TW202110483A - GalNAc亞磷醯胺表異構物 - Google Patents

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賽門 亞多夫 布萊特勒
柯特 普恩提納
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Abstract

本發明包含製備式I之GalNAc亞磷醯胺表異構物、其相應鏡像異構物及/或光學異構物之方法，
Figure 109116480-A0101-11-0001-1
其中R1 係羥基保護基團，n係0至10之整數且m係0至20之整數；及用於製備GalNAc簇寡核苷酸偶聯物之該方法用途。

Description

GalNAc亞磷醯胺表異構物
本發明係關於製備式I之表異構物純GalNAc亞磷醯胺表異構物、其相應鏡像異構物及/或光學異構物之新穎方法，
Figure 02_image006
其中R1 係羥基保護基團，n係0至10之整數且m係0至20之整數。
式I之GalNAc亞磷醯胺攜載GalNAc部分，其係包含GalNAc部分之偶聯物之靶向部分。由於GalNAc部分對位於肝細胞上之去唾液酸基醣蛋白受體之親和力，該GalNAc部分使得能夠將寡核苷酸偶聯物功能性遞送至肝細胞。此類GalNAc簇偶聯物具有充當藥物動力學調節劑之潛力，且因此係具有治療價值之化合物，如例如PCT公開案WO 2017/084987中所述。
由於GalNAc部分與亞磷醯胺之獨特組合，式I之GalNAc亞磷醯胺可與核苷結構單元一起在固相寡核苷酸合成中作為建構組元直接引入。由此可避免引入GalNAc部分之單獨偶聯步驟。
根據PCT公開案WO 2017/084987中所述之當前方法，式I之GalNAc亞磷醯胺可藉由以下製備 a) 使式A之GalNAc酸衍生物
Figure 02_image008
其中R1 係羥基保護基團且n係0至10之整數， 與式B之胺反應
Figure 02_image010
其中R3 係羥基保護基團且m係0至20之整數，以形成式C之醯胺
Figure 02_image012
其中R1 、R3 、n及m係如上文； b) 去除羥基保護基團R3 ，以形成式D之GalNAc醯胺
Figure 02_image014
其中R1 、n及m係如上文，且 c) 式D之GalNAc醯胺與磷醯胺化劑反應，以形成式I之GalNAc亞磷醯胺衍生物。
已發現，此方法導致在偶合步驟a)中在指定手性中心(下式I中之箭頭)處外消旋
Figure 02_image016
。
因此，本發明之目標係提供產生呈表異構物純形式之建構組元之新穎方法。
該目標可利用製備式I之表異構物純GalNAc亞磷醯胺表異構物之新穎方法達成，該方法包含 a) 將式II化合物
Figure 02_image018
其中R3 係羥基保護基團且m係如上文，或其鹽 與式III之GalNAc部分偶合
Figure 02_image020
其中R1 及n係如上文，以形成式IV之GalNAc醯胺
Figure 02_image022
其中R1 、R3 、n及m係如上文；及 b) 去除羥基保護基團R3 ，以形成式IV之GalNAc醯胺之游離醇，及 c) 使式IV之GalNAc醯胺之游離醇與磷醯胺化劑反應，以形成式I之GalNAc亞磷醯胺表異構物。
陳述下列定義以說明並定義用於闡述本發明之各種術語之含義及範圍。
當在化學結構中存在手性碳時，與該手性碳相關之所有立體異構物均意欲作為純立體異構物及其混合物由該結構涵蓋。
術語表異構物表示一對立體異構物中之一者，其中該等異構物僅在一個立體源中心處構形不同且其中分子中之所有其他立體中心均相同。
術語「C1-12 -烷基」表示1至12個碳原子之單價直鏈或具支鏈飽和烴基團且術語「C1-6 -烷基」表示1至6個碳原子之單價直鏈或具支鏈飽和烴基團。
「C1-12 -烷基」或「C1-6 -烷基」之實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基及戊基及己基以及其異構物。
術語「醯基」表示鏈接至烷基之羰基。該術語特定地代表C1-12 -烷基羰基、更特定地C1-6 -烷基羰基，其視情況經C1-6 -烷基取代或視情況經苯基取代。醯基之實例係乙醯基、特戊醯基或苯甲醯基。苯基之可選取代係鹵素(例如氯、溴或碘)或如上文所定義之C1-6 -烷基。醯基較佳代表乙醯基。
術語「羥基-保護基團」表示意欲保護羥基之基團且包括酯形成基及醚形成基團，特定地四氫吡喃基、醯基(例如苯甲醯基、乙醯基、胺甲醯基)、苄基及矽基醚(例如TBS、TBDPS)基團。該等基團之其他實例見於T. W. Greene及P. G. M. Wuts, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, 第2版, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, 第2-3章；E. Haslam, 「Protective Groups in Organic Chemistry」, J. G. W. McOmie編輯，Plenum Press, New York, NY, 1973, 第5章，及T.W. Greene, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, John Wiley and Sons, New York, NY, 1981。
術語「胺基-保護基團」表示意欲保護胺基之基團且包括苯甲醯基、苄基氧基羰基、苄氧羰基(CBZ或Z)、9-茀基甲氧基羰基(FMOC)、對-甲氧基苄基氧基羰基、對-硝基苄基氧基羰基、第三丁氧基羰基(BOC)及三氟乙醯基。該等基團之其他實例見於T. W. Greene及P. G. M. Wuts, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, 第2版, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, 第7章；E. Haslam, 「Protective Groups in Organic Chemistry」, J. G. W. McOmie編輯，Plenum Press, New York, NY, 1973, 第5章，及T.W. Greene, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, John Wiley and Sons, New York, NY, 1981。
式I之GalNAc亞磷醯胺表異構物較佳係其中R1 係視情況經C1-6 -烷基或苯基取代之C1-6 -烷基羰基、n係0至5之整數且m係0至10之整數之彼等，更佳其中R1 係乙醯基、n係2且m係5之彼等。
在更佳實施例中，式I之GalNAc亞磷醯胺表異構物包含式Ib至Ie之化合物。
Figure 02_image024
Figure 02_image026
Figure 02_image028
Figure 02_image030
甚至更佳者係式Ib及Ic之表異構物。
步驟 a) 步驟a)之特徵在於式II之化合物或其鹽與式III之GalNAc部分偶合以形成式IV之GalNAc醯胺。
式II之化合物或其鹽可藉由以下製備 a1) 使式V之離胺酸化合物
Figure 02_image032
其中R2 及R4 係胺基保護基團，與式VI之胺偶合
Figure 02_image034
其中R3 係羥基保護基團且m係如上文 以形成式VII之羧醯胺；
Figure 02_image036
其中R2 、R3 、R4 及m係如上文，且藉由 b1) 去除胺基保護基團R4 ，以形成式VIII之胺
Figure 02_image038
其中R2 及R3 及m係如上文； c1) 使式VIII之胺與胺基經保護之離胺酸偶合，以形成式IX之二肽
Figure 02_image040
其中R2 及R3 及m係如上文；及 d1) 去除胺基保護基團R2 ，以形成式II之化合物。
在較佳實施例中，偶合步驟a1)及c1)係在肽偶合劑、胺鹼及有機溶劑之存在下實施。
偶合可遵循熟習此項技術者已知之古典方法使用碳二亞胺偶合劑(如，DCC (N,N'-二環己基碳二亞胺)或EDC (N-(N’’,N’’-二甲基胺基丙基-N’-乙基碳二亞胺))在有或沒有添加劑(如，HOBt (1-羥基苯并三唑)或HOSu (N-羥基琥珀醯亞胺)、TBTU (N,N,N',N'-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸鹽)、HBTU (2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟磷酸鹽)或HOAt (1-羥基-7-氮雜苯并三唑)及其常見組合(例如TBTU/HOBt或HBTU/HOAt))之情形下實施。
在較佳實施例中，選擇正丙基膦酸酐(T3P)作為偶合劑以及三級胺作為胺鹼(如三乙胺、N-甲基嗎啉或N-二異丙基乙胺)，但較佳與N-二異丙基乙胺一起。
偶合反應通常在極性非質子溶劑(如乙腈、乙酸乙酯或四氫呋喃或其混合物)中在20℃與70℃之範圍內、較佳在20℃與40℃之範圍內的反應溫度下進行。
來自偶合步驟a1)及c1)之產物可自反應混合物之有機層應用熟習此項技術者已知之方法(例如藉由洗滌有機相且隨後藉由蒸發去除溶劑)獲得。
胺基保護基團R4 通常係可在鹼性條件下裂解之胺基保護基團。FMOC係最佳胺基保護基團。鹼性條件通常涉及利用脂肪族二級胺、例如利用六氫吡啶、4-甲基六氫吡啶、吡咯啶或二乙基胺、但較佳利用二乙基胺在有機溶劑之存在下處理。適宜溶劑係極性非質子溶劑，如乙腈或四氫呋喃或其混合物。
胺基保護基團R2 通常係可在酸性條件下裂解之胺基保護基團，較佳第三丁基氧基羰基(Boc)。
因此，胺基保護基團R2 之去除可利用例如選自鹽酸、三氟乙酸、磺酸(例如對-甲苯磺酸或甲磺酸)之適宜酸在極性非質子溶劑中(例如在乙腈中)進行。
在較佳實施例中，應用甲磺酸。
酸性處理利用各別酸形成式IX之二肽之三-銨鹽，對於較佳實施例利用甲磺酸形成式IX之二肽之三-銨鹽。
式IX之二肽之三-銨鹽可藉由應用熟習此項技術者已知之方法(例如結晶)分離或直接應用於步驟b)中與式III之GalNAc部分之偶合。
式III之GalNAc部分可根據PCT國際公開案WO 2017/084987、特別地根據其實例7製備。
式II之化合物或其鹽(例如式IX之二肽之三-銨鹽)與式III之GalNAc部分之最終偶合可在上文所提及之偶合條件下實施。而且，上文所報告之較佳反應條件可應用於此偶合反應。
式IV之GalNAc醯胺可藉由反相層析進一步純化且含有產物之部分可例如凍乾，以獲得式IV之經純化GalNAc醯胺。
步驟 b) 步驟b)需要去除羥基保護基團R3 ，以形成式IV之GalNAc醯胺之游離醇。
重要的是，羥基保護基團R3 化學上不同於羥基保護基團R1 ，使得去除條件係以羥基保護基團R3 裂解而羥基保護基團R1 保持不受影響之方式經選擇。
適宜羥基保護基團R3 係視情況經鹵素或C1-6 -烷基取代之苄基或係二苯甲基或三苯甲基，即可藉由氫解裂解之基團。
在較佳實施例中，R3 係苄基且氫解係利用氫在適宜氫化觸媒之存在下催化氫化。
用於去除苄基之適宜氫化觸媒係碳載鈀(Pd/C)。
反應通常在極性質子溶劑(如脂肪族醇，例如2-丙醇)或極性非質子溶劑(例如THF或乙酸乙酯)之存在下在介於0℃與40℃之間、較佳10℃與30℃之間之反應溫度下且在10巴(bar)至100巴、較佳30巴至80巴之氫壓力下實施。
式IV之GalNAc醯胺之游離醇可藉由濾除觸媒並藉由在真空中蒸發濃縮濾液來獲得。
步驟 c) 步驟c)需要式IV之GalNAc醯胺之游離醇與磷醯胺化劑反應，以形成式I之GalNAc亞磷醯胺表異構物。
磷醯胺化劑可選自2-氰基乙基-N,N-二-(2-丙基)氯亞磷醯胺或2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四(2-丙基)亞磷醯二胺。
在較佳實施例中，磷醯胺化劑係2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四(2-丙基)亞磷醯二胺與活化劑之組合。
活化劑可選自二級胺、較佳脂肪族二級胺(如二異丙胺)之酸性銨鹽，較佳二異丙基銨四唑鹽。或者，可使用其他四唑類型活化劑，如四唑、5-(乙基硫基)-1H-四唑、5-(苄基硫基)-1H-四唑或4,5-二氰基咪唑。
反應可在極性非質子溶劑(如二氯甲烷、四氫呋喃或乙腈)中在介於-20℃與50℃之間、較佳介於10℃與30℃之間之反應溫度下實施。
產物自反應混合物之分離可藉由蒸發實施。然而，通常產物留在溶液中並藉由製備型層析進一步純化。
或者，上述磷醯胺化反應之反應混合物可不經層析純化而直接用於固相寡核苷酸合成。
在較佳實施例中，將式I之層析純化產物GalNAc亞磷醯胺表異構物溶於極性非質子溶劑(例如二氯甲烷或乙腈或其混合物)中並直接應用於GalNAc簇寡核苷酸偶聯物之製備。或者，產物溶液可經乾燥劑(例如分子篩(3Å或4Å)、無水K2 CO3 、鹼性活性氧化鋁、CaCl2 或CaH2 ，較佳CaH2 或3Å分子篩)乾燥。
GalNAc簇寡核苷酸偶聯物之製備包含 a) 製備式I之GalNAc亞磷醯胺表異構物； b) 在固相寡核苷酸合成中將式I之GalNAc亞磷醯胺表異構物連同期望核苷建構組元以期望序列一起使用，以形成結合至固體支撐物之期望GalNAc簇寡核苷酸偶聯物，及最後 c) 使GalNAc簇寡核苷酸偶聯物自固相支撐物裂解並完全去保護並純化。
如熟習此項技術者通常所理解，本文所用之術語寡核苷酸定義為包含兩個或更多個共價鏈接之核苷的分子。為用作治療上有價值之寡核苷酸，寡核苷酸通常合成為7至30個核苷酸長度。寡核苷酸通常在實驗室中藉由固相化學合成、然後純化來製得。當提及寡核苷酸之序列時，係指共價鏈接之核苷酸或核苷之核鹼基部分或其改質之序列或順序。本發明之寡核苷酸係人造的，且係以化學方式合成，且通常經純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一或多個經改質核苷或核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸係反義寡核苷酸。
寡核苷酸可由DNA、RNA、經改質RNA或LNA核苷單體或其組合組成。LNA核苷單體係經改質核苷，其在核苷酸之核糖糖環之C2’與C4’之間包含鏈接體基團(稱為雙基或橋基)。該等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或二環核酸(BNA)。
在非限制性實施例中，GalNAc簇寡核苷酸偶聯物可選自由以下組成之群： 5’-(S,S )-GalNAc-C6-caGs Me Cs Gs ts as as as gs as gs as Gs G-3’ 5’-(S,S )-GalNAc-C6-caGs Me Cs Gs ts as as as gs as gs as Gs G-3’ 5’-(R,S )-GalNAc-C6-caGs Me Cs Gs ts as as as gs as gs as Gs G-3’ 5’-(S,S )-GalNAc-C6-caMe Cs Me Cs ts as ts ts ts as as cs as ts cs As Gs As Me C-3’ 5’-(R,S )-GalNAc-C6-caMe Cs Me Cs ts as ts ts ts as as cs as ts cs As Gs As Me C-3’ 5’-(S,S )-GalNAc-C6-caTs Me Cs As as cs ts ts ts cs as cs ts ts Me Cs As Gs -3’ 5’-(R,S )-GalNAc-C6-caTs Me Cs As as cs ts ts ts cs as cs ts ts Me Cs As Gs -3’ 5’-(S,S )-GalNAc-C6s -As As Ts gs cs ts as cs as as as as cs Me Cs Me Cs A-3’ 5’-(R,S )-GalNAc-C6s -As As Ts gs cs ts as cs as as as as cs Me Cs Me Cs A-3’ 其中大寫字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「s」表示硫代磷酸酯鏈接；上標Me表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基之DNA或β-D-氧基-LNA單元且C6表示6-胺基己基-1-磷酸酯鏈接。
固相合成之後，GalNAc簇寡核苷酸偶聯物仍結合至固體支撐物上且仍攜載諸如羥基保護基團R1 之保護基團。
自支撐物裂解及去保護可使用熟習此項技術者已知且闡述於文獻(Wincott等人；Nucl. Acids Res. (1995) 23 (14): 2677-2684)中之方法進行。通常，GalNAc簇寡核苷酸偶聯物係以適宜鹽(如銨鹽或鹼金屬鹽，例如鈉或鉀鹽)之形式獲得。
本文所揭示之化合物具有選自由SEQ ID NO：1、2、3及4組成之群之核鹼基序列。 SEQ ID NO 1:  cagcgtaaagagagg SEQ ID NO 2:  cacctatttaacatcagac SEQ ID NO 3:  catcaactttcacttcag SEQ ID NO 4:  aatgctacaaaaccca
實例 縮寫： DIPEA             二異丙基乙基胺 DMAP            4-(二甲基胺基)吡啶 ESI                電噴霧電離 EtOAc            乙酸乙酯 EtOH             乙醇 HRMS            高解析度質譜 HSQC-NMR    異核單量子相干-核磁共振 MeOH            甲醇 MS                分子篩 MsOH            甲磺酸 rt                   室溫(20-25℃) SPOS             固相寡核苷酸合成 T3P               正丙基膦酸酐 THF               四氫呋喃 TBME            甲基第三丁基醚
製程方案：
Figure 02_image042
實例 1a (2S )-6-(第三丁氧基羰基胺基)-2-(9H -茀-9-基甲氧基羰基胺基)己酸
Figure 02_image044
在20-25℃下向Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (54 g, 115 mmol)、6-苄基氧基己基-1-胺鹽酸鹽(根據WO2017084987A1製備) (29.5 g, 121 mmol)及N-乙基二異丙胺(78.4 ml, 461 mmol)於THF (540 ml)中之溶液中經30 s添加正丙基膦酸酐(環狀三聚體，50%於EtOAc中, 122 ml, 207 mmol)。將所得淺黃色溶液(pH 7-8)於20-25℃攪拌1 h。將水(540 ml)、TBME (135 ml)及正-庚烷(540 ml)依序添加至反應混合物並萃取雙相混合物。將有機層濃縮並在真空中濃縮，以獲得目標(S )-醯胺(79 g)，其不經進一步純化即使用。HRMS (ESI)：C39 H51 N3 O6 (MH+ )之計算值：657.3778；試驗值：657.3781。
實例 1b (2R )-6-(第三丁氧基羰基胺基)-2-(9H -茀-9-基甲氧基羰基胺基)己酸
Figure 02_image046
以與實例1a相同之方式，獲得呈白色固體之粗製(R )-醯胺且不經進一步純化即使用。HRMS (ESI)：C39 H51 N3 O6 (MH+ )之計算值: 657.3778；試驗值：657.3789。
實例 2a N -[(5S )-5-胺基-6-(6-苄基氧基己基胺基)-6-側氧基-己基]胺基甲酸第三丁基酯
Figure 02_image048
向上述粗製醯胺(79 g, 120 mmol)於THF (237 ml)中之溶液中添加二乙胺(251 ml, 2.4 mol)並在20-25℃下將無色溶液攪拌1.5 h。然後，將反應混合物濃縮並在真空中乾燥，以獲得淡黃色油狀物，將其重新溶於TBME (521 ml)及水(521 ml)中。添加甲磺酸(7.02 ml, 108 mmol)至pH 4並將各層分離。水層用TBME (521 ml)重新萃取且然後利用氫氧化鈉(32%於水中，12.9 ml, 139 mmol)鹼化至pH 14。水相用TBME (521 ml)萃取，分離有機層，經硫酸鈉乾燥，濃縮並在真空中乾燥，以獲得呈無色油狀物之(S )-B (48.5g, 97%產率，經2個步驟)。HRMS (ESI)：C24 H41 N3 O6 (MH+ )之計算值: 435.3097；試驗值：435.3121。
實例 2b N -[(5R )-5-胺基-6-(6-苄基氧基己基胺基)-6-側氧基-己基]胺基甲酸第三丁基酯
Figure 02_image050
以與實例2a相同之方式，獲得呈淡黃色油狀物之(R )-B (923 mg, 85%，經2個步驟)。HRMS (ESI)：C24 H41 N3 O6 (MH+ )之計算值: 435.3097；試驗值：435.3113。
實例 3a N -[(5S )-6-(6-苄基氧基己基胺基)-6-側氧基-5-[[(2S )-2,6-雙(第三丁氧基羰基胺基)己醯基]胺基]己基]胺基甲酸第三丁基酯
Figure 02_image052
在20-25℃下向(S )-B (48 g, 110 mmol)、DIPEA (75 ml, 441 mmol)及Boc-L-Lys(Boc)-OH (45.8 g, 132 mmol)於THF (480 ml)中之溶液中經30 s添加T3P (50%於乙酸乙酯中, 97.4 ml, 165 mmol)並將無色溶液攪拌45 min。然後添加水(480 ml)並將雙相混合物攪拌5 min。添加正庚烷(480 ml)並將各層分離。將有機層用於水中之0.5M HCl (230 ml)、0.5M NaOH (230 ml)洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。將粗產物溶於EtOH (45 ml)並添加正庚烷(428 ml)。將所得白色懸浮液在20-25℃下攪拌16 h。將懸浮液過濾，濾餅用EtOH/正庚烷(0.5/9.5, 50ml)洗滌且白色固體在真空中乾燥，以獲得呈白色結晶固體之(S ,S )-C (63.3g, 75%產率)。HRMS (ESI)：C40 H69 N5 O9 (MH+ )之計算值: 763.5095；試驗值：763.5098。
實例 3b N -[(5R )-6-(6-苄基氧基己基胺基)-6-側氧基-5-[[(2S )-2,6-雙(第三丁氧基羰基胺基)己醯基]胺基]己基]胺基甲酸第三丁基酯
Figure 02_image054
以與實例3a相同之方式，獲得呈白色固體之(R ,S )-C (16.4 g, 71%)。HRMS (ESI)：C40 H69 N5 O9 (MH+ )之計算值: 763.5095；試驗值：763.5076。
實例 4a ( 2S )-2,6-雙[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-N -[(1S )-1-(6-苄基氧基己基胺甲醯基)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]己醯胺
Figure 02_image056
將(S ,S )-C (36.1 g, 47.3 mmol)懸浮於乙腈(366 ml)中並添加甲磺酸(15.4 ml, 237 mmol)。將所得黃色渾濁溶液加熱至55-60℃。20 min後，添加額外乙腈(366 ml)以能夠攪拌。2h後，去除油浴且白色漿液用於偶合。將DIPEA (137 ml, 804 mmol)及F 之溶液(其根據WO2017084987A製備) (7.6% w/w, 1.35 kg, 191 mmol)添加至上述反應混合物並將淺黃色溶液升溫至40-45℃。然後，經5 min添加T3P (50%於乙酸乙酯中, 139 ml, 237 mmol)並將無色溶液在40-45℃下攪拌。30 min後，將反應混合物冷卻至20-25℃並在真空中濃縮至大約500 g。將此粗製溶液溶於1 M碳酸氫鈉(236 ml, 236 mmol)中並藉由反相層析分4部分純化(Redisep Rf C18, 360 g, H2 O/乙腈100:0至70:30至60:40至10:90)。將含有產物之部分在真空中濃縮以去除乙腈並然後凍乾，以獲得白色泡沫狀物，使其與乙腈(2x)共沸，以獲得呈白色泡沫狀之部分去乙醯化(S ,S )-G (77.1g)。
再乙醯化： 將以上獲得之(S ,S )-G (77.1g)吸收於乙腈(231 ml)中並在20-25℃下用DMAP (465 mg, 3.81 mmol)、DIPEA (4.86 ml, 28.6 mmol)及乙酸酐(2.51 ml, 26.7 mmol)處理1 h。用水(1.0 l)稀釋之後，溶液藉由反相層析分5部分再次純化(Redisep Rf C18, 360 g, H2 O/乙腈100:0至70:30至65:35至0:100)。將含有產物之部分在真空中濃縮以獲得白色泡沫狀物，使其與乙腈共沸，以獲得呈白色泡沫之(S ,S )-G (67.0 g, 87%)。HRMS (ESI)：C91 H144 N8 O42 ((M+2H)/22+ )之計算值: 1011.4762；試驗值：1011.4761。
實例 4b (2S )-2,6-雙[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-N -[(1R )-1-(6-苄基氧基己基胺甲醯基)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]己醯胺
Figure 02_image058
以與實例4a相同之方式但沒有再乙醯化程序，獲得呈白色泡沫之(R ,S )-G (29.1 g, 66%)。HRMS (EI)：C91 H144 N8 O42 (M+ )之計算值: 2020.9378；試驗值：2020.9365。
實例 5a (2S )-2,6-雙[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-N -[(1S )-1-(6-羥基己基胺甲醯基)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]己醯胺
Figure 02_image060
將(S ,S )-G (67.0 g, 33.1 mmol)溶於2-丙醇(670 ml)中並添加碳載鈀10% (3.8 g, 3.57 mmol)。將混合物在加壓反應器中在20℃在60巴H2 下氫化2 h。將懸浮液過濾且過濾器用2-丙醇(150 ml)洗滌。將所得無色溶液在真空中濃縮且殘餘物與乙腈(3×500 ml)共沸，以獲得呈白色泡沫之粗製(S ,S )-H (61.1 g, 95%)，其不經進一步純化即使用且儲存於-20℃下。HRMS (ESI)：C84 H139 N8 O42 (MH+ )之計算值: 1930.8908；試驗值：1931.9004。
實例 5b ( 2S )-2,6-雙[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-N -[(1R )-1-(6-羥基己基胺甲醯基)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]戊基]己醯胺
Figure 02_image062
以與實例5a相同之方式，獲得呈白色泡沫之(R ,S )-H (29.1 g, 定量)。LC-MS (ESI)：C84 H139 N8 O42 (MH+ )之計算值: 1931.9；試驗值：1931.5。
實例 6a (2S )-2,6-雙[[2-[2-[2-[2-[rac-(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-N -[(1S )-1-[6-[2-氰基乙氧基-(二異丙基胺基)磷烷基]氧基己基胺甲醯基]-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-胺基]戊基]己醯胺
Figure 02_image064
向(S ,S )-H (3.4 g, 1.76 mmol)於無水二氯甲烷(20 ml)中之溶液中添加3-((雙(二異丙基胺基)膦基)氧基)丙腈(902 mg, 2.99 mmol)及二異丙基-銨四唑鹽(151 mg, 0.88 mmol)。將淡黃色溶液在20-25℃攪拌1 h。將反應混合物用TBME稀釋並直接藉由製備型層析(Redisep Rf Gold Cyano, 275 g, TBME (含有1% v/v NEt3 )/乙腈90:10至70:30)純化。將含有產物之部分在真空中濃縮，以獲得呈白色泡沫狀之(S ,S )-I (3.0 g, 80%)。31 P NMR (162 MHz, DMSO-d6): ppm 146.32；HRMS (自無水CHCl3 之奈米噴霧)：C91 H144 N8 O42 ((M+2H)/22+ )之計算值: 1066.5066；試驗值：1066.5078。
實例 6b (2S )-2,6-雙[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]-N -[(1R )-1-[6-[2-氰基乙氧基-(二異丙基胺基)磷烷基]氧基己基胺甲醯基]-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R ,3R ,4S ,5R ,6R )-3-乙醯胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氫吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]-胺基]戊基]己醯胺
Figure 02_image066
向(R ,S )-H (2.5g, 1.29 mmol)於乙腈(20 ml, 經CaH2 乾燥)中之溶液中添加3-((雙(二異丙基胺基)膦基)氧基)丙腈(624 mg, 2.07 mmol)及二異丙基-銨四唑鹽(44.3 mg, 0.26 mmol)。將無色溶液於20-25℃攪拌1.5 h.。將反應混合物在真空中濃縮至12 ml之體積並實施製備型層析(Redisep Rf Gold Cyano, 275 g, TBME/乙腈95:5至75:25)。將含有產物之部分在真空中濃縮，以獲得呈無色蠟狀之(R ,S )-I (2.1 g, 76%)。31 P NMR (162 MHz, DMSO-d6): ppm 146.83。
對於固相寡核苷酸合成(SPOS)，將(S ,S )-I 及(R ,S )-I 中之任一者溶於無水MeCN或CH2 Cl2 中，以獲得0.1-0.2M溶液。將此溶液經4Å MS、3Å MS、無水K2 CO3 、鹼性活化氧化鋁、CaCl2 或CaH2 乾燥1小時且然後直接用於寡核苷酸合成器上。
固相寡核苷酸合成 GalNAc簇改質之LNA/DNA係藉由標準亞磷醯胺化學(參見WO2017084987A1及WO2018215391A1)在固相上以1或20 µmol之規模在BioAutomation Mermade 12上或以0.2、0.95或1.9 mmol規模使用AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)產生。所用固體支撐物包括Primer Support 5G Unylinker 200 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)、Primer Support 5G Unylinker 350 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)或Kinovate NittoPhase HL Unylinker 400。含有2-OCH2-4橋接核苷酸(Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany)及DNA (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany)之寡核苷酸係利用相應亞磷醯胺產生。以上製備之GalNAc簇亞磷醯胺( S ,S )-I 及(R ,S )-I 於MeCN或CH2 Cl2 中之溶液與標準SPOS活化劑(例如，4,5-二氰基咪唑(有或沒有N -甲基咪唑))或四唑活化劑(例如5-(苄基硫基)-1H -四唑或Activator 42)一起使用，採用1.5 - 4.0當量之亞磷醯胺、30/70 - 40/60之亞醯胺與活化劑比率及10 - 30 min之偶合時間。氧化係藉由有機氧化劑(例如，樟腦磺醯基氧氮環丙烷、異丙苯氫過氧化物、第三丁基氫過氧化物或於吡啶/H2 O (9:1)中之碘)實施。硫醇化可藉由用於SPOS之標準硫醇化試劑實施，例如3-胺基-1,2,3-二噻唑-5-硫酮(氫化黃原素(xanthane hydride))、3-二甲基胺基-1,2,3-二噻唑-5-硫酮、3-乙氧基-1,2,4-二噻唑啉-5-酮、Beaucage試劑或苯基乙酸二硫化物於其各別溶劑中。GalNAc簇亞磷醯胺之偶聯不採用封端步驟。裂解及去保護係藉由該領域中已知之方法達成(Wincott F.等人  Nucleic Acid Research, 1995, 23,14, 2677-84)，例如濃NH4 OH (28-33%)，在25 - 55℃之間之溫度下。對經去保護及乾燥之粗製GalNAc簇改質之LNA銨鹽進行表徵且利用離子對HPLC-MS確認身份。其可藉由用於寡核苷酸之標準純化方法進行純化(例如，參見WO2018215391A1)。 (大寫字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「s」表示硫代磷酸酯鏈接；上標Me表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基之DNA或β-D-氧基-LNA單元且AM-C6表示6-胺基己基-1-磷酸酯鏈接)。
實例 7a: 5’-(S,S )-GalNAc-C6-caGs Me Cs Gs ts as as as gs as gs as Gs G-3’之合成 根據以上標準SPOS條件使用(S,S )-I ，以1.9 mmol規模在AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)上合成標題產物。將去保護且經濃縮之粗製寡核苷酸銨鹽藉由反相HPLC純化，且在超濾/滲濾及凍乾之後，獲得呈白色凍乾物之5’-(S,S )-GalNAc-C6-caGs Me Cs Gs ts as as as gs as gs as Gs G-3’之鈉鹽(1.7 g, 87.0a% HPLC純度)。IP-RP-HPLC-HRMS (ESI)：C220 H303 N76 O111 P15 S12 (M- )之計算值: 6633.3115；試驗值：6633.3089。經1 H-13 C-HSQC-NMR測定，表異構物純度＞95% (LOD)。另外，於6M HCl中水解、游離胺基酸之衍生及離胺酸鏡像異構物於CHIRASIL VAL上之氣相層析分離均顯示99.8%之表異構物純度。
實例 7b 5’-(R,S )-GalNAc-C6-caGs Me Cs Gs ts as as as gs as gs as Gs G-3’之合成 根據以上標準SPOS條件使用(R,S )-I ，以1.9 mmol規模在AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)上合成標題產物。將去保護且經濃縮之粗製寡核苷酸銨鹽藉由反相HPLC純化，且在超濾/滲濾及凍乾之後，獲得呈白色凍乾物之5’-(R,S )-GalNAc-C6-caGs Me Cs Gs ts as as as gs as gs as Gs G-3’之鈉鹽(1.6 g, 91.6a% HPLC純度)。IP-RP-HPLC-HRMS (ESI)：C220 H303 N76 O111 P15 S12 (M- )之計算值: 6633.3115；試驗值：6633.3134。經1 H-13 C-HSQC-NMR測定，表異構物純度＞95% (LOD)。另外，於6M HCl中水解、游離胺基酸之衍生及離胺酸鏡像異構物於CHIRASIL VAL上之氣相層析分離均顯示＜95.6%之表異構物純度。
實例 8a 5’-(S,S )-GalNAc-C6-caMe Cs Me Cs ts as ts ts ts as as cs as ts cs As Gs As Me C-3’之合成 根據以上標準SPOS條件使用(S,S )-I ，以0.2 mmol規模在AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)上合成標題產物。將去保護且經濃縮之粗製寡核苷酸銨鹽藉由IEX-MPLC純化，且在超濾/滲濾及凍乾之後，獲得呈白色凍乾物之5’-(S,S )-GalNAc-C6-caMe Cs Me Cs ts as ts ts ts as as cs as ts cs As Gs As Me C-3’之鈉鹽(350 mg, 79.1a% HPLC純度)。IP-RP-HPLC-HRMS (ESI)：C259 H359 N76 O135 P19 S16 (M- )之計算值: 7793.4109；試驗值：7793.4127。經1 H-13 C-HSQC-NMR測定，表異構物純度＞96% (LOD)。另外，於6M HCl中水解、游離胺基酸之衍生及離胺酸鏡像異構物於CHIRASIL VAL上之氣相層析分離均顯示99.8%之表異構物純度。
實例 8b 5’-(R,S )-GalNAc-C6-caMe Cs Me Cs ts as ts ts ts as as cs as ts cs As Gs As Me C-3’之合成 根據以上標準SPOS條件使用(R,S )-I ，以0.2 mmol規模在AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)上產生標題產物。將去保護且經濃縮之粗製寡核苷酸銨鹽藉由IEX-MPLC純化，且在超濾/滲濾及凍乾之後，獲得呈白色凍乾物之5’-(R,S )-GalNAc-C6-caMe Cs Me Cs ts as ts ts ts as as cs as ts cs As Gs As Me C-3’之鈉鹽(630 mg, 82.9a% HPLC)。IP-RP-HPLC-HRMS (ESI)：C259 H359 N76 O135 P19 S16 (M- )之計算值: 7793.4109；試驗值：7793.4127。經1 H-13 C-HSQC-NMR測定，表異構物純度＞96% (LOD)。另外，於6M HCl中水解、游離胺基酸之衍生及離胺酸鏡像異構物於CHIRASIL VAL上之氣相層析分離均顯示＞95.4%之表異構物純度。
實例 9a 5’-(S,S )-GalNAc-C6-caTs Me Cs As as cs ts ts ts cs as cs ts ts Me Cs As Gs -3’之合成 根據以上標準SPOS條件使用(S,S )-I ，以2*1.9 mmol規模在AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)上合成標題產物。將去保護且經濃縮之粗製寡核苷酸銨鹽藉由IEX-MPLC、隨後反相HPLC純化，且在超濾/滲濾及凍乾之後，獲得呈白色凍乾物之5’-(S,S )-GalNAc-C6-caTs Me Cs As as cs ts ts ts cs as cs ts ts Me Cs As Gs -3’之鈉鹽(12.5 g, 92.7a% HPLC純度)。IP-RP-HPLC-HRMS (ESI)：C248 H346 N68 O133 P18 S15 (M- )之計算值: 7441.3490；試驗值：7441.3730。經1 H-13 C-HSQC-NMR測定，表異構物純度＞98% (LOD)。另外，於6M HCl中水解、游離胺基酸之衍生及離胺酸鏡像異構物於CHIRASIL VAL上之氣相層析分離均顯示99.6%之表異構物純度。
實例 9b 5’-(R,S )-GalNAc-C6-caTs Me Cs As as cs ts ts ts cs as cs ts ts Me Cs As Gs -3’之合成 根據以上標準SPOS條件使用(R,S )-I ，以1.9 mmol規模在AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)上合成標題產物。將去保護且經濃縮之粗製寡核苷酸銨鹽藉由反相HPLC純化，且在超濾/滲濾及凍乾之後，獲得呈白色凍乾物之5’-(R,S )-GalNAc-C6-caTs Me Cs As as cs ts ts ts cs as cs ts ts Me Cs As Gs -3’之鈉鹽(6.0 g, 82.0a% HPLC)。IP-RP-HPLC-HRMS (ESI)：C248 H346 N68 O133 P18 S15 (M- )之計算值: 7441.3490；試驗值：7441.3508。經1 H-13 C-HSQC-NMR測定，表異構物純度＞98% (LOD)。另外，於6M HCl中水解、游離胺基酸之衍生及離胺酸鏡像異構物於CHIRASIL VAL上之氣相層析分離均顯示＞97.0%之表異構物純度。
實例 10a 5’-(S,S )-GalNAc-C6s -As As Ts gs cs ts as cs as as as as cs Me Cs Me Cs A-3’之合成 根據以上標準SPOS條件使用(S,S )-I ，以0.95 mmol規模在AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)上合成標題產物。將去保護且經濃縮之粗製寡核苷酸銨鹽藉由反相HPLC純化，且在超濾/滲濾及凍乾之後，獲得呈白色凍乾物之5’-(S,S )-GalNAc-C6s -As As Ts gs cs ts as cs as as as as cs Me Cs Me Cs A-3’之鈉鹽(1.6 g, 87.7a% HPLC純度)。IP-RP-HPLC-HRMS (ESI)：C229 H318 N72 O113 P16 S16 (M- )之計算值: 6891.2684；試驗值：6891.2714。經1 H-13 C-HSQC-NMR測定，表異構物純度＞94% (LOD)。另外，於6M HCl中水解、游離胺基酸之衍生及離胺酸鏡像異構物於CHIRASIL VAL上之氣相層析分離均顯示99.6%之表異構物純度。
實例 10b 5’-(R,S )-GalNAc-C6s -As As Ts gs cs ts as cs as as as as cs Me Cs Me Cs A-3’之合成 根據以上標準SPOS條件使用(R,S )-I ，以0.95 mmol規模在AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)上產生標題產物。將去保護且經濃縮之粗製寡核苷酸銨鹽藉由反相HPLC純化，且在超濾/滲濾及凍乾之後，獲得呈白色凍乾物之5’-(R,S )- GalNAc-C6s -As As Ts gs cs ts as cs as as as as cs Me Cs Me Cs A-3’之鈉鹽(2.0 g, 88.0a% HPLC)。IP-RP-HPLC-HRMS (ESI)：C229 H318 N72 O113 P16 S16 (M- )之計算值: 6891.2684；試驗值：6891.2715。經1 H-13 C-HSQC-NMR測定，表異構物純度＞95% (LOD)。另外，於6M HCl中水解、游離胺基酸之衍生及離胺酸鏡像異構物於CHIRASIL VAL上之氣相層析分離均顯示99.4%之表異構物純度。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 109116480-A0101-11-0003-3

Claims (22)

  1. 一種製備式I之表異構物純GalNAc亞磷醯胺表異構物、其相應鏡像異構物及/或光學異構物之方法，
    Figure 03_image068
    其中R1 係羥基保護基團，n係0至10之整數且m係0至20之整數，該方法包含 a) 使式II之 化合物
    Figure 03_image070
    其中R3 係羥基保護基團且m係如上文，或其鹽 與式III之GalNAc部分偶合
    Figure 03_image072
    其中R1 及n係如上文，以形成式IV之GalNAc醯胺
    Figure 03_image074
    其中R1 、R3 、n及m係如上文；及 b) 去除該羥基保護基團R3 ，以形成式IV之該GalNAc醯胺之游離醇，及 c) 使式IV之該GalNAc醯胺之該游離醇與磷醯胺化劑反應，以形成該式I之該GalNAc亞磷醯胺表異構物。
  2. 如請求項1之方法，其中R1 係醯基。
  3. 如請求項1或2之方法，其中R1 係C1-6 -烷基羰基，其視情況經C1-6 -烷基或苯基取代。
  4. 如請求項1或2之方法，其中n係0至5之整數且m係0至10之整數。
  5. 如請求項2之方法，其中R1 係乙醯基，n係2且m係5。
  6. 2及5中任一項之方法，其中R3 係苄基。
  7. 2及5中任一項之方法，其中該式I包含式Ib至Ie之GalNAc亞磷醯胺表異構物
    Figure 03_image076
    Figure 03_image078
    。
  8. 2及5中任一項之方法，其中式II之該化合物係藉由以下製備 a1) 使式V之離胺酸化合物
    Figure 03_image080
    其中R2 及R4 係胺基保護基團 與式VI之胺偶合
    Figure 03_image082
    其中R3 及m係如上文 以形成式VII之羧醯胺；
    Figure 03_image084
    其中R2 、R3 、R4 及m係如上文，及 b1) 去除該胺基保護基團R4 以形成式VIII之胺
    Figure 03_image086
    其中R2 、R3 及m係如上文； c1) 使式VIII之該胺與胺基經保護之離胺酸偶合，以形成式IX之二肽
    Figure 03_image088
    其中R2 及R3 及m係如上文；及 d1) 去除該等胺基保護基團R2 ，以形成式II之該化合物。
  9. 如請求項8之方法，其中該等偶合步驟a1)及c1)係在肽偶合劑、胺鹼及有機溶劑之存在下實施。
  10. 如請求項8之方法，其中該肽偶合劑係正丙基膦酸酐，該胺鹼係三級胺，該有機溶劑係極性非質子溶劑且反應溫度選自20℃至70℃。
  11. 如請求項8之方法，其中R4 係在鹼性條件下可裂解之胺基保護基團，較佳FMOC。
  12. 如請求項11之方法，其中該等鹼性條件涉及利用脂肪族二級胺、較佳二乙基胺、在有機溶劑之存在下處理。
  13. 如請求項8之方法，其中該胺基保護基團R2 係第三丁基氧基羰基。
  14. 如請求項8之方法，其中在步驟d1)中，該胺基保護基團R2 係在酸性條件下去除且利用各別酸形成式IX之二肽之三-銨鹽。
  15. 如請求項14之方法，其中該酸係磺酸、較佳甲磺酸。
  16. 2及5中任一項之方法，其中在步驟a)中，式II之該化合物與該式III之該GalNAc部分之該偶合係在肽偶合劑、胺鹼及有機溶劑之存在下實施。
  17. 如請求項16之方法，其中該肽偶合劑係正丙基膦酸酐，該胺鹼係三級胺，該有機溶劑係極性非質子溶劑且反應溫度選自20℃至70℃。
  18. 2及5中任一項之方法，其中在步驟b)中，該去除該羥基保護基團R3 以形成該游離醇係利用氫在氫化觸媒之存在下藉助催化氫化實施。
  19. 2及5中任一項之方法，其中步驟c)中之該磷醯胺化劑係選自2-氰基乙基-N,N-二-(2-丙基)氯亞磷醯胺或2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四(2-丙基)亞磷醯二胺。
  20. 如請求項19之方法，其中步驟c)中之該反應係利用2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四(2-丙基)亞磷醯二胺在二級胺之酸性銨鹽及極性非質子溶劑之存在下在-20℃與50℃之間之反應溫度下實施。
  21. 一種如請求項1至20中任一項之方法的用途，其用於製備包含GalNAc部分作為單一表異構物之GalNAc簇寡核苷酸偶聯物。
  22. 如請求項21之用途，其中GalNAc簇寡核苷酸偶聯物之該製備包含 a) 根據請求項1至20製備式I之GalNAc亞磷醯胺表異構物； b) 在固相寡核苷酸合成中，將該式I之該GalNAc亞磷醯胺表異構物連同期望核苷建構組元以期望序列一起使用，以形成結合至固體支撐物之期望GalNAc簇寡核苷酸偶聯物，及最後 c) 使該GalNAc簇寡核苷酸偶聯物自該固相支撐物裂解並完全去保護並純化。
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