TW202016311A - 用於甲殼類過敏治療之核酸 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種期待對甲殼類過敏治療有用之核酸。
本發明提供一種核酸,其係依序包含編碼訊息肽之鹼基序列、編碼LAMP之胞器內穩定區之鹼基序列、編碼包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列、編碼跨膜區之鹼基序列、以及編碼LAMP之內體/溶酶體靶區之鹼基序列者,且包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列。
Description
本發明係一種期待作為醫藥組合物之有效成分有用之核酸,例如係關於一種期待對甲殼類過敏治療有用之核酸。
食物過敏係指「由食物所引起之經由抗原特異性之免疫學機制而引起對生物體不利之症狀的現象」,其特徵在於因攝取之食物而具有蕁麻疹、濕疹、下痢、咳嗽等症狀。甲殼類過敏係成人中之一種主要之食物過敏,作為引起甲殼類過敏之過敏原,已知有以分類為原肌凝蛋白(Tropomyosin)之Lit v 1及Pen m 1、分類為精胺酸激酶(Arginine kinase)之Lit v 2及Pen m 2、分類為肌凝蛋白輕鏈(Myosin light chain)之Lit v 3及Pen m 3、分類為肌漿鈣結合蛋白(Sarcoplasmic calcium binding protein)之Lit v 4及Pen m 4等作為代表之多種多樣之過敏原(非專利文獻1至4)。
目前,不存在甲殼類過敏之根本之治療方法,藉由去除食物而避免過敏原攝取係用於預防重度過敏等甲殼類過敏症狀之唯一之方法。雖亦進行過敏原特異性免疫療法(ASIT,Allergen specific immunotherapy)、DNA質體或肽基免疫療法(PIT,Peptide-based immunotherapy)等研究,但尚未開發出臨床上有效之治療方法,從而謀求一種有效之治療方法(非專利文獻4,European Annals of Allergy and Clinical Immunology, 2017, Vol.49, p.252-256)。
過敏疾病係因如下情況而引起:1)被吸收至體內之過敏原被抗原呈現細胞吞噬而於初始T細胞中進行抗原呈現;2)初始T細胞分化為Th2細胞;3)自Th2細胞等免疫細胞產生IL-4(interleukin-4,介白素-4)等細胞激素;4)藉由IL-4,B細胞產生IgE(immunoglobulin E,免疫球蛋白E);5)與過敏原結合之IgE與肥大細胞結合。已知於過敏疾病患者中,與產生IFN-γ(Interferon-γ,干擾素-γ)等之Th(T-helper cell,輔助T細胞)1細胞所參與之Th1型免疫、與產生IL-4等之Th2細胞所參與之Th2型免疫之拮抗係Th2型優勢而發生Th2型炎症免疫反應(米德爾頓變態反應原理與實踐第七版(Middleton's Allergy Seventh edition Principles & Practice),2009)。如此,IFN-γ可用於Th1型免疫之指標,IL-4可用於Th2型免疫之指標。又,於小鼠中,IFN-γ引起活化之B細胞中之向IgG2a同型之優先之類型轉換,另一方面,抑制對其他所有同型之應答。即,IgG2a抗體產生亦可用於Th1型免疫之指標。例如已知於IL-4缺損小鼠中促進IgG2a抗體產生,於IFN-γ缺損小鼠中抑制IgG2a抗體產生(Arthritis Res., 2002, Vol.4, p.54-58)。又,亦存在自B細胞產生之抗體參與過敏原免疫療法之作用機制之報告。例如已知於人類中,IgG係與結合於過敏原之IgE拮抗,而阻礙過敏原-IgE複合體形成,阻礙自肥大細胞之組胺釋放(Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2017, Vol.140, p.1485-1498)。
作為核酸疫苗之一種技術,研究利用溶酶體相關膜蛋白質(lysosome-associated membrane protein;LAMP)之用於過敏治療之核酸疫苗。而且,構建包含編碼包含作為LAMP家族之成員之LAMP-1、以及作為日本柳杉(Cryptomeria japonica)之過敏原之Cry J1及/或Cry J2之嵌合體蛋白之核酸的質體(專利文獻1、非專利文獻5)。而且,報告有此種質體不會引起成為重度過敏之原因之游離過敏原向全身之釋出,誘導Th1型免疫反應。又,報告有包含編碼包含LAMP-1以及作為花生之過敏原之Ara H1、Ara H2及Ara H3之嵌合體蛋白之核酸的質體於小鼠模型中緩和IgE之產生(專利文獻2)。然而,未報告有用於甲殼類過敏治療之核酸疫苗。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開編號2013/187906號
[專利文獻2]國際公開編號2015/200357號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]「國際過敏學雜誌(Allergo journal International)」,(德國),2016;25(7):210-218
[非專利文獻2]「過敏與臨床免疫學雜誌(The Journal of Allergy and Clinical Immunology)」,(美國),2009;124(1):114-120
[非專利文獻3]「過敏與臨床免疫學雜誌(The Journal of Allergy and Clinical Immunology)」,(美國),2008;122(4):795-802
[非專利文獻4]「過敏與免疫學臨床綜述(Clinical Reviews in Allergy and Immunology)」,(美國),2015;49(2):203-216
[非專利文獻5]「免疫學研究雜誌(Journal of Immunology Research)」,(埃及),2016;Article ID 4857869
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於提供一種期待對甲殼類過敏治療有用之核酸。
[解決問題之技術手段]
本發明者等人係於用於甲殼類過敏治療之核酸之製作中反覆進行相當之創意研究,結果製作出LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體(實施例1),確認由該質體表現嵌合體蛋白(實施例2),發現於投予該質體之小鼠中誘導Th1型免疫反應(實施例3、實施例4)。該等之結果為提供一種期待對甲殼類過敏治療有用之核酸,從而完成本發明。進而,發現於投予該質體之小鼠中,由蝦抗原所引起之過敏症狀得到緩和(實施例5)。
即,本發明係關於以下之[1]~[17]。
[1]
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼訊息肽之鹼基序列;
編碼LAMP之胞器內穩定區之鹼基序列;
編碼包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列;
編碼跨膜區之鹼基序列;以及
編碼LAMP之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
[2]
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼訊息肽之鹼基序列;
編碼LAMP之胞器內穩定區之鹼基序列;
編碼依序包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列;
編碼跨膜區之鹼基序列;以及
編碼LAMP之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
[3]
如[1]或[2]記載之核酸,其中訊息肽為LAMP之訊息肽。
[4]
如[1]至[3]中任一項記載之核酸,其中跨膜區為LAMP之跨膜區。
[5]
如[1]至[4]中任一項記載之核酸,其中訊息肽包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列,胞器內穩定區包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列,過敏原區係含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3的過敏原區,跨膜區包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列,內體/溶酶體靶區包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列。
[6]
一種核酸,其係包含編碼包含與序列編號2所表示之胺基酸序列之一致性為90%以上之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該核酸具有誘導對選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原之Th1型免疫的作用。
[7]
a)一種核酸,其包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列;或
b)一種核酸,其係包含編碼包含於序列編號2所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~10個胺基酸之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該核酸具有誘導對選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原之Th1型免疫的作用。
[8]
一種核酸,其包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列。
[9]
一種表現載體,其包含如[1]至[8]中任一項記載之核酸。
[10]
一種表現載體,其包含如[8]記載之核酸。
[11]
一種宿主細胞,其係利用如[1]至[8]中任一項記載之核酸轉形而成。
[12]
一種生產核酸之方法,其包括培養利用如[1]至[8]中任一項記載之核酸轉形而成之宿主細胞之步驟。
[13]
一種醫藥組合物,其包含如[10]記載之表現載體及藥學上所容許之賦形劑。
[14]
如[13]記載之醫藥組合物,其係甲殼類過敏之預防或治療用醫藥組合物。
[15]
一種預防或治療甲殼類過敏之方法,其包括投予如[10]記載之表現載體之預防有效量或治療有效量之步驟。
[16]
如[10]記載之表現載體,其係用於甲殼類過敏之預防或治療。
[17]
一種如[10]記載之表現載體之用途,其係用於甲殼類過敏之預防或治療用醫藥組合物之製造中。
[發明之效果]
本發明之核酸可用於甲殼類過敏之預防或治療。
以下,對本發明進行詳述。
<本發明之核酸>
於本發明之核酸中,包含具有以下之特徵之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼訊息肽之鹼基序列;
編碼LAMP之胞器內穩定區之鹼基序列;
編碼包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列;
編碼跨膜區之鹼基序列;以及
編碼LAMP之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
於本發明中,核酸係包含核苷酸進行聚合所形成之任意長度之鹼基序列的高分子。核苷酸可包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、及/或該等之相關物。本發明之核酸例如為DNA、RNA、或修飾該等而成之核酸。於1個實施形態中,本發明之核酸為DNA。
於1個實施形態中,本發明之核酸係組入至表現載體之核酸。又,於1個實施形態中,本發明之核酸係組入至質體載體中之核酸。
於本說明書中,「嵌合體蛋白」意指藉由使用基因重組技術使2個以上之基因融合而成之鹼基序列來進行編碼之蛋白質。本發明之核酸包含編碼嵌合體蛋白(以下,稱為「與本發明相關之嵌合體蛋白)之鹼基序列,該嵌合體蛋白依序包含訊息肽、LAMP之胞器內穩定區、包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區、跨膜區以及LAMP之內體/溶酶體靶區。
LAMP係業者所周知之蛋白質(J Biol Chem., 1991, Vol.266, p.21327-21330)。於本說明書中,LAMP並無特別限定,包含LAMP-1、LAMP-2、CD63/LAMP-3、DC-LAMP及LIMP II、以及該等之同源物、直系同源物、旁系同源物、變異體及修飾體。於本發明之1個實施形態中,LAMP為LAMP-1。本發明中之LAMP之來源動物並無特別限定,於1個實施形態中,LAMP為人類LAMP。於1個實施形態中,人類LAMP為人類LAMP-1。作為人類LAMP-1之胺基酸序列,例如可列舉於序列編號2之胺基酸編號1至380所表示之胺基酸序列之C末端結合有序列編號2之胺基酸編號1047至1082所表示之胺基酸序列的胺基酸序列。
訊息肽之一般結構係業者所周知(Annu Rev Biochem., 2003, Vol.72, p.395-447)。訊息肽具有指示蛋白質之傳輸及定位之功能。作為本發明中所使用之訊息肽,只要具有指示蛋白質之傳輸及定位之功能,則可選擇任意適當之訊息肽。於1個實施形態中,本發明中所使用之訊息肽係LAMP之訊息肽。於1個實施形態中,本發明中所使用之LAMP之訊息肽係LAMP-1之訊息肽。
於1個實施形態中,本發明中所使用之訊息肽包含以下之(a)或(b)之胺基酸序列。
(a)與序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列之一致性為90%以上的胺基酸序列;或者
(b)序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列、或於序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~3個胺基酸之胺基酸序列。
本說明書中之「一致性」意指使用EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res., 2015, Vol.43, p.W580-W584; https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/),藉由預設準備之參數所獲得之一致性(Identity)之值。上述參數如下所述。
空位開放罰分(Gap Open Penalty)=10
空位延伸罰分(Gap Extend Penalty)=0.5
矩陣(Matrix)=EBLOSUM62
末端空位罰分(End Gap Penalty)=錯誤(false)
於1個實施形態中,本發明中所使用之訊息肽包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列。
LAMP之胞器內穩定區之序列係業者所周知(國際公開編號2013/187906號)。LAMP之胞器內穩定區具有自蛋白質分解酵素、低pH值、以及其他使蛋白質不穩定化之物質及條件保護過敏原區之功能。作為本發明中所使用之LAMP之胞器內穩定區,只要具有自蛋白質分解酵素、低pH值、以及其他使蛋白質不穩定化之物質及條件保護過敏原區之功能,則可選擇任意之適當之LAMP之胞器內穩定區。於1個實施形態中,本發明中所使用之LAMP之胞器內穩定區係LAMP-1之胞器內穩定區。
於1個實施形態中,本發明中所使用之LAMP之胞器內穩定區包含以下之(a)或(b)之胺基酸序列:
(a)與序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列之一致性為90%以上的胺基酸序列;或者
(b)序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列、或於序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~10個胺基酸之胺基酸序列。
於1個實施形態中,本發明中所使用之LAMP之胞器內穩定區包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列。
本發明中所使用之過敏原區包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3作為過敏原。Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3係於甲殼類(Crustaceans)廣泛觀察到之過敏原(非專利文獻1)。本發明中所使用之Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3只要具有抗原性,則亦可為該等之變異體。任意之蛋白質具有抗原性例如可藉由觀察投予至動物而引起針對該蛋白質之抗體產生或T細胞應答進行確認(Bioanalysis., 2012, Vol.4, p.397-406)。
於1個實施形態中,Lit v 1包含以下之(a)或(b)之胺基酸序列:
(a)與序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之一致性為90%以上的胺基酸序列;或者
(b)序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列、或於序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~10個胺基酸之胺基酸序列。
於1個實施形態中,Lit v 1包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列。
於1個實施形態中,Lit v 4包含以下之(a)或(b)之胺基酸序列:
(a)與序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之一致性為90%以上的胺基酸序列;或者
(b)序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列、或於序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~10個胺基酸之胺基酸序列。
於1個實施形態中,Lit v 4包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列。
於1個實施形態中,Lit v 3包含以下之(a)或(b)之胺基酸序列:
(a)與序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之一致性為90%以上的胺基酸序列;或者
(b)序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列、或序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~10個胺基酸之胺基酸序列。
於1個實施形態中,Lit v 3包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列。
於1個實施形態中,本發明中所使用之過敏原區係以任意之順序包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3。又,於1個實施形態中,本發明中所使用之過敏原區依序包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3。
於1個實施形態中,本發明中所使用之過敏原區包含序列編號2之胺基酸編號383至1044之胺基酸序列。
跨膜區之一般之結構係業者所周知(Annu Rev Biochem., 2007, Vol.76, p.125-140)。跨膜區具有將蛋白質保留於生物體膜之功能。作為本發明中所使用之跨膜區,只要具有將蛋白質保留於生物體膜之功能即可,可選擇任意之適當之跨膜區。於1個實施形態中,本發明中所使用之跨膜區係LAMP之跨膜區。於1個實施形態中,本發明中所使用之LAMP之跨膜區係LAMP-1之跨膜區。
於1個實施形態中,本發明中所使用之跨膜區包含以下之(a)或(b)之胺基酸序列:
(a)與序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列之一致性為90%以上的胺基酸序列;或者
(b)序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列、或於序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~2個胺基酸之胺基酸序列。
於1個實施形態中,本發明中所使用之跨膜區包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列。
LAMP之內體/溶酶體靶區之結構係業者所周知(國際公開編號1994/017192號)。LAMP之內體/溶酶體靶區具有將蛋白質傳輸至溶酶體之功能。作為本發明中所使用之LAMP之內體/溶酶體靶區,只要具有將蛋白質傳輸至溶酶體之功能,則可選擇任意之適當之LAMP之內體/溶酶體靶區。於1個實施形態中,本發明中所使用之LAMP之內體/溶酶體靶區係LAMP-1之內體/溶酶體靶區。
於1個實施形態中,本發明中所使用之LAMP之內體/溶酶體靶區包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列、或於序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1個胺基酸之胺基酸序列。
於1個實施形態中,本發明中所使用之LAMP之內體/溶酶體靶區包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列。
在與本發明相關之嵌合體蛋白中,訊息肽、LAMP之胞器內穩定區、過敏原區中所包含之各過敏原、跨膜區及LAMP之內體/溶酶體靶區可直接連接,或者亦可經由連接肽而間接地連接。所使用之連接肽可由業者適當地選擇。於1個實施形態中,該連接肽包含10個以下之胺基酸。於1個實施形態中,LAMP之胞器內穩定區與過敏原區之間、各過敏原之間、及過敏原區與跨膜區之間所使用之連接肽係選自由LeuGlu、GlyGlyGlyGly及GluPheThr所組成之群中的連接肽。於1個實施形態中,跨膜區與LAMP之內體/溶酶體靶區之間所使用之連接肽係包含序列編號2之胺基酸編號1071至1078之胺基酸序列的連接肽。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼LAMP之訊息肽之鹼基序列;
編碼LAMP之胞器內穩定區之鹼基序列;
編碼包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列;
編碼LAMP之跨膜區之鹼基序列;以及
編碼LAMP之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼LAMP-1之訊息肽之鹼基序列;
編碼LAMP-1之胞器內穩定區之鹼基序列;
編碼包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列;
編碼LAMP-1之跨膜區之鹼基序列;以及
編碼LAMP-1之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列之訊息肽的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列之LAMP之胞器內穩定區的鹼基序列;
編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3之過敏原區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列之跨膜區的鹼基序列;以及
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列之LAMP之內體/溶酶體靶區的鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列之訊息肽的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列之LAMP之胞器內穩定區的鹼基序列;
編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3之過敏原區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列之跨膜區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1071至1078之胺基酸序列之肽連接子的鹼基序列;以及
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列之LAMP之內體/溶酶體靶區的鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼訊息肽之鹼基序列;
編碼LAMP之胞器內穩定區之鹼基序列;
編碼依序包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列;
編碼跨膜區之鹼基序列;以及
編碼LAMP之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼LAMP之訊息肽之鹼基序列;
編碼LAMP之胞器內穩定區之鹼基序列;
編碼依序包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列;
編碼LAMP之跨膜區之鹼基序列;以及
編碼LAMP之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼LAMP-1之訊息肽之鹼基序列;
編碼LAMP-1之胞器內穩定區之鹼基序列;
編碼依序包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列;
編碼LAMP-1之跨膜區之鹼基序列;以及
編碼LAMP-1之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列之訊息肽的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列之LAMP之胞器內穩定區的鹼基序列;
編碼依序含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3之過敏原區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列之跨膜區的鹼基序列;以及
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列之LAMP之內體/溶酶體靶區的鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列之訊息肽的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列之LAMP之胞器內穩定區的鹼基序列;
編碼依序含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4 、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3之過敏原區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列之跨膜區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1071至1078之胺基酸序列之肽連接子的鹼基序列;以及
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列之LAMP之內體/溶酶體靶區的鹼基序列。
本發明之核酸只要編碼與本發明相關之嵌合體蛋白,於該核酸投予至人類或動物之情形時,具有誘導對選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原之Th1型免疫的作用,則並無特別限定。於某種核酸投予至人類或動物之情形時,該核酸是否具有誘導對上述過敏原之Th1型免疫之作用例如可藉由實施例3及/或實施例4中所記載之方法進行確認。又,於該核酸投予至人類或動物之情形時,本發明之核酸亦可為具有誘導Th1細胞優勢之免疫反應之作用的核酸。於某種核酸投予至人類或動物之情形時,該核酸是否具有誘導Th1細胞優勢之免疫反應之作用例如可藉由實施例4中所記載之方法進行確認。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其包含編碼包含與序列編號2所表示之胺基酸序列之一致性為90%、92%、94%、96%、98%或99%以上之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其包含編碼包含與序列編號2所表示之胺基酸序列之一致性為90%以上之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白、或於包含序列編號2所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~10個胺基酸之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼包含與序列編號2所表示之胺基酸序列之一致性為90%以上之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該核酸具有誘導對選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原之Th1型免疫的作用。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
a)一種核酸,其包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列;或
b)一種核酸,其係包含編碼包含於序列編號2所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~10個胺基酸之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該核酸具有誘導對選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原之Th1型免疫的作用。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
一種核酸,其係包含編碼包含與序列編號2所表示之胺基酸序列之一致性為90%以上之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該核酸具有誘導對Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之Th1型免疫之作用。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
a)一種核酸,其包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列;或
b)一種核酸,其係包含編碼包含於序列編號2所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~10個胺基酸之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該核酸具有誘導對Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之Th1型免疫之作用。
於1個實施形態中,本發明之核酸係以下之核酸:
包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列的核酸。
於1個實施形態中,編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列係序列編號1所表示之鹼基序列。
本發明之核酸可基於其鹼基序列,使用該領域中公知之方法,由業者容易地製作。例如本發明之核酸可利用該領域中公知之基因合成方法而合成。作為此種基因合成方法,可使用國際公開編號90/07861號中所記載之抗體基因之合成方法等業者所公知之各種方法。
本發明之核酸可於合成一次後,使用該領域中公知之方法,由業者容易地複製。例如本發明之核酸可藉由下述<生產本發明之核酸之方法、及可藉由該方法生產之核酸>中所記載之方法進行複製。
<本發明之表現載體>
於本發明之表現載體中包含含有本發明之核酸之表現載體。
作為用於自本發明之核酸表現嵌合體蛋白之表現載體,只要為可於動物細胞中自本發明之核酸表現嵌合體蛋白者,則並無特別限制。於1個實施形態中,用於自本發明之核酸表現嵌合體蛋白之表現載體係可用於在人類體內表現嵌合體蛋白之表現載體。作為本發明中所使用之表現載體,例如可列舉:質體載體、病毒載體(例如腺病毒、反轉錄病毒、腺相關病毒)等。於1個實施形態中,本發明中所使用之表現載體為質體載體。於本說明書中,「質體」意指質體載體。
本發明之表現載體可包含與本發明之核酸可發揮作用地連結之啟動子。作為用於在動物細胞中自本發明之核酸表現嵌合體蛋白之啟動子,例如可列舉:CMV(cytomegalovirus,細胞巨大病毒)、RSV(respiratory syncytial virus,呼吸道融合性病毒)、SV40(simian virus 40,猴病毒40)等病毒源性啟動子、肌動蛋白啟動子、EF(elongation factor,延伸因子)1α啟動子、熱休克啟動子等。於1個實施形態中,本發明之表現載體中所包含之啟動子為CMV啟動子。本發明之表現載體可包含起始密碼子及終止密碼子。於此情形時,亦可包含增強子序列、非轉譯區、剪切接合部、聚腺苷酸化部位、或可複製之單元等。
於1個實施形態中,本發明之表現載體係包含以下之核酸之表現載體:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列之訊息肽的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列之LAMP之胞器內穩定區的鹼基序列;
編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3之過敏原區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列之跨膜區的鹼基序列;以及
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列之LAMP之內體/溶酶體靶區的鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之表現載體係包含以下之核酸之表現載體:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列之訊息肽的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列之LAMP之胞器內穩定區的鹼基序列;
編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3之過敏原區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列之跨膜區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1071至1078之胺基酸序列之肽連接子的鹼基序列;以及
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列之LAMP之內體/溶酶體靶區的鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之表現載體係含有包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列之核酸的表現載體。
於1個實施形態中,本發明之表現載體係含有包含序列編號1所表示之鹼基序列之核酸的表現載體。
於1個實施形態中,本發明之表現載體係含有包含序列編號3所表示之鹼基序列之核酸的表現載體。
<本發明之宿主細胞>
於本發明之宿主細胞中包含經本發明之核酸轉形之宿主細胞。於1個實施形態中,本發明之宿主細胞係經本發明之表現載體轉形之宿主細胞。於1個實施形態中,本發明之宿主細胞係經作為質體載體之本發明之表現載體轉形的宿主細胞。
作為經本發明之核酸轉形之宿主細胞,並無特別限定,只要為可用於核酸之複製之細胞,則可選擇該領域中公知之細胞。
作為可用於核酸之複製之宿主細胞,例如可列舉:本發明之技術領域中通常使用之天然細胞或人工建立之細胞等各種細胞(例如動物細胞(例如CHOK1SV細胞等)、昆蟲細胞(例如Sf9等)、細菌(大腸桿菌等)、酵母(酵母菌屬、畢赤氏酵母屬等)等)。於1個實施形態中,可使用大腸桿菌作為宿主細胞。轉形本身可藉由公知之方法實施。
<生產本發明之核酸之方法、及可藉由該方法生產之核酸>
於生產本發明之核酸之方法中包含包括培養經本發明之核酸或表現載體轉形之宿主細胞之步驟的生產核酸或表現載體之方法。於1個實施形態中,生產本發明之核酸之方法包括培養經本發明之核酸轉形之宿主細胞,複製本發明之核酸之步驟。
於1個實施形態中,生產本發明之核酸之方法包括培養經本發明之表現載體轉形之宿主細胞,複製本發明之表現載體之步驟。
於1個實施形態中,生產本發明之核酸之方法中所使用之宿主細胞為大腸桿菌。於大腸桿菌之培養中,可選擇適當之培養基、例如LB培養基、M9培養基、Terrific Broth培養基、SOB培養基、SOC培養基或2×YT培養基等。又,該大腸桿菌之培養可於碳(只要為可同化之碳化合物,則並無特別限定,例如甘油等多元醇類、或丙酮酸、丁二酸或檸檬酸等有機酸類)、氮(只要為大腸桿菌可利用之氮化合物即可,並無特別限定,例如蛋白腖、肉汁、酵母萃取物、酪蛋白水解物、大豆粕鹼萃取物、或者氨或其鹽)、無機物及無機離子(並無特別限定,例如磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、鎂、鈣、鉀、鐵、錳及鋅)、維生素源以及消泡劑等經控制為適當濃度之環境中進行。又,培養之控制包含pH值、溫度、攪拌、空氣流、溶存氧等參數之控制。於1個實施形態中,培養之條件係pH值為6.7至7.5,溫度為20至37℃,且攪拌速度為200至300 rpm之範圍。
生產本發明之核酸之方法亦可包括自回收之培養液獲得溶菌液(lysate)的步驟。溶菌液例如可藉由利用鹼溶解法或煮沸法對回收之培養液進行處理而獲得。又,獲得溶菌液之步驟亦可包括對最終之溶解物進行殺菌過濾之步驟。
生產本發明之核酸之方法亦可進而包括自溶菌液純化核酸或表現載體之步驟。於自溶菌液純化核酸或表現載體時,可使用離子交換層析法及/或疏水相互作用層析法。自溶菌液純化核酸或表現載體之步驟亦可包括進行超過濾及/或透析過濾之步驟。又,作為純化之步驟之最終處理,亦可包括進行殺菌過濾之步驟。
於1個實施形態中,本發明之核酸係藉由生產本發明之核酸之方法所生產的核酸。
於1個實施形態中,本發明之表現載體係藉由生產本發明之核酸之方法所生產的表現載體。
<本發明之醫藥組合物>
於本發明之醫藥組合物中含有包含本發明之核酸及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。於1個實施形態中,本發明之醫藥組合物係包含本發明之載體及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。本發明之醫藥組合物可使用該領域中通常使用之賦形劑、即藥劑用賦形劑或藥劑用載體等,並藉由通常使用之方法而製備。作為該等醫藥組合物之劑型之例,例如可列舉注射劑、點滴用劑等非經口劑,可藉由靜脈內投予、皮下投予、皮內投予、肌內投予等進行投予。於製劑化時,可於藥學上所容許之範圍內使用與該等劑型對應之賦形劑、載體、添加劑等。
於1個實施形態中,本發明之醫藥組合物係包含本發明之核酸或表現載體及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組合物。
本發明之核酸或表現載體之投予量係根據患者之症狀之程度或年齡、使用之製劑之劑型等而不同,例如可使用0.001 mg/kg~100 mg/kg左右。又,可添加與此種投予量對應之量之本發明之核酸或表現載體而進行製劑化。
本發明之醫藥組合物可用作由選自Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原所引起之過敏之預防或治療劑。又,本發明之醫藥組合物可用作甲殼類過敏之預防或治療劑。
於本發明中,包含一種過敏之預防或治療用醫藥組合物,其包含本發明之核酸。又,於本發明中,包含一種治療或預防過敏之方法,其包括投予本發明之核酸之預防有效量或治療有效量之步驟。又,於本發明中,包含一種用於過敏之預防或治療之本發明之核酸。又,於本發明中,包含一種本發明之核酸之用途,其係用於過敏之預防或治療用醫藥組合物之製造。於1個實施形態中,上述過敏係由選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原所引起之過敏。又,於1個實施形態中,上述過敏係具有與選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原進行反應之抗體之過敏患者所罹患的過敏。進而,於1個實施形態中,上述過敏為甲殼類過敏。
於1個實施形態中,本發明之醫藥組合物係包含以下之核酸及藥學上所容許之賦形劑之過敏之預防或治療用醫藥組合物:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列之訊息肽的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列之LAMP之胞器內穩定區的鹼基序列;
編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3之過敏原區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列之跨膜區的鹼基序列;以及
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列之LAMP之內體/溶酶體靶區的鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之醫藥組合物係含有包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列之核酸、及藥學上所容許之賦形劑的過敏之預防或治療用醫藥組合物。
於本發明中,含有包含本發明之表現載體之過敏之預防或治療用醫藥組合物。又,於本發明中,包含包括投予本發明之表現載體之預防有效量或治療有效量之步驟的治療或預防過敏之方法。又,於本發明中,包含用於過敏之預防或治療之本發明之表現載體。又,於本發明中,包含過敏之預防或治療用醫藥組合物之製造中之本發明之表現載體的用途。於1個實施形態中,上述過敏係由選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原所引起之過敏。又,於1個實施形態中,上述過敏係具有與選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原進行反應之抗體之過敏患者所罹患的過敏。進而,於1個實施形態中,上述過敏為甲殼類過敏。
於1個實施形態中,本發明之醫藥組合物係含有包含以下之核酸及藥學上所容許之賦形劑之表現載體的過敏之預防或治療用醫藥組合物:
一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列:
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列之訊息肽的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列之LAMP之胞器內穩定區的鹼基序列;
編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3之過敏原區的鹼基序列;
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列之跨膜區的鹼基序列;以及
編碼包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列之LAMP之內體/溶酶體靶區的鹼基序列。
於1個實施形態中,本發明之醫藥組合物係包含含有包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列之核酸之表現載體、及藥學上所容許之賦形劑的過敏之預防或治療用醫藥組合物。
此處提供為了對本發明進一步獲得瞭解而參照之特定之實施例,但該等係例示目的,並不限定本發明。
[實施例]
於無特別說明之情形時,以下之實施例中所記載之步驟可按照公知之方法實施。又,於使用市售之試劑或套組等之情形時,該步驟可按照市售品之指示書實施。
[實施例1:LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體之構建]
構建包含序列編號3所表示之鹼基序列之LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體(含有包含依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列(即編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列)之核酸的表現載體:編碼LAMP-1之訊息肽之鹼基序列、編碼LAMP-1之胞器內穩定區之鹼基序列、編碼依序包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列、編碼LAMP-1之跨膜區之鹼基序列、以及編碼LAMP-1之內體/溶酶體靶區之鹼基序列)。該質體可藉由於日本專利第5807994號之序列編號6所記載之質體之Eco RI-Xho I位點插入於序列編號1之鹼基編號1147至3132之鹼基序列(編碼依序包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列)之5'末側附加Xho I識別序列並於3'末側附加Eco RI識別序列而成之合成DNA而構建。藉由所構建之LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體將大腸桿菌進行轉形,進行液體培養。自培養液利用離心分離法回收菌體,使用依據一般之質體萃取純化法(小規模純化法(miniprep))之方法,獲得擴增之LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體。
[實施例2:LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3嵌合體蛋白之表現]
使用源自人類胚胎腎之293T細胞株來評價LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3嵌合體蛋白(包含序列編號1所表示之鹼基序列所編碼之胺基酸序列(即序列編號2所表示之胺基酸序列)之嵌合體蛋白)之活體外表現。
(1)細胞培養及質體導入
將源自人類胚胎腎之293T細胞(Thermo Fisher Scientific公司 Cat.HCL4517)懸浮於包含10%胎牛血清(Hyclone公司,Cat.SH30070.03)及稀釋100倍之青黴素-鏈黴素(ThermoFisher Scientific公司,Cat.15070063)之D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium,達爾伯克氏改良伊格爾培養液)培養基(Sigma-Aldrich公司,Cat.D5796)中,以3×105
cells/孔之方式接種至6孔板(IWAKI公司,Cat.3810-006)。將接種之細胞於37℃、5%CO2
之存在下培養一晚後,添加LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體:Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific公司 Cat.11668027)=2.5(μg):10(μL)之混合液250 μL。進而,將細胞於37℃、5%CO2
之存在下培養一晚後,去除培養基並藉由PBS(phosphate buffer saline,磷酸鹽緩衝液)清洗一次,然後供於西方墨點法。
(2)西方墨點法
樣本製作:利用包含蛋白酶抑制劑(Roche Diagnostics公司 Cat.11873580)之RIPA緩衝液(Pierce公司 Cat.89900)使細胞溶解,以20000×g進行5分鐘之離心分離,使用DC蛋白質分析套組II(DC protein assay kitII)(Bio-Rad公司 Cat.500-0112)測定離心分離後之上清液之蛋白質濃度。於以蛋白質濃度成為200 μg/mL之方式利用包含蛋白酶抑制劑之PBS稀釋而成之上清液5 μL中添加包含100 mM DTT之LDS樣本緩衝液(Thermo Fisher Scientific公司 Cat.NP0007)5 μL,於70℃下加熱處理10分鐘,製作供於SDS-PAGE之樣本。
SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳):將上述樣本塗覆於NuPAGE(註冊商標)4-12% Bis-Tris Gel(Thermo Fisher Scientific公司,Cat.NP0323),於NuPAGE(註冊商標)MOPS SDS 電泳緩衝液(Thermo Fisher Scientific公司,Cat.NP0001)中,以200 V之定電壓進行電泳。
阻隔:使PVDF(polyvinylidene fluoride,聚偏二氟乙烯)薄膜(Thermo Fisher Scientific公司 Cat.LC2005)與SDS-PAGE後之凝膠接觸,於裝滿有含有20%甲醇之NuPAGE(註冊商標)轉移緩衝液(Thermo Fisher Scientific公司,Cat.NP0006)之XCell II Blot Module(Thermo Fisher Scientific公司,Cat.EI9051)中,以180 mA通電70分鐘,進行阻隔。
阻隔:將通電後之薄膜浸漬於Blocking One(Nacalai Tesque公司,Cat.03953-95),於室溫下振盪1小時。
1次抗體:將薄膜浸漬於將抗人類LAMP1抗體(Sino biological公司,Cat.11215-RP01)藉由包含10% Blocking One之TBS Tween-20緩衝液(Thermo Fisher Scientific公司,Cat.28360)稀釋1000倍而成之溶液中,於4℃下振盪一晚。
2次抗體:藉由TBS Tween-20緩衝液清洗薄膜。將薄膜浸漬於將抗兔IgG(H+L chain)pAb-HRP(MBL公司,Cat.458)藉由包含10% Blocking One之TBS Tween-20緩衝液稀釋3000倍而成之液體中,於室溫下振盪1小時。
檢測:藉由TBS Tween-20緩衝液清洗薄膜。將薄膜浸漬於ECL prime西方墨點法檢測試劑(ECL prime western blotting detection reagent)(GE Healthcare公司,Cat.RPN2232)中,藉由LumiVision PRO 400EX(Aisin Seiki股份有限公司)檢測圖像。於該圖像中,檢測到與相當於嵌合體蛋白之抗人類LAMP1抗體進行反應之帶。
上述試驗之結果為,確認到藉由於源自人類胚胎腎之293T細胞株中導入LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體,而於細胞內表現LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3嵌合體蛋白。
[實施例3:由LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體投予所引起之IgG2a抗體產生誘導]
進行小鼠活體內之IgG2a抗體產生誘導之評價。作為各群8例,對投予開始時6週之BALB/c雌性小鼠(Charles River Laboratories Japan公司)之耳朵每週3次(第0、7、14天)皮內投予作為多價質體群之包含5 μg之LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體之PBS溶液25 μL,於最終投予3週後(第35天)進行採血而取得血漿樣本。於比較對照中,作為單價質體混合群,對各質體投予包含5 μg之LAMP-Lit v 1質體(含有包含依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列之核酸的表現載體:編碼序列編號2之胺基酸編號1至380之胺基酸序列(以下,於實施例3及4中,稱為LAMP-1之N末端)之鹼基序列、編碼包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1過敏原區之鹼基序列、以及編碼序列編號2之胺基酸編號1048至1082之胺基酸序列(以下,稱為LAMP-1之C末端)之鹼基序列)、LAMP-Lit v 3質體(含有包含依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列之核酸的表現載體:編碼LAMP-1之N末端之鹼基序列、編碼包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3過敏原區之鹼基序列、以及編碼LAMP-1之C末端之鹼基序列)及LAMP-Lit v 4質體(含有包含依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列之核酸的表現載體:編碼LAMP-1之N末端之鹼基序列、編碼包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4過敏原區之鹼基序列、以及編碼LAMP-1之C末端之鹼基序列)之混合物(以下,稱為單價質體混合物)之PBS溶液25 μL,以及作為對照群,投予PBS 25 μL。抗體效價係使用藉由包含1% BSA(Sigma-Aldrich公司,Cat.A8022)之PBS稀釋10倍、100倍或1000倍之血漿樣本,利用ELISA法進行測定。抗體效價之算出係藉由以高濃度含有自對蝦抗原(Greer公司,Cat.RMF34P)免疫之小鼠製備之Lit v 1、Lit v 3及Lit v 4特異性抗體之血漿作為標準血漿,對該標準血漿進行階段稀釋,製作校準曲線而進行。此時,將標準血漿中之各過敏原特異性IgG2a抗體效價規定為100 U/mL。ELISA測定係使用F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE(Nunc公司,Cat.439454)作為測試板,依據一般之ELISA法進行。作為天然蝦萃取純化蛋白質之Lit v 1(INDOOR Biotechnologies公司,Cat.NA-STM-1)係藉由PBS製備為1 μg/mL,作為重組純化蛋白質之Lit v 4(Sysmex公司,Uniprot KB:C7A639)及Lit v 3(Sysmex公司,Uniprot KB:B7SNI3)係藉由PBS製備為2 μg/mL,以50 μL/孔添加於測試板並於4℃下靜置一晚。將測試板利用清洗緩衝液(PBS Tween-20緩衝液,Thermo Fisher Scientific公司,Cat.28352)清洗3次後,以100 μL/孔添加包含1%BSA之PBS,於室溫下靜置1小時。將測試板利用清洗緩衝液清洗3次後,以50 μL/孔添加血漿樣本,於室溫下靜置1小時。將測試板利用清洗緩衝液清洗3次後,以50 μL/孔添加經包含1% BSA之PBS稀釋50000倍之二次抗體抗小鼠IgG2a檢測抗體(Bethyl Laboratories公司,Cat.A90-107P),於室溫下靜置1小時。將測試板利用清洗緩衝液清洗3次後,以50 μL/孔添加作為基質溶液之TMB Microwell Peroxidase Substrate System(Ceracare公司,Cat.50-76-03),於室溫下,將Lit v 1靜置10分鐘,將Lit v 3靜置30分鐘,將Lit v 4靜置60分鐘後,以50 μL/孔添加反應終止液(2 M H2
SO4
),測定450 nm之吸光度。
上述試驗之結果為,藉由對小鼠投予LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體(多價質體),確認到與單價質體混合物投予相同程度之Lit v 1、Lit v 3及Lit v 4特異性IgG2a抗體產生(圖1)。根據以上之結果,提示LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體係對質體所編碼之所有過敏原誘導Th1免疫應答,引起活化之B細胞向IgG2a同型之類型轉換。
[實施例4:由LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體所引起之IFN-γ及IL-4產生誘導]
進行將自投予LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體之小鼠採集之脾細胞藉由過敏原進行刺激時之IFN-γ及IL-4產生誘導的評價。於最終投予3週後(第35天)宰殺實施例3中所使用之投予LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體之小鼠,摘除脾臟。自摘除之脾臟,按照一般之方法製備脾細胞。將製備之脾細胞懸浮於包含10%胎牛血清(Hyclone公司,Cat.SH30070.03)及稀釋100倍之青黴素-鏈黴素(ThermoFisher公司,Cat.15070063)之RPMI-1640培養基(Sigma公司,Cat.R8758)中,以成為8×105
cells/孔之細胞數之方式接種於96孔板。於過敏原刺激中,使用蝦萃取液(診斷用過敏刮痕萃取物,TORII公司,授權編號(40A)4688)或Lit v 1(INDOOR Biotechnologies公司,Cat.NA-STM-1)。過敏原刺激係利用於接種有脾細胞之孔中以最終濃度分別成為100 μg/mL或10 μg/mL之方式添加蝦萃取液或Lit v 1,於37℃、5% CO2
下培養72小時之方法進行,利用ELISA法測定因刺激而自脾細胞釋出至培養上清液中之IFN-γ及IL-4之濃度。於IFN-γ之測定中使用經包含0.1% BSA及0.05% Tween 20之TBS緩衝液稀釋10倍之上清液樣本,於IL-4之測定中使用經包含1% BSA之PBS緩衝液稀釋3倍之上清液樣本。作為ELISA測定之測試板,使用F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE。作為ELISA套組,使用小鼠IFN-γ DuoSet ELISA(R&D Systems公司,Cat.DY485)及小鼠IL-4 DuoSet ELISA(R&D Systems公司,Cat.DY404)。實驗係依據ELISA套組之隨附操作說明進行。於上述試驗中,確認到藉由投予LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體(多價質體),誘導與單價質體混合物投予相同程度之蝦萃取液及Lit v 1特異性之IFN-γ產生(圖2)。另一方面,於該小鼠中,藉由多價質體及單價質體混合物投予所誘導之蝦萃取液及Lit v 1特異性之IL-4產生量為檢測下限值(圖3)。根據以上之結果,提示LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體誘導Th1細胞優勢之Th1型免疫應答。
[實施例5:由LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體所引起之蝦抗原誘發重度過敏症狀抑制作用]
為了判定由LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體所引起之過敏治療效果,利用以下詳述之方法進行重度過敏症狀之抑制作用之評價。
(1)蝦抗原經皮致敏
利用剪毛器剃掉7週BALB/c雌性小鼠(Charles River Laboratories Japan)之背部之毛,將藉由超純水所製備之4% SDS(Invitrogen公司,Cat.15553035)利用移液管每60 μL塗佈於麻醉下小鼠之背部。使之返回至籠中自然乾燥後,將以蛋白濃度成為5 mg/mL之方式藉由1.5% NaHCO3
/PBS所製備之蝦抗原(GREER公司,Cat.RNF34P)以0.3 mg/60 μL利用移液管塗佈於麻醉下小鼠之背部。作為對照,對6例之小鼠每60 μL塗佈1.5% NaHCO3
/PBS代替蝦抗原。將該一系列之操作自塗佈開始日起每週3次實施2週(第0、2、4、7、9、11天)。為了使各群之致敏水準均一,於第14天採集血漿試樣,依據實施例3中所記載之方法、及書籍(免疫測定法 基礎至尖端,生物化學測定研究會,小林 典裕,2014)中所記載之一般測定法測定Lit v 1特異性IgE、IgG1、IgG2a抗體效價,利用等數法進行分組。
(2)LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體之皮內免疫
對(1)中所分組之各群8例之蝦抗原致敏小鼠之耳朵每週4次(第21、28、35、42天)皮內投予0.5 μg、5 μg、50 μg/20 μL PBS之LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體、或作為對照之20 μL之PBS。又,對非致敏小鼠6例亦同樣地皮內投予20 μL之PBS。
(3)由蝦抗原所引起之過敏症狀之誘發
於第50天,對每隻小鼠每0.1 mg/200 μL腹腔內投予藉由1.5% NaHCO3
/PBS製備為0.5 mg/mL之蝦抗原,使用小鼠用體溫記錄儀(A&D公司,Cat.AD-1687)測定抗原投予前、投予後15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘之直腸溫度。又,以1至5分對抗原投予後60分鐘內可見之過敏症狀進行計分。症狀之判定係依據文獻(The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2013, Vol.131, p.213-221)之判定基準進行。
為了測定肥胖細胞去顆粒之程度,採集過敏症狀誘發60分鐘後之血漿,測定小鼠肥胖細胞蛋白酶1(mMCPT-1)之血漿中濃度。ELISA套組係使用小鼠MCPT-1 Uncoated ELISA(Thermo Fisher Scientific公司,Cat.88-7503),測定係依據隨附操作說明而進行。作為ELISA測定之測試板,使用F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE。作為測定值,製備藉由附屬於套組之稀釋液稀釋10倍、200倍、40000倍之血漿樣本而進行測定,採用落入至套組附屬之標準樣本校準曲線範圍之稀釋倍率之測定結果。
根據上述試驗之結果,顯示於小鼠中,LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體與對照群相比,帶來由蝦抗原投予所引起之體溫降低之抑制、及過敏症狀之緩和(圖4)。除此以外,確認到症狀誘發60分鐘後之血漿中去顆粒係藉由LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體投予而得到抑制(圖5)。該等結果顯示LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體可用於治療處理。
[產業上之可利用性]
本發明之核酸期待對甲殼類過敏之預防或治療有用。又,生產本發明之核酸之方法係對生產上述核酸有用。
[序列表非關鍵文字]
於以下之序列表之數字標題<223>中記載「人工序列」之說明。具體而言,序列表之序列編號1所表示之鹼基序列係編碼LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3嵌合體蛋白之鹼基序列,序列表之序列編號2所表示之胺基酸序列係由序列編號1所編碼之胺基酸序列。又,序列編號3所表示之鹼基序列係LAMP-Lit v 1-Lit v 4-Lit v 3質體之鹼基序列。
圖1之1.~3.係分別表示將本發明之核酸投予至小鼠中時誘導之Lit v 1、Lit v 3及Lit v 4特異性IgG2a抗體產生之圖。縱軸表示血漿中抗體效價(mU/mL),橫軸表示各投予群。虛線表示檢測極限,水平線表示各投予群之幾何平均值。
圖2之1.及2.係分別表示藉由最終濃度100 μg/mL之蝦萃取液或最終濃度10 μg/mL之Lit v 1蛋白質刺激投予有本發明之核酸之小鼠之脾細胞時之培養上清液中之IFN-γ產生的圖。縱軸表示培養上清液中IFN-γ濃度(pg/mL),橫軸表示各投予群。虛線表示檢測極限,水平線表示各投予群之算術平均值。
圖3之1.及2.係分別表示藉由最終濃度100 μg/mL之蝦萃取液或最終濃度10 μg/mL之Lit v 1蛋白質刺激投予有本發明之核酸之小鼠之脾細胞時之培養上清液中之IL-4產生的圖。縱軸表示培養上清液中IL-4濃度(pg/mL),橫軸表示各投予群。虛線表示檢測極限,水平線表示各投予群之算術平均值。
圖4之1.及2.係分別表示對蝦抗原致敏小鼠投予本發明之核酸時之蝦抗原腹腔內投予後60分鐘之體溫變化及過敏症狀的得分。體溫變化係表示即將進行蝦抗原腹腔內投予之前15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘時之自投予前體溫之變化。縱軸表示直腸溫度度變化(℃),橫軸表示時間。曲線係表示於各時間於同一配方內進行算術平均所獲得之值,縱線表示標準誤差。過敏症狀係表示基於文獻(The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2013, Vol.131, p.213-221)之判定基準判定蝦抗原腹腔內投予後60分鐘內可見之症狀之各小鼠的得分。縱軸表示重度過敏症狀得分,橫軸表示各投予群。水平線表示各投予群之中央值。++表示於對非致敏群藉由Willcoxon rank sum test進行之有意義差檢定中P值未達0.01,**表示於對致敏群藉由Steel multiple comparison test進行之有意義差檢定中P值未達0.01。
圖5係表示於蝦抗原致敏小鼠之腹腔內投予本發明之核酸後60分鐘時之血漿中之小鼠肥胖細胞蛋白酶1(mMCPT-1)的濃度。縱軸表示mMCPT-1濃度(pg/mL),橫軸表示各投予群。水平線表示各投予群之幾何平均值,++係表示於對對數轉換後之非致敏群藉由Unpaired t test進行之有意義差檢定中P值未達0.01,**係表示於對對數轉換後之致敏群藉由Dunnett's multiple comparison test進行之有意義差檢定中P值未達0.01。
Claims (18)
- 一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列: 編碼訊息肽之鹼基序列; 編碼LAMP之胞器內穩定區之鹼基序列; 編碼包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列; 編碼跨膜區之鹼基序列;以及 編碼LAMP之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
- 一種核酸,其係包含編碼嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該鹼基序列係依序包含以下之鹼基序列之鹼基序列: 編碼訊息肽之鹼基序列; 編碼LAMP之胞器內穩定區之鹼基序列; 編碼依序包含Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3之過敏原區之鹼基序列; 編碼跨膜區之鹼基序列;以及 編碼LAMP之內體/溶酶體靶區之鹼基序列。
- 如請求項1之核酸,其中訊息肽為LAMP之訊息肽。
- 如請求項2之核酸,其中訊息肽為LAMP之訊息肽。
- 如請求項1至4中任一項之核酸,其中跨膜區為LAMP之跨膜區。
- 如請求項1至4中任一項之核酸,其中訊息肽包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列,胞器內穩定區包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列,過敏原區係含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3的過敏原區,跨膜區包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列,內體/溶酶體靶區包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列。
- 如請求項5之核酸,其中訊息肽包含序列編號2之胺基酸編號1至27之胺基酸序列,胞器內穩定區包含序列編號2之胺基酸編號28至380之胺基酸序列,過敏原區係含有包含序列編號2之胺基酸編號383至666之胺基酸序列之Lit v 1、包含序列編號2之胺基酸編號671至863之胺基酸序列之Lit v 4、及包含序列編號2之胺基酸編號868至1044之胺基酸序列之Lit v 3的過敏原區,跨膜區包含序列編號2之胺基酸編號1048至1070之胺基酸序列,內體/溶酶體靶區包含序列編號2之胺基酸編號1079至1082之胺基酸序列。
- 一種核酸,其係包含編碼包含與序列編號2所表示之胺基酸序列之一致性為90%以上之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該核酸具有誘導對選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原之Th1型免疫的作用。
- 一種核酸,其係: a)一種核酸,其包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列;或 b)一種核酸,其係包含編碼包含於序列編號2所表示之胺基酸序列中缺失、置換、插入及/或附加有1~10個胺基酸之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列者,且該核酸具有誘導對選自由Lit v 1、Lit v 4及Lit v 3所組成之群中之過敏原之Th1型免疫的作用。
- 一種核酸,其包含編碼包含序列編號2所表示之胺基酸序列之嵌合體蛋白之鹼基序列。
- 一種表現載體,其包含如請求項1至10中任一項之核酸。
- 一種表現載體,其包含如請求項10之核酸。
- 一種宿主細胞,其係利用如請求項1至10中任一項之核酸轉形而成。
- 一種生產核酸之方法,其包括培養利用如請求項1至10中任一項之核酸轉形而成之宿主細胞之步驟。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項12之表現載體及藥學上所容許之賦形劑。
- 如請求項15之醫藥組合物,其係甲殼類過敏之預防或治療用醫藥組合物。
- 如請求項12之表現載體,其係用於甲殼類過敏之預防或治療。
- 一種如請求項12之表現載體之用途,其係用於甲殼類過敏之預防或治療用醫藥組合物之製造。
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