TW201946936A - 藉由磷酸酶補充之受體抑制 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示藉由特定地將膜磷酸酶補充至相關受體鄰近處來調節細胞表面受體信號傳導之組合物及方法。此新穎方法稱為藉由磷酸酶補充之受體抑制(RIPR)，其代表藉由經由磷酸化機制傳導信號之受體降低及抑制信號之新方法。更特定言之，本發明提供經由補充磷酸酶活性特異性結合細胞表面受體且拮抗受體信號傳導之新穎多價蛋白結合分子。亦提供適用於產生此類分子之組合物及方法，以及用於治療與細胞表面受體介導之信號轉導之抑制相關之疾病的方法。

Description

藉由磷酸酶補充之受體抑制
本發明大體上係關於免疫治療劑之領域，且尤其關於經由補充磷酸酶活性特異性結合細胞表面受體且拮抗受體信號傳導之多價蛋白結合分子。本發明亦提供適用於產生此類分子之組合物及方法，以及用於治療與細胞表面受體介導之信號轉導之抑制相關之疾病的方法。
生物藥劑或包含治療蛋白之醫藥組合物之使用來治療疾病或健康狀況為多個醫藥及生物技術公司之核心策略。舉例而言，在癌症免疫療法中，研發活化宿主免疫系統之T細胞以預防殺滅癌細胞增殖之藥劑已顯現為補充現有護理標準之有前景的治療途徑。此類免疫療法途徑之實例包括研發用於調節免疫系統殺滅癌細胞之抗體。舉例而言，對於受體之特定活性之拮抗作用，最普遍的策略為藉由使用例如針對受體ECD之拮抗劑抗體，經由受體細胞外域(ECD)之間的配位體結合之阻斷。在此情形中，阻斷分子(例如拮抗劑抗體)藉由與天然配位體競爭結合至受體ECD起作用。此途徑之例證包括在美國及歐盟已批准用於治療諸如不可切除性或轉移性黑色素瘤及轉移性非小細胞肺癌之疾病的對免疫受體PD-1或其配位體PD-L1之ECD具有特異性的多種阻斷抗體。在另一實例中，抑制免疫抑制蛋白，諸如CTLA-4之努力已實現市售產品之研發及亦藉由結合至ECD且阻斷其結合至天然配位體起作用之抗CTLA-4阻斷抗體之臨床評估。然而，此等阻斷抗體已報導為在多個患者中無效，且不能夠消除受體之基礎細胞內信號傳導活性(亦稱為休眠細胞內信號傳導活性)，諸如經由磷酸化機制傳導信號之PD-1及其他受體之基礎信號傳導活性。此未能消除基礎信號傳導活性，常常限制ECD配位體阻斷策略之效果。因此，需要新方法來藉由除ECD配位體阻斷機制外之替代機制直接降低或消除此類受體之細胞內信號傳導，其將降低或消除休眠及配位體活化信號傳導兩者。舉例而言，相對於免疫檢查點受體，需要藉由完全移除檢查點阻塞實現T細胞活性之全部擴增。另外，需要新途徑來抑制其他受體，諸如細胞介素受體(其經由磷酸化機制傳導信號且其配位體阻塞已證明有限效果)之信號傳導。
因此，仍需要藉由抗體或其他藥劑之除直接受體-配位體阻塞外之替代途徑來補充癌症及其他免疫疾病之免疫療法之現有治療性護理標準。
本發明大體上係關於免疫治療劑，諸如多價多肽、多價抗體及包含其之醫藥組合物，其用於治療各種疾病，諸如與細胞表面受體所介導之細胞信號傳導之抑制相關的彼等疾病。如在下文更詳細地描述，本發明提供藉由經由例如使用多價藥劑直接接合將膜磷酸酶尤其補充至信號傳導相關受體之空間鄰近處來調節細胞表面受體信號傳導之組合物及方法。此新穎方法稱為「藉由磷酸酶補充之受體抑制」(Receptor Inhibition by Phosphatase Recruitment，RIPR)。更特定言之，本發明提供特異性結合細胞表面受體之新穎嵌合蛋白結合分子，由此經由補充磷酸酶活性完全或部分拮抗受體信號傳導。在一些特定實施例中，所揭示之嵌合蛋白結合分子為多價多肽。在一些實施例中，多價多肽為多價抗體。本發明亦提供適用於產生此類化合物之組合物及方法，以及用於治療與細胞表面受體介導之信號轉導之抑制相關之疾病的方法。
在一個態樣中，本文揭示一種多價多肽，其包括(i)第一胺基酸序列，其包括能夠結合至一或多種受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)之第一多肽模組；及(ii)第二胺基酸序列，其包括能夠結合至一或多種經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體之第二多肽模組，其中第一多肽模組可操作地連接至該第二多肽模組。
本發明之多價多肽之非限制性例示性實施例可包括以下特徵中之一或多者。在一些實施例中，第一多肽模組經由多肽連接子序列可操作地連接至第二多肽模組。在一些實施例中，第一及第二多肽模組中之至少一者包括用於蛋白結合配位體或抗原結合部分之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白結合配位體為細胞表面受體或RPTP或其任一者的功能變體之細胞介素、生長因子、受體細胞外域(ECD)。在一些實施例中，抗原結合部分選自由以下組成之群：抗原結合片段(Fab)、單鏈可變片段(scFv)、奈米抗體、VH 域、VL 域、單域抗體(dAb)、VNAR 域及VH H域、雙功能抗體或其功能片段。在一些實施例中，抗原結合部分包括重鏈可變區及輕鏈可變區。
在一些實施例中，一或多種RPTP包括CD45磷酸酶或其功能變體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括免疫檢查點受體、細胞介素受體或生長因子受體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括選自由抑制性檢查點受體及刺激性檢查點受體組成之群的免疫檢查點受體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括選自由以下組成之群的抑制性檢查點受體：PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD5、CD132、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、其任一者的功能變體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括選自由以下組成之群的刺激性檢查點受體：CD27、CD28、CD40、OX40、GITR、ICOS、CD137及其任一者的功能變體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體經由選自ITAM模體、ITSM模體、ITIM模體或用作磷酸化受質之相關細胞內模體的基於特定酪胺酸之模體來介導信號傳導。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體選自由以下組成之群：DAP10、DAP12、SIRPa、CD3、CD28、CD4、CD8、CD200、CD200R、ICOS、KIR、FcR、BCR、CD5、CD2、G6B、LIR、CD7、BTN及其任一者的功能變體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括細胞介素受體。在一些實施例中，細胞介素受體選自由以下組成之群：介白素受體、干擾素受體、趨化介素受體、生長激素受體、紅血球生成素受體(EpoR)、胸腺基質淋巴球生成素受體(TSLPR)、血小板生成素受體(TpoR)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)受體及顆粒球群落刺激因子(G-CSF)受體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括生長因子受體。在一些實施例中，生長因子受體為屬於選自由以下組成之群的TRK家族之酪胺酸受體激酶(TRK)：EGF受體家族(ErbB家族)、胰島素受體家族、PDGF受體家族、VEGF受體家族、FGF受體家族、CCK受體家族、NGF受體家族、HGF受體家族、Eph受體家族、AXL受體家族、TIE受體家族、RYK受體家族、DDR受體家族、RET受體家族、ROS受體家族、LTK受體家族、ROR受體家族及MuSK受體家族。在一些實施例中，生長因子受體為選自由以下組成之群的幹細胞生長因子受體(SCFR)或表皮生長因子受體(EGFR)：ErbB-1、ErbB-2 (HER2)、ErbB-3、ErbB-4及c-Kit (CD117)。
在一些實施例中，多肽連接子序列包括1至100個胺基酸殘基。在一些實施例中，多肽連接子包括至少一個甘胺酸殘基。在一些實施例中，多肽連接子包括甘胺酸-絲胺酸連接子。在一些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區經由一或多個安置於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的介入胺基酸殘基彼此可操作地連接。在一些實施例中，介入胺基酸殘基包括1至100個胺基酸殘基。在一些實施例中，介入胺基酸殘基包括至少一個甘胺酸殘基。在一些實施例中，介入胺基酸殘基包括甘胺酸-絲胺酸連接子。
本文所揭示之一些實施例係關於一種多價多肽，其在N端至C端方向上包括(a)域A，其包括對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之重鏈可變區之結合區；(b)域B，其包括對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之輕鏈可變區之結合區；(c)域C，其包括對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之重鏈可變區之結合區；及(d)域D，其包括對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之輕鏈可變區之結合區。在一些實施例中，根據本發明之此態樣之多價多肽進一步包括信號肽之胺基酸序列。在一些實施例中，在一些實施例中，根據此態樣之多價多肽包括與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、10、12、14、16、20、22、24、26、28及54。
在一個態樣中，本文所揭示之一些實施例係關於一種多價抗體或其功能片段，其包括(i)對一或多種受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)具有特異性的第一多肽模組，及(ii)對一或多種經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體具有特異性的第二多肽模組，其中第一多肽模組可操作地連接至第二多肽模組。
本發明之多價多肽之非限制性例示性實施例可包括以下特徵中之一或多者。在一些實施例中，第一多肽模組經由多肽連接子序列可操作地連接至第二多肽模組。在一些實施例中，第一及第二多肽模組中之至少一者包括用於蛋白結合配位體或抗原結合部分之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原結合部分選自由以下組成之群：抗原結合片段(Fab)、單鏈可變片段(scFv)、奈米抗體、VH 域、VL 域、單域抗體(sdAb)、VNAR 域及VH H域或其功能片段。在一些實施例中，抗原結合部分包括重鏈可變區及輕鏈可變區。
在一些實施例中，一或多種RPTP包括CD45或其功能變體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括免疫檢查點受體、細胞介素受體或生長因子受體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括選自由抑制性檢查點受體及刺激性檢查點受體組成之群的免疫檢查點受體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括選自由以下組成之群的抑制性檢查點受體：PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD5、CD132、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA及其任一者的功能變體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體包括選自由以下組成之群的刺激性檢查點受體：CD27、CD28、CD40、OX40、GITR、ICOS、CD137及其任一者的功能變體。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體經由選自ITAM模體、ITSM模體、ITIM模體或用作磷酸化受質之相關細胞內模體的基於特定酪胺酸之模體來介導信號傳導。在一些實施例中，一或多種細胞表面受體選自由以下組成之群：DAP10、DAP12、SIRPa、CD3、CD28、CD4、CD8、CD200、CD200R、ICOS、KIR、FcR、BCR、CD5、CD2、G6B、LIR、CD7、BTN及其任一者的功能變體。在一些其他實施例中，細胞表面受體為細胞介素受體。在一些實施例中，細胞介素受體選自由以下組成之群：介白素受體、干擾素受體、趨化介素受體、生長激素受體、紅血球生成素受體(EpoR)、胸腺基質淋巴球生成素受體(TSLPR)、血小板生成素受體(TpoR)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)受體、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)受體。在又一些其他實施例中，細胞表面受體為生長因子受體。在一些實施例中，生長因子受體為屬於選自由以下組成之群的TRK家族之酪胺酸受體激酶(TRK)：EGF受體家族(ErbB家族)、胰島素受體家族、PDGF受體家族、VEGF受體家族、FGF受體家族、CCK受體家族、NGF受體家族、HGF受體家族、Eph受體家族、AXL受體家族、TIE受體家族、RYK受體家族、DDR受體家族、RET受體家族、ROS受體家族、LTK受體家族、ROR受體家族及MuSK受體家族。在一些實施例中，生長因子受體為選自由以下組成之群的幹細胞生長因子受體(SCFR)或表皮生長因子受體(EGFR)：ErbB-1、ErbB-2 (HER2)、ErbB-3、ErbB-4及c-Kit (CD117)。
在本發明之一些實施例中，多肽連接子序列包括1至100個胺基酸殘基。在一些實施例中，多肽連接子包括至少一個甘胺酸殘基。在一些實施例中，多肽連接子包括甘胺酸-絲胺酸連接子。
在一些實施例中，抗原結合部分之重鏈可變區及輕鏈可變區經由一或多個安置於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的介入胺基酸殘基彼此可操作地連接。在一些實施例中，介入胺基酸殘基包括1至100個胺基酸殘基。在一些實施例中，介入胺基酸殘基包括至少一個甘胺酸殘基。在一些實施例中，介入胺基酸殘基包括甘胺酸-絲胺酸連接子。
本文所揭示之一些實施例係關於在N端至C端方向上包括以下之多價抗體：(a)域A，其包括對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之重鏈可變區之結合區；(b)域B，其包括對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之輕鏈可變區之結合區；(c)域C，其包括對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之重鏈可變區之結合區；及(d)域D，其包括對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之輕鏈可變區之結合區。在一些實施例中，根據本發明之此態樣之多價抗體進一步包括信號肽之胺基酸序列。在一些實施例中，根據此態樣之多價抗體包括與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、10、12、14、16、20、22、24、26、28及54。
在另一態樣中，本文所揭示之一些實施例係關於一種醫藥組合物，其包括(i)如本文所揭示之多價多肽；或(ii)如本文所揭示之多價抗體；及醫藥可接受之賦形劑。
在其他態樣中，本文揭示之一些實施例係關於一種重組核酸分子，該核酸分子包括編碼包括以下之多肽之核苷酸序列：(i)與如本文所揭示之多價多肽之胺基酸序列具有至少80%一致性的胺基酸序列；或(ii)與如本文所揭示之多價抗體或其功能片段具有至少80%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與選自由以下組成之群的核苷酸序列具有至少80%序列一致性：SEQ ID NO: 1、3、5、9、11、13、15、19、21、23、25、27及53。在一些相關實施例中，本發明進一步提供包括如本文所揭示之重組核酸分子之表現卡匣或載體。
在另一態樣中，本文所揭示之一些實施例係關於一種包括如本文所揭示之核酸分子之重組細胞。根據此態樣之重組細胞包括一種核酸分子，其包括編碼包括以下之多肽之核苷酸序列：(i)與如本文所揭示之多價多肽之胺基酸序列具有至少80%一致性的胺基酸序列；或(ii)與如本文所揭示之多價抗體或其功能片段具有至少80%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與選自由以下組成之群的核苷酸序列具有至少80%序列一致性：SEQ ID NO: 1、3、5、9、11、13、15、19、21、23、25、27及53。在另一相關態樣中，本文所揭示之一些實施例係關於包括如本文所揭示之一或多種重組細胞之細胞培養物。
在另一態樣中，本文揭示用於產生包括以下之多肽或多價抗體之方法之實施例：(i)如本文所揭示之多價多肽，或(ii)如本文所揭示之多價抗體。在一些實施例中，根據此態樣之方法活體外、活體內或離體進行。
在另一態樣中，本文揭示在個體內調節經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體所介導之細胞信號傳導之方法之實施例，該方法包括向該個體投與包括有效量之(i)如本文所揭示之多價多肽或(ii)如本文所揭示之多價抗體的第一療法。
在又另一態樣中，本文揭示用於治療有需要個體之疾病之方法之實施例，該方法包括向該個體投與包括有效量之(i)如本文所揭示之多價多肽或(ii)如本文所揭示之多價抗體的第一療法。
本發明之方法之實施例之非限制性例示性實施例可包括以下特徵中之一或多者。在一些實施例中，投與多價多肽或多價抗體補充受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)活性至細胞表面受體之空間鄰近處且降低細胞表面受體之磷酸化水準。在一些實施例中，投與多價多肽或多價抗體賦予個體中之免疫檢查點受體之降低的活性。在一些實施例中，投與多價多肽或多價抗體賦予個體中之T細胞活性增強。在一些實施例中，投與多價多肽或多價抗體賦予個體中之T細胞活性抑制。在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物為人類。在一些實施例中，個體患有或疑似患有與細胞表面受體所介導之細胞信號傳導之抑制相關的疾病。在一些特定實施例中，疾病為癌症或慢性感染。
在一些實施例中，所揭示之治療方法進一步包括向該個體投與第二療法。在一些實施例中，第二療法選自由以下組成之群：化學療法、放射線療法、免疫療法、激素療法、毒素療法及手術。在一些實施例中，第一療法及第二療法同時投與。在一些實施例中，第一療法與第二療法同時投與。在一些實施例中，第一療法及第二療法依次投與。在一些實施例中，第一療法在第二療法之前投與。在一些實施例中，第一療法在第二療法之後投與。在一些實施例中，第一療法在第二療法之前及/或之後投與。在一些實施例中，第一療法及第二療法輪流投與。在一些實施例中，第一治療劑及第二療法在單一調配物中一起投與。
除非實施例或態樣之上下文中明確地或清楚地排除，否則本文所描述之態樣及實施例中之每一者能夠一起使用。
前述發明內容僅為說明性的，且不意欲以任何方式進行限制。除了本文所描述之說明性實施例及特徵之外，本發明之其他態樣、實施例、目標及特徵將自圖式及具體實施方式及申請專利範圍變得完全顯而易見的。
關於聯邦政府贊助研發之聲明
本發明係在美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予之授權號CA177684下利用政府支持進行的。政府在本發明中具有某些權利。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年5月17日申請之美國臨時專利申請案第62/673,049號之優先權。上文提及之申請案之揭示內容在本文中以全文引用之方式明確地併入，包括任何圖式。
序列表之併入
隨附序列表中之材料在此以引用之方式併入至本申請案中。命名為078430-504001WO_Sequence Listing.txt之隨附序列表文本文件在2019年5月8日產生且為102 KB。
本發明大體上係關於分子生物學免疫學及醫學之領域，包括藉由將膜磷酸酶尤其補充至相關受體之空間鄰近處調節細胞表面受體信號傳導之新穎方法(稱為RIPR)之組合物及方法。用於抑制受體信號傳導之此方法代表ECD配位體阻塞之替代途徑，且因此一般為受體拮抗作用之新範例。更特定言之，本發明提供完全或部分經由補充磷酸酶活性而特異性結合細胞表面受體且拮抗受體信號傳導之新穎嵌合蛋白結合分子。在一些實施例中，經由物理接合實現磷酸酶之補充。在本發明之一些實施例中，嵌合蛋白結合分子為多價多肽(例如二價或三價)，其包括能夠結合至受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)之第一多肽片段及能夠結合至經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體之第二多肽片段。本發明亦關於適用於產生此類多價(例如雙特異性)蛋白結合分子之組合物及方法，以及用於治療與細胞表面受體介導之信號轉導之抑制相關的疾病之方法。
如在下文更詳細地描述，本發明尤其提供各自展現對至少兩種細胞靶標之結合親和力之經工程改造之多價多肽：受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)及經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體。不受任何特定理論束縛，咸信，多價多肽將由RPTP編碼之磷酸酶活性補充至細胞表面受體之空間鄰近處，隨後降低其磷酸化。亦相信，多價分子藉由結合至細胞表面受體之細胞外域及跨膜磷酸酶之細胞外域來促進調節經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體之活性以使得細胞表面受體及磷酸酶之細胞內域足夠貼近，從而使得磷酸酶之細胞內域使細胞表面受體(或相關磷酸化分子)之細胞內域去磷酸化，由此降低細胞表面受體之活性。在檢查點受體且其中RPTP為CD45之情況下，結合至檢查點受體之細胞外域之模組接合至結合至受體蛋白酪胺酸磷酸酶CD45之細胞外域的模組使得T細胞信號傳導增強。亦相信，不受任何特定理論束縛，降低「免疫檢查點」受體之活性預期增強T細胞活性且用作廣泛範圍的疾病，包括癌症及慢性感染之療法。此新穎途徑略過經由配位體阻塞調節細胞受體功能之現用傳統策略，而是藉由受體細胞內域之去磷酸化調節細胞受體功能。
已認識到，調節細胞表面受體之現用臨床選項限於ECD阻斷抗體，其阻斷受體-配位體相互作用在細胞表面處發生。舉例而言，在諸如PD-1之抑制性受體之情況下，阻斷與高親和力抗體之細胞外PD-1/PD-L1相互作用迄今為止已為降低PD-1信號傳導之唯一可用手段。然而，抗體阻斷不會直接影響PD-1磷酸化，且重要的是，不會逆轉PD-1之基礎基態磷酸化。如在下文更詳細地描述，本發明人已甚至在PD-L1不存在下展示，PD-1使T細胞活化降低幾乎50%。不受任何特定理論束縛，咸信，現有阻斷抗體不能夠完全消除PD-1基礎信號傳導以便恢復全部T細胞活性，如藉由T細胞活化標記物CD69及CD25之較高水準以及IFNγ及IL-2細胞介素釋放之較高水準所測定。如本發明之一些實施例中所描述，新經工程改造之多價抗體藉由直接補充磷酸酶以使PD-1去磷酸化來解決此問題。此處，本發明展示在PD-1配位體(例如PD-L1)存在或不存在下CD45補充能夠消除PD-1誘發之耗盡表型。因此，磷酸酶，且尤其CD45補充至相關受體代表調節相關細胞表面受體之活性之新穎方式。
本文所揭示之途徑表示若干優點。磷酸酶活性補充至相關靶標之概念為極其模組化且通用的，且在原則上可容易適於靶向多種受體。舉例而言，靶向磷酸酶可選自相關細胞中表現之表面磷酸酶之組(Alonso等人, 2004；Neel及Tonks, 1997)。另外，經由酪胺酸磷酸化傳導信號之多個受體可以類似方式靶向。適合的受體之非限制性實例包括生長因子受體、細胞介素受體及其他檢查點抑制劑。此外，藉由改變本發明之多價多肽(下文亦稱為「RIPR分子」)內結合模組之定向及空間鄰近度之方法，受體抑制程度亦可自完全抑制調整至部分抑制。
通用實驗程序
除非另外指明，否則本發明之實施將採用熟習此項技術者已知之分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學及免疫學之習知技術。此類技術解釋於諸如以下之文獻中：Molecular Cloning: A Laboratory Manual ,第四版 (Sambrook等人, 2012)及Molecular Cloning: A Laboratory Manual ,第三版(Sambrook及Russel, 2001) (在本文中聯合稱為「Sambrook」)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編, 1987,包括直至2014年之增刊)；PCR: The Polymerase Chain Reaction , (Mullis等人編, 1994)；Beaucage等人編,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry , John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000 (包括直至2014年之增刊),Gene Transfer and. Expression in Mammalian Cells (Makrides編, Elsevier Sciences B.V., Amsterdam, 2003)及Current Protocols in Immunology (Horgan K及S. Shaw (1994) (包括直至2014年之增刊)。按需要，除非另外指出，否則涉及市售可得之套組及試劑之使用的程序一般根據製造商所定義之協定及/或參數進行。
定義
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術術語、符號及其他科學術語或術語集意欲具有涉及本發明之熟習此項技術者通常理解的含義。在一些情況下，出於清楚起見及/或方便參考，在本文中定義具有通常所理解含義之術語，且本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與此項技術中通常所理解存在實質性差異。熟習此項技術者能很好理解且通常使用習知方法論來使用本文中描述或參考之許多技術及程序。
除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個參考物。舉例而言，術語「細胞」包括一或多種細胞，包含其混合物。在本文中使用「A及/或B」來包括以下所有替代形式：「A」、「B」、「A或B」及「A及B」。
如本文所使用，術語「約」具有大致之其一般含義。若，近似程度自上下文並非另外明顯，則「約」意謂在所提供之值之加或減10%內，或捨入至最接近顯著數字，在所有情況下包括所提供之值。在提供範圍的情況下，其包括邊界值。
如本文所使用，術語「投與(administration)」及「投與(administering)」係指藉由包括(但不限於)以下之投與途徑遞送生物活性組合物或調配物：經口、靜脈內、動脈內、肌肉內、腹膜內、皮下、肌肉內及局部投與或其組合。術語包括(但不限於)藉由醫療專業人士投與及自投與。
如本文所使用，術語「抗體」係指一般已知為特異性結合至其他分子之特定空間及極性組織且由此定義為與其互補之免疫球蛋白的一類蛋白質。術語抗體包括全長單株抗體(單抗)，諸如IgG2單株抗體，其包括免疫球蛋白Fc區。術語抗體亦包括多價抗體、雙功能抗體、單鏈抗體、單鏈可變片段(scFvs)及抗體片段，諸如Fab、F(ab')2及Fv。在該抗體為多價抗體之情況下，多價抗體可呈多種不同格式。抗體可為單株或多株抗體且可藉由此項技術中熟知之技術製備，諸如宿主免疫及血清採集(多株)，或藉由製備連續雜交細胞株且採集所分泌之蛋白質(單株)，或藉由選殖及表現至少編碼天然抗體特異性結合所需之胺基酸序列的核苷酸序列或其突變誘發型式。因而，抗體可包括完全免疫球蛋白或其片段，該等免疫球蛋白包括各種類別及同型，諸如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3、IgM等。其片段可包括Fab、Fv及F(ab')2、Fab'及其類似物。另外，適當時可使用免疫球蛋白或其片段之聚集物、聚合物及共軛物，只要維持對特定目標之結合親和力即可。
術語「癌症」或「腫瘤」在本文中可互換使用。此等術語係指存在具有引起癌症之細胞的典型特徵，諸如不受控之增殖、不滅性、轉移潛力、快速生長及增殖速率及某些特徵性形態特徵的細胞。癌細胞通常呈腫瘤形式，但此類細胞可單獨存在於動物個體內，或可為非致瘤癌細胞，諸如白血病細胞。此等術語包括實體腫瘤、軟組織腫瘤或轉移性病灶。如本文所使用，術語「癌症」包括癌前以及惡性癌症。在一些實施例中，癌症為實體腫瘤、軟組織腫瘤或轉移性病灶。
如本文所使用，術語「嵌合」多肽係指包含至少兩種彼此可操作地連接之胺基酸序列(其在自然界中並非天然連接)之多肽。胺基酸序列可通常存在於一起結合於嵌合多肽中之單獨蛋白質中，或其可通常存在於相同蛋白質中，但以新配置置放於嵌合多肽中。嵌合多肽可例如藉由化學合成，或藉由產生及轉譯肽區以所需關係編碼之聚核苷酸而產生。
如本文所使用，術語「細胞」、「細胞培養物」、「細胞株」、「重組宿主細胞」、「受體細胞」及「宿主細胞」包括初代個體細胞及其任何後代，不考慮傳遞次數。應理解，並非所有後代均與親本細胞恰好一致(歸因於故意或無意突變或環境差異)；然而，此類改變的後代包括於此等術語中，只要後代保留與原始轉型細胞相同的功能即可。
如本文所使用，術語「構築體」意欲意謂任何重組核酸分子，諸如衍生自任何來源、能夠基因組整合或自主複製之表現卡匣、質體、黏質體、病毒、自主複製聚核苷酸分子、噬菌體或線形或環形單股或雙股DNA或RNA聚核苷酸分子，包括其中一或多個核酸序列已以功能上可操作之方式連接，例如可操作地連接之核酸分子。
本發明之個體多價多肽或多價抗體之術語「有效量」、「治療有效量」或「醫藥學上有效量」通常係指相對於組合物之不存在對於組合物實現所陳述之目的足夠的量(例如實現投與作用、治療疾病、降低信號傳導路徑或減輕疾病或病況之一或多個症狀)。「有效量」之一個實例為足以促進治療、預防或減輕疾病之一或多個症狀之量，其亦可稱為「治療有效量」。症狀「減輕」意謂症狀之嚴重程度或頻率降低或症狀消除。包括「治療有效量」之組合物之精確量將視治療目的而定，且將可由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第1卷至第3卷, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar, Dosage Calculations (1999)；及Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第20版, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins)。
如本文所使用，術語「其功能片段」或「其功能變體」係關於具有與衍生出片段或變體之野生型分子相同的定性生物活性之分子。舉例而言，抗體之功能片段或功能變體為保留與衍生出功能片段或功能變體之抗體基本上相同的結合至相同抗原決定基之能力的一者。舉例而言，能夠結合至細胞表面受體之抗原決定基之抗體可在N端及/或C端截短，且使用熟習此項技術者已知的分析(包括本文所提供之例示性分析)評定其抗原決定基結合活性之保留。當提及具有酶活性之多肽(例如酶，諸如受體蛋白酪胺酸磷酸酶；RPTP)時，術語「功能變體」係指具有與編碼該酶之多肽序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%一致的多肽序列之酶。「功能變體」酶可保留識別為酶保守性之胺基酸殘基，且可具有經取代或發現具有不同胺基酸或胺基酸插入或缺失之非保守性胺基酸殘基，但相比於本文所描述之酶，其不影響其酶活性或對其酶活性具有不顯著作用。「功能變體」酶具有與本文所描述之酶(例如RPTP)之生物活性一致或基本上一致的酶活性。熟習此項技術者將瞭解，「功能變體」酶可在自然界中發現，亦即，天然存在的或為其經工程改造之突變體。
如本文所使用，術語「可操作地連接」表示兩個或多於兩個元件，例如多肽序列或聚核苷酸序列之間的物理或功能性連接，其准許序列以其預期方式操作。舉例而言，相關聚核苷酸與調節序列(例如啟動子)之間的可操作連接為允許表現相關聚核苷酸之功能性鍵。在此意義上，術語「可操作地連接」係指安置調節區及待轉錄編碼序列以使得調節區能有效調節相關編碼序列之轉錄或轉譯。在本文所揭示之一些實施例中，術語「可操作地連接」表示一種構形，其中調節序列置放於相對於編碼多肽或功能性RNA之序列的適當位置處以使得對照序列引導或調節編碼多肽之mRNA、多肽及/或功能性RNA之表現或細胞定位。因此，若啟動子可介導核酸序列之轉錄，則啟動子與核酸序列可操作連接。可操作地連接之元件可為連續或非連續的。另外，在多肽之情況下，「可操作地連接」係指胺基酸序列(例如不同鏈段、模組或域)之間的物理連接(例如直接地或間接地連接)以提供所描述之多肽活性。在本發明中，本發明之多價多肽或多價抗體之各種鏈段、模組或域可以可操作地連接以保留細胞中之多價多肽或多價抗體之適當摺疊、處理、靶向、表現、結合及其他功能特性。除非另外說明，否則本發明之多價多肽或多價抗體之各種模組、域及鏈段彼此可操作地連接。本發明之多價多肽或多價抗體之可操作地連接之模組、域及鏈段可為連續或非連續的(例如彼此間經由連接子連接)。
術語「一致性百分比」在兩個或多於兩個核酸或蛋白質之上下文中係指相同或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸(例如當在比較窗或指定區域內比較及比對最大一致性時，在指定區域內約60%序列一致性，65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或高於99%的一致性)的兩個或多於兩個序列或子序列，如利用下文所描述之默認參數使用BLAST或BLAST 2.0序列比較算法或藉由手動比對及目視檢驗所量測。參見例如ncbi.nlm.nih.gov/BLAST之NCBI網站。此類序列隨後稱為「實質上一致」。此定義亦關於或可施加至測試序列之補充。此定義亦包括具有缺失及/或添加之序列以及具有取代之彼等者。序列一致性典型地存在於至少約20個胺基酸或核苷酸長之區域內，或10-100個胺基酸或核苷酸長之區域內，或給定序列之整個長度內。
必要時，序列一致性可使用所公佈之技術及廣泛可用電腦程式，諸如GCS程式包(Devereux等人, Nucleic Acids Res. 12:387, 1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul等人, J. Molecular Biol. 215:403, 1990)計算。可使用序列分析軟體，諸如威斯康星大學生物技術中心(University of Wisconsin Biotechnology Center) (1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)之遺傳學電腦組之序列分析軟件包，利用其默認參數量測序列一致性。
如本文所使用，術語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指提供用於向個體投與相關化合物之醫藥學上可接受之載劑、添加劑或稀釋劑之任何適合的物質。因而，「醫藥學上可接受之賦形劑」可涵蓋稱作醫藥學上可接受之稀釋劑、醫藥學上可接受之添加劑及醫藥學上可接受之載劑的物質。如本文所使用，術語「醫藥學上可接受之載劑」包括(但不限於)與醫藥投與相容之生理食鹽水、溶劑、分散介質、塗佈、抗細菌劑及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑及其類似物。補充活性化合物(例如抗生素)亦可併入組合物中。
如本文所使用，術語「重組」或「經工程改造之」核酸分子或多肽係指已經由人工干預改變之核酸分子或多肽。作為非限制性實例，cDNA為重組DNA分子，正如已藉由活體外聚合酶反應產生或連接子已附接或已整合至載體中之任何核酸分子，諸如選殖載體或表現載體。作為非限制性實例，重組核酸分子可為一種重組核酸分子，其：1)已例如使用化學或酶促技術(例如藉由使用化學核酸合成或藉由使用用於核酸分子之複製、聚合、核酸外切消化、核酸內切酶消化、接合、逆轉錄、轉錄、鹼基修飾(包括例如甲基化)或再結合(包括同源及位點特異性再結合)之酶活體外合成或經修飾；2)包括在自然界中未結合之結合核苷酸序列；3)已使用分子克隆技術經工程改造以使得其相對於天然存在之核酸分子序列不具有一或多個核苷酸；及/或4)已使用分子克隆技術操作以使得其相對於天然存在之核酸序列具有一或多個序列變化或重排。作為非限制性實例，cDNA為重組DNA分子，正如已藉由活體外聚合酶反應產生或連接子已附接或已整合至載體中之任何核酸分子，諸如選殖載體或表現載體。重組核酸及重組蛋白之其他非限制性實例為如本文所揭示之多價多肽或雙特異性抗原結合多肽。
「信號肽」或「信號序列」為由當可操作地連接至多肽之端，例如其N端時引導其易位至真核宿主細胞中之內質網(ER)中之胺基酸序列構成的靶向序列。
如本文所使用，「個體(subject)」或「個體(individual)」包括動物，諸如人類(例如人類個體)及非人類動物。在一些實施例中，「個體(subject)」或「個體(individual)」為在醫師護理下之患者。因此，個體可為患有或疑似患有相關疾病(例如癌症)及/或疾病之一或多個症狀的人類患者或個體。個體亦可為在診斷時或稍後診斷患有相關病況風險之個體。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物，例如嚙齒動物，例如小鼠；及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物，例如綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
如本文所使用，術語「轉化」及「轉染」係指將外來核酸(例如DNA)引入至宿主細胞中之多種此項技術中公認的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沈澱、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、脂質體轉染、粒子槍或電穿孔。
術語「載體」在本文中用於係指能夠轉移或傳送其他核酸分子之核酸分子或序列。經轉移之核酸分子一般連接至載體核酸分子，例如插入載體核酸分子中。一般而言，當與適當控制元件相關時，載體能夠複製。術語「載體」包括選殖載體及表現載體以及病毒載體及整合載體。「表現載體」為包括調節區之載體，由此能夠活體外及/或活體內表現DNA序列及片段。載體可包括引導細胞中之自主複製之序列，或可包括足以允許整合至宿主細胞DNA中之序列。適用的載體包括例如質體(例如DNA質體或RNA質體)、轉座子、黏質體、細菌人造染色體及病毒載體。適用的病毒載體包括例如複製缺陷反轉錄病毒及慢病毒。在一些實施例中，載體為基因遞送載體。在一些實施例中，載體用作將基因轉移至細胞中之基因遞送媒劑。
如本文所使用，術語「VHH」係指重鏈抗體之可變域。如本文所使用，術語「VH」及「VL」分別係指習知抗體之可變重鏈及可變輕鏈。
如本領域中熟習此項技術者將理解，出於任何及所有目的，諸如就提供書面描述而言，本文所揭示之所有範圍亦涵蓋其任何及所有可能之子範圍及子範圍之組合。任何列出範圍可因足夠說明而容易地識別且能夠將同一範圍分解為至少相同的兩份、三份、四份、五份、十份等。作為非限制性實例，本文所論述之各範圍可容易地分解為下部三分之一、中間三分之一及上部三分之一等。如本領域中熟習此項技術者將理解，所有語言，諸如「至多」、「至少」、「大於」、「小於」及其類似語言均包括所敍述之數目且係指可隨後如上文所論述分解為子範圍之範圍。最終，熟習此項技術者將理解，範圍包括各個別成員。因此，舉例而言具有1至3個對象之群係指具有1、2或3個對象之群。類似地，具有1至5個對象之群係指具有1、2、3、4或5個對象之群，以此類推。
應理解，本文所描述之本發明之態樣及實施例包括「包含」態樣及實施例、「由」態樣及實施例「組成」及「基本上由」態樣及實施例「組成」。如本文所使用，「包含」與「包括」、「含有」或「特徵在於」同義，且為包括性的或開放的且不排除額外的未敍述之元素或方法步驟。如本文所使用，「由……組成」排除所主張之組合物或方法中未指定之任何元素、步驟或成份。如本文所使用，「基本上由……組成」不排除不會實質上影響所主張之組合物或方法之基礎及新穎特徵之材料或步驟。本文對術語「包含」之任何敍述(尤其在組合物之組分之描述中或在方法之步驟之描述中)應理解為涵蓋基本上由所敍述組分或步驟組成及由其組成之彼等組合物及方法。
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細胞表面受體
細胞表面受體通常稱作跨膜受體，其為介導細胞與外部世界之間的溝通之蛋白質。此等受體負責細胞外信號傳導分子之結合及其消息轉導至一或多種細胞內信號傳導分子中，此改變細胞行為。細胞表面受體本質上嵌入於血漿膜中。此等受體充當酶或與細胞內部之酶結合。當刺激時，酶活化多種細胞內信號傳導路徑。發現其經由其在對細胞外信號蛋白質之反應中之作用，該等蛋白質調節動物組織中之細胞之生長、增殖、分化及存活。細胞生長、增殖、分化、存活及遷移之疾病對癌症而言為基本的，且經由酶偶合受體傳導信號之異常在研發此類別之疾病方面發揮主要作用。
細胞表面受體藉由接受(結合至)細胞外分子起細胞信號傳導作用。細胞外分子可為激素、神經傳遞素、細胞介素、生長因子、細胞黏附分子或養分；其與受體反應以誘發細胞之代謝及活性之變化。在細胞信號傳導過程中，經由膜受體之信號轉導過程涉及：外部反應，其中配位體結合至膜受體；及內部反應，其中細胞內反應被觸發。
由於此等路徑之重要性質，細胞表面受體中之突變對較寬範圍疾病負責，包括自體免疫、癌症、神經退化、軟骨發育不全及動脈粥樣硬化。實際上，臨床使用之所有藥物中幾乎一半靶向細胞表面受體，且此等蛋白質及其配位體仍為基於結構之藥物設計及新穎藥物研發之極其重要的靶標。細胞表面受體分成三個主要類別：(i)離子通道連接之受體，(ii)酶聯結受體，及(iii) G蛋白偶聯受體。其中，酶聯結受體通常為直接連接至細胞內酶之單程跨膜受體。此類別包括廣泛研究之受體酪胺酸激酶(RTK)及傳導信號之受體，但傑納斯激酶(Janus Kinases，JAKS)及STAT，後一已知為JAK/STAT細胞介素受體，其結合至控制細胞增殖及分化之多肽生長因子。如在下文更詳細地描述，RPTP補充為適用於經由磷酸化機制傳導信號之激酶連接之受體之方法，其大體上適用於含有ITAM/ITIM之受體及相關免疫受體(Bezbradica等人, 2012)、JAK/STAT細胞介素受體(Rawlings等人, 2004)及在配位體依賴性及非依賴性狀態下可為活性的RTK受體(Bergeron等人, 2016)。
酶聯結受體之最大家族為受體蛋白酪胺酸激酶，其使酪胺酸殘基上之其受質蛋白質磷酸化。此家族包括大部分多肽生長因子之受體，因此蛋白酪胺酸磷酸化已尤其充分研究為涉及控制動物細胞生長及分化之信號傳導機制。實際上，第一蛋白酪胺酸激酶發現於1980年研究動物腫瘤病毒，尤其勞斯(Rous)肉瘤病毒之致癌蛋白質期間。隨後發現起蛋白酪胺酸激酶作用之表皮生長因子(EGF)受體將蛋白酪胺酸磷酸化明確建立為細胞對生長因子刺激之反應中之關鍵信號傳導機制。
目前，已鑑別出超過50種受體蛋白酪胺酸激酶，包括表皮生長因子(EGF)、神經生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素及多種其他生長因子之受體。所有此等受體共有常見結構性組織：具有蛋白酪胺酸激酶活性之N端細胞外配體結合域、單一跨膜α螺旋狀物及細胞溶質C端域。大部分受體蛋白酪胺酸激酶由單一多肽組成，但胰島素受體及一些相關受體為由兩對多肽鏈組成之二聚體。配位體(例如生長因子)結合至此等受體之細胞外域使其細胞溶質激酶域活化，導致受體自身及傳導生長因子結合引發之信號的細胞內靶蛋白之磷酸化。自大部分受體蛋白酪胺酸激酶傳導信號之第一步驟為配位體誘發之受體二聚。諸如PDGF及NGF之一些生長因子自身為由兩個相同多肽鏈組成之二聚體；此等生長因子直接藉由同時結合至兩種不同受體分子而誘發二聚。其他生長因子(諸如EGF)為單體，但具有兩個不同的用以交聯受體之受體結合位點。
配位體誘發之二聚隨後導致受體之自體磷酸化，因為二聚多肽鏈彼此交叉磷酸化。此類自體磷酸化在自此等受體傳導信號方面發揮兩個重要作用。首先，催化域內酪胺酸殘基之磷酸化可藉由提高受體蛋白激酶活性而起調節性作用。第二，催化域外酪胺酸殘基之磷酸化產生傳送活化受體下游之細胞內信號之額外蛋白質的特異性結合位點。此等下游信號傳導分子與受體蛋白酪胺酸激酶之締合藉由結合至含有特定磷酸酪胺酸之肽的蛋白域介導。最具特徵此等域稱作SH2域(Src同源性2)，因為其首先在與Src (勞斯肉瘤病毒之致癌蛋白質)相關之蛋白酪胺酸激酶中識別出。SH2域由大致一百個胺基酸組成且結合至含有磷酸酪胺酸殘基之特異性短肽序列。含有SH2之蛋白質與活化受體蛋白酪胺酸激酶之所得締合可具有若干作用：其使含有SH2之蛋白質定位於血漿膜中，使得其與其他蛋白質締合，促進其磷酸化，且刺激其酶促活性。此等蛋白質與自身磷酸化受體之締合因此代表藉由生長因子結合至細胞表面引發之細胞內信號傳遞中之第一步驟。
酶聯結受體之其他家族為細胞介素受體及非受體蛋白酪胺酸激酶(亦稱作細胞介素受體總科)。並非具有固有酶活性，多種受體藉由刺激與其非共價締合之細胞內蛋白酪胺酸激酶(例如JAK/TYK)來起作用。此家族受體包括大部分細胞介素(例如介白素-2及紅血球生成素)及一些多肽激素(例如生長激素)之受體。類似受體蛋白酪胺酸激酶，細胞介素受體含有N端細胞外配位體結合域、單一跨膜α螺旋及C端細胞溶質域。然而，細胞介素受體之細胞溶質域不含任何已知催化活性。實際上，細胞介素受體與非受體蛋白酪胺酸激酶結合起作用，該等非受體蛋白酪胺酸激酶由於配位體結合而活化。
自細胞介素受體傳導信號之第一步驟咸信為配位體誘發之受體二聚及相關非受體蛋白酪胺酸激酶之交叉磷酸化。此等活化激酶隨後使受體磷酸化，為補充含有SH2域之下游信號傳導分子提供磷酸酪胺酸結合位點。細胞介素受體加締合的非受體蛋白酪胺酸激酶之組合因此類似於受體蛋白酪胺酸激酶之家族起作用。
與細胞介素受體締合之非受體蛋白酪胺酸激酶屬於兩個主要家族。多種此等激酶為Src家族之成員，該家族由Src及八個緊密相關蛋白質組成。Src起初鑑別為勞斯肉瘤病毒之致癌蛋白質且為展示具有蛋白酪胺酸激酶活性之第一蛋白質，因此其已在實驗中發揮關鍵作用，產生吾等對細胞信號傳導之現有理解。除了Src家庭成員之外，細胞介素受體與屬於傑納斯激酶或JAK家族之非受體蛋白酪胺酸激酶締合。JAK家族之成員似乎普遍地為自細胞介素受體傳導信號所需，指示JAK家族激酶在此等受體偶合至細胞內靶標之酪胺酸磷酸化中起關鍵作用。相比之下，Src家族之成員在自B及T淋巴細胞上之抗原受體傳導信號中起關鍵作用，但似乎不會為自大部分細胞介素受體傳導信號所需。
儘管大部分酶聯結受體刺激蛋白酪胺酸磷酸化，但一些受體與其他酶促活性相關。此等受體包括蛋白酪胺酸磷酸酶。蛋白酪胺酸磷酸酶自磷酸酪胺酸殘基移除磷酸基，因此作用於抗衡蛋白酪胺酸激酶之作用。在許多情況下，蛋白酪胺酸磷酸酶藉由終止蛋白酪胺酸磷酸化引發之信號而在細胞信號傳導路徑中起負面調節作用。然而，一些蛋白酪胺酸磷酸酶為細胞表面受體，其酶促活性在細胞信號傳導中起積極作用。一個實例藉由磷酸酶CD45提供，其在T及B淋巴球之表面上表現。在抗原刺激之後，咸信CD45使抑制Src家庭成員之酶活性之特定磷酸酪胺酸去磷酸化。因此，CD45蛋白酪胺酸磷酸酶用以刺激非受體蛋白酪胺酸激酶。
細胞表面受體之若干成員為免疫系統之調節因子，例如免疫檢查點，其可為刺激性檢查點或抑制性檢查點。此等受體不會具有固有酶活性，而實際上經由其細胞內ITAM、ITSM及/或ITIM模體(參見例如Pardoll, 2012)充當激酶受質。此等受體活性亦經由磷酸化及對其細胞內域起作用之磷酸酶活性之平衡控制，且因此為藉由如所描述之磷酸酶接合進行信號調節之良好候選物。其中，抑制性檢查點已因其用於多種類型癌症之可能性而愈來愈被視為用於癌症免疫療法之引人注目之目標(Topalian等人, 2015)。目前批准之檢查點抑制劑阻斷CTLA-4及PD-1及PD-L1。其他兩個刺激性檢查點分子屬於B7-CD28總科-CD28自身及ICOS。抑制性檢查點包括(但不限於) PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD5、CD132、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、TIGIT及VISTA及其功能變體。
PD-1
PD-1亦稱為計劃性細胞死亡蛋白質1及CD279 (分化簇279)，其為在下調免疫系統及藉由抑制T細胞發炎活性促進自身耐受性方面發揮重要作用之細胞表面受體。PD-1為經由促進淋巴結中之抗原特異性T細胞之細胞凋亡(計劃性細胞死亡)，而同時減少調節T細胞(抗炎性抑制性T細胞)之細胞凋亡的雙重機制，針對自體免疫之免疫檢查點及保護件。咸信，經由此等機制，PD-1抑制免疫系統。此預防自體免疫疾病，但其亦可預防免疫系統殺死癌細胞。人類中之PD-1蛋白質由PDCD1基因編碼。
PD-1具有兩個配位體PD-L1及PD-L2，其為B7家族之成員。PD-L1蛋白質響應於LPS及GM-CSF處理上調巨噬細胞及樹突狀細胞(DC)，且在TCR及B細胞受體傳導信號後上調T細胞及B細胞，而在休眠小鼠中，可在心臟、肺臟、胸腺、脾臟及腎臟中偵測到PD-L1 mRNA。在用IFN-γ處理後，PD-L1於幾乎所有小鼠腫瘤細胞系，包括P815肥胖細胞瘤、PA1骨髓瘤及B16黑色素瘤上表現。PD-L2表現更受限制且主要藉由DC及多種腫瘤株表現。
CTLA-4
CTLA4或CTLA-4 (細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4)亦稱為CD152 (分化簇152)，其為充當免疫檢查點、下調免疫反應之蛋白質受體。CTLA4在調節T細胞中組成性表現，但僅在活化(在癌症中尤其顯著的現象)之後習知T細胞上調。當結合至抗原呈遞細胞表面上之CD80或CD86時，CTLA-4充當「關閉」開關。CTLA-4蛋白質由小鼠中之Ctla4基因及人類中之CTLA4基因編碼。此基因中之變體已與胰島素依賴型糖尿病、格雷夫氏病(Graves' disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、乳糜瀉、全身性紅斑性狼瘡症、格雷夫氏病、橋本氏甲狀腺炎、乳糜瀉、甲狀腺相關眼眶病、原發性膽汁性肝硬化及其他自體免疫疾病相關。CTLA-4基因之多形現象與諸如自體免疫甲狀腺疾病及多發性硬化症之自體免疫疾病相關，但此相關性通常較弱。在全身性紅斑性狼瘡症(SLE)中，發現CTLA-4之剪接變體異常產生且可見於具有活性SLE之患者之血清中。
CTLA-4由活化T細胞表現且將抑制性信號傳送至T細胞。CTLA-4與T細胞共刺激蛋白CD28同源，且兩種分子均與抗原呈遞細胞上之亦分別稱為B7-1及B7-2之CD80及CD86結合。CTLA-4以與CD28相比更大的親和力及親合力結合CD80及CD86，因此使得其針對其配位體能夠勝過CD28。然而，CTLA-4將抑制性信號傳送至T細胞，而CD28傳送刺激性信號。CTLA-4亦於調節T細胞中發現且促進其抑制功能。
CD28
CD28 (分化簇28)為於提供T細胞活化及存活所需要之共刺激信號的T細胞上表現之蛋白質中之一者。據報導，經由除了T細胞受體(TCR)之外的CD28之T細胞刺激為產生各種介白素(尤其IL-6)提供有效信號。共刺激受體CD28藉由其配位體B7.1 (CD80)及B7.2 (CD86)活化，且在T細胞激活期間與TCR信號傳導偶合促進T細胞增殖及存活。在藉由Toll樣受體配位體活化時，CD80表現在抗原呈遞細胞(APC)中上調。抗原呈遞細胞上之CD86表現為組成型的(表現與環境因素無關)。CD28已知為在未處理T細胞上組成性表現之B7受體。已展示，小鼠狼瘡模型中之Cd28-/- MRL-lpr之抑制展現延遲且降低的絲球體腎炎，且不存在腎臟血管炎及關節炎意指阻斷CD28-B7相互作用可能為自體免疫狼瘡之可能性治療。
TIM-3
TIM-3 (含T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域-3)屬於TIM家族細胞表面受體蛋白質，其為表現於例如分泌IFN-γ之Th1 (T輔助1) CD4+細胞及細胞毒性CD8+ T細胞之跨膜受體蛋白。TIM-3一般不表現於未處理T細胞上，而是在活化的效應T細胞上上調。TIM-3在活體內調節免疫性及耐受性方面具有作用。
在人類中，TIM-3由HAVCR2基因編碼，其首先描述為於產生IFNγ之CD4+ Th1及CD8+ Tc1細胞上表現之細胞表面分子。TIM-3表現隨後在Th17細胞、調節T細胞及先天性免疫細胞，諸如樹突狀細胞、NK細胞、單核球中偵測到。TIM-3含有五個保守性酪胺酸殘基，咸信其與T細胞受體(TCR)複合物之多個組分相互作用且負調節其功能。TIM-3視為免疫檢查點及以及其他抑制受體，包括介導CD8+ T細胞耗盡之計劃性細胞死亡蛋白1 (PD-1)及淋巴球活化基因3蛋白(LAG3)。TIM-3亦已展示為調節巨噬細胞活化且增強小鼠中之實驗性自體免疫性腦脊髓炎之嚴重程度的CD4+ Th1特異性細胞表面蛋白。
CD5
CD5為表現於各種物種及已知為B-1a之小鼠B細胞子集中之T細胞之表面上的分化簇。CD5為I型醣蛋白及清除劑受體家族之成員。CD5由胸腺細胞、成熟T細胞及成熟B細胞子集表現且已展示為涉及調節淋巴球活化及分化過程。CD72、gp80-40及Ig構架結構CD5之計劃配位體且其與CD5之相互作用已展示於小鼠中。CD5已用作T細胞標記物直至研發出針對CD3之單株抗體。已報導，可為同嗜性之CD5可結合於其他細胞之表面上。與B細胞相比，T細胞表現更高水準之CD5。CD5在較強活化後在T細胞上上調。在胸腺中，CD5表現及T細胞朝向自身肽之相互作用之強度存在相關性。
CD5與B細胞受體(BCR)附近處表面IgM之CD79a及CD79b轉導搭配物相關，且CD5信號傳導藉由與BCR及CD79a及CD79b共沈澱至脂質筏中來介導。CD79a及CD79b藉由Lyn及其他酪胺酸激酶，諸如Syk磷酸化，且Zap70以及酪胺酸磷酸酶SHP-1已報導為此信號轉導之介體。
CD132
CD132 (常見γ鏈-γc)亦稱為介白素-2受體子單元γ或IL-2RG，其為若干不同介白素受體之受體複合物共有的細胞介素受體子單元，該等介白素受體包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15及介白素-21受體。具有此等配位體特異性受體之γc鏈搭配物引導淋巴細胞對細胞介素作出響應。γc醣蛋白為表現於大部分淋巴球(白血球)群體上之I型細胞介素受體家族之成員。在人類中，CD132由IL2RG基因編碼。
CD132表現於骨髓中之不成熟造血細胞之表面上。一端CD132蛋白質殘留於細胞外部，其中其結合至細胞介素，且另一端蛋白質殘留於細胞內部，其中其將信號傳送至細胞核。具有其他蛋白質之CD132搭配物引導造血細胞形成淋巴細胞。表現CD132之淋巴細胞可形成此等細胞介素蛋白質之功能性受體，其將信號自一個細胞傳送至其他細胞且引導細胞分化程序。
TIGIT
TIGIT (具有Ig及ITIM域之T細胞免疫受體)為在細胞質尾區中具有基於免疫受體酪胺酸之抑制性模體(ITIM)之免疫球蛋白總科之成員，其表現於活化T細胞及自然殺手(NK)細胞子集上。TIGIT之其他名稱包括WUCAM及Vstm3。TIGIT已知與CD155 (亦即，PVR或necl-5)、CD112 (PVRL2或黏附分子-2)及可能地CD113 (PVRL3或黏附分子-3)相互作用。TIGIT與高親和力配位體CD155 (其表現於抗原呈遞細胞上)之結合已報導抑制T細胞及NK細胞之功能。TIGIT亦報導間接藉由調節樹突狀細胞之細胞介素產量來抑制T細胞。已報導，TIGIT-Fc融合蛋白可與樹突狀細胞上之PVR相互作用，且在LPS刺激下提高其IL-10分泌水準/降低其IL-12分泌水準，且亦活體內抑制T細胞活化。NK細胞毒性之TIGIT抑制可藉由針對其與CD155之相互作用之抗體阻斷，且經由其ITIM域引導活性。
受體類型蛋白酪胺酸磷酸酶 (RPTP)
可逆的蛋白酪胺酸磷酸化為調節細胞信號傳導之主要機制，該信號傳導影響包括下列的基本細胞事件：代謝、增殖、黏著、分化、遷移、溝通及黏著。舉例而言，蛋白酪胺酸磷酸化決定蛋白質功能，包括蛋白質-蛋白質相互作用、構形、穩定性、酶活性及細胞定位。此關鍵調節性機制之破壞有助於多種人類疾病，包括癌症、糖尿病及自體免疫疾病。淨蛋白酪胺酸磷酸化藉由蛋白酪胺酸激酶(PTK)及蛋白酪胺酸磷酸酶(PTP)之活性之動態平衡來決定。PTK與PTP之間的微妙平衡之調節失常涉及多種人類疾病之致病機制，該等人類疾病諸如癌症、糖尿病及自體免疫疾病。
PTP構成較大且結構上不同的酶家族。定序資料指示人類基因組中存在107個PTP基因，其中81個編碼活性蛋白質磷酸酶。在PTP超家族中，38個為典型酪胺酸特異性PTP，而其他43為雙重特定酪胺酸/絲胺酸、蘇胺酸磷酸酶。典型PTP具有至少一個已知為PTP域之催化域。280個胺基酸PTP催化域含有不變的活性位點標誌模體(I/V) HCXAGXXR (S/T) G，其包括催化親核攻擊其受質之磷醯基基團及後續受質去磷酸化之必需半胱胺酸。
PTP可基於其整體結構進一步再分成跨膜受體類PTP (RPTP)及非跨膜PTP。其中，受體類型蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)為整體細胞表面蛋白質之家族，該等蛋白質具有細胞內PTP活性及與細胞黏附分子(CAM)具有序列同源性之細胞外域(ECD)。大部分RPTP之細胞內域(ICD)含有兩個串聯PTP域，稱為D1及D2。一般而言，近膜PTP域(D1)具有大部分催化活性，而遠膜PTP域(D2)具有較弱(若存在)催化活性。RPTP之ECD含有CAM類模體之組合，該等模體具有與纖網蛋白III型(FN3)、穿膜肽酶、A5、PTPμ (MAM)、免疫球蛋白(Ig)及碳酸酐酶(CA)同源之序列。總體而言，RPTP之分子結構實現細胞外黏著介導之事件之直接偶合以調節細胞內信號傳導路徑。
基於其ECD之結構，RPTP家族可分組成八個次家族：R1/R6、R2A、R2B、R3、R4、R5、R7及R8。此等次家族之代表性成員分別包括CD45、LAR、RPTP-κ、DEP1、RPTP-α、RPTP-ζ、PTPRR及IA2。關於限定次家族中之每一者之結構特徵、其分子/生物化學結構、調節模式、受質特異性及生物學功能之其他資訊已廣泛地記錄且可見於例如Xu Y.等人(J. Cell Commun. Signal. 6:125, 138, 2012)中。
CD45
受體類型蛋白酪胺酸磷酸酶CD45亦稱作白細胞共同抗原(LCA)，其為RPTP之R1/R6亞型之唯一成員。CD45為以各種形式存在於所有分化造血細胞上之I型跨膜蛋白，紅血球及漿細胞除外，且有助於彼等細胞(共刺激形式)之活化。CD45表現於淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病、毛細胞白血病及急性非淋巴細胞性白血病中。由基因PTPRC編碼之人類CD45為由淋巴源之所有細胞(包括造血細胞)表現之細胞膜酪胺酸磷酸酶，血小板及紅血球除外，且充當T及B細胞信號傳導之關鍵調節因子。CD45由細胞外區、細胞質區中之短跨膜鏈段及串聯PTP域組成。CD45之多種同功異型物藉由分子之細胞外域中之外顯子之複合替代性剪接產生，其以細胞類型特異性方式表現，視細胞分化及活化狀態而定。CD45同功異型物之非限制性實例包括CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45R0、CD45R (ABC)。CD45RA位於未處理T細胞上且CD45R0位於記憶T細胞上。CD45R為最長蛋白質且當自T細胞分離時在200 kDa下遷移。B細胞亦表現具有較重糖基化之CD45R，使分子量變為220 kDa，因此名稱為B220；220 kDa之B細胞同功異型物。B220表現不限於B細胞且亦可表現於活化T細胞、樹突狀細胞之子集及其他抗原呈遞細胞上。未處理T淋巴細胞表現較大CD45同功異型物且對於CD45RA通常為陽性的。活化及記憶T淋巴細胞表現最短CD45同功異型物CD45R0，其不具有RA、RB及RC外顯子。此最短同功異型物咸信促進T細胞活化。
CD45在免疫系統研發及作用中發揮重要作用且為抗原特異性淋巴球刺激及增殖所需。CD45藉由控制TCR活化閾值、調節細胞介素反應且調節淋巴球存活調節免疫反應。所有此等過程為自體免疫及傳染病之致病機制中必需。
CD45為募集至多種免疫受體之適合的RPTP目標，因為若其變為一個至另一個之空間鄰近處，則其將對較寬範圍受質起作用，例如兩個RPTP結合及受體結合模組以足夠鄰近度實現受體之細胞內域之去磷酸化。CD45藉由調節如Lyn及Lck之PTK之Src家族(SFK)之酪胺酸磷酸化來介導T及B細胞受體功能。CD45使Lyn及Lck中之抑制性C端磷酸化位點去磷酸化，由此增強此等SFK之活性。亦報導藉由CD45介導之其他酪胺酸去磷酸化之SFK活性衰減。CD45基因剔除小鼠中之研究展示，Fyn及Lck之CD45介導之活化在胸腺細胞研發中為重要的。在TCR接合後，活化Fyn及Lck磷酸化組分如TCR-ζ及CD3-ε之TCR複合物。此等酪胺酸磷酸化蛋白質為含有Src同源性2 (SH2)域之蛋白質提供對接位點以傳送下游信號。在CD45裸胸腺細胞中，TCR接合不會導致Lyn或Lck活化或TCR複合物之後續酪胺酸磷酸化。因此，不存在下游信號傳導事件；指示CD45在TCR活化中之必需作用。CD45亦鑑別為使CD3-ζ及CD3-ε ITAM、傑納斯激酶(JAK)去磷酸化之PTP，且負調節細胞介素受體活化。
本發明之組合物 多價多肽及多價抗體
在一個態樣中，本文所揭示之一些實施例係關於一種新穎嵌合多肽，其含有多種多肽模組，例如各自能夠結合至一或多種靶蛋白之模組化蛋白結合部分。在一些實施例中，所揭示之嵌合多肽包括(i)第一胺基酸序列，其包括能夠結合至受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)之第一多肽模組；及(ii)第二胺基酸序列，其包括能夠結合至經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體之第二多肽模組，其中第一多肽模組可操作地連接至該第二多肽模組。在一些實施例中所揭示之嵌合多肽為多價多肽。在一些實施例中，多價多肽為多價抗體。第一多肽模組及第二多肽模組至其對應靶標之結合可以競爭性或非競爭性方式用靶標之天然配位體進行。因此，在本發明之一些實施例中，第一多肽模組及/或第二多肽模組至其對應靶標之結合可為配位體阻斷的。在一些其他實施例中，第一多肽模組及/或第二多肽模組至其對應靶標之結合不阻斷天然配位體之結合。如本文所使用，如本文所使用之術語「多價多肽」係指包含兩個或多於兩個彼此可操作地連接之蛋白結合模組之多肽。舉例而言，本發明之「二價」多肽包含兩個蛋白結合模組，而本發明之「三價」多肽包含三個蛋白結合模組。多肽模組之胺基酸序列可通常存在於一起結合於多價多肽中之單獨蛋白質中，或其可通常存在於相同蛋白質中，但以新配置置放於多價多肽中。多價多肽可例如藉由化學合成，或藉由產生及轉譯肽區以所需關係編碼之聚核苷酸而產生。
包括能夠結合至受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)之第一多肽模組作為「第一」胺基酸序列之嵌合多肽(例如多價多肽)之胺基酸序列及包括能夠結合至細胞表面受體之多肽模組作為「第二」胺基酸序列之多價多肽之胺基酸序列的命名並不意欲暗示多價多肽內之「第一」及「第二」胺基酸序列之任何特定結構佈置。藉助於非限制性實例，在本發明之一些實施例中，多價多肽或多價抗體可包括能夠結合至RPTP之N端多肽模組及包括能夠結合至細胞表面受體之多肽之C端多肽模組。在其他實施例中，多價多肽或多價抗體可包括能夠結合至細胞表面受體之N端多肽模組及能夠結合至RPTP之C端多肽模組。另外或替代地，多價多肽或多價抗體可包括多於一個能夠結合至RPTP之多肽模組(例如模組)及/或多於一個能夠結合至細胞表面受體之多肽模組。因此，在一些實施例中，多價多肽或多價抗體之第一胺基酸序列包括至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個各自能夠結合至RPTP之多肽模組。在一些實施例中，至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個第一胺基酸序列之多肽模組各自能夠結合至相同RPTP。在一些實施例中，至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個第一胺基酸序列之多肽模組各自能夠結合至不同RPTP。
在一些實施例中，多價多肽或多價抗體之第二胺基酸序列包括至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個多肽模組各自能夠結合至細胞表面受體。在一些實施例中，至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個第二胺基酸序列之多肽模組各自能夠結合至相同細胞表面受體。在一些實施例中，至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個第二胺基酸序列之多肽模組各自能夠結合至不同細胞表面受體。含有多個各自能夠結合至不同細胞表面受體之多肽模組之此類多價多肽或多價抗體之非限制性實例描述於實例17中。
另外或替代地，如前文所提及，如本文所揭示之多價多肽及抗體可在影響具有對應靶蛋白之多價多肽或多價抗體之結合親和力之位置併入天然及非天然胺基酸兩者。因而，可調整多肽模組對其對應靶標(例如RPTP或細胞表面受體)之結合親和力以實現所需靶細胞特異性。舉例而言，因為CD45廣泛表現，PD1結合模組可經配置以形成高親和力結合模組，而CD45結合模組可經配置以具有低結合親和力。舉例而言，在一些實施例中，當相較於RPTP結合模組對RPTP之結合親和力時，細胞表面受體結合模組對細胞表面受體具有較高親和力(較低Kd )。在一些實施例中，親和力差值為至少一個數量級或至少兩個數量級(例如RPTP結合模組與RPTP之相互作用之Kd 與細胞表面受體結合模組與細胞表面受體之相互作用之Kd 的比率為至少10、至少20、至少50或至少100)。熟習此項技術者將瞭解，對RPTP或其靶受體具有高親和力及對其他另一者之較低親和力之多價多肽或多價抗體之此概念可為調整靶細胞特異性之RIPR活性之重要部分。因此，在一些實施例中，RPTP結合多肽模組之結合親和力可與受體結合多肽模組之結合親和力不同。舉例而言，在一些實施例中，RPTP結合多肽模組對其靶標具有高親和力且受體結合多肽模組對其靶標具有低親和力。在一些實施例中，RPTP結合多肽模組對其靶標具有低親和力且細胞表面受體結合多肽模組對其靶標具有高親和力。在一些實施例中，RPTP結合及受體結合模組對對應靶蛋白具有相同親和力。
在一些實施例中，對其對應靶標之細胞外域各自具有親和力之受體結合及RPTP結合模組之結合親和力獨立地為Kd =10-5 至10-12 M，諸如約10-5 至約10-11 M之Kd ，或者約10-5 至約10-10 M之Kd ，或者約10-6 至約10-12 M之Kd ，或者約10-7 至約10-12 M之Kd ，或者約10-8 至約10-12 M之Kd ，或者約10-9 至約10-12 M之Kd ，或者約10-10 至約10-12 M之Kd ，或者約10-11 至約10-12 M之Kd ，或者約10-5 至約10-11 M之Kd ，或者約10-5 至約10-10 M之Kd ，或者約10-5 至約10-9 M之Kd ，或者約10-5 至約10-8 M之Kd ，或者約10-5 至約10-7 M之Kd ，或者約10-5 至約10-6 M之Kd 。
在一些實施例中，如本文所揭示之多價多肽或多價抗體對RPTP (例如CD45)具有結合親和力，其中Kd 為約1,000 nM、約800 nM、約700 nM、約600 nM、約500 nM、約400 nM、約200 nM、約100 nM、約10 nM、約5 nM或約1 nM。在一些實施例中，如本文所揭示之多價多肽或多價抗體對RPTP具有較低結合親和力，例如具有超過約10-5 M之Kd ，諸如超過約10-4 M，超過約10-3 M，超過約10-2 M，或超過約10-1 M之Kd 。在一些實施例中，RPTP (例如CD45)之結合親和力(Kd)可為約700 nM。在一些實施例中，多價多肽或多價抗體對CD45之結合親和力可為約300 nM。
在一些實施例中，如本文所揭示之多價多肽或多價抗體可對細胞表面受體(例如PD-1)具有結合親和力，其中Kd 為1,000 nM、約800 nM、約700 nM、約600 nM、約500 nM、約400 nM、約200 nM、約150 nM、約100 nM、約80 nM、約60 nM、約40 nM、約20 nM、約10 nM、約5 nM或約1 nM。在一些實施例中，如本文所揭示之多價多肽或多價抗體對細胞表面受體具有較高結合親和力，例如其中Kd 為小於約10-8 M，小於約10-9 M，小於約10-10 M，小於約10-11 M，或小於約10-12 M。在一些實施例中，細胞表面受體之親和力可為約7 nM。在一些實施例中，多價多肽或多價抗體對細胞表面受體之結合親和力可為約6 nM。在一些實施例中，細胞表面受體之結合親和力可為約5 nM。
在一些實施例中，多價多肽或多價抗體之第一胺基酸序列直接連接至第二胺基酸序列。在一些實施例中，第一胺基酸序列經由至少一個共價鍵直接連接至第二胺基酸序列。在一些實施例中，第一胺基酸序列經由至少一個肽鍵直接連接至第二胺基酸序列。在一些實施例中，第一胺基酸序列之C端胺基酸可操作地連接至第二多肽模組之N端胺基酸。替代地，第一多肽模組之N端胺基酸可操作地連接至第二多肽模組之C端胺基酸。
在一些實施例中，多價多肽或多價抗體之第一胺基酸序列經由連接子可操作地連接至第二胺基酸序列。可用於本文所描述之多價多肽中之連接子不存在特定限制。在一些實施例中，連接子為合成化合物連接子，諸如化學交聯劑。可商購的適合交聯劑之非限制性實例包括N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、琥珀醯亞胺基辛二酸酯(DSS)、雙(磺基丁二醯亞胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫代雙(丙酸丁二醯亞胺酯) (DSP)、二硫代雙(磺酸基丁二醯亞胺基丙酸酯) (DTSSP)、乙二醇雙(丁二醯亞胺基丁二酸酯) (EGS)、乙二醇雙(磺酸基琥珀醯亞胺琥珀酸酯) (磺酸基-EGS)、酒石酸二丁二醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基丁二醯亞胺酯(磺酸基-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺基氧基羰基氧基)乙基]碸(BSOCOES)及雙[2-(磺酸基琥珀醯亞胺基氧基羰基氧基)乙基]碸(磺酸基-BSOCOES)。適合於本發明之多價多肽及多價抗體之替代結構及鍵之其他實例包括描述於Spiess等人, Mol. Immunol. 67:95-106, 2015中之彼等者。
在一些實施例中，本文所揭示之多價多肽或多價抗體之第一胺基酸序列經由連接子多肽序列(肽性鍵)可操作地連接至第二胺基酸序列。原則上，連接子多肽序列之長度及/或胺基酸組成無特定限制。在一些實施例中，包含約一個至100個胺基酸殘基(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個等胺基酸殘基)之任何任意單鏈肽可用作多肽連接子。在一些實施例中，連接子多肽序列包括約5至50，約10至60，約20至70，約30至80，約40至90，約50至100，約60至80，約70至100，約30至60，約20至80，約30至90個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子多肽序列包括約1至10、約5至15、約10至20、約15至25、約20至40、約30至50、約40至60、約50至70個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子多肽序列包括約40至70，約50至80，約60至80，約70至90，或約80至100個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子多肽序列包括約1至10，約5至15，約10至20，約15至25個胺基酸殘基。
在一些實施例中，連接子多肽序列之長度及胺基酸組成可最佳化以改變第一及第二多肽模組相對於彼此之定向及/或鄰近度以實現所需多價多肽之活性。在一些實施例中，第一及第二多肽模組相對於彼此之定向及/或鄰近度可改變為「調整」工具以實現將增強或降低多價多肽之RPTP活性之調整作用。在一些實施例中，第一及第二多肽模組相對於彼此之定向及/或鄰近度可最佳化以產生雙特異性多肽之部分拮抗劑至完全拮抗劑型式。在某些實施例中，連接子僅含有甘胺酸及/或絲胺酸殘基(例如甘胺酸-絲胺酸連接子)。此類多肽連接子之實例包括：Gly、Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；Gly Gly Gly Ser；Ser Gly Gly Gly；Gly Gly Gly Gly Ser；Ser Gly Gly Gly Gly；Gly Gly Gly Gly Gly Ser；Ser Gly Gly Gly Gly Gly；Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser；Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly；(Gly Gly Gly Gly Ser)n，其中n為一或多個之整數；及(Ser Gly Gly Gly Gly)n，其中n為一或多個之整數。在一些實施例中，修飾連接子以使得胺基酸序列多肽Gly Ser Gly (GSG) (在傳統Gly/Ser連接子多肽重複序列之接合處出現)不存在。舉例而言，在一些實施例中，多肽連接子包括選自由以下組成之群的胺基酸序列：(GGGXX)nGGGGS及GGGGS(XGGGS)n，其中X為可插入序列中且不會產生包含序列GSG之多肽之任何胺基酸，且n為0至4。在一些實施例中，連接子多肽之序列為(GGGX1X2)nGGGGS，且X1為P，且X2為S，且n為0至4。在一些實施例中，連接子多肽之序列為(GGGX1X2)nGGGGS，且X1為G，且X2為Q，且n為0至4。在一些其他實施例中，連接子多肽之序列為(GGGX1X2)nGGGGS，且X1為G，且X2為A，且n為0至4。在一些實施例中，連接子多肽之序列為GGGGS(XGGGS)n，且X為P，且n為0至4。在一些實施例中，本發明之連接子多肽包含以下或由以下組成：胺基酸序列(GGGGA)2 GGGGS。在一些實施例中，連接子多肽包含以下或由以下組成：胺基酸序列(GGGGQ)2 GGGGS。在一些實施例中，連接子多肽包含以下或由以下組成：胺基酸序列(GGGPS)2 GGGGS。在一些實施例中，連接子多肽包含以下或由以下組成：胺基酸序列GGGGS(PGGGS)2 。在一些實施例中，連接子多肽包含以下或由以下組成：序列表中之SEQ ID NO: 7、36、38、40、42、44、46、48、50或52中所闡述之胺基酸序列。
另外或替代地，在一些實施例中，本發明之多價多肽及多價抗體可包括以化學方式連接至一或多個受體結合模組之一或多個RPTP結合模組。在一些實施例中，本發明之多價多肽及多價抗體可包括(i)以化學方式連接至一或多個受體結合模組之一或多個RPTP結合模組；及(ii)經由肽基鍵連接至一或多個受體結合模組之一或多個RPTP結合模組。
在本文所揭示之一些實施例中，所揭示之多價多肽或多價抗體之第一及第二多肽模組中之至少一者包括蛋白結合配位體或抗原結合部分之胺基酸序列。在一些實施例中，第一及第二多肽模組中之至少一者包括蛋白結合配位體之胺基酸序列。一般而言，任何適合的蛋白結合配位體可用於本發明之組合物及方法，且可為例如對靶抗體或靶蛋白(例如受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)或細胞表面受體之重組或天然配位體)具有特異性結合親和力之任何重組多肽或天然存在之多肽(亦參見Verdoliva等人, J. Immuno. Methods, 2002；Naik等人, J. Chromatography, 2011)。舉例而言，磷酸酶CD45之適合的配位體之非限制性實例包括其天然配位體，諸如凝集素CD22 (Hermiston ML等人, Annu. Rev. Immunol. 2003)及泌乳素-1 (Walzel H.等人, J. Immunol. Lett. 1999及Nguyen JT等人 J Immunol. 2001)。在一些實施例中，所揭示之多價多肽或多價抗體之第一及第二多肽模組中之至少一者包括細胞表面受體或RPTP之一或多個細胞外域(ECD)之胺基酸序列。因此，在一些實施例中，所揭示之多價多肽之第一多肽模組包括可操作地連接至多價多肽之第二模組的RPTP之一或多個ECD。在一些實施例中，所揭示之多價多肽之第二多肽模組包括可操作地連接至多價多肽之第一模組的細胞表面受體之一或多個ECD。
如上文所論述，適合於本發明之組合物及方法之蛋白結合配位體之非限制性實例包括細胞表面受體之天然配位體。舉例而言，PD-1之適合的天然配位體包括PD-L1及PD-L2，其為B7家族之成員。CD5之適合的天然配位體包括CD72、gp80-40及Ig構架結構。如實例18中所描述，重組介白素-2 (IL-2)為天然存在之IL-2R配位體，其可操作地連接至抗CD45 scFv以產生能夠結合至CD45及IL-2R之多價多肽。
另外或替代地，蛋白結合配位體可為目標之天然配位體之促效劑或拮抗劑型式。因此，在一些實施例中，蛋白結合配位體為受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)或細胞表面受體之促效劑配位體。在一些其他實施例中，蛋白結合配位體為受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)或細胞表面受體之拮抗劑配位體。在一些實施例中，蛋白結合配位體可為合成分子，諸如肽或小分子。
在一些實施例中，所揭示之多價多肽或多價抗體之第一及第二多肽模組中之至少一者包括結合至靶蛋白，例如受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)或細胞表面受體之抗原結合部分的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原結合部分包括抗體或其功能性抗原結合片段之一或多個抗原結合決定子。阻斷抗體及非阻斷抗體皆為適合的。如本文所使用，術語「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體係指阻止、抑制、阻斷或降低其結合之抗原之生物學或功能活性的抗體。阻斷抗體或拮抗劑抗體可實質上或完全阻止、抑制、阻斷或降低抗原之生物活性或功能。舉例而言，阻斷抗PD-1抗體可阻止、抑制、阻斷或降低PD-1與PD-L1之間的結合相互作用，因此阻止、阻斷、抑制或降低與PD-1/PD-L1相互作用相關之免疫抑制功能。術語「非阻斷」抗體係指不干擾、抑制、阻斷或降低其結合之抗原之生物學或功能活性的抗體。
如本文所使用之術語「抗原結合片段」係指抗體片段，諸如雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫基穩定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫基穩定化雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(例如二價雙功能抗體-雙scFv或二價雙功能抗體-二scFv)或由包括抗體之一或多個互補決定區(CDR)之抗體之一部分形成之多特異性抗體。抗原結合部分可包括天然衍生之多肽、藉由非人類動物免疫產生之抗體或獲自其他來源，例如駱駝之抗原結合部分(參見例如Bannas等人 Front. Immunol., 2017年11月22日；McMahon C.等人, Nat Struct Mol Biol. 25(3): 289-296, 2018)。抗原結合部分可經工程改造、合成、設計、人類化(參見例如Vincke等人, J. Biol. Chem. 30;284(5):3273-84, 2009)或修飾以便提供所需及/或改良特性。
因此，在一些實施例中，所揭示之多價多肽或多價抗體之第一及第二多肽模組中之至少一者包括選自由以下組成之群的抗原結合部分之胺基酸序列：抗原結合片段(Fab)、單鏈可變片段(scFv)、奈米抗體、VH 域、VL 域、單域抗體(dAb)、VNAR 域及VH H域、雙功能抗體或前述中之任一者之功能片段。在一些實施例中，抗原結合部分包括單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，抗原結合部分包括雙功能抗體。在一些實施例中，抗原結合部分包括雙scFv或二scFv，其中兩個scFv分子彼此可操作地連接。在一些實施例中，雙scFv或二scFv包括具有兩個VH 及兩個VL 區域之單一肽鏈，產生串聯scFv。在一些實施例中，抗原結合部分包括奈米抗體。在一些實施例中，抗原結合部分包括重鏈可變區及輕鏈可變區。
在一些實施例中，抗原結合部分之重鏈可變區及輕鏈可變區經由一或多個安置於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的介入胺基酸殘基彼此可操作地連接。在一些實施例中，一或多個介入胺基酸殘基包括連接子多肽序列。原則上，連接子多肽序列之長度及/或胺基酸組成無特定限制。在一些實施例中，包括約一個至100個胺基酸殘基(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個等胺基酸殘基)之任何任意單鏈肽可用作多肽連接子。在一些實施例中，連接子多肽序列包括約5至50，約10至60，約20至70，約30至80，約40至90，約50至100，約60至80，約70至100，約30至60，約20至80，約30至90個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子多肽序列包括約1至10、約5至15、約10至20、約15至25、約20至40、約30至50、約40至60、約50至70個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子多肽序列包括約40至70，約50至80，約60至80，約70至90，或約80至100個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子多肽序列包括約1至10，約5至15，約10至20，約15至25個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接子多肽序列之長度及胺基酸組成可最佳化以改變第一及第二多肽模組相對於彼此之定向及/或鄰近度以實現所需多價多肽之活性。在一些實施例中，第一及第二多肽模組相對於彼此之定向及/或鄰近度可改變為將增強或降低多價多肽之RPTP活性之「調整」工具或作用。在一些實施例中，第一及第二多肽模組相對於彼此之定向及/或鄰近度可最佳化以產生多價多肽之部分拮抗劑至完全拮抗劑型式。
在某些實施例中，連接子僅含有甘胺酸及/或絲胺酸殘基(例如甘胺酸-絲胺酸連接子)。此類多肽連接子之實例包括：Gly、Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；Gly Gly Gly Ser；Ser Gly Gly Gly；Gly Gly Gly Gly Ser；Ser Gly Gly Gly Gly；Gly Gly Gly Gly Gly Ser；Ser Gly Gly Gly Gly Gly；Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser；Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly；(Gly Gly Gly Gly Ser)n，其中n為一或多個之整數；及(Ser Gly Gly Gly Gly)n，其中n為一或多個之整數。在一些實施例中，修飾連接子多肽以使得胺基酸序列GSG (在傳統Gly/Ser連接子多肽重複序列之接合處出現)不存在。舉例而言，在一些實施例中，多肽連接子包括選自由以下組成之群的胺基酸序列：(GGGXX)nGGGGS及GGGGS(XGGGS)n，其中X為可插入序列中且不會包括序列GSG之多肽之任何胺基酸，且n為0至4。在一些實施例中，連接子多肽之序列為(GGGX1X2)nGGGGS，且X1為P，且X2為S，且n為0至4。在一些其他實施例中，連接子多肽之序列為(GGGX1X2)nGGGGS，且X1為G，且X2為Q，且n為0至4。在一些其他實施例中，連接子多肽之序列為(GGGX1X2)nGGGGS，且X1為G，且X2為A，且n為0至4。在又一些其他實施例中，連接子多肽之序列為GGGGS(XGGGS)n，且X為P，且n為0至4。在一些實施例中，本發明之連接子多肽包含以下或由以下組成：胺基酸序列(GGGGA)2GGGGS。在一些實施例中，連接子多肽包含以下或由以下組成：胺基酸序列(GGGGQ)2GGGGS。在一些實施例中，連接子多肽包含以下或由以下組成：胺基酸序列(GGGPS)2GGGGS。在一些實施例中，連接子多肽包含以下或由以下組成：胺基酸序列GGGGS(PGGGS)2。在另一實施例中，連接子多肽包含以下或由以下組成：序列表中之SEQ ID NO:7、36、38、40、42、44、46、48、50或52中所闡述之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所揭示之多價多肽及多價抗體之第一多肽模組包括能夠結合一或多個靶RPTP之抗原結合部分。一般而言，可藉由本文所描述之多價多肽及多價抗體靶向之RPTP不存在特定限制。適合的RPTP之非限制性實例包括次家族R1/R6、R2A、R2B、R3、R4之成員。次家族R5、R7及R8之成員亦適合於本文揭示之組合物及方法。適合的RPTP之實例包括(但不限於)Ptpn5 (STEP)、Ptpra (RPTP-α)、Ptprb (PTPB)、Ptprc (CD45)、Ptprd (RPTP-δ)、Ptpre (RPTP-R)、Ptprf (LAR)、Ptprg (RPTP-γ)、Ptprh (SAP1)、Ptprj (DEP-1)、Ptprk (RPTP-κ)及其任一者的功能變體。適合於本文所揭示之組合物及方法之其他非限制性實例RPTP包括Ptprm (RPTP-µ)、Ptprn (IA2)、Ptprn2 (IA2β)、Ptpro (GLEPP1)、Ptprp (PTPS31)、Ptprr (PCPTP1)、Ptprs (RPTP-σ)、Ptprt (RPTP-ρ)、Ptpru (RPTP-λ)、Ptprz (RPTP-ζ)及其任一者的功能變體。在一些實施例中，本文所揭示之多價多肽及多價抗體之第一多肽模組包括能夠結合CD45磷酸酶或其功能變體，諸如其同源物之抗原結合部分。在一些實施例中，CD45磷酸酶為人類CD45磷酸酶。一般而言，可使用CD45之任何同功異型物。在一些實施例中，受體蛋白酪胺酸磷酸酶為選自由以下組成之群的CD45同功異型物：CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45R0、CD45R。適合於本文所揭示之組合物及方法之例示性CD45結合部分包括(但不限於)描述於美國專利第7,825,222號及第9,701,756號中之彼等者。
在一些實施例中，本文所揭示之多價多肽及多價抗體之第二多肽模組包括能夠結合經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體之抗原結合部分。一般而言，細胞表面受體可為此項技術中已知之任何細胞表面受體。在一些實施例中，細胞表面受體為免疫檢查點受體、細胞介素受體或生長因子受體。在一些實施例中，細胞表面受體為選自由抑制性檢查點受體及刺激性檢查點受體組成之群的免疫檢查點受體。在一些實施例中，細胞表面受體為抑制性檢查點受體。一般而言，抑制性檢查點受體可為經由磷酸化機制傳導信號之抑制性檢查點受體中之任一者。適合於本文所揭示之組合物及方法之抑制性檢查點受體之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD5、CD132、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA及其功能變體。在一些實施例中，抑制性檢查點受體為PD-1或其功能變體。在一些實施例中，抑制性檢查點受體為CTLA-4或其功能變體。在一些實施例中，抑制性檢查點受體為TIGIT或其功能變體。在一些實施例中，抑制性檢查點受體為CD5或其功能變體。在一些實施例中，抑制性檢查點受體為CD132或其功能變體。
在一些實施例中，細胞表面受體為刺激性檢查點受體。一般而言，刺激性檢查點受體可為經由磷酸化機制傳導信號之刺激性檢查點受體中之任一者。適合於本文所揭示之組合物及方法之刺激性檢查點受體之非限制性實例包括CD27、CD28、CD40、OX40、GITR、ICOS、CD137及其功能變體。在一些實施例中，抑制性檢查點受體為CD28或其功能變體。
在一些實施例中，細胞表面受體經由用作磷酸化受質之保守胺基酸模體傳導信號，該等模體諸如基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)或基於免疫受體酪胺酸之轉換模體(ITSM)或基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(ITIM)。在一些實施例中，細胞表面受體經由選自ITAM模體、ITSM模體、ITIM模體或用作磷酸化受質之相關細胞內模體之基於特定酪胺酸之模體來介導信號傳導。在一些實施例中，細胞表面受體選自由以下組成之群：DAP10、DAP12、SIRPa、CD3、CD28、CD4、CD8、CD200、CD200R、ICOS、KIR、FcR、BCR、CD5、CD2、G6B、LIR、CD7及BTN或其任一者的功能變體。
在一些實施例中，細胞表面受體為細胞介素受體。在一些實施例中，細胞介素受體選自由以下組成之群：介白素受體、干擾素受體、趨化介素受體、生長激素受體、紅血球生成素受體(EpoR)、胸腺基質淋巴球生成素受體(TSLPR)、血小板生成素受體(TpoR)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)受體、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)受體。
在一些實施例中，細胞表面受體為生長因子受體。在一些實施例中，生長因子受體為酪胺酸受體激酶(TRK)，其在本文中亦可互換稱為酪胺酸激酶受體(TKR)。一般而言，TRK可為此項技術中已知之任何TRK。適合於本發明之TRK之非限制性實例包括(但不限於)屬於以下之彼等者：RTK I類(EGF受體家族；ErbB家族)、RTK II類(胰島素受體家族)、RTK III類(PDGF受體家族)、RTK IV類(VEGF受體家族)、RTK V類(FGF受體家族)、RTK VI類(CCK受體家族)、RTK VII類(NGF受體家族)。適合於本發明揭示內容之額外TRK包括(但不限於)屬於以下之彼等者：RTK VIII類(HGF受體家族)、RTK IX類(Eph受體家族)、RTK X類(AXL受體家族)、RTK XI類(TIE受體家族)、RTK XII類(RYK受體家族)、RTK XIII類(DDR受體家族)、RTK XIV類(RET受體家族)、RTK XV類(ROS受體家族)、RTK XVI類(LTK受體家族)、RTK XVII類(ROR受體家族)、RTK XVIII類(MuSK受體家族)、RTK XIX類(LMR受體)、RTK XX類。在一些特定實施例中，生長因子受體為選自由以下組成之群的幹細胞生長因子受體(SCFR)或表皮生長因子受體(EGFR)：ErbB-1、ErbB-2 (HER2)、ErbB-3、ErbB-4及c-Kit (CD117)。
本文所揭示之一些實施例係關於一種多價多肽，其包括：(a)域A，其包括對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之重鏈可變區之結合區；(b)域B，其包括對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之輕鏈可變區之結合區；(c)域C，其包括對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之重鏈可變區之結合區；及(d)域D，其包括對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之輕鏈可變區之結合區。
所揭示之多價多肽及多價抗體之多肽結構域命名為「A」、「B」、「C」或「D」多肽域並不意欲暗示所揭示之多價多肽及多價抗體內之「第一」、「第二」、「第三」或「第四」多肽域之任何特定結構佈置。另外或替代地，所揭示之多價多肽及多價抗體可包括多於一個能夠結合至RPTP及/或細胞表面受體之多肽模組。在一些實施例中，所揭示之多價多肽及多價抗體可包括各自能夠結合至不同RPTP之至少兩個多肽模組。在一些實施例中，所揭示之多價多肽及多價抗體可包括各自能夠結合至相同RPTP之至少兩個多肽模組。在一些實施例中，所揭示之多價多肽及多價抗體可包括各自能夠結合至不同細胞表面受體之至少兩個多肽模組。在一些實施例中，所揭示之多價多肽及多價抗體可包括各自能夠結合至相同細胞表面受體之至少兩個多肽模組。
在一些實施例中，多個受體結合模組可操作地連接至中樞RPTP結合模組以形成具有通式(I)之多價多肽或多價抗體。
(RPTP 結合模組 )-[ 連接子 -( 受體結合域 )]n 式(I).
其中n為選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之範圍之整數。
在一些實施例中，多個受體結合模組以串聯方式可操作地連接以形成具有通式(II)之多價多肽或多價抗體。
RPTP 結合模組 - 連接子 1- 受體結合域 1- 連接子 2- 受體結合域 2 式(II).
本文所揭示之一些實施例係關於在N端至C端方向上包括以下之多價多肽：(a)域A，其包括對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之重鏈可變區之結合區；(b)域B，其包括對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之輕鏈可變區之結合區；(c)域C，其包括對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之重鏈可變區之結合區；及(d)域D，其包括對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之輕鏈可變區之結合區。
本文所描述之例示性多肽及抗體，諸如式(I)及(II)之多價多肽或多價抗體之非限制性清單提供於表1、2及3中。
表2：本發明之例示性二價多肽或二價雙特異性抗體。
表3：本發明之例示性三價多肽或三價抗體(基於scFv或VHH)。
在本文所揭示之一些實施例中，多價多肽包括與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、10、12、14、16、20、22、24、26、28及54或其功能片段。在一些實施例中，多價多肽包括與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、10、12、14、16、20、22、24、26、28及54或其功能片段。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 4之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 6之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 18之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 26之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，多價多肽包括與SEQ ID NO: 54之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些特定實施例中，本發明之多價多肽可為包括至少兩個各自對靶蛋白具有特異性結合之抗原結合部分之多價抗體(例如二價抗體或三價抗體)。在一些實施例中，至少兩個抗原結合部分對相同靶蛋白具有特異性結合。此類抗體為多價單特異性抗體。在一些實施例中，至少兩個抗原結合部分對至少兩個不同靶蛋白具有特異性結合。此類抗體為多價多特異性抗體(例如雙特異性、三特異性等)。因此，本文所揭示之一些實施例係關於一種多價抗體或其功能片段，其包括(i)對一或多種受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)具有特異性的第一多肽模組，及(ii)對一或多種經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體具有特異性的第二多肽模組，其中第一多肽模組可操作地連接至第二多肽模組。因此，在一些實施例中，所揭示之多價抗體可為二價單特異性抗體。在一些實施例中，所揭示之多價抗體可為三價單特異性抗體。在一些實施例中，所揭示之多價抗體可為二價雙特異性抗體。在一些實施例中，所揭示之多價抗體可為三價三特異性抗體。
熟習此項技術者將瞭解，完整胺基酸序列可用於構築回譯基因(back-translated gene)。舉例而言，可合成含有編碼給定多肽之核苷酸序列之DNA寡聚物。舉例而言，可合成編碼所需多肽之各部分的若干小寡核苷酸且隨後接合。個別寡核苷酸典型地含有用於互補組裝之5'或3'突出端。
除了經由已藉由重組分子生物學技術改變之核酸分子之表現生成突變多肽之外，根據本發明之目標多價多肽或多價抗體可以化學方式合成。以化學方式合成之多肽常規地由熟習此項技術者生成。
在組裝(藉由合成、定點突變誘發或其他方法)後，編碼如本文所揭示之多價多肽或多價抗體之DNA序列將插入表現載體中且可操作地連接至適於在所需轉化宿主中表現多價多肽或多價抗體之表現控制序列。正確組裝可藉由核苷酸定序、限制酶圖譜及生物活性多肽在適合宿主中之表現來確認。如此項技術中已知，為獲得經轉染基因在宿主中之高表現量，基因必須可操作地連接至在所選表現宿主中具有功能性之轉錄及轉譯表現控制序列。
可藉由此項技術中已知之任何適合的方法分析本發明之多價多肽及多價抗體之結合活性。舉例而言，可藉由例如史卡查(Scatchard)分析(Munsen等人1980 Analyt. Biochem. 107:220-239)測定本發明之多價多肽及多價抗體之結合活性。可使用此項技術中已知之技術評定特異性結合，該等技術包括(但不限於)競爭ELISA、BIACORE®分析及/或KINEXA®分析。「優先結合」或「特異性結合」(在本文中可互換使用)至靶蛋白或靶抗原決定基之抗體或多肽為此項技術中充分理解之術語，且用以測定此類特異性或優先結合之方法亦為此項技術中已知的。若抗體或多肽與替代蛋白質或抗原決定基相比更頻繁、更快速、以更大持續時間及/或更大親和力與特定蛋白質或抗原決定基反應或締合，則抗體或多肽據稱展現「特異性結合」或「優先結合」。若抗體或多肽以與其結合至其他物質相比更大的親和力、親合力、更容易地及/或更大持續時間結合，則抗體或多肽「特異性結合」或「優先結合」至靶標。此外，若抗體或多肽以與其結合至樣品中存在之其他物質相比更大的親和力、親合力、更容易地及/或更大持續時間結合至樣品中之靶標，則抗體或多肽「特異性結合」或「優先結合」至靶標。舉例而言，尤其或優先結合至PD-1抗原決定基之抗體或多肽為以與其結合至其他PD-1抗原決定基或非PD-1抗原決定基相比更大的親和力、親合力、更容易地及/或更大持續時間結合此抗原決定基之抗體或多肽。藉由閱讀此定義亦應理解，例如尤其或優先結合至第一靶標之抗體或多肽(或部分或抗原決定基)可或可不尤其或優先結合至第二靶標。因此，「特異性結合」或「優先結合」不一定需要(儘管其可包括)獨佔式結合。
多種分析格式可用於選擇特異性結合相關分子之抗體或多肽。舉例而言，固相ELISA免疫分析、免疫沈澱、Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)、KinExA、螢光活化細胞分選(FACS)、Octet™ (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA)及西方墨點分析等許多分析法可用於鑑別與抗原特異性反應之抗體或與同源配體或結合搭配物特異性結合之受體或其配位體結合部分。一般而言，特異性或選擇性反應將為背景信號或雜訊之至少兩倍、更通常超過背景之10倍、甚至更通常超過背景之50倍、更通常超過背景之100倍、更通常超過背景之500倍、甚至更通常超過背景之1000倍及甚至更通常超過背景之10,000倍。此外，當平衡解離常數(KD )＜7 nM時，抗體據稱「特異性結合」抗原。
術語「結合親和力」在本文中用作兩個分子，例如抗體或其部分及抗原之間的非共價相互作用之強度量度。術語「結合親和力」用於描述單價相互作用(固有活性)。兩個分子之間的結合親和力可藉由測定解離常數(KD )定量。反之，KD 可藉由使用例如表面電漿子共振(SPR)方法(Biacore)對複合物形成及解離進行動力學量測來測定。對應於單價複合物之締合及解離的速率常數分別稱為締合速率常數ka (或kon )及解離速率常數kd (或koff )。KD 經由等式KD =kd /ka 與ka 及kd 相關。解離常數值可直接藉由熟知方法測定，且甚至複合混合物之解離常數值可藉由諸如例如Caceci等人(1984, Byte 9: 340-362)中所闡述之彼等方法計算出。舉例而言，KD 可使用諸如由Wong及Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432)所揭示之雙過濾片硝化纖維過濾器結合分析來確立。評估本發明之抗體或多肽針對靶抗原之結合能力之其他標準分析為此項技術中已知的，包括例如ELISA、西方墨點法、RIA及流式細胞測量術分析及本文中其他地方例示之其他分析。抗體之結合動力學及結合親和力亦可藉由此項技術中已知之標準分析來評定，諸如例如藉由使用Biacore™系統或KinExA進行表面電漿子共振(SPR)。
核酸分子
在一個態樣中，本文所揭示之一些實施例係關於編碼本發明之多價多肽及多價抗體之重組核酸分子；含有可操作地連接至允許多價多肽及多價抗體在宿主細胞或活體外不含細胞表現系統中表現之調節因子序列之此等核酸分子的表現卡匣及表現載體。
術語「核酸分子」及「聚核苷酸」在本文中可互換使用，且係指RNA及DNA分子兩者，包括包含cDNA、基因組DNA、合成DNA之核酸分子，及含有核酸類似物之DNA或RNA分子。核酸分子可為雙股或單股(例如有義股或反義股)。核酸分子可含有非習知或經修飾之核苷酸。如本文可互換使用之術語「聚核苷酸序列」及「核酸序列」係指聚核苷酸分子之序列。本文中使用如37 CFR §1.822中所闡述之核苷酸鹼基之命名法。
本發明之核酸分子可為任何長度之核酸分子，包括一般在約5 Kb與約50 Kb之間，例如在約5 Kb與約40 Kb之間，在約5 Kb與約30 Kb之間，在約5 Kb與約20 Kb之間，或在約10 Kb與約50 Kb之間，例如在約15 Kb至30 Kb之間，在約20 Kb與約50 Kb之間，在約20 Kb與約40 Kb，約5 Kb與約25 Kb，或約30 Kb與約50 Kb之間的核酸分子。
如本文所使用，術語「重組」核酸分子係指已經由人工干預改變之核酸分子。作為非限制性實例，cDNA為重組DNA分子，正如已藉由活體外聚合酶反應產生或連接子已附接或已整合至載體中之任何核酸分子，諸如選殖載體或表現載體。作為非限制性實例，重組核酸分子：1)已例如使用化學或酶促技術(例如藉由使用化學核酸合成或藉由使用用於核酸分子之複製、聚合、核酸外切消化、核酸內切酶消化、接合、逆轉錄、轉錄、鹼基修飾(包括例如甲基化)或再結合(包括同源及位點特異性再結合)之酶活體外合成或經修飾；2)包括在自然界中未結合之結合核苷酸序列；3)已使用分子克隆技術經工程改造以使得其相對於天然存在之核酸分子序列不具有一或多個核苷酸；及/或4)已使用分子克隆技術操作以使得其相對於天然存在之核酸序列具有一或多個序列變化或重排。
在本文所揭示之一些實施例中，本發明之核酸分子包括編碼多價多肽之核苷酸序列，其包括(i)第一胺基酸序列，其包括能夠結合至受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)之第一多肽模組；及(ii)第二胺基酸序列，其包括能夠結合至經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體之第二多肽模組，其中第一多肽模組可操作地連接至第二多肽模組。在一些實施例中，本發明之核酸分子包括編碼多價抗體之核苷酸序列，其包括(i)對一或多種受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)具有特異性的第一多肽模組，及(ii)對經由磷酸化機制傳導信號之一或多種細胞表面受體具有特異性的第二多肽模組。
在本文所揭示之一些實施例中，核酸分子包括編碼包括以下之多肽之核苷酸序列：(i)與如本文所揭示之多價多肽之胺基酸序列或其功能片段具有至少80%序列一致性的胺基酸序列；或(ii)與如本文所揭示之多價抗體或其功能片段具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。核酸分子包括編碼包括以下之多肽之核苷酸序列：(i)與如本文所揭示之多價多肽之胺基酸序列或其功能片段具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列；或(ii)與如本文所揭示之多價抗體或其功能片段具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，核酸分子包括與選自由以下組成之群的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性的核苷酸序列：SEQ ID NO: 1、3、5、9、11、13、15、19、21、23、25、27及53或其功能片段。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 3之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 5之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。
在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 9之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 13之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。
在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 15之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 19之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 21之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。
在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 23之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 25之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 27之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包括與SEQ ID NO: 53之核苷酸序列或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列。
本文所揭示之一些實施例係關於包括如本文所揭示之重組核酸分子之載體或表現卡匣。如本文所使用，術語「表現卡匣」係指含有編碼序列及活體內及/或離體引導編碼序列在受體細胞中之適當轉錄及/或轉譯之足夠調節性資訊的基因物質之構築體。可將表現卡匣插入用於靶向所需宿主細胞之載體中及/或個體中。因而，術語表現卡匣可與術語「表現構築體」互換使用。
本文亦提供含有編碼本文所揭示之多價多肽及多價抗體中之任一者之核酸分子中之一或多者的載體、質體或病毒。上文所描述之核酸分子可含於能夠引導其在例如已經載體轉導之細胞中之表現之載體內。用於真核及原核細胞中之適合的載體為此項技術中已知的且可商購的或容易由熟習此項技術者製備。額外載體亦可發現於例如Ausubel, F. M.,等人,Current Protocols in Molecular Biology , (Current Protocol, 1994) 及Sambrook等人, 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 」,第2版 (1989)中。
應理解，並非所有載體及表現控制序列將同等地作用良好以表現本文所描述之DNA序列。所有宿主亦將與相同表現系統同等地作用良好。然而，熟習此項技術者可在不進行過度實驗之情況下在此等載體、表現控制序列及宿主中進行選擇。舉例而言，在選擇載體時，必須考慮宿主，因為載體必須在宿主中複製。亦應考慮載體之複本數、控制複本數之能力及由載體編碼之任何其他蛋白質(諸如抗生素標記物)之表現。舉例而言，可使用之載體包括允許編碼本發明之多價多肽及多價抗體之DNA在複本數中擴增之彼等者。此類可擴增載體為此項技術中已知的。其包括例如能夠藉由DHFR擴增(參見例如Kaufman,美國專利第4,470,461號)或穀醯胺酸合成酶(「GS」)擴增(參見例如美國專利第5,122,464號及歐洲公佈申請案EP 338,841)來擴增載體。
因此，在一些實施例中，本發明之多價多肽及多價抗體可自載體，一般表現載體表現。載體適用於宿主細胞中之自主複製或可在引入至宿主細胞中後整合至宿主細胞之基因組中，且從而與宿主基因組(例如非游離型哺乳動物載體)一起複製。表現載體能夠引導與其可操作地連接之編碼序列之表現。一般而言，在重組DNA技術中有用之表現載體通常呈質體(載體)形式。然而，亦包括表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)之其他形式。
例示性重組表現載體可包括基於用於表現之宿主細胞選擇之一或多種調節序列，其可操作地連接至待表現核酸序列。
可經由習知轉化或轉染技術將DNA載體引入原核或真核細胞中。用於轉化或轉染宿主細胞之適合的方法可見於Sambrook等人(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manua l (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)及其他標準分子生物學實驗室手冊。
編碼本發明之多價多肽及多價抗體之核酸序列可最佳化以便相關宿主細胞中之表現。舉例而言，序列之G-C含量可調節至給定細胞宿主之平均水準，如參考宿主細胞中表現之已知基因所計算。用於密碼子最佳化之方法為此項技術中已知的。可使本文所揭示之多價多肽及多價抗體之編碼序列內之密碼子使用最佳化以增強宿主細胞中之表現，從而使得編碼序列內約1%、約5%、約10%、約25%、約50%、約75%或多達100%的密碼子已經最佳化以便特定宿主細胞中之表現。
適合於用途之載體包括用於細菌中之T7類載體、用於哺乳動物細胞中之pMSXND表現載體及用於昆蟲細胞中之桿狀病毒衍生載體。在一些實施例中，編碼此類載體中之目標多價多肽或多價抗體之核酸插入件可操作地連接至基於例如所探尋之表現之細胞類型而選擇的啟動子。
在選擇表現控制序列時，亦應考慮多種因素。其包括例如序列相對強度、其可控性及其與編碼目標多價多肽或多價抗體之實際DNA序列之相容性，尤其關於可能的二級結構。應藉由考慮其與所選載體之相容性、本發明之DNA序列編碼之產物之毒性、其分泌特徵、其恰當摺疊多肽之能力、其醱酵或培養需求及DNA序列編碼之產物之純化便利性來選擇宿主。
在此等參數內，熟習此項技術者可選擇將在醱酵時或在大規模動物培養物中例如使用CHO細胞或COS 7細胞表現所需DNA序列之各種載體/表現控制序列/宿主組合。
在一些實施例中，表現控制序列及表現載體之選擇將視宿主之選擇而定。可採用廣泛多種表現宿主/載體組合。用於真核宿主之適用的表現載體之非限制性實例包括例如具有來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及細胞巨大病毒之表現控制序列之載體。用於細菌宿主之適用的表現載體之非限制性實例包括已知細菌質體，諸如來自大腸桿菌之質體，包括El、pCRI、pER32z、pMB9及其衍生物；較寬宿主範圍質體，諸如RP4、噬菌體DNA，例如噬菌體λ之眾多衍生物，例如NM989及其他DNA噬菌體，諸如M13及絲狀單股DNA噬菌體。用於酵母細胞之適用的表現載體之非限制性實例包括2µ質體及其衍生物。用於昆蟲細胞之適用的載體之非限制性實例包括pVL 941及pFastBac™ 1。
另外，廣泛多種表現控制序列中之任一者可用於此等載體中。此類適用的表現控制序列包括與前述表現載體之結構性基因相關之表現控制序列。適用的表現控制序列之實例包括例如SV40或腺病毒之前及後啟動子、lac系統、trp系統、TAC或TRC系統；噬菌體λ之主要操縱子及啟動子區域，例如PL；fd鞘蛋白之對照區域；3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶之啟動子；酸磷酸酶之啟動子，例如PhoA；酵母a配對系統之啟動子；桿狀病毒之多面體啟動子；及已知控制原核或真核細胞或其病毒之基因表現之其他序列；及其各種組合。
T7啟動子可用於細菌中，多角體蛋白啟動子可用於昆蟲細胞中，且細胞巨大病毒或金屬硫蛋白啟動子可用於哺乳動物細胞中。此外，在較高真核細胞之情況下，組織特異性及細胞類型特異性啟動子為廣泛可用的。此等啟動子根據其引導核酸分子在體內給定組織或細胞類型中之表現的能力如此命名。熟習此項技術者將容易地瞭解可用於引導核酸表現之眾多啟動子及其他調節元件。
除了促進插入的核酸分子之轉錄之序列之外，載體可含有複製起點及編碼可選擇標記物之其他基因。舉例而言，新黴素耐性(neoR)基因賦予表現該基因之細胞G418耐性，且因此准許經轉染細胞之表現型選擇。熟習此項技術者可容易地判定給定調節元件或可選擇標記物是否適用於特定實驗情境。
可用於本發明中之病毒載體包括例如反轉錄病毒、腺病毒及腺相關載體、疱疹病毒、猿猴病毒40 (SV40)及牛乳頭狀瘤病毒載體(參見例如Gluzman (編), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。
含有及表現編碼本文所揭示之目標多價多肽或多價抗體之核酸分子的原核或真核細胞亦為本發明之特徵。本發明之細胞為經轉染細胞，例如已藉助於重組DNA技術引入核酸分子，例如編碼突變型IL-2多肽之核酸分子的細胞。此類細胞之後代亦被認為是在本發明之範疇內。
表現系統之精確組分不為關鍵的。舉例而言，如本文所揭示之多價多肽或多價抗體可在諸如細菌大腸桿菌之原核宿主中或在諸如昆蟲細胞(例如Sf21細胞)或哺乳動物細胞(例如COS細胞、NIH 3T3細胞或HeLa細胞)之真核宿主中產生。此等細胞可購自多種來源，包括美國菌種保存中心(American Type Culture Collection) (Manassas, Va.)。在選擇表現系統時，重要的僅有組分彼此相容。業內人士或一般技術能夠進行此類判定。此外，若在選擇表現系統時需要指南，則熟習此項技術者可參考Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1993)及Pouwels等人(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987)。
表現多肽可使用常規生物化學程序自表現系統純化，且可例如用作如本文所描述之治療劑。
在一些實施例中，所獲得之多價多肽或多價抗體將視用於產生多價多肽或多價抗體之宿主生物體而定經糖基化或未經糖基化。若選擇細菌作為宿主，則所產生之多價多肽或多價抗體將未經糖基化。另一方面，真核細胞將使多價多肽或多價抗體糖基化，但可能不以與天然多肽相同的方式經糖基化。轉化宿主產生之多價多肽或多價抗體可根據此項技術中已知之任何適合的方法純化。所產生之多價多肽或多價抗體可使用陽離子交換、凝膠過濾及或反相液相層析自諸如大腸桿菌之細菌中產生之包涵體或自產生給定多價多肽或多價抗體之哺乳動物或酵母培養物之改良性培養基分離。
另外或替代地，構築編碼本發明之多價多肽或多價抗體之DNA序列之另一例示性方法係藉由化學合成。此包括藉由編碼展現所描述特性之多價多肽或多價抗體之蛋白質序列之化學手段來引導肽合成。此方法可在影響多價多肽或多價抗體與靶蛋白之結合親和力之位置處併入天然及非天然胺基酸兩者。替代地，編碼所需多價多肽或多價抗體之基因可藉由化學手段使用寡核苷酸合成器合成。基於所需多價多肽或多價抗體之胺基酸序列設計此類寡核苷酸，且一般選擇有助於將產生重組多價多肽或多價抗體之宿主細胞之彼等密碼子。在此方面，在此項技術中充分認識到，遺傳密碼為簡併的，即，可藉由多於一個密碼子編碼之胺基酸。舉例而言，Phe(F)藉由兩個密碼子TIC或TTT編碼，Tyr(Y)藉由TAC或TAT編碼，且his(H)藉由CAC或CAT編碼。Trp(W)藉由單一密碼子TGG編碼。因此，熟習此項技術者應瞭解，對於編碼特定多價多肽或多價抗體之給定DNA序列，將存在將編碼多價多肽或多價抗體之多個DNA簡併序列。舉例而言，應瞭解，除了序列表中所提供之多價多肽或多價抗體之DNA序列之外，將存在編碼本文所揭示之多價多肽或多價抗體之多個簡併DNA序列。此等簡併DNA序列考慮在本發明之範疇內。因此，在本發明之情況下，「其簡併變體」意謂編碼特定多價多肽或多價抗體且從而實現特定多價多肽或多價抗體之表現的所有DNA序列。
編碼目標多價多肽或多價抗體之DNA序列(無論藉由定點突變誘發、化學合成抑或其他方法製備)亦可包括編碼信號序列之DNA序列。此類信號序列(若存在)應為藉由所選細胞識別多價多肽或多價抗體表現之一種信號序列。其可為原核、真核的或兩者之組合。一般而言，包括信號序列視其是否需要自產生其之重組細胞分泌如本文所揭示之多價多肽或多價抗體而定。若所選細胞為原核的，則DNA序列一般不編碼信號序列。若所選細胞為真核的，則一般包括信號序列。
所提供之核酸分子可含有天然存在之序列或不同於天然存在之彼等者，但歸因於遺傳密碼簡併而編碼相同多肽之序列。此等核酸分子可由RNA或DNA (例如基因組DNA、cDNA或合成DNA，諸如藉由基於胺基磷酸酯之合成產生)或此等類型核酸內核苷酸之組合或修飾組成。另外，核酸分子可為雙股或單股(例如有義股或反義股)。
核酸分子不限於編碼多肽之序列；亦可包括處於編碼序列(例如IL-2之編碼序列)上游或下游之非編碼序列中之一些或全部。一般熟習分子生物學技術者熟悉用於分離核酸分子之常規程序。其可例如藉由用限制性核酸內切酶處理基因組DNA或藉由進行聚合酶鏈反應(PCR)產生。在核酸分子為核糖核酸(RNA)之情況下，分子可例如藉由活體外轉錄產生。
本發明之例示性經分離之核酸分子可包括在天然狀態下未發現如此之片段。因此，本發明涵蓋重組分子，諸如其中核酸序列(例如編碼突變體IL-2之序列)併入載體(例如質體或病毒載體)中或異源細胞基因組(或在除天然染色體位置外之位置處之同源細胞基因組)中之彼等者。
醫藥組合物
在一些實施例中，本發明之多價多肽及多價抗體可併入組合物(包括醫藥組合物)中。此類組合物典型地包括多價多肽及/或多價抗體及醫藥學上可接受之賦形劑。
適合於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在水溶性情況下)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。關於靜脈內投與，適合載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物均應為無菌的且應具有流體性至存在易於注射能力之程度。其應在製造及儲存條件下穩定且必須保存以防諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。可例如藉由使用諸如卵磷脂之塗層，藉由在分散液之情況下維持所需粒子尺寸及藉由使用界面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉來維持適當流動性。微生物作用之預防可藉由各種抗菌劑及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，組合物中將一般包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)、氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
可藉由如下方法來製備無菌可注射溶液：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中，視需要隨後進行過濾滅菌。一般而言，藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及來自上文所列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉劑之情況下，通用製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其自其先前經無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何其他所需成分之粉劑。
經口組合物(若使用)通常包括惰性稀釋劑或可食用載劑。出於經口治療性投與之目的，活性化合物(例如本發明之多價多肽、多價抗體及/或核酸分子)可與賦形劑一起併入且以錠劑、糖衣錠或膠囊(例如明膠膠囊)形式使用。亦可使用流體載劑製備經口組合物以用作漱口劑。可包括醫藥學上相容之黏合劑及/或佐劑物質作為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠及其類似物可含有以下成分或具有類似性質之化合物中之任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、Primogel™或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes™；滑動劑，諸如膠狀二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙調味劑。
在藉由吸入投與之情況下，本發明之目標多價多肽及多價抗體以來自含有適合的推進劑，例如氣體(諸如二氧化碳)之按壓容器或分配器或噴霧器之氣溶膠噴霧形式遞送。此類方法包括美國專利第6,468,798號中所描述之彼等者。
亦可藉由經黏膜或經皮手段全身性投與本發明之目標多價多肽及多價抗體。對於經黏膜或經皮投與，在調配物中使用適於待滲透之障壁的滲透劑。此類滲透劑一般為此項技術中已知的，且對於經黏膜投與，包括例如清潔劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投與可經由使用經鼻噴霧或栓劑實現。對於經皮投與，如此項技術中一般已知，將活性化合物調配成軟膏、油膏、凝膠或乳膏。
在一些實施例中，本發明之多價多肽及多價抗體亦可製備為栓劑(例如與諸如可可脂及其他甘油酯之習知栓劑基質一起)或保留灌腸劑形式以便直腸遞送。
在一些實施例中，本發明之多價多肽及多價抗體亦可藉由使用此項技術中已知之方法轉染或感染來投與，該等方法包括(但不限於)McCaffrey等人 (Nature 418:6893, 2002), Xia等人 (Nature Biotechnol . 20: 1006-1010, 2002)或Putnam (Am. J. Health Syst. Pharm. 53: 151-160, 1996, 在Am. J. Health Syst. Pharm . 53:325, 1996之勘誤表)中所描述之方法。
在一些實施例中，本發明之目標多價多肽及多價抗體與將保護多價多肽及多價抗體而不會自身體快速消除之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。可使用標準技術製備此類調配物。材料亦可商業上獲自Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals, Inc。脂質體懸浮液(包括靶向具有針對病毒抗原之單株抗體之經感染細胞的脂質體)亦可用作醫藥學上可接受之載劑。此等物質可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如如美國專利第4,522,811號中所描述。
如在下文更詳細地描述，本發明之多價多肽及多價抗體亦可經修飾以實現延長的作用持續時間，諸如藉由聚乙二醇化、醯化、Fc融合、鍵聯至諸如白蛋白之分子等。在一些實施例中，多價多肽或多價抗體可進一步經修飾以延長其活體內及/或離體半衰期。適合於修飾本發明之多價多肽或多價抗體之已知策略及方法之非限制性實例包括(1)用諸如聚乙二醇(「PEG」)之高度可溶性大分子化學修飾本文所描述之多價多肽或多價抗體，其預防多價多肽或多價抗體與蛋白酶接觸；及(2)使本文所描述之多價多肽或多價抗體與諸如白蛋白之穩定蛋白質共價連接或共軛。因此，在一些實施例中，本發明之多價多肽或多價抗體可融合至諸如白蛋白之穩定蛋白質。舉例而言，人類白蛋白已知為用於增強與其融合之多肽之穩定性的最有效蛋白質中之一者，且存在多種報導的此類融合蛋白。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物包括一或多種聚乙二醇化試劑。如本文所使用，術語「聚乙二醇化」係指藉由使聚乙二醇(PEG)共價附接至蛋白質修飾蛋白質，其中「聚乙二醇化」指代具有附接PEG之蛋白質。具有約10,000道爾頓至約40,000道爾頓之視情況選用之尺寸範圍之一系列PEG或PEG衍生物可使用多種化學物質附接至本發明之重組多肽。在一些實施例中，聚乙二醇化試劑選自甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SPA)、mPEG-丁酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SBA)、mPEG-丁二酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SS)、mPEG-碳酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SC)、mPEG-戊二酸琥珀醯亞胺酯(mPEG-SG)、mPEG-N-羥基-丁二醯亞胺(mPEG-NHS)、mPEG-三氟乙磺酸酯及mPEG-醛。在一些實施例中，聚乙二醇化試劑為聚乙二醇；例如該聚乙二醇化試劑為平均分子量為20,000道爾頓、共價鍵結至本發明之多價多肽及多價抗體之N端甲硫胺酸殘基的聚乙二醇。
因此，在一些實施例中，本發明之多價多肽及多價抗體用一或多種聚乙二醇部分經化學修飾，例如聚乙二醇化；或具有類似修飾，例如PAS化。在一些實施例中，PEG分子或PAS分子與多價多肽或多價抗體之一或多個胺基酸側鏈共軛。在一些實施例中，聚乙二醇化或PAS化之多價多肽或多價抗體在僅一個胺基酸上含有PEG或PAS部分。在其他實施例中，聚乙二醇化或PAS化之多價多肽或多價抗體在兩個或多於兩個胺基酸上含有PEG或PAS部分，例如附接至兩個或多於兩個、五個或多於五個、十個或多於十個、十五個或多於十五個，或二十個或多於二十個不同胺基酸殘基。在一些實施例中，PEG或PAS鏈為2000、大於2000，5000、大於5,000、10,000、大於10,000，大於10,000，20,000、大於20,000及30,000 Da。PAS化之多價多肽或多價抗體可直接經由胺基、硫氫基、羥基或羧基偶合至PEG或PAS (例如不具有連接基團)。在一些實施例中，本發明之多價多肽或多價抗體共價鍵結至平均分子量為20,000道爾頓之聚乙二醇。
在一些實施例中，本發明之多價多肽或多價抗體可進一步經修飾以延長其活體內及/或離體半衰期。適合於修飾本發明之多價多肽或多價抗體之已知策略及方法之非限制性實例包括(1)用諸如聚乙二醇(「PEG」)之高度可溶性大分子化學修飾本文所描述之多價多肽或多價抗體，其預防多價多肽或多價抗體與蛋白酶接觸；及(2)使本文所描述之多價多肽或多價抗體與諸如白蛋白之穩定蛋白質共價連接或共軛。因此，在一些實施例中，本發明之多價多肽或多價抗體可融合至諸如白蛋白之穩定蛋白質。舉例而言，人類白蛋白已知為用於增強與其融合之多肽之穩定性的最有效蛋白質中之一者，且存在多種報導的此類融合蛋白。
治療方法
投與本文所描述之治療組合物，例如多價多肽、多價抗體、核酸、重組細胞、細胞培養物及醫藥組合物中之任一者可用於治療相關疾病，諸如癌症及慢性感染。在一些實施例中，如本文所描述之多價多肽、多價抗體、核酸、重組細胞、細胞培養物及/或醫藥組合物可併入治療劑中，用於治療患有、疑似患有或可能處於罹患一或多種與檢查點抑制相關之健康疾病或自體免疫疾病高風險下的個體之方法中。例示性自體免疫疾病及健康疾病可包括(但不限於)癌症及慢性感染。
因此，在一個態樣中，本發明之一些實施例係關於在個體內調節經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體所介導之細胞信號傳導的方法，該方法包括向個體投與包括有效量之(i)如本文所揭示之多價多肽或(ii)如本文所揭示之多價抗體的第一療法。在另一態樣中，本發明之一些實施例係關於用於治療有需要個體之健康疾病之方法，該方法包括向個體投與包括有效量之(i)如本文所揭示之多價多肽或(ii)如本文所揭示之多價抗體的第一療法。
醫藥組合物經調配可與其預期投與途徑相容。本發明之多價多肽及多價抗體可經口或藉由吸入給予，但其更可能將經由非經腸途徑投與。非經腸投與途徑之實例包括例如靜脈內、皮內、皮下、經皮(局部)、經黏膜及直腸投與。用於非經腸施用之溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼，諸如單及/或二-鹼性磷酸鈉、鹽酸或氫氧化鈉調節pH (例如至約7.2-7.8，例如7.5 之pH)。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
本發明之此類目標多價多肽及多價抗體之劑量、毒性及治療功效可藉由細胞培養物或實驗動物中之標準醫藥程序確定，該等程序例如用於測定LD50 (50%群體致死之劑量)及ED50 (50%群體治療學上有效之劑量)。毒性與治療效果之間的劑量比率為治療指數且其可表示為比率LD50/ED50。展現高治療指數之化合物一般為適合的。雖然可使用展現毒性副作用之化合物，但應謹慎設計將此類化合物靶向受影響組織位點之遞送系統，以便使對未感染細胞之潛在損害降至最低且由此減少副作用。
自細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配一系列用於人類的劑量。此類化合物之劑量一般處於循環濃度之範圍內，包括具有很小毒性或無毒性之ED50 。劑量可視所用劑型及所用投與途徑而在此範圍內變化。對於本發明之方法中所使用之任何化合物，治療學上有效劑量可起初根據細胞培養物分析進行估算。可在動物模型中調配劑量以達成包括如在細胞培養物中所測定之IC50 (例如達成症狀之半最大抑制的測試化合物之濃度)之循環血漿濃度範圍。此類資訊可用於更準確地確定適用於人類之劑量。血漿中之含量可例如藉由高效液相層析法量測。
本文所描述之治療組合物，例如多價多肽、多價抗體、核酸、重組細胞、細胞培養物及醫藥組合物可一者每天一次或多次至每週一次或多次投與；包括每隔一天一次。熟習此項技術者將瞭解，某些因素可影響有效地治療個體所需之劑量及時序，該等因素包括(但不限於)疾病之嚴重程度、先前治療、個體之一般健康及/或年齡及其他所存在疾病。另外，用治療有效量之本發明之目標多價多肽及多價抗體治療個體可包括單一治療或可包括一系列治療。在一些實施例中，組合物每8小時投與，持續五天，繼而2至14天，例如9天之休息期，繼而每8小時投與額外五天。關於多價多肽或多價抗體，本發明之多價多肽或多價抗體之治療有效量(例如有效劑量)視所選多價多肽或多價抗體而定。舉例而言，可投與大致0.001至0.1 mg/kg患者體重範圍內之單次劑量；在一些實施例中，可投與約0.005、0.01、0.05 mg/kg。
在一個態樣中，本文提供一種在個體內調節經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體所介導之細胞信號傳導之方法。該方法藉由向個體投與有效量之(i)如本文所揭示之多價多肽或(ii)如本文所揭示之多價抗體來進行。在另一態樣中，本文提供一種用於治療有需要個體之疾病之方法。該方法藉由向個體投與有效量之(i)如本文所揭示之多價多肽或(ii)如本文所揭示之多價抗體來進行。
如上文所論述，治療有效量包括當向個體，諸如患有疾病、疑似患有疾病或處於疾病風險下之個體投與時足以促進特定作用之治療性組合物之量。在一些實施例中，有效量包括足以預防或延遲疾病症狀發展、改變疾病症狀病程(例如(但不限於)減緩疾病症狀進展)或逆轉疾病症狀之量。應理解，對於任何給定情況，適當的有效量可由一般熟習此項技術者使用常規實驗測定。
包括用於治療疾病之所揭示之治療性組合物之治療的療效可由熟練的臨床師測定。然而，若疾病跡象或症狀中至少任一者或全部得到改良或改善，則治療被視為有效治療。亦可藉由個體未惡化(如藉由住院所評定)或不需要醫學干預(例如疾病進展停止或至少減緩)來量測療效。量測此等指標之方法已為熟習此項技術者所知及/或描述於本文中。治療包括個體或動物(一些非限制性實例包括人類或哺乳動物)中之疾病之任何治療，且包括：(1)抑制疾病，例如遏制或減緩症狀進展；或(2)緩解疾病，例如使得症狀消退；及(3)預防或降低症狀發展可能性。
在所揭示之方法之一些實施例中，所投與之多價多肽或多價抗體將RPTP活性補充至細胞表面受體之空間鄰近處，引發磷酸酶活性且降低細胞表面受體之磷酸化水準。在一些實施例中，所投與之多價多肽或多價抗體將RPTP補充至細胞表面受體之空間鄰近處，例如RPTP與細胞表面受體之間的距離為小於約500埃，諸如約5埃至約500埃之距離。在一些實施例中，空間鄰近度量至小於約5埃，小於約20埃，小於約50埃，小於約75埃，小於約100埃，小於約150埃，小於約250埃，小於約300埃，小於約350埃，小於約400埃，小於約450埃，或小於約500埃。在一些實施例中，空間鄰近度量至小於約100埃。在一些實施例中，空間鄰近度量至小於約50埃。在一些實施例中，空間鄰近度量至小於約20埃。在一些實施例中，空間鄰近度量至小於約10埃。在一些實施例中，空間鄰近度在約10至100埃，約50至150埃，約100至200埃，約150至250埃，約200至300埃，約250至350埃，約300至400埃，約350至450埃，或約400至500埃範圍內。在一些實施例中，所投與之多價多肽或多價抗體將RPTP補充至空間鄰近處以使得RPTP距離細胞表面受體約10至100埃。在一些實施例中，空間鄰近度量至小於約100埃。在一些實施例中，RPTP與細胞表面受體之間的距離為小於約250埃，或者小於約200埃，或者小於約150埃，或者小於約120埃，或者小於約100埃，或者小於約80埃，或者小於約70埃，或者小於約50埃。
在一些實施例中，當RPTP及細胞表面受體被帶至一個至另一個之空間鄰近處時，細胞表面受體之磷酸化水準可相比於在類似條件下未經治療之個體中之細胞表面受體之磷酸化水準降低至少或至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%，或任何兩個前述值之範圍，例如約20%至約60% (包括其間此等百分比之值)。
在一些實施例中，投與多價多肽或多價抗體賦予個體中之免疫檢查點受體之降低的活性。免疫檢查點受體之活性降低可相比於在類似條件下未經治療之個體中之免疫檢查點受體之活性減小至少或至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%或任何兩個前述值之範圍，例如約20%至約60% (包括其間此等百分比之值)。
在所揭示之方法之一些實施例中，投與多價多肽或多價抗體賦予個體中之T細胞活性增強。T細胞活性可相比於在類似條件下未經治療之個體中之T細胞活性增強至少或至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%或任何兩個前述值之範圍，例如約20%至約60% (包括其間此等百分比之值)。在一些實施例中，藉由活化T細胞中之CD69及/或CD25上調提高來測定T細胞活性增強。在一些實施例中，藉由活化T細胞中之IL-2分泌提高來測定T細胞活性增強。在一些實施例中，藉由活化T細胞產量提高來測定T細胞活性增強。
在所揭示之方法之一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物為人類。在一些實施例中，個體患有或疑似患有與細胞表面受體所介導之細胞信號傳導之抑制相關的疾病。適合於藉由本發明之組合物及方法治療之疾病包括(但不限於)癌症、自體免疫疾病、發炎疾病及傳染病。在一些實施例中，疾病為癌症或慢性感染。
如上文所論述，本文所描述之多價多肽、多價抗體、核酸、重組細胞、細胞培養物及/或醫藥組合物中之任一者可與諸如化學治療劑或抗癌劑或抗癌療法之一或多種額外治療劑組合投與。「與」一或多種額外治療劑「組合」投與包括以任何次序之同時(並行)及連續投與。在一些實施例中，一或多種額外治療劑、化學治療劑、抗癌劑或抗癌療法選自由以下組成之群：化學療法、放射線療法、免疫療法、激素療法、毒素療法及手術。「化學療法」及「抗癌劑」在本文中可互換使用。可使用各種類別之抗癌劑。非限制性實例包括：烷基化劑、抗代謝物、蒽環黴素、植物鹼、拓樸異構酶抑制劑、鬼臼毒素、抗體(例如單株或多株)、酪胺酸激酶抑制劑(例如甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate) (Gleevec®或Glivec®))、激素治療、可溶性受體及其他抗腫瘤藥。
拓樸異構酶抑制劑亦為可用於本文中之其他類別之抗癌劑。拓樸異構酶為維持DNA之拓樸的必需酶。藉由擾亂恰當的DNA超螺旋化，I型或II型拓樸異構酶之抑制干擾DNA之轉錄及複製兩者。一些I型拓樸異構酶抑制劑包括喜樹鹼：伊立替康(irinotecan)及拓朴替康(topotecan)。II型抑制劑之實例包括安吖啶(amsacrine)、依託泊苷(etoposide)、磷酸依託泊苷及替尼泊苷(teniposide)。此等為表鬼臼毒素之半合成衍生物，其為美國鬼臼屬(American Mayapple)根中天然存在之生物鹼(美洲鬼臼(Podophyllum peltatum ))。
抗腫瘤藥包括免疫抑制劑放線菌素(dactinomycin)、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、博萊黴素(bleomycin)、二氯甲二乙胺、環磷醯胺、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、異環磷醯胺(ifosfamide)。抗腫瘤化合物一般藉由以化學方式修飾細胞DNA起作用。
烷基化劑可在存在於細胞中之條件下使多種親核性官能基烷基化。順鉑(Cisplatin)及卡鉑(carboplatin)及奧賽力鉑(oxaliplatin)為烷基化劑。其藉由在生物學上重要的分子中與胺基、羧基、巰基及磷酸酯基形成共價鍵而削弱細胞功能。
長春花生物鹼結合至微管蛋白上之特異性位點，抑制微管蛋白組裝至微管中(細胞循環之M期)。長春花生物鹼包括：長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)及長春地辛(vindesine)。
抗代謝物類似嘌呤(硫唑嘌呤、巰基嘌呤)或嘧啶，且在細胞循環之「S」期期間預防此等物質併入DNA中，停止正常發展及分裂。抗代謝物亦影響RNA合成。
植物鹼及萜類獲自植物且藉由預防微管功能阻斷細胞分裂。因為微管對於細胞分裂而言為至關重要的，在不存在微管之情況下，細胞分裂無法存在。主要實例為長春花生物鹼及紫杉烷。鬼臼毒素為植物衍生之化合物，其已報導幫助消化以及用於產生兩種其他細胞生長抑制藥物(依託泊苷及替尼泊苷)。其預防細胞進入G1期(DNA複製開始)及DNA複製(S期)。
作為基團之紫杉烷包括太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多烯紫杉醇(docetaxel)。太平洋紫杉醇為天然產物，原先已知為紫杉醇且首先衍生自太平洋紫杉樹之樹皮。多烯紫杉醇為太平洋紫杉醇之半合成類似物。紫杉烷增強微管穩定性，預防染色體在分裂後期期間分離。
在一些實施例中，抗癌劑可選自雷米卡德(remicade)、多烯紫杉醇(docetaxel)、塞內昔布(celecoxib)、美法侖(melphalan)、地塞米松(dexamethasone) (Decadron®)、類固醇、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatinum)、替莫唑胺(temozolomide)、依託泊苷(etoposide)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、替莫達(temodar)、卡鉑(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、戈利德爾(gliadel)、他莫昔芬(tamoxifen)、拓朴替康(topotecan)、甲胺喋呤(methotrexate)、吉非替尼(gefitinib) (Iressa®)、紫杉醇(taxol)、紫杉德(taxotere)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、伊立替康(irinotecan)、希羅達(xeloda)、CPT-11、干擾素α、聚乙二醇化干擾素α (例如PEG INTRON-A)、卡培他濱(capecitabine)、順鉑(cisplatin)、噻替派(thiotepa)、氟達拉濱(fludarabine)、卡鉑(carboplatin)、脂質體道諾黴素(liposomal daunorubicin)、阿糖胞苷(cytarabine)、紫杉特爾(doxetaxol)、紫杉醇(pacilitaxel)、長春鹼(vinblastine)、IL-2、GM-CSF、達卡巴嗪(dacarbazine)、長春瑞濱(vinorelbine)、唑來膦酸(zoledronic acid)、帕米膦酸鹽(palmitronate)、比阿辛(biaxin)、白消安(busulphan)、潑尼松(prednisone)、硼替佐米(bortezomib) (Velcade®)、雙膦酸鹽(bisphosphonate)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、長春新鹼(vincristine)、小紅莓(Doxil®)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、更昔洛韋(ganciclovir)、阿德力黴素(adriamycin)、雌氮芥磷酸鈉(estrainustine sodium phosphate) (Emcyt®)、舒林酸(sulindac)、依託泊苷(etoposide)及其任何組合。
在其他實施例中，抗癌劑可選自硼替佐米、環磷醯胺、地塞米松、小紅莓、干擾素-α、來那度胺(lenalidomide)、美法侖、聚乙二醇化干擾素-α、潑尼松(prednisone)、沙立度胺(thalidomide)或長春新鹼。
在一些實施例中，如本文所描述之治療方法進一步包括免疫療法。在一些實施例中，免疫療法包括投與一或多種檢查點抑制劑。因此，本文所描述之治療方法之一些實施例包括進一步投與抑制一或多種免疫檢查點分子之化合物。在一些實施例中，抑制一或多種免疫檢查點分子之化合物包括拮抗抗體。在一些實施例中，拮抗抗體為伊派利單抗(ipilimumab)、納武單抗、帕博利珠單抗、德瓦魯單抗(durvalumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、曲美單抗(tremelimumab)或阿維魯單抗(avelumab)。
在一些態樣中，一或多種抗癌療法包括輻射療法。在一些實施例中，輻射療法可包括投與輻射以殺死癌細胞。輻射與細胞中之分子，諸如DNA相互作用以誘發細胞死亡。輻射亦可損傷細胞及細胞核膜及其他細胞器。視輻射類型而定，DNA損傷機制可隨著相對生物效果而改變。舉例而言，重鏈粒子(亦即，質子、中子)直接損傷DNA且具有更大相對生物效果。電磁輻射經由短生命期、主要由細胞水離子化產生之羥基自由基導致間接離子化作用。輻射臨床應用由外部射束輻射(來自外部來源)及近接療法(使用植入或插入患者中之輻射來源)組成。外部射束輻射由X射線及/或γ射線組成，而近接療法採用衰減且發射α粒子或β粒子以及γ射線之放射性核。本文中亦涵蓋之輻射包括例如將放射性同位素引導遞送至癌細胞中。本文中亦涵蓋DNA損傷因子之其他形式，諸如微波及UV照射。
輻射可以單次劑量或劑量分級時程中之一系列較小劑量提供。本文中涵蓋之輻射之量在約1至約100 Gy範圍內，包括例如約5至約80，約10至約50 Gy，或約10 Gy。可在部分方案中施加總劑量。舉例而言，方案可包括2 Gy之分級個別劑量。放射性同位素之劑量範圍廣泛改變，且視同位素之半衰期及發出之輻射之強度及類型而定。當輻射包括使用放射性同位素時，同位素可與靶向劑，諸如帶有針對靶組織(例如腫瘤組織)之放射性核苷酸之治療抗體共軛。
本文所描述之手術包括切除術，其中全部或部分癌組織物理上移除、運行及/或毀壞。腫瘤切除係指物理移除腫瘤之至少一部分。除了腫瘤切除以外，手術治療包括雷射手術、冷凍手術、電手術及顯微鏡控制手術(莫氏手術(Mohs surgery))。本文中亦涵蓋移除初癌或正常組織。
因此，在一些實施例中，所揭示之治療方法進一步包括向該個體投與第二療法。一般而言，第二療法可為此項技術中已知之任何療法。適於與本文所揭示之治療組合物組合使用之療法之非限制性實例包括化學療法、放射線療法、免疫療法、激素療法、毒素療法及手術。在一些實施例中，第二療法包括一或多種額外治療劑，諸如如上文所描述之化學治療劑或抗癌劑或抗癌療法。在一些實施例中，第一療法及第二療法同時投與。在一些實施例中，第一療法與第二療法同時投與。在一些實施例中，第一療法及第二療法依次投與。在一些實施例中，第一療法在第二療法之前投與。在一些實施例中，第一療法在第二療法之後投與。在一些實施例中，第一療法在第二療法之前及/或之後投與。在一些實施例中，第一療法及第二療法輪流投與。在一些實施例中，第一治療劑及第二療法在單一調配物中一起投與。
系統或套組
本發明之系統或套組包括以下中之任一者或多者：本文所揭示之多肽、抗體、核酸、載體或醫藥組合物以及用於向個體投與多價多肽、多價抗體、核酸、載體或醫藥組合物中之任一者的注射器(包括預填充注射器)及/或導管(包括預填充注射器)。該套組亦包括使用本文所揭示之多價多肽、多價抗體、核酸、載體或醫藥組合物中之任一者的書面說明書以及與 其投與一起使用之注射器及/或導管。
預期本說明書通篇所給出的每一個最大數值限制包括每一個較低的數值限制，如同此類較低的數值限制明確地書寫在本文中一樣。本說明書通篇中所給出的每一個最小數值限制包括每一個較高的數值限制，如同該等較高的數值限制明確地書寫在本文中一樣。本說明書通篇中所給出之每一個數值範圍將包括落在此類較寬數值範圍內之每一個較窄數值範圍，如同該等較窄數值範圍全部明確地書寫在本文中一般。
在本發明中提及之所有公開案及專利申請案以引用之方式併入本文中直至如同各個別公開案或專利申請案尤其且單獨地指示以引入方式併入之相同程度一般。
未承認本文中引用之任何參考構成先前技術。參考文獻之論述陳述其作者斷言，且本發明人保留挑戰所引用之文獻之準確度及相關性的權利。將明確理解，儘管本文中參考多種資訊來源，包括科學雜誌文章、專利文獻及教科書；但此參考不構成承認此項技術中公共常識之此等文獻形式部分中之任一者。
本文中給出之一般方法之論述意欲僅出於說明性目的。在回顧本發明後，熟習此項技術者將顯而易見其他替代方法及替代方案，且包括於本申請案之精神及範圍內。
實例
額外實施例進一步詳細揭示於以下實例中，其以說明方式提供且不意欲以任何方式限制本發明或申請專利範圍之範疇。
實例 1
此實例描述進行實驗以證明細胞表面受體信號傳導可藉由根據本發明之一些實施例之局部磷酸酶補充調節。
如圖 2 中所示，在細胞膜處之細胞表面受體(諸如PD-1及檢查點受體)在休眠無配位體狀態下經歷較低基礎水準之磷酸化(圖 2 之左上圖)。結合至同源配位體提高磷酸化且加強信號傳導以抑制T細胞活化(圖 2 之右上圖)。作為實例，PD-1阻斷抗體「檢查點抑制劑」削弱受體/配位體相互作用以提高T細胞活化，但基礎受體信號傳導不受影響，因此藉由檢查點Ab阻塞增強T細胞活化受其效果限制。在本發明中，將CD45磷酸酶補充至相關受體之空間鄰近處的雙特異性雙功能抗體預期在休眠及配位體活化狀態下均降低PD-1磷酸化(圖 2 之下圖)。
構築靶向人類 CD45 及 PD-1 之雙特異性雙功能抗體
構築靶向人類CD45及PD-1之雙特異性雙功能抗體，其中該抗體之胺基酸序列在N端至C端方向上包括：(i)對CD45具有特異性的scFv之重鏈可變區，(ii)對細胞表面受體PD-1具有特異性的scFv之輕鏈可變區；(iii)對細胞表面受體PD-1具有特異性的scFv之重鏈可變區；及對CD45具有特異性的scFv之輕鏈可變區。該抗體之胺基酸序列揭示於序列表之SEQ ID NO: 2中。
如圖 3A-3C 中所示，如上文所描述構築之雙特異性雙功能抗體CD45/PD-1證明結合至經CD45 (圖 3A )、PD-1 (圖 3B )或兩種分子(圖 3C )轉染之HEK293細胞。在此等實驗中，大致一百萬HEK293細胞經1 µg CD45 RA、PD-1或兩者轉染。在轉染之後大致24小時，採集細胞且在指定濃度下在冰上染色45分鐘，其中CD45/PD-1雙特異性雙功能抗體根據製造商方案(Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, USA)先前用Alexa Fluor® 647螢光染料標記。未經轉染之HEK293細胞在指定濃度下染色(灰線)。藉由FACS (CytoFLEX, Beckman Coulter, Indianapolis, USA)進行表面染色之定量。代表性資料展示為平均值±SD，n=3。
進行實驗之其他組以證明上文所描述之雙特異性雙功能抗體CD45/PD-1能夠結合至人類CD45及人類PD-1之細胞外區。在此等實驗中，抗人類RIPR-PD1多價抗體αCD45-PD1 (Nivo)經設計及構築。在此抗體中，雙特異性模組由可操作地連接至對應於納武單抗序列之抗PD1 scFv之抗CD45 scFv構成。此雙特異性雙功能抗體CD45/PD-1藉由尺寸排阻(AKTA FPLC, GE Healthcare, Superdex 200 Increase；280 nm吸收率)純化。另外，藉由非還原性SDS-PAGE電泳，繼而標準考馬斯染色(資料未示出)確認雙特異性雙功能抗體CD45/PD-1之蛋白質完整性及純度。使用表面電漿子共振(SPR)技術，測定αCD45-PD1 (Nivo)結合至人類CD45及人類PD-1之細胞外區，其中對CD45之親和力(KD )發現為大致300 nM且對PD-1之親和力發現為大致6 nM。
構築能夠結合至根據本發明之一些實施例之磷酸酶CD45及細胞表面受體PD-1之另一例示性多價抗體。此多價多肽之胺基酸序列在N端至C端方向上包括：(i)對CD45具有特異性的scFv之重鏈可變區，(ii)對PD-1具有特異性的scFv之輕鏈可變區；(iii)對PD-1具有特異性的scFv之重鏈可變區；及(iv)對CD45具有特異性的scFv之輕鏈可變區。多價抗體之胺基酸序列揭示於序列表之SEQ ID NO: 12中。
實例 2
此實例描述進行實驗以證明即使在PD-1配位體不存在下PD-1表現降低T細胞活化。
在此等實驗中，Jurkat T細胞經全長野生型PD-1慢病毒轉導，且PD-1之表面表現藉由用抗PD1抗體(殖株EH12.2H7，Biolegend)進行之FACS測定。發現大致56%經全長野生型PD-1轉導之Jurkat T細胞在細胞表面呈現PD-1。在96孔板中，在約1百萬/ml細胞密度下用2 µg/ml固定化莫羅莫那-CD3 (Orthoclone OKT3)活化表現PD-1 (Jurkat-PD1)之Jurkat T細胞隔夜。如圖 4A 中所示，對於表現PD-1之細胞，發現藉由與OKT3一起培育隔夜觸發之CD25及CD69 (Biolegend)上調較低。如圖 4B 中所示，觀測到，經CRISPR/Cas9 PD-1靶向引導RNA處理之細胞中降低的PD-1表現導致在用OKT3活化後較高的CD69表現。
在此等實驗中，在CRISPR/Cas9慢病毒遞送主鏈(Addgene，質體#52961)中選殖靶向人類PD-1序列之DNA序列(5'-CACCGCGACTGGCCAGGGCGCCTGT-3'；SEQ ID NO: 8)。Jurkat T細胞在OKT3刺激分析之前七天經PD-1/CRISPR/Cas9轉導。代表性資料展示為平均值±SEM，n=3。
實例 3
此實例描述進行實驗以說明藉由在CD45-PD1雙特異性雙功能抗體存在或不存在下與HEK293細胞中之淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶Lck及/或CD45一起培育之PD-1磷酸化之復原(參見圖 5A )。
如圖 5B 中所示，細胞表面受體PD-1未在野生型HEK293細胞中磷酸化(泳道1)。然而，當Lck亦存在時，容易觀測到PD-1之磷酸化(泳道2)。觀測到CD45 (泳道3)之共表現降低總體磷酸化。在與CD45-PD1雙特異性雙功能抗體(Db)一起培育後，觀測到PD-1磷酸化降低。在此等實驗中，大致兩百萬細胞暫時經編碼全長人類PD-1、Lck及CD45之基因轉染。在24小時之後，細胞未經處理或在室溫下與如上述實例1中所描述構築之多價抗體CD45-PD1一起培育15分鐘，其後細胞在冰上用裂解緩衝液(20 mM HEPES，150 mM NaCl，2 mM EDTA，10%甘油，2×完整蛋白酶抑制劑混合液(Roche)，2 mM原釩酸鈉(NEB)，1×磷酸酶抑制劑混合液(細胞信號傳導技術(Cell Signaling Technology))，1×DNA酶(NEB)，1% NP-40)裂解30分鐘。在溶解之後，藉由在4℃下在21,000 g下離心30分鐘來預清除細胞裂解物。PD-1隨後在冰上用與抗生蛋白鏈菌素偶合之Dynabeads® (Thermo Fisher Scientific)偶合之生物素化抗PD1抗體(Biolegend，目錄號367418)自細胞裂解物免疫沈澱(IP)1小時。在用洗滌緩衝液(20 mM HEPES，150 mM NaCl，1% NP-40，2×完整蛋白酶抑制劑混合液(Roche)，2 mM原釩酸鈉及1×磷酸酶抑制劑混合液)洗滌四次之後，將珠粒與非還原性SDS樣品緩衝液一起培育且在95℃下加熱5分鐘。在使用SDS-PAGE電泳之後，IP樣品轉移至PVDF膜(Bio-Rad)且與抗Tyr磷酸化(上圖；細胞信號傳導；P-Tyr-100，目錄號9411S)或抗PD-1 (下圖；Biolegend，目錄號367402)抗體一起培育以便根據製造商說明書進行西方墨點法分析(WB)。
實例 4
此實例描述進行實驗以說明藉由與HEK293細胞中之淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶Lck及/或CD45一起培育之多種受體磷酸化之復原。因為CD45為所有淋巴細胞中存在之高度豐富的磷酸酶，此實例中所描述之實驗結果展現，CD45補充可用於使涉及不同細胞功能之多種不同受體去磷酸化。
在此等實驗中，觀測到，CD45可使多種靶標去磷酸化，指示CD45活性不對特定靶標具有特異性。TIGIT、CTLA-4、CD132、CD5及較低程度CD28及TIM-3均發現藉由CD45去磷酸化。如圖 6A 中所示，細胞表面受體TIGIT、CTLA4、CD28、TIM3、CD132、CD5及B7H3不會在野生型HEK293細胞中基礎地磷酸化。當亦存在Lck時，容易觀測到受體磷酸化，除了不含有信號傳導酪胺酸殘基之B7H3之外(圖 6A )。如圖 6B 中所示，觀測到CD45之共表現降低所有測試受體之磷酸化，指示CD45活性不對特定靶標具有特異性。在此等實驗中，大致兩百萬細胞暫時經編碼人類受體Lck及CD45之細胞內區之基因轉染。在24小時之後，細胞在冰上用裂解緩衝液(20 mM HEPES，150 mM NaCl，2 mM EDTA，10%甘油，2×完整蛋白酶抑制劑混合液(Roche)，2 mM原釩酸鈉(NEB)，1×磷酸酶抑制劑混合液(細胞信號傳導技術)，1×DNA酶(NEB)，1% NP-40)裂解30分鐘。在溶解之後，藉由在4℃下在21,000 g下離心30分鐘來預清除細胞裂解物。PD-1隨後在冰上用抗HA磁珠自細胞裂解物免疫沈澱(IP)1小時。在用洗滌緩衝液(20 mM HEPES，150 mM NaCl，1% NP-40，2×完整蛋白酶抑制劑混合液(Roche)，2 mM原釩酸鈉及1×磷酸酶抑制劑混合液)洗滌四次之後，將珠粒與非還原性SDS樣品緩衝液一起培育且在95℃下加熱5分鐘。在使用SDS-PAGE電泳之後，IP樣品轉移至PVDF膜(Bio-Rad)且與抗Tyr磷酸化(上圖；細胞信號傳導；P-Tyr-100，目錄號9411S)或抗PD-1 (下圖；Biolegend，目錄號367402)抗體一起培育以便根據製造商說明書進行西方墨點法分析(WB)。
實例 5
此實例描述進行實驗以說明用CD45-PD1雙特異性雙功能抗體處理T細胞提高響應於莫羅莫那-CD3 (OKT3)及肽-MHC刺激之T細胞活化。
在此等實驗中，用單獨的培養盤包被OKT3 (2 µg/ml) (實心菱形)或納武單抗抗體(空心方形)或CD45-PD1 (Nivo)雙功能抗體(實心圓形)刺激如上述實例1中所描述之表現PD-1之Jurkat T細胞(圖 3A )。觀測到，雙特異性雙功能抗體CD45-PD1提高活化標記物CD69 (圖 7A )及CD25 (圖 7B-7C )之表現以及IL-2細胞介素分泌之較高水準(圖 7D )。表面表現CD69及CD25藉由OKT3刺激之後FACS染色16小時測定。在納武單抗抗體(空心方形)或CD45-PD1 (Nivo)雙功能抗體(實心圓形)存在下用OKT3 (2 µg/ml)進行Jurkat T細胞刺激48小時之後藉由ELISA (目錄號431804，Biolegend)定量IL-2濃度。在不同T細胞株SKW-3 T細胞(目錄號ACC 53；DSMZ, Leibniz, Germany)中進行類似實驗。如圖 7E-7F 中所示，將經適當T細胞受體(TCR)及PD-1轉導之SKW-3 T細胞與呈遞促效劑肽-MHC±PD-L1之細胞一起培育48小時(PD-L1-，實心菱形；PD-L1+，空心圓形)及納武單抗抗體(空心方形)或CD45-PD1 (Nivo)雙功能抗體(實心圓形)。在與SKW-3 T細胞一起培育之前，在37℃下將抗原呈遞細胞與10 µM促效劑肽一起培育1小時。TCR、PD-1、MHC及PD-L1之表面表現藉由FACS確認。已發現，與上述實例1中所描述之雙特異性雙功能抗體CD45-PD1一起培育將IL-2細胞介素分泌提高至與PD-L1不存在時實現之彼等水準類似的水準。在圖 7A-7F 中，代表性資料展示為平均值±SEM，n=3。
實例 6
此實例描述進行實驗以說明雙特異性CD45-PD1雙功能抗體可增強活化外周血液單核細胞(PBMC)之增殖。
在此等實驗中，使用標準菲科爾(Ficoll)分離自白血球分離腔室分離來自健康供體之活化PBMC細胞。在實驗之前，PBMC靜置於完整RPMI (10%FBS，1×1格魯塔瑪(Glutamax)，1×丙酮酸鈉，1×HEPES及1×Pen/Strep)中隔夜。在大致1百萬/ml密度下PBMC用1 µM CFSE在室溫下標記10分鐘且以1 µg/ml與培養盤包被OKT3加市售PD-1抗體納武單抗或上述實例1中所描述之雙特異性CD45-PD1雙功能抗體一起培育4天。所示資料閘控於活T細胞(CD3+/CD4+/CD8+)上，如藉由FACS染色所測定。如圖 8A 中所示，觀測到，與納武單抗抗體相比，CD45-PD1將T細胞增殖增強至較高水準。
在此等實驗中，CD45-PD1及納武單抗 以0.5 µM最終濃度添加。另外，經單獨OKT3或OKT3以及納武單抗或CD45-PD1處理之細胞的T細胞增殖百分比之定量亦藉由FACS進行(圖 8B )。代表性資料展示為平均值±SEM，n=3)。
實例 7
此實例描述用活化PBMC進行其他實驗以說明雙特異性雙功能抗體CD45-PD1可增強響應於促效劑肽之CD4+及CD8+ T細胞活化且RIPR-PD1不嚴格地視PD-1/PD-L1相互作用阻塞而定。
已知PD-1降低T細胞活性(亦稱為「檢查點抑制劑」)，為此，PD-1必須藉由未知機制磷酸化，但假定完全視結合至PD-L1而定。本發明人假設，存在兩個促進PD-1信號傳導之組分：1)配位體結合及2)基態信號傳導(亦即，預期PD-1或任何其他受體甚至在配位體結合之前具有較低但在功能上恰當的磷酸化水準)。先前，已作出多種努力來控制配位體結合，包括研發諸如納武單抗或帕博利珠單抗之阻斷抗體。然而，大部分忽視了基態信號傳導之作用。不受任何特定理論束縛，補充CD45磷酸酶至PD-1預期降低PD-1磷酸化且因此降低基態及配位體誘發之PD-1信號傳導兩者。受損PD-1活性之結果預期為增強的T細胞活化。在此實例中，本發明人展示，在新鮮經分離之淋巴細胞中，用阻斷PD-1結合至PD-L1之納武單抗及帕博利珠單抗抗體處理增強活化之各種標記物(包括CD69、CD25及分泌性細胞介素，諸如IL-2及IFNγ)之表現或分泌。另外，使用結合至PD-之納武單抗或帕博利珠單抗臂用RIPR處理此等細胞展示誘發甚至更高水準之活化。
在此等實驗中，如先前實例7中所描述經分離之PBMC首先藉由在50 µM (最終濃度)下與由176種肽(JPT，PM-CEFX-1)構成之肽池一起培育24小時而活化，其後在0.5 µM (最終濃度)下添加不同抗體或雙功能抗體。以下表1及2提供雙功能抗體靶標及組合物之概述及簡要說明。多價抗體CD45-PD1 (Nivo)及CD45-PD-1 (Pembro)描述於序列表之SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 14中(亦參見表1)
在抗體或雙功能抗體處理之後24小時採集經處理之細胞及上清液。觀測到，CD45-PD1 (Nivo)及CD45-PD1 (Pembro)均可增強T細胞活化，如藉由CD69 (圖 9A )及CD25 (圖 9B )之提高的表現量所測定，如藉由FACS (CytoFLEX)所測定，以及IFNγ (圖 9D )及細胞介素IL-2 (圖 9C)之分泌，如藉由ELISA (使用目錄號431804，Biolegend定量IL-2，且使用目錄號430104，Biolegend定量IFNγ，根據製造商說明書)所測定。針對CD69所示之資料閘控於活CD3+/CD4+/CD8+細胞上。圖 9E 中概述競爭實驗，其中在用納武單抗、帕博利珠單抗或CD45-PD1 (Nivo)及CD45-PD1 (Pembro)處理之後，用經螢光標記之抗PD1阻斷抗體殖株EH12.2H7 (Biolegend，目錄號329904)染色T細胞。殖株EH12.2H7、納武單抗及帕博利珠單抗具有重疊抗原決定基，且因此殖株EH12.2H7標記之螢光強度(PD-1 MFI)在納武單抗或帕博利珠單抗處理之後降低。RIPR-Nivo及RIPR-Pembro分子亦損害殖株EH12.2H7標記至類似程度，因此表明RIPR-Nivo及RIPR-Pembro分別維持納武單抗及帕博利珠單抗之PD-1結合特性。

表1：RIPR結合模組、野生型蛋白質及連接子單元之描述
*除非另外說明，否則CD45-PDl (Nivo)-穩定化雙特異性雙功能抗體為默認結合模組且在主要文本、圖式及數字圖例中亦稱為「CD45-PDl (Nivo)」
實例 8
此實例描述用活化PBMC進行實驗之其他組以說明使用非阻斷scFv結合至PD-1之雙特異性雙功能抗體CD45-PD1 (Cl19)可響應於促效劑肽增強T細胞活化。
在此實驗中，如先前實例7中所描述經分離之PBMC首先藉由在50 µM (最終濃度)下與由176種肽(JPT，PM-CEFX-1)構成之肽池一起培育24小時而活化，其後在0.5 µM (最終濃度)下添加不同抗體或雙功能抗體。在抗體或雙功能抗體處理之後24小時採集經處理之細胞及上清液。觀測到，CD45-PD1 (Cl19)可增強如藉由CD69之提高的表現量 (圖 10A )所測定之T細胞活化以及如藉由ELISA (使用目錄號430104，Biolegend定量IFNγ，根據製造商說明書)所測定之IFNγ之分泌(圖 10B )。
針對CD69及CD25所示之資料閘控於活CD3+/CD4+/CD8+細胞上。圖 10C 中概述競爭實驗，其中在用納武單抗、帕博利珠單抗或CD45-PD1 (Cl19)處理之後，用經螢光標記之抗PD1阻斷抗體殖株EH12.2H7 (Biolegend，目錄號329904)染色T細胞。殖株EH12.2H7、納武單抗及帕博利珠單抗具有重疊抗原決定基，且因此當細胞經納武單抗或帕博利珠單抗處理時，殖株EH12.2H7標記之螢光強度(PD-1 MFI)降低。觀測到，45-PD1 (Cl19)在殖株EH12.2H7標記(較高螢光，PD1 MFI)中具有較弱作用，其表明CD45-PD1 (Cl19)抗原決定基與納武單抗或帕博利珠單抗不同。
此實例中所描述之實驗展示，使用不完全阻斷PD-1結合至PD-L1之抗PD1結合單位之hRIPR-PD1分子亦促進T細胞活性。不受任何特定理論束縛，hRIPR-PD1分子因為其直接靶標PD-1磷酸化而預期降低PD-1信號傳導，且因此甚至在PD-1/PD-L1阻塞不存在下增強T細胞活化。觀測到，在增強T細胞活化方面，αCD45-PD1 (Cl19)似乎比納武單抗更弱，但比帕博利珠單抗更強。
實例 9
此實例描述進行實驗以產生具有不同架構之第三hRIPR-PD1分子，因為其使用融合至scFv之奈米抗體(單一重鏈)。如下文更詳細地論述，此新RIPR分子(第2代)證明提高的純化量且維持結合至PD-1及CD45，如藉由表面電漿子共振(SPR)所測定。
此實例中所描述之第2代雙特異性RIPR-PD1分子使用與上述實例中所描述相同的抗CD45 scFv，但現在融合至奈米抗體(VHH)抗人類PD-1 (US20170137517A1中所描述)。因此，預期此新αCD45-PD1 (VHH)雙特異性分子將結合至人類CD45及人類PD-1。
由結合至抗PD1奈米抗體(VHH)之抗CD45 scFv構成之此第2代抗人類RIPR-PD1 (抗CD45/抗PD1)雙特異性分子藉由尺寸排阻(AKTA FPLC, GE Healthcare, Superdex 200 Increase；280 nm吸收率)純化。蛋白質完整性及純度藉由非還原性SDS-PAGE電泳，繼而標準考馬斯染色(資料未示出)確認。觀測到，此CD45-PD1 (VHH)能夠結合至人類CD45及人類PD-1蛋白質之細胞外區，如藉由表面電漿子共振技術(資料未示出)所測定。對CD45之親和力(KD )發現為大致700 nM，且對PD-1之親和力發現為大致5 nM。
實例 10
此實例描述進行實驗以說明用如上述實例9中所描述之第二代CD45-PD1 (VHH)雙特異性結合模組處理T細胞可提高響應於莫羅莫那-CD3 (OKT3)之T細胞活化。
在此等實驗中，在1.5 µM下，在納武單抗(實心菱形)、CD45-PD1 (Nivo) (實心圓形)、CD45-PD1 (VHH) (空心圓形)、抗CD45雙功能抗體#4 (實心三角形)不存在或存在下，在不同濃度(0.625至5 µg/ml)下用培養盤包被OKT3刺激Jurkat T細胞表現。觀測到，雙特異性雙功能抗體CD45-PD1 (Nivo)及CD45-PD1 (VHH)提高活化標記物CD69 (圖 11A )及CD25 (圖 11B )之表現，導致較高分量之CD69+/CD25+細胞(圖 11C )。表面表現CD69及CD25藉由OKT3刺激之後FACS染色24小時測定。
實例 11
此實例描述經設計以研發靶向小鼠CD45及小鼠PD-1之RIPR-PD1分子之實驗。
構築小鼠RIPR且由靶向直接融合至識別小鼠PD-1之scFv (PD-1 scFv；PD1-F2，先前描述於WO2004056875A1中)之小鼠CD45的奈米抗體(VHH)序列構成。使用粉紋夜蛾(Trichoplusia ni ) (High FiveTM )細胞中之桿狀病毒-昆蟲細胞表現系統產生重組mRIPR。在Ni-NTA純化之後，mRIPR在使用280 nm吸收率(資料未示出)之尺寸排阻層析法期間展示單體及單分散溶離特徵。mRIPR純度藉由非還原性SDS-PAGE電泳，繼而對應於峰部分SEC溶離(資料未示出)之標準考馬斯染色進一步確認。
實例 12
此實例描述進行實驗以說明用抗小鼠CD45 (VHH)-PD1F2雙特異性結合模組處理小鼠T細胞提高響應於抗小鼠CD3 (2C11)之T細胞活化。
在此等實驗中，在不同濃度之上述實例11中所描述之CD45 (VHH)-PD1F2雙特異性結合模組不存在(未經處理；實心菱形)或存在下，用不同濃度(1至10 µg/ml)之培養盤包被2C11刺激自C57BL/6小鼠分離之CD8+ T細胞。觀測到，雙特異性雙功能抗體CD45 (VHH)-PD1F2提高活化標記物CD69 (圖 12A )及CD25 (圖 12B )之表現。在此等實驗中，表面表現CD69及CD25藉由2C11刺激之後16小時FACS染色測定。FACS分析之結果概述於以下表4中，其中展示各群體中之雙重陽性細胞(CD69+CD25+)之百分比。
表4
實例 13
此實例描述進行實驗以說明用抗小鼠CD45 (VHH)-PD1 (F2)雙特異性結合模組處理小鼠TCR轉基因(Pmel-1) CD8+ T細胞提高響應於gp100肽之T細胞活化。
在此等實驗中，以1:1比率將表現Pmel-1 TCR之小鼠CD8+ T細胞與全部脾臟細胞一起培育，且在1 µM之CD45 (VHH)-PD1 (F2)或抗PD1阻斷抗體RMP-14不存在(未經處理)或存在下，用gp100肽(0.1至10 µM)刺激。觀測到，雙特異性CD45 (VHH)-PD1F2結合分子提高活化標記物CD69 (圖 13A )及CD25 (圖 13B )之表現。表面表現CD69及CD25藉由gp100肽刺激之後24小時FACS染色測定。FACS分析之結果概述於以下表5中，其中展示各群體中之雙重陽性細胞(CD69+CD25+)之百分比。


表5
實例 14
此實例描述進行實驗以說明用mRIPR-CTLA4、抗小鼠CD45 (VHH)-CTLA4雙特異性結合模組處理小鼠T細胞提高響應於抗小鼠CD3 (2C11)之T細胞活化。
作為PD-1之CTLA-4降低T細胞活性。本發明人研發將CD45補充至CTLA4之RIPR分子。對於PD-1，預期CD45活性補充降低CTLA-4磷酸化，且因為CTLA-4為T細胞活性之抑制劑，預測RIPR-CTLA4增強T細胞功能。
在此等實驗中，在250 nM或1 µM之mRIPR-CTLA4不存在或存在下，用1 µg/ml之培養盤包被2C11刺激自C57BL/6小鼠分離之T細胞。觀測到，mRIPR-CTLA4提高活化標記物CD69及CD25之表現，在與2C11抗體一起培育之後24小時(圖 14A )及48小時(圖 14B )導致針對CD4+及CD8+之CD69+/CD25+細胞之分量提高。表面表現CD69及CD25藉由在2C11刺激之後指定時間點FACS染色測定。資料展示閘控於活CD3+/CD4+或CD3+/CD8+ T細胞上。
實例 15
此實例描述進行實驗以說明用抗小鼠CD45 (VHH)-CTLA4雙特異性結合模組、mRIPR-CTLA4處理小鼠T細胞提高響應於抗小鼠CD3 (2C11)之T細胞活化。
在此等實驗中，在1 µM之CD45 (VHH)-mCTLA4不存在(左側圖)或(右側圖)存在下，用1 µg/ml之培養盤包被2C11刺激自C57BL/6小鼠分離之T細胞。觀測到，雙特異性雙功能抗體CD45 (VHH)-CTLA4提高活化標記物CD69及CD25之表現，在與2C11抗體一起培育之後24小時及48小時導致針對CD4+及CD8+之CD69+/CD25+細胞之分量提高。表面表現CD69及CD25藉由在2C11刺激之後適當時間點FACS染色測定。表4中所示之資料閘控於活CD3+/CD4+或CD3+/CD8+ T細胞上。表6中所示之資料為CD25及CD69表面染色之一個實例，其對應於用如上述實例14中所描述之1 µg/ml培養盤包被2C11及1 µM mRIPR-CTLA4活化。
表6
實例 16
此實例描述進行實驗以說明用mRIPR-CD28、抗小鼠CD45 (VHH)-CD28雙特異性結合模組、mRIPR-CD28處理小鼠T細胞降低響應於抗小鼠CD3 (2C11)之T細胞活化之標記物(諸如CD25及CD44)之表現。
如上文所論述，CD28為與PD-1及CTLA-4相同的蛋白質家族(細胞表面輔受體之B7家族)之部分。與PD-1及CTLA-4相反，藉由CD28輔受體傳導信號增強T細胞活化。不受任何特定理論束縛，諸如CD45之磷酸酶補充至CD28預期削弱CD28信號傳導且降低(例如抑制) T細胞活化。
此等實驗中使用之mRIPR-CD28包括融合至奈米抗體抗CD45 (PMID：25819371)之奈米抗體抗小鼠CD28 (WO2002047721A1)。在125、250、500或1000 µM之mRIPR-CD28不存在或存在下，用0.5、1、2、4或8 µg/ml之培養盤包被2C11刺激自C57BL/6小鼠分離之T細胞。觀測到，mRIPR-CD28在與2C11抗體及mRIPR-CD28一起培育48小時之後降低針對CD4+ (圖 15A )及CD8+ (圖 15B ) T細胞之活化標記物CD25及CD44之表現。表面表現CD25及CD44藉由在2C11刺激之後指定時間點FACS染色測定。所示資料閘控於活CD4+或CD8+ T細胞上。
實例 17
此實例描述RIPR分子之三特異性型式，其經設計以將CD45補充至兩種不同細胞表面抗原PD-1及CTLA4，且指定雙重RIPR (dRIPR)-PD1/CTLA4)。RIPR分子之此三特異性型式結合至小鼠CD45、PD-1及CTLA4，且預期增強T細胞活化。
此分子由融合至奈米抗體抗CD45 (PMID：25819371)及scFv 抗PD1 (PD1-F2，描述於WO2004056875A1中)之奈米抗體抗CTLA4 (PMID：29581255)構成。dRIPR-PD1/CTLA4之胺基酸序列闡述於序列表之SEQ ID NO: 28中。關於dRIPR-PD1/CTLA4之其他資訊亦可發現於表1中。此抗小鼠三特異性CD45-PD1-CTLA4隨後藉由尺寸排阻(AKTA FPLC, GE Healthcare, Superdex 200 Increase；280 nm吸收率展示於圖 17A 中)純化。另外，三特異性CD45-PD1-CTLA4分子之蛋白質完整性及純度藉由非還原性SDS-PAGE電泳，繼而標準考馬斯染色確認(圖 17B )。
實例 18
此實例描述進行實驗以證明包括融合至細胞介素(在此情況下介白素-2)之抗CD45 scFv之多價多肽降低STAT5之磷酸化(pSTAT5)且降低STAT5信號傳導。
在此等實驗中，為了將CD45磷酸酶補充至IL-2R，抗人類CD45 scFv如下融合至野生型IL-2：構築能夠結合至CD45及IL-2R之多價多肽，其中多肽之胺基酸序列在N端至C端方向上包括：(i)對CD45具有特異性的scFv之重鏈可變區，(ii)對CD45具有特異性的scFv之輕鏈可變區；及(iii)對細胞介素受體IL-2R具有結合親和力之細胞介素IL-2之胺基酸序列。多價多肽抗CD45-IL2之胺基酸序列揭示於序列表之SEQ ID NO: 6中。如圖 16A 中所概述，咸信IL-2在結合至IL-2受體後誘導JAK Tyr磷酸化，且將CD45局部磷酸酶補充至細胞介素受體IL-2R降低STAT5之磷酸化(pSTAT5)。
在此等實驗中，用經螢光標記之抗CD45-IL-2多價多肽(根據製造商說明書用Alexa Fluor647標記；Thermo Fisher Scientific)表面染色HEK293s (灰色)及YT+細胞(CD25+；紅色)展示於圖 16B 中。此外，如圖 16C 中所示，在指定濃度下在37℃下用抗CD45-IL2多價多肽培育YT+細胞15分鐘使得pSTAT5 Emax相比於野生型IL-2降低約50%。代表性資料展示為平均值±SD，n=3。為了測定響應於IL-2或CD45-IL2嵌合體之pSTAT5程度，在4% PFA中在室溫下固定大致100,000個細胞10分鐘。在固定之後，在冰上用甲醇滲透細胞1小時，繼而在-80℃下培育隔夜。在用MACS緩衝液(Miltenyi)洗滌之後，以1:100稀釋度在MACS緩衝液(AlexaFluor® 647；BD Biosciences目錄號612599)中在冰上將細胞與經螢光標記之抗人類pSTAT5抗體一起培育1小時。在冰冷MACS緩衝液中洗滌三次之後，藉由FACS (CytoFLEX)定量pSTAT5。
儘管已揭示本發明之特定替代方案，但應理解，各種修飾及組合為可能的且涵蓋在隨附申請專利範圍之真實精神及範疇內。因此，不意圖限制本文中呈現之精確摘要及揭示內容。
圖 1A-1B 示意性地說明藉由根據本發明之一些實施例經由RIPR方法進行局部磷酸酶補充來調節細胞表面受體信號傳導之非限制性實例。細胞膜處之活性激酶誘發受體磷酸化之較低基礎水準(圖 1A- 左側圖)。結合至同源配位體提高受體磷酸化且引發信號傳導(圖 1A- 右側圖)。如所說明，將磷酸酶補充至相關受體之空間鄰近處之雙特異性多肽降低基礎以及配位體誘發之磷酸化兩者(圖 1B ，藉由在其基礎及配位體活化狀態下以酶促方式自受體胞內域『切除』磷酸鹽(圖 1B )。RIPR分子之受體結合模組可為與天然配位體競爭性或非競爭性的，其可為分泌性或膜結合的。
圖 2 示意性地說明根據本發明之一些實施例藉由局部CD45補充調節PD-1表面受體信號傳導之RIPR方法之應用之非限制性實例。PD-1表現藉由膜結合激酶，諸如Lck，歸因於細胞內模體之較低基礎磷酸化降低T細胞活性(圖 2- 上部 ；左側圖)。在結合至PD-L1後，PD-1磷酸化提高，其進一步降低T細胞活性(圖 2- 上部 ；右側圖)。PD-1阻斷抗體「檢查點抑制劑」削弱受體/配位體相互作用，且因此降低PD-L1誘發之磷酸化。如所說明，將CD45磷酸酶補充至相關受體之空間鄰近處之雙特異性雙功能抗體降低基礎以及PD-L1誘發之磷酸化兩者(圖 2- 左下 圖)，自受體細胞內信號傳導模體移除磷酸鹽(圖 2- 右下 圖)。
圖 3A-3C 以圖形方式概述為了說明靶向結合至經CD45 (圖 3A )、PD-1 (圖 3B )或兩種分子(圖 3C )轉染之HEK293細胞之人類CD45及PD-1之雙特異性雙功能抗體所進行的實驗之結果。
圖 4A-4B 以圖形方式概述為了說明甚至在PD-1配位體不存在下PD-1表現降低T細胞活化所進行的實驗之結果。在此等實驗中，表現PD-1之Jurkat T細胞用OKT3在2 µg/ml下活化隔夜。圖 4A ：CD25及CD69上調對於表現PD-1之細胞較低。圖4B：經CRISPR/Cas9 PD-1靶向引導RNA處理之細胞中降低之PD-1表現在用OKT3活化後導致較高CD69表現。
圖 5A-5B 概述為了說明藉由HEK293細胞中之Lck及CD45復原PD-1磷酸化所進行的實驗之結果。PD-1未在野生型HEK293細胞中磷酸化(泳道1)。然而，當Lck亦存在時，PD-1容易磷酸化(泳道2)。CD45之共表現(泳道3)降低總體磷酸化。在與CD45-PD1雙特異性雙功能抗體(Db)一起培育後，觀測到PD-1磷酸化進一步降低(泳道4)。在與CD45-PD1雙特異性雙功能抗體(Db；泳道6)一起培育之後，具有嚴重降低之磷酸酶活性之CD45突變體(C856S)突變不會在表現(泳道5)或補充後影響PD-1磷酸化。
圖 6A -6B 概述為了說明藉由與HEK293細胞中之淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶Lck及/或CD45一起培育多個受體磷酸化復原所進行的實驗之結果。
圖 7A-7F 概述為了說明用CD45-PD1雙特異性雙功能抗體處理T細胞提高響應於OKT3及肽-MHC刺激之T細胞活化所進行的實驗之結果。在納武單抗(nivolumab)抗體(空心方形)或CD45-PD1 (Nivo)雙功能抗體(實心圓形)存在下用OKT3 (2 μg/mL；實心菱形)刺激表現PD-1之Jurkat T細胞隔夜。CD45-PD1提高活化標記物CD69 (圖 7A )及CD25 (圖 7B-7C )之表現以及IL-2細胞介素分泌(圖 7D )。在圖 7E-7F 中，經適當的TCR及PD-1轉導之SKW-3 T細胞與呈遞促效劑肽-MHC±PD-L1 (PD-L1-，實心菱形；PD-L1+，空心圓形)及納武單抗抗體(空心方形)或CD45-PD1 (Nivo)雙功能抗體(實心圓形)之細胞一起培育。與CD45-PD1雙功能抗體一起培育將IL-2細胞介素分泌提高至與PD-L1不存在時實現之彼等水準類似的水準。
圖 8A-8B 概述為了說明CD45-PD1雙功能抗體增強活化外周血液單核細胞(PBMC)之增殖所進行的實驗之結果。圖 8A ：新鮮分離之PBMC用CFSE標記且與OKT3加納武單抗或CD45-PD1雙功能抗體一起培育4天。CD45-PD1以與納武單抗抗體相比更高的水準增強T細胞增殖。圖 8B ：經單獨OKT3或與OKT3及納武單抗或CD45-PD1 (Nivo) (0.5 µM)組合處理之細胞的T細胞增殖百分比之定量。
圖 9A-9F 概述為了說明雙特異性雙功能抗體CD45-PD1可增強響應於促效劑肽之CD4+及CD8+ T細胞活化、用活化PBMC進行之其他實驗的結果。觀測到，CD45-PD1 (Nivo)及CD45-PD1 (Pembro)均可增強T細胞活化，如提高的CD69 (圖 9A )及CD25 (圖 9B )之表現量以及IFNγ (圖 9D )及細胞介素IL-2 (圖 9C )之分泌所指示。在與納武單抗、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、CD45-PD1 (Nivo)或CD45-PD1 (Pembro)一起培育後，抗PD1螢光標記抗體(殖株29F.1A12；PD-1/PD-L1阻斷抗體)染色降低，如PD1 MFI所指示，而與單獨促效劑肽或與抗CD45雙特異性雙功能抗體組合一起培育不受影響(圖 9E )。CD4+及CD8+ T細胞均觀測到在用CD45-PD1 (Nivo)或CD45-PD1 (Pembro)處理後提高的CD69表現量(圖 9F )。
圖 10A-10C 概述為了說明RIPR-PD1不嚴格視PD-1/PD-L1相互作用阻塞而定、用活化PBMC進行之其他實驗的結果。觀測到，雙特異性雙功能抗體CD45-PD1(Cl19) (使用非阻斷scFv以結合至PD-1 (殖株19；Cl19))可增強響應於促效劑肽之T細胞活化，如提高的CD69表現量(圖 10A )以及IFNγ分泌(圖 10B )所指示。與雙特異性雙功能抗體CD45-PD1 (Cl19)一起培育可能在用螢光標記抗PD1抗體(殖株29F.1A12；PD-1/PD-L1阻斷抗體)染色細胞之後導致PD1 MFI部分降低，而與納武單抗或帕博利珠單抗一起培育可能導致更強的PD-1 MFI降低(圖 10C )。
圖 11A-11C 概述為了說明用第二代CD45-PD1 (VHH)雙特異性結合模組處理T細胞提高響應於莫羅莫那(Muromonab)-CD3® (OKT3)之T細胞活化所進行的實驗之結果。在此等實驗中，雙特異性雙功能抗體CD45-PD1 (Nivo)及CD45-PD1 (VHH)提高活化標記物CD69 (圖 11A )及CD25 (圖 11B )之表現，產生更多CD69+/CD25+細胞(圖 11C )。
圖 12A-12B 概述為了說明用抗小鼠CD45 (VHH)-PD1F2雙特異性結合模組處理小鼠T細胞提高響應於抗小鼠-CD3 (2C11)之T細胞活化所進行的實驗之結果。在此等實驗中，雙特異性雙功能抗體CD45 (VHH)-PD1F2提高活化標記物CD69 (圖 12A )及CD25 (圖 12B )之表現。
圖 13A-13B 概述為了說明用抗小鼠CD45 (VHH)-PD1 (F2)雙特異性結合模組處理小鼠TCR轉基因(Pmel-1) CD8+ T細胞提高響應於gp100肽之T細胞活化所進行的實驗之結果。在此等實驗中，雙特異性CD45 (VHH)-PD1F2結合分子提高活化標記物CD69 (圖 13A )及CD25 (圖 13B )之表現。
圖 14A-14B 概述為了說明用抗小鼠CD45 (VHH)-CTLA4雙特異性結合模組(指定mRIPR-CTLA4)處理小鼠T細胞提高響應於抗小鼠-CD3 (2C11)之T細胞活化所進行的實驗之結果。在此等實驗中，用雙特異性CD45 (VHH)-CTLA4結合分子處理T細胞提高細胞之分量，其中在與2C11抗體及CD45 (VHH)-CTLA4一起培育24小時(圖 14A )及48小時(圖 14B )之後，對於CD4+及CD8+ T細胞兩者，具有提高的CD69及CD25水準。
圖 15A-15B 概述表明mRIPR-CD28降低響應於抗小鼠-CD3 (2C11)之T細胞活化之標記物(諸如CD25及CD44)之表現的實驗之結果。在此等實驗中，在與2C11抗體及mRIPR-CD28一起培育48小時之後，對於CD4+ (圖 15A )及CD8+ (圖 15B ) T細胞兩者，抗小鼠CD45 (VHH)-CD28雙特異性多肽降低活化標記物CD25及CD44之表現。
圖 16A-16C 示意性地說明根據本發明之一些實施例之雙特異性蛋白結合分子之其他非限制性實例。在此情況下，圖式展示由連接至IL-2之CD45結合模組構成之RIPR之一個實例。IL-2誘導其IL-2R-β及γ-c受體之磷酸化。IL-2至補充CD45之結合模組之連接使得自IL-2受體上之酪胺酸殘基移除磷酸鹽，導致信號傳導降低。類似RIPR設計預期降低其他細胞介素及生長因子受體之信號傳導。(圖 16A )。能夠結合至磷酸酶CD45及細胞表面受體IL-2R之多價多肽螢光標記YT+細胞表面(圖 16B )。CD45補充至IL-2受體降低STAT5之磷酸化(pSTAT5；圖 16C )。
圖 17A-17B 概述為了表徵根據本發明之一些實施例之三特異性RIPR設計所進行的實驗之結果。在此等實驗中，抗小鼠三特異性CD45-PD1-CTLA4用融合至抗小鼠PD1 scFv且進一步融合至抗小鼠CTLA-4 VHH之抗小鼠CD45 VHH設計且構築。所得三特異性RIPR分子為指定雙重RIPR (dRIPR)-PD1/CTLA4)。此dRIPR-PD1/CTLA4分子之胺基酸序列闡述於序列表之SEQ ID NO: 28中。圖 17A ：在尺寸排阻層析法(AKTA FPLC，GE Healthcare，Superdex 200 Increase；展示280 nm吸收率)之後的蛋白質純度；圖 17B ：藉由非還原性SDS-PAGE電泳，繼而標準考馬斯(Coomassie)染色確認蛋白質純度及完整性。

Claims (81)

  1. 一種多價多肽，其包含： 第一胺基酸序列，其包含能夠結合至一或多種受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)之第一多肽模組；及 第二胺基酸序列，其包含能夠結合至經由磷酸化機制傳導信號之一或多種細胞表面受體之第二多肽模組； 其中該第一多肽模組可操作地連接至該第二多肽模組。
  2. 如請求項1之多價多肽，其中該第一多肽模組經由多肽連接子序列可操作地連接至該第二多肽模組。
  3. 如請求項1至2中任一項之多價多肽，其中該第一及第二多肽模組中之至少一者包含用於蛋白結合配位體或抗原結合部分之胺基酸序列。
  4. 如請求項3之多價多肽，其中該抗原結合部分選自由以下組成之群：抗原結合片段(Fab)、單鏈可變片段(scFv)、奈米抗體、VH 域、VL 域、單域抗體(dAb)、VNAR 域及VH H域、雙功能抗體或其任一者的功能片段。
  5. 如請求項3至4中任一項之多價多肽，其中該抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區。
  6. 如請求項3之多價多肽，其中該蛋白結合配位體為細胞介素、生長因子、細胞表面受體或RPTP之受體細胞外域(ECD)或其任一者的功能變體。
  7. 如請求項1至6中任一項之多價多肽，其中一或多種RPTP包含CD45或其功能變體。
  8. 如請求項1至7中任一項之多價多肽，其中該一或多種細胞表面受體包含免疫檢查點受體、細胞介素受體或生長因子受體。
  9. 如請求項1至8中任一項之多價多肽，其中該一或多種細胞表面受體包含選自由抑制性檢查點受體及刺激性檢查點受體組成之群的免疫檢查點受體。
  10. 如請求項1至8中任一項之多價多肽，其中該一或多種細胞表面受體包含選自由以下組成之群的抑制性檢查點受體：PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD5、CD132、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、TIGIT及VISTA或其任一者的功能變體。
  11. 如請求項1至8中任一項之多價多肽，其中該一或多種細胞表面受體包含選自由以下組成之群的刺激性檢查點受體：CD27、CD28、CD40、OX40、GITR、ICOS及CD137或其任一者的功能變體。
  12. 如請求項1至8中任一項之多價多肽，其中該一或多種細胞表面受體經由選自ITAM模體、ITSM模體、ITIM模體或用作磷酸化受質之相關細胞內模體的基於特定酪胺酸之模體來介導信號傳導。
  13. 如請求項12之多價多肽，其中該一或多種細胞表面受體選自由以下組成之群：DAP10、DAP12、SIRPa、CD3、CD28、CD4、CD8、CD200、CD200R、ICOS、KIR、FcR、BCR、CD5、CD2、G6B、LIR、CD7及BTN或其任一者的功能變體。
  14. 如請求項1至8中任一項之多價多肽，其中該一或多種細胞表面受體包含細胞介素受體。
  15. 如請求項14之多價多肽，其中該一或多種細胞介素受體選自由以下組成之群：介白素受體、干擾素受體、趨化介素受體、生長激素受體、紅血球生成素受體(EpoR)、胸腺基質淋巴球生成素受體(TSLPR)、血小板生成素受體(TpoR)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)受體及顆粒球群落刺激因子(G-CSF)受體。
  16. 如請求項1至8中任一項之多價多肽，其中該一或多種細胞表面受體包含生長因子受體。
  17. 如請求項16之多價多肽，其中該生長因子受體為選自由以下組成之群的幹細胞生長因子受體(SCFR)或表皮生長因子受體(EGFR)：ErbB-1、ErbB-2 (HER2)、ErbB-3、ErbB-4及c-Kit (CD117)。
  18. 如請求項2至17中任一項之多價多肽，其中該多肽連接子序列為約1至約100個胺基酸殘基。
  19. 如請求項2至18中任一項之多價多肽，其中該多肽連接子包含至少一個甘胺酸殘基。
  20. 如請求項2至18中任一項之多價多肽，其中該多肽連接子包含甘胺酸-絲胺酸連接子。
  21. 如請求項5至20中任一項之多價多肽，其中該抗原結合部分之重鏈可變區及輕鏈可變區經由一或多個安置於該重鏈可變區與該輕鏈可變區之間的介入胺基酸殘基彼此可操作地連接。
  22. 如請求項21之多價多肽，其中該等介入胺基酸殘基為約1至約100個胺基酸殘基。
  23. 如請求項21至22中任一項之多價多肽，其中該等介入胺基酸殘基包含至少一個甘胺酸殘基。
  24. 如請求項21至23中任一項之多價多肽，其中該等介入胺基酸殘基包含甘胺酸-絲胺酸連接子。
  25. 如請求項1至24中任一項之多價多肽，其在該N端至C端方向上包含： a) 域A，其包含對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之重鏈可變區之結合區； b) 域B，其包含對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之輕鏈可變區之結合區； c) 域C，其包含對該細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之重鏈可變區之結合區；及 d) 域D，其包含對該RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之輕鏈可變區之結合區。
  26. 如請求項1至25中任一項之多價多肽，其進一步包含用於信號肽之胺基酸序列。
  27. 如請求項1至26中任一項之多價多肽，其進一步包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、10、12、14、16、20、22、24、26、28及54。
  28. 一種多價抗體或其功能片段，其包含： 對一或多種受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)具有特異性的第一多肽模組；及 對經由磷酸化機制傳導信號之一或多種細胞表面受體具有特異性的第二多肽模組， 其中該第一多肽模組可操作地連接至該第二多肽模組。
  29. 如請求項28之多價抗體或其功能片段，其中該第一多肽模組經由多肽連接子序列可操作地連接至該第二多肽模組。
  30. 如請求項28至29中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該第一及第二多肽模組中之至少一者包含用於蛋白結合配位體或抗原結合部分之胺基酸序列。
  31. 如請求項30之多價抗體或其功能片段，其中該抗原結合部分選自由以下組成之群：抗原結合片段(Fab)、單鏈可變片段(scFv)、奈米抗體、VH 域、VL 域、單域抗體(sdAb)、VNAR 域及VH H域或其功能片段。
  32. 如請求項30至31中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該抗原結合部分包含重鏈可變區及輕鏈可變區。
  33. 如請求項30之多價多肽，其中該蛋白結合配位體為細胞介素、生長因子、細胞表面受體之受體細胞外域(ECD)或其任一者的功能變體。
  34. 如請求項28至33中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種RPTP包含CD45或其功能變體。
  35. 如請求項28至34中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種細胞表面受體包含免疫檢查點受體、細胞介素受體或生長因子受體。
  36. 如請求項28至35中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種細胞表面受體包含選自由抑制性檢查點受體及刺激性檢查點受體組成之群的免疫檢查點受體。
  37. 如請求項28至36中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種細胞表面受體包含選自由以下組成之群的抑制性檢查點受體：PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD5、CD132、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、TIGIT及VISTA或其任一者的功能變體。
  38. 如請求項28至37中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種細胞表面受體包含選自由以下組成之群的刺激性檢查點受體：CD27、CD28、CD40、OX40、GITR、ICOS及CD137或其任一者的功能變體。
  39. 如請求項28至35中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種細胞表面受體經由選自ITAM模體、ITSM模體、ITIM模體或用作磷酸化受質之相關細胞內模體的基於特定酪胺酸之模體來介導信號傳導。
  40. 如請求項39之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種細胞表面受體選自由以下組成之群：DAP10、DAP12、SIRPa、CD3、CD28、CD4、CD8、CD200、CD200R、ICOS、KIR、FcR、BCR、CD5、CD2、G6B、LIR、CD7及BTN或其任一者的功能變體。
  41. 如請求項28至35中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種細胞表面受體包含細胞介素受體。
  42. 如請求項41之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種細胞介素受體選自由以下組成之群：介白素受體、干擾素受體、趨化介素受體、生長激素受體、紅血球生成素受體(EpoR)、胸腺基質淋巴球生成素受體(TSLPR)、血小板生成素受體(TpoR)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)受體及顆粒球群落刺激因子(G-CSF)受體。
  43. 如請求項28至35中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該一或多種細胞表面受體包含生長因子受體。
  44. 如請求項43之多價抗體或其功能片段，其中該生長因子受體為選自由以下組成之群的幹細胞生長因子受體(SCFR)或表皮生長因子受體(EGFR)：ErbB-1、ErbB-2 (HER2)、ErbB-3、ErbB-4及c-Kit (CD117)。
  45. 如請求項28至44中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該多肽連接子序列包含1至100個胺基酸殘基。
  46. 如請求項29至45之多價抗體或其功能片段，其中該多肽連接子包含至少一個甘胺酸殘基。
  47. 如請求項29至46之多價抗體或其功能片段，其中該多肽連接子包含甘胺酸-絲胺酸連接子。
  48. 如請求項32至47之多價抗體或其功能片段，其中該抗原結合部分之重鏈可變區及輕鏈可變區經由一或多個安置於該重鏈可變區與該輕鏈可變區之間的介入胺基酸殘基彼此可操作地連接。
  49. 如請求項48之多價抗體或其功能片段，其中該等介入胺基酸殘基為約1至約100個胺基酸殘基。
  50. 如請求項48至49中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該等介入胺基酸殘基包含至少一個甘胺酸殘基。
  51. 如請求項48至50中任一項之多價抗體或其功能片段，其中該等介入胺基酸殘基包含甘胺酸-絲胺酸連接子。
  52. 如請求項28至51之多價抗體或其功能片段，其在該N端至C端方向上包含： a) 域A，其包含對RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之重鏈可變區之結合區； b) 域B，其包含對細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之輕鏈可變區之結合區； c) 域C，其包含對該細胞表面受體之抗原決定基具有特異性的第二scFv之重鏈可變區之結合區；及 d) 域D，其包含對該RPTP之抗原決定基具有特異性的第一scFv之輕鏈可變區之結合區。
  53. 如請求項28至52中任一項之多價抗體或其功能片段，其進一步包含用於信號肽之胺基酸序列。
  54. 如請求項28至53中任一項之多價抗體或其功能片段，其包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、10、12、14、16、20、22、24、26、28及54。
  55. 一種醫藥組合物，其包含： 如請求項1至27中任一項之多價多肽，或 如請求項28至54中任一項之多價抗體或其功能片段， 及醫藥可接受之賦形劑。
  56. 一種重組核酸分子，其包含編碼多肽之核苷酸序列，該多肽包含： a) 與如請求項1至27中任一項之多價多肽之胺基酸序列具有至少80%一致性的胺基酸序列；或 b) 與如請求項28至54中任一項之多價抗體或其功能片段具有至少80%一致性的胺基酸序列。
  57. 如請求項56之重組核酸分子，其中該核苷酸序列與選自由以下組成之群的核苷酸序列具有至少80%序列一致性：SEQ ID NO: 1、3、5、9、11、13、15、19、21、23、25、27及53。
  58. 一種表現卡匣或載體，其包含如請求項56至57中任一項之重組核酸分子。
  59. 一種重組細胞，其包含如請求項56至57中任一項之重組核酸分子。
  60. 一種細胞培養物，其包含如請求項59之一或多種重組細胞及培養基。
  61. 一種用於產生多肽或多價抗體之方法，其包含： 提供如請求項59之一或多種重組細胞；及 在培養基中培養該一或多種重組細胞以使得該等細胞產生由該重組核酸分子編碼之多價多肽或多價抗體。
  62. 一種在個體內調節經由磷酸化機制傳導信號之細胞表面受體所介導之細胞信號傳導之方法，該方法包含向該個體投與第一療法，其包含有效量之 a) 如請求項1至27中任一項之多價多肽；或 b) 如請求項28至54中任一項之多價抗體或其功能片段。
  63. 一種用於治療有需要個體之疾病之方法，該方法包含向該個體投與第一療法，其包含有效量之 a) 如請求項1至27中任一項之多價多肽；或 b) 如請求項28至54中任一項之多價抗體或其功能片段。
  64. 如請求項62至63中任一項之方法，其中所投與之多價多肽或該多價抗體將該受體蛋白酪胺酸磷酸酶(RPTP)活性補充至該細胞表面受體之空間鄰近處，且降低該細胞表面受體之磷酸化水準。
  65. 如請求項62至64中任一項之方法，其中投與該多價多肽或該多價抗體賦予該個體中之免疫檢查點受體之降低的活性。
  66. 如請求項62至64中任一項之方法，其中投與該多價多肽或該多價抗體賦予該個體中之T細胞活性增強。
  67. 如請求項62至64中任一項之方法，其中投與該多價多肽或該多價抗體賦予該個體中之T細胞活性抑制。
  68. 如請求項62至67中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物。
  69. 如請求項68之方法，其中該哺乳動物為人類。
  70. 如請求項62至69中任一項之方法，其中該個體患有或疑似患有與該細胞表面受體所介導之細胞信號傳導之抑制相關的疾病。
  71. 如請求項70之方法，其中該疾病為癌症或慢性感染。
  72. 如請求項62至71中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與第二療法。
  73. 如請求項72之方法，其中該第二療法選自由以下組成之群：化學療法、放射線療法、免疫療法、激素療法或毒素療法。
  74. 如請求項72至73中任一項之方法，其中該第一療法及該第二療法同時投與。
  75. 如請求項72至74中任一項之方法，其中該第一療法與該第二療法同時投與。
  76. 如請求項72至73中任一項之方法，其中該第一療法及該第二療法依次投與。
  77. 如請求項76之方法，其中該第一療法在該第二療法之前投與。
  78. 如請求項76之方法，其中該第一療法在該第二療法之後投與。
  79. 如請求項72至73中任一項之方法，其中該第一療法在該第二療法之前及/或之後投與。
  80. 如請求項72至73中任一項之方法，其中該第一療法及該第二療法輪流投與。
  81. 如請求項72至73中任一項之方法，其中該第一療法及該第二療法在單一調配物中一起投與。
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