積介於10立方公分～1立方公尺之間（0.01～1,000公升之間），較佳的體積介於0.1～800公升之間，或介於0.5～600公升之間，或介於1～400公升之間、介於2～200公升之間，較佳為至多是100公升的體積，特別較佳為介於0.65～50公升之間，例如介於1～40公升之間，此些體積係特別適合對植物細胞的培養基進行該處理。
較佳地，該處理的液態培養基的量為至多50000公斤，較佳為介於0.5克～50,000公斤之間，例如介於1克～25,000公斤之間、介於2課～10,000公斤之間、介於5克～5,000公斤之間、介於10克～2,500公斤之間、介於20克～1,000公斤之間、介於30克～500公斤之間、介於50課～250公斤之間、介於100克～100公斤之間、介於200克～50公斤之間、介於500克～250公斤之間、介於1～100公斤之間、介於2～50公斤或介於4～20公斤之間，此類的量為較佳用於非連續方法每一輪中的量。
較佳地，該植物細胞存在於該液態培養基的濃度為0.2～60克/公升（植物細胞的量為其乾重），於此方面，該植物細胞的較佳濃度（乾重）介於0.5～50克/公升之間、介於1～40克/公升之間、介於2～30克/公升之間、介於4～20克/公升，特別較佳為約10克/公升，例如介於5～15克/公升之間。此些植物細胞的濃度對該定轉子的處理特別地有效。
較佳地，以該定轉子處理該植物細胞2～150分鐘，於連續性方法中，此些時間指該植物細胞的平均處理時間，特別較佳的時間為3～120分鐘、5～100分鐘、8～80分鐘、10～60分鐘或特別較佳的12～40分鐘。如果培養量大，可以採用更長的定轉子處理時間，較佳的其他可能時間為1～24小時，較佳為2～20小時、3～16小時、4～12小時，以此一方式，所有的較佳處理時間係介於3分鐘～24小時之間，及所述處理時間的每個範圍之間或者實際上更長。
較佳地，該植物細胞可以培養於一懸浮培養基中，在本發明的方法中，此一懸浮液可以直接作為該液態培養基進行處理；或者，苔癬亦可以首先分離，例如分離自一固態培養基、液態培養基或懸浮培養基，接著在適合進行該定轉子處理的條件下懸浮於一水性培養基中。特別適合本發明的方法的植物為非木質的植物（non-ligneous plant），較佳的植物為藻類及苔癬，特別是苔癬植物（bryophyte）。較佳地，該苔癬植物或細胞為一苔癬，較佳為小立碗蘚（P. patens ），該苔癬植物可以為任何苔癬植物，但是較佳選自苔癬（moss）、癬（liverwort）或角蘚（hornwort），特別較佳係選自苔（Bryopsida）綱（class）或中歐葫蘆蘚（Physcomitrella）、葫蘆苔（Funaria）、泥炭蘚（Sphagnum）、角齒蘚（Ceratodon）、地錢（Marchantia）及囊果苔（Sphaerocarpos）等屬（genus），特別較佳是小立碗蘚（Physcomitrella patens）。最佳係使用來自植物組織的細胞，例如來自小立碗蘚（Physcomitrella patens ）的原絲體（protonema），來實施本發明的方法。較佳的藻類係選自綠藻，例如來自小球藻（Chlorellales）目（order），較佳來自小球藻（Chlorellaceae）科（family），更佳來自小球藻（Auxenochlorella）或綠球藻（Chlorella）等屬，特別是小綠球藻（Chlorella vulgaris ），及來自團藻（Volvocales）目，較佳來自紅球藻（Haematococcaceae）科，更佳來自紅球藻（Haematococcus）屬，特別是紅球藻（Haematococcus pluvialis ），及來自眼點藻（Eustigmatales）目，較佳來自Loboceae、Chlorobothryaceae、擬小椿藻（Pseudocharaciopsidaceae）及真眼點藻（Eustigmataceae）科，另外的較佳的植物為菸草、豆類或小扁豆，較佳地，該植物為一水生植物，例如來自青萍（Lemna）、浮萍（Spirodela）、疏根萍（Landoltia）、微萍（Wolffia）或扁無根萍（Wolffiella）等屬。
植物細胞構成本發明的主題，本文所述的〝植物細胞〞可以指分離的細胞、個體化的細胞，亦可以指植物組織的一細胞或來自植物組織的細胞，較佳為一組織選自由癒傷組織（callus）、原絲體（protonema）、韌皮部（phloem）、木質部（xylem）、葉肉組織（mesophyll）、莖、葉、葉狀體（thallus）、直立原絲體（chloronema）、假根（rhizoid）或配子囊柄（gametophore）或植物有機體中的一細胞。
本發明的方法中，該培養基較佳具有一生理的pH值，特別是為了如上所述之保存該原生質體（位於該細胞壁內側的細胞組分，特別是來自該細胞膜）、為了避免於該質外體中/位於該細胞的表面的表面的材料受到汙染，該液態培養基的pH值較佳介於3.5～8.5之間，特別較佳介於4～8之間，或介於4.5～7之間，或介於5～6.5之間，特別是介於5.5～6之間，或前述數值的組合，例如介於5～8之間。
再次地，為了保存該原生質體，該液態培養基的滲透壓較佳為生理性的，特別是為了避免膨脹應力（swelling stress），例如當該滲透壓太低時。如果合適，可以提供該滲透壓（osmolarity）的一上限值，以避免滲透收縮應力（osmotic shrinking stress）。較佳地，該培養基具有一滲透壓至少為0.1 osmol/L，或較佳地至少為0.150 osmol/L。該滲透壓能夠以溶解例如鹽類或其他培養基成分（如糖或糖醇）來調整；較佳地，例如鈉離子（Na+ ）及/或鉀離子（K+ ）的一鹼金屬鹽（alkali metal salt）；較佳地，例如氯離子（Cl- ）、氟離子（F‑ ）或碘離子（I‑ ）的一鹵素、一磷酸根（phosphate）或一醋酸根（acetate）可以作為該陰離子（anion），如三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，簡稱為Tris）等緩衝成分也是可能的。
此外，為了進一步保存該原生質體，可以將界面活性劑聚合物加入該定轉子處理的液態培養基中，界面活性劑聚合物為例如PCT公開第2013/156504 A1專利案所述者，且較佳包含乳化劑等不帶電聚合物，例如聚烷二醇（polyalkylglycol），特別是聚乙二醇（polyethyleneglycol）。特別地，該聚合物為非離子型水溶性界面活性劑聚合物，其較佳不會使蛋白質變性，實例為選自由聚烷二醇、聚山梨醇酯（polysorbate）或聚乙烯吡咯烷酮（poly乙烯吡咯烷酮）、聚乙烯醇（polyvinylalcohol）等聚醚（polyether）、羥丙基纖維素（hydroxypropylcellulose）、羥丙基甲基纖維素（hydroxypropylmethylcellulose）、羧甲基纖維素（carboxymethylcellulose）或羥乙基纖維素（hydroxyethylcellulose）、乙烯吡咯烷酮醋酸乙烯酯共聚物（vinylpyrrolidone vinylacetate copolymer，copovidone）、聚醋酸乙烯酯、部分水解的聚乙烯醇、聚乙烯醇─聚乙二醇共聚物等水溶性纖維素衍生物（water-soluble cellulose derivative）及其混合物。其他的可能性為聚山梨醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯（polyoxyethylene sorbitan monolaurate）、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯（polyoxyethylene sorbitan monooleate）、聚氧乙烯山梨醇單棕櫚酸酯（polyoxyethylene sorbitan monopalmitate）、聚氧乙烯山梨醇單硬脂酸酯（polyoxyethylene sorbitan monostearate）、聚氧乙烯山梨醇三硬脂酸酯（polyoxyethylene sorbitan tristearate），較佳為聚山梨醇酯80（polysorbate 80，polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate，Tween® 80）、硬脂酸聚烴氧(40)酯（polyoxyethylene (40) stearate）。存在於該培養基中的界面活性劑聚合物較佳的濃度為至少0.05 wt%， 特別較佳為至少0.08 wt%、至少0.1 wt%或至少1.5 wt%，該界面活性劑聚合物的分子量，例如PEG及其他，較佳為至少500 Da，特別較佳為至少1,000 Da、至少1,500 Da、至少2,000 Da、至少3,000 Da、至少4,000 Da、至少6,000 Da、至少8,000 Da、至少10,000 Da、至少20,000 Da或至少30,000 Da，特別較佳地，該分子量介於500～2,000,000 Da之間，較佳介於1,000～200,000 Da之間或介於1,200～80,000 Da之間。
該液態培養基較佳為水性的，特別是水或含水的混合液，其可以與細胞相容。特別是，其可以為植物細胞的培養基，只要該植物未先與其分離即可。
較佳地，在以該定轉子處理該植物細胞之前，該表現的材料即已經表現，使該植物細胞聚集在該表面上或該質外體中。於此方面，該植物細胞可以在例如眾所周知的培養基中，在植物的生長條件（營養培養基、光線）下培養及/或允許生長（參照，例如Frank et al. Plant Biol 7, (2005):220–227）。表現或培養較佳進行13分鐘～1個月（30天）或更長，例如2個月（60天），例如1小時～22天，或5小時～15天，例如10小時～7天或20小時～3天。在定期移除細胞以獲得該產物（表現的材料）的連續性細胞培養中，此些時間範圍或最短時間可以對應培養中細胞的平均時間。
應避免會破壞或裂解或均質化該原生質體的其他方法，該細胞壁較佳未被裂解，特別是未被酵素性裂解及/或未被化學性及/或未被滲透性及/或未使用超音波裂解。較佳地，除本發明的定轉子處理之外，該細胞壁應保持未接觸或完整，特別是，該細胞膜（原生質體）應維持完整；因此在本發明的方法中，該細胞的活力（vitality）沒有特殊作用，惟應避免該液態培養基受到該細胞內部組分的汙染，特別是受到細胞質的汙染。
以下將透過附圖及實例更詳細地描述本發明，惟不將本發明限制於此些實施例。
實例：
實例1：以Turrax棒均質機及剪切泵測定能量輸入
用於水性介質中的能量輸入的參數係以溫度作為可測量的變量（measurable variable），針對T25-S25N-18G Turrax棒均質機（IKA Staufen），將1.5公升的水於杜瓦瓶（Dewar flask）中，以10,000轉/分鐘分散30分鐘，並測量溫度分布（temperature profile），在該實驗期間的室溫為介於20.5～20.7℃之間，以該熱比容（4,190 J kg-1 K-1 ）計算能量輸入數據，能量輸入數據可以與文獻（Orellana-Escobedo et al., Plant cell Rep. 2015, 34(3), 425-433）比較，並以19,000轉/分鐘的轉速獲得。
針對該剪切泵（shear pump FSP 712，Fristam Hamburg），使用強化PVC管自Nalgene容器以2,800轉/分鐘的速度循環輸送50公升的水，於該Nalgene容器中的溫度測量係使用一溫度感測器（G002.1 precision thermometer, Carl Roth ）進行，實驗係於19℃的恆溫室中進行。於此一實驗設定中忽略向環境的熱量損失，以該熱比容（4,190 J kg-1 K-1 ）計算能量輸入數據。
實例2：苔癬培養物的生產
在生物反應器（WaveTM Rocking Motion bioreactor，Wave200, Ge Healthcare）上的200公升單次使用的生物反應袋（Cellbag，GE Healthcare）中進行苔癬生產菌株的無機培養（axenic culture）3～4週，其培養參數為：震盪頻率（shaking frequency）為19～25轉/分鐘、震盪角度（shaking angle）為9°、溫度為24～26℃、氣體流量（gas flow）為2公升/分鐘，且空氣供應中濃化有2%二氧化碳。照明條件為4個LED模塊設置於該生物反應袋的上方（參考號120268～120282，Infors AG），並帶有〝暖白色（warm white）〝的LED，苔癬的培養係於24小時的光照環境中進行。使用SM07﹝100 mM氯化鈉（NaCl）、6.6 mM氯化鉀（KCl）、2.0 mM硫酸鎂（MgSO4 ‧7H2 O）、1.8 mM磷酸二氫鉀（KH2 PO4 ）、20.4 mM硝酸鈣（Ca(NO3 )2 ‧4H2 O）、0.05 mM乙二胺四乙酸鐵鈉（Fe Na-EDTA）、4.9mM MES、0.1%（w/v）PEG4000、100.26 µM硼酸（H3 BO3 ）、0.11 µM氯化鈷（CoCl2 ‧6H2 O）、0.1 µM硫酸銅（CuSO4 ‧5H2 O）、5 µM碘化鉀（KI）、85.39 µM氯化錳（MnCl2 ‧4H2 O）、1.03 µM鉬酸鈉（Na2 MoO4 ‧2H2 O）、0.11 mM氯化鎳（NiCl2 ‧6H2 O）、0.04亞硒酸鈉（Na2 SeO3 ‧5H2 O）、0.039醋酸鋅（Zn-acetate‧2H2 O），加入1000倍Nitsch維生素（Nitsch維生素混合物，Duchefa，參見製造商規格）﹞作為該礦物鹽培養基，以WAVEPOD I及Pump20（GE Healthcare）自動添加0.25 M硫酸（H2 SO4 ）及0.25 M氫氧化鈉（NaOH），以使pH值為5～6，重組的α-半乳糖苷酶（recombinant α-galactosidase，簡稱為aGal或α-Gal A）係依PCT公開第2016/146760號專利案進行表現（〝moss-aGal〞）。
實例3：結合苔癬的產物的釋放及分析方法
為了分析結合苔癬的產物的釋放的時間分布（temporal profile），獲得自實例2的培養物在不同能量輸入下曝露於該T25-S25N-18G Turrax棒均質機及該剪切泵FSP 712中，以moss-aGal ELISA（Biogenes/Germany）測定釋放的產物的cPL 產物的濃度（cPL），以苔癬細胞的顯微鏡影像分析測定細胞消化作用的程度，顯微鏡：Axiovert 200 oper Stemi SV11，具有AxioCam照相機、AxioSoft軟體及KL 1500 LCD冷光源（Carl Zeiss）。以100%功率對50毫升進行超音波消化作用（探針：UW2070，Bandelin；放大器：HD 2070，Bandelin）20分鐘的顯微鏡分析，可以進行顯微鏡影像進行總消化的比較。在分子水平上，使用西方墨點法對該釋放的產物及該胞內指標蛋白質Rubisco進行定性分析，初級抗體為抗aGal抗體（H00002717-D01P，abnova）及抗Rubisco抗體（AS03037，Agrisera），且二級抗體為抗兔HRP抗體（abcam，AS03037。
為了分析釋放的（cPL）及可釋放的結合苔癬的產物（cPX）的關係，以球磨機（鋼球：RB-3/G20W，Schleer；球磨機：MM300，Retsch）對未處理的培養物進行細胞消化作用，在分離該細胞殘渣之後，使用ELISA（Biogenes）測定該產物的濃度，於此方面，分析表現至該質外體空隙（apoplastic void）的aGal（α-半乳糖苷酶，亦稱為〝moss-aGal〞）。
實例4：結果及討論
藉由溫度測量，確定於一培養機（公斤）中的二種不同的均質機─T25-S25N-18G Turrax棒均質機及FSP 712剪切泵─的能量輸入（熱量，單位為千焦耳/公斤，公斤係相對於該液態培養基）（第1～5圖）。於此方面，設定該均質機為低轉速，以產生低熱容（單位為千焦耳/公斤/分鐘），以此一方式確定依特定時間段（0～60分鐘）內的總熱量。於此方面，根據所測量的溫度，使用對水的比熱係數（4.182千焦耳/公斤×K）確定水中的能量輸入，於此方面，計算相對於該植物部分的乾重（第4～5圖）的熱量（第1～3圖）或比熱。
第3、5圖顯示該期望的蛋白質（來自苔癬的重組的aGal，〝moss-aGal〞）的產物釋放，這些蛋白質沉積於該表面或於該質外體中，且隨著處理的增加，釋放量也有所增加。
在比對實驗中，以較高的熱容，實際上於19,000轉/分鐘的轉速下運行該Turrax 棒均質機（第4c圖，12～13），相較於在10,000轉/分鐘的保護處理（conservational treatment）下，該熱容約為100倍以上（比較第4a、4c圖），在較高熱容下的運行快速地導致產物釋放，但也會破壞該細胞（原生質體），因此胞外產物被該細胞內部的成分所污染，此些影響在1分鐘之後即已經發生。
第6圖顯示來自該胞外蛋白質（moss-aGal）及來自該胞內蛋白質Rubisco的產物釋放的品質，Rubisco係以高濃度存在於植物細胞中，因此被認定是對細胞內容物的逸出為高度敏感的指標。於生理鹽水中進行的實驗中，在高於32.9千焦耳/公斤的能量（熱量）輸入下，可以觀察到Rubisco的釋放增加；於去礦質水中的比較實驗中，Rubisco的汙染發生得更快，自約10千焦耳/公斤，這是因為除了來自該均質機的剪切應力外，還產生了滲透作用（osmolytic effect），不同的熱量（能量輸入）可以使用該處理時間進行控制。
處理後的細胞複合物的顯微鏡分析反映此些結果。第7圖顯示於去礦質水中以該Ultraturrax定轉子進行處理之後的結果；第8圖為於生理條件（20 mM Tris緩衝液、100 mM氯化鈉，pH＝7）下以該Ultraturrax定轉子進行處理之後的結果；第9圖顯示於生理條件下以該剪切泵進行處理之後的細胞複合物。隨著處理時間（熱量）的增加，可能由被破壞的細胞所形成的顆粒的數量也增加，自約30千焦耳/公斤，增加的細胞消化作用提升。藉由比較的方式，第10圖顯示於去礦質水中以該剪切泵進行的實驗，此處，可比較的顆粒於約20千焦耳/公斤即已經出現。
藉由與第7～10圖進行比較，第11圖顯示使用超音波進行細胞消化作用，該細胞在約1分鐘之後失去其完整性。
如此顯示，一方面，每單位時間下的能量輸入（該定轉子的旋轉的強度；熱容）應該被限制，且另一方面，在此處實驗中，絕對能量輸入（熱量）藉由該處理時間而被控制，此參數可能包含或與該生物質（乾燥生物質，TBM）有關。保護方法的適當數字，其盡可能地釋放較多的被吸收的或與質外體結合的產物，以確保該原生質體維持完整，該適當數字的最大值為3千焦耳/公斤/（克/公升）乾重，及最大值為1.5千焦耳/公斤/分鐘/（克/公升）乾重；或者，一最大值為30千焦耳/公斤，及最大值為1.5千焦耳/公斤/分鐘。此類低熱容的可能處理時間為2～150分鐘─具體取決於旋轉的強度，通常比目前所使用的短而密集的處理時間更長。
無
［第1a圖］    以T25 Ultra Turrax棒均質機（IKA/Staufen）測定水中的能量輸入─於10,000轉/分鐘的一轉速下，於1.5公升的水中的溫度分布圖。 ［第1b圖］    以T25 Ultra Turrax棒均質機（IKA/Staufen）測定水中的能量輸入─計算出的能量輸入（千焦耳）。 ［第1c圖］    以T25 Ultra Turrax棒均質機（IKA/Staufen）測定水中的能量輸入─計算出的能量輸入（千焦耳/公斤）。 ［第2a圖］    以FSP712VC-2.2kW-FU剪切泵均質機（Fristram/Hamburg）測定水中的能量輸入─於2,800轉/分鐘的一轉速下，於50公升的水中的溫度分布圖。 ［第2b圖］    以FSP712VC-2.2kW-FU剪切泵均質機（Fristram/Hamburg）測定水中的能量輸入─計算出的能量輸入（千焦耳）。 ［第2c圖］    以FSP712VC-2.2kW-FU剪切泵均質機（Fristram/Hamburg）測定水中的能量輸入─計算出的能量輸入（千焦耳/公斤）。 ［第3圖］  在以該剪切泵（虛線）及T25 Ultra Turrax棒均質機（實線）進行處理的期間，結合生物質（biomass）的產物（moss-aGal）的釋放百分比。該反應器培養物的剪切泵處理於50公升的體積下進行，該反應器培養物的T25 Turrax棒均質機的處理於0.65公升的體積下進行。 ［第4a圖］    使用該T25 Ultra Turrax棒均質機的比能量輸入（10克/公升的乾燥生物質）。 ［第4b圖］    使用該剪切泵的比能量輸入（10克/公升的乾燥生物質）。 ［第4c圖］    比較實例T25 Ultra Turrax棒均質機於19,000轉/分鐘下（1克/公升的乾燥生物質）的比能量輸入。 ［第5圖］  在以該剪切泵（虛線）及T25 Ultra Turrax棒均質機（實線）進行處理的期間，結合生物質的產物（moss-aGal）的釋放百分比。該反應器培養物的剪切泵處理於50公升的體積下進行，該反應器培養物的T25 Turrax棒均質機的處理於0.65公升的體積下進行。生物質：9.2克/公升（剪切泵）；8.2克/公升（T25 Ultra Turrax棒均質機）。 ［第6圖］  比較胞內指標蛋白質（Rubisco大次單元）及產物釋放（moss-aGal）的西方墨點法，在含鹽介質（例如20 mM Tris緩衝液、100 mM氯化鈉，pH＝7）的胞內蛋白質，最低的輸入能量可以檢測到32.9千焦耳/公斤，在滲透脅迫條件（去礦質水）下，可以檢測到的能量約為10千焦耳/公斤，目標蛋白質含量（Moss-aGal）於含鹽介質中及在滲透脅迫條件下，隨該輸入能量的變化而增加。 ［第7圖］  於去礦質水中的T25程序的顯微鏡分析─在高達16.5千焦耳/公斤的能量輸入下，該苔癬細胞仍維持其完整性；在32.9千焦耳/公斤的能量輸入下，仍存在細胞的完整性，但清楚地存在更多的顆粒，顯示開始進行細胞消化作用。 ［第8圖］  於含鹽緩衝液（20 mM Tris緩衝液、100 mM氯化鈉，pH＝7）中的T25程序的顯微鏡分析─在高達16.5千焦耳/公斤的能量輸入下，該苔癬 細胞仍維持其完整性；在32.9千焦耳/公斤的能量輸入下，仍存在細胞的完整性，但清楚地存在更多的顆粒，顯示開始進行細胞消化作用。 ［第9圖］  於含鹽培養基（反應器培養物）中的剪切泵程序的顯微鏡分析─在高達18.41千焦耳/公斤的能量輸入下，該苔癬細胞仍維持其完整性；在27.20千焦耳/公斤的能量輸入下，仍存在細胞的完整性，但清楚地存在更多的顆粒，顯示開始進行細胞消化作用。 ［第10圖］    於去礦質水中的剪切泵程序的顯微鏡分析─在高達9.62千焦耳/公斤的能量輸入下，該苔癬細胞仍維持其完整性；在18.41千焦耳/公斤的能量輸入下，仍存在細胞的完整性，但清楚地存在更多的顆粒，顯示開始進行細胞消化作用。 ［第11圖］    於超音波過程中苔癬細胞的顯微鏡分析，作為細胞消化作用的比較影像。在短時間（超音波處理1分鐘）之後，該細胞即已失去其完整性，在3分鐘之後，只可以觀察到細胞碎片及空細胞殘渣（100%於50毫升樣品中）。 ［第12a圖］   比較實例：於轉速為19,000轉/分鐘的高能量下，以T25 Ultra Turrax棒均質機（IKA/Staufen）測定水中的能量輸入─於1公升的水中的溫度分布圖。 ［第12b圖］  比較實例：於轉速為19,000轉/分鐘的高能量下，以T25 Ultra Turrax棒均質機（IKA/Staufen）測定水中的能量輸入─計算出的能量輸入（千焦耳）。 ［第12c圖］   比較實例：於轉速為19,000轉/分鐘的高能量下，以T25 Ultra Turrax棒均質機（IKA/Staufen）測定水中的能量輸入─計算出的能量輸入（千焦耳/公斤）。 ［第13圖］    比較實例：以19,000轉/分鐘更快速地產物釋放，特別是高達7千焦耳/公斤的能量輸入。超過84千焦耳/公斤的能量輸入，由於高溫及剪切應力使產物損失。

Claims (15)

  1. 一種用以自植物細胞的表面或該質外體分離表現的材料的方法，其中，該植物細胞係於一液態培養基中被以一定轉子處理，其中，該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的該比熱具有一最大值為3千焦耳/公斤的該培養基/克/公升的該植物細胞的乾重，且被誘導進入該培養基的該熱比容具有一最大值為1.5千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘/克/公升的該植物細胞的乾重。
  2. 如請求項1之方法，其特徵在於該表現的材料位於該植物細胞的該質外體中。
  3. 如請求項2之方法，其特徵在於該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的該熱為至少1千焦耳/公斤的該液態培養基，及/或來自該定轉子的該比熱為至少0.1千焦耳/公斤的該液態培養基/克/公升的該植物細胞的乾重。
  4. 如請求項1～3中任一項的方法，其特徵在於該轉子的旋轉所誘導進入該培養基的該熱容為至少0.2千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘，及/或進入該培養基的該熱比容為至少0.02千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘/克/公升的該植物細胞的乾重。
  5. 如請求項1～4中任一項的方法，其特徵在於該表現的材料包含蛋白質，及/或該表現的材料為分泌的材料，較佳地為透過該細胞膜分泌的蛋白質。
  6. 如請求項1～5中任一項的方法，其特徵在於該定轉子被誘導進入具有該培養基的一容器。
  7. 如請求項1～6中任一項的方法，其特徵在於該定轉子具有一內部，其具有至少一入口及出口，該液態培養基經由該至少一入口及出口被連續地注入該內部。
  8. 如請求項1～7中任一項的方法，其特徵在於該定子定義出一體積為10立方公分～1立方公尺，及/或被處理的液態培養基的該量達50公斤，較佳為0.5克～50公斤。
  9. 如請求項1～8中任一項的方法，其特徵在於該植物細胞的於該液態培養基的濃度為0.2～60克/公升（植物細胞的質量為乾重）。
  10. 如請求項1～9中任一項的方法，其特徵在於該植物細胞為苔癬細胞，較佳為小立碗蘚細胞。
  11. 如請求項1～10中任一項的方法，其特徵在於該轉子被操控的最大旋轉速率為15,000轉/分鐘，較佳為1,000～15,000轉/分鐘。
  12. 如請求項1～11中任一項的方法，其特徵在於該定轉子為一棒均質機或一剪切泵，及/或其中，該定子具有一梳狀結構。
  13. 如請求項1～12中任一項的方法，其特徵在於該轉子的旋轉所誘導的來自該定轉子的該熱具有一最大值為30千焦耳/公斤的該液態培養基，且被誘導進入該培養基的該熱容具有一最大值為1.5千焦耳/公斤的該液態培養基/分鐘。
  14. 如請求項1～13中任一項的方法，其特徵在於該培養基具有一pH值為5～8，及/或一滲透壓為至少0.1 osmol/公升。
  15. 如請求項1～14中任一項的方法，其特徵在於以該定轉子處理該植物細胞2～150分鐘。
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