TW202103679A

TW202103679A - 一種落葵萃取物用於製備預防或治療神經系統疾病組合物的用途

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Publication number: TW202103679A
Application number: TW108125582A
Authority: TW
Inventors: 楊定一; 徐慧妤
Original assignee: 國立陽明大學; 徐慧妤
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2021-02-01
Also published as: TWI783161B

Abstract

一種落葵萃取物用於製備預防或治療神經系統疾病組合物之用途，其中該落葵萃取物是由落葵屬植物萃取而得，包含多醣成分；其中神經系統疾病包含神經退化疾病及細胞週期異常，其中該神經退化疾病包含失智症或運動疾患，該失智症包含阿茲海默症、血管型失智症、額顳葉型失智症、路易士體失智症或輕度認知功能障礙，該運動疾患包含巴金森氏症、亨丁頓舞蹈症、肌萎縮側索硬化症、小腦萎縮症或多系統萎縮症，其中該神經系統細胞之細胞週期異常是神經系統腫瘤。

Description

一種落葵萃取物用於製備預防或治療神經系統疾病組合物的用途

本發明係關於一種落葵萃取物用於預防或治療神經系統疾病的用途。

神經系統是由膠細胞(包括星狀體細胞、寡樹突細胞及微膠細胞)以及神經元這類特化細胞的網路所構成的，在身體的不同部位間傳遞訊號，接收外界與內在的訊息，並加以整合協調，指示身體做出適當的反應，使生物能進行快速、短暫的訊息傳達來保護個體存活與延續生命。然而，由於絕大多數的神經細胞無法再生，加上神經網絡系統的高度複雜性，神經系統疾病不同程度地影響著廣泛的人群且往往無法治癒。

神經系統疾病包含神經退化疾病(neurodegenerative disease)與神經細胞之細胞週期異常，隨著人口的老化，神經退化性疾病的發病率越來越高，如何改善和治療神經退化性疾病已是目前研究的重要課題。神經退化疾病包含失智症(dementia)與運動疾患(movement disorder)，都與粒線體健康有直接或間接的關係。

失智症屬於慢性神經退化性疾病，患者思考能力和記憶力出現長期而漸進式的退化，最終影響到患者甚至照護者的日常生活功能。除了認知功能與記憶力退化之外，其他常見的症狀也包含情緒問題、語言問題、還有行動能力降低等等。年齡為罹患失智症最重要的危險因子，但失智症是大腦中主動進行式的疾病，而非單純因老化而造成，所以失智症的診斷包括心智功能出現退化且其退化程度比一般老化的情形更為嚴重。失智症並非單一疾病，只要出現漸進式認知功能退化與記憶力減退均可能被診斷為失智症。

最常見的失智症類型是阿茲海默症(Alzheimer’s disease)，其患者約佔所有失智症患者人數的50-70%。另一種常見的失智症是約佔25%的血管型失智症(vascular dementia)。血管性失智症是因為腦血管病變後所導致的失智症，其退化速度取決於腦中風次數與中風發生的位置。在阿茲海默症致病機轉扮演重要角色的類澱粉乙型蛋白(amyloid-beta peptide簡稱Aβ)若是由血管內皮細胞所分泌而組成堆積在血管壁上的老年斑塊(senile plaque)也是血管性失智症的重要危險因子之一。約佔失智症患者15%左右的路易氏體失智症(dementia with Lewy body)除了有認知功能障礙外，在病程早期就可能出現身體僵硬、手抖、走路不穩，以及重複無法解釋的跌倒現象，而這些症狀與巴金森氏症類似；事實上，路易士體的核心組成蛋白是α-synuclein，其突變會導致體染色體顯性遺傳的家族型巴金森氏症。除了上述的失智症類型之外，還有額顳葉型失智症(frontotemporal lobe dementia)，此類型失智症與阿茲海默氏症最大差異點在於病人初期症狀並非記憶功能下降，而是產生行為問題、人格轉變或語言功能退化，而導致額顳葉型失智症的突變基因也與阿茲海默症的致病基因不同。除了已確診的失智症類型之外，也有患者在失智前出現輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment)，此為介於正常認知功能與輕度失智症間的過渡階段，雖然少部分的患者會回復到正常的認知功能，但大部分的患者會進一步退化而發展成失智症；因此，輕度認知功能障礙的患者屬於未來會罹患失智症的高危險群。目前已將臨床上出現失憶型輕度認知功能障礙且合併有阿茲海默症生物標記的患者，診斷為因阿茲海默症導致的MCI(MCI due to Alzheimer's disease)，甚至於認為這個很可能就是極早期阿茲海默症。現今對MCI尚無有效的藥物可以治療，只能經由控管危險因子的或加強訓練認知功能等非藥物治療來減緩其病程。

現今用來治療阿茲海默症的藥物無法保護神經細胞使其不再走向細胞凋亡，僅能暫時性減緩病人疾病的症狀，因此阿茲海默症仍然是無藥可治。當前阿茲海默症的處方藥物分為兩大類：乙醯膽鹼酯酶抑制劑(acetylcholinesterase inhibitors)與N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑(NMDA receptor antagonists)，但都有很多副作用；乙醯膽鹼酯酶抑制劑適用於輕中度病情的患者，這類藥物可抑制乙醯膽鹼的分解，因而提高其在腦部的含量，可改善患者的認知，其副作用包括尿失禁、心動過緩、近視等；NMDA受體拮抗劑，通過阻斷glutamate刺激NMDA受體所引起的興奮性神經毒性(excitotoxicity)，繼而起治療作用，適用於中重度病情或不適合使用乙醯膽鹼酯酶抑制劑的阿茲海默症患者，其常見的副作用為眩暈、嗜睡、頭痛以及便秘。但不論症狀減緩效果及其副作用如何，均無法治癒此一神經退化性疾病。

一般細胞處於分化狀態時為G0-phase，而處於分裂增生狀態的細胞則按順序走過四個不同週期(G1-S-G2-M)，完成有絲分裂(mitosis)。每個分裂週期細胞會表現特定蛋白質，可以被免疫螢光染色法偵測得到，例如G1-phase表現cyclin-D1，S-phase表現proliferating cell nuclear antigen (PCNA)，G2/M-phase表現phosphor-Histone H3，細胞凋亡可以用cleaved caspase-3來代表。目前已知已分化之神經細胞在正常生存條件下會停止分裂而維持在G0-phase，但有很多證據顯示已經完全分化之成熟神經元在受到刺激或處於壓力狀態時會試圖重新進入細胞週期，但因無法走完有絲分裂(mitosis)而改為走向細胞凋亡(apoptosis)。因此，若能抑制神經元再進入細胞週期，應可以抑制細胞凋亡而造成神經保護的作用。

臨床研究顯示死後解剖阿茲海默症患者觀察其腦部海馬迴與大腦皮質均可以偵測到表現細胞週期相關蛋白質(例如cyclin-D1)的神經元，但在同年齡正常對照組腦中則比較不會有類似的情形，顯示成熟分化之神經元再進入細胞週期後走向死亡是一個可以在臨床上觀察到的現象，而非僅只是發生在動物身上或細胞培養時人為造成的現象。

另一個常見的神經退化疾病為巴金森氏症，屬於運動疾患，好發於五、六十歲以上的人口，表現的症狀以肢體靜止型顫抖、肌肉僵硬、動作遲緩、姿態不穩導致平衡失調為主。早期症狀常出現有單手規律性顫抖，動作變慢，肌肉僵硬逐漸地蔓延全身，到了末期幾乎都要靠輪椅才能行動。巴金森氏症是由於位在中腦的黑質緻密部(substantia nigra pars compacta)釋放多巴胺作為神經傳導因子的神經元死亡而導致多巴胺缺乏，進而使得基底核(basal ganglia)中仰賴黑質細胞提供多巴胺做為神經傳導物質的紋狀體(striatum)受到影響，無法調節大腦皮質、視丘(thalamus)與錐體外系統(extrapyramidal system)的訊息，因而引起各肌肉之間協調運作功能上的障礙。如同前述之阿茲海默症，巴金森氏症亦無法可治癒。目前臨床上以補充左旋多巴胺對巴金森氏症患者進行症狀緩解，但左旋多巴胺的使用經常造成副作用；症狀更嚴重藥物無法控制時也可以考慮在腦部植入電極進行深層腦部刺激(deep brain stimulation)，但此為腦部手術而具高度侵入性與不確定性。而因為神經元持續死亡，故不論藥物或手術最多僅能減輕某些症狀，但無治療功能。

粒線體功能損傷及氧化壓力已被證實是導致多巴胺神經元死亡的重要原因，也因此成為巴金森氏症的重要致病機轉。事實上，有數個導致家族遺傳性巴金森氏症的致病基因(如PINK1、Parkin、DJ-1等)都與維持粒線體正常功能有密切關係。PINK1與Parkin直接參與細胞內粒線體的「品質管控」，結構受損或因老化而功能不好的粒線體會透過PINK1與Parkin共同作用將其清除掉，並且將分解後的組成物如胺基酸等進行回收再利用，而DJ-1則是位於粒線體中的一個抗氧化蛋白質。除了家族遺傳性巴金森氏症之外，過去實驗證實有部份散發性巴金森氏症患者其白血球粒線體功能較正常人低下，特別是粒線體電子傳遞鏈複合體I的活性；換言之，這些散發性巴金森氏症患者有可能是其全身粒線體功能都有缺損(這有可能是肇因於其粒線體DNA的多型性)，只是因為黑核緻密區的神經元利用多巴胺作為神經傳導物質，而其合成過程中會產生較多自由基造成氧化壓力，因此數十年長期累積下來這些多巴胺神經元率先受到損傷，進而出現巴金森氏症狀。不論其上游分子機轉為何，粒線體功能損傷都是巴金森氏症非常重要的病理機轉，也因此粒線體電子傳遞鏈複合體I的抑制劑(如MPTP或rotenone)常在動物實驗或細胞實驗中被用來做為模擬巴金森氏症的藥物模型，而可以對粒線體抑制劑的神經毒性產生保護作用的藥物或天然萃取物預期應可對巴金森氏症患者有所助益。

三硝基丙酸(3-nitropropionic acid，3-NP)，屬於粒線體複合體II之不可逆抑制劑，主要影響succinate dehydrogenase的作用，較易於選擇性地對紋狀體造成傷害，但劑量高時最終也會傷害到大腦皮質。在投予到靈長類或囓齒類動物時，3-NP所引發之病理特徵與亨丁頓舞蹈症臨床特徵極為相似。除了亨丁頓舞蹈症與前述之阿茲海默症及巴金森氏症之外，粒線體功能損傷也與其他多種神經退化性疾病有直接關聯，例如脊索側硬化症及小腦萎縮症等罕見疾病；事實上，除了慢性神經退化性疾病之外，急性神經系統損傷如缺血性腦中風與脊髓損傷等其致病機轉中也都包括粒線體功能失衡或損傷。因此，具有保護神經細胞免於粒線體功能損傷之藥物或製劑應具有治療或預防神經系統疾病的潛力。

思覺失調症(Schizophrenia)是精神疾病的一種，其病理機制複雜尚且未明，當中常見的成因說法就是因多巴胺神經元異常所導致，其中紋狀體多巴胺運轉體的可用性與其治療狀況有關。

已完全分化的神經細胞在正常健康的狀態下應該處於靜息狀態，不再進行有絲分裂；而在神經退化性疾病進展的過程中，已分化之神經元試圖重新進入細胞週期、但失敗後走向細胞凋亡的現象則是從臨床及動物細胞實驗中均已獲得證實。因此，神經元細胞週期異常所造成的後續凋亡是在阿茲海默症與巴金森氏症等神經退化性疾病的重要致病機轉之一，而可以抑制神經元細胞週期異常以及凋亡的藥物或天然萃取物預期應可對神經退化性疾病患者有所助益。而另一方面，癌症的成因是由於癌細胞不正常增生轉移，目前治療方式包括手術切除、放射線治療以及化療藥物。腫瘤由於癌細胞持續進入細胞週期導致細胞分裂失控，而與抑制神經細胞進入細胞周期會抑制凋亡造成神經保護作用相反，多數抑制腫瘤細胞分裂的藥物往往導致其凋亡而有利於癌症治療，因此若能找到抑制細胞分裂的藥物或天然物或許可以具有抗癌的作用。在神經系統中的腫瘤則包含頭頸部癌症、腦瘤、外周神經系統癌、中樞神經系統癌、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤等等。

目前臨床上神經系統疾病藥物治療效果有限且具有嚴重副作用，許多患者無法持續治療。更重要的是，藥物僅緩解症狀，但未能根本解決神經退化及死亡的問題，所以如何開發出一種可以真正預防或治療神經系統疾病的新成份是本發明在此欲解決的重要課題。

有鑒於現有技術的前述缺失，本發明的目的即在於提供一種落葵萃取物用於製備預防或治療神經系統疾病醫藥組合物之用途，萃取自落葵屬植物。

本發明的目的即在於提供一種包含落葵萃取物之組合物用於預防或治療神經系統疾病組合物之用途，萃取自落葵屬植物，其中該組合物包含健康食品、動物性食品、動物性藥品。

為達前述發明目的，其中該神經系統疾病是神經退化疾病，包含失智症或運動疾患。

為達前述發明目的，其中該失智症包含阿茲海默症、血管型失智症、額顳葉型失智症、路易士體失智症或輕度認知功能障礙。

為達前述發明目的，其中該神經系統疾病是粒線體損傷相關的神經系統疾病。

為達前述發明目的，其中該粒線體損傷相關的神經系統疾病是黑質或紋狀體損傷相關的神經系統疾病。

為達前述發明目的，該治療阿茲海默症包括延緩阿茲海默症之認知力損傷發作或延緩記憶力損傷發作。

為達前述發明目的，其中該運動疾患包含巴金森氏症、亨丁頓舞蹈症、肌萎縮側索硬化症、小腦萎縮症或多系統萎縮症。

為達前述發明目的，其中該神經系統疾病是細胞週期異常。

為達前述發明目的，其中該神經系統細胞之細胞週期異常是神經系統腫瘤。

為達前述發明目的，該落葵萃取物的萃取步驟為：步驟1、新鮮或冷凍落葵直接磨碎不加水，或新鮮或冷凍落葵加水或醇類磨碎攪拌；步驟2、過濾去除殘渣取得落葵汁液；步驟3、加入醇類沉澱，過濾取得沉澱物。

為達前述發明目的，其中該步驟1的攪拌前加入水，該落葵與水的重量比例為1：1~1：20，攪拌溫度是70℃~121℃，攪拌時間是10~200分鐘；該步驟3的醇類為乙醇、甘油、丙二醇(Propylene Glycol)、丙醇、1,3-丁二醇(1,3-Butylene Glycol)、異丁醇、、異戊醇、丁醇、己醇、辛醇、十二醇(月桂醇)、1-十六醇、苯甲醇、香葉醇、芳樟醇、薄荷醇、3-苯丙醇、1-苯丙醇、橙花醇、紫蘇醇，該落葵汁液與該醇類的體積比為1：1~1：6，於10°C以下低溫靜置沉澱；該步驟2與該步驟3之間可以進一步進行濃縮；該步驟3之後可以進一步進行第二次醇類沉澱，取得二次沉澱物，醇類為乙醇、甘油、丙二醇(Propylene Glycol)、丙醇、1,3-丁二醇(1,3-Butylene Glycol)、異丁醇、丙醇、異戊醇、丁醇、己醇、辛醇、十二醇(月桂醇)、1-十六醇、苯甲醇、香葉醇、芳樟醇、薄荷醇、3-苯丙醇、1-苯丙醇、橙花醇、紫蘇醇。

為達前述發明目的，其中該落葵萃取物包含多醣類物質。

綜上所述，本發明以由可食用的落葵屬植物得到萃取物，可以：(1)保護由Aβ或3-NP引起的神經毒性，(2)保護由Aβ或3-NP引起的神經元樹突損傷，(3)在已分化之神經元中抑制Aβ所誘發之神經元再進入細胞週期以及後續之神經細胞凋亡，(4)降低失智症引起的認知與記憶衰退，而達成預防及治療神經退化疾病，包含中風、輕度認知功能障礙、阿茲海默症、巴金森氏症、亨丁頓舞蹈症、肌萎縮側索硬化症、多發性硬化症、小腦萎縮症或思覺失調症的功效。

S01~S05‧‧‧落葵萃取流程

圖1是落葵萃取流程。

圖2A是落葵萃取物(50mg/kg)對阿茲海默症小鼠認知與記憶的影響。

圖2B是落葵萃取物(25mg/kg)對阿茲海默症小鼠認知與記憶的影響。

圖3是不同批次之落葵萃取物對Aβ造成神經毒性的影響。

圖4A是共同處理不同濃度落葵萃取物對Aβ造成神經毒性的影響。

圖4B是前處理不同濃度落葵萃取物對Aβ造成神經毒性的影響。

圖4C是落葵萃取物對Aβ造成神經元樹突損傷影響的共軛焦顯微鏡結果。

圖4D是落葵萃取物對Aβ造成神經元樹突損傷影響的共軛焦顯微鏡結果之樹突總長度分析。

圖4E是落葵萃取物對Aβ造成神經元樹突損傷影響的共軛焦顯微鏡結果之單顆神經細胞樹突長度分析。

圖4F是落葵萃取物對Aβ造成神經元樹突損傷影響的共軛焦顯微鏡結果之樹突總分叉數目分析。

圖4G是落葵萃取物對Aβ造成神經元樹突損傷影響的共軛焦顯微鏡結果之單顆神經細胞樹突分叉數目分析。

圖5是落葵萃取物對Aβ造成之氧化壓力的影響。

圖6是落葵萃取物對Aβ造成細胞凋亡的影響。

圖7A是以免疫螢光染色法偵測落葵萃取物對Aβ刺激已分化神經元再進入細胞週期G1-phase而於神經元中表現cyclin-D1的影響。

圖7B是以西方墨點法偵測落葵萃取物對Aβ刺激大腦皮質神經細胞表現G1-phase標記蛋白質cyclin-D1的影響。

圖7C是以免疫螢光染色法偵測落葵萃取物對Aβ刺激已分化神經元再進入細胞週期G1-phase而於神經元中表現p-Rb的影響。

圖7D是以西方墨點法偵測落葵萃取物對Aβ刺激大腦皮質神經細胞表現G1-phase標記蛋白p-Rb的影響。

圖7E是以免疫螢光染色法偵測落葵萃取物對刺激已分化神經元再進入細胞週期S-phase而於神經元中表現PCNA的影響。

圖7F以西方墨點法偵測落葵萃取物對Aβ刺激大腦皮質神經細胞表現S-phase標記蛋白質PCNA的影響。

圖7G是以西方墨點法偵測落葵萃取物對Aβ刺激大腦皮質神經細胞表現G2/M-phase標記蛋白質p-Histone H3的影響。

圖7H是以西方墨點法偵測落葵萃取物後處理對Aβ刺激大腦皮質神經細胞表現G1-phase標記蛋白質cyclin-D1的影響。

圖7I是以西方墨點法偵測落葵萃取物後處理對Aβ刺激大腦皮質神經細胞表現G1-phase標記蛋白質p-Rb的影響。

圖7J是以西方墨點法偵測落葵萃取物後處理對Aβ刺激大腦皮質神經細胞表現S-phase標記蛋白質PCNA的影響。

圖7K是以西方墨點法偵測落葵萃取物後處理對Aβ刺激大腦皮質神經細胞表現G2/M-phase標記蛋白質p-Histone H3的影響。

圖7L是以西方墨點法偵測落葵萃取物後處理對Aβ刺激大腦皮質神經細胞表現凋亡標記蛋白質cleaved caspase-3的影響。

圖8是不同批次之落葵萃取物對3-NP造成神經毒性的影響。

圖9A是落葵萃取物對3-NP造成細胞死亡的共軛焦顯微鏡結果。

圖9B是不同濃度落葵萃取物對3-NP造成神經毒性的影響。

圖9C是前處理不同濃度落葵萃取物對3-NP造成神經毒性的影響。

圖9D是落葵萃取物對3-NP造成神經元樹突損傷的共軛焦顯微鏡結果。

圖9E是落葵萃取物對3-NP造成神經元樹突損傷影響的共軛焦顯微鏡結果之樹突總長度分析。

圖9F是落葵萃取物對3-NP造成神經元樹突損傷影響的共軛焦顯微鏡結果之樹突總分叉數目分析。

圖9G落葵萃取物與3-NP對後突觸蛋白質PSD-95表現量的影響。

圖9H是落葵萃取物對3-NP造成氧化壓力的影響。

圖9I是落葵萃取物對3-NP造成細胞凋亡的影響。

本發明之新穎技術特徵，包含特定特徵，係揭示於申請專利範圍，針對本發明之技術特徵，較佳之理解茲配合說明書、依據本發明原理之實施例、和圖式將本發明較佳之實施例詳細說明。

發明說明書及申請專利範圍中所述之所有技術性及科學用語，除非另有所定義，皆依據以下敘述定義之。其中單數用語「一」、「一個」、「該」，除非另有說明，皆可指涉多於一個對象。除非另有說明，本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。本說明書使用之「或」、「以及」、「和」，除非另有說明，皆指涉「或/和」。此外，用語「包含」、「包括」皆非有所限制之開放式連接詞。前述段落僅為系統性之指涉而不應解釋為對發明主體之限制。除非另有說明，本發明所用之材料皆市售易於取得。

本說明書用語「有效量(effective amount)」或「治療(therapeutically)有效量」，係指涉化合物或藥物之一足夠量，可於服用者服藥後減輕一或多項疾病症狀或生理狀況；其結果為降低和/或緩和徵象(sign)、症狀(symptom)、或病因，或為其他生理系統之有意圖之改變。舉例而言，治療之「有效量」係包含一本發明提供化合物之可於臨床上顯著降低疾病症狀之劑量。一適當之有效量，其有效值取決於通常藥學技術，如藥物增量方法(dose escalation methods)。

本說明書用語「組合物」，係指涉一產物，該產物係來自混和或組合多於一種活性成分，並且該產物之活性成分係組合藥或非組合藥之組合物。用語「組合藥」說明其活性成分及其助劑(co-agent)係同時以一藥劑給予服用者；用語「非組合藥」說明其活性成分及其助劑(co-agent)係以分離之藥劑同時、分別、或依序地施予服用者且無限制其用藥間隔，前述施予提供服用者於體內具有有效量之多種化合物；其中該非組合藥可應用於雞尾酒療法，即施予三種或多種活性成分。

本說明書用語「治療」、「治療中」、「療法」，係包含以治療或預防之方式緩和、減輕、或改善至少一項疾病症狀或生理狀況、預防新增之症狀、抑制疾病或生理狀況、阻止或減緩疾病發展、造成疾病或生理狀況之復原、減緩因疾病造成的生理狀況、停止疾病症狀或生理狀況。

本說明書用語「約」在此處係指一指定數值之±20%，或較佳±10%。

本說明書用語「醇類」在此處係指乙醇、甘油、丙二醇 (Propylene Glycol)、丙醇、1,3-丁二醇(1,3-Butylene Glycol)、異丁醇、丙醇、異戊醇、丁醇、己醇、辛醇、十二醇(月桂醇)、1-十六醇、苯甲醇、香葉醇、芳樟醇、薄荷醇、3-苯丙醇、1-苯丙醇、橙花醇、紫蘇醇。

適當之給藥途徑包含但不限於口服、靜脈、直腸、氣霧、腸胃道、眼、肺、黏膜穿透、皮膚穿透、陰道、耳、鼻、局部給藥。

以下治療實施僅為例示，由於個體治療療程之變異極大，而大量的建議值之偏離並非異常。劑量可依據變異而改變，而不限於使用之化合物之活性、治療疾病或生理狀態、給藥方式、個體需求、疾病嚴重性、及醫師判斷。

治療療程之毒性和療效可藉由細胞培養或動物實驗之標準醫藥程序而判定，包括但不限於判斷半數有效劑量(ED₅₀，治療效果達成試驗體半數具有療效之劑量)。

本發明所使用的原料為落葵(Basella alba L.)，別名為皇宮菜、木耳菜、潺菜、豆腐菜(雲南)等。落葵萃取方法如圖1與表1所示：步驟1、落葵磨碎攪拌(S01)：新鮮或冷凍落葵加水或不加水磨碎攪拌，落葵與水的重量比例為1：1~1：20，冷凍落葵的重量以冷凍前重量計算；步驟2、高溫萃取(S02)：以70℃~121℃加熱10~200分鐘；步驟3、過濾去除殘渣取得落葵汁液(S03)；步驟4、第一次乙醇沉澱取得沉澱物(S04)：加入乙醇，落葵汁液與乙醇的體積比為1：1~1：6，於10℃以下低溫靜置，過濾取得沉澱物；步驟5、冷凍乾燥得到落葵萃取物粉末(S05)。

前述步驟3過濾去除殘渣取得落葵汁液後可以進行濃縮；前述步驟4第一次乙醇沉澱取得沉澱物後可以進行第2次乙醇沉澱，沉澱物與乙醇的體積比為1：0.5~1：6，經過濾得到二次沉澱物。

前述落葵萃取物粉末含落葵多醣，如表2所示；總多醣含量在80%以上，其中6號為91.2%、8號為93.7%、12號為91%；總多醣含量中的糖醛酸比例(糖醛酸/總醣含量)差異較大，其中6號為48.0%、8號為52.3%、12號為2.8%；落葵萃取物的單醣組成包含葡萄糖(Glucose)、果糖(Fructose)、甘露糖(Mannose)、鼠李糖(Rhamnose)、海藻糖(Fucose)、半乳糖(Galactose)、阿拉伯糖(Arabonose)、木糖(Xylose)，如表3所示，其中以葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量最多。

落葵萃取物水溶液(簡稱PBA)製備：落葵萃取物粉末溶於二次水，經高溫高壓溶解後，離心去除不可溶部分製備而成，濃度為配製時每一毫升PBA中含有五毫克落葵萃取物粉末(含有不可溶部分)。

實施例1：PBA對阿茲海默症動物模式辨識新物體測試記憶法(novel object recognition test，簡稱NOR)的影響

動物體內試驗流程，如圖1所示，採用雄性APPswePS1dE9阿茲海默症模式小鼠，經基因檢測選擇出阿茲海默基因轉殖小鼠(AD型)與同窩野生型(wild-type littermate、即WT型)，於七個月大時分組，口服給藥(oral gavage)給予離心過的PBA，每週給予三次。持續服藥一個月後(即八個月大時)進行NOR測試，過程中每次給藥皆監測小鼠個別體重的變化，以評估藥物對小鼠生理機能的影響。

本實驗中將小鼠分為四組，1. WT：WT小鼠控制組，沒有餵食PBA(N=16)；2. AD：AD小鼠控制組，沒有餵食PBA(N=9)；3. AD+PBA(50mg/kg)：AD小鼠實驗組，投予50mg/kg PBA(6號，N=9)；4. AD+PBA(25mg/kg)：AD小鼠實驗組，投予25mg/kg PBA(6號，N=3)。

NOR是一種已被使用超過一個世紀的動物記憶功能測試實驗，利用動物(在本案實驗例使用小鼠)對於未曾見過之物體的基於警戒或好奇等原因而產生的先天性探索慾望，來測試動物的記憶能力。NOR有許多不同的變化型和操作手法，核心概念為先給予動物探索某相同兩物後間隔一段時間，將其中一物換為未曾見過之異物，如果動物的記憶功能較佳，應能記得其中一物件已於先前探索過，故會花費較長時間探索未曾見過之異物。反之，如果動物的記憶力存在缺陷，不記得兩物其一已經被探索過，則對其來說兩相異物件皆為全新陌生，故花費在探索兩物的時間比例上會較為接近。典型的NOR為在相同場所中放置不同物件的記憶功能評估，不涉及空間概念，是故測試結果與工作記憶(working memory)、時序記憶(temporal order memory)、情節相似記憶(episodic-like memory)等相關，而少空間記憶(spatial memory)參與，並可依據操作間隔時間的長短調整，同時評估動物的短期、中期與長期記憶。

本案實施例中操作NOR試驗的方式為將小鼠置於一白色空箱中(open field)任其自由探索十分鐘，每天一次持續三天使其習慣實驗場域，於第四天放入兩相同紫色球體(以下簡稱同物)供其探索十分鐘，第五天將其中一球體換成粉色長方柱體(以下簡稱異物)並同樣給予十分鐘的探索時間。第四天與第五天的探索全程錄影，人工分析影片數據，計算小鼠探索個別物體的時間(僅將距離物件三公分之內的正面視線接觸、前肢碰觸，鼻吻與鬍鬚碰觸、攀爬物件、啃咬物件行為視為探索動作)記錄單位為秒數。第四天兩相同物件中個別物件接觸時間差大於10秒的個體，數據不列入計算，第五天兩相異物件接觸總時間須超過15秒才採納數據，最終實驗動物採納隻數(N值)如前述。

圖2A結果顯示數值為第五天異物接觸時間減去同物接觸時間除以兩物接觸總時間(異物接觸時間加上同物接觸時間)的絕對值，數值皆為正數。WT型小鼠平均獲得分數為0.6，其對異物有較大的好奇心並能分辨同物已於昨天探索過，服食PBA並未進一步增強WT型小鼠的分數(數據未呈現)；AD型小鼠在未服藥的情況下得分僅有0.4左右，相較於WT型小鼠未給予PBA組其P值小於0.05達統計差異；而AD型小鼠在餵食50mg/kg的6號PBA一個月之後，其物件記憶認知功能相較於未服藥AD型組別有改善(P值小於0.05)，得分接近WT組；服食較低劑量25mg/kg而AD型小鼠在餵食PBA一個月之後，其物件記憶認知功能相較於未服藥AD型組別似乎略有改善，但可能由於試驗動物隻數尚不足(僅3隻)，故呈現出趨勢但未達統計差異；另外，服食較高劑量100mg/kg 6號PBA的AD型小鼠記憶改善情況雖較50mg/kg 6號PBA組別為差，仍然高於未服藥AD型小鼠，但統計上未達顯著差異(數據未呈現)。五組小鼠於服藥期間體重監測趨勢皆同於WT未服藥組別，PBA並未顯著影響小鼠體重變化。綜合以上結果，PBA具有對於改善雄性APPswePS1dE9品系阿茲海默模式小鼠記憶的功效。

前述小鼠實驗使用劑量為10~100mg/kg，依據2005年美國食品藥物管理局所公告之實驗初期估算方法(Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)，人體與小鼠之換算系數為12.3倍計算，換算至人體劑量為0.8~8.0mg/kg；本發明所屬領域具有通常知識者可明顯得知前述實施例僅為例示，實際有效量係指涉化合物或藥物之一足夠量，可於服用者服藥後減輕一或多項疾病症狀或生理狀況；其結果為降低和/或緩和徵象、症狀、或病因，或為其他生理系統之有意圖之改變，其有效值取決於通常藥學技術，如藥物增量方法。具本發明所屬技術領域通常知識者可藉由諸多變換、替換而實施，而不與本發明之技術特徵有所差異。依據說明書實施例，本發明可有多種變換仍無礙於實施。本說明書提供之請求項界定本發明之範圍，該範圍涵蓋前述方法與結構及與其相等之發明。

實施例2：PBA在細胞模式對Aβ造成神經毒性的影響存在於人體大腦中的Aβ長度不一，約39至43個胺基酸，但過去已有很多研究證明人工合成之Aβ第25至35個胺基酸胜肽(Aβ25-35)即具有神經毒性；本發明利用初代培養大鼠大腦皮質神經細胞為模型，以Aβ25-35(10μM)同時加入PBA(200μg/ml)處理48小時後以碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色測定細胞存活率。圖3結果表示單獨處理6號PBA或12號PBA不影響細胞存活，Aβ25-35處理後細胞的存活率小於50%，不論是6號PBA或12號PBA與Aβ25-35同時處理都可以抑制Aβ所造成的細胞毒性而恢復神經細胞存活，6號PBA更幾乎完全恢復細胞存活率，達到完全保護神經細胞免於Aβ毒性的作用。

利用初代培養大鼠大腦皮質神經細胞為模型，以Aβ25-35處理48小時後測定粒線體的還原能力以作為細胞存活的指標。圖4A結果表示細胞同時加入6號PBA與Aβ25-35處理48小時，觀察細胞存活率，6號PBA在10-300μg/mL劑量範圍可以提高存活率，表示有效抑制Aβ25-35所造成的神經毒性，此抑制Aβ25-35神經毒性功效具有劑量的依存性，6號PBA在200-500μg/mL劑量範圍則達到幾乎完全保護的作用。以PBA前處理8小時，再加入Aβ25-35處理48小時，觀察細胞存活率。圖4B結果顯示300-500μg/mL劑量範圍6號PBA、7號PBA、8號PBA前處理可以部份抑制Aβ25-35所造成的神經毒性，但並未達到完全保護且尚未具有統計差異。

以PBA(200μg/ml)與Aβ25-35(10μM)共同處理48小時，以共軛焦顯微鏡的實驗證實6號PBA恢復因為Aβ25-35所造成的神經元樹突損傷(圖4C)，量化結果則顯示PBA可以恢復因Aβ25-35所造成的樹突總長度(圖4D)以及分叉數目(圖4F)的降低，計算單顆神經細胞的樹突長度(圖4E)以及分叉數目(圖4G)也得到類似的結果。

為測試PBA是否具有抗氧化的效果，本實驗利用一種試劑CellROX®，在細胞產生過多自由基的時候會發出綠色螢光，圖5的實驗結果顯示在加入CellROX®(5μM)後，以PBA(200μg/ml)與Aβ25-35(10μM)共同處理16小時發現6號PBA有效降低因Aβ25-35所產生的綠色螢光，代表PBA可以降低自由基產量而具有抗氧化的作用。

已知Aβ25-35會造成細胞凋亡，細胞凋亡的過程中pro-caspase-3會被切割產生具活性之cleaved caspase-3，因此以caspase-3 cleavage的量即可以代表細胞凋亡的指標，本實施例以西方墨點法定量caspase-3。圖6結果顯示以PBA(200μg/ml)與Aβ25-35(10μM)共同處理24或 48小時，6號PBA皆可以完全抑制因Aβ25-35所造成之caspase-3 cleavage，代表PBA具有抗凋亡的效用。

相較於處於分裂狀態的細胞，已完全分化的神經元處於G0狀態，但是神經細胞在受到外界在壓力刺激時，往往會試圖重新再度進入細胞週期，但是無法順利走過有絲分裂而改為走向細胞凋亡。利用初代培養大腦皮質神經細胞(其中約85%為神經細胞，15%為其他的細胞，例如星狀體細胞)為模型，本實驗測試落葵多醣萃取物PBA是否能夠透過抑制類澱粉乙型蛋白(Aβ)所誘發之神經元再進入細胞週期以及後續之細胞凋亡現象。以Aβ25-35(10μM)同時加入PBA(250μg/ml)處理24小時後進行免疫螢光染色，圖7A中紅色代表神經細胞標記蛋白質MAP-2，綠色代表G1-phase標記蛋白質cyclin-D1，藍色代表以赫斯特染色(Hoechst staining)染上顯微鏡視野下所有細胞核，從63倍顯微鏡放大圖可以觀察到Aβ25-35顯著增加表現MAP-2之成熟神經元被染上cyclin-D1的細胞數，而126倍顯微鏡放大圖可以更明顯觀察到這些染上綠色cyclin-D1的細胞與紅色MAP-2神經元是同一顆細胞，量化的結果確認PBA可以完全抑制Aβ25-35所導致的cyclin-D1⁺/MAP-2⁺細胞數；除了免疫螢光染色之外，圖7B中西方墨點法的結果也證明在初代培養的大腦皮質神經細胞中，PBA可以完全抑制類澱粉乙型蛋白所增加的cyclin-D1蛋白質表現。這些結果都顯示PBA可以完全抑制類澱粉乙型蛋白所造成的神經元再進入細胞週期的G1-phase。

利用p-Rb作為另外一個G1-phase的標記蛋白，圖7C與圖7D的實驗結果分別顯示PBA可以完全抑制Aβ25-35所導致的p-Rb⁺/MAP-2⁺細胞數以及在初代培養大腦皮質神經細胞中PBA可以完全抑制類澱粉乙型蛋白所增加的G1-phase標記蛋白p-Rb蛋白質表現量。

以PCNA作為一個S-phase的標記蛋白，圖7E與7F的實驗結果分別顯示PBA可以完全抑制Aβ25-35所導致的PCNA⁺/MAP-2⁺細胞數以及在初代培養大腦皮質神經細胞中PBA可以完全抑制類澱粉乙型蛋白所增加的S-phase標記蛋白PCNA蛋白質表現量。

圖7G的西方墨點法實驗結果顯示在初代培養大腦皮質神經細胞中PBA可以完全抑制類澱粉乙型蛋白所增加的G2/M-phase標記蛋白p-Histone H3蛋白質表現量。

以類澱粉乙型蛋白Aβ25-35與落葵多醣萃取物PBA共同處理初代培養的大腦皮質神經細胞時，不能排除落葵多醣萃取物在細胞培養液中與類澱粉乙型蛋白Aβ25-35直接產生交互作用而抑制其毒性的可能；若真是如此，代表落葵多醣萃取物並沒有對神經細胞產生實質上的影響(例如活化神經保護機制的訊息傳遞路徑等)，如此臨床意義並不大。為了排除這個可能性，神經細胞先以Aβ25-35(10μM)處理2小時，接著移除含Aβ25-35的培養液，之後再加入新鮮且含有PBA(250μg/ml)的培養液再處理22小時，這樣Aβ25-35與PBA就不會同時存在於培養基當中，兩者不可能產生交互作用。圖7H顯示在初代培養大腦皮質神經細胞中PBA後處理22小時可以完全抑制因Aβ25-35前處理2小時所增加的G1-phase標記蛋白cyclin-D1蛋白質表現量。

圖7I顯示在初代培養大腦皮質神經細胞中PBA後處理22小時可以完全抑制因Aβ25-35前處理2小時所增加的G1-phase標記蛋白p-Rb蛋白質表現量。

圖7J顯示在初代培養大腦皮質神經細胞中PBA後處理22小時可以完全抑制因Aβ25-35前處理2小時所增加的S-phase標記蛋白PCNA蛋白質表現量。

圖7K顯示在初代培養大腦皮質神經細胞中PBA後處理22小時可以完全抑制因Aβ25-35前處理2小時所增加的G2/M-phase標記蛋白p-Histone H3蛋白質表現量。

圖7L顯示在初代培養大腦皮質神經細胞中PBA後處理22小時可以完全抑制因Aβ25-35前處理2小時所增加的細胞凋亡標記蛋白cleaved caspase-3表現量。

依據前述結果，由大腦皮質神經細胞模式的結果證實PBA可以有效抑制類澱粉乙型蛋白之神經毒性，促進樹突再生，並且具有抗氧化及抗凋亡的作用。此外，不管是經由類澱粉乙型蛋白與落葵多醣萃取物共同處理的實驗，或是透過先處理類澱粉乙型蛋白2小時再處理落葵多醣萃取物22小時的前後分開處理的實驗，其結果都一致證明PBA可以有效抑制類澱粉乙型蛋白所誘發之已分化神經元再進入細胞週期的現象，因而達到神經保護的效果。

實施例3：PBA在細胞模式對3-NP造成神經毒性的影響

三硝基丙酸(3-nitropropionic acid，3-NP)，屬於粒線體複合體II之不可逆抑制劑，主要影響succinate dehydrogenase的作用，對於紋狀體具專一性影響，會造成紋狀體之傷害，其引發之病理特徵與亨丁頓舞蹈症臨床特徵極為相似；此外，巴金森氏症等其他多數神經退化性疾病致病機轉也都與粒線體失衡或損傷直接相關。利用初代培養大腦皮質神經細胞為模型，以PBA(500μg/ml)加入3-NP(2.5mM)處理24小時後以碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色偵測細胞膜破裂而被染上的死細胞來定量細胞存活率；圖8結果顯示單獨處理6號PBA或12號PBA不影響細胞存活率，3-NP處理後細胞的存活率小於70%，不論是6號PBA或12號PBA與3-NP同時處理都可以大幅度降低3-NP所造成的細胞死亡，恢復細胞存活，其中12號PBA更是幾乎達到完全抑制3-NP毒性之神經保護的作用。

進一步觀察不同濃度6號PBA對3-NP神經毒性的影響，同樣利用初代培養大腦皮質神經細胞處理為模型，以3-NP(2.5mM)加入PBA(100~500μg/ml)處理24小時後以赫斯特染色(Hoechst staining)染上顯微鏡視野下所有細胞，再配合碘化丙啶(PI)染上同一視野下死亡的細胞，藉此計算細胞死亡程度。在同一視野下，也可以單純分析赫斯特染上的細胞和形狀來判斷細胞存活，細胞核若被赫斯特均勻染上而成橢圓形或圓形則被歸類為正常健康的細胞，若細胞核皺縮而被赫斯特染上的螢光顯得過於明亮則被歸類為凋亡或死亡的細胞，計數時僅計算正常健康之細胞。圖9A為以碘化丙啶(PI)和赫斯特(Hoechst)雙重染色的一個代表性結果，顯示初代培養大鼠大腦皮質神經細胞經過3-NP(2.5mM)處理24小時後，3-NP顯著增加PI染上的死細胞數，其中箭頭處為染上PI的細胞核，表示死亡的細胞，而共同處理PBA(500μg/ml)則可以有效降低3-NP所造成的細胞死亡程度。圖9B是以同樣方法測試PBA保護效果的劑量依存性，以赫斯特染上的健康細胞數計算存活率，未經任何處理的對照組細胞為100%。圖9B結果顯示3-NP處理後存活率剩約一半，而同時處理PBA可以回復細胞存活而造成神經保護作用，且具有劑量的依存性，事實上400μg/ml與500μg/ml劑量的PBA幾乎完全回復細胞存活率至與未處理3-NP的對照組相當。除了共同處理之外，前處理PBA也可以造成對3-NP神經毒性的保護作用，圖9C結果顯示在前處理PBA(500μg/ml)8小時候再處理3-NP(2.5mM)24小時可以部份回復細胞存活率，但效果顯然沒有共同處理好。

由於初代培養大腦皮質細胞是一種混合培養的系統，神經元(neuron)約占85%而星狀細胞(astrocyte)約占15%，因此我們以免疫螢光染色觀察神經細胞形狀時，同時也會染星狀細胞以及所有細胞的核來作為對比。將大腦皮質細胞以3-NP(2.5mM)和PBA(500μg/ml)共同處理24小時(圖9D、圖9E、圖9F)，圖9D代表同時染色MAP-2、GFAP、赫斯特(Hoechst)的結果，MAP-2呈現紅色螢光是神經元(neuron)的標誌蛋白，GFAP呈現綠色螢光是星狀細胞(astrocyte)的標誌蛋白，赫斯特(Hoechst)染上所有細胞的細胞核且呈現藍色螢光。圖9D結果顯示神經元因為3-NP而造成損傷，這可以從萎縮斷裂的樹突來判斷，而PBA可以明顯恢復因3-NP所造成的樹突萎縮斷裂，幾乎完全回復其長度及複雜度。以軟體量化分析同一視野下樹突總長度也確認PBA也可以增加因3-NP所減少的樹突總長度(圖9E，代表樹突完整性)以及樹突總分岔數目(圖9F，代表樹突複雜度)。PSD-95是後突觸上的一個蛋白質，因此可以其表現量間接代表突觸的數量。神經細胞同時以3-NP(2.5mM)和PBA(500μg/ml)處理8小時，由圖9G結果可以發現3-NP處理明顯降低PSD-95表現，但同時處理PBA則可以回復PSD-95表現，顯示神經元受3-NP影響而降低的突觸數量可經由PBA處理而恢復。

PBA具有保護神經元不受粒線體抑制劑毒性的影響，但其機轉仍待探討。以初代培養大腦皮質神經細胞共同處理3-NP(2.5mM)和PBA (500μg/ml)2小時候再加入CellROX^® Green試劑染色偵測細胞中的活性氧(reactive oxygen species，ROS，箭號所指綠色螢光細胞)，結果顯示細胞同時處理PBA可以顯著降低因3-NP而增加的ROS生成(圖9H)；初代培養大腦皮質神經細胞加入3-NP(2.5mM)和PBA(500μg/ml)處理12小時，以西方墨點法觀察細胞的pro-caspase-3、cleaved caspase-3和tubulin，結果如圖9I，caspase-3是細胞凋亡標誌、tubulin則作為內參對照，細胞同時處理PBA可以顯著降低因3-NP而增加的cleaved caspase-3，也就是說PBA可以幾乎完全抑制因為3-NP所引起的神經細胞凋亡。這些結果顯示PBA具有抗氧化與抗凋亡的作用。

依據前述結果，由大腦皮質神經細胞模式的結果證實PBA可以有效抑制3-NP之神經毒性，促進neurite再生，並且具有抗氧化及抗凋亡與恢復突觸數量的作用。

於本說明書較佳實施例揭示之內容，本發明所屬領域具有通常知識者可明顯得知前述實施例僅為例示；具本發明所屬技術領域通常知識者可藉由諸多變換、替換而實施，而不與本發明之技術特徵有所差異。依據說明書實施例，本發明可有多種變換仍無礙於實施。本說明書提供之請求項界定本發明之範圍，該範圍涵蓋前述方法與結構及與其相等之發明。

Claims

一種落葵萃取物用於製備預防或治療神經系統疾病醫藥組合物之用途，萃取自落葵屬植物。
一種包含落葵萃取物之組合物用於預防或治療神經系統疾病組合物之用途，萃取自落葵屬植物，其中該組合物包含健康食品、動物性食品、動物性藥品。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該神經系統疾病是神經退化疾病，包含失智症或運動疾患。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該失智症包含阿茲海默症、血管型失智症、額顳葉型失智症、路易士體失智症或輕度認知功能障礙。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該神經系統疾病是粒線體損傷相關的神經系統疾病。
如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該粒線體損傷相關的神經系統疾病是黑質或紋狀體損傷相關的神經系統疾病。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該治療阿茲海默症包括延緩阿茲海默症之認知力損傷發作或延緩記憶力損傷發作。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該運動疾患包含巴金森氏症、亨丁頓舞蹈症、肌萎縮側索硬化症、小腦萎縮症或多系統萎縮症。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該神經系統疾病是細胞週期異常。
如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該細胞週期異常是神經系統腫瘤。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，該落葵萃取物的萃取步驟為：步驟1、新鮮或冷凍落葵磨碎不加水、或加水或醇類攪拌；步驟2、過濾去除殘渣取得落葵汁液；步驟3、加入醇類沉澱，過濾取得沉澱物。
如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該步驟1的攪拌前加入水，該落葵與水的重量比例為1：1~1：20，攪拌溫度是70℃~121℃，攪拌時間是10~200分鐘；該步驟3的醇類為乙醇、甘油、丙二醇(Propylene Glycol)、丙醇、1,3-丁二醇(1,3-Butylene Glycol)、異丁醇、丙醇、異戊醇、丁醇、己醇、辛醇、十二醇(月桂醇)、1-十六醇、苯甲醇、香葉醇、芳樟醇、薄荷醇、3-苯丙醇、1-苯丙醇、橙花醇、紫蘇醇，該落葵汁液與該醇類的體積比為1：1~1：6，於10℃以下低溫靜置沉澱；該步驟2與該步驟3之間可以進一步進行濃縮；該步驟3之後可以進一步進行第2次醇類沉澱，取得二次沉澱物，醇類為乙醇、甘油、丙二醇(Propylene Glycol)、丙醇、1,3-丁二醇(1,3-Butylene Glycol)、異丁醇、丙醇、異戊醇、丁醇、己醇、辛醇、十二醇(月桂醇)、1-十六醇、苯甲醇、香葉醇、芳樟醇、薄荷醇、3-苯丙醇、1-苯丙醇、橙花醇、紫蘇醇。
如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該落葵萃取物包含多醣類物質。