TW202028738A - 血液試料中之微生物之檢出方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於提供一種簡便性或迅速性優異,且可高精度地檢出血液試料中之微生物之方法。
若使用依序包括以下之步驟(a)~(c)之方法,則可高精度地檢出下述受驗者是否被特定之微生物感染:步驟(a),其係將自受驗者採集之血液試料之培養物以213 xg左右之相對離心力進行1分鐘左右之離心處理,分離為上清液組分與沈澱組分;步驟(b),其係自步驟(a)中所獲得之上清液組分獲得微生物組分;及步驟(c),其係使用質量分析計,對上述微生物組分中是否含有微生物進行解析。
Description
本發明係關於一種檢出來自受驗者之血液試料中有無微生物之方法;製備來自受驗者之含有微生物之試料之方法;用以檢出來自受驗者之血液試料中有無微生物之系統(裝置等機構之組合,以下相同);用以製備來自受驗者之含有微生物之試料之系統;及含有微生物之試料。
於微生物傳染病、尤其是如敗血症般因細菌或真菌(以下,有時稱為「細菌等」)導致之重度之傳染病之情形時,就傳染病之治癒或良好之預後之方面而言,早期投予合適之抗菌藥較重要。針對因細菌等導致之傳染病,假定致炎菌,選擇有效果之抗菌藥,實施經驗性治療。與此同時,實施用以查明致炎菌之血液培養檢查,但查明致炎菌為止需要數天時間。因此,要求迅速地查明致炎菌,並以經驗性治療作為有根據之抗菌藥之精確使用。
最近,報告有若對細菌蛋白質或全細菌,進行使用基質輔助雷射脫附離子化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF MS)之質量分析法,則可生成細菌之菌屬、菌種、及菌株固有之生物標記(專利文獻1)。又,報告有以下方法:藉由對尿以2000 xg進行30秒鐘之低速旋轉之離心處理,而使細菌與來自生物體內之細胞(白血球)根據比重之不同分別分離為上清液組分與沈澱組分,並進行使用MALDI-TOFMS之質量分析法,對細菌進行鑑定(非專利文獻1)。進而,已知有由於比重或尺寸大於其他細菌之鏈或簇形成較明顯之細菌於低速旋轉之離心處理中無法與來自生物體內之細胞分離,故而以於離心處理前消除細菌之鏈或簇形成為目的,使用超音波產生裝置之方法(非專利文獻2)。
另一方面,本發明人等發現若將經氯化銨進行過溶血處理之來自受驗者之血液培養物,利用具有不使細菌通過之孔徑之過濾膜進行過濾處理,並回收被過濾膜捕捉之殘渣,對如此所獲得之殘渣試料中之細菌使用質量分析計進行解析,則與使用其他溶血劑(例如,NP-40、Tween 20、Triton X-100)進行溶血處理之情形相比,可更高感度地檢出上述殘渣試料中是否含有細菌(日本專利特願2018-61903)。
先前技術文獻
專利文獻
專利文獻1:美國專利第6,177,266號
非專利文獻
非專利文獻1:J Clin Microbiol 48:2110-2115.
非專利文獻2:日本臨床微生物學會雜誌 Vol.26 No.2 79-89 2016
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於提供一種簡便性或迅速性優異,且可高精度地檢出血液試料中之微生物之方法等。
[解決問題之技術手段]
本發明人等對不使用溶血劑而將血液培養物中之微生物與血球成分進行分離之方法進行了研究。於高速旋轉之離心操作中,預想由於大量細菌與血球成分一同沈澱,故而無法將兩者分離,又,於低速旋轉之離心操作中,如上所述,有比重或尺寸大於其他細菌之鏈或簇形成較明顯之細菌或真菌無法與血球成分分離之顧慮,但經過反覆進行相對離心力與離心時間之研究,結果發現若將血液培養物以213 xg左右之相對離心力進行1分鐘左右之離心處理,則可藉由質量分析高精度地檢出離心處理後之上清液組分中是否含有細菌(尤其是葡萄球菌屬細菌或鏈球菌屬細菌等鏈或簇形成較明顯之細菌)或真菌。
即,本發明如下所述。
[1]一種血液試料中之微生物之檢出方法,其特徵在於包括以下之步驟(a)~(c):
(a)將自受驗者採集之血液試料之培養物(以下,有時稱為「來自受驗者之血液培養物」)以170~800 xg之相對離心力進行40~80秒鐘之離心處理,分離為上清液組分與沈澱組分之步驟;
(b)自步驟(a)中所獲得之上清液組分獲得微生物組分之步驟;
(c)對上述微生物組分中是否含有微生物進行解析之步驟。
[2]如上述[1]所記載之方法,其特徵在於:於步驟(c)中,使用質量分析計進行解析。
[3]如上述[2]所記載之方法,其特徵在於:質量分析計係基質輔助雷射脫附離子化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF MS)。
[4]一種含有微生物之試料之製備方法,其特徵在於包括以下之步驟(a)及(b):
(a)將自受驗者採集之血液試料之培養物以170~800 xg之相對離心力進行40~80秒鐘之離心處理,分離為上清液組分與沈澱組分之步驟;
(b)自步驟(a)中所獲得之上清液組分獲得微生物組分之步驟。
[5]如上述[4]所記載之方法,其特徵在於:試料係質量分析用試料。
[6]如上述[1]至[5]中任一項所記載之方法,其特徵在於:於步驟(b)中,藉由實施以下之步驟(p)及(q)而獲得微生物組分,
(p)將步驟(a)中所獲得之上清液組分利用具有不使微生物通過之孔徑之過濾膜進行過濾處理之步驟;
(q)回收上述過濾處理後之過濾膜所捕捉之殘渣而獲得微生物組分之步驟。
[7]如上述[6]所記載之方法,其特徵在於:於步驟(q)中,將過濾處理後之過濾膜浸漬於純水中,藉由離心分離回收殘渣而獲得微生物組分。
[8]如上述[6]或[7]所記載之方法,其特徵在於:於步驟(p)與步驟(q)之間包括將過濾處理後之過濾膜使用純水進行洗淨之步驟(r)。
[9]如上述[1]至[8]中任一項所記載之方法,其特徵在於:微生物係細菌或真菌。
[10]一種血液試料中之微生物之檢出系統,其特徵在於具備以下之(A)~(C)之機構:
(A)離心機構,其將自受驗者採集之血液試料之培養物於170~800 xg之相對離心力、40~80秒鐘之條件下分離為上清液組分與沈澱組分;
(B)獲取機構,其基於上清液組分,獲取微生物組分;
(C)分析機構,其對微生物組分中是否含有微生物進行解析。
[11]如上述[10]所記載之系統,其特徵在於:分析機構係質量分析機構。
[12]如上述[11]所記載之系統,其特徵在於:質量分析機構係基質輔助雷射脫附離子化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF MS)。
[13]一種含有微生物之試料之製備系統,其特徵在於包括以下之(A)及(B)之機構:
(A)離心機構,其將自受驗者採集之血液試料之培養物於170~800 xg之相對離心力、40~80秒鐘之條件下分離為上清液組分與沈澱組分;
(B)獲取機構,其基於上清液組分,獲取微生物組分。
[14]如上述[13]所記載之系統,其特徵在於:試料係質量分析用試料。
[15]如上述[10]至[14]所記載之系統,其特徵在於:微生物組分之獲取機構係具有不使微生物通過之孔徑之過濾膜。
[16]如上述[10]至[15]中任一項所記載之系統,其特徵在於:微生物係細菌或真菌。
[17]一種含有微生物之試料,其特徵在於:含有至少1×105
個葡萄球菌屬細菌,且實質上不含血紅蛋白。
[18]如上述[17]所記載之試料,其特徵在於:其係質量分析用試料。
又,作為本發明之實施之另一形態,可列舉:
對受驗者是否被微生物感染進行診斷之方法,其包括上述步驟(a)~(c),進而於上述步驟(c)之後,包括於上述微生物組分中含有微生物之情形時,診斷出上述受驗者被上述微生物感染之可能性較高,於上述微生物組分中不含微生物之情形時,診斷出上述受驗者被上述微生物感染之可能性較低之步驟(x);以及
對受驗者是否被微生物感染進行診斷,並對微生物傳染病進行預防或治療之方法,其包括上述步驟(a)~(c)、及(x),進而包括對於診斷出被微生物感染之可能性較高之受驗者,使用針對該微生物之抗生素或疫苗等藥劑,實施治療處理之步驟(y)。
[發明之效果]
近年來,於血液培養物之檢體數有增加傾向之狀況下,藉由使用本發明之方法,將血液培養物以213 xg左右之相對離心力進行1分鐘左右之相對較短時間之離心處理,即便係多檢體之血液培養物,亦可迅速且有效率地進行處理。又,由於藉由上述離心處理,可將血液培養物中之微生物(尤其是葡萄球菌屬細菌、鏈球菌屬細菌等鏈及/或簇形成較明顯之細菌或真菌)與血球成分高精度地分離,故而若基於分離後之含有微生物之上清液組分,製備分析用樣品,使用質量分析計等分析機構進行解析,則可高精度地對血液培養物中是否含有特定之微生物進行判定、評價。尤其是若於不使用溶血劑而實施本發明之方法,則不會因溶血劑導致對微生物造成損害,因此可更高效率地回收微生物,更高精度地鑑定微生物。綜上所述,根據本發明,可提供於對受驗者是否被特定之微生物感染進行診斷之方面有用之資料,因此除微生物傳染病之診斷以外,可期待微生物傳染病之早期預防或早期治療。
又,本發明中,若將離心處理後之含有微生物之上清液組分利用具有不使微生物通過之孔徑之過濾膜進行過濾處理,則過濾處理可藉由使用注射器之手動操作而進行,因此即便沒有真空泵等大型機器,亦可實施本發明。
診斷敗血症之血液培養檢查如下述般進行:將自受驗者採集之血液試料於培養液中進行培養,以血液培養物之濁度之變化、因細菌等引起之培養液中之氣體產生、pH值之變化等作為指標,確認1~7天期間有無細菌等之增殖。繼而,於確認到細菌等之增殖之情形時,採集血液培養物,進行革蘭氏染色與繼代培養(二次培養),根據藉由革蘭氏染色之大致之細菌等之菌種之分類結果,進行經驗性治療所使用之抗菌藥之評價。另一方面,若使用本發明之檢出法,則可高效率地採集細菌等,迅速且準確地對細菌等進行菌種鑑定,因此能夠準確地對致炎菌之細菌等之菌種進行鑑定,帶來抗菌藥之精確治療。因此,本發明可貢獻於細菌等之傳染病患者之預後之改善、耐藥細菌等之增加抑制、成本削減等。
作為本發明之血液試料中之微生物之檢出方法,只要為依序包括下述步驟(a)~(c)之方法(以下,有時稱為「本案檢出法」),則無特別限制:步驟(a),其係將來自受驗者之血液培養物以170~800 xg之相對離心力(RCF,relative centrifugal force;亦稱為相對離心加速度)進行40~80秒鐘之離心處理,分離為上清液組分與沈澱組分;步驟(b),其係自上述步驟(a)中所獲得之上清液組分獲得微生物組分;及步驟(c),其係對上述微生物組分中是否含有微生物進行解析;且本案檢出法係檢出上述來自受驗者之血液試料中是否存在微生物之方法,不包括由醫師進行之診斷行為。又,作為本發明之含有微生物之試料之製備方法,只要為依序包括上述步驟(a)及(b),製備含有微生物之試料之方法(以下,有時稱為「本案製備法」),則無特別限制。再者,以下,有時將本案檢出法及本案製備法統稱為「本案方法」。
作為本發明之血液試料中之微生物之檢出系統,只要為具備下述(A)~(C)之機構之系統(以下,有時稱為「本案檢出系統」),則無特別限制:離心機構(A),其將來自受驗者之血液培養物於170~800 xg之相對離心力、40~80秒鐘之條件下分離為上清液組分與沈澱組分;獲取機構(B),其基於上清液組分,獲取微生物組分;及分析機構(C),其對微生物組分中是否含有微生物進行解析;又,作為本發明之含有微生物之試料之製備系統,只要為具備上述步驟(A)及(B)之機構之系統(以下,有時稱為「本案製備系統」),則無特別限制。再者,以下,有時將本案檢出系統及本案製備系統統稱為「本案系統」。
本說明書中,「至少1×105
個葡萄球菌屬細菌」中例如包含至少1×106
個葡萄球菌屬細菌、至少1×107
個葡萄球菌屬細菌、至少1×108
個葡萄球菌屬細菌等。
本說明書中,所謂「實質上不含血紅蛋白」,意指幾乎或完全不含血紅蛋白,更具體而言,意指於對含有微生物之試料(即,微生物組分)之一部分或全部,利用使用MALDI-TOFMS之質量分析法進行檢出、定量之情形時,幾乎未檢出(例如,檢出5 mg/mL以下)或完全未檢出(即,為檢出感度以下)1種或2種以上之來自血紅蛋白之波峰。
作為上述受驗者,無特別限制,例如可列舉:不確定有無微生物感染者(例如,健康者;癌患者、糖尿病患者等非微生物傳染病患者)、或不確定是否被特定之微生物感染者(例如,健康者;敗血症患者、上呼吸道傳染病患者等微生物傳染病患者)。
[關於本案方法中之步驟(a)]
上述步驟(a)中,藉由以170~800 xg之RCF進行40~80秒鐘之離心處理,而將來自受驗者之血液培養物中所含有之微生物之一部分或大部分、與血球成分之一部分或大部分,分別分離為上清液組分與沈澱組分。來自受驗者之血液培養物可使用任意之離心機(例如,離心管以規定之角度配置之角轉子式離心機;或離心管之角度可變,且於離心處理中離心管處於水平或大致水平之水平轉子式離心機)進行離心處理。離心機可使用後述之本實施例中所使用之桌上型離心機4000(KUBOTA Corporation公司製造)、Beckman GPR(himac CF7D2,HITACHI公司製造)、桌上低速離心機(LT-015,TOMY公司製造)等市售品。並且,作為本案系統中之離心機構,可列舉可將來自受驗者之血液培養物於170~800 xg之相對離心力、40~80秒鐘之條件下分離為上清液組分與沈澱組分之機構,例如上述任意之離心機或市售品之離心機。
本說明書中,RCF可基於下述式(1)算出。
RCF(xg)=1118×R×N2
×10-8
(1)
[式中,「R」表示旋轉半徑(cm),「N」表示每1分鐘之轉速(rpm=min-1
)]。
上述步驟(a)中,作為式(1)中之旋轉半徑R,使用基於自旋轉軸至離心處理中之離心管之半徑之中最大之半徑(即,最大半徑[Rmax
])、與最小之半徑(即,最小半徑[Rmin
])算出之平均半徑(Rav=[最大Rmax
+Rmin
]/2)之值,以RCF成為170~800 xg之範圍內之方式,設定轉速N,進行離心處理。
作為上述RCF,只要為170~800 xg之範圍內即可,例如可列舉:170~700 xg、170~600 xg、170~500 xg、170~400 xg、170~300 xg、170~250 xg、170~230 xg、170~220 xg、175~800 xg、180~800 xg、185~800 xg、190~800 xg、195~800 xg、200~800 xg、175~700 xg、180~700 xg、185~700 xg、190~700 xg、195~700 xg、200~700 xg、175~700 xg、175~600 xg、175~500 xg、175~400 xg、175~300 xg、175~250 xg、175~230 xg、175~220 xg、180~700 xg、180~600 xg、180~500 xg、180~400 xg、180~300 xg、180~250 xg、180~230 xg、180~220 xg、185~700 xg、185~600 xg、185~500 xg、185~400 xg、185~300 xg、185~250 xg、185~230 xg、185~220 xg、190~700 xg、190~600 xg、190~500 xg、190~400 xg、190~300 xg、190~250 xg、190~230 xg、190~220 xg、195~700 xg、195~600 xg、195~500 xg、195~400 xg、195~300 xg、195~250 xg、195~230 xg、195~220 xg、200~700 xg、200~600 xg、200~500 xg、200~400 xg、200~300 xg、200~250 xg、200~230 xg、200~220 xg等。
作為上述步驟(a)中之離心處理時間,只要為40~80秒鐘之範圍內即可,例如可列舉:40~76秒鐘、40~73秒鐘、40~70秒鐘、40~66秒鐘、40~63秒鐘、43~80秒鐘、46~80秒鐘、50~80秒鐘、53~80秒鐘、56~80秒鐘、43~76秒鐘、46~76秒鐘、50~76秒鐘、53~76秒鐘、56~76秒鐘、43~73秒鐘、46~73秒鐘、50~73秒鐘、53~73秒鐘、56~73秒鐘、43~70秒鐘、46~70秒鐘、50~70秒鐘、53~70秒鐘、56~70秒鐘、43~66秒鐘、46~66秒鐘、50~66秒鐘、53~66秒鐘、56~66秒鐘、43~63秒鐘、46~63秒鐘、50~63秒鐘、53~63秒鐘、56~63秒鐘等。
離心處理中之溫度通常為0~40℃之範圍內,可較佳地例示室溫(例如,10~30℃)。
來自受驗者之血液培養物例如可藉由將自受驗者採集之血液試料於培養溫度35℃之條件下進行12~48小時培養而獲得。
藉由上述步驟(a)中之離心處理,來自受驗者之血液培養物中之血球成分(例如,血紅蛋白)能夠以不會妨礙其後之步驟(b)及/或步驟(c)之操作之程度去除。因此,亦可不將上述步驟(a)中所獲得之上清液組分使用溶血劑進行溶血處理,但為了將上述步驟(a)中所獲得之上清液組分中可能含有之血球成分進行溶血處理,進一步提高血液試料中之微生物之檢出精度,亦可於上述步驟(b)之前,將上述步驟(a)中所獲得之上清液組分與溶血劑混合,進行溶血處理。又,上述步驟(a)中,亦可將預先利用溶血劑進行溶血處理之來自受驗者之血液培養物進行離心處理。
作為上述溶血劑,例如可列舉:本發明人等之先前申請案(日本專利特願2018-61903)中所記載之氯化銨、以及界面活性劑、低張液等。此處,作為氯化銨以外之溶血劑,例如可列舉:界面活性劑、低張液等。作為上述界面活性劑,可列舉:Triton X-100(Triton為註冊商標)(聚氧乙烯(10)辛基苯基醚)、Triton X-114(聚氧乙烯(8)辛基苯基醚)、Triton X-405(聚氧乙烯(40)異辛基苯基醚)、NP-40(Nonidet P-40)(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)等聚氧乙烯對第三辛基苯基醚(Triton系界面活性劑);Tween 20(Tween為註冊商標)、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Tween 65、Tween 85等聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(Tween系界面活性劑);Briji 35(Briji為註冊商標)(聚氧乙烯(23)月桂醚)等聚氧乙烯烷基醚(Briji系界面活性劑);十二烷基-β-D-麥芽糖、辛基-β-D-葡糖苷等非離子性界面活性劑或十二烷基硫酸鈉(SDS)等陰離子性界面活性劑或氯化苄烷銨、苄索氯銨、二癸基二甲基銨鹽、氯化十二烷基三甲基銨等陽離子性界面活性劑或CHAPS(3-(3-膽醯胺丙基)二甲基銨基-1-丙磺酸鹽)、氯化烷基聚胺基乙基甘胺酸等兩性界面活性劑。
作為上述低張液,只要為以低於體液(例如血漿)或細胞液之滲透壓之方式利用鈉或鉀等調整鹽或糖濃度等之低張液,則無特別限制。本說明書中,所謂「低張」,意指滲透壓低於250 mOsm/L。
[關於本案方法中之步驟(b)]
上述步驟(a)中所獲得之上清液組分係血球成分之一部分或大部分被去除之來自受驗者之血液培養物。上述步驟(b)中,將上述上清液組分中所含有之微生物分離,獲得微生物組分(即,含有微生物之試料)。作為自上清液組分分離微生物之方法,只要為可將作為非溶解成分之微生物與溶解成分進行分離之方法即可,例如可列舉:將上述步驟(a)中所獲得之上清液組分藉由離心處理分離為沈澱組分與上清液組分,獲得沈澱組分作為微生物組分之方法;或藉由實施以下之步驟(p)及(q)而獲得微生物組分之方法:步驟(p),其係將上述步驟(a)中所獲得之上清液組分利用具有不使微生物通過之孔徑之過濾膜進行過濾處理;步驟(q),其係回收上述過濾處理後之過濾膜所捕捉之殘渣而獲得微生物組分;且該等之中,可較佳地例示藉由實施上述步驟(p)及(q),而獲得微生物組分之方法。本說明書中,「含有微生物之試料」可為液體試料,亦可為固體試料(例如,對液體試料進行乾燥處理而成者)。並且,作為本案系統中之微生物組分之獲取機構,可列舉可自上清液組分獲得微生物組分之機構,例如上述任意之離心機或市售品之離心機、或者具有不使微生物通過之孔徑之過濾膜,可較佳地例示具有不使微生物通過之孔徑之過濾膜。
於藉由離心處理獲得微生物組分之情形時,以上清液組分中所含有之微生物進行充分沈澱之方式,設定RCF及時間,進行離心處理。離心處理中之RCF例如為3000 xg以上,較佳為6000 xg以上,更佳為9000 xg以上。又,離心時間例如為3分鐘以上,較佳為5分鐘以上,更佳為10分鐘以上。
[關於本案方法中之步驟(p)]
藉由上述步驟(p)之過濾處理,溶解成分通過過濾膜。因此,於上述步驟(a)中所獲得之上清液組分中含有微生物之情形時,微生物以殘渣之形式被過濾膜捕捉,從而可與上述步驟(a)中所獲得之上清液組分之溶解成分進行分離。
作為進行上述過濾處理之方法,例如可列舉:藉由將上述步驟(a)中所獲得之上清液組分轉移至具備過濾膜且由塑膠、金屬、玻璃等材質製造之容器內,使用注射器、真空泵、吸出器、壓縮機等機器,進行抽吸或加壓,而進行過濾處理之方法;或藉由將上述步驟(a)中所獲得之上清液組分轉移至具備過濾膜且由塑膠、金屬、玻璃等材質製造之離心管或試管內,進行離心,而進行過濾處理之方法,就不使用大型機器,而更簡便地進行過濾處理之觀點而言,較佳為藉由手動操作注射器使其加壓或減壓,而進行過濾處理之方法;或藉由進行離心而進行過濾處理之方法。又,就防止微生物之污染之觀點而言,過濾處理較佳為於密閉系統中進行,過濾膜較佳為拋棄式者。
作為上述過濾膜之孔徑,只要為不使微生物通過之孔徑即可,例如,於微生物係細菌之情形時,通常為1.5 μm以下,較佳為1.2 μm以下,更佳為0.8 μm以下,進而較佳為0.7 μm以下,進而更佳為0.6 μm以下,最佳為0.5 μm以下,就避免因血紅蛋白等血球成分造成堵塞之觀點而言,通常為0.1 μm以上,較佳為0.2 μm以上,更佳為0.25 μm以上,進而較佳為0.3 μm以上,進而更佳為0.35 μm以上,最佳為0.4 μm以上。因此,作為細菌之過濾處理所使用之過濾膜之孔徑,通常為0.1~1.5 μm之範圍內,較佳為0.2~1.2 μm,更佳為0.25~0.8 μm,進而較佳為0.3~0.7 μm,進而更佳為0.35~0.6 μm,最佳為0.4~0.5 μm。又,於微生物係真菌之情形時,作為上述過濾膜之孔徑,通常為15 μm以下,較佳為12 μm以下,更佳為8 μm以下,進而較佳為7 μm以下,進而更佳為6 μm以下,最佳為5 μm以下,就避免因血紅蛋白等血球成分造成堵塞之觀點而言,通常為0.1 μm以上,較佳為0.2 μm以上,更佳為0.25 μm以上,進而較佳為0.3 μm以上,進而更佳為0.35 μm以上,最佳為0.4 μm以上。因此,作為真菌之過濾處理所使用之過濾膜之孔徑,通常為0.1~15 μm之範圍內,較佳為0.2~12 μm,更佳為0.25~8 μm,進而較佳為0.3~7 μm,進而更佳為0.35~6 μm,最佳為0.4~5 μm。
作為上述過濾膜之材質,例如可列舉:纖維素混合酯(MCE,Mixed cellulose esters)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、親水性PTFE、聚醚碸(PES)、親水性聚醚碸(hydrophilic polyethersulfone)、親水性聚丙烯(GHP)、尼龍(NYL)、乙酸纖維素(CA,cellulose acetate)、聚碸(PSF)、丙烯酸系共聚物(acrylic copolymer)、聚醯胺、尼龍6,6、聚酯、聚碳酸酯、硝化纖維素、硝化纖維素與纖維素酯之混合物等。
[關於本案方法中之步驟(q)]
上述步驟(q)中,作為回收殘渣而獲得微生物組分之方法,只要為自步驟(p)之過濾處理後之過濾膜可使殘渣游離並回收之方法即可,亦可為使用藥匙等,刮取被上述過濾膜捕捉之殘渣之方法,就殘渣中所含有之微生物之回收效率之觀點而言,較佳為將上述過濾膜之一部分或全部浸漬於純水中,將過濾膜及/或純水進行攪拌後,自含有殘渣之水藉由離心分離回收殘渣之方法,此處,就防止微生物等之污染之觀點而言,離心分離較佳為於密閉系統中進行。又,較佳為於回收殘渣之前,將上述過濾膜使用純水進行洗淨。作為洗淨次數,只要為至少1次即可,亦可為複數次(2、3、4次等),若考慮到時間效益及成本效益,則較佳為1次。又,過濾膜之洗淨可藉由下述方式進行:向步驟(p)之過濾處理後之過濾膜添加純水,利用與過濾處理同樣之抽吸或加壓方法,使純水通過過濾膜內。
本說明書中,所謂「純水」,意指去除雜質或離子性物質後之水,具體而言,意指導電率於24~26℃條件下為10 μS/cm以下之水。純水可藉由將自來水進行蒸餾及/或離子交換而製備。
[關於本案檢出法中之步驟(c)]
上述步驟(c)中,作為解析方法,只要為可對微生物之有無進行檢出、定量之方法,則無特別限制,例如可列舉:使用質量分析計進行解析(更具體而言,對來自微生物之蛋白質進行檢出、定量)之方法;使用即時PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)裝置、下一代定序儀[NGS,Next Generation Sequencer]等DNA分析機構進行解析(更具體而言,對來自微生物之基因組DNA進行檢出、定量)之方法;使用近紅外分光測定裝置等成分分析機構進行解析(更具體而言,對來自微生物之成分進行檢出、定量)之方法等,該等之中,可較佳地例示使用質量分析計進行解析之方法。
作為上述「使用質量分析計進行解析之方法」,只要為使用下述質量分析計之解析方法,則無特別限制,該質量分析計係將上述步驟(b)中所獲得之微生物組分使用離子源製成氣體狀之離子(離子化),於分析部中,於真空中使其運動,使用電磁力,或者使藉由飛行時間差而離子化之微生物組分,根據質荷比,可進行分離、檢出。此處,作為使用離子源進行離子化之方法,可適當選擇電子離子化(EI)法、化學離子化(CI)法、電場脫附離子化(FD)法、高速原子衝擊(FAB)法、基質輔助雷射脫附離子化(MALDI)法、電灑離子化法(ESI)法等方法,又,作為於分析部中,將經離子化之微生物組分進行分離之方法,可適當選擇磁場偏向型、四極型、離子捕捉型、飛行時間(TOF)型、傅立葉變換離子回旋共振型等分離方法。又,可利用組合2種以上之質量分析法之串聯型質量分析(MS/MS)。又,可利用氣體層析法(GC)或液體層析法(LC)或高效液相層析法(HPLC),將SBP或甲基半胱胺酸自夾雜物分離、純化而進行分析。作為質量分析計,較佳為基質輔助雷射脫附離子化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOFMS)。
本說明書中,所謂「下一代定序儀」,亦稱為第2代定序儀,意指可同時並排決定數千萬之DNA片段之核苷酸序列之核苷酸序列決定裝置。作為下一代定序儀中之定序原理,例如可列舉:利用橋接PCR法與邊合成邊定序(Sequencing-by-synthesis)法,於流槽上使檢出對象之DNA擴增,一邊進行合成一邊進行定序等之原理;或利用乳液PCR法與藉由測定於DNA合成時釋出之焦磷酸之量而進行序列決定之焦磷酸定序法進行定序等之原理。作為下一代定序儀,更具體而言,可列舉因美納(Illumina)公司製造之MiniSeq、MiSeq、NextSeq、HiSeq及HiSeq X系列;Roche公司製造之Roche 454 GS FLX定序儀等。
作為本案系統中之分析機構,可列舉:可對微生物組分中是否含有微生物進行解析之分析機構,例如質量分析機構(例如,上述質量分析計)、DNA分析機構(例如,下一代定序儀、即時PCR裝置)、分光分析機構(例如,近紅外分光測定裝置),較佳為質量分析機構,可較佳地例示MALDI-TOFMS。
上述步驟(c)中,微生物組分中是否含有微生物係由微生物組分製備適用於解析之樣品而進行解析。作為微生物組分中之解析對象物,只要為微生物中之物質(例如,蛋白質、肽、化合物)即可,就微生物中之表現量較多;易被離子化;無需利用胰蛋白酶等蛋白質分解酵素進行肽片段化處理,易於分子量約為4000~15,000 Da之範圍內被TOFMS檢出;對於多數種類之微生物,已知有可判別微生物之種類之質譜圖案等理由而言,於微生物係細菌或真菌等來自生物體外之細胞之情形時,較佳為該來自生物體外之細胞中之核糖體蛋白質。
上述步驟(c)中,於在微生物組分中檢出特定之微生物之情形時,上述受驗者可獲得用以診斷出被上述特定之微生物感染之可能性較高之資料,於在微生物組分中未檢出特定之微生物之情形時,上述受驗者可獲得用以診斷出被上述特定之微生物感染之可能性較低之資料。因此,作為本發明之實施之另一形態,可列舉包括上述步驟(a)~(c),且進而包括獲取該等資料之步驟之收集用以診斷受驗者是否被微生物感染之資料之方法。
作為上述微生物,例如可列舉細菌、真菌等來自生物體外之細胞或病毒,可較佳地例示細菌或真菌。作為上述細菌或真菌之具體例,例如可列舉後述實施例中記載之細菌或真菌。
本發明之「含有微生物之試料」可使用於製備後之解析(例如,質量分析、DNA分析、成分分析)用途,較佳為用於質量分析。
本發明中,將來自受驗者之血液培養物以213 xg左右相對較弱之相對離心力,且以1分鐘左右相對較短時間之離心處理時間進行離心處理。藉由上述特定條件下之離心處理,即便係血液培養物中所含有之微生物,尤其是比重或尺寸大於其他細菌之鏈及/或簇形成較明顯之細菌(例如,葡萄球菌屬細菌、鏈球菌屬細菌)或真菌,亦可不使用超音波產生裝置來消除細菌之鏈或簇形成,而使得與血球成分一併沈澱之菌體數得到抑制,從而可使能夠檢出之大量之菌體區分至上清液組分。因此,本案方法中通常不包括將來自受驗者之血液培養物使用超音波產生裝置進行處理之步驟,又,本案系統中不包括超音波產生機構。
以下,藉由實施例更具體地說明本發明,但本發明之技術範圍不受該等例示限定。再者,本實施例中所使用之血液培養物係藉由將在2016年6月~2017年4月期間自重症傳染病患者採集之血液試料於培養溫度35℃之條件下進行12~48小時培養而獲得之培養物中,利用血液培養自動分析裝置(BACTEC FX SYSTEM,BD Bioscience公司製造)呈培養陽性之培養物(n=120)。
實施例
實施例1. 血液培養物之分離條件之研究1
本發明人等預想於血液培養物中之細菌與血球成分分離之情形時,於相對離心力較強之高速離心操作中,菌體與血球成分一同被區分至沈澱組分,因此對相對離心力相對較弱(具體而言,相對離心力為37~213 xg)之低速離心操作進行了研究。再者,本實施例中,相對離心力係使用平均半徑(Rav)之值作為旋轉半徑而算出者。
1-1 方法
依照以下之順序[1]~[7]進行。
[1]將3 mL之血液培養物轉移至15 mL錐形管,利用3 mL之PBS(Phosphate Buffer Saline,磷酸鹽緩衝液)溶液稀釋後,使用桌上型離心機4000(轉子半徑:13.29,15 mL錐形管×16孔試管架,水平轉子,KUBOTA CORPORATION公司製造),於相對離心力為5種類之條件(213 xg[以轉速換算為1200 rpm]、148 xg[以轉速換算為1000 rpm]、95 xg[以轉速換算為800 rpm]、53 xg[以轉速換算為600 rpm]、或37 xg[以轉速換算為500 rpm])下,於室溫下進行1分鐘離心處理。
[2]將離心處理後之上清液組分添加至孔徑為0.45 μm之過濾膜(37 mm品質監測儀(Quality Monitor)[日本PALL公司製造])上。
[3]將上清液組分藉由利用安裝於37 mm品質監測儀之注射器之手動操作進行過濾。再者,藉由於上述5種類之條件中之3種類之條件(95 xg、53 xg、及37 xg)下之離心處理而獲得之上清液組分中,因過濾處理導致過濾膜堵塞。因此,以後之操作僅針對藉由於2種類之條件(213 xg及148 xg)下之離心處理而獲得之上清液組分進行。
[4]將2 mL之蒸餾水添加至37 mm品質監測儀上,藉由利用安裝於37 mm品質監測儀之注射器之手動操作進行過濾洗淨。
[5]取出洗淨後之37 mm品質監測儀,浸漬於1 mL之蒸餾水中,使用旋渦混合器攪拌30秒鐘後,進行離心處理(20630 xg、3分鐘、室溫),去除上清液。
[6]將所獲得之沈澱物(即,微生物組分)中之數μg載置於MALDI樣品靶(Bruker Daltonics公司製造)上,添加1 μL之70%甲酸、及1 μL之基質溶液(2,5-二羥基苯甲酸,80 mg/mL,30%乙腈,0.1%三氟乙酸),進行藉由乾燥處理之結晶化。
[7]向乾燥後之樣品添加α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質試劑(Bruker Daltonics公司製造)1 μL,乾燥後導入至MALDI-TOFMS(Microflex[Bruker Daltonics公司製造]),進行雙重測定,算出其平均值。質譜之獲取係使用Flex Control軟體(Bruker Daltonics公司製造)進行,基於核糖體蛋白質之指紋(fingerprint)(質譜圖案)之3種類之葡萄球菌屬細菌(金黃色葡萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、及頭狀葡萄球菌(S. capitis))之鑑定係使用MALDI Biotyper 3.1軟體(Bruker Daltonics公司製造)進行。於得分值為2.0以上之情形時,評價為菌種水準之一致較高;於得分值為1.7以上~未達2.0之情形時,評價為菌屬水準之一致較高;於得分值未達1.7之情形時,評價為無法鑑定。
1-2 結果
於使用藉由將血液培養物以相對離心力為213 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分,檢出上述3種類之葡萄球菌屬細菌之情形時,菌種水準(得分值≧2.0)之鑑定概率為100%(7/7),相對於此,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為148 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分,檢出上述3種類之葡萄球菌屬細菌之情形時,菌種水準之鑑定概率為0%(0/7),全部限於菌屬水準(1.7≦得分值<2.0)中之鑑定(參照表1)。
該結果表示為了高精度地檢出血液培養物中所含有之微生物(尤其是葡萄球菌屬細菌等簇形成較明顯之細菌),於將血液培養物以1分鐘左右之時間進行離心處理時之相對離心力需要設為至少大於148 xg,且接近於213 xg之值。
[表1]
葡萄球菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 148 xg之相對離心力 |
金黃色葡萄球菌 | 1 | 2.263 | 1.714 |
2 | 2.293 | 1.881 | |
3 | 2.304 | 1.721 | |
表皮葡萄球菌 | 4 | 2.047 | 1.879 |
5 | 2.049 | 1.894 | |
6 | 2.051 | 1.847 | |
頭狀葡萄球菌 | 7 | 2.202 | 1.992 |
實施例2. 血液培養物之分離條件之研究2
作為將血液培養物中之細菌與血球成分進行分離之離心處理條件,針對強於213 xg之相對離心力(具體而言,1337 xg)進行研究。
2-1 方法
依照以下之順序[1]~[7]進行。
[1]將3 mL之血液培養物轉移至15 mL錐形管,利用3 mL之PBS溶液稀釋後,使用桌上型離心機4000(轉子半徑:13.29,15 mL錐形管×16孔試管架,KUBOTA CORPORATION公司製造),於相對離心力為2種類之條件(213 xg[以轉速換算為1200 rpm]、或1337 xg[以轉速換算為3000 rpm])下,於室溫下進行1分鐘離心處理。
[2]將離心處理後之上清液組分添加至孔徑為0.45 μm之過濾膜(37 mm品質監測儀[日本PALL公司製造])上。
[3]將上清液組分藉由利用安裝於37 mm品質監測儀之注射器之手動操作進行過濾。
[4]將2 mL之蒸餾水添加至37 mm品質監測儀上,藉由利用安裝於37 mm品質監測儀之注射器之手動操作進行過濾洗淨。
[5]取出洗淨後之37 mm品質監測儀,浸漬於1 mL之蒸餾水中,使用旋渦混合器攪拌30秒鐘後,進行離心處理(20630 xg、3分鐘、室溫),去除上清液。
[6]將所獲得之沈澱物(即,微生物組分)中之數μg載置於MALDI樣品靶(Bruker Daltonics公司製造)上,添加1 μL之70%甲酸、及1 μL之基質溶液(2,5-二羥基苯甲酸,80 mg/mL,30%乙腈,0.1%三氟乙酸),進行藉由乾燥處理之結晶化。
[7]向乾燥後之樣品添加CHCA基質試劑(Bruker Daltonics公司製造)1 μL,乾燥後導入至MALDI-TOFMS(Microflex[Bruker Daltonics公司製造]),進行雙重測定,算出其平均值。質譜之獲取係使用Flex Control軟體(Bruker Daltonics公司製造)進行,基於核糖體蛋白質之指紋(質譜圖案)之8種類之葡萄球菌屬細菌(金黃色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、山羊葡萄球菌(S. caprae)、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)、人葡萄球菌(S. hominis)、里昂葡萄球菌(S. lugdunesis)、及華納葡萄球菌(S. warneri))、3種類之鏈球菌屬細菌(壞乳鏈球菌(S. dysgalactiae)、和緩鏈球菌(S. mitis)、及肺炎鏈球菌(S. pneumoniae))、2種類之非病原性腸桿菌屬細菌(鬆脆桿菌(B. fragilis)及馬鈴薯桿菌(B. vulgatus))、1種類之丙酸桿菌屬細菌(痤瘡丙酸桿菌(P. acnes))、1種類之檸檬酸桿菌屬細菌(弗氏檸檬酸桿菌(C. freundii))、3種類之腸內菌屬細菌(陰溝腸桿菌(E. cloacae)、糞腸球菌(E. faecalis)、及屎腸球菌(E. faecium))、1種類之梭菌屬細菌(敗血芽胞梭菌(C. septicum))、1種類之棒狀桿菌屬細菌(紋帶棒狀桿菌(C. striatum))、1種類之克雷伯氏菌屬細菌(產酸克雷伯氏菌(K. oxytoca))、1種類之變形桿菌屬細菌(奇異變形桿菌(P. mirabilis))、1種類之普洛維登斯菌屬細菌(雷氏普洛維登斯菌(P. rettgeri))、及1種類之假單胞菌屬細菌(銅綠假單胞菌(P. aeruginosa))之鑑定係使用MALDI Biotyper 3.1軟體(Bruker Daltonics公司製造)進行。於得分值為2.0以上之情形時,評價為菌種水準之一致較高;於得分值為1.7以上~未達2.0之情形時,評價為菌屬水準之一致較高;於得分值未達1.7之情形時,評價為無法鑑定。
2-2 結果
關於上述8種類之葡萄球菌屬細菌之菌種水準(得分值≧2.0)之鑑定概率,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為213 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,全部菌種中為100%(金黃色葡萄球菌[16/16]、頭狀葡萄球菌[7/7]、山羊葡萄球菌[4/4]、表皮葡萄球菌[13/13]、溶血葡萄球菌[1/1]、人葡萄球菌[5/5]、里昂葡萄球菌[2/2]、及華納葡萄球菌[1/1]),相對於此,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為1337 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,華納葡萄球菌中為100%(1/1),但金黃色葡萄球菌中為37.5%(6/16)、頭狀葡萄球菌中為28.6%(2/7)、山羊葡萄球菌中為25%(1/4)、表皮葡萄球菌中為7.70%(1/13)、溶血葡萄球菌中為0%(0/1)、人葡萄球菌中為0%(0/5)、里昂葡萄球菌中為0%(0/2),大幅度地下降(參照表2)。
又,關於上述3種類之鏈球菌屬細菌之菌種水準之鑑定概率,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為213 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,全部菌種中為100%(壞乳鏈球菌[1/1]、和緩鏈球菌[1/1]、及肺炎鏈球菌[2/2]),相對於此,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為1337 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,全部菌種中為0%(壞乳鏈球菌[0/1]、和緩鏈球菌[0/1]、及肺炎鏈球菌[0/2])(參照表3)。
又,關於上述2種類之非病原性腸桿菌屬細菌之菌種水準之鑑定概率,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為213 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,全部菌種中為100%(鬆脆桿菌[1/1]及馬鈴薯桿菌[1/1]),相對於此,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為1337 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,全部菌種中為0%(鬆脆桿菌[0/1]及馬鈴薯桿菌[0/1])(參照表4)。
又,關於上述1種類之丙酸桿菌屬細菌(痤瘡丙酸桿菌)之菌種水準之鑑定概率,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為213 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,為100%(1/1),相對於此,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為1337 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,為0%(0/1)(參照表5)。
又,關於上述1種類之檸檬酸桿菌屬細菌(弗氏檸檬酸桿菌)之菌種水準之鑑定概率,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為213 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,為100%(2/2),相對於此,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為1337 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,為50%(1/2)(參照表6)。
又,關於上述3種類之腸內菌屬細菌之菌種水準之鑑定概率,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為213 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,全部菌種中為100%(陰溝腸桿菌[1/1]、糞腸球菌[2/2]、及屎腸球菌[1/1]),相對於此,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為1337 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形時,陰溝腸桿菌之菌種水準之鑑定概率為100%(1/1),糞腸球菌之菌種水準之鑑定概率為100%(2/2),但屎腸球菌之菌種水準之鑑定概率為0%(0/1)(參照表7)。再者,關於上述1種類之梭菌屬細菌(敗血芽胞梭菌)、上述1種類之棒狀桿菌屬細菌(紋帶棒狀桿菌)、上述1種類之克雷伯氏菌屬細菌(產酸克雷伯氏菌)、上述1種類之變形桿菌屬細菌(奇異變形桿菌)、上述1種類之普洛維登斯菌屬細菌(雷氏普洛維登斯菌)、及上述1種類之假單胞菌屬細菌(銅綠假單胞菌)之菌種水準之鑑定概率,於使用藉由將血液培養物以相對離心力為213 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形、與使用藉由將血液培養物以相對離心力為1337 xg進行1分鐘離心處理而獲得之上清液組分進行檢出之情形,均為100%,未發生變化(參照表8~13)。
以上之結果表示為了高精度地檢出血液培養物中所含有之微生物(尤其是葡萄球菌屬細菌或鏈球菌屬細菌等鏈或簇形成較明顯之細菌、非病原性腸桿菌屬細菌、丙酸桿菌屬細菌),於將血液培養物以1分鐘左右之時間進行離心處理時之相對離心力需要設為至少小於1337 xg,且接近於213 xg之值。
[表2-1]
葡萄球菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
金黃色葡萄球菌 | 1 | 2.141 | 2.039 |
2 | 2.072 | 1.759 | |
3 | 2.130 | 2.014 | |
4 | 2.082 | 1.517 | |
5 | 2.117 | 2.051 | |
6 | 2.031 | 1.770 | |
7 | 2.233 | 1.770 | |
8 | 2.393 | 1.840 | |
9 | 2.231 | 1.930 | |
10 | 2.218 | 2.067 | |
11 | 2.436 | 1.567 | |
12 | 2.218 | 2.196 | |
13 | 2.217 | 2.085 | |
14 | 2.085 | 1.619 | |
15 | 2.242 | 1.513 | |
16 | 2.049 | 1.988 | |
頭狀葡萄球菌 | 17 | 2.109 | 2.068 |
18 | 2.019 | 1.870 | |
19 | 2.186 | 2.046 | |
20 | 2.105 | 1.632 | |
21 | 2.190 | 1.820 | |
22 | 2.115 | 1.690 | |
23 | 2.202 | 1.820 | |
山羊葡萄球菌 | 24 | 2.031 | 1.680 |
25 | 2.277 | 1.720 | |
26 | 2.367 | 2.031 | |
27 | 2.334 | 1.960 |
[表2-2]
葡萄球菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
表皮葡萄球菌 | 28 | 2.037 | 1.933 |
29 | 2.054 | 1.880 | |
30 | 2.011 | 1.890 | |
31 | 2.046 | 1.480 | |
32 | 2.042 | 1.886 | |
33 | 2.192 | 2.130 | |
34 | 2.057 | 1.920 | |
35 | 2.008 | 1.880 | |
36 | 2.185 | 1.400 | |
37 | 2.091 | 1.026 | |
38 | 2.088 | 1.810 | |
39 | 2.139 | 1.898 | |
40 | 2.022 | 1.852 | |
溶血葡萄球菌 | 41 | 2.110 | 1.822 |
人葡萄球菌 | 42 | 2.073 | 1.300 |
43 | 2.183 | 1.300 | |
44 | 2.012 | 1.646 | |
45 | 2.052 | 1.570 | |
46 | 2.087 | 1.570 | |
里昂葡萄球菌 | 47 | 2.081 | 1.640 |
48 | 2.088 | 1.985 | |
華納葡萄球菌 | 49 | 2.133 | 2.012 |
[表3]
鏈球菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
壞乳鏈球菌 | 1 | 2.004 | 1.680 |
和緩鏈球菌 | 2 | 2.019 | 1.713 |
肺炎鏈球菌 | 3 | 2.044 | 1.556 |
4 | 2.110 | 1.620 |
[表4]
桿菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
鬆脆桿菌 | 1 | 2.341 | 1.880 |
馬鈴薯桿菌 | 2 | 2.468 | 1.910 |
[表5]
丙酸桿菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
痤瘡丙酸桿菌 | 1 | 2.059 | 1.528 |
[表6]
檸檬酸桿菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
弗氏檸檬酸桿菌 | 1 | 2.082 | 1.808 |
2 | 2.043 | 2.014 |
[表7]
腸內菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
陰溝腸桿菌 | 1 | 2.216 | 2.130 |
糞腸球菌 | 2 | 2.219 | 2.114 |
3 | 2.276 | 2.115 | |
屎腸球菌 | 4 | 2.220 | 1.890 |
[表8]
芽胞梭菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
敗血芽胞梭菌 | 1 | 2.251 | 2.137 |
[表9]
棒狀桿菌屬 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
紋帶棒狀桿菌 | 1 | 2.251 | 2.137 |
[表10]
克雷伯氏菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
產酸克雷伯氏菌 | 1 | 2.397 | 2.264 |
2 | 2.495 | 2.367 |
[表11]
變形桿菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
奇異變形桿菌 | 1 | 2.247 | 2.145 |
[表12]
普洛維登斯菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
雷氏普洛維登斯菌 | 1 | 2.388 | 2.094 |
[表13]
假單胞菌屬細菌 | 檢體 | 213 xg之相對離心力 | 1337 xg之相對離心力 |
銅綠假單胞菌 | 1 | 2.281 | 2.058 |
實施例3. 本案檢出法與先前法之比較
針對使用將血液培養物以213 xg左右之相對離心力進行1分鐘左右之離心處理而製備微生物組分之本案製備法之情形、與使用將血液培養物藉由溶血劑製備微生物組分之先前法之情形,研究其後藉由質量分析檢出之微生物水準是否存在差異。
3-1 方法
3-1-1 本案檢出法
本案製備法依照以下之順序[1]~[5]進行,其後依照以下之順序[6]及[7],進行本案檢出法。
[1]將3 mL之血液培養物轉移至15 mL錐形管,利用3 mL之PBS溶液稀釋後,使用桌上型離心機4000(轉子半徑:13.29,15 mL錐形管×16孔試管架,KUBOTA CORPORATION公司製造),於相對離心力之值為213 xg(以轉速換算為1200 rpm)、室溫且1分鐘之條件下,進行離心處理。
[2]將離心處理後之上清液組分添加至孔徑為0.45 μm之過濾膜(37 mm品質監測儀[日本PALL公司製造])上。
[3]將上清液組分藉由利用安裝於37 mm品質監測儀之注射器之手動操作進行過濾。
[4]將2 mL之蒸餾水添加至37 mm品質監測儀上,藉由利用安裝於37 mm品質監測儀之注射器之手動操作進行過濾洗淨。
[5]取出洗淨後之37 mm品質監測儀,浸漬於1 mL之蒸餾水中,使用旋渦混合器攪拌30秒鐘後,進行離心處理(20630 xg、3分鐘、室溫),去除上清液,獲得沈澱物(即,微生物組分)。
[6]將所獲得之沈澱物中之數μg載置於MALDI樣品靶(Bruker Daltonics公司製造)上,添加1 μL之70%甲酸、及1 μL之基質溶液(2,5-二羥基苯甲酸,80 mg/mL,30%乙腈,0.1%三氟乙酸),進行藉由乾燥處理之結晶化。
[7]向乾燥後之樣品添加CHCA基質試劑(Bruker Daltonics公司製造)1 μL,乾燥後導入至MALDI-TOFMS(Microflex[Bruker Daltonics公司製造]),進行雙重測定,算出其平均值。質譜之獲取係使用Flex Control軟體(Bruker Daltonics公司製造)進行,基於核糖體蛋白質之指紋(質譜圖案)之8種類之葡萄球菌屬細菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、山羊葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、及華納葡萄球菌)、5種類之鏈球菌屬細菌(無乳鏈球菌(S. agalactiae)、咽峽炎鏈球菌(S. anginosus)、壞乳鏈球菌、和緩鏈球菌、及犬血鏈球菌(S. sanguinis))、1種類之葡萄糖非醱酵菌(銅綠假單胞菌)、2種類之腸球菌屬細菌(屎腸球菌及糞腸球菌)、6種類之屬於腸內細菌科之細菌(大腸桿菌(E. coli)、產氣腸桿菌(E. aerogenes)、肺炎克雷伯氏桿菌(K. pneumoniae)、奇異變形桿菌、解鳥胺酸拉烏爾菌(R. ornithinolytica)、及弗氏檸檬酸桿菌)、2種類之桿菌屬細菌(臘狀桿菌(B. cereus)及枯草桿菌(B. Subtilis))、1種類之棒狀桿菌屬細菌(紋帶棒狀桿菌)、及1種類之梭菌屬細菌(產氣莢膜芽胞梭菌(C. perfringens))之鑑定係使用MALDI Biotyper 3.1軟體(Bruker Daltonics公司製造)進行。於得分值為2.0以上之情形時,評價為菌種水準之一致較高;於得分值為1.7以上~未達2.0之情形時,評價為菌屬水準之一致較高;於得分值未達1.7之情形時,評價為無法鑑定。
3-1-2 先前法
先前法係依照以下之順序[1]~[6]進行,其後依照以下之順序[7]及[8],進行細菌之檢出。
[1]將1 mL之血液培養物轉移至1.5 mL試管,與200 μL之Sepsityper裂解緩衝液(Bruker公司製造)混合後,使用桌上微型離心機Centric 3300角轉子(轉子半徑:8.20 cm,1.5/2 mL×24根,KUBOTA公司製造),以15000 rpm(20630 xg)進行2分鐘離心處理。
[2]去除離心處理後之上清液組分,向沈澱組分加入1 mL之Sepsityper洗滌緩衝液(Bruker公司製造),使其混合後,使用桌上微型離心機Centric 3300角轉子,以15000 rpm(20630 xg)進行1分鐘離心處理。
[3]去除上清液組分,向沈澱組分加入300 μL純化水,使其混合。
[4]加入900 μL之100%乙醇,使其混合後,使用桌上微型離心機Centric 3300角轉子,以15000 rpm(20630 xg)進行2分鐘離心處理。
[5]去除上清液組分後,使用桌上微型離心機Centric 3300角轉子,以15000 rpm(20630 xg)進行2分鐘離心處理。
[6]以使試管之蓋敞開之狀態使其乾燥5分鐘,獲得沈澱物(即,微生物組分)。
[7]向所獲得之沈澱物添加30 μL之70%甲酸及30 μL之乙腈,使其分散、混合後,使用桌上微型離心機Centric 3300角轉子,以15000 rpm(20630 xg)進行3分鐘離心處理。
[8]回收上清液,導入至MALDI-TOFMS(Microflex[Bruker Daltonics公司製造]),進行雙重測定,算出其平均值。質譜之獲取、或細菌種之鑑定係依照上述「3-1-1本案檢出法」之項目之順序[7]所記載之方法進行。
3-2 結果
關於上述8種類之葡萄球菌屬細菌之菌種水準(得分值≧2.0)之鑑定概率,於使用本案檢出法之情形時,為100%(24/24,金黃色葡萄球菌中為100%[10/10]、表皮葡萄球菌中為100%[6/6]、頭狀葡萄球菌中為100%[1/1]、山羊葡萄球菌中為100%[1/1]、人葡萄球菌中為100%[1/1]、溶血葡萄球菌中為100%[2/2]、里昂葡萄球菌中為100%[2/2]、及華納葡萄球菌中為100%[1/1]),相對於此,於使用先前法之情形時,為58.4%(14/24,金黃色葡萄球菌中為80%[8/10]、表皮葡萄球菌中為50%[3/6]、頭狀葡萄球菌中為100%[1/1]、山羊葡萄球菌中為0%[0/1]、人葡萄球菌中為100%[1/1]、溶血葡萄球菌中為0%[0/2]、及華納葡萄球菌中為100%[1/1])(參照表14)。再者,微生物組分中所含有之葡萄球菌屬細菌之菌體量為1×105
~1×108
個。
又,關於上述5種類之鏈球菌屬細菌之菌種水準之鑑定概率,於使用本案檢出法之情形時,為71.4%(5/7,無乳鏈球菌中為100%[1/1]、咽峽炎鏈球菌中為100%[1/1]、壞乳鏈球菌中為100%[2/2]、和緩鏈球菌中為50%[1/2]、及犬血鏈球菌中為0%[0/1]),相對於此,於使用先前法之情形時,為42.9%(3/7,無乳鏈球菌中為100%[1/1]、咽峽炎鏈球菌中為100%[1/1]、壞乳鏈球菌中為0%[0/2]、和緩鏈球菌中為50%[1/2]、及犬血鏈球菌中為0%[0/1])(參照表15)。又,關於上述5種類之鏈球菌屬細菌之菌屬水準(得分值≧1.7)之鑑定概率,於使用本案檢出法之情形時,為100%(7/7,無乳鏈球菌中為100%[1/1]、咽峽炎鏈球菌中為100%[1/1]、壞乳鏈球菌中為100%[2/2]、和緩鏈球菌中為100%[2/2]、及犬血鏈球菌中為100%[1/1]),相對於此,於使用先前法之情形時,為71.4%(5/7,無乳鏈球菌中為100%[1/1]、咽峽炎鏈球菌中為100%[1/1]、壞乳鏈球菌中為50%[1/2]、和緩鏈球菌中為100%[2/2]、及犬血鏈球菌中為0%[0/1])(參照表15)。
又,關於上述1種類之葡萄糖非醱酵菌(銅綠假單胞菌)之菌種水準之鑑定概率,於使用本案檢出法之情形時,為100%(1/1),相對於此,於使用先前法之情形時,為0%(0/1)(參照表16)。
又,關於上述2種類之腸球菌屬細菌之菌種水準之鑑定概率,於使用本案檢出法之情形時,為100%(3/3,屎腸球菌中為100%[2/2]、及糞腸球菌中為100%[1/1]),相對於此,於使用先前法之情形時,為66.7%(2/3,屎腸球菌中為100%[2/2]、及糞腸球菌中為0%[0/1])(參照表17)。
又,關於上述6種類之屬於腸內細菌科之細菌之菌種水準之鑑定概率,於使用本案檢出法之情形時,為100%(17/17,大腸桿菌中為100%[10/10]、產氣腸桿菌中為100%[1/1]、肺炎克雷伯氏桿菌中為100%[2/2]、奇異變形桿菌中為100%[1/1]、解鳥胺酸拉烏爾菌中為100%[1/1]、及弗氏檸檬酸桿菌中為100%[2/2]),相對於此,於使用先前法之情形時,為94.1%(16/17,17/17,大腸桿菌中為100%[10/10]、產氣腸桿菌中為100%[1/1]、肺炎克雷伯氏桿菌中為100%[2/2]、奇異變形桿菌中為100%[1/1]、解鳥胺酸拉烏爾菌中為100%[1/1]、及弗氏檸檬酸桿菌中為50%[1/2])(參照表18)。再者,關於上述2種類之桿菌屬細菌(臘狀桿菌及枯草桿菌)、上述1種類之棒狀桿菌屬細菌(紋帶棒狀桿菌)、及上述1種類之梭菌屬細菌(產氣莢膜芽胞梭菌)之菌種水準之鑑定概率,於使用本案檢出法之情形,與使用先前法之情形,均為100%,未發生變化(參照表19~21)。
綜合以上之結果,全細菌之鑑定率於使用先前法之情形時,限於菌屬水準為90%、菌種水準為72%,相對於此,於使用本案檢出法之情形時,菌屬水準為100%、菌種水準中為96%,較高。
又,作為血球成分之一之血紅蛋白於使用先前法之情形時被檢出,相對於此,於使用本案檢出法之情形時,未被檢出(即,為檢出感度以下)。
以上之結果表示若使用本案製備法,則與使用先前法之情形相比,可高效率地回收血液培養物中之微生物(尤其是葡萄球菌屬細菌或鏈球菌屬細菌等鏈或簇形成較明顯之細菌),其結果為,可高精度地檢出該微生物。又,表示本案製備法與先前法不同,可不使用溶血劑,而藉由1分鐘左右之相對較短時間之離心處理,將血球成分與微生物分離,且其後之微生物組分之製備亦可以相對較短之時間進行,因此簡便性及迅速性亦優異。
[表14]
葡萄球菌屬細菌 | 檢體數 | 本案檢出法之得分值 | 先前技術之檢出法之得分值 | ||||
≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ||
金黃色葡萄球菌 | 10 | 10 | 0 | 0 | 8 | 0 | 2 |
表皮葡萄球菌 | 6 | 6 | 0 | 0 | 3 | 2 | 1 |
頭狀葡萄球菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
山羊葡萄球菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
人葡萄球菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
溶血葡萄球菌 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 |
里昂葡萄球菌 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
華納葡萄球菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
合計 | 24 | 24 | 0 | 0 | 14 | 6 | 4 |
[表15]
鏈球菌屬細菌 | 檢體數 | 本案檢出法之得分值 | 先前技術之檢出法之得分值 | ||||
≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ||
無乳鏈球菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
咽峽炎鏈球菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
壞乳鏈球菌 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
和緩鏈球菌 | 2 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 |
犬血鏈球菌 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 |
合計 | 7 | 5 | 2 | 0 | 3 | 2 | 2 |
[表16]
葡萄糖非醱酵菌 | 檢體數 | 本案檢出法之得分值 | 先前技術之檢出法之得分值 | ||||
≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ||
銅綠假單胞菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
合計 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
[表17]
腸球菌屬細菌 | 患者數 | 本案檢出法之得分值 | 先前技術之檢出法之得分值 | ||||
≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ||
屎腸球菌 | 2 | 2 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 |
糞腸球菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
合計 | 3 | 3 | 0 | 0 | 2 | 1 | 0 |
[表18]
屬於腸內細菌科之細菌 | 檢體數 | 本案檢出法之得分值 | 先前技術之檢出法之得分值 | ||||
≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ||
大腸桿菌 | 10 | 10 | 0 | 0 | 10 | 0 | 0 |
產氣腸桿菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
肺炎克雷伯氏桿菌 | 2 | 2 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 |
奇異變形桿菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
解鳥胺酸拉烏爾菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
弗氏檸檬酸桿菌 | 2 | 2 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
合計 | 17 | 17 | 0 | 0 | 16 | 1 | 0 |
[表19]
桿菌屬細菌 | 檢體數 | 本案檢出法之得分值 | 先前技術之檢出法之得分值 | ||||
≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ||
臘狀桿菌 | 2 | 2 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 |
枯草桿菌 | 3 | 3 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 |
合計 | 5 | 5 | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 |
[表20]
棒狀桿菌屬細菌 | 檢體數 | 本案檢出法之得分值 | 先前技術之檢出法之得分值 | ||||
≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ||
紋帶棒狀桿菌 | 2 | 2 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 |
合計 | 2 | 2 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 |
[表21]
芽胞梭菌屬細菌 | 檢體數 | 本案檢出法之得分值 | 先前技術之檢出法之得分值 | ||||
≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ||
產氣莢膜芽胞梭菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
合計 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
實施例4. 使用本案檢出法之真菌之檢出
使用實施例3中所記載之本案檢出法,檢出血液培養物中所含有之3種類之真菌(白色念珠菌[Candida albicans]、光滑念珠菌[Candida glabrata]、熱帶念珠菌[Candida tropcalis]),結果菌種水準之鑑定概率為75%(白色念珠菌中為67%[2/3]、光滑念珠菌中為75%[3/4]、及熱帶念珠菌中為100%[1/1]),較高(參照表22)。
該結果表示藉由本案檢出法,對於比重或尺寸大於細菌之真菌,亦同樣地可高精度地檢出。
[表22]
[產業上之可利用性]
念球菌屬真菌 | 檢體數 | 本案檢出法之得分值 | ||
≧2.0 | 1.7~2.0 | <1.7 | ||
白色念珠菌 | 3 | 2 | 1 | 0 |
光滑念珠菌 | 4 | 3 | 1 | 0 |
熱帶念珠菌 | 1 | 1 | 0 | 0 |
合計 | 8 | 6 | 2 | 0 |
本發明係有助於受驗者之微生物(尤其是葡萄球菌屬細菌或鏈球菌屬細菌等鏈或簇形成較明顯之細菌或真菌)之傳染病之診斷、以及該傳染病之早期預防或早期治療者。
Claims (18)
- 一種血液試料中之微生物之檢出方法,其特徵在於包括以下之步驟(a)~(c): (a)將自受驗者採集之血液試料之培養物以170~800 xg之相對離心力進行40~80秒鐘之離心處理,分離為上清液組分與沈澱組分之步驟; (b)自步驟(a)中所獲得之上清液組分獲得微生物組分之步驟; (c)對上述微生物組分中是否含有微生物進行解析之步驟。
- 如請求項1之方法,其中於步驟(c)中,使用質量分析計進行解析。
- 如請求項2之方法,其中質量分析計係基質輔助雷射脫附離子化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF MS)。
- 一種含有微生物之試料之製備方法,其特徵在於包括以下之步驟(a)及(b): (a)將自受驗者採集之血液試料之培養物以170~800 xg之相對離心力進行40~80秒鐘之離心處理,分離為上清液組分與沈澱組分之步驟; (b)自步驟(a)中所獲得之上清液組分獲得微生物組分之步驟。
- 如請求項4之方法,其中試料係質量分析用試料。
- 如請求項1至5中任一項之方法,其中於步驟(b)中,藉由實施以下之步驟(p)及(q)而獲得微生物組分, (p)將步驟(a)中所獲得之上清液組分利用具有不使微生物通過之孔徑之過濾膜進行過濾處理之步驟; (q)回收上述過濾處理後之過濾膜所捕捉之殘渣而獲得微生物組分之步驟。
- 如請求項6之方法,其中於步驟(q)中,將過濾處理後之過濾膜浸漬於純水中,藉由離心分離回收殘渣而獲得微生物組分。
- 如請求項6或7之方法,其中於步驟(p)與步驟(q)之間包括將過濾處理後之過濾膜使用純水進行洗淨之步驟(r)。
- 如請求項1至8中任一項之方法,其中微生物係細菌或真菌。
- 一種血液試料中之微生物之檢出系統,其特徵在於具備以下之(A)~(C)之機構: (A)離心機構,其將自受驗者採集之血液試料之培養物於170~800 xg之相對離心力、40~80秒鐘之條件下分離為上清液組分與沈澱組分; (B)獲取機構,其基於上清液組分,獲取微生物組分; (C)分析機構,其對微生物組分中是否含有微生物進行解析。
- 如請求項10之系統,其中分析機構係質量分析機構。
- 如請求項11之系統,其中質量分析機構係基質輔助雷射脫附離子化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF MS)。
- 一種含有微生物之試料之製備系統,其特徵在於包括以下之(A)及(B)之機構: (A)離心機構,其將自受驗者採集之血液試料之培養物於170~800 xg之相對離心力、40~80秒鐘之條件下分離為上清液組分與沈澱組分; (B)獲取機構,其基於上清液組分,獲取微生物組分。
- 如請求項13之系統,其中試料係質量分析用試料。
- 如請求項10至14之系統,其中微生物組分之獲取機構係具有不使微生物通過之孔徑之過濾膜。
- 如請求項10至15中任一項之系統,其中微生物係細菌或真菌。
- 一種含有微生物之試料,其特徵在於:含有至少1×105 個葡萄球菌屬細菌,且實質上不含血紅蛋白。
- 如請求項17之試料,其係質量分析用試料。
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