TW202112385A - 痘苗病毒致炎兔皮提取物治療癌症的用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物的治療用途。更具體而言，本發明涉及所述提取物預防或治療癌症的用途。本發明還涉及所述提取物在患者中刺激體細胞分泌細胞因數的用途。另外，本發明還涉及一種藥物組合及其用於預防或治療癌症的用途，所述藥物組合包含作為第一抗癌藥物的所述提取物和第二抗癌藥物。

Description

痘苗病毒致炎兔皮提取物治療癌症的用途

本發明屬於醫藥領域。具體而言，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物的新治療用途。更具體而言，本發明涉及所述提取物用於預防或治療癌症的用途。本發明還涉及所述提取物在患者中刺激體細胞分泌細胞因數的用途。另外，本發明還涉及一種藥物組合及其用於預防或治療癌症的用途，所述藥物組合包含所述提取物和另外的抗癌藥物。

無論在發達國家還是在發展中國家，癌症都是死亡率最高的疾病，並且其死亡率和發病率仍在不斷增高，因此市場上對於抗腫瘤藥物有著巨大的需求。 已經開發的抗腫瘤藥物可以通過不同的途徑殺滅或抑制癌細胞來達到治療惡性腫瘤的目的。例如，抗腫瘤藥物可以直接抑制癌細胞分裂(例如細胞毒性藥物)、啟動免疫系統來識別和清除癌細胞(例如細胞免疫療法、抗體療法、細胞因數療法等)、抑制腫瘤生長所需的血管生成(例如血管生成抑制劑)、靶向腫瘤相關的細胞轉導信號(例如抑制酪氨基酸激酶活性、抑制法尼基轉移酶活性、抑制MAPK信號轉導通路等)等。 在中國，目前被使用的大多數化療藥物屬於細胞毒類藥物，毒副作用大。尋找安全有效和毒性副作用小的抗腫瘤藥物已成為科學家和臨床醫學工作者面臨的重大挑戰。 近年來，越來越多的免疫療法得到臨床應用和推廣，而細胞因數療法是免疫療法的重要類別之一(見李川等，國際腫瘤學雜誌，第40卷第8期，2013年8月)。細胞因數(例如干擾素IFN、白細胞介素IL和腫瘤壞死因數TNF)可以在腫瘤位置處直接刺激免疫效應細胞和基質細胞從而增強細胞毒效應細胞識別腫瘤細胞，因此它們所具有的免疫調節功能使之可以作為藥物用於啟動針對癌細胞的免疫應答。此外，刺激免疫細胞釋放這些細胞因數的藥物也預期能夠啟動抗腫瘤的免疫反應。 此外，尋求包含兩種或以上的不同抗腫瘤藥的聯合療法將會是有利的，因為這樣的聯合療法可以產生治療癌症的協同效果並且有可能降低抗癌治療的毒性和副作用。 本文所述的"痘苗病毒致炎兔皮提取物"是指從接種痘苗病毒後致炎的兔的皮膚中提取的活性物質，如中國發明專利ZL98103220.6 (中國專利公告號：CN1055249C)中所述，該專利的全部內容通過引用結合到本文中。這種痘苗病毒致炎兔皮提取物可市售獲得，商品名為立再適，由威世藥業(如皋)有限公司生產。痘苗病毒致炎兔皮提取物及其藥理作用還被描述於WO2010/054531中，該申請的全部內容通過引用結合到本文中。此外，PCT/CN2019/083027描述了痘苗病毒致炎兔皮提取物用於治療造血系統損傷的用途，該申請的全部內容通過引用結合到本文中。

本發明目的包括提供用於預防、緩解或治療癌症或腫瘤的藥物，以及能夠刺激體細胞分泌細胞因數的藥物。此外，本發明的目的還包括提供一種具有協同效果的藥物組合及其用於治療癌症的用途，該治療癌症的藥物組合的毒性和副作用都顯著降低。 本發明的技術問題之一通過提供痘苗病毒致炎兔皮提取物，優選立再適來解決。此外，本發明的技術問題之一通過提供所述提取物與另一種抗癌藥物例如細胞毒性藥物(例如作用於DNA化學結構的藥物或者影響核酸合成的藥物)的組合來解決。 總體而言，發明人發現，痘苗病毒致炎兔皮提取物能夠有效預防、治療或緩解癌症或腫瘤。此外，所述提取物聯合其他抗癌藥物能夠起到協同的治療作用，並且能夠降低所述其他抗癌藥物的毒性和副作用。這樣的效果對於細胞毒藥物這一類抗腫瘤藥是特別有利的，因為本領域中一直渴望減少該類藥物的毒性和副作用，例如在維持或甚至提高療效的前提下減少其用量。發明人預料不到地發現，所述提取物能夠與細胞毒性藥物一起產生抗腫瘤的協同作用，並且顯著減少細胞毒性藥物的副作用。 本領域技術人員知曉，一種抗癌藥物與放療能產生協同作用並不代表它能夠與另一種抗癌藥物也會產生協同作用。放療與化療之間具有明顯不同的癌症治療機理。放療的治療本質是通過用各種不同能量的射線照射腫瘤，使癌細胞的生物分子結構改變，以在局部達到縮小腫瘤的目的。放療的副作用以局部反應為主，例如皮膚紅腫、咽喉腫痛、咽喉乾等。化療的作用原理則通常是阻斷癌細胞的細胞分裂或促使癌細胞從機體清除，通常是全身給藥。化療的副作用則通常是骨髓抑制、胃腸道反應等全身反應。 使用化療例如細胞毒性藥物治療癌症時，藥物的副作用通常會導致患者體重減輕。因此，體重是衡量藥物毒性和副作用的綜合指標。另外，長期大量地使用化療藥物會抑制胸腺和脾臟的免疫功能，機體免疫系統功能處於低下狀態，易導致腫瘤的轉移和復發。發明人預料不到地發現，本發明提取物與化療藥物例如細胞毒性藥物一起使用時能夠緩解或防止所述藥物所造成的受試對象體重減少和脾臟指數降低。因此，本發明也涉及上述提取物在這方面的用途。 在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患者中預防或治療癌症的藥物中的用途。在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物，其用於預防或治療癌症。在一個方面，本發明涉及一種預防或治療癌症的方法，所述方法包括將治療有效量的痘苗病毒致炎兔皮提取物給予有需要的患者。 在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患者中刺激體細胞分泌細胞因數的藥物中的用途。在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物，其用於在患者中刺激體細胞分泌細胞因數。在一個方面，本發明涉及一種在患者中刺激體細胞分泌細胞因數的方法，所述方法包括將治療有效量的痘苗病毒致炎兔皮提取物給予有需要的患者。 在一個方面，本發明涉及一種用於治療癌症的藥物組合，所述藥物組合包含作為第一抗癌藥物的痘苗病毒致炎兔皮提取物和第二抗癌藥物。所述第二抗癌藥物不同於所述第一抗癌藥物。 在一個方面，本發明涉及作為第一抗癌藥物的痘苗病毒致炎兔皮提取物和第二抗癌藥物在製備用於在患者中預防或治療癌症的藥物中的用途。在一方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物(第一抗癌藥物)，其用於與抗癌藥物(第二抗癌藥物)聯合用於預防或治療患者中的癌症。在一個方面，本發明涉及一種預防或治療癌症的方法，所述方法包括將治療有效量的作為第一抗癌藥物的痘苗病毒致炎兔皮提取物和第二抗癌藥物給予有需要的患者。在所述方面，痘苗病毒致炎兔皮提取物(第一抗癌藥物)可與另一種抗癌藥物(第二抗癌藥物)同時、分開或序貫地施用。所述第二抗癌藥物不同於所述第一抗癌藥物。在該方面，第二抗癌藥物可為環磷醯胺或5-氟尿嘧啶。 在一個方面，本發明涉及一種藥物組合物，其包含痘苗病毒致炎兔皮提取物和任選的藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑。在本發明的一個方面，所述藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑是將藥物配製成口服製劑或注射劑的那些。在一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物配被製成口服製劑或注射劑，優選肌肉注射劑、腹膜內注射劑、腹腔注射劑、皮下注射劑或靜脈注射劑。在一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物是立再適。所述藥物組合物還可包含第二抗癌藥物。 本文所述“癌症”可以包括但不限於新生瘤、腫瘤、轉移瘤或特徵為不受控的患者體細胞生長的任何疾病或障礙。癌症可為原發性或轉移性癌症。另外，癌症可包括實體瘤和血液系統惡性腫瘤例如白血病和淋巴瘤。癌症的實例包括肝癌、肺癌、宮頸癌、膽管癌、膀胱癌、腦癌、骨癌、乳腺癌、頭頸癌、結腸直腸癌、大腸癌、胃癌、食道癌、膽癌、肝細胞癌、腎癌、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、口腔癌、胰腺癌、卵巢癌、輸尿管癌、垂體腺瘤、尿道癌、前列腺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、子宮內膜癌、白血病、淋巴癌、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、尤因肉瘤、軟組織肉瘤、神經膠質瘤、皮膚癌或黑色素瘤。在本發明中，癌症優選肝癌，例如肝細胞癌；肺癌，例如小細胞肺癌或非小細胞肺癌；或宮頸癌。 本文所述“細胞因數”是指由免疫細胞(例如單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞等)和某些非免疫細胞(例如內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等)經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的蛋白質。細胞因數可以包括白細胞介素(IL)和干擾素(IFN)。本發明涉及的細胞因數通常是指與癌症治療相關的細胞因數，包括IFN，例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ；和IL，例如IL-2、IL-4、IL-12。優選地，細胞因數選自IL-2、IFN-γ、IL-4或IL-12。 因此，分泌細胞因數的體細胞通常是指免疫細胞、內皮細胞、表皮細胞或纖維母細胞等，優選免疫細胞。免疫細胞可包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、粒細胞、肥大細胞和樹突狀細胞等，優選淋巴細胞。淋巴細胞可包括T淋巴細胞、B淋巴細胞和K淋巴細胞，其中T淋巴細胞可以是外周血淋巴細胞、淋巴結淋巴細胞和脾淋巴細胞。此外，T淋巴細胞可包括細胞毒性T細胞、輔助性T細胞和抑制性T細胞三個亞群。 本文所述“患者”可以指哺乳動物，包括伴侶動物、實驗動物、畜牧動物等。在本發明中，“患者”優選是人。 在本文中，“抗癌藥物”、“抗腫瘤藥物”和“抗癌藥物治療”等可以互換使用，是指標對患者的癌症或腫瘤實施的藥物治療。本文所述的抗癌藥物，特別是第二抗癌藥物，可以包括化學治療藥物和免疫治療藥物。或者，抗癌藥物可以包括小分子化學藥物和大分子生物藥物。優選地，抗癌藥物包括細胞毒藥物，例如作用於DNA化學結構的藥物和影響核酸合成的藥物(即抗代謝物)。 作用於DNA化學結構的藥物的實例包括烷化劑或其藥學上可接受的鹽。烷化劑可包括氮芥類或其藥學上可接受的鹽。 氮芥類藥物是β-氯乙胺類化合物的總稱，其結構可分為兩部分：烷基化部分和載體部分。烷基化部分是抗腫瘤活性的功能基團；並且載體部分主要影響藥物在體內的吸收、分佈等藥代動力學性質。氮芥類藥物可分為脂肪氮芥、芳香氮芥、氨基酸氮芥、甾體氮芥或雜環氮芥或其藥學上可接受的鹽。所述雜環氮芥可包括環磷醯胺、異環磷醯胺、4H-過氧環磷醯胺、地磷醯胺、馬磷醯胺、培磷醯胺、曲磷胺或其藥學上可接受的鹽，優選環磷醯胺。此外，脂肪氮芥的實例包括鹽酸氮芥；芳香氮芥的實例包括苯丁酸氮芥；氨基酸氮芥的實例包括美法侖；甾體氮芥的實例包括潑尼莫司汀和磷酸雌莫司汀；和雜環氮芥的實例包括嘧啶苯芥、烏拉莫司汀、胸腺嘧啶氮芥和環磷醯胺等。 影響核酸合成的藥物的實例包括胸苷酸合成酶抑制劑或其藥學上可接受的鹽。胸苷酸合成酶(TS)是由相同亞基構成的同源二聚體胞漿酶，它參與體內DNA生物合成所需的胸腺嘧啶核苷酸的起始合成過程，是該過程的限速酶。對TS活性的抑制會引起腫瘤細胞內胸腺嘧啶缺失，從而使胞內DNA合成不能正常進行，隨之產生缺陷的DNA合成、裂解以及細胞凋亡。胸苷酸合成酶抑制劑可包括嘧啶拮抗劑(嘧啶類似物)或其藥學上可接受的鹽。嘧啶拮抗劑可選自5-氟尿嘧啶、卡培他濱、替加氟、雙呋氟尿嘧啶、卡莫氟、優氟泰、氟鐵龍、氟尿苷、去氧氟尿苷或其藥學上可接受的鹽，優選5-氟尿嘧啶。 本文所述“藥學上可接受的鹽”是指通過酸堿反應使抗癌藥物活性成分形成的常規無毒鹽。例如，常規的無毒鹽包括得自無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的鹽，也包括自有機酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、撲酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、對氨基苯磺酸、2-乙醯氧基一苯甲酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙基磺酸、三氟乙酸等製備的鹽。常規的無毒鹽還包括得自無機堿的鹽，包括鋁鹽、銨鹽、鈣鹽、銅鹽、鐵鹽、亞鐵鹽、鋰鹽、鎂鹽、錳鹽、亞錳鹽、鉀鹽、鈉鹽、鋅鹽等。常規的無毒鹽還包括得自藥學上可接受的有機無毒堿的鹽，所述堿包括伯胺、仲胺和叔胺的鹽。 在本發明的一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物(優選立再適)以約0.01-約20U/kg、優選約0.05-約10U/kg、更優選約0.1-約5U/kg、更優選約0.5-約4U/kg、更優選約0.8-約3.2U/kg的量給予患者，優選人。例如，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物以選自以下的量給予患者，優選人：約0.01U/kg、約0.02U/kg、約0.05U/kg、約0.1U/kg、約0.15U/kg、約0.2U/kg約0.3U/kg、約0.4U/kg、約0.5U/kg、約0.6U/kg、約0.7U/kg、約0.8U/kg、約1U/kg、約1.5U/kg、約2U/kg、約2.5U/kg、約3U/kg、約3.5U/kg、約4U/kg、約4.5U/kg、約5U/kg、約5.5U/kg、約6U/kg、約7U/kg、約8U/kg、約9U/kg、約10U/kg、約12U/kg、約15U/kg、約20U/kg以及以這些數位為邊界的範圍。本領域技術人員知曉，對於給藥量而言，人的劑量(U/kg或者mg/kg)=小鼠的劑量(U/kg或者mg/kg)/12.3；或者人的劑量(U/kg或者mg/kg)=小鼠的劑量(U/kg或者mg/kg)×0.08(見Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Pharmacology and Toxicology, Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, Page 7, July 2005)。以上劑量可以是治療患者中癌症的有效量。在一個方面，所述提取物按上述劑量口服或注射給藥，例如肌肉注射、腹膜內注射、腹腔注射、皮下注射或靜脈注射。 在本發明一個方面，被製備的藥物包含約0.6-約1200U、優選約3-約600U、更優選約6-約300U、更優選約30-約240U、更優選約48-約192U的痘苗病毒致炎兔皮提取物。所述藥物被用於給予人，例如成人。成人的平均體重例如是60 kg(見Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Pharmacology and Toxicology, Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, Page 7, July 2005)。相應地，包含在本發明製備的藥物中的痘苗病毒致炎兔皮提取物的量例如為約0.6U、約1.2U、約3U、約3.5U、約3.6U、約6U、約9U、約12U、約15U、約18U、約21U、約30U、約36U、約40U、約45U、約50U、約55U、約60U、約65U、約70U、約80U、約90U、約100U、約110U、約120U、約130U、約140U、約150U、約160U、約180U、約190U、約200U、約220U、約250U、約280U、約300U、約350U、約400U、約450U、約500U、約600U、約1000U、約1200U，以及以這些數位為邊界的範圍。在一個方面，所述藥物被製備成口服製劑或注射劑，例如肌肉注射劑、腹膜內注射劑、腹膜內注射劑、腹腔注射劑、皮下注射劑或者靜脈注射劑。在一個方面，所述藥物或注射劑是不能分割的固定劑量。在一個方面，所述藥物或注射劑在1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之內不能分割成更小劑量。在一個方面，所述藥物或注射劑在1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之內只給藥一次。 在本發明的一個方面，每隔約6-約72小時、優選約12-約60小時、更優選約24-約48小時、更優選約24-約36小時、更優選約24小時向所述患者給予痘苗病毒致炎兔皮提取物。在一個方面，每天給予所述提取物1-3次，優選1次。在另一方面，按以下方式給予所述提取物：兩天一次，三天一次，四天一次，五天一次，六天一次，一週一次，兩週一次，或一月一次。在本發明的一個方面，向接受抗癌療法的患者給予痘苗病毒致炎兔皮提取物持續至少約24個月、至少約12個月、至少約6個月、至少約2個月、至少約1個月、至少約3周、至少約2周、至少約10天、至少約7天、至少約5天、至少約2天或至少約1天。 在本發明的一個方面，作為第一抗癌藥物的痘苗病毒致炎兔皮提取物可與其他抗癌藥物(即第二抗癌藥物)同時、分開或序貫地施用。所述提取物的劑量可以按以上所述的施用。此外，所述其他抗癌藥物或第二抗癌藥物以約0.01-約100mg/kg、約0.02-約50mg/kg、約0.03-約20mg/kg、優選約0.05-約10mg/kg、更優選約0.1-約5mg/kg、更優選約0.2-約2.5mg/kg、更優選約0.5-約2mg/kg、更優選約0.8-約1.6mg/kg的量給予患者，優選人。例如，所述抗癌藥物以選自以下的量給予患者，優選人：約0.01mg/kg、約0.02mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.2mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約1mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg、約1.5mg/kg、約1.6mg/kg、約1.7mg/kg、約1.8mg/kg、約2mg/kg、約2.5mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約8mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約50mg/kg、約60mg/kg、約70mg/kg、約80mg/kg、約90mg/kg、約100mg/kg以及以這些數位為邊界的範圍。所述其他抗癌藥物優選是細胞毒性藥物、優選作用於DNA化學結構的藥物、更優選烷化劑、更優選氮芥類、更優選雜環氮芥、更優選環磷醯胺或異環磷醯胺。或者，所述其他抗癌藥物是細胞毒性藥物、優選影響核酸合成的藥物、更優選胸苷酸合成酶抑制劑、更優選嘧啶拮抗劑、更優選5-氟尿嘧啶。 在本發明的一個方面，每隔約6-約72小時、優選約12-約60小時、更優選約24-約48小時、更優選約24-約36小時、更優選約24小時向所述患者給予所述其他抗癌藥物。在一個方面，每天給予其他抗癌藥物1-3次，優選1次。在另一方面，按以下方式給予所述其他抗癌藥物：兩天一次，三天一次，四天一次，五天一次，六天一次，一週一次，兩週一次，或一月一次。在本發明的一個方面，向接受抗癌療法的患者給予其他抗癌藥物持續至少約24個月、至少約12個月、至少約6個月、至少約2個月、至少約1個月、至少約3周、至少約2周、至少約10天、至少約7天、至少約5天、至少約2天或至少約1天。 在本發明的藥物組合中，痘苗病毒致炎兔皮提取物的含量可以如上文所定義。在本發明的藥物組合中，其他抗癌藥物或第二抗癌藥物的含量可為約0.6-約5000mg、優選約3-約600mg、更優選約6-約300mg、更優選約12-約150mg、更優選約60-約120mg、更優選約48-約96mg。例如，所述抗癌藥物的含量為：約0.6mg、約0.8mg、約1mg、約1.5mg、約3mg、約4mg、約5mg、約6mg、約8mg、約10mg、約12mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約70mg、約80mg、約90mg、約100mg、約110mg、約120mg、約130mg、約140mg、約150mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約500mg、約600mg、約800mg、約1000mg、約1500mg、約2000mg、約2500mg、約3000mg、約3500mg、約4000mg、約4500mg或約5000mg以及以這些數位為邊界的範圍。所述其他抗癌藥物優選是細胞毒性藥物、優選作用於DNA化學結構的藥物、更優選烷化劑、更優選氮芥類、更優選雜環氮芥、更優選環磷醯胺或異環磷醯胺。或者，所述其他抗癌藥物是細胞毒性藥物、優選影響核酸合成的藥物、更優選胸苷酸合成酶抑制劑、更優選嘧啶拮抗劑、更優選5-氟尿嘧啶。在一個方面，所述藥物被製備成注射劑，例如肌肉注射劑、腹膜內注射劑、、腹腔注射劑、皮下注射劑或者靜脈注射劑。在一個方面，所述藥物或注射劑是不能分割的固定劑量。在一個方面，所述藥物或注射劑在1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之內不能分割成更小劑量。在一個方面，所述藥物或注射劑在1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之內只給藥一次。 本文所述的“藥物組合”與“聯合藥物”互換使用，是指包含兩種或以上的不同抗癌藥物，用於治療預防或治療癌症或腫瘤。本發明的藥物組合可以呈藥盒的形式，例如用於治療癌症的藥盒。例如，所述藥盒包含第一組合物和第二組合物，其中第一組合物包含本發明的痘苗病毒致炎兔皮提取物作為第一抗癌藥物並且第二組合物包含本文所述的其他抗癌藥作為第二抗癌藥物。或者，所述藥盒包含第一抗癌藥物和第二抗癌藥物，其中第一抗癌藥物為本發明的提取物並且第二抗癌藥物為本文所述的其他抗癌藥。在一個方案中，所述第一和第二組合物(或第一和第二抗癌藥物)可以分開包裝在相同或不同的容器內。在一個方案中，所述藥盒可包含標籤或說明書，說明第一組合物與第二組合物(或第一抗癌藥物與第二抗癌藥物)聯合施用以治療癌症。 在痘苗病毒致炎兔皮提取物單獨或與其他抗癌藥物聯合使用的實施方案中，所述提取物可以是通過以下方式對患者實現治療：直接抑制腫瘤細胞增殖、通過刺激體細胞(優選免疫細胞、更優選淋巴細胞)分泌細胞因數(優選IFN或IL，更優選IFN-γ、IL-2、IL-4或IL-12)、促進腫瘤細胞的細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的生長、增強患者中對抗腫瘤細胞的免疫功能、降低腫瘤細胞的活力、降低腫瘤細胞的集落形成能力、誘導腫瘤細胞G2/M細胞週期停滯(例如通過降低細胞週期蛋白A2、細胞週期蛋白B1和/或CDK1的表達水準)、在腫瘤細胞中增加Bax表達和/或降低Bcl-2水準、啟動腫瘤細胞的凋亡信號通路(例如通過增加細胞色素C、胱天蛋白酶-3、裂解的胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9和/或p53的表達水準)或它們的組合。 因此，在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備藥物中的用途，所述藥物用於直接抑制腫瘤細胞增殖、刺激體細胞(優選免疫細胞、更優選淋巴細胞)分泌細胞因數(優選IFN或IL，更優選IFN-γ、IL-2、IL-4或IL-12)、促進腫瘤細胞的細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的生長、增強患者中對抗腫瘤細胞的免疫功能、降低腫瘤細胞的活力、降低腫瘤細胞的集落形成能力、誘導腫瘤細胞G2/M細胞週期停滯(例如通過降低細胞週期蛋白A2、細胞週期蛋白B1和/或CDK1的表達水準)、在腫瘤細胞中增加Bax表達和/或降低Bcl-2水準、啟動腫瘤細胞的凋亡信號通路(例如通過增加細胞色素C、胱天蛋白酶-3、裂解的胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9和/或p53的表達水準)或它們的組合。在該方面中，所述藥物可以是抗癌藥物。在一個方面中，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物，其用於直接抑制腫瘤細胞增殖、通過刺激體細胞(優選免疫細胞、更優選淋巴細胞)分泌細胞因數(優選IFN或IL，更優選IFN-γ、IL-2、IL-4或IL-12)、促進腫瘤細胞的細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的生長、增強患者中對抗腫瘤細胞的免疫功能、降低腫瘤細胞的活力、降低腫瘤細胞的集落形成能力、誘導腫瘤細胞G2/M細胞週期停滯(例如通過降低細胞週期蛋白A2、細胞週期蛋白B1和/或CDK1的表達水準)、在腫瘤細胞中增加Bax表達和/或降低Bcl-2水準、啟動腫瘤細胞的凋亡信號通路(例如通過增加細胞色素C、胱天蛋白酶-3、裂解的胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9和/或p53的表達水準)或它們的組合。在一方面，本發明涉及直接抑制腫瘤細胞增殖、通過刺激體細胞(優選免疫細胞、更優選淋巴細胞)分泌細胞因數(優選IFN或IL，更優選IFN-γ、IL-2、IL-4或IL-12)、促進腫瘤細胞的細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的生長、增強患者中對抗腫瘤細胞的免疫功能、降低腫瘤細胞的活力、降低腫瘤細胞的集落形成能力、誘導腫瘤細胞G2/M細胞週期停滯(例如通過降低細胞週期蛋白A2、細胞週期蛋白B1和/或CDK1的表達水準)、在腫瘤細胞中增加Bax表達和/或降低Bcl-2水準、或啟動腫瘤細胞的凋亡信號通路(例如通過增加細胞色素C、胱天蛋白酶-3、裂解的胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9和/或p53的表達水準)的方法，所述方法包括將有效量的痘苗病毒致炎兔皮提取物給予有需要的患者。在上述方面中，所述提取物可以作為第一抗癌藥物與其他抗癌藥物(例如第二抗癌藥物，優選環磷醯胺或5-氟尿嘧啶)聯合用於上述用途或方法。 在痘苗病毒致炎兔皮提取物與其他抗癌藥物聯合使用的實施方案中，所述提取物的使用可以導致所述抗癌藥物的用量或劑量減少至少1%-99%，例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%。 本文所述的“痘苗病毒致炎兔皮提取物(extract from rabbit skin inflamed by vaccinia virus)”和“牛痘疫苗致炎兔皮提取物”可以互換使用，是指從接種痘苗病毒的發炎兔皮中例如經過浸提、純化、精製等工序提取的一種含有活性物質的提取物。這種提取物通常是黃色或淡黃色液體，但也可通過乾燥方法製成固體。這種痘苗病毒致炎兔皮提取物的注射液可市售獲得，商品名為立再適(Lepalvir)，由威世藥業(如皋)有限公司生產。在一個方面，痘苗病毒致炎兔皮提取物或者立再適的製備方法描述於中國專利公開號CN1205233A、CN1613305A和CN1493302A，PCT公開號WO2004/060381，以及歐洲專利公開號EP1557171等中，它們的全部內容通過引用結合到本文中。 在本發明提取物的製備中，製備方法包括使用苯酚水溶液提取痘苗病毒接種後發炎的兔皮碎片，其中優選使用苯酚濃度為約1%-10%，優選約2%-5%，更優選約2%或約3%的苯酚水溶液在低於約12℃下，例如約0-10℃，優選約2-8℃，更優選約3-6℃，更優選約4℃進行。此外，製備方法還包括用吸附劑(例如活性炭)吸附用苯酚水溶液處理後的提取液，並且在鹼性條件下進行脫吸附，其中優選吸附在酸性條件下(例如約pH3-6，更優選約pH4-5，更優選約pH4.5)進行，並且脫吸附的鹼性條件為約pH9-12，優選約pH10或pH11。 在一個方面，痘苗病毒致炎兔皮提取物或者立再適可以通過包括以下步驟的方法來製備： (1) 收集用痘苗病毒接種後發炎的兔皮，將所述兔皮碎片化，用提取溶劑提取，獲得溶液A； (2) 對溶液A進行酸和加熱處理，得到溶液B； (3) 對溶液B進行堿和加熱處理，得到溶液C； (4) 在酸性條件下對溶液C進行吸附和過濾，在鹼性條件下進行脫吸附，得到溶液D； (5) 對溶液D進行中和以及加熱處理，得到溶液E； (6) 濃縮溶液E，得到所述提取物；和 (7) 任選將提取物與藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑混合。 在一個方面，在步驟(1)中，用痘苗病毒接種家兔，收集出痘的皮膚，將所述皮膚碎片化，加入苯酚水溶液，在低於約12℃下(例如約0-10℃，優選約2-8℃，更優選約3-6℃，更優選約4℃)下浸泡至少約12小時(例如約24-90小時，優選約48-72小時，更優選約70或約72小時)，離心獲得上清液，過濾得到溶液A。所述苯酚水溶液中苯酚濃度為約1%-10%，優選約2%-5%，更優選約2%或約3%。 在一個方面，在步驟(2)中，用酸(例如鹽酸)將溶液A調至酸性(例如約pH4-6，更優選約pH4.5-5.5，更優選約pH5)，加熱(例如在約90-100℃，優選約95℃下持續至少約10分鐘，例如約20-50分鐘，優選約30-40分鐘)，任選降溫(例如至低於約50℃，優選低於約30℃)，隨後離心獲得上清液，過濾後得到溶液B。所述步驟(2)可以在氮氣環境下進行。 在一個方面，在步驟(3)中，用堿(例如氫氧化鈉)將溶液B調至鹼性(例如約pH8-10，更優選約pH8.5-9.5，更優選約pH9或約pH9.2)，加熱(例如在約90-100℃，優選約95℃下持續至少10分鐘，例如約30-50分鐘，優選約30-40分鐘)，任選降溫(例如至低於約50℃，優選低於約30℃)，過濾後得到溶液C。所述步驟(3)可以在氮氣環境下進行。 在一個方面，在步驟(4)中，用酸(例如鹽酸)將溶液C調至酸性(例如約pH3-6，更優選約pH4-5，更優選約pH4.5)，向其中加入吸附劑(例如活性炭)進行浸泡(例如在攪拌下持續至少約1小時，優選約2-10小時，更優選約4小時)，之後移除溶液並收集含有活性成分的吸附劑。隨後，將上述吸附劑加入洗脫液(例如水)中，用堿(例如氫氧化鈉)將pH調節至鹼性(例如約pH9-12，優選約pH10或pH11)使活性成分從吸附劑中分離(例如攪拌至少約1小時，優選2-10小時，更優選4小時，隨後過濾，再用水洗滌吸附劑)，得到溶液D。所述步驟(4)可以在氮氣環境下進行。 在一個方面，在步驟(5)中，用酸(例如鹽酸)將溶液D調中和至弱酸性(例如約pH5.5-6.6，優選約pH6)，得到溶液E。優選地，所述步驟(5)可以在無菌條件下進行。 在一個方面，在步驟(6)中，將溶液E濃縮(例如減壓濃縮，優選減壓蒸發濃縮，例如在約50℃-70℃下，優選約54℃-56℃下)，隨後過濾，得到含有活性成分的提取物。所述步驟(6)可以在氮氣環境下進行。 本領域技術人員理解，本發明的提取物也可以通過用痘苗病毒接種其它動物組織獲得。例如，在本發明中，可以使用接種痘苗病毒的炎症組織提取物。所述組織可以來自哺乳動物的組織，所述哺乳動物可包括伴侶動物、實驗動物、畜牧動物，例如為兔、牛、馬、綿羊、山羊、猴、鼠、豬。所述組織可為皮膚。

除非另有說明，否則本文使用的所有科學術語都和本領域一般技術人員通常理解的含義一致。下文描述了示例方法和材料，可以使用其等同物。本文提及的所有出版物和其它參考文獻都通過引用整體結合到本文中。 提供以下的實施例是為了進一步闡述本發明。以下實施例無意以任何理由限制本發明的範圍。實施例 實施例 1 - 立再適的體外抗腫瘤活性 1.1. 立再適對腫瘤細胞增殖的抑制效應 將處於對數生長期的人肝癌細胞HepG2、高轉移肝癌細胞LM3、宮頸癌細胞HeLa、肺泡上皮細胞A549和大細胞肺癌細胞H460，以0.25%胰蛋白酶消化後製備成細胞懸液。調整細胞濃度為5×10⁴ /ml 接種於96 孔細胞培養板，每孔100μl，於5%CO₂ 、37℃恆溫培養箱中培養過夜。棄上清，加入預先配製好的含有不同濃度立再適的完全培養液，設置5 個作用濃度(立再適終濃度為1.63、0.815、0.326、0.163和0.0815U/ml)，另設不加藥液的對照組和無細胞空白組，加入含10%FBS的DMEM培養液或RPMI-1640培養液。各濃度均設置3個複孔，每孔總體積為100μl。在恆溫細胞培養箱中培養24h，每孔加入10μl CCK-8試劑，繼續孵育1h後於酶聯免疫檢測儀450 nm處測定各孔吸光度(OD)值，計算各組細胞增殖抑制率。細胞抑制率(%)= 1-〔(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)〕×100%。 以不同濃度立再適(終濃度分別為1.63、0.815、0.326、0.163和0.0815U/ml)作用HepG2、LM3、HeLa、A549和H460細胞，使用CCK-8法檢測細胞增殖活性。結果如表1所示，立再適在高濃度作用時，對上述5種腫瘤細胞均表現出顯著的抑制增殖作用，尤其是對HepG2、LM3和H460細胞。當立再適濃度達到1.63U/ml時，對HepG2、LM3、H460細胞的抑制率分別達到58.95%、55.08%和57.28%，對HeLa和A549細胞的抑制率略低，分別為48.18%和45.80%。當立再適濃度為0.8151.63U/ml時，與HeLa和A549細胞的抑制率相比較，HepG2、LM3細胞的抑制率差異均有統計學意義(P＜0.05)。

1.2 立再適對小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因數的影響 取製備好的脾臟淋巴細胞懸液，調整細胞密度為5×10⁶ /ml，接種於96孔細胞培養板中，每孔100μl細胞液，再加入50μl ConA或LPS(測定IL-2、IFN-γ的脾淋巴細胞懸液中ConA 終濃度為2mg/L，測定IL-4的脾淋巴細胞懸液中ConA終濃度為10mg/L，測定IL-12 的脾淋巴細胞懸液中LPS 終濃度為10mg/L)，再加入預先配製好的50μl不同濃度的立再適(終濃度為0.815、0.163 和0.0815U/ml)，另設ConA、LPS 對照組，每種處理均設置3個複孔，每孔總體積為200μl。於5%CO₂ 、37℃恆溫培養箱中培養24h後，室溫300×g 離心5min，小心吸取各組上清液備用。 使用ELISA從收集的脾淋巴細胞上清液中檢測不同濃度立再適(終濃度為0.815、0.163和0.0815U/ml)對其分泌細胞因數IL-2、IFN-γ、IL-4 和IL-12的影響，實驗結果表明，給予脾淋巴細胞不同濃度立再適後，4種細胞因數的分泌水平均有所提高。與對照組相比，立再適0.0815U/ml 對IL-2的分泌水準無顯著影響，而立再適0.163 和0.815U/ml組IL-2的分泌水準顯著提高，立再適0.815U/ml 組作用更為顯著(P＜0.01，圖1A)。立再適0.163 和0.815U/ml組IFN-γ和IL-4的分泌水準顯著提高(P＜0.05，P＜0.01，圖1B-C)，立再適0.163U/ml 組作用更為顯著，而立再適0.0815U/ml對IFN-γ、IL-4的分泌無顯著影響。立再適3個劑量組IL-12的分泌水平均有顯著提高，立再適0.163U/ml 組作用更為顯著(P＜0.01，圖1D)。1.3 立再適刺激淋巴細胞上清液對 HepG2 細胞增殖的影響 取製備好的脾淋巴細胞懸液，調整細胞濃度為5×10⁶ /ml(含ConA終濃度為5mg/L)，接種於96孔細胞培養板中，每孔100μl細胞液。一半加入100μl立再適(立再適終濃度為0.163U/ml)，另一半加入相同體積的含10%FBS的RPMI-1640培養液，每孔總體積為200μl。置於5%CO₂ 、37℃恆溫培養箱中培養24h後，室溫300×g 離心5min，小心吸取上清液備用。 將處於對數生長期的HepG2細胞，以0.25%胰酶消化後製備細胞懸液，調整細胞密度為5×10⁴ /ml，接種於96孔細胞培養板中，每孔體積100μl，5%CO₂ 、37℃恆溫培養箱培養過夜。棄上清，加入立再適刺激的脾淋巴細胞上清液。按實驗設計分組，分為實驗組、淋巴細胞上清液處理組、立再適單用組和空白對照組，實驗組加入立再適作用的不同比例淋巴細胞上清液，使其上清液體積占比分別為25%、50%、75%、100%；不含立再適作用的淋巴細胞上清液組，剩餘體積用含10%FBS的DMEM培養液補齊；空白對照組加入相同體積含10%FBS的DMEM培養液；立再適單用組藥物終濃度為0.163U/ml。每種處理均設置3個複孔，每孔體積為100μl。置於5%CO₂ 、37℃恆溫培養箱培養24h後用於細胞增殖活性測定。 上述處理的待測細胞，每孔加入10μl cck-8試劑，繼續孵育1.5h後於酶聯免疫檢測儀450nm波長處測定各孔OD值，計算各組細胞增殖抑制率。 淋巴細胞上清液中含有多種免疫活性因數，綜合上述ELISA檢測結果，採用立再適0.163U/ml刺激脾淋巴細胞上清液作用於HepG2細胞。結果如圖2所示，當上清液體積占比為25%、50%、75%和100%時，對HepG2細胞的抑制率分別為16.06%、21.10%、28.46%和41.70%，均高於相同濃度立再適單用組的抑制率3.87%，特別是當上清液體積達到100%時，與陰性對照組相比，HepG2細胞的增殖被顯著抑制(P＜0.01)。1.4 結論 A. 立再適體外抑制HepG2、LM3、H460、A549和HeLa 5種人源腫瘤細胞增殖，證實立再適具有抑制腫瘤細胞生長的作用，且它對人肝癌細胞HepG2、LM3的抑制作用更為顯著； B. 立再適能上調小鼠體外培養的脾淋巴細胞中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-12等細胞因數的分泌水準，表明立再適能夠活化淋巴細胞，促進Th1和Th2細胞的增殖與分化，增強機體細胞免疫功能。 C. 立再適刺激的脾淋巴細胞上清液比同濃度立再適單獨處理HepG2細胞的抑制效果更加顯著，進一步證實立再適可通過活化淋巴細胞，分泌多種細胞因數上調細胞免疫功能，增強自身抑制腫瘤細胞生長的作用。實施例 2 - 立再適對人肝癌荷瘤裸鼠的藥效學研究 2.1 製備人肝癌 LM3 細胞 將處於對數生長期的LM3細胞從5%CO₂ 、37℃恆溫培養箱中取出，吸棄原培養液，加適量PBS清洗，去除殘留血清，吸棄後加入1ml 0.25%胰酶消化，置於顯微鏡下觀察，當細胞形態逐漸變圓，加入適量含10%FBS的DMEM培養液終止消化，反復吹打至細胞完全懸浮，收集至15ml離心管中，室溫1500rpm 離心8min，棄上清，加入適量0.9%氯化鈉注射液，輕輕吹打至細胞分散均勻，細胞計數，放在冰盒中備用。2.2 接種人肝癌 LM3 皮下移植瘤 將製備好的LM3細胞調整細胞濃度為1×10⁷ /ml，皮下接種於8只BALB/C裸鼠右前肢腋下，每只注射0.2ml細胞懸液，注射時，75%酒精擦拭消毒，皮下進針約1cm，接種處可見迅速隆起，接種後用棉簽按壓針孔片刻，將裸鼠放回飼養盒中。待裸鼠皮下腫瘤體積長至800-1000mm³ 時，頸椎脫臼處死，75%酒精擦拭後移入超淨台中無菌操作剝取出腫瘤組織，用0.9%氯化鈉注射液清洗一遍，再用剪刀剪成約1 mm³ 的小塊，使用套管針，皮下接種於50只BALB/c裸鼠右前肢腋下，接種時，75%酒精擦拭消毒，套管針伸入皮下約1cm，接種處可見瘤塊隆起，接種後用棉球按壓針口片刻，將裸鼠放回飼養盒中。每天觀察裸鼠精神狀態，飲食、活動、排便情況，記錄腫瘤生長情況。2.3 動物分組給藥 建立了50只BALB/c裸鼠人肝癌LM3皮下移植瘤模型，每天觀察記錄腫瘤的生長情況，當腫瘤體積長至100-300 mm³ 時，按照腫瘤體積隨機分組給藥。將50只裸鼠隨機分成5組，分別是空白對照組(10只)、陽性對照組(10只)、立再適低中高劑量組(每組各10只)。空白對照組給予0.9%氯化鈉注射液，0.2ml/d，腹腔注射；陽性對照組給予環磷醯胺，20mg/kg，隔天給藥一次，腹腔注射；立再適低劑量組，0.01U/g/d，腹腔注射；立再適中劑量組，0.02U/g/d，腹腔注射；立再適高劑量組，0.04U/g/d，腹腔注射。連續給藥15天。從給藥第一天開始每天觀察裸鼠精神狀態，飲食、活動、排便情況，每三天記錄一次裸鼠的體重情況和腫瘤生長情況，於第16天結束實驗，各組裸鼠稱量體重，而後頸椎脫臼處死，完整剝取出腫瘤組織和脾臟組織進行稱重和測量，計算抑瘤率和脾臟指數。2.4 抑瘤率與脾臟指數的測定 第16天結束實驗，將各組裸鼠頸椎脫臼處死，完整剝取出皮下腫瘤組織進行稱重和測量。使用遊標卡尺測量腫瘤長徑(a)、短徑(b)，計算腫瘤體積，瘤體體積=a×b×b /2。抑瘤率(%)=[(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100%。 第16天結束實驗，稱取裸鼠體重，待各組裸鼠頸椎脫臼處死後，完整剝取脾臟組織進行稱重。脾臟指數計算公式如下：脾臟指數=脾臟重量(mg)/小鼠體重(g)×10。2.5 立再適對人肝癌裸鼠體重的影響 對於接種了LM3移植瘤的BALB/C裸鼠，實驗開始前空白對照組體重為19.81±0.49g，實驗結束時體重為21.48±0.76g，立再適低中高劑量組，裸鼠體重變化曲線與空白對照組基本一致，各組之間沒有統計學差異(P＞0.05)。而環磷醯胺(CTX)組裸鼠體重下降顯著，實驗結束時體重為18.91±0.46g，與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖3)。2.6 立再適對人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用 將人肝癌細胞LM3接種於BALB/C裸鼠皮下，接種後當腫瘤體積長至100-300mm³ 時，按照腫瘤體積隨機分組給藥，分為空白對照組，陽性對照組，立再適低中高劑量組共五組。使用遊標卡尺測量腫瘤長徑(a)、短徑(b)，計算腫瘤體積，繪製腫瘤生長曲線。從各組的腫瘤體積增長情況來看，陽性對照組和立再適低中高劑量組在給藥第六天，與空白對照組相比較，已存在統計學差異(P＜0.05)(圖4)，且抑瘤作用與計量有一定相關性。第十六天結束實驗時，空白對照組裸鼠的腫瘤重量為1.01±0.24g，陽性對照組的瘤重為0.21±0.10g，立再適低劑量組(0.01U/g)、中劑量組(0.02U/g)、高劑量組(0.04U/g)的瘤重分別為0.75±0.13g、0.66±0.08g和0.50±0.07g，對裸鼠LM3移植瘤生長抑制率分別為25.24%、34.71%、49.86%，陽性對照組環磷醯胺的抑瘤率為79.33%，與空白對照組的瘤重相比較，各處理組均存在統計學差異(P＜0.05或P＜0.01)(表2，圖5)。

2.7 立再適對人肝癌裸鼠免疫器官的影響 第十六天結束實驗時，裸鼠頸椎脫臼處死後，完整剝取脾臟組織，去除多餘的黏連組織，先用0.9%氯化鈉注射液漂洗，再用吸水紙吸幹水分後稱取重量，計算脾臟指數。結果顯示(表3)，空白對照組脾臟指數為0.84±0.12，陽性對照組的脾臟指數為0.70±0.10，立再適低劑量組(0.01U/g)、中劑量組(0.02U/g)、高劑量組(0.04U/g)的脾臟指數分別為1.15±0.05、1.23±0.07、1.17±0.02，各處理組與空白對照組相比，均存在統計學差異(P＜0.01)。

2.8 結論 A. 成功建立了BALB/C裸鼠LM3皮下移植瘤模型，為開展立再適的體內藥效學研究奠定了基礎。 B. 立再適對LM3皮下瘤BALB/C裸鼠的體重增長無顯著影響，顯示出它的高安全性特徵。 C. 立再適對BALB/C裸鼠LM3皮下移植瘤的生長具有顯著抑制作用，且與劑量有一定相關性，預示其在癌症治療方面的應用價值。 D. 立再適對LM3皮下瘤BALB/C裸鼠的免疫器官脾臟具有增重作用，能夠提高裸鼠的脾臟指數，提示立再適可以提高機體免疫功能。實施例 3 - 立再適聯合環磷醯胺對人肝癌荷瘤裸鼠的藥效學研究 人肝癌LM3細胞的製備及BALB/C裸鼠LM3皮下移植瘤模型的建立方法見實施例2。3.1 動物分組給藥 建立了50只BALB/C裸鼠人肝癌LM3皮下移植瘤模型，每天觀察記錄腫瘤的生長情況，當腫瘤體積長至100-300 mm³ 時，按照腫瘤體積隨機分組給藥。將50只裸鼠隨機分成5組，分別是空白對照組(10只)、立再適單用組(10只)、環磷醯胺低劑量組(10只)、環磷醯胺高劑量組(10只)、立再適與環磷醯胺聯合給藥組(10只)。對照組給予0.9%氯化鈉注射液，0.2ml/d，腹腔注射；立再適單用組，0.02U/g/d，腹腔注射；環磷醯胺低劑量組，10mg/kg，隔兩天給一次藥，腹腔注射；環磷醯胺高劑量組，20mg/kg，隔兩天給一次藥，腹腔注射；立再適與環磷醯胺聯合給藥組，0.02U/g＋10mg/kg，立再適每天給一次藥，環磷醯胺隔兩天給一次藥，腹腔注射。連續給藥15天。從給藥第一天開始每天觀察裸鼠精神狀態，飲食、活動、排便情況，每三天記錄一次裸鼠的體重情況和腫瘤生長情況，於第16天結束實驗，各組裸鼠稱量體重，而後頸椎脫臼處死，完整剝取出腫瘤組織和脾臟組織進行稱重和測量，計算抑瘤率和脾臟指數。3.2 抑瘤率與脾臟指數的測定 第16天結束實驗，將各組裸鼠頸椎脫臼處死，完整剝取出皮下腫瘤組織進行稱重和測量。使用遊標卡尺測量腫瘤長徑(a)、短徑(b)，計算腫瘤體積，瘤體體積=a×b×b /2。抑瘤率(%)=[(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重]×100%。 第16天結束實驗，稱取裸鼠體重，待各組裸鼠頸椎脫臼處死後，完整剝取脾臟組織進行稱重。脾臟指數計算公式如下：脾臟指數=脾臟重量(mg)/小鼠體重(g)×10。3.3 立再適對人肝癌裸鼠體重的影響 對於接種了LM3移植瘤的BALB/C裸鼠，實驗開始前對照組體重為18.13±0.54g，實驗結束時體重為19.83±0.51g，立再適組、立再適與環磷醯胺聯合給藥組的裸鼠體重變化曲線與對照組基本一致，各組之間沒有統計學差異(P＞0.05)。環磷醯胺低、高劑量組裸鼠實驗結束時體重分別為18.58±0.41g、17.54±0.28g，與對照組相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)(圖6)。3.4 立再適對人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用 將人肝癌細胞LM3接種於BALB/C裸鼠皮下，接種後當腫瘤體積長至100-300mm³ 時，按照腫瘤體積隨機分組給藥，分為對照組，立再適組，環磷醯胺低劑量組，環磷醯胺高劑量組，立再適與環磷醯胺聯合給藥組共五組。使用遊標卡尺測量腫瘤長徑(a)、短徑(b)，計算腫瘤體積，繪製腫瘤生長曲線。從各組的腫瘤體積增長情況來看，立再適組，環磷醯胺低、高劑量組、立再適與環磷醯胺聯合給藥組在給藥第九天，與對照組相比較，已存在統計學差異(P＜0.05)(圖7)。第十六天結束實驗時，對照組裸鼠的腫瘤重量為0.75±0.04g，立再適組(0.02U/g)的瘤重為0.58±0.06g，對裸鼠LM3移植瘤的生長抑制率為22.25%；環磷醯胺低劑量組(10mg/kg)、高劑量組(20mg/kg)的瘤重分別為0.50±0.02g、0.28±0.06g，抑瘤率分別為33.21%和62.67%；立再適與環磷醯胺聯合給藥組(0.02U/g＋10mg/kg)的瘤重為0.29±0.05g，抑瘤率為60.95%，與對照組的瘤重相比較，各處理組均存在統計學差異(P＜0.01)；與立再適與環磷醯胺聯合給藥組的瘤重相比較，立再適組和環磷醯胺低劑量組均存在顯著性差異(P＜0.01)。(表4，圖8)。從表4和圖7可以看出立再適與環磷醯胺聯合給藥的抑瘤率大於立再適單獨給藥的抑瘤率與環磷醯胺單獨給藥的抑瘤率之和。該結果表明立再適和環磷醯胺的聯合使用在治療腫瘤上存在協同效應。

3.5 立再適對人肝癌裸鼠免疫器官的影響 第十六天結束實驗時，裸鼠頸椎脫臼處死後，完整剝取脾臟組織，去除多餘的黏連組織，先用0.9%氯化鈉注射液漂洗，再用吸水紙吸幹水分後稱取重量，計算脾臟指數。結果顯示(表5)，與對照組的脾臟指數相比，立再適組(0.02U/g)和環磷醯胺低(10mg/kg)、高劑量組(20mg/kg)均存在統計學差異(P＜0.05)，而立再適與環磷醯胺聯合給藥組(0.02U/g＋10mg/kg)無顯著差異(P＞0.05)；與聯合給藥組的脾臟指數相比，立再適組和環磷醯胺低、高劑量組均存在統計學差異(P＜0.05)。

3.6 結論 A. 立再適可以減輕環磷醯胺對機體的毒副作用，提升機體健康水準。 B. 立再適對環磷醯胺具有抗瘤協同作用，且可以通過合用立再適，降低環磷醯胺的用量，以達到同樣的抗腫瘤效果，預示立再適作為抗癌輔助藥的應用價值。 C. 立再適與環磷醯胺聯合給藥組與單獨使用同劑量環磷醯胺組相比，能夠明顯提高脾臟指數，減輕環磷醯胺對脾臟的抑制作用。立再適可以提高機體免疫功能，對環磷醯胺發揮減毒增效。

[圖1]立再適對小鼠脾淋巴細胞上清液中IL-2(A)、IFN-γ(B)、IL-4(C)和IL-12(D)的影響。^* P＜0.05，^** P＜0.01，與陰性對照組比較；

±s，n=3。 [圖2]立再適刺激淋巴細胞上清液對HepG2細胞增殖的影響。1. 陰性對照組；2. 立再適(0.163U/ml)單用組；3. 淋巴細胞上清液處理組；4～7. 立再適刺激脾淋巴細胞上清液體積分別為25%、50%、75%和100%處理組。^** P＜0.01，與陰性對照組比較；^## P＜0.01，與立再適單用組比較；

±s，n=3。 [圖3]立再適對LM3移植瘤裸鼠體重的影響(

±s，n=6)。CTX: 環磷醯胺。 [圖4]立再適對LM3移植瘤裸鼠瘤體積的影響(

±s，n=6)。CTX: 環磷醯胺。 [圖5]LM3皮下瘤裸鼠腫瘤組織塊結果圖。CTX:環磷醯胺。 [圖6]立再適聯合環磷醯胺對LM3移植瘤裸鼠體重的影響(

±s，n=6)。1. 對照組；2. 立再適組(0.02U /g)；3. 環磷醯胺低劑量組(10mg/kg)；4. 環磷醯胺高劑量組(20mg/kg)；5. 立再適與環磷醯胺聯合給藥組(0.02U/g＋10mg/kg)。 [圖7]立再適聯合環磷醯胺對LM3移植瘤裸鼠瘤體積的影響(

±s，n=6)。1. 對照組；2. 立再適組(0.02U/g)；3. 環磷醯胺低劑量組(10mg/kg)；4. 環磷醯胺高劑量組(20mg/kg)；5. 立再適與環磷醯胺聯合給藥組(0.02U/g＋10mg/kg)。 [圖8]LM3皮下瘤裸鼠腫瘤組織塊結果圖。

Claims (21)

1. 一種痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患者中預防或治療癌症的藥物的用途。
2. 如請求項1的用途，其中所述癌症選自肝癌、肺癌、宮頸癌、膽管癌、膀胱癌、腦癌、骨癌、乳腺癌、頭頸癌、結腸直腸癌、大腸癌、胃癌、食道癌、膽癌、肝細胞癌、腎癌、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、口腔癌、胰腺癌、卵巢癌、輸尿管癌、垂體腺瘤、尿道癌、前列腺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、子宮內膜癌、白血病、淋巴癌、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、尤因肉瘤、軟組織肉瘤、神經膠質瘤、皮膚癌或黑色素瘤。
3. 一種痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患者中刺激體細胞分泌細胞因數的藥物中的用途。
4. 如請求項3的用途，其中所述細胞因數包括IL或IFN，優選選自IL-2、IFN-γ、IL-4或IL-12。
5. 如請求項3或4的用途，其中所述體細胞為免疫細胞，例如淋巴細胞。
6. 一種痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患者中促進腫瘤細胞的細胞凋亡或者啟動腫瘤細胞的凋亡信號通路的藥物中的用途。
7. 如請求項6的用途，其中促進促進腫瘤細胞的細胞凋亡或者啟動腫瘤細胞的凋亡信號通路通過增加細胞色素C、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、裂解的胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9、p53和/或Bax的表達水準來實現，或者通過降低Bcl2的表達水準來實現。
8. 一種痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患者中誘導腫瘤細胞G2/M細胞週期停滯的藥物中的用途。
9. 如請求項8的用途，其中誘導腫瘤細胞G2/M細胞週期停滯通過降低細胞週期蛋白A2、細胞週期蛋白B1和/或CDK1的表達水準來實現。
10. 如請求項1至9中任一項的用途，其中痘苗病毒致炎兔皮提取物作為抗癌藥物與另一種抗癌藥物聯合用於製備藥物。
11. 一種用於治療癌症的藥物組合，所述藥物組合包含作為第一抗癌藥物的痘苗病毒致炎兔皮提取物和第二抗癌藥物。
12. 一種作為第一抗癌藥物的痘苗病毒致炎兔皮提取物和第二抗癌藥物在製備用於在患者中預防或治療癌症的藥物的用途。
13. 如請求項11的藥物組合或如請求項7的用途，其中所述第二抗癌藥物是細胞毒藥物；優選作用於DNA化學結構的藥物或者影響核酸合成的藥物。
14. 如請求項13的藥物組合或用途，其中作用於DNA化學結構的藥物是烷化劑或其藥學上可接受的鹽，優選氮芥類。
15. 如請求項14的藥物組合或用途，其中所述氮芥類包括脂肪氮芥、芳香氮芥、氨基酸氮芥、甾體氮芥或雜環氮芥或其藥學上可接受的鹽。
16. 如請求項15的藥物組合或用途，其中所述雜環氮芥包括環磷醯胺、異環磷醯胺、4H-過氧環磷醯胺、地磷醯胺、馬磷醯胺、培磷醯胺、曲磷胺或其藥學上可接受的鹽，優選環磷醯胺。
17. 如請求項13的藥物組合或用途，其中影響核酸合成的藥物是胸苷酸合成酶抑制劑或其藥學上可接受的鹽，優選嘧啶拮抗劑。
18. 如請求項17的藥物組合或用途，其中所述嘧啶拮抗劑選自5-氟尿嘧啶、卡培他濱、替加氟、雙呋氟尿嘧啶、卡莫氟、優氟泰、氟鐵龍、氟尿苷、去氧氟尿苷或其藥學上可接受的鹽，優選5-氟尿嘧啶。
19. 如請求項11至18中任一項的藥物組合或用途，其中所述癌症選自肝癌、肺癌、宮頸癌、膽管癌、膀胱癌、腦癌、骨癌、乳腺癌、頭頸癌、結腸直腸癌、大腸癌、胃癌、食道癌、膽癌、肝細胞癌、腎癌、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、口腔癌、胰腺癌、卵巢癌、輸尿管癌、垂體腺瘤、尿道癌、前列腺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、子宮內膜癌、白血病、淋巴癌、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、尤因肉瘤、軟組織肉瘤、神經膠質瘤、皮膚癌或黑色素瘤。
20. 如請求項1至19中任一項的藥物組合或用途，其中所述痘苗病毒致炎兔皮提取物是立再適。
21. 如請求項1至20中任一項的藥物組合或用途，其中所述痘苗病毒致炎兔皮提取物配製成口服製劑或注射劑，優選肌肉注射劑、腹膜內注射劑、腹腔注射劑、皮下注射劑或靜脈注射劑。

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