TW202012621A

TW202012621A - 植酸酶突變體

Info

Publication number: TW202012621A
Application number: TW108118771A
Authority: TW
Inventors: 挨璽白; 峰李
Original assignee: 大陸商南京百斯杰生物工程有限公司
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2020-04-01
Also published as: WO2019228441A1; EP3805381A1; CN112204136B; EA202092569A1; CN112204136A; EP3805381A4; US20210207112A1

Abstract

本發明涉及熱穩定性植酸酶，在野生型大腸桿菌植酸酶或突變型大腸桿菌植酸酶的胺基酸序列中包含至少一對引入的二硫鍵，引入後可以提升植酸酶的性質，特別是在於耐熱穩定性，耐蒸汽穩定性，制粒穩定性方面，顯著優於現有的野生型或者突變型植酸酶；相比于現有的引入二硫鍵的工程改造植酸酶，其耐熱穩定性也有顯著提高。

Description

植酸酶突變體

本發明屬於蛋白質工程領域，涉及來源於革蘭氏陰性菌的植酸酶，尤其是大腸桿菌植酸酶，此類經引入一對或多對二硫鍵而改造後，熱穩定性得到提升。

植酸酶(Phytase)，即肌醇六磷酸磷酸水解酶(myo-Inositol hexakisphosphate phosphohydrolase)，屬於正磷酸單酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低級肌醇磷酸衍生物和無機磷酸，在某些情況下可將植酸水解為游離的肌醇。植酸在穀物、豆類、油料等作物種子中含量最為豐富，高達1%~3%，占植物總磷含量的60%~80%。但植酸中的磷不能被直接吸收利用，必須在消化道內先水解為無機磷酸鹽。研究表明，單胃動物(豬、雞、鴨、鵝等)因為缺乏植酸酶而對植酸中磷的利用率很低。同時，植酸強烈電負性導致其通常與二價或三價陽離子，如Ca²⁺、Zn²⁺、Fe^{2+ +}等形成不溶性鹽類，阻礙小腸對礦物質的吸收。還會與蛋白質，胺基酸以及脂肪酸等形成絡合物，影響他們的吸收利用，植酸還會與胃蛋白酶、胰凝乳酶、胰蛋白酶等結合，降低消化酶活性。因此，在單胃動物飼料中添加植酸酶可提高動物飼料中磷的利用率，降低動物排泄物中的磷含量，同時能提高蛋白和飼料能量利用率。

植酸酶作為飼料添加劑預先加入飼料原料中，經高溫制粒等過程(70-95度，時間為30秒-120秒)後，生產出飼料用於動物飼養。因此為了最大化發揮植酸酶作用，需要其耐受較高的溫度，或者說植酸酶應有良好的耐熱性。商業化的植酸酶主要來源於黑麯黴(如US5436156所述)，大腸桿菌(如US7432098所述)，檸檬酸細菌屬(如US20100261259所述Citrobacter braakii菌)，布氏桿菌(如US8143046所述的Buttiauxella sp.菌)等。這些植酸酶由於來源不同，導致他們具有不同的耐酸耐熱性質。Nielsen等(J Agric Food Chem.2015,63(3)：943-50)比較了商業化的植酸酶性質，結果顯示大腸桿菌植酸酶顯示出最好的特性。文中描述的大腸桿菌植酸酶產品是經過蛋白質工程修飾的突變體，因此具有更好熱穩定性。US8540984，US9765313，US7432098和US8877478描述了通過對大腸桿菌植酸酶序列進行隨機突變和定點突變篩選後獲得的熱穩定性提高的突變體酶，而US20130017185以及US20170240872專利申請中提到了根據大腸桿菌植酸酶蛋白質三維結構進行特定二硫鍵引入也可以提高酶熱穩定性。

業內還需要提供更多的具有熱穩定性的植酸酶。

本發明人發現，通過在大腸桿菌野生型植酸酶(例如與SEQ ID NO：1所示的大腸桿菌野生型植酸酶具有大於85%的序列一致性者)或者大腸桿菌植酸酶突變體(例如與SEQ ID NO：2所示的大腸桿菌植酸酶突變體具有大於75%的序列一致性者)的胺基酸序列中的特定位置上引入一對或多對二硫鍵，可以提高其穩定性，從而實現了發明的目的。

在一些實施例中，在與SEQ ID NO：1所示的大腸桿菌野生型植酸酶具有大於85%的序列一致性的大腸桿菌植酸酶突變體的胺基酸序列中特定位置上引入如表1所示的一對或多對二硫鍵。在一些較佳實施例中，在與SEQ ID NO：1所示的大腸桿菌野生型植酸酶具有大於88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的大腸桿菌植酸酶的胺基酸序列中特定位置上引入如表1所示的一對或多對二硫鍵。

在另一些實施例中，在與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：99所示的大腸桿菌植酸酶突變體具有大於75%的序列一致性的大腸桿菌植酸酶變異體的胺基酸序列中特定位置上引入如表1所示的一對或多對二硫鍵。在一些較佳實施例中，在與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：99所示的大腸桿菌植酸酶突變體具有大於80%、82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的大腸桿菌植酸酶變異體的胺基酸序列中特定位置上引入如表1所示的一對或多對二硫鍵。

在一些實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在至少1個位置上具有突變：1,25,30,36,37,38,39,46,55,60,62,65,69,70,73,74,75,76,77,79,80,85,101,108,109,111,114,116,118,120,123,126,127,133,137,138,139,141,142,146,151,157,159,161,173,176,178,180,183,184,185,186,187,188,189,204,211,233,235,245,253,255,267,276,282,283,284,286,287,288,291,295,297,311,315,317,318,327,341,354,363,367,369,370,380,382,383,385,391,402,408。在一些較佳實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在至少1個位置上具有突變：25，46，62，70，73，74，75，76，114，137，142，146，159，173，204，255，282，283，284。在一些更佳的實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在至少1個位置上具有突變：25，46，62，70，73，74，75，76，114，137，142， 146，159，173，204，255。

在一些具體實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在如下位置上包含突變：46，62，73，75，146，159，204，255。在另一些具體實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在如下位置上包含突變：25，46，62，70，73，75，114，137，142，146，159，255。在一些具體實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在如下位置上包含突變：46，62，70，73，74，75，76，146，159，173，255，282，283，284。在另一些具體實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在如下位置上包含突變：25，46，62，70，73，74，75，114，137，142，146，159，173，255，282，283，284。

在一些實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有至少一個如下突變：Q1S,Q1V,Q1N,A25F,Q30K,A36K,W37F,P38Y,T39D,W46E,I55V,H60S,H60Q,Q62W,R65H,D69N,G70E,A73P,A73D,A73E,K74D,K74P,K74L,K74N,K75C,K75Q,G76T,C77A,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,S80P,I85V,A101L,C108A,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,T114H,T116A,T118R,T118S,S120R,P123E,N126Y,P127V,P127L,C133A,N137V,N137E,N137S,N137P,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141R,T141E,T141G,T141A,D142R,S146E,S146R,S151P,G157R,G157Q,G157N,G157L,G157A,R159Y,T161P,P173Y,P173S,N176P,N176K,C178A,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S187P,C188A,S189T,N204C,V211W,G233E,G235Y,T245E,Q253V,Y255D,R267A,H282N,P283G,P284T,K286F,Q287Y,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297T,G311S,E315G,E315S,N317L,W318Y,T327Y,L341Y,L341V,F354Y,K363A,K363L,S367F,N369P,T370P,A380P,A380R,A380T, C382A,E383S,R385S,R385V,R385T,C391A,E402R,E402T,E402D,E402P,E402N,C408A。在一些較佳實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有至少一個如下突變：A25F，W46E，Q62W，G70E，A73P，K74N，K75C，K75Q，G76T，T114H，N137V，D142R，S146E，R159Y，P173S，N204C，Y255D，H282N，P283G，P284T。在一些更佳的實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有至少一個如下突變：A25F，W46E，Q62W，G70E，A73P，K74N，K75C，K75Q，G76T，T114H，N137V，D142R，S146E，R159Y，P173S，N204C，Y255D。

在一些實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有至少一個如下突變：W46E，Q62W，A73P，K75C，S146E，R159Y，N204C，Y255D。在另一些實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有至少一個如下突變：A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K75C,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,Y255D。在一些實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有至少一個如下突變：W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,G76T,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T。在另一些實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有至少一個如下突變：A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T。

在一些具體實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，包含如下突變：W46E，Q62W，A73P，K75C， S146E，R159Y，N204C，Y255D。在另一些具體實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，包含如下突變：A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K75C,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,Y255D。在一些具體實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，包含如下突變：W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,G76T,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T。在另一些具體實施例中，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，包含如下突變：A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T。

具體而言，本發明人發現，在如SEQ ID NO：1所示的大腸桿菌野生型植酸酶序列或如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：99所示的大腸桿菌突變型植酸酶序列中分別引入如表1中所示的一對或多對二硫鍵組合，可以提高其熱穩定性。

在一些實施例中，在野生型或突變型大腸桿菌植酸酶中引入的一對或多對二硫鍵，所述二硫鍵選自(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(J)、(M)或(O)中的至少一項，條件式(C)和(D)項不同時滿足。

在一些實施例中，在野生型或突變型大腸桿菌植酸酶中引入的一對二硫鍵，所述二硫鍵選自(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(J)、(M)或(O)項。

在一些實施例中，在野生型或突變型大腸桿菌植酸酶中同時引入多對二硫鍵，較佳地，在野生型或突變型植酸酶中同時引入(B)+(O)、(C)+(O)、(M)+(O)、(B)+(D)+(O)或(D)+(M)+(O)所述的二硫鍵；更佳地，在野生型或突變型大腸桿菌植酸酶中同時引入(B)+(O)或(C)+(O)所述的二硫鍵。

為本發明的目的，“引入”不限定二硫鍵是以任何特定的方式生成的。例如，“引入”二硫鍵，可以包括將待引入二硫鍵的植酸酶序列的相應位置上的胺基酸殘基替換成能夠形成二硫鍵的胺基酸殘基(包括，例如，半胱胺酸殘基Cys，同型半胱胺酸殘基Hcy，等等)；和/或在相應位置上插入能夠形成二硫鍵的胺基酸殘基。這樣的替換和/或插入可以，例如，通過業內公知的定點誘變方法來實現。“引入”亦包括形成所述二硫鍵的任何一個或兩個胺基酸殘基是由於自然突變而產生的情況。

為了生產經過如此改造的突變體，可以使用微生物細菌如大腸桿菌，真菌如酵母(畢赤酵母，粟酒裂殖酵母等)和絲狀真菌(如黑麯黴，米麯黴，裡氏木黴等)，以及植物(如玉米，大豆，小麥等)作為宿主進行表現。

表現和生產上述突變體使用通用的和已知技術即可完成。如APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,2004,3041-3046描述了大腸桿菌植酸酶及突變體在大腸桿菌中的表現，Journal of Biotechnology 175(2014)1-6描述了植酸酶及突變體在畢赤酵母中的表現，專利申請CN107353327描述了植酸酶及突變體在黑麯黴中表現。

為了構建上述突變，可以在已有野生型核酸序列基礎上使用習知的定點突變方法，也可以使用基因合成方法從頭合成。在連接啟動子和終止子後導入到宿主細胞中，在合適的培養條件下進行表現。上述方法為業內習知方法。

“野生型植酸酶”中是指植酸酶由天然存在的微生物，如在自然界中發現的大腸桿菌細胞中表現的植酸酶。

“變異體”或“突變型”是指具有植酸酶活性的包含在一個或多個(數個)位置的一個或多個(數個)胺基酸殘基的變更，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代是指用不同的胺基酸替代佔據某位置的胺基酸；缺失是指除去佔據某位置的胺基酸；而插入是指在佔據某位置的胺基酸鄰接處且在之後添加1-5個胺基酸。對野生型植酸酶進行突變，也是指與野生型植酸酶相比，在至少一個位置上進行胺基酸的取代、插入和/或缺失，較佳地，是指在至少一個位置上進行胺基酸的取代，如“A25F”，即為野生型植酸酶第25位丙胺酸取代位苯丙胺酸。

“(B)+(O)”、“B+O”或“(B)項+(O)項”指在野生型或突變型植酸酶序列的中引入兩個二硫鍵，既在(B)項所述的兩個位置上形成二硫鍵，又在(O)項所述的兩個位置上形成二硫鍵；同理髮明中所述(C)項+(O)項，(M)項+(O)項，(B)項+(D)項+(O)項和(D)項+(M)項+(O)項等帶“+”的描述具有類似的解釋。

“序列一致性”定義為對比序列並在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分，候選序列中與特定肽或多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。可以業內技術範疇內的多種方式進行序列對比以測定百分比胺基酸序列同一性，例如使用公眾可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。業內熟習此項技術者可決定測量對比的適宜參數，包括對所比較的序列全長獲得最大對比所需的任何算法。

基於該發現，本申請提供下述技術方案。

1.一種熱穩定性植酸酶，其特徵在於，在野生型大腸桿菌植酸酶或突變型大腸桿菌植酸酶的胺基酸序列中包含至少一對引入的二硫鍵，所述野生型大腸桿菌植酸酶的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在至少1個位置上具有突變，並且，所述引入的二硫鍵選自：(A)與SEQ ID NO：1的第34位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第174位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(B)與SEQ ID NO：1的第56位對應的位置上的胺基酸殘基、且與SEQ ID NO：1的第103位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵； (C)與SEQ ID NO：1的第57位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第366位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(D)與SEQ ID NO：1的第61位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第366位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(E)與SEQ ID NO：1的第82位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第296位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(F)與SEQ ID NO：1的第128位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第203位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(G)與SEQ ID NO：1的第140位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第262位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(H)與SEQ ID NO：1的第156位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第191位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(I)與SEQ ID NO：1的第165位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第245位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(J)與SEQ ID NO：1的第191位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第210位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(K)與SEQ ID NO：1的第196位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第211位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(L)與SEQ ID NO：1的第264位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第312位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(M)與SEQ ID NO：1的第315位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第380位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵； (N)與SEQ ID NO：1的第322位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第356位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(O)與SEQ ID NO：1的第346位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第393位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(P)與SEQ ID NO：1的第349位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第390位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；條件是：(C)項和(D)項不同時滿足；(H)項和(J)項不同時滿足。

2.如實施例1所述的熱穩定性植酸酶，其中所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在至少1個下述位置上具有突變：1,25,30,36,37,38,39,46,55,60,62,65,69,70,73,74,75,76,77,79,80,85,101,108,109,111,114,116,118,120,123,126,127,133,137,138,139,141,142,146,151,157,159,161,173,176,178,180,183,184,185,186,187,188,189,204,211,233,235,245,253,255,267,276,282,283,284,286,287,288,291,295,297,311,315,317,318,327,341,354,363,367,369,370,380,382,383,385,391,402,408。

3.如實施例2所述的熱穩定性植酸酶，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有至少一個如下突變：Q1S,Q1V,Q1N,A25F,Q30K,A36K,W37F,P38Y,T39D,W46E,I55V,H60S,H60Q,Q62W,R65H,D69N,G70E,A73P,A73D,A73E,K74D,K74P,K74L,K74N,K75C,K75Q,G76T,C77A,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,S80P,I85V,A101L,C108A,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,T114H,T116A,T118R,T118S,S120R,P123E,N126Y,P127V,P127L,C133A,N137V,N137E,N137S, N137P,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141R,T141E,T141G,T141A,D142R,S146E,S146R,S151P,G157R,G157Q,G157N,G157L,G157A,R159Y,T161P,P173Y,P173S,N176P,N176K,C178A,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S187P,C188A,S189T,N204C,V211W,G233E,G235Y,T245E,Q253V,Y255D,R267A,H282N,P283G,P284T,K286F,Q287Y,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297T,G311S,E315G,E315S,N317L,W318Y,T327Y,L341Y,L341V,F354Y,K363A,K363L,S367F,N369P,T370P,A380P,A380R,A380T,C382A,E383S,R385S,R385V,R385T,C391A,E402R,E402T,E402D,E402P,E402N,C408A。

4.如實施例3所述的熱穩定性植酸酶，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有選自下組的任一突變組合：W46E,Q62W,A73P,K75C,S146E,R159Y,N204C,Y255D；A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K75C,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,Y255D；W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,G76T,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T；和A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T。

5.如實施例4所述的熱穩定性植酸酶，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有選自下組的任一突變組合：W46E,Q62W,A73P,K75C,S146E,R159Y,N204C,Y255D；A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K75C,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,Y255D；和W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,G76T,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T。

6.如實施例3所述的熱穩定性植酸酶，所述突變型大腸桿菌植酸酶的胺基酸序列為SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：99。

7.如實施例1-6中任一項所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述二硫鍵選自(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(J)、(M)或(O)中的至少一項，條件是(C)項和(D)項不同時滿足。

8.如實施例7所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足下組中的任意兩項、三項以上：(A)項、(B)項、(C)項、(D)項、(E)項、(J)項、(M)項和(O)項，條件是(C)項和(D)項不同時滿足。

9.如實施例7所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(A)項、(B)項、(C)項、(E)項、(J)項或(M)項。

10.如實施例7所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列至少滿足上述(D)項或(O)項。

11.如實施例10所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(D)項。

12.如實施例10所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(O)項。

13.如實施例7所述的熱穩定性植酸酶，其中所述胺基酸序列滿足上述(B)項和(O)項；(C)項和(O)項；(D)項和(O)項；(M)項和(O)項；(B)項、(D)項和(O)項；或(D)項、(M)項和(O)項。

14.如實施例13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(B)項和(O)項。

15.如實施例13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(C)項和(O)項。

16.如實施例13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(M)項和(O)項。

17.如實施例13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(B)項、(D)項和(O)項。

18.如實施例13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(D)項、(M)項和(O)項。

19.如實施例1-18中任一項所述的熱穩定性植酸酶，還進一步包含至少一對引入的二硫鍵，所述二硫鍵選自：(i)與SEQ ID NO：1的第31位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第176位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(ii)與SEQ ID NO：1的第31位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第177位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(iii)與SEQ ID NO：1的第52位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第99位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(iv)與SEQ ID NO：1的第59位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第100位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(v)與SEQ ID NO：1的第91位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第46位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(vi)與SEQ ID NO：1的第141位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第200位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(vii)與SEQ ID NO：1的第162位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第248位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵； (viii)與SEQ ID NO：1的第205位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第257位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；條件是：(i)項和(ii)項不同時滿足。

20.如實施例1所述的熱穩定性植酸酶，其中，該熱穩定性植酸酶包含選自下組的任一胺基酸序列：SEQ ID NOs：4-40、SEQ ID NOs：80-88和SEQ ID NOs：100-108。

21.如前述任一項實施例所述的熱穩定性植酸酶，其中，該熱穩定性植酸酶是通過在畢赤酵母或者黑麯黴宿主中異源表現而獲得的。

22.如前述任一項實施例所述的熱穩定性植酸酶，其中，能夠形成二硫鍵的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基或同型半胱胺酸殘基。

23.一種多核苷酸，其編碼如實施例1-22中任一項所述的熱穩定性植酸酶。

24.實施例23的多核苷酸，其編碼序列是為在畢赤酵母或者黑麯黴中表現而密碼子優化的。

25.實施例23的多核苷酸，其包含SEQ ID NOs：41-77、SEQ ID NOs：90-98和SEQ ID NOs：110-118中任一項所示的核苷酸序列。

26.一種宿主細胞，其包含實施例23-25中任一項所述的多核苷酸。

27.實施例26所述的宿主細胞，其中該宿主細胞是真菌細胞、細菌細胞或植物細胞。

28.實施例27所述的宿主細胞，其為酵母細胞或絲狀真菌細胞。

29.實施例28所述的宿主細胞，其為畢赤酵母細胞或者黑麯黴細胞。

30.一種提高植酸酶的熱穩定性的方法，其包括對感興趣的植酸酶的胺基酸序列或其編碼核酸序列進行改變，使得植酸酶的胺基酸序列中選自如下(A)至(P) 中的至少一項所述的兩個位置上的胺基酸殘基之間能夠形成二硫鍵：(A)與SEQ ID NO：1的第34位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第174位對應的位置；(B)與SEQ ID NO：1的第56位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第103位對應的位置；(C)與SEQ ID NO：1的第57位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第366位對應的位置；(D)與SEQ ID NO：1的第61位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第366位對應的位置；(E)與SEQ ID NO：1的第82位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第296位對應的位置；(F)與SEQ ID NO：1的第128位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第203位對應的位置；(G)與SEQ ID NO：1的第140位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第262位對應的位置；(H)與SEQ ID NO：1的第156位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第191位對應的位置；(I)與SEQ ID NO：1的第165位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第245位對應的位置；(J)與SEQ ID NO：1的第191位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第210位對應的位置；(K)與SEQ ID NO：1的第196位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第211位對應的位置；(L)與SEQ ID NO：1的第264位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第312位對應的位置；(M)與SEQ ID NO：1的第315位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第380位對應的位置；(N)與SEQ ID NO：1的第322位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第356位對應的位置；(O)與SEQ ID NO：1的第346位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第393位對應的位置；(P)與SEQ ID NO：1的第349位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第390位對應的位置；條件是(C)項和(D)項不同時被選擇；(H)項和(J)項不同時被選擇。

31.如實施例30所述的方法，其中，所述改變使得感興趣的植酸酶的胺基酸序列的如(A)項、(B)項、(C)項、(D)項、(E)項、(J)項、(M)項或(O)項中至少一項所述的兩個位置上的胺基酸殘基之間能夠形成二硫鍵，條件是(C)項和(D)項不同時被選擇。

32.如實施例31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如選自下組的任意兩項、三項以上所述的兩個位置上的胺基酸殘基之間能夠形成二硫鍵：(A)項、(B)項、(C)項、(D)項、(E)項、(J)項、(M)項和(O)項，條件是(C)項和(D)項不同時被選擇。

33.如實施例31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(A)項、(B)項、(C)項、(E)項、(J)項或(M)項中所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。

34.如實施例31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的至少如(D)項或(O)項中所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。

35.如實施例34所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(D)項所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。

36.如實施例34所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(O)項所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。

37.如實施例31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(B)項和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。

38.如實施例31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(C)項和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。

39.如實施例31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(M)項和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。

40.如實施例31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(B)項、(D)和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。

41.如實施例31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(D)項、(M)和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。

42.如實施例30-41中任一項所述的方法，其中感興趣的植酸酶來源於大腸桿菌，且包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列具有至少75%序列一致性的胺基酸序列。

43.如實施例42所述的方法，其中感興趣的植酸酶是野生型大腸桿菌植酸酶，較佳包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。

44.如實施例42所述的方法，其中感興趣的植酸酶是突變型大腸桿菌植酸酶，較佳包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。

45.如實施例30-44中任一項所述的方法，其中經過改變後的植酸酶包含選自下組的胺基酸序列、或者其編碼核酸包含編碼選自下組的胺基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NOs：4-40、SEQ ID NOs：80-88和SEQ ID NOs：100-108。

46.如實施例30-45中任一項所述的方法，其中該方法還包括生成包含經改造的胺基酸序列的植酸酶，並將其置於容許二硫鍵形成的環境中。

47.如實施例46所述的方法，其中生成包含經改造的胺基酸序列的植酸酶包括將編碼該植酸酶的多核苷酸在宿主細胞中表現。

48.如實施例47所述的方法，其中所述宿主細胞是真菌細胞，較佳酵母細胞或絲狀真菌細胞，更佳畢赤酵母細胞或黑麯黴細胞。

本發明的有益效果：

如本發明所述對植酸酶和突變體引入一對或多對二硫鍵，尤其是同時引入多對二硫鍵。本發明在野生型或突變型植酸酶中的引入至少一對二硫鍵，比野生型植酸酶的殘餘活力約提高了1-8倍。因此，本發明的技術方案可以提升植酸酶的酶活性質，特別是在於耐熱穩定性，耐蒸汽穩定性，制粒穩定性方面，顯著優於現有的野生型或者突變型植酸酶；相比于現有的引入二硫鍵的工程改造植酸酶，其耐熱穩定性也有顯著提高。

圖1是pPIC9K-WT質體圖譜。

圖2是顯示野生型及二硫鍵突變體熱穩定性測定結果的圖。

圖3是APPA-M1及突變體熱穩定性測定結果的圖。

圖4是APPAan-WT及突變體熱穩定性測定結果的圖。

圖5是APPA-M2及突變體熱穩定性測定結果圖。

實例1 構建二硫鍵突變體，畢赤酵母表現野生型和突變體

大腸桿菌植酸酶3D結構已發佈(參見Lim D et al,Nat Struct Biol.2000,7(2)：108-13)，根據3D結構文件PDB ID 1DKO作為參考，設計引入如下表所述二硫鍵。

野生型植酸酶胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其在畢赤酵母表現核酸序列如SEQ ID NO：78所示。表現載體為pPIC9K，使用釀酒酵母Alpha因子作為信號肽，野生型植酸酶表現質體pPIC9K-WT如圖1所示。

為構建上表所述突變體，分別設計引子進行PCR，引子如下表所示。

為引入A-Y的25對二硫鍵，以質體pPIC9K-WT為模板，使用F1/R2和F2/R1為引入對，分別進行兩個PCR擴增反應，擴增反應使用Phusion® High-Fidelity DNA聚合酶完成(New England Biolabs，貨號M0530L)，參照其說明書進行設置。在擴增完成後，加入DpnI內切酶(New England Biolabs)消化模板，隨後使用Gibson Assembly® Master Mix Kit(New England Biolabs，貨號E2611)進行片段重組，經測序確認突變體質體構建成功。突變體質體按照上表二硫鍵名稱分別命名為pPIC9K-A至pPIC9K-Y。

為了將植酸酶及突變體進行表現，參考Pichia expression kit(Invitrogen)說明書對畢赤酵母GS115和質體進行操作。具體如下，將畢赤酵母GS115菌株使用YPD培養基(1%酵母提取物、2%蛋白、2%葡萄糖和1.5%瓊脂)平板30℃培養48h後，挑取單克隆到4mL YPD液體培養基(1%酵母提取物、2%蛋白、2%葡萄糖)中，30度200RPM培養12h，隨後轉接到30mLYPD液體培養基的三角瓶中，30℃、220rpm培養4-5h，偵檢到OD600值在1.1-1.3範圍後，將培養液在4度9,000rpm離心2min，分別收集4mL菌體至滅菌EP管中，輕輕棄上清，用滅菌的濾紙吸幹殘留的上清後用預冷的1mL滅菌水重懸菌體，4℃、9,000rpm離心2min，棄上清。重複上述步驟，將預冷的1mL山梨醇(1mol/L)重懸菌體；4℃、9,000rpm離心2min，棄上清，預冷的100-150μl山梨醇(1mol/L)重懸菌體，至此感受態製備完成。將表現質體pPIC9K-WT和剩餘25個二硫鍵突變體用BglII 進行線性化，線性化片段純化回收後通過電穿孔法轉化上述畢赤酵母GS115感受態中，將混合物均勻塗布於MD平板上，30℃倒置培養2-3天，將平板上所有的菌落都用無菌水洗下來後塗布在含不同濃度遺傳黴素的YPD(0.5mg/mL-8mg/mL)平板上篩選多拷貝的轉化子。在MD平板上篩選得到畢赤酵母重組菌株命名為APPA-WT和APPA-A，APPA-B,APPA-C,APPA-D,APPA-E,APPA-F,APPA-G,APPA-H,APPA-I,APPA-J,APPA-K,APPA-L,APPA-M,APPA-N,APPA-O,APPA-P,APPA-Q,APPA-R,APPA-S,APPA-T,APPA-U,APPA-V,APPA-W,APPA-X和APPA-Y。將上述篩選獲得的克隆分別轉接於BMGY培養基中，在30℃、250rpm振盪搖床中培養24h，再轉入BMMY培養基中，維持30℃、250rpm條件，每天添加0.5%的甲醇，誘導表現120h後；9000-12000rpm離心10min以去除菌體，得到含植酸酶APPA-WT和其25個突變體的發酵上清液，SDS-PAGE結果顯示APPA-S,APPA-X和APPA-Y三個突變體未能表現，剩餘的22個突變體都有表現。

實例2 熱穩定性測定

植酸酶活力測定遵循GBT 18634-2009文件標準。將實例1中的23個樣品用水稀釋至100U/mL。取9mL水於25mL比色管中分別在80℃恒溫水浴中預熱，用移液槍吸取酶樣品1mL，快速加入到各對應試管中，混勻器快速混勻放置3min。迅速冷卻至室溫，用水進行稀釋，測定各樣品殘餘活力。從而計算不同處理溫度下的酶活存留率(熱處理前酶活定為100%)。熱穩定性數據如圖2所示，有一些突變體顯示出好的熱穩定性，APPA-B，APPA-C，APPA-D，APPA-M，APPA-O和APPA-P表現最好，與APPA相比，殘餘活力提高了20-25%左右，提高了約2-3倍。上述結果表明二硫鍵的引入對突變體有顯著影響，有的突變甚至導致了不能正常表現，如APPA-S,APPA-X和APPA-Y；另外一些特定二硫鍵引入會導致穩定性降低，如APPA-Q和APPA-V，上述兩個突變體導致了顯著低於野生型的熱穩定性；還有一些引入的二硫鍵對於酶結構穩定是有利的，如APPA-A至APPA-P，能夠提高野生型的抗熱能力。

實例3 突變體基礎上引入二硫鍵及測定其穩定性

Nov9X是野生型植酸酶經突變篩選獲得的耐熱優良突變體(如US7432098所述)，其在野生型基礎上引入8個突變，具體序列如SEQ ID NO：2所示。在Nov9X序列基礎上繼續引入其他突變，其序列變為SEQ ID NO：3所述，命名為APPA-M1，可以進一步提高其熱穩定性。為了測試實例1中描述的二硫鍵突變體是否在植酸酶突變體上也可以發揮功能，進一步提高穩定性。按照實例1中的方法在APPA-M1基礎上引入二硫鍵D，O，以及二硫鍵組合B+O，C+O，D+O，M+O，B+D+O和D+M+O，各突變體分別命名為APPA-M1-D，APPA-M1-O，APPA-M1-BO，APPA-M1-CO，APPA-M1-DO，APPA-M1-MO，APPA-M1-BDO和APPA-M1-DMO。同時根據US20170240872和US20130017185描述，在APPA-M1基礎上引入各自實例中最好的兩個突變體二硫鍵，分別命名為US20170240872-A，US20170240872-B，US20130017185-B和US20130017185-C。使用畢赤酵母表現各突變體，隨後按照實例2中的方法測定熱穩定性，不同參數在於85度條件下孵育3分鐘。結果如圖3所示，二硫鍵D和O都進一步提高了突變體的熱穩定性，而二硫鍵O對於APPA-M1突變體穩定性提高要比野生型APPA-WT提高更加有效，提高幅度高達35.5%。組合引入二硫鍵突變體APPA-M1-CO和APPA-M1-DO都表現出了與APPA-M1-O相似的穩定性，其他組合突變，如APPA-M1-BO、APPA-M1-MO、APPA-M1-BDO和APPA-M1-DMO則具有更高的穩定性，最好的APPA-M1-BO殘餘活力可達到77.2%，比APPA-M1提高了約1-1.5倍，具有顯著的耐熱特性，可以預見其在飼料制粒中會有良好表現，上述結果顯示出合適的組合可以創造出更穩定的突變體。在本方法下測定的US20170240872-A和US20170240872-B穩定性比APPA-M1提高1.1-8.7%，US20130017185-B和US20130017185-C穩定性提高5.0-14.8%，可以看到，發明人所提出的二硫鍵引入顯示出更加有效的結果。

實例4 黑麯黴表現大腸桿菌野生型植酸酶和引入二硫鍵突變體植酸酶

按照專利申請CN107353327的描述對大腸桿菌植酸酶野生型(SEQ ID NO：1)及突變體(A到P)進行表現，野生型植酸酶命名為APPAan-WT，各突變體分別按照APPAan-A到APPAan-P進行命名。獲得搖瓶上清液後按照實例2描述進行熱穩定性測定，不同參數在於85度條件下孵育3分鐘。實驗結果如圖4所示。我們發現黑麯黴表現的野生型植酸酶較畢赤酵母表現的酶體現出明顯的穩定性，這可能是由於他們的糖基化狀態不同造成的。實驗還發現突變體APPAan-P不能夠表現，APPAan-G表現出和WT差不多的穩定性，而APPAan-H穩定性顯著下降。剩餘的13個突變體都表現出顯著的穩定性性能提升，都表現出最低5%最高20.5%的提升。我們還發現穩定性提高的幅度與畢赤酵母中表現的突變體並不一致。上述結果表明，16個突變體至少在一種宿主細胞中表現並體現出比野生型較為優秀的穩定性，而合適地引入上述二硫鍵組合可以獲得更高穩定性的突變體。

實例5 植酸酶突變體引入二硫鍵後穩定性偵檢結果

Nov9X是野生型植酸酶經突變篩選獲得的耐熱優良突變體(如US7432098所述)，其在野生型基礎上引入8個突變，具體序列如SEQ ID NO：2所示。在Nov9X序列基礎上，根據文獻報道(Improving specific activity and thermostability of Escherichia coli phytase by structure-based rational design)繼續引入糖基化位點，其序列變為SEQ ID NO：79所述，命名為APPA-M2，可以進一步提高其熱穩定性。為了測試實例1中描述的二硫鍵突變體是否在植酸酶突變體APPA-M2上也可以發揮功能，進一步提高穩定性。按照實例1中的方法在APPA-M2基礎上引入二硫鍵B，C，D，M，O以及二硫鍵組合B+O，D+O，M+O，C+O，各突變體分別命名為APPA-M2-B，APPA-M2-C，APPA-M2-D，APPA-M2-M，APPA-M2-O，APPA-M2-BO，APPA-M2-DO,APPA-M2-MO和APPA-M2-CO。各突變體的胺基酸序列如SEQ ID NOs：80-88所示，對應的核苷酸序列如SEQ ID NOs：90-98所示。使用黑麯黴表現各突變體，隨後按照實例2中的方法測定熱穩定性。結果如圖5所示，該實驗中採用的二硫鍵都顯著的提高了突變體的熱穩定性，其中組合二硫鍵C+O效果最佳，其耐熱處理後殘餘活力可達到84.5%，具有顯著的耐熱特性，可以預見其在飼料制粒中會有良好表現，上述結果顯示出合適的組合可以創造出更穩定的突變體。上述結果顯示，發明人所提出的二硫鍵的引入對植酸酶突變體序列依舊顯示出非常有效的結果。

發明人也嘗試了在Nov9X序列基礎上，繼續引入糖基化位點，其序列如SEQ ID NO：99所示，命名為APPA-M3，也可以提高其熱穩定性。按照實例1中的方法在APPA-M3基礎上引入二硫鍵B，C，D，M，O以及二硫鍵組合B+O，D+O，M+O，C+O，各突變體分別命名為APPA-M3-B，APPA-M3-C，APPA-M3-D，APPA-M3-M，APPA-M3-O，APPA-M3-BO，APPA-M3-DO,APPA-M3-MO和 APPA-M3-CO。各突變體的胺基酸序列如SEQ ID NOs：100-108所示，對應的核苷酸序列如SEQ ID NOs：110-118所示。使用黑麯黴表現各突變體，按照實例2中的方法測定穩定性，發現引入二硫鍵的突變體與AMMA-M2引入二硫鍵的突變體一樣，具有較好的耐熱特性，同樣可以預見其在飼料制粒中會有良好的表現。

本發明所述方法的各種修飾和變型對於業內熟習此項技術者是顯而易見的，並不脫離本發明的範疇。儘管本發明結合特定實施例進行了描述，應當理解的是，要求保護的本發明並未不恰當地限定於這些特定較佳實施例。事實上，對業內熟習此項技術者顯而易見的用於實現本發明的所述技術效果的野生型植酸酶的各種突變修飾都包含在申請專利範圍的範疇內。

<110> 南京百斯傑生物工程有限公司

<120> 植酸酶突變體

<130> 1

<160> 118

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> 黑麯黴(Aspergillus niger)

<400> 1

<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NOV9X

<400> 2

<210> 3

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1

<400> 3

<210> 4

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-A

<400> 4

<210> 5

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-B

<400> 5

<210> 6

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-C

<400> 6

<210> 7

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-D

<400> 7

<210> 8

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-E

<400> 8

<210> 9

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-F

<400> 9

<210> 10

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-G

<400> 10

<210> 11

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-H

<400> 11

<210> 12

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-I

<400> 12

<210> 13

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-J

<400> 13

<210> 14

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-K

<400> 14

<210> 15

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-L

<400> 15

<210> 16

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M

<400> 16

<210> 17

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-N

<400> 17

<210> 18

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-O

<400> 18

<210> 19

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-P

<400> 19

<210> 20

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-D

<400> 20

<210> 21

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-O

<400> 21

<210> 22

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-BO

<400> 22

<210> 23

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-CO

<400> 23

<210> 24

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-DO

<400> 24

<210> 25

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-MO

<400> 25

<210> 26

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-BDO

<400> 26

<210> 27

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-DMO

<400> 27

<210> 28

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-A

<400> 28

<210> 29

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-B

<400> 29

<210> 30

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-C

<400> 30

<210> 31

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-D

<400> 31

<210> 32

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-E

<400> 32

<210> 33

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-F

<400> 33

<210> 34

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-I

<400> 34

<210> 35

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-J

<400> 35

<210> 36

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-K

<400> 36

<210> 37

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-L

<400> 37

<210> 38

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-M

<400> 38

<210> 39

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-N

<400> 39

<210> 40

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-O

<400> 40

<210> 41

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-A

<400> 41

<210> 42

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-B

<400> 42

<210> 43

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-C

<400> 43

<210> 44

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-D

<400> 44

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-E

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-F

<400> 46

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-G

<400> 47

<210> 48

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-H

<400> 48

<210> 49

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-I

<400> 49

<210> 50

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-J

<400> 50

<210> 51

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-K

<400> 51

<210> 52

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-L

<400> 52

<210> 53

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M

<400> 53

<210> 54

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-N

<400> 54

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-O

<400> 55

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-P

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-D

<400> 57

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-O

<400> 58

<210> 59

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-BO

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-CO

<400> 60

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-DO

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-MO

<400> 62

<210> 63

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-BDO

<400> 63

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M1-DMO

<400> 64

<210> 65

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-A

<400> 65

<210> 66

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-B

<400> 66

<210> 67

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-C

<400> 67

<210> 68

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-D

<400> 68

<210> 69

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-E

<400> 69

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-F

<400> 70

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<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-I

<400> 71

<210> 72

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-J

<400> 72

<210> 73

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-K

<400> 73

<210> 74

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-L

<400> 74

<210> 75

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-M

<400> 75

<210> 76

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-N

<400> 76

<210> 77

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPAan-O

<400> 77

<210> 78

<211> 1233

<212> DNA

<213> 黑麯黴(Aspergillus niger)

<400> 78

<210> 79

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2

<400> 79

<210> 80

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAPA-M2-B

<400> 80

<210> 81

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-C

<400> 81

<210> 82

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-D

<400> 82

<210> 83

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-M

<400> 83

<210> 84

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-O

<400> 84

<210> 85

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-BO

<400> 85

<210> 86

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-DO

<400> 86

<210> 87

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-MO

<400> 87

<210> 88

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-CO

<400> 88

<210> 89

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2

<400> 89

<210> 90

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-B

<400> 90

<210> 91

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAPA-M2-C

<400> 91

<210> 92

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAPA-M2-D

<400> 92

<210> 93

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-M

<400> 93

<210> 94

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-O

<400> 94

<210> 95

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAPA-M2-BO

<400> 95

<210> 96

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-DO

<400> 96

<210> 97

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M2-MO

<400> 97

<210> 98

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAPA-M2-CO

<400> 98

<210> 99

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3

<400> 99

<210> 100

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-B

<400> 100

<210> 101

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-D

<400> 101

<210> 102

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-M

<400> 102

<210> 103

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-O

<400> 103

<210> 104

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-C

<400> 104

<210> 105

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-BO

<400> 105

<210> 106

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-DO

<400> 106

<210> 107

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-MO

<400> 107

<210> 108

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-CO

<400> 108

<210> 109

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3

<400> 109

<210> 110

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-B

<400> 110

<210> 111

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-D

<400> 111

<210> 112

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-M

<400> 112

<210> 113

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-O

<400> 113

<210> 114

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-C

<400> 114

<210> 115

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-BO

<400> 115

<210> 116

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-DO

<400> 116

<210> 117

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-MO

<400> 117

<210> 118

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APPA-M3-CO

<400> 118

Claims

一種熱穩定性植酸酶，其在野生型大腸桿菌植酸酶或突變型大腸桿菌植酸酶的胺基酸序列中包含至少一對引入的二硫鍵，其中所述野生型大腸桿菌植酸酶的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在至少1個位置上具有突變，並且，所述引入的二硫鍵選自：(A)與SEQ ID NO：1的第34位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第174位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(B)與SEQ ID NO：1的第56位對應的位置上的胺基酸殘基、且與SEQ ID NO：1的第103位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(C)與SEQ ID NO：1的第57位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第366位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(D)與SEQ ID NO：1的第61位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第366位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(E)與SEQ ID NO：1的第82位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第296位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(F)與SEQ ID NO：1的第128位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第203位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(G)與SEQ ID NO：1的第140位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第262位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵； (H)與SEQ ID NO：1的第156位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第191位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(I)與SEQ ID NO：1的第165位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第245位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(J)與SEQ ID NO：1的第191位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第210位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(K)與SEQ ID NO：1的第196位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第211位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(L)與SEQ ID NO：1的第264位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第312位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(M)與SEQ ID NO：1的第315位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第380位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(N)與SEQ ID NO：1的第322位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第356位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(O)與SEQ ID NO：1的第346位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第393位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(P)與SEQ ID NO：1的第349位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第390位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；條件是：(C)項和(D)項不同時滿足；(H)項和(J)項不同時滿足。
如請求項1所述的熱穩定性植酸酶，其中所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，在至少1個下述位置上具有突變：1,25,30,36,37,38,39,46,55,60,62,65,69,70,73,74,75,76,77,79,80,85,101,108,109,111,114,116,118,120,123,126,127,133,137,138,139,141,142,146,151,157,159,161,173,176,178,180,183,184,185,186,187,188,189,204,211,233,235,245,253,255,267,276,282,283,284,286,287,288,291,295,297,311,315,317,318,327,341,354,363,367,369,370,380,382,383,385,391,402,408。
如請求項2所述的熱穩定性植酸酶，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有至少一個如下突變：Q1S,Q1V,Q1N,A25F,Q30K,A36K,W37F,P38Y,T39D,W46E,I55V,H60S,H60Q,Q62W,R65H,D69N,G70E,A73P,A73D,A73E,K74D,K74P,K74L,K74N,K75C,K75Q,G76T,C77A,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,S80P,I85V,A101L,C108A,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,T114H,T116A,T118R,T118S,S120R,P123E,N126Y,P127V,P127L,C133A,N137V,N137E,N137S,N137P,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141R,T141E,T141G,T141A,D142R,S146E,S146R,S151P,G157R,G157Q,G157N,G157L,G157A,R159Y,T161P,P173Y,P173S,N176P,N176K,C178A,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S187P,C188A,S189T,N204C,V211W,G233E,G235Y,T245E,Q253V,Y255D,R267A,H282N,P283G,P284T,K286F,Q287Y,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297T,G311S,E315G,E315S,N317L,W318Y,T327Y,L341Y,L341V,F354Y,K363A,K363L,S367F, N369P,T370P,A380P,A380R,A380T,C382A,E383S,R385S,R385V,R385T,C391A,E402R,E402T,E402D,E402P,E402N,C408A。
如請求項3所述的熱穩定性植酸酶，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有選自下組的任一突變組合：W46E,Q62W,A73P,K75C,S146E,R159Y,N204C,Y255D；A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K75C,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,Y255D；W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,G76T,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T；和A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T。
如請求項4所述的熱穩定性植酸酶，所述突變型大腸桿菌植酸酶與如SEQ ID NO：1所示的野生型大腸桿菌植酸酶相比，具有選自下組的任一突變組合：W46E,Q62W,A73P,K75C,S146E,R159Y,N204C,Y255D；A25F,W46E,Q62W,G70E,A73P,K75C,T114H,N137V,D142R,S146E,R159Y,Y255D；和W46E,Q62W,G70E,A73P,K74N,K75Q,G76T,S146E,R159Y,P173S,Y255D,H282N,P283G,P284T。
如請求項3所述的熱穩定性植酸酶，所述突變型大腸桿菌植酸酶的胺基酸序列為SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：99。
如請求項1-6中任一項所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述二硫鍵選自(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(J)、(M)或(O)中的至少一項，條件是(C)項和(D)項不同時滿足。
如請求項7所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足下組中的任意兩項、三項以上：(A)項、(B)項、(C)項、(D)項、(E)項、(J)項、(M)項和(O)項，條件是(C)項和(D)項不同時滿足。
如請求項7所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(A)項、(B)項、(C)項、(E)項、(J)項或(M)項。
如請求項7所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列至少滿足上述(D)項或(O)項。
如請求項10所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(D)項。
如請求項10所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(O)項。
如請求項7所述的熱穩定性植酸酶，其中所述胺基酸序列滿足上述(B)項和(O)項；(C)項和(O)項；(D)項和(O)項；(M)項和(O)項；(B)項、(D)項和(O)項；或(D)項、(M)項和(O)項。
如請求項13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(B)項和(O)項。
如請求項13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(C)項和(O)項。
如請求項13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(M)項和(O)項。
如請求項13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(B)項、(D)項和(O)項。
如請求項13所述的熱穩定性植酸酶，其中，所述胺基酸序列滿足上述(D)項、(M)項和(O)項。
如請求項1-18中任一項所述的熱穩定性植酸酶，還進一步包含至少一對引入的二硫鍵，所述二硫鍵選自：(i)與SEQ ID NO：1的第31位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第176位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(ii)與SEQ ID NO：1的第31位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第177位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(iii)與SEQ ID NO：1的第52位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第99位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(iv)與SEQ ID NO：1的第59位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第100位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(v)與SEQ ID NO：1的第91位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第46位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(vi)與SEQ ID NO：1的第141位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第200位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵； (vii)與SEQ ID NO：1的第162位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第248位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；(viii)與SEQ ID NO：1的第205位對應的位置上的胺基酸殘基、以及與SEQ ID NO：1的第257位對應的位置上的胺基酸殘基之間形成的二硫鍵；條件是：(i)項和(ii)項不同時滿足。
如請求項1所述的熱穩定性植酸酶，其中，該熱穩定性植酸酶包含選自下組的任一胺基酸序列：SEQ ID NOs：4-40、SEQ ID NOs：80-88和SEQ ID NOs：100-108。
如前述任一項請求項所述的熱穩定性植酸酶，其中，該熱穩定性植酸酶是通過在畢赤酵母或者黑麯黴宿主中異源表現而獲得的。
如前述任一項請求項所述的熱穩定性植酸酶，其中，能夠形成二硫鍵的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基或同型半胱胺酸殘基。
一種多核苷酸，其編碼如請求項1-22中任一項所述的熱穩定性植酸酶。
請求項23的多核苷酸，其編碼序列是為在畢赤酵母或者黑麯黴中表現而密碼子優化的。
請求項23的多核苷酸，其包含SEQ ID NOs：41-77、SEQ ID NOs：90-98和SEQ ID NOs：100-118中任一項所示的核苷酸序列。
一種宿主細胞，其包含請求項23-25中任一項所述的多核苷酸。
請求項26所述的宿主細胞，其中該宿主細胞是真菌細胞、細菌細胞或植物細胞。
請求項27所述的宿主細胞，其為酵母細胞或絲狀真菌細胞。
請求項28所述的宿主細胞，其為畢赤酵母細胞或者黑麯黴細胞。
一種提高植酸酶的熱穩定性的方法，其包括對感興趣的植酸酶的胺基酸序列或其編碼核酸序列進行改變，使得植酸酶的胺基酸序列中選自如下(A)至(P)中的至少一項所述的兩個位置上的胺基酸殘基之間能夠形成二硫鍵：(A)與SEQ ID NO：1的第34位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第174位對應的位置；(B)與SEQ ID NO：1的第56位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第103位對應的位置；(C)與SEQ ID NO：1的第57位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第366位對應的位置；(D)與SEQ ID NO：1的第61位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第366位對應的位置；(E)與SEQ ID NO：1的第82位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第296位對應的位置；(F)與SEQ ID NO：1的第128位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第203位對應的位置； (G)與SEQ ID NO：1的第140位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第262位對應的位置；(H)與SEQ ID NO：1的第156位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第191位對應的位置；(I)與SEQ ID NO：1的第165位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第245位對應的位置；(J)與SEQ ID NO：1的第191位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第210位對應的位置；(K)與SEQ ID NO：1的第196位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第211位對應的位置；(L)與SEQ ID NO：1的第264位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第312位對應的位置；(M)與SEQ ID NO：1的第315位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第380位對應的位置；(N)與SEQ ID NO：1的第322位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第356位對應的位置；(O)與SEQ ID NO：1的第346位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第393位對應的位置；(P)與SEQ ID NO：1的第349位對應的位置，以及與SEQ ID NO：1的第390位對應的位置；條件是(C)項和(D)項不同時被選擇； (H)項和(J)項不同時被選擇。
如請求項30所述的方法，其中，所述改變使得感興趣的植酸酶的胺基酸序列的如(A)項、(B)項、(C)項、(D)項、(E)項、(J)項、(M)項或(O)項中至少一項所述的兩個位置上的胺基酸殘基之間能夠形成二硫鍵，條件是(C)項和(D)項不同時被選擇。
如請求項31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如選自下組的任意兩項、三項以上，或者全部項中所述的兩個位置上的胺基酸殘基之間能夠形成二硫鍵：(A)項、(B)項、(C)項、(D)項、(E)項、(J)項、(M)項和(O)項，條件是(C)項和(D)項不同時被選擇。
如請求項31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(A)項、(B)項、(C)項、(E)項、(J)項或(M)項中所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。
如請求項31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的至少如(D)項或(O)項中所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。
如請求項34所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(D)項所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。
如請求項34所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(O)項所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。
如請求項31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(B)項和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。
如請求項31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(C)項和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。
如請求項31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(M)項和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。
如請求項31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(B)項、(D)和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。
如請求項31所述的方法，其中，所述改變使得所述胺基酸序列的如(D)項、(M)和(O)項分別所述的兩個位置上的胺基酸之間能夠形成二硫鍵。
如請求項30-41中任一項所述的方法，其中感興趣的植酸酶來源於大腸桿菌，且包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列具有至少75%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項42所述的方法，其中感興趣的植酸酶是野生型大腸桿菌植酸酶，較佳包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
如請求項42所述的方法，其中感興趣的植酸酶是突變型大腸桿菌植酸酶，較佳包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。
如請求項30-44中任一項所述的方法，其中經過改變後的植酸酶包含選自下組的胺基酸序列、或者其編碼核酸包含編碼選自下組的胺基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NOs：4-40、SEQ ID NOs：80-88和SEQ ID NOs：100-118。
如請求項30-45中任一項所述的方法，其中該方法還包括生成包含經改造的胺基酸序列的植酸酶，並將其置於容許二硫鍵形成的環境中。
如請求項46所述的方法，其中生成包含經改造的胺基酸序列的植酸酶包括將編碼該植酸酶的多核苷酸在宿主細胞中表現。
如請求項47所述的方法，其中所述宿主細胞是真菌細胞，較佳酵母細胞或絲狀真菌細胞，更佳畢赤酵母細胞或黑麯黴細胞。