TW202007405A - 靈芝複合多醣體組成物 - Google Patents

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Abstract

一種靈芝複合多醣體組成物，包含以重量百分比計為1至5%之一β-聚葡萄糖濃縮液、重量百分比1至5%之一靈芝菌絲體萃取液、重量百分比1至5%之一雲芝菌絲體萃取液、重量百分比1至5%之一白木耳萃取液、重量百分比1至5%之一黑木耳萃取液、重量百分比1至5%之一猴頭菇萃取液、重量百分比1至3%之一靈芝子實體萃取液以及水。

Description

靈芝複合多醣體組成物
本發明係與一種多醣體組成物有關；特別是指一種可以提升免疫功能之靈芝複合多醣體組成物。
存在於菇蕈類之多醣體，已知具有提升免疫功能之功效，以靈芝為例，長久以來即廣泛使用作為營養及保健食品之原料。β-葡聚醣(β-Glucan)為多醣體之一種，與多醣體之免疫功效極為相關。
以往多醣體保健產品有單一成分產品，亦有複方產品，而複方產品具有更佳的免疫調節功效，更能獲得消費者青睞。隨著現代社會消費者對保健食品的需求提升，亟待開發兼具風味及保健功效之複方多醣體產品。
有鑑於此，本發明之目的在於提供一種靈芝複合多醣體組成物，其可以提升免疫功能。
緣以達成上述目的，本發明提供的一種靈芝複合多醣體組成物，包含以重量百分比計為1至5%之一β-聚葡萄糖濃縮液、重量百分比1至5%之一靈芝菌絲體萃取液、重量百分比1至5%之一雲芝菌絲體萃取液、重量百分比1至5%之一白木耳萃取液、重量百分比1至5%之一黑木耳萃取液、重量百分比1至5%之一猴頭菇萃取液、重量百分比1至3%之一靈芝子實體萃取液以及水。
緣以達成上述目的，本發明另提供一種靈芝複合多醣體組成物的製造方法，包含將一黑酵母菌之菌體發酵產物、一靈芝菌之菌體發酵產物、一雲芝菌之菌體發酵產物、一白木耳之子實體粉末、一黑木耳之子實體粉末、一猴頭菇之子實體粉末及一靈芝之子實體粉末，分別與水以重量比10:1至40:1之比例各別混合成一混合物，再分別將前述混合物於70至100℃攪拌2至6小時，進行壓濾，去除固體，取其濾液進行濃縮並加熱滅菌後分別獲得一β-聚葡萄糖濃縮液、一靈芝菌絲體萃取液、一雲芝菌絲體萃取液、一白木耳萃取液、一黑木耳萃取液、一猴頭菇萃取液及一靈芝子實體萃取液，再將前述所有的萃取濃縮液進行調和以獲得該靈芝複合多醣體組成物。
本發明之效果在於，藉由複方多醣體組成物之綜合作用，有效提升特異性及非特異性之免疫功能。
為能更清楚地說明本發明，茲舉較佳實施例並配合圖式詳細說明如後。
本發明之靈芝複合多醣體組成物，係取自多種菇菌類的萃取液，主要配方包含一β-聚葡萄糖濃縮液、一靈芝菌絲體萃取液、一雲芝菌絲體萃取液、一白木耳萃取液、一黑木耳萃取液、一猴頭菇萃取液、一靈芝子實體萃取液以及水。
以下將說明本發明之靈芝複合多醣體組成物之製備方法。 (1) 自菌體發酵產物取得多醣體之方式 1.1 製備菌體發酵液 將菌種各別接種於碳源（例如葡萄糖或蔗糖）0.5至5.0重量百分比、氮源（例如酵母抽出物、酵母蛋白腖或大豆蛋白腖）0.1至1.5重量百分比及其他微量物質（例如微量元素及無機物）、酸鹼值介於5.0至6.5之間的一培養基中，於溫度20至30℃通氣攪拌培養2至7天後即可得到菌體發酵產物。 1.2 取得多醣體萃取液 將菌體發酵產物與水以重量比10:1至40:1之比例各別混合成一混合物後，於70至100℃攪拌該混合物2至6小時，將該混合物進行壓濾，去除固體，取其濾液進行濃縮，加熱滅菌，獲得多醣體萃取液。 (2) 自子實體取得多醣體之方式 2.1 製備子實體混合液 將子實體粉末與水以重量比10:1至40:1之比例各別混合成一混合物後，於70至100℃攪拌該混合物2至6小時。 2.2 取得多醣體萃取液 將前述混合物各別進行壓濾，去除固體，取其濾液進行濃縮，加熱滅菌，獲得多醣體萃取液。 (3) 多醣規格的測定方式 3.1 計算β-葡聚醣含量 將β-聚葡萄糖濃縮液加入適當體積的緩衝液混合均勻後，再依序加入α-澱粉酶(α-amylase)、蛋白水解酶(Protease)及澱粉葡萄糖苷酶(Amyloglucosidase)三種酵素處理後，以4倍體積的酒精進行沉澱，將β-葡聚醣自溶液中沉降分離出來，收集沉澱物以酒精清洗後乾燥，乾燥後的沉澱物以強酸和高溫水解處理，經酸鹼中和後測定葡萄糖，並計算β-葡聚醣含量。 3.2 檢測多醣體濃度 將靈芝菌絲體萃取液、雲芝菌絲體萃取液、白木耳萃取液、黑木耳萃取液、猴頭菇萃取液以及靈芝子實體萃取液分別稀釋至適當濃度，注入透析膜(規格：MW6000～8000)內，以流動水進行48小時透析(流速：0.2 L/min)，透析後的液體係使用苯酚-硫酸法(Phenol-sulfuric acid assay)測定多醣體濃度。當醣類遇到強酸時，結構式上的羥基與酚結合，會產生橘黃色液體，因此可用比色法測定吸光值以檢測其多醣體的濃度。 (4) 實例 本實例以黑酵母菌(Aureobasidium pullulans ，BCRC編號930184)、靈芝菌(Ganoderma lucidum )及雲芝菌(Trametes versicolor )之菌種，以及白木耳(Tremella fuciformis Berk )、黑木耳(Auricularia auricula-judae )、猴頭菇(Hericium erinaceus )及靈芝(Ganoderma lucidum )之子實體依照前述方式分別製備多醣體萃取液，並包含如下配方：
Figure 107125245-A0304-0001
如上表所示，本發明之靈芝複合多醣體組成物更可以包含以檸檬酸為例之調味劑、以乙醯磺胺酸鉀(即代糖-AK糖)為例之甜味劑，以及以柳橙濃縮汁為例之果汁濃縮汁。
本發明之靈芝複合多醣體組成物包含：以重量百分比計為3%之β-聚葡萄糖濃縮液、重量百分比3%之靈芝菌絲體萃取液、重量百分比2.5%之雲芝菌絲體萃取液、重量百分比3%之白木耳萃取液、重量百分比2.5%之黑木耳萃取液、重量百分比0.5%之猴頭菇萃取液、重量百分比0.2%之靈芝子實體萃取液、重量百分比0.13%之檸檬酸、重量百分比0.035%之乙醯磺胺酸鉀、重量百分比3.4%之柳橙濃縮汁以及水。
為評估本發明之靈芝複合多醣體組成物促進免疫細胞之增生能力，以下動物試驗分別就特異性及非特異性免疫調節功效進行評估。 (1) 特異性免疫調節功效 1.1 試驗組別設計及試驗物質投予劑量 選用7週齡之BALB/c雌性小鼠進行動物試驗，如表1所示，試驗組別設計有負對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組以及正常對照組，每組試驗動物隻數為10隻，其中負對照組僅投予滅菌水、低劑量組之試驗物質投予劑量為1倍人體建議劑量、中劑量組為2倍人體建議劑量、高劑量組為4倍人體建議劑量、正常對照組僅投予滅菌水。本發明之靈芝複合多醣體組成物之人體建議劑量為180 mL/day，根據2005年美國食品藥物管理局所公告之方法，動物與人體的每公斤體重劑量折算系數為12.3，依此法換算各組別小鼠投予劑量。將本發明之靈芝複合多醣體組成物以冷凍乾燥方式製備成粉末，以滅菌水配置試驗物質後，直接進行管餵投予。試驗動物於每日經口管餵方式給予試驗物質及負對照溶液（即滅菌水）一次，連續8週，投予體積為10 mL/kg，每日投予1次。
表1、試驗組別設計及試驗物質投予劑量
Figure 107125245-A0304-0002
 1.2 致敏小鼠 於投予試驗物質4週後，以卵白蛋白（Ovalbumin, OVA）做為免疫原致敏試驗小鼠，以腹腔注射方式給予100 μL之25 μg OVA及佛氏完全輔劑(complete Freund’s adjuvant)混合液，2週後再次腹腔注射100 μL之25 μg OVA及佛氏不完全輔劑(incomplete Freund’s adjuvant)混合液為追加致敏。試驗結束後犧牲小鼠，採取血液以及脾臟細胞進行免疫功能評估分析，包括測定免疫細胞增生、免疫細胞激素分泌、免疫細胞種類以及血清抗體濃度等，藉此評估本發明之靈芝複合多醣體組成物特異性免疫調節之功效。 1.3 試驗動物觀察 試驗期間，試驗動物之活動力、毛色及反應皆無異常，亦無任何脫毛、異常臨床症狀或死亡等情形。試驗開始時，各組平均體重約為17.3至17.8 g，試驗結束時，各組平均體重約為20.1至20.7 g。試驗期間各組別試驗動物之體重皆無明顯差異，如圖1所示。此外，脾臟與體重之相對重量在OVA誘導各組別皆顯著高於正常對照組，此乃OVA致敏所造成的現象。但在各OVA致敏組間（包含負對照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組）脾臟與體重之相對重量均無差異，如表2所示。
表2、試驗動物每週平均體重變化及脾臟與體重之相對重量比
Figure 107125245-A0304-0003
 1.4 免疫細胞增生試驗 於96孔盤中，加入定量為1.0×105 cells/well的脾臟細胞，以OVA刺激細胞，經培養72小時後，進行反應（CellTiter 96R Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay），利用OD490 nm測定吸光值，藉此評估試驗物質對於淋巴細胞增生之作用。試驗結果以刺激指數（Stimulation index, S.I.）表示，計算方式如下：Stimulation index（S.I.）=OVA刺激後OD490 nm/無裂殖素刺激OD490 nm。 如表3及圖2所示，脾臟免疫細胞經OVA刺激後，經OVA致敏的各組別包含負對照組、低劑量組、中劑量組以及高劑量組相較於正常對照組（亦即無OVA致敏）皆呈現顯著上升（p＜0.05）。在OVA致敏的小鼠方面，投予試驗物質的各個組別（包含低劑量組、中劑量組以及高劑量組）皆顯著高於負對照組（p＜0.05）。此結果表示，本發明之靈芝複合多醣體組成物具有促進OVA誘導的免疫細胞增生之功效。
表3、脾臟免疫細胞增生能力
Figure 107125245-A0304-0004
 1.5 細胞激素分析 於24孔盤中，加入定量為0.5至2×106 cells/well的脾臟細胞，加入25 μg/mL OVA，並於37℃、5%CO2 下培養48至72小時。收取細胞培養液，經離心（300×g、4℃、10分鐘）後取上清液，以ELISA Cytokine assay kit測定細胞激素包含細胞白介素-2（Interleukin-2, IL-2）、細胞白介素-4（Interleukin-4, IL-4）、細胞白介素-5（Interleukin-5, IL-5）、細胞白介素-10（Interleukin-10, IL-10）以及干擾素-γ（Interferon γ, IFN-γ）等之含量。另外，腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）則是於48小時OVA刺激後進行分析。藉此評估試驗物質對於淋巴細胞分泌細胞激素之影響。 1.5.1 IL-2分泌量 如表4及圖3所示，在無OVA刺激下，各組別自發性IL-2的分泌量均無顯著性差異（p＞0.05）。而在OVA誘導下，OVA致敏的各組別（包含負對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組）均顯著高於正常對照組（無OVA致敏）顯示OVA致敏模式成功。經OVA致敏的各組別中，經OVA刺激後與負對照組相比，IL-2均有顯著上升（p＜0.05），如圖4所示。此結果表示，本發明之靈芝複合多醣體組成物具有促進OVA誘導的IL-2分泌量之功效。
表4、細胞激素分泌含量
Figure 107125245-A0304-0005
 1.5.2 IL-4分泌量 再參照表4，在無OVA刺激下，各組別自發性IL-4的分泌量均無顯著性差異（p＞0.05）。而在OVA誘導下，OVA致敏的各組別（包含負對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組）均顯著高於正常對照組（無OVA致敏）顯示OVA致敏模式成功。經OVA誘導後，IL-4分泌量在OVA致敏的動物中不論負對照組、低劑量組、中劑量組以及高劑量組之間均無明顯差異（p＞0.05）。 1.5.3 IL-5分泌量 再參照表4，在無OVA刺激下，各組別自發性IL-5的分泌量均無顯著性差異（p＞0.05）。而在OVA誘導下，OVA致敏的各組別（包含負對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組）均顯著高於正常對照組（無OVA致敏）顯示OVA致敏模式成功。經OVA誘導後，IL-5分泌量在OVA致敏的動物中不論負對照組、低劑量組、中劑量組以及高劑量組之間均無明顯差異（p＞0.05）。 1.5.4 IL-10分泌量 再參照表4，在無OVA刺激下，各組別自發性IL-10的分泌量均無顯著性差異（p＞0.05）。而在OVA誘導下，OVA致敏的各組別（包含負對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組）均顯著高於正常對照組（無OVA致敏）顯示OVA致敏模式成功。經OVA誘導後，IL-10分泌量在OVA致敏的動物中不論負對照組、低劑量組、中劑量組以及高劑量組之間均無明顯差異（p＞0.05）。 1.5.5 TNF-α分泌量 再參照表4及圖3，在無OVA刺激下，各組別自發性TNF-α的分泌量均無顯著性差異（p＞0.05）。而在OVA誘導下，OVA致敏的各組別（包含負對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組）均顯著高於正常對照組（無OVA致敏）顯示OVA致敏模式成功。經OVA誘導後，與負對照組相比，TNF-α分泌量在在OVA致敏的動物中隨著劑量增加而有升高的趨勢，在高劑量組達到顯著性差異（p＜0.05），如圖5所示。 1.5.6 IFN-γ分泌量 再參照表4及圖3，在無OVA刺激下，各組別自發性IFN-γ的分泌量均無顯著性差異（p＞0.05）。而在OVA誘導下，OVA致敏的各組別（包含負對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組）均顯著高於正常對照組（無OVA致敏）顯示OVA致敏模式成功。經OVA誘導後，投予試驗物質的各組別與負對照組相比，IFN-γ均有顯著上升（p＜0.05），如圖6所示。此結果表示，本發明之靈芝複合多醣體組成物具有促進OVA誘導的IFN-γ分泌量之功效。 1.6 血液中抗體含量試驗 將全血離心後，收取血清，並保存於-80℃以供進一步分析OVA特異性抗體anti-OVA IgG2a、OVA特異性抗體anti-OVA IgG1以及OVA特異性抗體anti-OVA IgE的濃度。於4℃下被覆OVA 24小時，經清洗後，將血清檢體加入盤中（三重覆），於37℃下放置1小時。經含Tween 20的磷酸鹽緩衝食鹽水（Phosphate buffered saline with Tween 20, PBST）清洗後與標示有過氧化酶（Horseradish peroxidase, HRP）的二級抗體作用，並以SureBlue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate呈色。藉由檢測OD450 nm來定量血清中之抗體。OVA特異性抗體之結果以ELISA unit（EU）呈現，計算公式如下：ELISA Unit（EU）=（Asample –Ablank ）/（Apositive - Ablank ）。 如表5所示，因OVA致敏的關係，經OVA致敏的各組別包含負對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，其血清中anti-OVA IgG2a、anti-OVA IgG1以及anti-OVA IgE抗體均較正常對照組（無OVA致敏）高（p＜0.05），顯示OVA致敏模式成功。其中anti-OVA IgG2a在低劑量組、中劑量組以及高劑量組相較於其負對照組有顯著增加（p＜0.05），如圖7所示。此結果表示，本發明之靈芝複合多醣體組成物具有促進OVA致敏小鼠體內anti-OVA IgG2a抗體的生成。
表5、OVA特異性血清抗體生成
Figure 107125245-A0304-0006
 1.7 淋巴細胞表面標記分析試驗 取定量為5×105 cells/well的脾臟細胞，分別以標示有螢光的抗體進行免疫螢光染色，再以流式細胞儀分析T細胞（CD3+ /CD45+ ）、B細胞（CD19+ / CD45+ ）、T4細胞（CD4+ /CD3+ ）、T8細胞（CD8+ / CD3+ ）以及NK細胞（PanNK+ / CD45+ ）等淋巴細胞的比例，以觀察淋巴細胞次族群的變化。如表6所示，試驗動物之脾臟免疫細胞族群包含T細胞、B細胞、T4細胞、T8細胞以及NK細胞，於各試驗組別間均無差異。
表6、脾臟免疫細胞表面抗原標記分析
Figure 107125245-A0304-0007
Figure 107125245-A0304-0008
綜上所述，如表7所示，本發明之靈芝複合多醣體組成物具有促進OVA誘發的免疫細胞增生能力、增加血清anti-OVA IgG2a抗體的含量，此外，在OVA刺激作用下，可增加免疫細胞分泌IL-2、IFN-γ以及TNF-α之分泌，具有提升特異性免疫功能之功效。
表7、特異性免疫調節試驗結果總表
Figure 107125245-A0304-0009
 (2) 非特異性免疫調節功效 2.1 試驗組別設計及試驗物質投予劑量 選用7週齡之BALB/c雌性小鼠進行動物試驗，如表8所示，試驗組別設計有負對照組、低劑量組、中劑量組以及高劑量組，每組試驗動物隻數為10隻，其中負對照組僅投予滅菌水、低劑量組之試驗物質投予劑量為1倍人體建議劑量、中劑量組為2倍人體建議劑量、高劑量組為4倍人體建議劑量。本發明之靈芝複合多醣體組成物之人體建議劑量為180 mL/day，依動物與人體的每公斤體重劑量折算系數12.3換算各組別小鼠投予劑量。將本發明之靈芝複合多醣體組成物以冷凍乾燥方式製備成粉末，以滅菌水配置試驗物質後，直接進行管餵投予。試驗動物於每日經口管餵方式給予試驗物質及負對照溶液（即滅菌水）一次，連續6週，投予體積為10 mL/kg，每日投予1次。
表8、試驗組別設計及試驗物質投予劑量
Figure 107125245-A0304-0010
 於投予試驗物質6週後犧牲小鼠，採取血液、脾臟細胞以及腹腔吞噬細胞進行免疫功能評估分析，包括測定免疫細胞增生、吞噬細胞活性、自然殺手細胞活性、免疫細胞激素分泌、免疫細胞種類以及血清抗體濃度等，藉此評估本發明之靈芝複合多醣體組成物非特異性免疫調節之功效。 2.2 試驗動物觀察 試驗期間，試驗動物之活動力、毛色及反應皆無異常，亦無任何脫毛、異常臨床症狀或死亡等情形。試驗開始時，各組平均體重約為17.7至17.9 g，試驗結束時，各組平均體重約為19.8至20.6 g。試驗期間各組之動物體重皆有穩定上升，且各組別試驗動物之體重皆無明顯差異（p＞0.05），如圖8所示。此外，脾臟與體重之相對重量於各組間均無顯著差異，如表9所示。
表9、試驗動物每週平均體重變化及脾臟與體重之相對重量比
Figure 107125245-A0304-0011
 2.3 免疫細胞增生試驗 將定量為2.0×105 cells/well的脾臟細胞，分別以細胞裂殖素Concanavalin A (Con A)、lipopolysaccharide (LPS)刺激T細胞與B細胞的生長，經培養72小時後，進行反應（CellTiter 96R Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay），利用OD490 nm測定吸光值，藉此評估試驗物質對於淋巴細胞增生之作用。試驗結果以刺激指數（Stimulation index, S.I.）表示，計算方式如下：Stimulation index（S.I.）=OD490 nm裂殖素刺激後/OD490 nm無裂殖素刺激。 如表10及圖9所示，脾臟免疫細胞經Con A刺激後，低劑量組、中劑量組以及高劑量各組相較於負對照組皆呈現顯著上升（p＜0.05）；另外，脾臟免疫細胞經LPS刺激後，僅有高劑量組顯著高於負對照組。此結果表示，本發明之靈芝複合多醣體組成物具有促進免疫細胞增生之功效。
表10、脾臟免疫細胞增生能力
Figure 107125245-A0304-0012
 2.4 自然殺手細胞活性試驗 利用YAC-1細胞株（即小鼠淋巴瘤細胞）作為自然殺手細胞之標的，以PKH67 kit將YAC-1細胞標示上螢光，再以定量的脾臟細胞（含自然殺手細胞）與已標示螢光的YAC-1細胞依10：1及25：1的比例在37℃下共同培養4小時，最後加入50μL之Propidium iodine (PI) solution （0.1 mg/mL），再利用流式細胞儀進行分析，藉此分析自然殺手細胞之毒殺能力。 如表11及圖10所示，在自然殺手細胞與小鼠淋巴瘤YAC-1細胞比例（E/T ratio）為10：1及25：1之比例下，低劑量組、中劑量組以及高劑量組相較於負對照組皆顯著增高（p＜0.05）。此結果表示，本發明之靈芝複合多醣體組成物有助於增強自然殺手細胞活性。
表11、自然殺手細胞活性
Figure 107125245-A0304-0013
 2.5 吞噬細胞活性試驗 將定量之試驗動物腹腔吞噬細胞與標示螢光的E. coli 在感染劑量（Multiplicity of infection, M.O.I.）為12.5、25以及50的比例下，於37℃下共同培養2小時，使吞噬細胞進行吞噬E. coli 。作用完畢後，利用流式細胞儀偵測帶有螢光的吞噬細胞量，藉此評估吞噬細胞的吞噬活性。 如表12及圖11所示，在M.O.I.為12.5時，吞噬細胞活性在中劑量組以及高劑量組相較於負對照組均有顯著增加（p＜0.05）；在M.O.I.為25及50比例下，低劑量組、中劑量組以及高劑量組皆顯著高於負對照組（p＜0.05）。此結果表示，本發明之靈芝複合多醣體組成物有助於增加吞噬細胞活性。
表12、吞噬細胞活性
Figure 107125245-A0304-0014
 2.6 細胞激素分析試驗 取定量為0.5至1×106 cells/well的脾臟細胞分別加入Con A及LPS，並於37℃下培養。經72小時Con A或LPS刺激後，收取細胞培養液，經離心（300×g、4℃、10分鐘）後取上清液，以ELISA Cytokine assay kit測定細胞激素IL-2、IL-4、IL-5、IL-10以及IFN-γ含量。另外，TNF-α則是於48小時Con A或LPS刺激後進行分析。藉此評估試驗物質對於淋巴細胞分泌細胞激素之影響。 2.6.1 IL-2分泌量 如表13及圖12所示，在自發性IL-2分泌表現上（未加入細胞裂殖素），各試驗組與負對照組相比沒有明顯差異。脾臟免疫細胞經Con A刺激後，相較於負對照組，各試驗組的IL-2量皆有顯著性增加（p＜0.05），如圖13所示；而脾臟免疫細胞在LPS刺激下，高劑量組之IL-2分泌顯著高於負對照組（p＜0.05），如圖14所示。此結果表示，本發明之靈芝複合多醣體組成物具有使脾臟免疫細胞在細胞裂殖素刺激下有助於促進IL-2之分泌之功效。
表13、細胞激素分泌含量
Figure 107125245-A0304-0015
 2.6.2 IL-4分泌量 再參照表13，在自發性IL-4分泌表現上（未加入細胞裂殖素），各試驗組與負對照組相比沒有明顯差異。在Con A及LPS的刺激下，各試驗組之IL-4分泌情形相較於負對照組均無明顯差異（p＞0.05）。 2.6.3 IL-5分泌量 再參照表13，在自發性IL-5分泌表現上（未加入細胞裂殖素），各試驗組與負對照組相比沒有明顯差異。在Con A及LPS的刺激下，各試驗組之IL-5分泌情形相較於負對照組均無明顯差異（p＞0.05）。 2.6.4 IL-10分泌量 再參照表13，在自發性IL-10分泌表現上（未加入細胞裂殖素），各試驗組與負對照組相比沒有明顯差異。在Con A及LPS的刺激下，各試驗組之IL-10分泌情形相較於負對照組均無明顯差異（p＞0.05）。 2.6.5 TNF-α分泌量 再參照表13，在自發性TNF-α分泌表現上（未加入細胞裂殖素），各試驗組與負對照組相比沒有明顯差異。在經Con A及LPS刺激後，各試驗組的TNF-α量雖隨著劑量的增高有上升的趨勢，但相較於負對照組均無明顯差異（p＞0.05）。 2.6.6 IFN-γ分泌量 再參照表13及圖12，在自發性IFN-γ分泌表現上（未加入細胞裂殖素），各試驗組與負對照組相比沒有明顯差異。經Con A刺激後，各試驗組的IFN-γ量皆顯著高於負對照組（p＜0.05），如圖15所示；另外，在LPS刺激下，雖各試驗組有上升的趨勢，但相較於負對照組均未達顯著差異（p＞0.05），如圖16所示。 2.7 血液中抗體含量試驗 將血液離心（2200×g、15分鐘）後，收取血清，並利用Mouse IgM、IgE、IgA及IgG ELISA Quantitation Set測定血清中抗體濃度。如表14所示，在血清抗體方面，IgM、IgE、IgA及IgG在各試驗組間均無顯著性差異（p＞0.05）。
表14、血清抗體生成
Figure 107125245-A0304-0016
 2.8 淋巴細胞表面標記分析試驗 取定量為5×105 cells/well的脾臟細胞，分別以標示有螢光的抗體進行免疫螢光染色，再以流式細胞儀分析T細胞（CD3+ /CD45+ ）、B細胞（CD19+ / CD45+ ）、T4細胞（CD4+ /CD3+ ）、T8細胞（CD8+ / CD3+ ）以及NK細胞（PanNK+ / CD45+ ）等淋巴細胞的比例，以觀察淋巴細胞次族群的變化。如表15所示，試驗動物之脾臟免疫細胞族群包含T細胞、B細胞、T4細胞、T8細胞以及NK細胞，於各試驗組別間均無差異。
表15、脾臟免疫細胞表面抗原標記分析
Figure 107125245-A0304-0017
Figure 107125245-A0304-0018
綜上所述，如表16所示，本發明之靈芝複合多醣體組成物具有促進免疫細胞增生能力、提升吞噬細胞及自然殺手細胞活性，在細胞裂殖素刺激作用下，也可增加細胞激素IL-2及IFN-γ之分泌，具有提升非特異性免疫功能之功效。
表16、非特異性免疫調節試驗結果總表
Figure 107125245-A0304-0019
據上所述，本發明之靈芝複合多醣體組成物在服用後可提升特異性及非特異性之免疫功能。
以上所述僅為本發明較佳可行實施例而已，舉凡應用本發明說明書及申請專利範圍所為之等效變化，理應包含在本發明之專利範圍內。
無
圖１為特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物每週平均體重變化圖表； 圖２為特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物脾臟免疫細胞增生能力圖表； 圖３為特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物自發性細胞激素IL-2、TNF-α以及IFN-γ分泌量圖表； 圖４為特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物經OVA刺激後細胞激素IL-2分泌量圖表； 圖５為特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物經OVA刺激後細胞激素TNF-α分泌量圖表； 圖６為特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物經OVA刺激後細胞激素IFN-γ分泌量圖表； 圖７為特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物anti-OVA IgG2a抗體生成量圖表； 圖８為非特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物每週平均體重變化圖表； 圖９為非特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物脾臟免疫細胞增生能力圖表； 圖１０為非特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物自然殺手細胞活性圖表； 圖１１為非特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物吞噬細胞活性圖表； 圖１２為非特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物自發性細胞激素IL-2以及IFN-γ分泌量圖表； 圖１３為非特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物脾臟免疫細胞經Con A刺激後細胞激素IL-2分泌量圖表； 圖１４為非特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物脾臟免疫細胞經LPS刺激後細胞激素IL-2分泌量圖表； 圖１５為非特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物脾臟免疫細胞經Con A刺激後細胞激素IFN-γ分泌量圖表；以及 圖１６為非特異性免疫調節功能評估試驗之試驗動物脾臟免疫細胞經LPS刺激後細胞激素IFN-γ分泌量圖表。

Claims (10)

  1. 一種靈芝複合多醣體組成物，包含以重量百分比計為1至5%之一β-聚葡萄糖濃縮液、重量百分比1至5%之一靈芝菌絲體萃取液、重量百分比1至5%之一雲芝菌絲體萃取液、重量百分比1至5%之一白木耳萃取液、重量百分比1至5%之一黑木耳萃取液、重量百分比1至5%之一猴頭菇萃取液、重量百分比1至3%之一靈芝子實體萃取液以及水。
  2. 如請求項1所述之靈芝複合多醣體組成物，其中該β-聚葡萄糖濃縮液包含黑酵母菌之β-聚葡萄糖濃縮液。
  3. 如請求項1所述之靈芝複合多醣體組成物，包含一調味劑，其中該調味劑包含檸檬酸。
  4. 如請求項1所述之靈芝複合多醣體組成物，包含一甜味劑，其中該甜味劑包含乙醯磺胺酸鉀。
  5. 如請求項1所述之靈芝複合多醣體組成物，包含一果汁濃縮汁，其中該果汁濃縮汁包含柳橙濃縮汁。
  6. 如請求項1所述之靈芝複合多醣體組成物，其中該靈芝複合多醣體組成物包含粉末、飲品或膠囊形式。
  7. 一種靈芝複合多醣體組成物的製造方法，包含將一黑酵母菌之菌體發酵產物、一靈芝菌之菌體發酵產物、一雲芝菌之菌體發酵產物、一白木耳之子實體粉末、一黑木耳之子實體粉末、一猴頭菇之子實體粉末及一靈芝之子實體粉末，分別與水以重量比10:1至40:1之比例各別混合成一混合物，再分別將前述混合物於70至100℃攪拌2至6小時，進行壓濾，去除固體，取其濾液進行濃縮並加熱滅菌後分別獲得一β-聚葡萄糖濃縮液、一靈芝菌絲體萃取液、一雲芝菌絲體萃取液、一白木耳萃取液、一黑木耳萃取液、一猴頭菇萃取液及一靈芝子實體萃取液，再將前述所有的萃取液進行調和以獲得該靈芝複合多醣體組成物。
  8. 如請求項7所述之靈芝複合多醣體組成物的製造方法，其中該黑酵母菌之菌體發酵產物、該靈芝菌之菌體發酵產物或該雲芝菌之菌體發酵產物之製備步驟包含分別將一黑酵母菌之菌種、一靈芝菌之菌種或一雲芝菌之菌種接種於碳源0.5至5.0重量百分比、氮源0.1至1.5重量百分比及其他微量物質、酸鹼值介於5.0至6.5之間的一培養基中，於溫度20至30℃通氣攪拌培養2至7天。
  9. 如請求項7所述之靈芝複合多醣體組成物的製造方法，更包含以重量百分比計為3%之該β-聚葡萄糖濃縮液、重量百分比3%之該靈芝菌絲體萃取液、重量百分比2.5%之該雲芝菌絲體萃取液、重量百分比3%之該白木耳萃取液、重量百分比2.5%之該黑木耳萃取液、重量百分比0.5%之該猴頭菇萃取液以及重量百分比0.2%之該靈芝子實體萃取液的一比例進行調和之步驟。
  10. 如請求項7所述之靈芝複合多醣體組成物的製造方法，其中該β-聚葡萄糖濃縮液之多醣規格為10 g/L、該靈芝菌絲體萃取液之多醣規格為5 g/L、該雲芝菌絲體萃取液之多醣規格為5 g/L、該白木耳萃取液之多醣規格為10 g/L、該黑木耳萃取液之多醣規格為10 g/L、該猴頭菇萃取液之多醣規格為5 g/L以及該靈芝子實體萃取液之多醣規格為5 g/L。
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