TW202017596A - 高效率的抗tfpi抗體組成物 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容關於一種用於治療血友病的藥用高效率的抗TFPI抗體組成物，其包括一抗TFPI抗體，其中在一藥品物質中的HCP含量係少於10.0 ng/mg且在該藥品物質或該藥品產物中的LPA含量係少於1.0 ng/mg。根據本揭示內容，具有極低含量之HCP與LPA的高效率的抗TFPI抗體組成物可藉由提供能夠使抗TFPI抗體聚合物的生成最小化的分離/純化方法來提供，並且可有效地用於治療抗體誘導的血友病患者及用於預防凝血疾病。

Description

高效率的抗TFPI抗體組成物
發明領域 本揭示內容關於一種用於治療血友病的高效率的抗TFPI抗體組成物。
背景技術 抗TFPI抗體是抗組織因子途徑抑制劑(下文稱為抗TFPI)重組抗體，其為針對組織因子途徑抑制劑(下文稱為TFPI)具有高親和力的人類IgG4單株抗體。
抗TFPI抗體係用作血友病治療劑，其藉由抑制TFPI與活化因子X (FXa)之間的結合並在外在凝血途徑中誘導下游凝血因子FX的活化來凝結血液。
抗TFPI抗體是IgG4型抗體，當將其應用於一般的抗體製造方法時，則出現以下問題：在該方法期間生成的聚合物增加，導致產物的治療效果降低，並且由於抗體在低pH值的高度不穩定性，該方法的再現性很低。
特別地，當最終抗TFPI抗體濃縮物中存在適當或更高位準的聚合物時，該聚合物具有不利效應，因為其降低了抗TFPI抗體對抗原TFPI的結合親和力，導致抗體的效力降低。
因此，應當適當地保持方法條件，以防止在抗TFPI抗體製造方法中生成聚合物，並且應當選擇性地移除在抗體純化方法中不可避免地生成的聚合物。
於是，就開發高效率的抗TFPI抗體治療劑而言，必須需要開發用於純化高純度的抗TFPI抗體的方法。
於是，為了製造高效率的抗TFPI抗體組成物，發明人對用於吸附蛋白質雜質的親和力層析方法中的中和方法、使抗TFPI抗體聚合物的生成最小化以及在混合模式層析純化方法中選擇性地移除所生成的聚合物的方法、以及在第一超濾與滲濾方法、第二超濾與滲濾方法及最終濃縮方法中使抗TFPI抗體純化產率最大化的方法的條件進行了研究，並且已經發現可製造高效率的抗TFPI抗體，藉此完成本揭示內容。 先前技術文件 專利文件 (專利文件1) 韓國專利號10-1744899 (專利文件2) 韓國專利號10-1804988 非專利文件
(非專利文件1) 1. Defining your product profile and maintaining control over it, part 2: challenges of monitoring host cell protein impurities. BioProcess Int 2005; 3:52-4, 6, 8
(非專利文件2) 2. CHOPPI: A Web Tool for the Analysis of Immunogenicity Risk from Host Cell Proteins in CHO-Based Protein Production. Biotechnol Bioeng. 2014 Nov; 111(11): 2170-2182.
(非專利文件3) 3. Reducing risk, improving outcomes: bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin Immunol. 2009 May; 131(2):189-201
(非專利文件4) 4. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 2008 Apr 4; 4(4):e1000048.
技術課題 本揭示內容之目的是藉由以下提供一種具有極低含量之HCP與LPA的高效率的抗TFPI抗體組成物：(i)藉由在低pH親和力層析沖提方法之後引進中和方法來最小化聚合物生成，以增加親和力層析方法中的抗體穩定性；(ii)藉由選擇高效純化樹脂來決定聚合物分離條件，以在混合模式層析法中選擇性移除抗TFPI抗體中含有的聚合物，以及(iii)最大化抗TFPI抗體純化產率，同時在最終濃縮方法中使抗TFPI抗體聚合物的形成最小化，以製造高效率的抗TFPI抗體組成物。
本揭示內容的技術問題不限於以上提及的技術問題，本領域技術人員由以下說明可清楚地理解未提及的其他技術問題。 技術解決方案
為了達到上述目的，本揭示內容提供了一種用於治療血友病藥用高效率的抗TFPI抗體組成物，其包括一抗TFPI抗體，其中在一藥品物質中的HCP與LPA的總含量為10 ng/mg或更少。
HCP (宿主細胞蛋白)是在CHO細胞中發現的獨特蛋白質，在抗TFPI抗體製造中用作宿主，在細胞培養物中的HCP含量極高，約為500,000 ng/mg。另一方面，LPA (可浸出蛋白質A)是在純化方法中從樹脂解離的蛋白質A雜質，其含量取決於純化條件而在產物之間可能不同，但是一般為約10 ng/mg。於是，HCP雜質的含量係相對高於LPA雜質的含量，降低HCP與LPA的含量就抗TFPI抗體組成物有效而言是關鍵性的且非常重要。
假使將抗TFPI抗體組成物中的HCP含量保持在少於10.0 ng/mg，且LPA的含量保持在少於1.0 ng/mg，則當將該組成物作為治療性藥品施予人體時，其具有降低免疫性副作用的優異性質，於是可展現作為抗TFPI抗體組成物的優異效果。
在本揭示內容的一個具體例中，HCP與LPA的總含量可為5 ng/mg或更少。
假使將抗TFPI抗體組成物中的HCP與LPA的總含量保持在5 ng/mg或更少，則當將該組成物作為治療性藥品施予人體時，其具有降低免疫性副作用的優異性質，於是可展現作為抗TFPI抗體組成物的優異效果。
在本揭示內容的另一個具體例中，高效率的抗TFPI抗體組成物可經由澄清含有抗TFPI的培養物的方法、親和力層析方法、病毒滅活方法、第一超濾與滲濾方法、混合模式層析方法、奈米過濾方法以及最終濃縮方法來製造。
在本揭示內容的再另一個具體例中，在混合模式層析方法之後，可再包括第二超濾與滲濾方法。
在本揭示內容的又另一個具體例中，混合模式層析方法可藉由使用不同類型的管柱樹脂進行二或多個複數混合模式層析方法來移除98%或更多的抗TFPI抗體之聚合物。
假使移除98%或更多的聚合物，則當將該組成物作為治療性藥品施予人體時，其具有降低免疫性副作用並增加抗TFPI抗體對TFPI的結合親和力的優點，於是可展現作為抗TFPI抗體組成物的更佳活性。
在本發明的又另一個具體例中，親和力層析方法可包括以下步驟：中和已通過一親和力層析管柱的一沖提液，使其pH介在4.0至6.0的範圍內；使經中和的該沖提液在室溫(15至25°C)靜置8至16小時。
在本揭示內容的又另一個實施例中，濃縮方法可包括潤洗液循環/回收方法。
在本揭示內容的又另一個具體例中，藥品物質中的抗TFPI抗體聚合物的含量可少於1%。
在本揭示內容的又另一個具體例中，藥品物質可具有3.26 ng/mL或更小的EC50 值。
當藥品物質的EC50 值為3.26 ng/mL或更小時，該組成物具有增加抗TFPI抗體對TFPI的結合親和力以及改善抗TFPI抗體中和TFPI功能的能力的優點，於是可展現作為抗TFPI抗體組成物的優異效果。
在本揭示內容的又另一個具體例中，可製造高純度抗TFPI抗體組成物，其中該藥品物質中的HCP含量係少於10.0 ng/mg且該藥品物質中的LPA含量係少於1.0 ng/mg，而且同時地，最終產物之藥品物質中的每單位含量抗TFPI抗體的HCP含量相比於起始原料之澄清培養物中的每單位含量抗TFPI抗體的HCP含量低了至少10,000倍。
假使抗TFPI抗體組成物保持為高純度的抗TFPI抗體組成物，其中該藥品物質中的HCP含量係少於10.0 ng/mg且該藥品物質中的LPA含量係少於1.0 ng/mg，而且同時地，經受一純化方法之該藥品物質中的每單位抗TFPI抗體的HCP含量相比於一澄清培養物中的每單位抗TFPI抗體的HCP含量低了至少50,000倍，則當將該抗TFPI抗體組成物作為治療性藥品施予人體時，其具有降低免疫性副作用的優點，於是可展現作為抗TFPI抗體組成物的更佳活性。
在本揭示內容的又另一個具體例中，藥品物質中的HCP含量可少於10.0 ng/mg且藥品物質中的LPA含量可少於1.0 ng/mg，同時，該藥品物質的結合活性EC50 值可為3.26 ng/mL或更小。
假使HCP與LPA的總含量為5.0 ng/mg或更少，結合活性EC50 值為3.26 ng/mL或更小，則當將抗體組成物作為治療性藥品施予人體時，其具有降低免疫性副作用並增加抗TFPI抗體對TFPI的結合親和力的優點，於是可展現作為抗TFPI抗體組成物的更佳活性。 有利效應
根據本揭示內容，藉由最小化聚合物的生成、有效地移除所生成的聚合物並在濃縮方法中回收潤洗液提供了具有極低含量之HCP與LPA的高效率的抗TFPI抗體組成物，於是純化產率最大化。於是，高效率的抗TFPI抗體組成物可有效地用於治療抗體誘導的血友病患者及用於預防凝血疾病。
發明模式 本揭示內容的高效率的抗TFPI抗體組成物可藉由下述最佳化方法來製造。然而，本揭示內容不被解釋為限於本揭示內容的具體例，並且最佳條件可隨著方法條件的改變而改變。 1.培養物收穫和澄清
培養物收穫和澄清方法是意圖移除培養物中含有的細胞和細胞碎片。此方法在15至25°C進行。
首先，POD支架係配備POD過濾器就諸，然後將支架的手柄轉至防止液體洩漏到入口和出口以外的部分，然後以200至300 L的注射用水沖洗過濾器。
此後，使培養物澄清緩衝液通過，以洗滌安裝在該支架的POD過濾器和連接至該出口的無菌膠囊過濾器。打開培養物收穫閥以啟始培養物澄清，並在培養物澄清期間，將POD過濾器系統的壓力調整至不超過29 psi (2巴)。
如上所述完成培養物澄清後，以培養物澄清緩衝液進行後洗滌。後洗滌完成後，將收集有經澄清的培養物的容器稱重，並用於下一方法。下表1顯示培養物收穫與澄清方法的方法參數與QA/PA (品質/性能屬性)。 表1
Figure 108132804-A0304-0001
 2. 親和力層析
親和力層析方法是意圖從培養物吸附並回收抗TFPI抗體組成物。此方法使用Mabselect sure樹脂在15至25°C進行，但不限於此，也可使用常規的蛋白A樹脂。
首先，使用AKTA純化系統進行裝填評估以確認適用性。此外，將CIP溶液沖洗15分鐘，然後以管柱洗滌緩衝液進行滅菌。
用平衡緩衝液進行平衡後，將經澄清的培養物連接並吸附，並收集通過管柱的樣本作為未結合的溶液。吸附完成後，藉由以平衡緩衝液沖洗進行再次平衡。此時，將通過管柱的再次平衡溶液與未結合的溶液一起收集。重新平衡方法完成後，以洗滌緩衝液洗滌層析管柱，並收集通過層析管柱的洗滌液。
在沖提方法中，用親和力層析沖提緩衝液沖洗管柱，從達到0.8倍凝膠體積的時間點收集沖提液。藉由以pH調整溶液將pH調整至4.0至6.0來中和如上所述收集的沖提液，並將經中和的沖提液儲存在15至25 °C直至下一方法。待該方法完成後，在以管柱洗滌緩衝液沖洗樹脂的同時進行管柱洗滌。以CIP緩衝液進行層析管柱CIP達15分鐘，並以平衡緩衝液穩定pH。此後，藉由以凝膠儲存溶液沖洗來填充管柱，然後從系統分離並儲存。
親和力層析方法的方法參數與QA/PA顯示在下表2。 表2
Figure 108132804-A0304-0002
 3. 病毒滅活
病毒滅活方法是意圖在低pH滅活包膜病毒。
在此實驗中，病毒滅活方法在15至25°C進行。在乾淨的小室中，一邊攪拌沖提液一邊添加pH調整溶液(0.1 M HCl)，將親和力層析方法的中和沖提液的pH調整為3.0至3.8 (對照組pH 1)，其為參照pH，並在18至24°C進行45分鐘至105分鐘的病毒滅活。
病毒滅活完成後，以pH調整溶液將所得溶液再次調整到pH 4.5至5.5 (對照組pH 2)。此後，使用無菌膠囊過濾器將調整過pH的方法溶液過濾到濾液收集袋中。過濾完成後，使病毒滅活的溶液經受第一超濾與滲濾方法，其為下一方法。病毒滅活方法的方法參數與QA/PA顯示在下表3。 表3
Figure 108132804-A0304-0003
 4. 第一超濾與滲濾
第一超濾與滲濾方法是意圖使病毒滅活的溶液在第一混合模式層析方法的載入條件下經受超濾與滲濾。
實際方法係如下進行。
UF支架係配備有膜，並用扭矩扳手將其擰緊至預定壓力，使得壓下固定板。經組配的UF支架被命名為「UF系統」。藉由以第一超濾與滲濾CIP溶液循環使UF系統經受CIP，並用注射用水和第一超濾與滲濾緩衝液沖洗以穩定pH。
此後，藉由調整滲透物閥和截留物閥將TMP壓力調整至1.0±0.5巴。將病毒滅活的溶液濃縮至10±5 mg/mL，並用相當於5至15倍濃縮體積的平衡緩衝液(第一超濾與滲濾緩衝液)滲濾，然後檢查pH和電導率是否符合標準，並終止滲濾。
此後，將0.22 μm過濾器連接至截留物管線，並在過濾的同時進行後洗滌。然後，關閉滲透物閥，並將相當於約10至30 vol%的最終截留物質量的滲濾緩衝液注入進料管線，以對濃縮器和進料管線中的停滯液體加壓，進行第一次後洗滌且無排水。
將相當於20至40 vol%的最終截留物質量的滲濾緩衝液注入進料管線並循環1分鐘，然後在潤洗液完全排出的同時進行第二次後洗滌，藉此將截留物濃度調整至最終目標濃度(3至7 mg/mL)。此後，將過濾的第一UF截留物稱重，並附著記錄紙。如上所述進行的第一超濾與滲濾方法的方法參數與QA/PA顯示在下表4。 表4
Figure 108132804-A0304-0004
 5. 第一混合模式層析
第一混合模式層析方法是意圖移除雜質，例如HCP與LPA，並增加純度。
使用PPA混合模式樹脂在15至25°C進行第一混合模式層析純化方法。首先，使用AKTA純化系統進行裝填評估以確認適用性。此後，藉由以CIP溶液沖洗並使管柱洗滌緩衝液通過管柱來進行滅菌處理，然後藉由以平衡緩衝液沖洗來進行平衡方法。
經由上述方法完成平衡後，連接第一UF截留物，然後進行流通方法。對於第一混合模式層析純化，以流通模式方法載入樣本，並從載入時間點開始收集流通液。樣本載入完成後，注入平衡緩衝液，並進行再次平衡方法，以完全回收殘留在層析管柱中的流通液。
此後，藉由以管柱洗滌緩衝液沖洗來進行管柱洗滌，並且以CIP緩衝液進行管柱CIP。CIP完成後，藉由以平衡緩衝液沖洗來穩定管柱的pH。同時，以凝膠儲存溶液填充該管柱，然後從系統分離並分開儲存。
如上所述進行的第一混合模式層析方法的方法參數與QA/PA顯示在下表5。 表5
Figure 108132804-A0304-0005
 6. 第二混合模式層析
此方法是意圖移除聚合性抗體和剩餘的雜質，例如HCP。
第二混合模式層析純化方法是使用CHT陶瓷羥基磷灰石樹脂在15至25°C進行。首先，使用AKTA純化系統進行裝填評估以確認適用性。
此後，將第一混合模式層析法流通液用稀釋緩衝液以1：1的比例稀釋，並檢查其是否符合pH和電導率標準。滅菌和過濾後將其用作載入溶液。然後，藉由以CIP 1溶液沖洗並使管柱洗滌緩衝液通過管柱來進行滅菌，並藉由以平衡緩衝液沖洗來進行平衡。如上所述完成平衡後，連接第二混合模式層析載入溶液並進行吸附方法。吸附完成後，藉由以平衡緩衝液沖洗進行再次平衡方法。
再次平衡完成後，以沖提緩衝液沖洗管柱，並收集沖提液，直到UV峰降至0.1 AU以下。此時，當UV峰不符合標準時，另外載入相當於凝膠體積兩倍的沖提緩衝液，以使UV值符合標準。
此後，藉由以管柱洗滌緩衝液沖洗來進行管柱洗滌。在完成管柱洗滌方法後，藉由以CIP 2-> CIP 3-> CIP 2-> CIP 1的順序載入溶液來進行管柱CIP。此外，藉由以凝膠儲存溶液沖洗來填充管柱，然後從系統分離並儲存。將收集的沖提液稱重，然後過濾並儲存在15至25°C，直至用於下一方法。第二混合模式層析方法的方法參數和操作條件顯示於下表6。 表6
Figure 108132804-A0304-0006
 7. 第二超濾與滲濾
第二超濾與滲濾方法是意圖將第二MM沖提液濃縮至目標濃度，然後以調配物緩衝液滲濾沖提液。
藉由以第二超濾與滲濾CIP溶液循環使UF系統經受CIP，並以注射用水和第二超濾與滲濾緩衝液沖洗以穩定pH。此外，藉由調整滲透物閥和截留物閥將TMP壓力調整至1.0±0.5巴。
此後，將第二混合模式層析沖提液濃縮至20±5 mg/mL，並以相當於5至15倍濃縮體積的平衡緩衝液(第二超濾與滲濾緩衝液)滲濾。測量其pH和電導率，當該等達到標準時，終止滲濾。
此外，關閉滲透物閥，將相當於10至30 vol%的最終截留物質量的第二超濾與滲濾緩衝液注入進料管線，並在轉送濃縮器與進料管中的停滯液體的同時進行第一次後洗滌且無排放液體。
同時，將相當於10至30 vol%的最終截留物質量的第二超濾與滲濾緩衝液注入進料管線並循環1分鐘，然後進行第二次後洗滌，同時完全排出潤洗液，藉此將截留物濃度調整至目標濃度(10至20 mg/mL)。
此後，將A1HC (深度過濾器、預過濾器)和Durapore 0.1 μm過濾器的過濾器組合連接至第二超濾與滲濾截留物收集容器，並進行截留物的過濾。過濾完成後，用3至7L的滲濾緩衝液進行後洗滌，藉此將第二超濾與滲濾截留物的最終濃度調整至5至15 mg/mL。
將如上所述過濾的第二超濾與滲濾截留物稱重，並儲存在15至25°C，直至用於下一方法。第二超濾與滲濾方法的方法參數與QA/PA顯示在下表7。 表7
Figure 108132804-A0304-0007
從上述分析結果可看出，經由第二超濾與滲濾方法獲得的抗TFPI抗體組成物中的HCP含量為5.3 ng/mg，抗TFPI抗體組成物中的LPA含量為0.4 ng/mg，HCP與LPA的總含量為5.7 ng/mg。如上所述，抗體組成物中的HCP與LPA含量極低，於是可看出該抗體組成物作為抗TFPI抗體組成物可展現優異的效果。 8. 奈米過濾
奈米過濾方法是意圖使用奈米過濾器移除病毒。
使用奈米過濾器(Viresolve Pro)在15至25°C進行奈米過濾方法。首先，奈米過濾器以注射用水沖洗，然後以奈米過濾緩衝液洗滌。此後，將壓力調節器的壓力調整至2.0±0.5巴，並打開壓力閥以啟始奈米過濾。
奈米過濾完成後，用1至3 L的奈米過濾緩衝液進行後洗滌，然後將奈米濾液稱重。奈米過濾方法的方法參數與QA/PA顯示在下表8。 表8
Figure 108132804-A0304-0008
從以上分析結果可看出，經由奈米過濾方法獲得的抗TFPI抗體組成物中的HCP含量為4.5 ng/mg，抗體組成物中的LPA含量為0.4 ng/mg， HCP與LPA的總含量為4.9 ng/mg。如上所述，HCP與LPA的含量極低，於是可看出，該抗體組成物作為抗TFPI抗體組成物可展現出非常優異的效果。 9. 最終濃縮
最終濃縮方法是意圖將奈米濾液濃縮至最終目標濃度。首先，打開滲透物閥，用最終濃縮CIP溶液循環進行CIP，並藉由以注射用水和最終濃縮緩衝液沖洗來穩定pH。
此後，藉由調整滲透物閥和截留物閥將TMP壓力調整至1.0±0.5巴，並將奈米濾液濃縮至36±10 mg/mL。濃縮完成後，進行額外濃縮，直至最終質量的70%，然後注入相當於縮減30%的10 vol%的最終濃度緩衝液，並在轉移填充至濃縮物儲存管線中的液體的同時進行第一次後洗滌且無液體洩漏。此外，注入對應於剩餘20 vol%的最終濃度緩衝液並循環1分鐘，並且在完全排出潤洗液的同時進行第二次後洗滌。獲得最終濃縮物並測量其質量。最終濃縮方法的方法參數與QA/PA顯示在下表9。 表9
Figure 108132804-A0304-0009
從以上分析結果可看出，藉由最終濃縮方法獲得的抗TFPI抗體組成物中的HCP含量為3.9 ng/mg，抗體組成物中的LPA含量為0.5 ng/mg，HCP與LPA的總含量為4.4 ng/mg。如上所述，抗體組成物中的HCP與LPA含量極低，於是可看出，該抗體組成物作為抗TFPI抗體組成物可展現優異的效果。 10. 藥品物質調配
藥品物質調配方法是意圖藉由添加賦形劑Polysorbate 80來提高藥品物質的穩定性，並以目標濃度調配藥品物質。
首先，將賦形劑Polysorbate 80添加至最終截留物並攪拌以充分混合，將攪拌的溶液經由0.2 μm的過濾器過濾，藉此調配藥品物質。 表10
Figure 108132804-A0304-0010
從以上分析結果可看出，經由藥品物質調配方法獲得的抗TFPI抗體組成物中的HCP含量為4.1 ng/mg，抗體組成物中的LPA含量為0.4 ng/mg，抗體組成物中的HCP與LPA的總含量為4.5 ng/mg。如上所述，抗體組成物中的HCP與LPA含量極低，於是可看出，該抗體組成物作為抗TFPI抗體組成物可展現優異的效果。 11. SDS-PAGE分析
為了確認所製造的藥品物質中的抗體並確認雜質移除模式，在還原和非還原條件下進行了SDS-PAGE分析。
在此方法期間用以純化抗TFPI抗體組成物的大部分樣本中，未還原條件下的150 kDa (其為抗體的固有尺寸)條帶、還原條件下的50 kDa重鏈的條帶和25 kDa輕鏈的條帶(圖2、3和4)被視為主要條帶。結果，既沒有出現非特異性條帶，也沒有雜質污染。此外，在該方法期間移除了雜質，或者在未結合的溶液中，未偵測到如同主要條帶的抗體條帶。
因此，可確認本揭示內容的純化方法是用於從原料培養物有效地製造沒有被雜質、微生物和病毒污染的高效率的抗TFPI抗體組成物的最佳方法。
在下文中，將說明整理藉由進行針對本揭示內容的效果的對照實驗而獲得的結果的結果。 A. 最小化聚合物生成的方法最佳化實驗
本揭示內容的特徵在於經由引進中和親和力層析沖提液的方法來使聚合物的生成最小化。
為了最小化聚合物的生成，首先藉由使親和力層析沖提方法的pH維持在3.2至3.6來沖提抗TFPI抗體組成物。接下來，在低pH進行病毒滅活1小時至1小時30分鐘，以確保病毒穩定性，然後在增加之pH下進行下一方法。為了確認經由引進中和方法是否可使聚合物的生成最小化，如下進行三個對照實驗。 >實驗實施例1>
就一般抗體而言，在低pH親和力層析沖提方法後立即進行病毒滅活，在此情況下，得自沖提方法的沖提液純度在病毒滅活後從96.0%降低至85%，其聚合物含量 增加了11%。 >實驗實施例2>
在低pH親和力層析沖提方法之後，將沖提液在室溫下靜置8至16小時而無調整pH，然後經受病毒滅活方法。在此情況下，沖提後即刻的96%純度在靜置8至16小時後之病毒滅活後降低至83%，聚合物含量增加了13%。 >實驗實施例3>
在低pH親和力層析沖提方法後，將沖提液中和至pH為4.8至5.2，在室溫下靜置8至16小時，然後再次滴定至低pH並經受病毒滅活方法。在此情況下，沖提後即刻的96%純度在病毒滅活後降低至91%，聚合物含量增加了5%。
考慮該些實驗實施例，可證實藉由緊接在親和力層析沖提方法之後的pH中和方法來穩定該物質且隨後進行病毒滅活方法，抑制了聚合物的形成約兩倍。
上述實驗實施例1至3的結果整理在下表11。 表11
Figure 108132804-A0304-0011
 13. 檢查聚合物形成與抗TFPI抗體效果之間的相關性
為了檢查聚合物形成與抗TFPI抗體效果之間的相關性，藉由增加聚合物形成來構建分別具有100%、90%和60%單體含量的抗TFPI抗體，並測試該等抗體的結合活性效價。
由100%單體構成的抗TFPI抗體的結合活性效價測試中的EC50 值係測定為1.91 ng/mL。由於聚合物含量增加10%而具有90%單體純度的抗TFPI抗體的結合活性效價測試中的EC50 值係測定為2.53 ng/mL。由於聚合物含量增加40%而具有60%單體純度的抗TFPI抗體的結合活性效價測試中的EC50 值係測定為3.26 ng/mL。可證實，隨著聚合物含量的增加，抗體的結合活性下降了，相較於具有100%單體純度的對照組，具有60%單體純度的抗TFPI抗體的結合活性效價下降了40%或更多。結果整理在下表12。 表12
Figure 108132804-A0304-0012
 B. 經由CHT樹脂移除聚合物
抗TFPI抗體是IgG4型抗體，比IgG1型抗體具有更高的聚合物生成率。隨著聚合物的生成，抗TFPI抗體對TFPI的結合親和力下降了，於是抗體的效果下降了。因此，應合宜地維持方法條件，以防止在製造方法中生成聚合物。但是，只有當藉由選擇性地移除中間方法所製造的聚合物可生成高純度抗體樣本時，才能開發出高效率的抗體治療劑。
為了在該方法期間選擇性移除抗體中含有的聚合物，發明人選擇了在篩選後的混合模式樹脂(其為最有效的純化樹脂CHT陶瓷羥基磷灰石)並建立了最佳的聚合物分離條件。結果，證實了經由使用CHT樹脂的純化方法移除了12-23%聚合物，於是獲得了近乎100%的純度。 表13
Figure 108132804-A0304-0013
 C. 濃縮和緩衝液循環/回收方法
超濾與滲濾方法的回收率受到壓力條件、蛋白質性質和蛋白質濃度的影響。
因此，證實了在相同條件下根據蛋白質回收方法可提高回收率。即，證實了藉由在循環潤洗液的同時回收甚至吸附在膜上的蛋白質，可提高產率。
圖1以圖解顯示用於製造本揭示內容的高效率的抗TFPI抗體組成物的整體方法的流程圖。
圖2A顯示了在非還原條件(左)對150 kDa (其為抗TFPI抗體組成物的固有尺寸)及在還原條件(右)對50 kDa重鏈和25 kDa輕鏈進行SDS-PAGE分析的結果，以在介於培養物收穫和澄清方法到病毒滅活方法之範圍的方法中確認物質中的抗體，並確認雜質移除模式。所示的SDS-PAGE凝膠的樣本泳道如下：泳道1和9 - 標記；泳道2 –澄清培養物；泳道3 – 親和力層析未結合溶液(ACU)；泳道4 – 親和力層析洗滌液(ACW)；泳道5 – 親和力層析管柱洗滌液(ACCW)；泳道6 – 親和力層析沖提液(ACE)；泳道7 – 親和力層析中和沖提液(ACEN)；泳道8 – 病毒滅活溶液(VI)。
圖2B顯示了在非還原條件(左)對150 kDa (其為抗TFPI抗體組成物的固有尺寸)及在還原條件(右)對50 kDa重鏈和25 kDa輕鏈進行SDS-PAGE分析的結果，以確認在介於第一超濾與滲濾方法到第二混合模式層析方法之範圍的方法中的物質中的抗體，並確認雜質移除模式。所示的SDS-PAGE凝膠的樣本泳道如下：泳道1和10 - 標記；泳道2 – 第一UF截留物；泳道3 – 第一UF滲透物；泳道4 – 第一混合模式流經溶液(1st MM FT)；泳道5 – 第一混合模式管柱洗滌液(1st MM CW)；泳道6 – 第二混合模式載入溶液(2nd MM載入物)；泳道7 – 第二混合模式未結合溶液(2nd MM未結合)；泳道8 – 第二混合模式沖提液(2nd MM沖提液)；泳道9 – 第二混合模式層析管柱洗滌液(2nd MM CW)。
圖2C顯示了在非還原條件(左)對150 kDa (其為抗TFPI抗體組成物的固有尺寸)及在還原條件(右)對50 kDa重鏈和25 kDa輕鏈進行SDS-PAGE分析的結果，以確認在介於第二次超濾與滲濾方法到藥品物質調配方法之範圍的方法中的物質中的抗體，並確認雜質移除模式。所示的SDS-PAGE凝膠的樣本泳道如下：泳道1和8 - 標記；泳道2 – 第二UF截留物(2nd UF截留物)；泳道3 – 第二UF滲透物(2nd UF滲透物)；泳道4 – 奈米濾液；泳道5 – 最終截留物；泳道6 – 最終濃縮滲透物；泳道7 – 藥品物質。
(無)

Claims (10)

  1. 一種用於治療血友病的藥用高效率的抗TFPI抗體組成物，其包含一抗TFPI抗體，其中在一藥品物質或藥品產物中的HCP含量係少於10.0 ng/mg且在該藥品物質或該藥品產物中的LPA含量係少於1.0 ng/mg。
  2. 如請求項1的高效率的抗TFPI抗體組成物，其中該HCP與LPA的總含量為5 ng/mg或更少。
  3. 如請求項1或2的高效率的抗TFPI抗體組成物，其中該高效率的抗TFPI抗體組成物係經由以下製造： 一澄清含有該抗TFPI抗體的培養物的方法； 一親和力層析方法； 一病毒滅活方法； 一超濾與滲濾方法； 一混合模式層析方法； 一奈米過濾方法；以及 一最終濃縮方法。
  4. 如請求項3的高效率的抗TFPI抗體組成物，其中該混合模式層析方法包含藉由使用不同類型的管柱樹脂進行二或多個複數混合模式層析方法來移除98%或更多的該抗TFPI抗體之聚合物。
  5. 如請求項3的高效率的抗TFPI抗體組成物，其中該親和力層析方法包含以下步驟： 中和已通過一親和力層析管柱的一沖提液，使其pH介在4.0至6.0的範圍內；以及 使經中和的該沖提液在室溫(15至25°C)靜置8至16小時。
  6. 如請求項3的高效率的抗TFPI抗體組成物，其中該濃縮方法包含潤洗液循環/回收方法。
  7. 如請求項1的高效率的抗TFPI抗體組成物，其中該藥品物質中的一抗TFPI抗體聚合物的含量少於5%。
  8. 如請求項1的高效率的抗TFPI抗體組成物，其中該藥品物質具有3.26 ng/mL或更小的EC50 值。
  9. 如請求項1的高效率的抗TFPI抗體組成物，其中該組成物具有高純度，俾使經受一純化方法之該藥品物質中的每單位含量之抗TFPI抗體的HCP含量相比於一澄清培養物中的每單位含量之抗TFPI抗體的HCP含量低了至少50,000倍。
  10. 如請求項1的高效率的抗TFPI抗體組成物，其中該藥品物質的相對效價之值相較於100%單體的相對效價之值為85%或更高。
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