TW202039533A - 重組病毒載體及用於生產其之核酸 - Google Patents

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Abstract

本文描述用於生產重組腺相關病毒(rAAV)載體之核酸、AAV轉移卡匣及質體。所揭示之核酸、卡匣及質體包含表現一或多種轉殖基因之序列，該轉殖基因在一或多種疾病或病症之改善、治療及/或預防中具有治療功效。

Description

重組病毒載體及用於生產其之核酸
本發明係關於分子生物學及基因療法之領域。更特定言之，本發明係關於用於生產重組病毒載體之組合物及方法。
包括腺相關病毒載體(AAV)之重組病毒載體適用作基因遞送劑，且為用於人類基因療法之強大工具。使用AAV，可活體內及活體外實現多種細胞中高頻穩定之DNA整合及表現。不同於一些其他病毒載體系統，AAV不需要活性細胞分裂用於在目標細胞中穩定整合。
可使用病毒生產細胞株在培養物中生產重組AAV載體。重組AAV之生產通常需要細胞中存在三種元件：1)包含由AAV反向末端重複序列(ITR)側接之轉殖基因之核酸，2) AAV rep及cap基因，及3)輔助病毒蛋白質序列。此等三種元件可設置於一或多種質體上，且經轉染或轉導至細胞中。
重組AAV載體之生產及使用已受到不能將轉殖基因DNA有效封裝至病毒衣殼中且在目標細胞中有效地表現轉殖基因之限制。因此，此項技術中需要用於生產重組AAV載體之改良組合物及方法。
本文描述包含AAV轉移卡匣之核酸。所揭示之核酸可用於生產重組腺相關病毒(AAV)載體。所揭示之核酸及轉移卡匣包含一或多種轉殖基因之序列，該一或多種轉殖基因在一或多種疾病或病症之改善、治療及/或預防中具有治療功效。
在一些實施例中，本發明提供一種核酸，其自5'至3'包含5'反向末端重複序列(ITR)、啟動子、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號及3' ITR。在一些實施例中，該轉殖基因序列編碼共濟蛋白(frataxin，FXN)蛋白質。FXN蛋白質可為例如人類FXN蛋白質。在一些實施例中，該FXN蛋白質具有SEQ ID NO: 65之序列或與其至少95%一致之序列。在一些實施例中，該核酸包含SEQ ID NO: 28-64中之任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，該5' ITR與該3' ITR具有相同長度。在一些實施例中，該5' ITR及該3' ITR具有不同長度。在一些實施例中，該5' ITR及該3' ITR中之至少一者的長度為約110至約160個核苷酸。該5' ITR及該3' ITR中之至少一者可分離自或衍生自例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、rhAAV74、鳥AAV或牛AAV之基因組。在一些實施例中，該5' ITR包含SEQ ID NO: 1之序列或與其至少95%一致之序列。在一些實施例中，該3' ITR包含SEQ ID NO: 2之序列或與其至少95%一致之序列。在一些實施例中，該3' ITR包含SEQ ID NO: 3之序列或與其至少95%一致之序列。
該啟動子可驅動轉殖基因之表現。在一些實施例中，該啟動子為組成型啟動子。在一些實施例中，該啟動子為誘導型啟動子。在一些實施例中，該啟動子為組織特異性啟動子。在一些實施例中，該啟動子為野生型啟動子之修飾形式。舉例而言，由於AAV之封裝限制，啟動子之長度可縮短。在一些實施例中，該啟動子為野生型啟動子之截短形式。
該啟動子可為例如CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子、多角體蛋白(polyhedrin)啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1 α啟動子、EF-1 α短啟動子、EF-1 α核心啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子或磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在一些實施例中，該啟動子包含選自SEQ ID NO: 6至12中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，該轉殖基因序列經CpG最佳化。在一些實施例中，該轉殖基因序列包含SEQ ID NO: 19或20或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，該核酸包含緊接該轉殖基因序列之5'的科札克序列(Kozak sequence)。該科札克序列可包含例如序列SEQ ID NO: 17或18或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，該多腺苷酸化信號係選自猴病毒40 (SV40)、人類α-球蛋白、兔α-球蛋白、人類β-球蛋白、兔β-球蛋白、人類膠原蛋白、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)之多腺苷酸化信號。在一些實施例中，該多腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 21至24中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，該核酸進一步包含強化子。該強化子可為例如CMV強化子。在一些實施例中，該強化子包含SEQ ID NO: 4或5之序列或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，該核酸進一步包含內含子序列。該內含子序列可為例如嵌合序列或雜交序列。在一些實施例中，該內含子序列包含分離自或衍生自以下基因中之一或多者之序列：β-球蛋白、雞β-肌動蛋白、小鼠微小病毒及人類IgG。在一些實施例中，該內含子序列包含SEQ ID NO: 13至16中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，該核酸進一步包含至少一個填充序列(例如1、2、3、4或5個填充序列)。在一些實施例中，該至少一個填充序列包含SEQ ID NO: 25至27中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
本文亦提供一種包含本發明之核酸的載體(例如，AAV載體或質體)。
亦提供一種包含本發明之核酸的細胞。
亦提供一種生產重組AAV載體之方法，該方法包含使AAV生產細胞與本發明之核酸或質體/桿狀病毒質體(bacmid)接觸。亦提供藉由此方法生產之重組AAV載體。該重組AAV載體可包含來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV或牛AAV之衣殼蛋白。在一些實施例中，該AAV載體可包含與野生型AAV衣殼蛋白相比具有一或多個取代或突變之衣殼蛋白。在一些實施例中，該重組AAV載體為單股的(ssAAV)。在一些實施例中，該重組AAV載體為自互補的(scAAV)。
亦提供包含本發明之核酸、質體、桿狀病毒質體、細胞或重組AAV載體之組合物。
亦提供一種用於治療有需要之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之核酸、質體、細胞或重組AAV載體。在一些實施例中，該個體為人類個體。在一些實施例中，該個體患有弗里德希氏共濟失調(Friedreich's Ataxia，FRDA)。
此等及其他實施例更詳細地闡述於下文所述之實施方式中。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2018年11月21日申請之美國臨時申請案第62/770,202號之優先權，該申請案出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。 有關以電子方式提交之正文檔案的說明
在此以電子方式提交之正文檔案的內容以全文引用之方式併入本文中：序列表之電腦可讀形式複本(檔案名：STRD-011-01WO_Sequence_Listing.txt，記錄日期：2019年11月21日，檔案大小~145千位元組)。
基因療法對於治療及預防包括例如弗里德希氏共濟失調(FRDA)之遺傳疾病及病症具有極大前景。FRDA係通常由共濟蛋白(FXN)基因中之突變造成的常染色體隱性遺傳病。在美國在50,000人中約1人患有FRDA。典型發作年齡在約5與約18歲之間。症狀在個體中不同，但可包括(i)手臂及腿中之協調損失(共濟失調)，(ii)疲勞/能量剝奪及肌肉損失，(iii)視覺障礙、聽力損失及言語不清，(iv)侵襲性脊柱側彎(脊柱彎曲)，(v)糖尿病(典型地胰島素依賴型)，及(vi)嚴重心臟病病況(例如肥厚型心肌病及心律不齊)。患有FRDA之個體的心理能力保持完好。目前不存在針對FRDA之治療；監測個體以進行症狀管理。因此，此項技術中需要治療及/或預防FRDA之組合物及方法。
本文提供包含AAV轉移卡匣之核酸，其用於生產AAV載體。AAV載體可用於基因療法應用，例如用以將治療性轉殖基因遞送至細胞或有需要之個體。本發明之AAV轉移卡匣及載體可用於治療或預防各種遺傳疾病及病症，諸如FRDA。
本說明書中所引用之所有論文、公開案及專利均以引用之方式併入本文中，如同各個別論文、公開案或專利具體地且個別地指示以引用之方式併入一般，且以引用之方式併入本文中以揭示及描述與所引用之公開案有關的方法及/或材料。
除非上下文另外指示，否則尤其希望本文所述之各種特徵可以任何組合使用。章節標題在本文中用於組織之目的，且並不意欲為限制性的。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬領域者通常所理解相同的含義。本文實施方式中使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且並不意欲為限制性的。定義
以下術語用於本文之描述及隨附申請專利範圍中：
除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」以及「該(the)」亦意欲包括複數形式。
此外，當提及可量測值，諸如聚核苷酸或多肽序列之量或長度、劑量、時間、溫度及其類似者時，如本文所用之術語“約”意謂包涵指定量之±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%之變化。
亦如本文所用，「及/或」係指且涵蓋相關聯之所列項目中之一或多者的任何及所有可能組合，以及在替代方案(「或」)中解釋時組合之缺乏。
「核酸」或「聚核苷酸」為核苷酸鹼基序列，例如RNA、DNA或DNA-RNA雜交序列(包括天然存在之核苷酸與非天然存在之核苷酸)。在一些實施例中，本發明之核酸為單股或雙股DNA序列。核酸之長度可為1-1,000、1,000-10,000、10,000-100,000、100,000-1百萬或超過1百萬個核苷酸。核酸一般將含有磷酸二酯鍵，但在一些情況下，包括可具有替代主鏈的核酸類似物，該等替代主鏈包含例如磷醯胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基胺基磷酸酯或P-乙氧基鍵或肽核酸主鏈及鍵。其他類似物核酸包括具有正主鏈、非離子主鏈及非核糖主鏈之彼等核酸。含有一或多個碳環糖之核酸亦包括於核酸之定義內。核糖-磷酸酯主鏈之此等修飾可促進標記之添加，或增加此類分子在生理環境中之穩定性及半衰期。本發明之核酸可為線性的，或可為圓形的(例如，質體)。
術語「蛋白質」、「肽」及「多肽」在本文中可互換使用，且係指由肽鍵共價連接之胺基酸殘基構成的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，但對於可包含蛋白質或肽序列之胺基酸之最大數目無限制。
如本文所使用，術語「病毒載體(virus vector)」、「病毒載體(viral vector)」或「基因遞送載體」係指充當核酸遞送媒劑之病毒粒子，且其包含封裝於病毒體內之載體基因組。本發明之例示性病毒載體包括腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)、慢病毒載體及反轉錄病毒載體。
腺相關病毒或AAV屬於細小病毒科之依賴病毒(Dependovirus )屬。4.7 kb野生型AAV基因組編碼兩個主要開放閱讀框架。rep 基因表現病毒複製蛋白且cap 基因表現病毒衣殼蛋白。在AAV基因組之末端為形成T形髮夾結構之反向末端重複序列(ITR)。儘管成熟AAV病毒體在哺乳動物細胞中為感染性的，複製型AAV生命週期需要來自例如腺病毒或疱疹病毒之輔助功能。重組AAV載體可藉由用轉殖基因表現卡匣替代野生型AAV開放閱讀框架來產生。
如本文所描述，AAV可為AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A及3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、AAV rh32.33型、AAV rh8型、AAV rh10型、AAV rh74型、AAV hu.68型、鳥AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、羊AAV、蛇AAV、髭頰蜥AAV、AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B及目前已知或後續發現之任何其他AAV。參看，例如，BERNARD N. FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。已鑑別多種AAV血清型及分枝系(參見例如，Gao等人, (2004) J. Virology 78:6381-6388；Moris等人, (2004) Virology 33-: 375-383；及表1)。 表1：AAV血清型及分枝系
Genbank 寄存編號    GenBank 寄存編號    GenBank 寄存編號
完整基因組 分枝系C Rh57 AY530569
腺相關病毒1 NC_002077, AF063497 Hu9 AY530629 Rh50 AY530563
腺相關病毒2 NC_001401 Hu10 AY530576 Rh49 AY530562
腺相關病毒3 NC_001729 Hu11 AY530577 Hu39 AY530601
腺相關病毒3B NC_001863 Hu53 AY530615 Rh58 AY530570
腺相關病毒4 NC_001829 Hu55 AY530617 Rh61 AY530572
腺相關病毒5 Y18065, AF085716 Hu54 AY530616 Rh52 AY530565
腺相關病毒6 NC_001862, AAB95450.1 Hu7 AY530628 Rh53 AY530566
鳥AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828 Hu18 AY530583 Rh51 AY530564
鳥AAV病毒株DA-1 NC_006263, AY629583 Hu15 AY530580 Rh64 AY530574
牛AAV NC_005889, AY388617, AAR26465 Hu16 AY530581 Rh43 AY530560
AAV11 AAT46339, AY631966 Hu25 AY530591 AAV8 AF513852
AAV12 ABI16639, DQ813647 Hu60 AY530622 Rh8 AY242997
分支系A    Ch5 AY243021 Rh1 AY530556
AAV1 NC_002077, AF063497 Hu3 AY530595 分支系F   
AAV6 NC_001862 Hu1 AY530575 Hu14 (AAV9) AY530579
Hu.48 AY530611 Hu4 AY530602 Hu31 AY530596
Hu 43 AY530606 Hu2 AY530585 Hu32 AY530597
Hu 44 AY530607 Hu61 AY530623 HSC1 MI332400.1
Hu 46 AY530609 分支系D    HSC2 MI332401.1
分支系B    Rh62 AY530573 HSC3 MI332402.1
Hu. 19 AY530584 Rh48 AY530561 HSC4 MI332403.1
Hu. 20 AY530586 Rh54 AY530567 HSC5 MI332405.1
Hu 23 AY530589 Rh55 AY530568 HSC6 MI332404.1
Hu22 AY530588 Cy2 AY243020 HSC7 MI332407.1
Hu24 AY530590 AAV7 AF513851 HSC8 MI332408.1
Hu21 AY530587 Rh35 AY243000 HSC9 MI332409.1
Hu27 AY530592 Rh37 AY242998 HSC11 MI332406.1
Hu28 AY530593 Rh36 AY242999 HSC12 MI332410.1
Hu 29 AY530594 Cy6 AY243016 HSC13 MI332411.1
Hu63 AY530624 Cy4 AY243018 HSC14 MI332412.1
Hu64 AY530625 Cy3 AY243019 HSC15 MI332413.1
Hu13 AY530578 Cy5 AY243017 HSC16 MI332414.1
Hu56 AY530618 Rh13 AY243013 HSC17 MI332415.1
Hu57 AY530619 分支系E    Hu68   
Hu49 AY530612 Rh38 AY530558 純系分離株   
Hu58 AY530620 Hu66 AY530626 AAV5 Y18065, AF085716
Hu34 AY530598 Hu42 AY530605 AAV 3 NC_001729
Hu35 AY530599 Hu67 AY530627 AAV 3B NC_001863
AAV2 NC_001401 Hu40 AY530603 AAV4 NC_001829
Hu45 AY530608 Hu41 AY530604 Rh34 AY243001
Hu47 AY530610 Hu37 AY530600 Rh33 AY243002
Hu51 AY530613 Rh40 AY530559 Rh32 AY243003
Hu52 AY530614 Rh2 AY243007 其他   
Hu T41 AY695378 Bb1 AY243023 Rh74   
Hu S17 AY695376 Bb2 AY243022 髭頰蜥AAV   
Hu T88 AY695375 Rh10 AY243015 蛇AAV NC_006148.1
Hu T71 AY695374 Hu17 AY530582      
Hu T70 AY695373 Hu6 AY530621      
Hu T40 AY695372 Rh25 AY530557      
Hu T32 AY695371 Pi2 AY530554      
Hu T17 AY695370 Pi1 AY530553      
Hu LG15 AY695377 Pi3 AY530555      
術語「自互補AAV」或「scAAV」係指形成自發黏接之二聚反向重複DNA分子之重組AAV載體，與習知單股(ss) AAV基因組相比，產生更早且更穩固之轉殖基因表現。值得注意的是，scAAV可僅保留習知AAV載體一半尺寸，約2.4 kb的基因組。在一些實施例中，可使用雙載體策略克服AAV之小封裝能力。舉例而言，可使用順式活化、反式剪接、重疊及雜交系統。
術語「AAV轉移卡匣」係指包含由第一及第二ITR序列側接之轉殖基因的核酸。在AAV載體生產期間將AAV轉移卡匣封裝至AAV載體中。
術語「病毒生產細胞(viral production cell)」、「病毒生產細胞株」或「病毒生產細胞(viral producer cell)」係指用於生產病毒載體之細胞。HEK293及239T細胞為常見病毒生產細胞株。下表2列舉各種病毒載體之例示性病毒生產細胞株。 表2：例示性病毒生產細胞株
病毒載體 例示性一或多種病毒生產細胞株
腺病毒 HEK293、911、pTG6559、PER.C6、GH329、N52.E6、HeLa-E1、UR、VLI-293
腺相關病毒(AAV) HEK293、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、Ha2302、Hz2E5、High Five
反轉錄病毒 HEK293
慢病毒 293T
「HEK293」係指最初衍生自在組織培養物中生長之人類胚胎腎臟細胞的細胞株。HEK293細胞株容易生長於培養物中，且通常用於病毒生產。如本文所使用，「HEK293」亦可指一或多種變異HEK293細胞株，亦即，衍生自另外包含一或多個基因改變之原始HEK293細胞株的細胞株。已開發且最佳化許多變異HEK293細胞株以用於一或多種特定應用。舉例而言，293T細胞株含有SV40大T-抗原，其允許含有SV40複製起點的經轉染質體之游離型複製，引起所需基因產物之表現增加。
「Sf9」係指一種昆蟲細胞株，其為衍生自親本草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞株IPLB-Sff-21-AE之純系分離株。Sf9細胞可在不存在血清之情況下生長且可附著或在懸浮液中培養。
「轉染試劑」意謂增強核酸轉移至細胞中之組合物。此項技術中常用之一些轉染試劑包括一或多種結合至核酸及細胞表面之脂質(例如LipofectamineTM )。反向末端重複序列
反向末端重複序列或ITR序列為AAV原病毒整合及將AAV DNA封裝至病毒粒子中所需的最小序列。ITR參與AAV生命週期中之多種活動。舉例而言，在載體基因組之轉染、複製及自宿主細胞基因組整合及挽救之後，ITR序列在自質體切除中起作用。
本發明之核酸可包含5' ITR及/或3' ITR。ITR序列之長度可為約110至約160個核苷酸，例如110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160個核苷酸。在一些實施例中，該5' ITR與該3' ITR具有相同長度。在一些實施例中，該5' ITR及該3' ITR具有不同長度。在一些實施例中，該5' ITR比該3' ITR長，且在其他實施例中，該3' ITR比該5' ITR長。
ITR可分離自或衍生自任何AAV(例如表1中所列舉之AAV)之基因組。在一些實施例中，該5' ITR及該3' ITR中之至少一者可分離自或衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、rhAAV74、鳥AAV或牛AAV之基因組。在一些實施例中，該5' ITR及該3' ITR中之至少一者可為衍生自除AAV之外的另一種小病毒物種之成員的野生型或突變型ITR。舉例而言，在一些實施例中，ITR可為分離自或衍生自博卡病毒(bocavirus)或小病毒(parvovirus)B19之野生型或突變型ITR。
在一些實施例中，ITR包含促進生產自互補AAV (scAAV)之修飾。在一些實施例中，促進生產scAAV之修飾為自ITR缺失末端解析序列(TRS)。在一些實施例中，5' ITR為野生型ITR，且3' ITR為缺少末端解析序列之突變型ITR。在一些實施例中，3' ITR為野生型ITR，且5' ITR為缺少末端解析序列之突變型ITR。在一些實施例中，末端解析序列不存在於5' ITR與3' ITR兩者中。在其他實施例中，促進生產scAAV之修飾為用不同的形成髮夾之序列，諸如形成shRNA之序列置換ITR。
在一些實施例中，5' ITR或3' ITR可包含SEQ ID NO: 1之序列或與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，5' ITR或3' ITR可包含SEQ ID NO: 2之序列或與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，5' ITR或3' ITR可包含SEQ ID NO: 3之序列或與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 1之序列，且3' ITR包含SEQ ID NO: 2之序列。在一些實施例中，5' ITR包含SEQ ID NO: 1之序列，且3' ITR包含SEQ ID NO: 3之序列。
在一些實施例中，核酸可包含一或多個「代替」ITR，亦即與ITR功能相同的非ITR序列。參見例如Xie, J.等人, Mol. Ther., 25(6): 1363-1374 (2017)。在一些實施例中，ITR由代替ITR置換。在一些實施例中，代替ITR包含形成髮夾之序列。在一些實施例中，代替ITR為形成短髮夾(sh) RNA之序列。啟動子、強化子、抑制子及其他調節序列
基因表現可由核苷酸序列控制，該等核苷酸序列諸如與該基因可操作地連接之啟動子、強化子及/或抑制子。術語「可操作地連接」係指核酸表現控制序列(諸如啟動子或轉錄因子結合位點陣列)與第二核酸序列之間的功能鍵，其中表現控制序列引導對應於第二序列之核酸的轉錄。
在一些實施例中，本文所描述之核酸或AAV轉移卡匣包含啟動子。其啟動子可為例如組成型啟動子或誘導型啟動子。在一些實施例中，該啟動子為組織特異性啟動子。如本文所用，術語「啟動子」係指引導可操作地連接之核酸之轉錄的一或多個核酸控制序列。啟動子可包括轉錄起始位點附近之核酸序列，諸如TATA元件。啟動子亦可包括可由轉錄因子結合之順式作用聚核苷酸序列。「組成型」啟動子為在大多數環境及發育條件下具有活性之啟動子。「誘導型」啟動子為在環境或發育調節下具有活性之啟動子。
可用於本文所描述之核酸及卡匣中的例示性啟動子包括CMV啟動子、SV40啟動子(例如SV40早期或晚期啟動子)、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1 α啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子、GUSB240啟動子(例如人類GUSB240 (hGUSB240)啟動子)、GUSB379啟動子(例如人類GUSB379 (hGUSB379)啟動子)及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子(例如人類PGK(hPGK)啟動子)。在一些實施例中，EF-1 α啟動子係選自EF-1 α野生型啟動子、EF-1 α短啟動子及EF-1 α核心啟動子。在一些實施例中，啟動子係選自由以下組成之群：雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1 α短啟動子、EF-1 α野生型啟動子、EF-1 α核心啟動子、hPGK啟動子、hGUSB240啟動子及hGUSB379啟動子。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 6至12中任一者之序列或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
可用於本文所描述之核酸及卡匣中之例示性組織特異性啟動子及強化子的非限制性清單包括： HMG-COA還原酶啟動子；固醇調節元件1 (SRE-1)；磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)啟動子；人類C反應蛋白(CRP)啟動子；人類葡萄糖激酶啟動子；膽固醇7-α水解酶(CYP7)啟動子；β-半乳糖苷酶α-2,6唾液酸轉移酶啟動子；似胰島素生長因子結合蛋白(IGFBP-1)啟動子；醛縮酶B啟動子；人類運鐵蛋白啟動子；膠原蛋白I型啟動子；前列腺酸磷酸酶(PAP)啟動子；94之前列腺分泌蛋白(PSP 94)啟動子；前列腺特異性抗原複合物啟動子；人類腺激肽釋放素基因啟動子(hgt-1)；肌細胞特異性強化子結合因子MEF-2；肌酸激酶啟動子；胰腺炎相關蛋白啟動子(PAP)；彈性蛋白酶1轉錄強化子；胰臟特異性澱粉酶及彈性蛋白酶強化子啟動子；胰臟膽固醇酯酶基因啟動子；子宮珠蛋白啟動子；膽固醇側鏈裂解(SCC)啟動子；γ-γ烯醇酶(神經元特異性烯醇酶，NSE)啟動子；神經纖毛重鏈(NF-H)啟動子；人類CGL-1/顆粒酶B啟動子；末端去氧基轉移酶(TdT)、λ5、VpreB及lck(淋巴細胞特異性酪胺酸蛋白激酶p561ck)啟動子；人類CD2啟動子及其3'轉錄強化子；人類NK及T細胞特異性活化(NKG5)啟動子；pp60c-src酪胺酸激酶啟動子；器官特異性新抗原(OSN)、mw 40 kDa (p40)啟動子；結腸特異性抗原-P啟動子；人類α-乳白蛋白啟動子；磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)啟動子、HER2/neu啟動子、酪蛋白啟動子、IgG啟動子、絨膜胚抗原啟動子、彈性蛋白酶啟動子、膽色素原脫胺酶啟動子、胰島素啟動子、生長激素因子啟動子、酪胺酸羥化酶啟動子、白蛋白啟動子、α胎蛋白啟動子、乙醯基-膽鹼受體啟動子、醇去氫酶啟動子、α或β球蛋白啟動子、T細胞受體啟動子、骨鈣蛋白啟動子、IL-2啟動子、IL-2受體啟動子、乳清(乳清酸蛋白)啟動子及MHC II級啟動子。
基因表現亦可藉由一或多個遠端「強化子」或「抑制子」元件控制，該等元件可位於距轉錄起始位點多達幾千鹼基對處。增強子或抑制子元件以與轉錄起始位點附近之順式作用元件類似之方式調節轉錄，除強化子元件可自轉錄起始位點起作用外。
在一些實施例中，本文所描述之核酸或AAV轉移卡匣包含強化子。該強化子可以可操作地連接於啟動子。該強化子可為例如CMV強化子。在一些實施例中，該強化子包含SEQ ID NO: 4或5之序列，或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。轉殖基因
本文所描述之核酸及AAV轉移卡匣可包含用於在目標細胞中表現之轉殖基因序列。
轉殖基因可為任何相關異源核酸序列。相關核酸可編碼多肽，包括治療性(例如用於醫學或獸醫使用)或免疫原性(例如用於疫苗)多肽或RNA。在一些實施例中，轉殖基因為cDNA序列。
在一些實施例中，轉殖基因編碼治療性多肽。治療性多肽包括(但不限於)囊腫性纖維化跨膜調節蛋白(CFTR)、肌肉萎縮蛋白(包括微型(mini)及微小(micro)肌肉萎縮蛋白，參見例如Vincent等人，(1993) Nature Genetics 5: 130；美國 專利公開案第2003/017131號；國際公開案WO/2008/ 088895，Wang等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 13714-13719 (2000)；及Gregorevic等人，Mol. Ther. 16:657-64 (2008))、肌肉抑制素(myostatin)原肽、卵泡抑素、活化素11型可溶性受體、IGF-1、抗炎多肽(諸如Iκ B顯性突變體)、肌長蛋白(sarcospan)、抗肌肉萎縮蛋白相關蛋白(utrophin) (Tinsley等人, (1996) Nature 384:349)、 微型(mini)抗肌肉萎縮蛋白相關蛋白、凝血因子(例如因子VIII、因子IX、因子X等)、 紅血球生成素、血管生長抑素(angiostatin)、內皮生長抑素(endostatin)、催化酶、酪胺酸羥化酶、超氧化物歧化酶、瘦素、LDL受體、脂蛋白脂肪酶、鳥胺酸轉胺甲醯酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白(spectrin)、α-1-抗胰蛋白酶、腺苷脫胺酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、β-葡糖腦苷脂酶、神經鞘磷脂酶、溶酶體己醣胺酶A、分支鏈酮酸去氫酶、RP65蛋白、細胞介素(例如α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、介白素-2、介白素-4、粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子、淋巴毒素及其類似物)、肽生長因子、神經營養因子及激素(例如生長激素、胰島素、似胰島素生長因子1及2、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、纖維母細胞生長因子、神經生長因子、神經營養因子3及4、腦衍生神經營養因子、骨形態形成蛋白[包括RANKL及VEGF]、膠細胞衍生生長因子、轉型生長因子α及β及其類似物)、溶酶體酸α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、受體(例如腫瘤壞死生長因子可溶受體)、S100A1、小白蛋白、腺苷酸環化酶6型、調節鈣調控之分子(例如SERCA2A 、PP1之抑制劑1及其片段[例如WO 2006/029319及WO 2007/100465])、引起 G蛋白偶聯受體激酶2型基因表現減弱(knockdown)之分子(諸如截短之組成活性bARKct)、抗發炎因子(諸如IRAP)、抗肌肉抑制素蛋白、天冬胺酸醯胺酶(aspartoacylase)、單株抗體(包括單鏈單株抗體；例示性Mab為Herceptin® Mab )、神經肽及其片段(例如甘丙胺素、神經肽Y (參見U.S. 7,071,172))、血管生成抑制劑(諸如血管抑制蛋白(Vasohibins))，及其他VEGF抑制劑(例如血管抑制蛋白2 [參見WO JP2006/073052])。其他例示性治療性多肽包括自殺基因產物(例如胸苷激酶、胞嘧啶脫胺酶、白喉毒素及腫瘤壞死因子)、增強或抑制宿主因子轉錄之蛋白質(例如連接至轉錄強化子或抑制劑元件之無核酸酶活性(nuclease-dead)的Cas9、連接至轉錄強化子或抑制劑元件之鋅指蛋白質、連接至轉錄強化子或抑制劑元件之類轉錄活化因子(TAL)效應物)、賦予對癌症療法所用藥物抗性的蛋白質、腫瘤抑制基因產物(例如p53、Rb、Wt-1)、TRAIL、共濟蛋白(frataxin)(FXN)、FAS-配位體，及對有需要之個體具有療效之任何其他多肽。轉殖基因亦可為單株抗體或抗體片段，例如針對肌肉抑制素之抗體或抗體片段。(參見例如Fang等人, Nature Biotechnology 23:584-590 (2005))。治療性多肽亦包括編碼報導多肽(例如酶)者。報導多肽為此項技術中已知的且包括(但不限於)綠色螢光蛋白、β-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶及氯黴素乙醯基轉移酶基因。
視情況，轉殖基因編碼分泌多肽(例如，其天然狀態為分泌多肽或已經工程改造，例如藉由與此項技術中已知之分泌信號序列可操作地結合以分泌之多肽)。
或者，在一些實施例中，轉殖基因可編碼反義核酸、核糖核酸酶(例如，如美國專利第5,877,022號中所描述)、實現剪接體介導/ram剪接之RNA (參見Puttaraju等人, (1999) Nature Biotech. 17:246；美國專利第6,013,487號；美國專利第6,083,702號)、干擾RNA (RNAi)，其包括介導基因沉默之siRNA、shRNA或miRNA (參見Sharp等人, (2000) Science 287:2431)及其他非轉譯RNA，諸如「導向」RNA及其類似物。例示性非轉譯RNA包括針對多重藥物抗性(MDR)基因產物之RNAi (例如治療及/或預防腫瘤及/或向心臟投與以預防由化學療法引起之損害)、針對肌肉抑制素之RNAi (例如杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy))、針對VEGF之RNAi (例如治療及/或預防腫瘤)、針對膜磷蛋白之RNAi (例如用於治療心血管疾病，參見例如Andino等人, J. Gene Med. 10: 132-142 (2008)及Li等人, Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005))；膜磷蛋白抑制或顯性陰性分子，諸如膜磷蛋白S 16E (例如用於治療心血管疾病，參見例如Hoshijima等人Nat. Med. 8:864-871(2002))、針對腺苷激酶之RNAi (例如用於癲癇症)及針對病原性生物及病毒之RNAi (例如B型及/或C型肝炎病毒、人類免疫缺乏病毒、CMV、單純疱疹病毒、人類乳頭狀瘤病毒等)。
此外，轉殖基因序列可導引替代性剪接。舉例而言，與肌肉萎縮蛋白外顯子51之剪接位點5'及/或3'互補之反義序列(或其他抑制序列)可與U1或U7小核(sn) RNA啟動子結合遞送以誘導此外顯子之跳躍。舉例而言，包含位於反義/抑制序列5'之U1或U7 snRNA啟動子的DNA序列可封裝於卡匣中且遞送於本發明之AAV載體中。
在一些實施例中，轉殖基因可導引基因編輯。舉例而言，轉殖基因可編碼基因編輯分子，諸如導向RNA或核酸酶。在一些實施例中，轉殖基因可編碼鋅指核酸酶、歸位核酸內切酶、TALEN (類轉錄活化因子效應物核酸酶)、NgAgo (船蛸(agronaute)核酸內切酶)、SGN (結構導向核酸內切酶)或RGN (RNA導向核酸酶)，諸如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。
轉殖基因可與宿主染色體上之基因座共有同源性且與宿主染色體上之基因座重組。可利用此方法例如來校正宿主細胞中之基因缺陷。
轉殖基因可為免疫原性多肽，例如用於疫苗接種。轉殖基因可編碼此項技術中已知之任何相關免疫原，包括(但不限於)來自人類免疫缺乏病毒(HIV)、猴免疫缺乏病毒(SIV)、流感病毒、HIV或SIV gag蛋白、腫瘤抗原、癌症抗原、細菌抗原、病毒抗原及其類似者之免疫原。
根據本發明之病毒載體提供一種用於將轉殖基因遞送至廣泛範圍之細胞中的方式，包括分裂及非分裂細胞。病毒載體可用於活體外遞送轉殖基因至細胞，例如以活體外生產多肽或用於離體基因療法。病毒載體另外適用於將轉殖基因遞送至有需要之個體之方法，例如以表現免疫原性或治療性多肽或功能性RNA。以此方式，多肽或功能性RNA可在個體中活體內產生。因為個體缺乏多肽，所以個體可能需要多肽。另外，因為在個體中生產多肽或功能性RNA可賦予一些有益作用，所以可實施該方法。
病毒載體亦可用於在經培養細胞或個體中生產相關多肽或功能性RNA (例如，使用個體作為生物反應器以生產多肽或結合篩選方法，觀測功能性RNA對個體之影響)。
一般而言，本發明之核酸及病毒載體可用於遞送編碼多肽或功能性RNA之轉殖基因以治療及/或預防有任何遞送治療性多肽或功能性RNA為有利之疾病病況。說明性疾病病況包括(但不限於)：肺臟之囊腫性纖維化(囊腫性纖維化跨膜調節蛋白)及其他疾病、A型血友病(因子VIII)、B型血友病(因子IX)、地中海貧血症(β-球蛋白)、貧血症(紅血球生成素)及其他血液病症。阿茲海默氏症(Alzheimer's disease) (GDF；腦啡肽酶)、多發性硬化症(β-干擾素)、帕金森氏病(Parkinson's disease) (膠細胞株衍生神經營養因子[GDNF])、亨廷頓氏病(Huntington's disease) (RNAi用以移除重複序列)、肌肉萎縮性側索硬化、癲癇症(甘丙胺素、神經營養因子)及其他神經病症、癌症(內皮生長抑素、血管生長抑素、TRAIL、FAS-配位體、包括干擾素之細胞介素；包括針對VEGF或多重藥物抗性基因產物之RNAi之RNAi、mir-26a[例如用於肝細胞癌]、糖尿病(胰島素)、包括杜興氏之肌肉失養症(肌肉萎縮蛋白、微型肌肉萎縮蛋白、類胰島素生長因子I、肌肉瘤[例如α、β、γ]、針對肌靜止性肌肉抑制素原肽之RNAi、卵泡抑素、活化素II型可溶受體、抗炎多肽，諸如Iκ B顯性突變體、肌長蛋白、抗肌肉萎縮蛋白相關蛋白、微型抗肌肉萎縮蛋白相關蛋白、肌肉萎縮蛋白基因中針對剪接點以誘導外顯子跳躍之反義或RNAi [參見例如WO/2003/095647]、針對U7 snRNA以誘導外顯子跳躍之反義[參見例如WO/2006/021724]，及針對肌肉抑制素或肌肉抑制素原肽之抗體或抗體片段，及貝克氏症(Becker)、高雪氏病(Gaucher disease) (葡萄糖腦苷脂酶)、賀勒氏病(Hurler's disease) (a-L-艾杜糖苷酶)、腺苷脫胺酶缺乏(腺苷脫胺酶)、糖原貯積病(例如法布立病(Fabry disease) [a-半乳糖苷酶]及龐培氏病(Pompe disease) [溶酶體酸α-葡糖苷酶])及其他代謝障礙、先天性肺氣腫(α-1-抗胰蛋白酶)、萊施-奈恩症候群(Lesch-Nyhan Syndrome) (次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶)、尼曼匹克症(Niemann-Pick disease) (神經磷脂酶)、泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease) (溶酶體己糖苷酶A)、楓糖尿症(Maple Syrup Urine Disease) (分支鏈酮酸去氫酶)、視網膜變性疾病(及眼睛及視網膜之其他疾病；例如用於 黃斑變性之PDGF及/或血管抑制蛋白或VEGF之其他抑制劑或用於治療/預防視網膜病症之其他血管生成抑制劑，例如I型糖尿病中之視網膜病症)、諸如大腦之實體器官之疾病(包括帕金森氏病[GDNF]、星形細胞瘤[內皮生長抑素、血管生長抑素及/或針對VEGF之RNAi]、成膠細胞瘤[內皮生長抑素、血管生長抑素及/或針對VEGF之RNAi])、肝臟、腎臟、心臟疾病(包括充血性心臟衰竭或外周動脈疾病(PAD))(例如藉由遞送蛋白質磷酸酶抑制劑I (I-1)及其片段(例如IIC)、serca2a、調節膜磷蛋白基因之鋅指蛋白質、Barkct、[32-腎上腺素激導性受體、2-腎上腺素激導性受體激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、S100A1、小白蛋白、腺苷酸環化酶6型、引起G蛋白偶聯受體激酶2型基因表現減弱之分子，諸如截短之組成活性bARKct；鈣沙辛(calsarcin)、針對膜磷蛋白之RNAi；膜磷蛋白抑制或顯性陰性分子，諸如膜磷蛋白S16E等)、關節炎(類胰島素生長因子)、關節紊亂病(類胰島素生長因子1及/或2)、內膜增生(例如藉由遞送內皮型一氧化氮合酶(enos)、誘導型一氧化氮合酶(inos))、提高心臟移植存活(超氧化物歧化酶)、AIDS (可溶CD4)、肌肉萎縮(類胰島素生長因子I)、腎虛(紅血球生成素)、貧血(紅血球生成素)、關節炎(抗炎因子諸如I RAP及TNFa可溶受體)、肝炎(α-干擾素)、LDL受體缺乏(LDL受體)、高胺血症(鳥胺酸轉胺甲醯酶)、克臘伯氏病(Krabbe's disease) (半乳糖腦苷脂酶)、貝敦氏症(Batten's disease)、弗里德希氏共濟失調(FRDA)、包括SCA1、SCA2及SCA3之脊柱大腦共濟失調、苯酮尿症(苯丙胺酸羥化酶)、自身免疫疾病及其類似者。在器官移植之後，本發明可進一步用於提高移植成功率及/或減少器官移植或輔助療法之不良副作用(例如藉由投與免疫抑制劑或抑制性核酸以阻斷細胞介素產生)。作為另一實例，可伴隨異體骨移植投與骨形態形成蛋白(包括BNP 2、7等，RANKL及/或VEGF)，例如在斷裂或癌症患者手術移除之後投與。
在一些實施例中，本發明之病毒載體可用於遞送編碼多肽或功能性RNA之轉殖基因以治療及/或預防肝臟疾病或病症。肝臟疾病或病症可為例如原發性膽汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、自體免疫肝炎、B型肝炎、C型肝炎、酒精性肝臟疾病、纖維化、黃疸、原發性硬化性膽管炎(PSC)、布加症候群(Budd-Chiari syndrome)、血色沉著病、威爾森氏病(Wilson's disease)、酒精性纖維化、非酒精性纖維化、肝脂肪變性、吉爾伯特症候群(Gilbert's syndrome)、膽道閉鎖、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、艾歐吉勒症候群(alagille syndrome)、漸進性家族性肝內膽汁淤積、B型血友病、遺傳性血管性水腫(HAE)、純合家族性高膽固醇血症(HoFH)、異型接合家族性高膽固醇血症(HeFH)、馮吉爾克氏病(Von Gierke's Disease，GSD I)、A型血友病、甲基丙二酸酸血症、丙酸酸血症、高胱胺酸尿、苯酮尿症(PKU)、酪胺酸血症1型、精胺酸酶1缺乏、精胺酸琥珀酸解離酶缺乏、胺甲醯磷酸合成酶1缺乏、瓜胺酸血症1型、希特林蛋白(Citrin) 缺乏、克里格勒-納賈爾症候群(Crigler-Najjar Syndrome)1型、胱胺酸症、法布立病、肝糖貯積病1b、LPL缺乏、N-乙醯麩胺酸合成酶缺乏、鳥胺酸轉胺甲醯酶缺乏、鳥胺酸移位酶缺乏、主要高草酸鹽尿症1型或ADA SCID。
本發明之病毒載體可用於遞送用於生產誘導多能幹細胞(iPS)之轉殖基因。舉例而言，本發明之病毒載體可用於將幹細胞相關核酸遞送至非多能細胞中，諸如成人纖維母細胞、皮膚細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、脂肪細胞、心臟細胞、神經細胞、上皮細胞、內皮細胞及其類似者。與幹細胞相關之轉殖基因編碼因子在此項技術中已知。與幹細胞及多能性相關聯之此類因子之非限制性實例包括Oct-3/4、SOX家族(例如SOX 1、SOX2、SOX3及/或SOX 15)、Klf家族(例如Klfl、KHZ Klf4及/或Klf5)、Myc家族(例如C-myc、L-myc及/或N-myc)、NANOG及/或LIN28。
可採用本發明之病毒載體遞送轉殖基因以治療及/或預防代謝病症，諸如糖尿病(例如胰島素)、血友病(例如因子IX或因子VIII)、溶酶體貯積病諸如黏多糖病(例如斯賴症候群(Sly syndrome) [β-葡萄糖醛酸苷酶]、賀勒氏症侯群[α-L-艾杜糖苷酶]、沙伊症侯群(Scheie Syndrome) [α-L-艾杜糖苷酶]、賀勒-沙伊症侯群(Hurler-Scheie Syndrome) [α-L-艾杜糖苷酶]、亨特氏症侯群(Hunter's Syndrome) [艾杜糖醛硫酸酯酶]、聖菲利波症候群(Sanfilippo Syndrome ) A [乙醯肝素硫酸醯胺酶]、B [N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶]、C [乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷乙醯基轉移酶]、D [N-乙醯基葡糖胺6-硫酸酯酶]、莫奎症候群(Morquio Syndrome) A [半乳糖硫酸硫酸酯酶]、B [β-半乳糖苷酶]、馬洛特-拉米症候群(Maroteaux-Lamy Syndrome) [N-乙醯基半乳胺糖-4-硫酸酯酶]等)、法布立病(α-半乳糖苷酶)、高雪氏病(葡糖腦苷脂酶)或肝糖貯積病(例如龐培氏病；溶酶體酸α-葡糖苷酶)。
在一些實施例中，轉殖基因適用於治療弗里德希氏共濟失調。在一些實施例中，轉殖基因編碼共濟蛋白(FXN)蛋白質。共濟蛋白蛋白質可為例如人類共濟蛋白蛋白質。以下提供例示性人類共濟蛋白蛋白質序列(SEQ ID NO: 65)：
Figure 02_image001
亦參見Uniprot寄存編號Q16595，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，共濟蛋白蛋白質具有與人類共濟蛋白蛋白質之序列至少90%相同、至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同的序列。在一些實施例中，共濟蛋白蛋白質具有與SEQ ID NO: 65之序列至少90%相同、至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同或至少99%相同的序列。在一些實施例中，人類共濟蛋白蛋白質為共濟蛋白之同功異構物、變異體(例如，替代性剪接變異體)或突變體形式。在一些實施例中，突變共濟蛋白具有展示於表3中之取代中之一或多者。 表3：例示性共濟蛋白胺基酸取代
取代之位置 (基於SEQ ID NO: 65之胺基酸編號) 突變
106 L à S
122 D à Y
130 G à V
154 I à F
155 W à R
165 R à C
182 L à F
198 L à R
202 W à S
39-40 RR à GG
53-54 RR à GG
78-79 LR à GG
79-80 RK à GG
在一些實施例中，轉殖基因包含相對於野生型序列經密碼子最佳化之共濟蛋白cDNA。舉例而言，cDNA可經修飾以移除隱藏剪接受體/供體位點、減少使用稀有密碼子、移除核糖體進入位點等。在一些實施例中，轉殖基因包含經CpG最佳化之共濟蛋白cDNA。舉例而言，cDNA可經修飾以減少CpG二核苷酸之數量。
在一些實施例中，轉殖基因包含共濟蛋白cDNA，其包含SEQ ID NO: 19之序列或與其至少90%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之序列。在一些實施例中，轉殖基因包含共濟蛋白cDNA，其包含SEQ ID NO: 20之序列或與其至少90%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之序列。多腺苷酸化 ( 聚 A ) 信號
多腺苷酸化信號為可見於幾乎所有哺乳動物基因中之核苷酸序列且控制一串約200個腺苷殘基(聚(A)尾)添加至基因轉錄物之3'端。聚(A)尾有助於mRNA穩定性，且缺乏聚(A)尾之mRNA快速降解。亦有證據表明，聚(A)尾之存在藉由引起轉譯之起始而積極地有助於mRNA之可譯性。
在一些實施例中，本發明之核酸及AAV轉移卡匣包含一或多個多腺苷酸化信號。在一些實施例中，核酸及AAV轉移卡匣包含兩個、三個、四個或更多個多腺苷酸化信號。多腺苷酸化信號可為猴病毒40 (SV40)、α-球蛋白(例如人類α-球蛋白、小鼠α-球蛋白或兔α-球蛋白)、β-球蛋白(例如人類β-球蛋白、小鼠β-球蛋白或兔β-球蛋白)、人類膠原蛋白、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)或牛生長激素(bGH)或其變異體之多腺苷酸化信號。
在一些實施例中，多腺苷酸化信號為牛生長激素(bGH)多腺苷酸化信號，例如具有SEQ ID NO: 21之序列的bGH多腺苷酸化信號。在一些實施例中，多腺苷酸化信號為人類生長激素(hGH)多腺苷酸化信號，例如具有SEQ ID NO: 22之序列的hGH多腺苷酸化信號。在一些實施例中，多腺苷酸化信號為人類β球蛋白多腺苷酸化信號，例如具有SEQ ID NO: 23之序列之人類β球蛋白多腺苷酸化信號。在一些實施例中，多腺苷酸化信號為兔β球蛋白多腺苷酸化信號，例如具有SEQ ID NO: 24之序列的兔β球蛋白多腺苷酸化信號。在一些實施例中，多腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 21至24中任一者之序列或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，多腺苷酸化信號可以反向定向存在於核酸或卡匣中。以反向定向，多腺苷酸化信號可充當安全因子。舉例而言，反向定向多腺苷酸化信號可防止在反向方向上自啟動子顯著轉錄。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣包含兩個多腺苷酸化信號，諸如SEQ ID NO: 21及22之多腺苷酸化信號。在核酸或AAV轉移卡匣包含兩個多腺苷酸化信號之實施例中，信號中之一者可以反向定向存在。填充序列
AAV載體通常接受具有經定義尺寸範圍(大體上為約4 kb至約5.2 kb，或略多)之DNA的插入。因此，對於較短序列，可能需要在插入片段中包括額外核酸以便達成AAV載體可接受之所需長度。填充序列可分離自或衍生自已知基因或核酸序列之非編碼區(例如內含子區域)。填充序列可為例如長度在1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500-5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000個核苷酸之間的序列。填充序列可位於核酸或卡匣中處於任何使得不會阻礙功能或活性的所需位置。
在一些實施例中，本發明之核酸或AAV轉移卡匣包含填充序列。在一些實施例中，填充序列包括內含子序列或自其衍生的序列。在一些實施例中，填充序列為嵌合序列。在一些實施例中，填充序列係分離自或衍生自諸如α1-抗胰蛋白酶或白蛋白之基因。在一些實施例中，填充序列係選自SEQ ID NO: 25至27中任一者之序列或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。內含子序列
在一些實施例中，本發明之核酸及/或轉移卡匣可包含內含子序列。所包括之內含子序列可將對於高效核輸出及轉譯重要之因子募集至轉錄mRNA。因此，與在無內含子序列存在下之表現相比包括內含子序列可增強表現。
在一些實施例中，內含子序列為雜交或嵌合序列。在一些實施例中，內含子序列係分離自或衍生自以下中之一或多者之內含子序列：β-球蛋白、雞β-肌動蛋白、小鼠微小病毒(MVM)、因子IX、SV40及/或人類IgG (重鏈或輕鏈)。在一些實施例中，內含子序列包括SEQ ID NO: 13至16中任一者之序列或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。科札克 序列
科札克序列為以真核mRNA之轉譯起始位點為中心之短序列，其允許mRNA之轉譯之有效起始。核糖體轉譯機制在科札克序列之情形下識別AUG起始密碼子。
在一些實施例中，本發明之AAV轉移卡匣可包含科札克序列。科札克序列可增強轉殖基因之轉譯效率及總體表現。科札克序列可緊鄰轉殖基因序列之5'安置，或與轉殖基因序列重疊。
本發明之核酸或AAV轉移卡匣中之科札克序列可為共同序列或其經修飾版本。科札克序列可包含SEQ ID NO: 17至18或66至70中任一者之序列或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。核酸及 AAV 轉移卡匣
在一些實施例中，核酸或腺相關病毒(AAV)轉移卡匣包含以下中之一或多者：強化子、啟動子、內含子序列、科札克序列、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號及/或填充序列。在一些實施例中，核酸或腺相關病毒(AAV)轉移卡匣包含強化子、啟動子、內含子序列、科札克序列、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號及/或填充序列之任何組合。
在一些實施例中，核酸或腺相關病毒(AAV)轉移卡匣自5'至3'包含5'反向末端重複序列(ITR)、啟動子、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號及3' ITR。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣自5'至3'包含5' ITR、強化子、啟動子、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號及3' ITR。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣自5'至3'包含5' ITR、強化子、啟動子、內含子序列、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號及3' ITR。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣自5'至3'包含5' ITR、啟動子、內含子序列、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號及3' ITR。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣自5'至3'包含5' ITR、聚腺苷酸信號(反向定向)、啟動子、內含子序列、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號、填充序列及3' ITR。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣自5'至3'包含5' ITR、填充序列、多腺苷酸化信號(反向定向)、啟動子、內含子序列、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號、填充序列及3' ITR。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣自5'至3'包含5' ITR、填充序列、多腺苷酸化信號(反向定向)、啟動子、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號、填充序列及3' ITR。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣自5'至3'包含5' ITR、啟動子、內含子序列、轉殖基因序列、多腺苷酸化信號、填充序列及3' ITR。
在以上實施例中之任一者中，核酸或AAV轉移卡匣可進一步包含科札克序列。科札克序列可位於緊鄰轉殖基因序列之5'。科札克序列可具有SEQ ID NO: 17至18中任一者之序列。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣自5'至3'包含表4中所示之元件或其任何子集。不同例示性核酸或AAV轉移卡匣顯示於下表中之每一列中。「X」指示指定元件包括於核酸或AAV轉移卡匣中。 表4：例示性核酸或AAV轉移卡匣(5'至3')
5' ITR 填充 聚A 強化子 啟動子 內含子 科札克 轉殖基因 聚A 填充 3' ITR
X       X X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X       X X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X    X    X X X X X X X
X X X    X X X X X X X
X X X    X X X X X X X
X X X    X    X X X X X
X X X    X X X X X X X
X    X    X X X X X X X
X          X X X X X X X
X          X X X X X    X
X    X    X X X X X    X
X X X    X X X X X X X
X X X    X X X X X X X
X X X    X    X X X X X
X X X    X X X X X X X
X    X    X X X X X X X
X          X X X X X X X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
X          X X X X X    X
在以上實施例中之任一者中，轉殖基因序列可編碼共濟蛋白(FXN)蛋白質。轉殖基因序列可具有例如SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之序列。在一些實施例中，轉殖基因可編碼具有SEQ ID NO: 65之序列的FXN蛋白質。
在以上實施例中之任一者中，5' ITR可具有SEQ ID NO: 1之序列，且3' ITR可具有SEQ ID NO: 2或3之序列。
在以上實施例中之任一者中，強化子可具有SEQ ID NO: 4至5中任一者之序列。
在以上實施例中之任一者中，啟動子可具有SEQ ID NO: 6至12中任一者之序列。
在以上實施例中之任一者中，內含子序列可具有SEQ ID NO: 13至16中任一者之序列。
在以上實施例中之任一者中，多腺苷酸化信號可包含SEQ ID NO: 21至24中任一者之序列。
在以上實施例中之任一者中，填充序列可包含SEQ ID NO: 25至27中任一者之序列。
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣自5'至3'包含表5中所示之元件及序列或其任何子集。不同例示性核酸或AAV轉移卡匣顯示於表中之每一列中。表中所提供之數字對應於SEQ ID NO。 表5：例示性核酸或AAV轉移卡匣(5'至3')
5' ITR 填充 聚A 強化子 啟動子 內含子 科札克 轉殖基因 聚A 填充 3' ITR
1       5 6 13 17 19 21    2
1          7 15 17 19 22    2
1          7 14 17 19 21    2
1          11 15 17 19 22    2
1          11 14 17 19 21    2
1          11 16 17 19 22    2
1          12 16 17 19 22    2
1       5 6 13 18 19 21    2
1          7 15 18 19 22    2
1          7 15 18 19 21    2
1          11 15 18 19 22    2
1          11 14 18 19 21    2
1          11 16 18 19 22    2
1          12 16 18 19 22    2
1    23    10 14 18 19 22 + 24 25 3
1 26 23    6 14 18 19 22 + 24 27 3
1 26 23    7 14 18 19 22 + 24 27 3
1 26 23    8    18 19 22 + 24 27 3
1 26 23    10 14 18 19 22 + 24 27 3
1    23    7 15 18 19 22 + 24 25 3
1          9 14 18 20 22 + 24 25 2
1          9 14 18 20 22    2
1    23    10 14 17 19 22 + 24    3
1 26 23    6 14 17 19 22 + 24 27 3
1 26 23    7 14 17 19 22 + 24 27 3
1 26 23    8    17 19 22 + 24 27 3
1 26 23    10 14 17 19 22 + 24 27 3
1    23    7 15 17 19 22 + 24 25 3
1          9 14 17 20 22 + 24 25 2
1          9 14 17 20 22    2
1          7 15 17 20 22    2
1          7 15 17 20 22    2
1          7 15 18 19 22    2
1          7 18 18 20 22    2
在一些實施例中，核酸或AAV轉移卡匣包含SEQ ID NO: 28至64中任一者之序列或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
本文所述之核酸及AAV轉移卡匣可使用標準分子生物學技術併入載體(例如質體或桿狀病毒質體)中。載體(例如質體或桿狀病毒質體)可進一步包含在AAV生產期間使用之一或多種基因元件，包括例如AAV rep及cap基因，及輔助病毒蛋白質序列。重組 AAV 及 AAV 生產方法
核酸及AAV轉移卡匣及包含本文所述之核酸及AAV轉移卡匣的載體(例如質體)可用於生產重組AAV載體。AAV載體可包含單股基因組或雙股基因組(亦即，scAAV)。高效價AAV製劑可使用此項技術中已知之技術生產，諸如標準三重轉染或桿狀病毒生產方法。
典型地，用於生產AAV載體之方法包括4種組分：反式起作用之質體及順式起作用之轉殖基因。此等組分包括：1)含有用於衣殼形成及複製之AAV Rep及Cap基因之質體；2)含有腺病毒輔助基因之質體；3)含有由兩個反向末端重複序列(ITR)包圍之轉殖基因的卡匣；及4)病毒封裝細胞株。由於AAV具有高度感染性且天然存在於大百分比之人類群體中，因此可在使用之前充分測試細胞培養物及所有物質之短暫野生型AAV感染。
在一些實施例中，一種用於生產重組AAV載體之方法包含使AAV生產細胞(例如HEK293細胞)與本發明之核酸、AAV轉移卡匣或載體(例如質體)接觸。在一些實施例中，該方法進一步包含使AAV生產細胞與一或多種編碼例如AAV rep及cap基因之額外載體(例如質體)及輔助病毒蛋白質序列接觸。在一些實施例中，該方法進一步包含在生產AAV之條件下維持AAV生產細胞。
在一些實施例中，一種用於生產重組AAV載體之方法包含使AAV生產細胞(例如昆蟲細胞，諸如Sf9細胞)與至少一種包含本發明之核酸或AAV轉移卡匣的昆蟲細胞相容之載體接觸。「昆蟲細胞相容之載體」為任何生物學或化學之化合物或調配物，該調配物有助於用核酸轉型或轉染昆蟲細胞。在一些實施例中，昆蟲細胞相容之載體為桿狀病毒載體。在一些實施例中，該方法進一步包含維持昆蟲細胞在生產AAV之條件下。
在一些實施例中，AAV生產細胞用三種質體轉染(例如使用轉染試劑)：(1)第一質體，其包含本發明之核酸或AAV轉移卡匣；(2)第二質體，其包含AAV rep及cap基因序列；及(3)第三質體，其包含輔助病毒蛋白質序列。參見例如圖5。AAV生產細胞可為表2中所列細胞中之任一者。AAV生產細胞可隨後維持在AAV生產之條件下。AAV可接著使用標準技術(諸如氯化銫(CsCl)梯度離心或管柱層析技術)純化。
所生產之重組AAV載體可包含任何血清型之衣殼，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV及牛AAV。在一些實施例中，所生產之重組AAV載體可包含與天然AAV衣殼相比具有一或多個胺基酸修飾(例如取代及/或缺失)之衣殼蛋白。舉例而言，重組AAV載體可包含衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV及牛AAV之經修飾之AAV衣殼。在一些實施例中，所生產之AAV載體為AAV9。在一些實施例中，所生產之AAV載體為AAV1。在一些實施例中，所生產之AAV載體為AAV4。
重組AAV載體可用於例如藉由使重組AAV載體與目標細胞接觸以轉殖基因序列來轉導目標細胞。組合物
亦提供包含本發明之核酸、AAV轉移卡匣、質體、細胞或重組AAV載體的組合物。在一些實施例中，組合物為液體組合物。在一些實施例中，組合物為固體組合物。
在一些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含本發明之核酸、AAV轉移卡匣、質體、細胞或重組AAV載體。除核酸、AAV轉移卡匣、質體、細胞或重組AAV載體以外，根據本發明且根據本發明使用的醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或其他材料(例如稀釋劑、佐劑、填充劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、增溶劑、界面活性劑(例如潤濕劑)、掩蔽劑、著色劑、調味劑及甜味劑)。此類材料應較佳為無毒的。適合之載劑、稀釋劑、賦形劑等可見於標準醫藥學文本中。參見例如Handbook of Pharmaceutical Additives , 第二版(編者M. Ash及I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA)、Remington's Pharmaceutical Sciences , 第20版, 出版商Lippincott, Williams & Wilkins, 2000；及Handbook of Pharmaceutical Excipients , 第2版, 1994。載體或其他材料之確切性質將視投與路徑而定，投與路徑可為口服或藉由注射(例如皮膚、皮下或靜脈內)。
用於經口投與之醫藥組合物可為錠劑、膠囊、散劑或液體形式。錠劑可包括固體載體或佐劑。液體醫藥組合物一般包含液體載劑，諸如水、石油、動物油或植物油、礦物油或合成油。可包括生理食鹽水溶液，右旋糖或其他醣溶液或二醇(諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。膠囊可包括固體載體，諸如明膠。
對於靜脈內、皮膚或皮下注射，或在病痛之部位注射，醫藥組合物可呈非經腸可接受之水溶液形式，其不含熱原質且具有適合之pH、等滲性及穩定性。適合之溶液可包含例如等滲媒劑，諸如氯化鈉、林格氏溶液(Ringer's solution)及/或乳酸林格氏溶液。視需要，可包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。治療方法
本發明之AAV載體，包括使用本發明之核酸或AAV轉移卡匣製備之AAV載體，可用於治療或預防有需要之個體的疾病、病症或其他病況。個體可為哺乳動物或鳥類。在一些實施例中，哺乳動物為貓、犬、小鼠、大鼠、馬、牛、豬、天竺鼠或非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體為人類。人類可為兒童個體、成年個體或老齡個體。
本發明之AAV載體或包含其之組合物可與細胞活體內或離體接觸。細胞可接著維持在足以在細胞中表現轉殖基因之條件下。
本發明之AAV載體或包含其之組合物可投與有需要之個體。可藉由此項技術中已知之任何手段投與。視情況，以於醫藥學上可接受之載劑中之治療有效劑量遞送病毒載體及/或組合物。在一些實施例中，遞送治療有效劑量之病毒載體及/或組合物。
待向個體投與之病毒載體及/或組合物之劑量視投與模式、待治療及/或預防之疾病或病況、個別個體之病況、特定病毒載體或組合物、待遞送之核酸及其類似因素而定，且可以常規方式確定。用於實現療效之例示性劑量為至少約105 、至少約106 、至少約107 、至少約108 、至少約109 、至少約1010 、至少約1011 、至少約1012 、至少約1013 、至少約1014 、至少約1015 個轉導單位、視情況約108 至約1013 個轉導單位之力價。
在特定實施例中，可採用超過一次投與(例如兩次、三次、四次或更多次投與)以在不同時間間隔(例如每天、每週、每月、每年等)內達成所需水準之基因表現。
例示性投與模式包括經口、經直腸、經黏膜、鼻內、吸入(例如經由噴霧劑)、頰內(例如舌下)、經陰道、鞘內、眼內、經皮、子宮內(或在卵內)、非經腸(例如靜脈內、皮下、皮內、肌肉內(包括投與至骨骼、隔膜及/或心肌)、皮內、胸膜內、腦內及關節內)、局部(例如投與至皮膚及黏膜表面，包括呼吸道表面及經皮投與)、淋巴管內及其類似者，以及導引組織或器官注入(例如投與至肝臟、骨胳肌、心肌、膈肌或大腦)。投與亦可針對腫瘤(例如在腫瘤或淋巴結中或附近)。在任何給定情況下，最適合之途徑將視所治療及/或預防之病況之性質及嚴重程度及正使用之特定載體之性質而定。
在一些實施例中，AAV載體或包含載體之組合物可藉由直接注射至心臟或中樞神經系統(CNS)組織中投與。在一些實施例中，可在顱內(包括鞘內、神經內、腦內或心室內投與)遞送AAV載體或包含載體之組合物。在一些實施例中，可藉由心外注射隨後微型剖胸術、冠狀動脈內注射或心內膜注射將AAV載體或包含載體之組合物遞送至心臟。
亦可藉由遞送包含病毒載體及/或衣殼之儲槽來遞送至目標組織。在代表性實施例中，包含病毒載體及/或衣殼之儲槽被植入骨骼肌、心肌及/或隔肌組織中，或組織可與包含病毒載體及/或衣殼之膜或其他基質接觸。此類可植入基質或受質描述於美國專利第7,201,898號中。
AAV之投與可在目標細胞或組織中引起穩固及持久性轉殖基因表現。舉例而言，轉殖基因表現可持續至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少12個月、至少24個月、至少36個月或更長。
在一些實施例中，用於治療有需要之個體的方法包含向個體投與治療有效量之本發明之核酸、AAV轉移卡匣、質體、細胞或重組AAV。在一些實施例中，該個體為人類個體。在一些實施例中，該個體罹患弗里德希氏共濟失調。投與可使得治療有效量之FXN蛋白質在個體之CNS組織(例如，神經元組織)或心臟組織中表現。
在一些實施例中，投與可導致一或多種弗里德希氏共濟失調之症狀緩解。舉例而言，投與可(1)改善個體之手臂及腿中之協調(共濟失調)，(2)增加個體之能量位準及/或減少疲勞及肌肉損失，(3)改善個體之視力、聽力損失或言語，(3)降低脊柱側彎或其發展速率，(4)改善糖尿病之症狀，諸如胰島素靈敏度，或(5)改善諸如肥厚性心肌症或心律不整之心臟病況。個體歸因於治療之改善可為相比於個體治療前之改善，或相比於患有弗里德希氏共濟失調之典型個體之改善。
在一些實施例中，投與可引起個體之壽命延長。舉例而言，與患有弗里德希氏共濟失調之典型個體相比，投與可使個體之壽命延長約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約5-10年、或超過10年。 實例
僅出於說明之目的在本文中包括之以下實例並不意欲為限制性的。 實例1：在哺乳動物細胞中製備重組AAV載體
提供三種質體。第一質體包含轉移卡匣，其包含編碼由兩個ITR (SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或3)側接之人類共濟蛋白(SEQ ID NO: 19或20)之cDNA，且具有SEQ ID NO: 28至64中任一者之序列。第二質體包含編碼Rep及Cap基因之序列。第三質體包含AAV生產所需之各種「輔助」序列(E4、E2a及VA)。
使用適當轉染試劑(例如LipofectamineTM )將三種質體轉染至病毒生產細胞(例如HEK293)中。在37℃下培育預定時間段之後，自培養基收集AAV粒子或溶解細胞以釋放AAV粒子。隨後純化、滴定AAV粒子，且可將其儲存在-80℃下以供後續使用。 實例2：在昆蟲細胞中製備重組AAV載體
提供第一重組桿狀病毒載體。第一重組桿狀病毒載體包含轉移卡匣序列，其包含編碼由兩個ITR (SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或3)側接之人類共濟蛋白(SEQ ID NO: 19或20)之cDNA，其中轉移卡匣具有SEQ ID NO: 28至64中任一者之序列。
昆蟲細胞(例如Sf9)與第一重組桿狀病毒載體及包含編碼AAV Rep及Cap蛋白之序列的至少一種額外重組桿狀病毒載體共同感染於懸浮培養物中。在28℃下培育預定時間段之後，自培養基收集AAV粒子或溶解細胞以釋放AAV粒子。隨後純化、滴定AAV粒子，且可將其儲存在-80℃下以供後續使用。實例 3 ： 封裝 FXN 轉殖基因之重組 AAV 活體內轉導心臟細胞且延長 缺乏 FXN 之 小鼠之壽命
使用標準選殖技術製備包含AAV轉移卡匣(SEQ ID NO: 32) (包括人類FXN轉殖基因)之質體(FXN質體)。製備包含FXN質體、包含編碼AAV Rep及Cap (AAV9)基因之序列的第二質體及包含編碼AAV輔助序列之序列的第三質體的組合物，且使用標準「三重轉染」協定將其用於轉染HEK293細胞。將HEK293細胞維持在標準培養條件(37℃，5% CO2 )下以允許產生重組、自互補AAV9載體。將此程序重複數次，且使用ddPCR® 定量AAV9載體產量。如圖 1 中所示，在各操作中封裝FXN轉殖基因之AAV9 (AAV9-FXN)之產量在1013 與1014 個載體基因組之間。
重組AAV9-FXN用於轉導培養物中之Lec2細胞。圖 4 展示人類FXN (ng/mg)在經各種劑量之AAV9-FXN轉導之經培養Lec2細胞中之表現。在使用較高劑量之載體下觀測到較高hFXN表現。
重組AAV9-FXN亦用於感染在心肌及骨胳肌(FXNflox / flox MCKCre + )中缺少FXN之小鼠。在3週齡用生理食鹽水或AAV9-FXN (5×1013 vg/kg)處理小鼠，且監測存活期。如圖 2 中所示，用AAV9-FXN處理顯著延長壽命。注射生理食鹽水之小鼠之中值存活期為64天，而經AAV9-FXN注射之小鼠之中值存活期為138.5天。
在獨立實驗中，缺乏FXN之小鼠在3週齡用生理食鹽水或低劑量或高劑量之AAV9-FXN (分別為1×1013 或5×1013 vg/kg)處理。在處理後3週處死小鼠，且分析心臟組織。如圖 3A 中所示，可在來自經AAV9-FXN處理之小鼠的心臟組織中偵測到人類FXN (hFXN) DNA。將hFXN DNA轉錄為RNA (圖 3B )且轉譯成蛋白質(圖 3C )。較高劑量之AAV9-FXN在心臟樣本中產生較高水準之FXN DNA、RNA及蛋白質。
綜合而言，此等資料展示包含FXN轉殖基因之本發明之AAV轉移卡匣可用於生產重組AAV載體，且可用於活體內轉導個體之細胞。 編號實施例
不管隨附申請專利範圍，本發明闡述以下本發明之編號實施例：
1.     一種核酸，其自5'至3'包含：5'反向末端重複序列(ITR)；啟動子；轉殖基因序列；多腺苷酸化信號；及3' ITR；其中該轉殖基因序列編碼共濟蛋白(FXN)蛋白質。
2.     如實施例1之核酸，其中該5' ITR及該3' ITR中之至少一者的長度為約110至約160個核苷酸。
3.     如實施例1或2之核酸，其中該5' ITR與該3' ITR具有相同長度。
4.     如實施例1或2之核酸，其中該5' ITR與該3' ITR具有不同長度。
5.     如實施例1至4中任一項之核酸，其中該5' ITR及該3' ITR中之至少一者係分離自或衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、rhAAV74、鳥AAV或牛AAV之基因組。
6.     如實施例1之核酸，其中該5' ITR包含SEQ ID NO: 1之序列或與其至少95%一致之序列。
7.     如實施例1至6中任一項之核酸，其中該3' ITR包含SEQ ID NO: 2之序列或與其至少95%一致之序列。
8.     如實施例1至7中任一項之核酸，其中該3' ITR包含SEQ ID NO: 3之序列或與其至少95%一致之序列。
9.     如實施例1至8中任一項之核酸，其中該啟動子驅動該轉殖基因之表現。
10.    如實施例1至9中任一項之核酸，其中該啟動子為組成型啟動子。
11.    如實施例1至9中任一項之核酸，其中該啟動子為誘導型啟動子。
12.    如實施例1至11中任一項之核酸，其中該啟動子為組織特異性啟動子。
13.    如實施例1至12中任一項之核酸，其中該啟動子係選自由以下組成之群：CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1 α啟動子、EF-1 α短啟動子、EF-1 α核心啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
14.    如實施例13之核酸，其中該啟動子為雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。
15.    如實施例13之核酸，其中該啟動子為該EF-1 α啟動子、該EF-1 α短啟動子或該EF-1 α核心啟動子。
16.    如實施例13之核酸，其中該啟動子為GUSB240啟動子。
17.    如實施例13之核酸，其中該啟動子為GUSB379啟動子。
18.    如實施例13之核酸，其中該啟動子為PGK啟動子。
19.    如實施例1至12中任一項之核酸，其中該啟動子包含選自SEQ ID NO: 6至12中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
20.    如實施例1至19中任一項之核酸，其中該FXN蛋白質為人類FXN蛋白質。
21.    如實施例1至20中任一項之核酸，其中該FXN蛋白質具有SEQ ID NO: 65之序列或與其至少95%一致之序列。
22.    如實施例1至21中任一項之核酸，其中該轉殖基因序列經CpG最佳化。
23.    如實施例1至21中任一項之核酸，其中該轉殖基因序列包含SEQ ID NO: 19或20或與其至少95%一致之序列。
24.    如實施例1至24中任一項之核酸，其中該核酸包含緊接該轉殖基因序列之5'的科札克序列。
25.    如實施例24之核酸，其中該科札克序列包含序列SEQ ID NO: 17或18或與其至少95%一致之序列。
26.    如實施例1至25中任一項之核酸，其中該多腺苷酸化信號係選自猴病毒40 (SV40)、人類α-球蛋白、兔α-球蛋白、人類β-球蛋白、兔β-球蛋白、人類膠原蛋白、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)之多腺苷酸化信號。
27.    如實施例26之核酸，其中該多腺苷酸化信號為該牛生長激素多腺苷酸化信號。
28.    如實施例26之核酸，其中該多腺苷酸化信號為該人類生長激素多腺苷酸化信號。
29.    如實施例26之核酸，其中該多腺苷酸化信號為該人類β-球蛋白多腺苷酸化信號。
30.    如實施例26之核酸，其中該多腺苷酸化信號為該兔β-球蛋白多腺苷酸化信號。
31.    如實施例1至25中任一項之核酸，其中該多腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 21至24中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
32.    如實施例1至31中任一項之核酸，其中該核酸進一步包含強化子。
33.    如實施例32之核酸，其中該強化子為CMV強化子。
34.    如實施例32之核酸，其中該強化子包含SEQ ID NO: 4或5之序列或與其至少95%一致之序列。
35.    如實施例1至34中任一項之核酸，其中卡匣進一步包含內含子序列。
36.    如實施例35之核酸，其中該內含子序列為嵌合序列。
37.    如實施例35之核酸，其中該內含子序列為雜交序列。
38.    如實施例35之核酸，其中該內含子序列包含分離自或衍生自以下中之一或多者之內含子序列之序列：β-球蛋白、雞β-肌動蛋白、小鼠微小病毒及人類IgG。
39.    如實施例35之核酸，其中該內含子序列包含SEQ ID NO: 13至16中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
40.    如實施例1至39中任一項之核酸，其中該核酸進一步包含至少一個填充序列。
41.    如實施例40之核酸，其中該核酸包含兩個填充序列。
42.    如實施例40之核酸，其中該至少一個填充序列包含SEQ ID NO: 25至27中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
43.    如實施例1之核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 28至64中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
44.    一種質體，其包含如實施例1至43中任一項之核酸。
45.    一種細胞，其包含如實施例1至43中任一項之核酸或如實施例44之質體。
46.    一種生產重組AAV載體之方法，該方法包含使AAV生產細胞與如實施例1至43中任一項之核酸或如實施例44之質體接觸。
47.    一種重組AAV載體，其藉由如實施例46之方法生產。
48.    如實施例47之重組AAV載體，其中該重組AAV載體為單股AAV (ssAAV)。
49.    如實施例47之重組AAV載體，其中該重組AAV載體為自互補AAV (scAAV)。
50.    如實施例47至49中任一項之重組AAV載體，其中該AAV載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV或牛AAV之衣殼蛋白。
51.    如實施例47至49中任一項之重組AAV載體，其中該AAV載體包含與野生型AAV衣殼蛋白相比具有一或多種取代或突變之衣殼蛋白。
52.    一種組合物，其包含如實施例1至43中任一項之核酸、如實施例44之質體、如實施例45之細胞或如實施例47至51中任一項之重組AAV載體。
53.    一種用於治療有需要之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如實施例1至43中任一項之核酸、如實施例34之質體、如實施例35之細胞或如實施例47至41中任一項之重組AAV載體。
54.    如實施例53之方法，其中該個體患有弗里德希氏共濟失調。
55.    如實施例53或54之方法，其中該個體為人類個體。
56.    如實施例53至55中任一項之方法，其中該核酸、該質體、該細胞或該重組AAV載體係藉由直接注射至中樞神經系統中投與。
前述內容說明本發明且不應被解釋為限制本發明。藉由以下申請專利範圍界定本發明，申請專利範圍之等效物包括在其中。
圖 1 展示使用三重質體轉染方法之AAV生產產量(載體基因組)。使用液滴式數位PCR (ddPCR® )檢定法定量AAV載體。
圖 2 展示與注射生理食鹽水之小鼠(第1組)相比，用5×1013 vg/kg劑量之封裝人類FXN轉殖基因之AAV載體處理的缺乏FXN之(FXNflox/flox MCKCre+ ) 小鼠(第2組)之存活百分比。
圖 3A-3C 展示實驗結果，其中3週齡缺乏FXN之(FXNflox/flox MCKCre+ ) 小鼠用生理食鹽水或封裝人類FXN轉殖基因之AAV載體處理(低劑量=1×1013 vg/kg，高劑量=5×1013 vg/kg)。處理後3週處死小鼠。圖 3A 展示在心臟組織中每微克宿主DNA人類FXN載體DNA之複本數量。圖 3B 展示FXN mRNA之複本之數量，正規化為HPRT (次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸基-核糖基轉移酶) mRNA。ND =未偵測到。圖 3C 展示FXN蛋白質含量。
圖4展示人類FXN (ng/mg)在經各種劑量之AAV9-FXN轉導之經培養Lec2細胞中之表現。使用標準ELISA量測人類FXN含量。
圖 5 展示使用本發明之AAV轉移卡匣生產AAV之例示性流程的示意圖。使用標準選殖技術將包含5' ITR、啟動子、轉殖基因及3' ITR的AAV轉移卡匣封裝至質體中。製備包含AAV rep及cap序列之第二質體及包含腺病毒輔助基因之第三質體。將三種質體轉染至AAV生產細胞株(例如HEK293)中。細胞隨後生產AAV，其可經純化及冷凍以供後續使用。
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Figure 12_A0101_SEQ_0086

Claims (56)

  1. 一種核酸，其自5'至3'包含： 5'反向末端重複序列(ITR)； 啟動子； 轉殖基因序列； 多腺苷酸化信號；及 3' ITR； 其中該轉殖基因序列編碼共濟蛋白(frataxin)(FXN)蛋白質。
  2. 如請求項1之核酸，其中該5' ITR及該3' ITR中之至少一者的長度為約110至約160個核苷酸。
  3. 如請求項1或2之核酸，其中該5' ITR與該3' ITR具有相同長度。
  4. 如請求項1或2之核酸，其中該5' ITR及該3' ITR具有不同長度。
  5. 如請求項1至4中任一項之核酸，其中該5' ITR及該3' ITR中之至少一者係分離自或衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、rhAAV74、鳥AAV或牛AAV之基因組。
  6. 如請求項1之核酸，其中該5' ITR包含SEQ ID NO: 1之序列或與其至少95%一致之序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之核酸，其中該3' ITR包含SEQ ID NO: 2之序列或與其至少95%一致之序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之核酸，其中該3' ITR包含SEQ ID NO: 3之序列或與其至少95%一致之序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之核酸，其中該啟動子驅動該轉殖基因之表現。
  10. 如請求項1至9中任一項之核酸，其中該啟動子為組成型啟動子。
  11. 如請求項1至9中任一項之核酸，其中該啟動子為誘導型啟動子。
  12. 如請求項1至11中任一項之核酸，其中該啟動子為組織特異性啟動子。
  13. 如請求項1至12中任一項之核酸，其中該啟動子係選自由以下組成之群：CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子、多角體蛋白(polyhedrin)啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子、EF-1α短啟動子、EF-1α核心啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
  14. 如請求項13之核酸，其中該啟動子為雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。
  15. 如請求項13之核酸，其中該啟動子為EF-1α啟動子、EF-1α短啟動子或EF-1α核心啟動子。
  16. 如請求項13之核酸，其中該啟動子為GUSB240啟動子。
  17. 如請求項13之核酸，其中該啟動子為GUSB379啟動子。
  18. 如請求項13之核酸，其中該啟動子為PGK啟動子。
  19. 如請求項1至12中任一項之核酸，其中該啟動子包含選自SEQ ID NO: 6至12中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
  20. 如請求項1至19中任一項之核酸，其中該FXN蛋白質為人類FXN蛋白質。
  21. 如請求項1至20中任一項之核酸，其中該FXN蛋白質具有SEQ ID NO: 65之序列或與其至少95%一致之序列。
  22. 如請求項1至21中任一項之核酸，其中該轉殖基因序列經CpG最佳化。
  23. 如請求項1至21中任一項之核酸，其中該轉殖基因序列包含SEQ ID NO: 19或20或與其至少95%一致之序列。
  24. 如請求項1至24中任一項之核酸，其中該核酸包含緊接該轉殖基因序列之5'的科札克序列(Kozak sequence)。
  25. 如請求項24之核酸，其中該科札克序列包含序列SEQ ID NO: 17或18或與其至少95%一致之序列。
  26. 如請求項1至25中任一項之核酸，其中該多腺苷酸化信號係選自猴病毒40 (SV40)、人類α-球蛋白、兔α-球蛋白、人類β-球蛋白、兔β-球蛋白、人類膠原蛋白、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)之多腺苷酸化信號。
  27. 如請求項26之核酸，其中該多腺苷酸化信號為牛生長激素多腺苷酸化信號。
  28. 如請求項26之核酸，其中該多腺苷酸化信號為人類生長激素多腺苷酸化信號。
  29. 如請求項26之核酸，其中該多腺苷酸化信號為人類β-球蛋白多腺苷酸化信號。
  30. 如請求項26之核酸，其中該多腺苷酸化信號為該兔β-球蛋白多腺苷酸化信號。
  31. 如請求項1至25中任一項之核酸，其中該多腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 21至24中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
  32. 如請求項1至31中任一項之核酸，其中該核酸進一步包含強化子。
  33. 如請求項32之核酸，其中該強化子為CMV強化子。
  34. 如請求項32之核酸，其中該強化子包含SEQ ID NO: 4或5之序列或與其至少95%一致之序列。
  35. 如請求項1至34中任一項之核酸，其中卡匣進一步包含內含子序列。
  36. 如請求項35之核酸，其中該內含子序列為嵌合序列。
  37. 如請求項35之核酸，其中該內含子序列為雜交序列。
  38. 如請求項35之核酸，其中該內含子序列包含分離自或衍生自以下中之一或多者之內含子序列之序列：β-球蛋白、雞β-肌動蛋白、小鼠微小病毒及人類IgG。
  39. 如請求項35之核酸，其中該內含子序列包含SEQ ID NO: 13至16中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
  40. 如請求項1至39中任一項之核酸，其中該核酸進一步包含至少一個填充(stuffer)序列。
  41. 如請求項40之核酸，其中該核酸包含兩個填充序列。
  42. 如請求項40之核酸，其中該至少一個填充序列包含SEQ ID NO: 25至27中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
  43. 如請求項1之核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 28至64中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
  44. 一種質體，其包含如請求項1至43中任一項之核酸。
  45. 一種細胞，其包含如請求項1至43中任一項之核酸或如請求項44之質體。
  46. 一種生產重組AAV載體之方法，該方法包含使AAV生產細胞與如請求項1至43中任一項之核酸或如請求項44之質體接觸。
  47. 一種重組AAV載體，其藉由如請求項46之方法生產。
  48. 如請求項47之重組AAV載體，其中該重組AAV載體為單股AAV (ssAAV)。
  49. 如請求項47之重組AAV載體，其中該重組AAV載體為自互補AAV (scAAV)。
  50. 如請求項47至49中任一項之重組AAV載體，其中該AAV載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV或牛AAV之衣殼蛋白。
  51. 如請求項47至49中任一項之重組AAV載體，其中該AAV載體包含與野生型AAV衣殼蛋白相比具有一或多個取代或突變之衣殼蛋白。
  52. 一種組合物，其包含如請求項1至43中任一項之核酸、如請求項44之質體、如請求項45之細胞或如請求項47至51中任一項之重組AAV載體。
  53. 一種治療有需要個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至43中任一項之核酸、如請求項34之質體、如請求項35之細胞或如請求項47至41中任一項之重組AAV載體。
  54. 如請求項53之方法，其中該個體患有弗里德希氏共濟失調(Friedreich's Ataxia)。
  55. 如請求項53或54之方法，其中該個體為人類個體。
  56. 如請求項53至55中任一項之方法，其中該核酸、該質體、該細胞或該重組AAV載體係藉由直接注射至中樞神經系統中投與。
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