TW201938795A - 預測藥物功效之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種預測藥物之治療功效的方法,該方法包括分析一組基因以得到用於預測患者是否將對該藥物起反應的資訊。針對一組基因之該分析包括針對基因突變、拷貝數變異及/或表現量之分析。該組基因包含PIK3CA、KRAS、PTEN、BRAF及CSF-1R。該等基因突變包括PIK3CA中之E542K、E545K及H1047R突變;KRAS中之G12C、G12D、G12V、G13D突變;PTEN中之R130G及C71F/Y突變或缺失;BRAF中之V600E突變;及CSF-1R中之H362R突變。該藥物為CSF-1R抑制劑。
Description
本發明大體上關於用於預測藥物功效或作用之方法。
傳統上,醫療治療係基於症狀。因此,假定具有相同症狀之患者具有相同的潛在病因,且因此相同的治療應該適用於具有相同症狀之所有患者。然而,此方法忽略了不同患者可能具有不同遺傳背景的事實。因此,相同的藥物可能對一些患者有效,但是對其他患者可能無效。對於沒有從治療中受益的患者,他們出現了更糟的情況,因為他們遭受了不良影響,且他們亦可能失去了寶貴的時間/機會進行適當的治療。
為了改善這種情況,推動了個體化醫學或精準醫學。對於精準醫學,人們通常會進行伴隨診斷以更好地瞭解患者。伴隨診斷可以用於基於患者之生物學特徵(例如,遺傳輪廓)來判定藥物是否對患者有益,該等生物學特徵決定療法之反應者及非反應者。伴隨診斷偵測且評定預期能夠幫助預測療法之可能結果(例如,功效及毒性)的生物標記物。此外,伴隨診斷亦可用於監測治療期間的藥物反應。此資訊可以幫助醫生找到新的治療策略。
伴隨診斷相對較新且僅少數藥物已建立伴隨診斷。例如,評定Her2表現量之伴隨診斷有助於決定是否使用賀癌平(Herceptin)進行乳癌治療。在另一實例中,EGFR抑制劑常常能夠縮小肺癌。然而,由於EGFR
基因中之T970M突變,癌細胞最終會對藥物產生抗性。此突變之伴隨診斷可以幫助醫生將藥物轉換為較新的EGFR抑制劑,該等抑制劑能夠對抗具有T790M突變之細胞起作用,諸如奧希替尼(osimertinib) (Tagrisso®)。
雖然已證明伴隨診斷有助於為患者選擇適當的治療,但是目前只建立了很少的伴隨診斷。
本發明之實施例係關於用於預測治療功效之診斷技術。
本發明之一個態樣係關於用於預測藥物之治療功效的方法。根據本發明之一個實施例的預測藥物之治療功效的方法包括分析一組基因以得到用於預測患者是否將對該藥物起反應之資訊。針對一組基因之該分析包括針對基因突變、拷貝數變異及/或表現量之分析。該組基因包含PIK3CA、KRAS、PTEN、BRAF及CSF-1R。該等基因突變可以包括PIK3CA中之E542K、E545K及H1047R突變;KRAS中之G12C、G12D、G12V、G13D突變;PTEN中之R130G及C71F/Y突變或缺失;BRAF中之V600E突變;及CSF-1R中之H362R突變。
根據本發明之實施例,該藥物可為CSF-1R抑制劑。該CSF-1R抑制劑可為小分子藥物、生物製劑或核苷酸。該核苷酸可為siRNA或miRNA。
根據本發明之實施例,該藥物可為靶向從該組基因中之基因轉譯之蛋白質的藥物。該藥物可為PIK3CA抑制劑、KRAS抑制劑、PTEN抑制劑或BRAF抑制劑。
根據本發明之實施例,該分析利用illumina多樣本混合定序(multiplexing illumina)、即時聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、次世代定序法(next-generation sequencing,NGS)、基因晶片、微流體(microfluidics)、流動式細胞測量術或其組合。針對一組基因之分析可以多樣本混合定序格式(multiplex format)同時進行。
本發明之一個態樣係關於一種用於基因診斷之方法/平台。根據本發明之一個實施例的方法包含使用與探針偶合之磁珠來與樣品反應以偵測目標基因之存在或不存在,其中該探針能夠與該目標基因之片段雜交。該目標基因為KRAS且該探針經設計以偵測KRAS中之G12D突變。該探針與生物素偶合以與抗生蛋白鏈菌素-R-藻紅素相互作用,從而允許對螢光強度及數量之illumina多樣本混合定序偵測。該探針具有用於偵測KRAS G12D突變之序列5'-TTGGAGCTGA
TGGCGTAGGCA-3'或用於偵測野生型KRAS之序列5'- TTGGAGCTGG
TGGCGTAGGCA -3',其中該探針之5'端經胺基修飾。
本發明之實施例係關於用於預測治療功效之診斷技術。本發明方法可以用作用於篩選將對特定療法起反應之患者亞群的伴隨診斷,從而提高治療成功之機率並避免醫療資源之浪費。
根據本發明之實施例,預測藥物之治療功效的方法可以包括分析一組基因以得到用於預測患者是否將對該藥物起反應之資訊的步驟。針對一組基因之該分析可以包括針對基因突變、拷貝數變異及/或表現量之分析。
本發明方法將以有限數目之實例來說明。然而,熟習此項技術者將瞭解,此等實例僅僅為了說明,且並不意欲限制本發明之範疇。在特定實例中,將描述CSF-1R抑制劑療法。關於CSF-1R抑制劑療法,伴隨診斷可以包括對參與CSF-1R信號傳導路徑之基因的分析。此類基因例如可以包括PIK3CA、KRAS、PTEN及BRAF。
發現癌症療法抗性與群落刺激因子-1 (CSF1)及CSF1受體(CSF-1R)驅動之腫瘤浸潤性巨噬細胞的存在有關。因此,已在癌症療法中使用CSF-1R抑制來靶向腫瘤相關之巨噬細胞。然而,CSF-1R抑制治療之作用在不同種族之患者中係不同的,表明不同的遺傳背景可能起重要作用。
藉由針對與CSF-1R作用相關之基因分析各種基因資料庫,發現緊挨著信號傳導路徑中之CSF-1R下游之基因(諸如PIK3CA、KRAS、PTEN及BRAF)的突變可能對CSF-1R抑制劑療法之功效造成影響。此等基因之突變經常與各種癌症有關。藉由分析此等基因產物中可能影響其功能之突變,發現若干潛在的突變,包括PIK3CA中之E542K、E545K及H1047R突變,KRAS中之G12C、G12D、G12V、G13D突變,PTEN中之R130G及C71F/Y突變或缺失,BRAF中之V600E突變及CSF-1R中之H362R突變,可能對CSF-1R抑制劑療法造成影響。藉由分析此等突變在各種癌細胞中之發生率,可得到可用於預測CSF-1R抑制劑治療之治療功效的有用資訊。
本發明之實施例將用以下特定實例進一步加以說明。熟習此項技術者將瞭解,此等實例僅僅為了說明,且並不意欲限制本發明之範疇。熟習此項技術者將瞭解,針對此等實例之修改及變化在不脫離本發明之範疇的情況下係可能的。
實例1:與CSF-1R抑制劑作用相關之基因突變
實例1:與CSF-1R抑制劑作用相關之基因突變
發現癌症療法抗性與群落刺激因子-1 (CSF1)/CSF1受體(CSF1R)驅動之腫瘤浸潤性巨噬細胞的存在有關。因此,已在癌症療法中使用CSF-1R抑制來靶向腫瘤相關之巨噬細胞。然而,CSF-1R抑制治療之作用在不同種族之患者中係不同的,表明遺傳背景可能起重要作用。因此,分析與CSF-1R信號傳導路徑相關之基因及突變可以提供有助於預測療法結果之資訊。
針對可能影響CSF-1R信號傳導及CSF-1R抑制療法之作用的基因、突變,分析若干人類癌症基因資料庫。該分析聚焦於突變對功能之影響。可使用交叉統計分析來評定亦存在於癌症患者中之基因突變率。此類分析之結果可用於預測哪種藥物將適合於患者。
用於此類分析之癌症基因資料庫包括GENIE (AACR計畫基因組學證據瘤形成資訊交換(Project Genomics Evidence Neoplasia Information Exchange))、TCGA (癌症基因組圖譜(Cancer Genome Atlas))及ICGC (國際癌症基因組聯盟(International Cancer Genome Consortium))。該分析可以使用任何適合工具,諸如cBioPortal平台(v.1.8.3) (http :// www . cbioportal . org / index . do
)。用於癌症基因組學之cBioPortal為在紀念斯隆-凱特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)之計算生物學中心(Computational Biology Center,cBio)開發的工具。
本發明中,對CSF-1R信號轉導相關基因進行分析。此等基因例如包括CSF1R、PIK3CA、PTEN、KRAS及BRAF。在不同種族患者中,分析關於各種癌症(神經膠質瘤、口腔癌、甲狀腺癌、肺癌、乳癌、胃癌、肝癌、膽道癌、結腸直腸癌、卵巢癌及子宮內膜癌)中此等基因之突變率。
預測CSF-1R抑制劑之作用
預測CSF-1R抑制劑之作用
藉由在cBioPortal平台上分析與CSF-1R蛋白質之磷酸化有關之信號傳導路徑,連同基因網路分析一起,發現在信號傳導路徑(圖1)中最接近CSF-1R的PIK3CA及KRAS具有最高突變率。
針對主要來自美國及歐洲患者之各種癌症組織,GEINE資料庫之分析揭示PIK3CA及KRAS在所有癌症中具有超過5%的突變率。PIK3CA在乳癌中之突變率為約31.3%,且KRAS在非小細胞腺癌中之突變率為約27%。PIK3CA及KRAS之突變伴隨著CSF-1R活性增加。此等突變亦與臨床上缺乏對治療之反應相關。
評估PIK3CA及KRAS中之點突變對藥物功效之影響
評估PIK3CA及KRAS中之點突變對藥物功效之影響
此等突變與藥物功效相關這一點可以藉由分析蛋白質結構及文獻資訊來確認。可使用GEINE及TCGA癌症資料庫分析突變率。發現在乳癌組織中,影響蛋白質功能之PIK3CA突變(E542K、E545K及H1047R)佔患者之約20%,與種族無關。(圖1)。
發現對藥物功效有影響之KRAS中之點突變(G12C、G12D、G12V及G13D)在結腸直腸癌中具有更高的突變率。對於所有種族,該等突變率為約33%。(圖1)。此等突變率可以預測將不對CSF-1R抑制劑治療起反應之患者的百分比。亦分別以19%及21%之比率在亞洲人膽道癌及高加索人(Caucasian)肺癌中發現了此等突變。(圖1)。 此等比率亦可以預測將不對CSF-1R抑制劑治療起反應之患者的百分比。
在CSF-1R信號傳導路徑中,PTEN及BRAF為直接分別與PIK3CA及KRAS相互作用之作用物。因此,預期影響PTEN (例如,R130G、C71F/Y及缺失)及BRAF (V600E)功能之突變對CSF-1R抑制劑之作用具有負面影響。分析此等突變對癌症治療之潛在影響,發現此等突變在高加索人中可以影響高達9%的神經膠質瘤患者且在高加索人及亞洲人中可以影響高達50%的甲狀腺癌患者。(圖2)。因此,此等突變分析可用於預測可能不對CSF-1R抑制劑治療起反應之患者的百分比。
基於整合突變分析預測對CSF-1R抑制劑治療作用之影響
基於整合突變分析預測對CSF-1R抑制劑治療作用之影響
為了更好地處理臨床上的意外情況,對PIK3CA、KRAS、PTEN及BRAF突變進行交叉分析。此等分析尤其是尋找影響此等基因之功能的兩個或更多個突變。來自此等分析之結果揭示,在結腸直腸癌及甲狀腺癌中,在所有不同種族中具有影響此等基因功能之兩個或兩個以上突變的比率高達40%。(圖3)。此等結果可用於預測將不對CSF-1R抑制劑治療起反應之患者的百分比。
CSF-1R突變
CSF-1R突變
除了上述CSF-1R信號傳導路徑基因之外,預期CSF-1R本身之突變亦會影響CSF-1R抑制劑治療之功效。基於在臺灣人體生物資料庫(Taiwan Biobank)之遺傳資訊之分析,據報導,在臺灣群體中,42%具有CSF-1R中之H362R突變。此突變會引起對CSF-1R抑制劑治療之反應增強或減弱。
上述分析顯示,CSF-1R信號傳導路徑中之各種因子在CSF-1R抑制治療中起作用。此等因子包括CSF-1R、PIK3CA、PTEN、KRAS及BRAF。分析影響此等因子之功能的功能性突變可以提供用於預測哪些患者將從CSF-1R抑制治療受益且哪些患者將不受益的資訊。
實例2:使用細胞株確定基因突變之分析方法
實例2:使用細胞株確定基因突變之分析方法
此實例展示使用細胞株來確定基因突變之分析方法。首先,從肺癌細胞A549、H727、HCC-827、H1975、NCI-H146、H460及H292獲得基因組DNA。基於此等基因組DNA,使用聚合酶鏈反應(PCR)獲得CSF-1R、PIK3CA、KRAS及PTEN之基因片段。使用桑格定序法(Sanger's sequencing method)測定此等基因片段之序列,且隨後將該等序列與來自正常細胞之相同片段的序列進行比較。該比較將揭示任何核苷酸差異。進一步確認突變位置。序列確定及分析程序如下:
製備基因組DNA
製備基因組DNA
使用DNeasy血液與組織套組(QIAGEN,目錄號69581)進行基因組DNA提取。簡言之,在離心管中收集目標肺癌細胞。用1×PBS洗滌細胞以移除用於將細胞保存於冷凍等分試樣中之DMSO。對管子進行離心,且捨棄頂部澄清溶液。向管中之細胞集結粒(cell pellet)中添加180 μl ATL溶解緩衝液(Qiagen)及20 μl蛋白酶K。混合且再懸浮細胞集結粒。將管於烘箱中在56℃下置放4小時以消化蛋白質。在蛋白質消化之後,向管中添加200 μl AL溶解緩衝液且充分混合。隨後添加200 μl純乙醇且充分混合。
在微量離心機中將管離心15秒。收集頂部透明液體且將其加載於DNeasy微型旋轉管柱(Qiagen)上。使旋轉管柱在8000 rpm下離心1分鐘。捨棄下層液體。隨後添加500 μl AW1洗滌緩衝劑,繼之以在8000 rpm下離心1分鐘。捨棄下層液體。添加500 μl AW2洗滌緩衝劑,繼之以在14000 rpm下離心3分鐘。捨棄下層液體。在高速(14000 rpm)下再一次離心3分鐘以移除殘留緩衝劑。
將旋轉管柱置放於1.5 ml微量離心管之頂部。在管柱頂部添加200 μl AE溶離緩衝劑。使管在室溫下靜置1分鐘,隨後使管在8000 rpm下離心1分鐘。收集在微量離心管中之液體為含有所提取之基因組DNA的樣品。
聚合酶鏈反應(PCR)
聚合酶鏈反應(PCR)
使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TAKARA)進行聚合酶鏈反應。CSF-1R、PIK3CA、KRAS及PTEN之特定引子顯示於表1中。擴增反應條件描述於下文中。擴增所要DNA片段且用電泳對其進行分析以確認片段及濃度。
DNA擴增
DNA擴增
使用桑格法進行DNA定序。使用BigDye Terminator V3.1循環定序套組(Applied Biosystems, Foster City, CA)進行PCR產物之序列分析。各反應使用50 ng引子及1 µl BigDye混合物、10 ng PCR產物及1 µl 5×反應緩衝劑。在GeneAmp PCR系統2700熱循環儀(Applied Biosystems, Foster City, CA)中進行PCR。反應條件為:96℃初始變性1分鐘,96℃變性10秒,50℃黏接10秒,重複45個循環,且隨後在60℃下延伸4分鐘。
使用ABI 3730XL DNA分析儀(Applied Biosystems)對PCR產物進行定序,該分析儀可以對平均700至800 bp定序。將來自肺癌細胞之CSF-1R、PIK3CA、KRAS及PTEN之序列與來自正常細胞之彼等序列進行比較以確定差異。隨後,確認突變位置。
表1:引子
表1:引子
總之,已分析了來自肺癌細胞株A549、H727、HCC-827、H1975、NCI-H146、H460及H292之與CSF-1R信號傳導相關之基因。發現了CSF-1R、PIK3CA、KRAS及PTEN中之突變(圖1及圖2)。此等分析之結果顯示,大部分基因為野生型基因。來自肺癌細胞A549及H727之基因在G12具有突變(表2)。此等突變可被準確地測定。
上述實例顯示,可以分析不同細胞株之遺傳資訊。基於不同的遺傳背景資訊,就能夠預測或評估治療性治療之作用。
表2
表2
肺癌細胞株A549、H727、HCC-827及H1975之基因序列分析之結果,及關於CSF-1R、PIK3CA、KRAS及PTEN所觀察到的突變。結果顯示,大部分基因為野生型,且僅來自A549及H727之KRAS在G12位置具有突變,來自HCC-827及H1975之PI3K在E545具有突變。
表3
表3
肺癌細胞株NCI-H146、H460及H292之序列分析,尋找CSF-1R、PIK3CA、KRAS及PTEN中之突變。發現所分析的大部分基因為野生型,且僅來自H460之PI3K在E545具有突變。
實例3:開發針對多個基因之偵測方法
實例3:開發針對多個基因之偵測方法
此實例描述基於Luminex xMAP (多重分析技術平台(Multi-Analyte Profiling);Luminex Corp., Austin, TX)、基因-探針設計及雜交技術的基因偵測及分析方法。首先,設計且合成用於目標DNA序列(例如,CSF-1R、PIK3CA、KRAS、BRAF及PTEN)之基因探針。隨後,使用該等基因探針如下偵測特定目標基因。選擇對目標基因具有特異性的基因探針。使選定的基因探針偶合在特定磁珠上。混合用於不同分析樣品之螢光磁珠。添加分析樣品之經擴增片段且用磁珠上經螢光標記之探針偵測該等片段。隨後,使用流動式細胞測量術偵測磁珠類型並量測螢光強度。
此方法可以提供多個基因偵測且可以達成快速且準確的偵測。該等方法可以用於臨床上。
實例4:偵測癌症中之KRAS基因突變
實例4:偵測癌症中之KRAS基因突變
在臨床上,KRAS突變常常與結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌等有關。大部分常見的KRAS突變發現位於位置G12及G13。在G12之突變比在G13之突變更常見,使得G12突變在治療反應中之相關性較高。
本發明之目的為提供用於偵測KRAS中之G12突變的方法。本發明之實施例係基於Liminex xMAP (多重分析技術平台)原理且利用磁珠探針來偵測基因突變。本發明方法可以包括以下步驟:測試樣品擴增、基因-探針設計及雜交反應。簡言之,在磁珠上偶合基因探針,且隨後將其添加至已經過擴增(例如,使用PCR)之測試樣品。探針或珠粒含有螢光標記,其可方便人們使用流動式細胞測量術來區分不同的磁珠。不同的磁珠致使可區分出突變型或野生型基因。此外,可使用螢光強度來定量物種。此等方法能夠快速且準確地進行基因診斷,以及定量。
將描述例示性方法來舉例說明。然而,熟習此項技術者應瞭解,此實例僅用於說明,且其他修改及變化在不脫離本發明之範疇的情況下係可能的。
引子及探針設計
引子及探針設計
用於Kras基因偵測之引子可以對文獻中之Kras序列作一些修改而得到。例如,可將生物素附接於反向引子之5'端,如表4中所示。此外,基於目標基因,可設計野生型(Wt)探針及KrasG12D
(GAT)突變型(Mt)探針,如表5中所示。此等引子長21個核苷酸,且此等引子之5'端經胺基修飾。
表4:Kras引子
表5:用於Kras偵測之探針設計
樣品種類及處理
表4:Kras引子
由人類細胞株或由患者衍生之異種移植(patient-derived xenograft,PDX)樣品製備DNA提取物。使用特定經修飾引子及PCR來擴增特定Kras基因片段且用螢光標記物對其作標記。
與 Kras 野生型 ( Wt ) 、 KrasG12D ( GAT ) 突變型 ( Mt ) 探針結合之珠粒
與 Kras 野生型 ( Wt ) 、 KrasG12D ( GAT ) 突變型 ( Mt ) 探針結合之珠粒
將具有不同代碼之珠粒(例如,珠粒012及078)充分混合於0.1 M 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)緩衝劑中。使用10 mg/ml 1-乙基-3-3 (3-3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC),使具有不同代碼的各珠粒與特定探針(0.2 nmol)偶合。偶合反應在室溫下進行30分鐘。再重複一次EDC偶合反應。隨後,添加0.5 ml 0.02% Tween 20且充分混合。隨後使混合物在14000 rpm下離心3分鐘。捨棄上層澄清溶液。向管中添加0.5 ml 0.1% SDS且充分混合。使其再次離心且捨棄上層澄清溶液。添加適合體積之Tris-EDTA溶液以再溶解珠粒。
雜交
雜交
藉由上述程序,合成了兩個序列:Kras野生型(Wt)及KrasG12D
(GAT)突變型(Mt)。用生物素標記此等序列之5'端。兩個序列片段長59 b.p.,其用作用於構築分析平台之標準品。
雜交反應在96孔PCR盤中進行。各孔加載有2500個珠粒,將其與上述合成序列混合。每孔總體積為50 μl。在PCR機器(Biometra Tadvanced)中進行雜交。在雜交之後,將PCR盤中之樣品轉移至96孔深色盤中。藉助於磁性盤,捨棄上清液。向各孔中添加抗生蛋白鏈菌素-R-藻紅素(75微升/孔),且在室溫下進行結合反應30分鐘。使用Magpix設備(Luminex)來量測磁珠之中值螢光強度(MFI)。
表6:Kras野生型(Wt)及KrasG12D (GAT)突變型(Mt)合成序列
珠粒 - 探針偶合效率
表6:Kras野生型(Wt)及KrasG12D (GAT)突變型(Mt)合成序列
為了評定探針之靈敏度,將與KrasG12D
Mt探針偶合之磁珠與不同濃度(0.005、0.025、0.05、0.1及0.2 pmol)之KrasG12D
Mt序列雜交。雜交在95℃下進行5分鐘,且隨後在52℃下進行30分鐘。如圖4中所示,KrasG12D
Mt探針可以偵測在0.025-0.1 pmol範圍內之KrasG12D
Mt序列,最低偵測極限為0.025 pmol。
探針特異性
探針特異性
為了評定探針之特異性,將與Kras Wt探針偶合之磁珠與不同濃度(0.005、0.025、0.05、0.1及0.2 pmol)之Kras Wt及KrasG12D
Mt序列雜交。雜交在95℃下進行5分鐘,且隨後在52℃下進行30分鐘。如圖5中所示,Kras Wt探針可以比與KrasG12D
Mt序列更高的親和力與Kras Wt序列雜交。因此,磁性探針具有特異性。
最佳雜交條件
雜交溫度
最佳雜交條件
雜交溫度
為了找出最佳的雜交溫度,將與Kras Wt探針偶合之磁珠分別單獨地與低濃度、中等濃度及高濃度(0.005、0.05及0.2 pmol)之Kras Wt及KrasG12D
Mt序列雜交。雜交在95℃下進行5分鐘,且隨後在23.3-75℃下進行30分鐘。如圖6中所示,相比於在低雜交溫度下,在高雜交溫度下,MFI值顯示Kras Wt探針可以與Kras Wt及KrasG12D
Mt序列形成更穩定的雜交體。因此,本發明偵測平台之較佳雜交溫度將使用相對較高的雜交溫度,諸如65-80℃,更佳為約70℃ (例如,70.6℃)。
雜交時間 / 持續時間
雜交時間 / 持續時間
為了找出最佳的雜交持續時間,將與Kras Wt探針偶合之磁珠分別單獨地與低濃度、中等濃度及高濃度(0.005、0.05及0.2 pmol)之Kras Wt及KrasG12D
Mt序列雜交。雜交在95℃下進行5分鐘,且隨後在70.6℃下進行,觀察不同反應時間(1、5、10、15、20及30分鐘)之交雜。如圖7A及圖7B中所示,相比於其他雜交時間,在10分鐘之雜交時間下,中等濃度及高濃度(0.05及0.2 pmol)之KrasG12D
Mt探針可以與Kras Wt及KrasG12D
Mt序列雜交產生最佳的MFI值。因此,在較短的雜交時間(10分鐘而非30分鐘)下,可以獲得較佳的偵測信號。因此,對於本發明之偵測平台,較佳選擇10分鐘之雜交時間。
偵測平台之準確性
偵測平台之準確性
偵測平台之準確性可以如下測試。用PCR擴增人類細胞株及由患者衍生之異種移植(PDX)樣品以獲得目標基因片段。隨後,使用Quick Microbeads Kras基因偵測平台偵測基因狀態。偵測樣品已經過分析且測定其基因序列。因此,其可以用作用於評定偵測平台之標準品。隨後,在10個盲法測試中分析樣品,每次採用10個PCR產物且一式四份地測試各樣品。根據此等測試,發現本發明之偵測平台或方法在測試100個PCR產物之後具有99%之準確性。因此,本發明之偵測平台/方法具有系統穩定性及偵測準確性之優點。
本發明之實施例已以有限數目之實例來說明。熟習此項技術者應瞭解,此等實例僅用於說明且並不意欲限制本發明之範疇,因為其他修改及變化在不脫離本發明之範疇的情況下係可能的。因此,保護範疇應僅受所附申請專利範圍之限制。
圖1顯示展示參與CSF-1R信號傳導的各個因子的示意圖。基於對來自各種癌細胞之基因資料庫之分析,發現PIK3CA及KRAS在乳癌及結腸直腸癌中具有高突變率。顯示了各種癌症中PIK3CA突變之發生率,以及各種癌症中KRAS突變之發生率。
圖2顯示展示參與CSF-1R信號傳導的各個因子的示意圖。基於對來自各種癌細胞之基因資料庫之分析,發現PTEN及BRAF在神經膠質瘤及甲狀腺癌中具有高突變率。顯示了各種癌症中PTEN突變之發生率,以及各種癌症中BRAF突變之發生率。
圖3顯示來自PIK3CA、KRAS、PTEN及BRAF突變之交叉分析的結果。來自此等分析之結果揭示,在結腸直腸癌及甲狀腺癌中,在所有不同種族中具有兩個或更多個影響此等基因功能之突變的比率高達40%。
圖4顯示來自與探針偶合之磁珠與目標KRAS G12D序列之間的雜交的結果。
圖5顯示來自探針特異性測試之結果。使Kras WT探針(0.2 nmol)與野生型Kras或突變型Kras_GAT (mG12D)雜交。結果顯示本發明探針具有特異性。
圖6A顯示在0.2 pmol之野生型及突變型Kras下測試最佳雜交溫度的結果。使具有野生型Kras探針之磁珠與野生型Kras或突變型Kras_GAT (mG12D)序列在不同溫度下雜交且量測中值螢光強度(median fluorescence intensity,MFI)值以評定該雜交。結果顯示,在例如60-80℃之較高溫度下,雜交進行得較好且產生較穩定的結果。
圖6B顯示在0.05 pmol之野生型及突變型Kras下測試最佳雜交溫度的結果。
圖6C顯示在0.005 pmol之野生型及突變型Kras下測試最佳雜交溫度的結果。
圖7A顯示最佳雜交時間之測試結果。使具有突變型Kras Mt探針之磁珠與突變型Kras目標序列雜交持續不同的雜交時間且量測中值螢光強度(MFI)值以評定該雜交。結果顯示,約10分鐘之雜交時間進行得較好且產生較穩定的結果。
圖7B顯示最佳雜交時間之測試結果。使具有突變型Kras Mt探針之磁珠與野生型Kras目標序列雜交持續不同的雜交時間且量測中值螢光強度(MFI)值以評定該雜交。結果顯示,約10分鐘之雜交時間進行得較好且產生較穩定的結果。
Claims (18)
- 一種用於預測藥物之治療功效的方法,該方法包含:分析個別基因或一組基因,以得到用於預測患者是否將對該藥物起反應之資訊。
- 如請求項1之方法,其中針對個別基因或一組基因之該分析包括針對基因突變、拷貝數變異及/或表現量之分析。
- 如請求項2之方法,其中該組基因包含PIK3CA、KRAS、PTEN、BRAF及CSF-1R。
- 如請求項3之方法,其中該等基因突變包含PIK3CA中之E542K、E545K及H1047R突變;KRAS中之G12C、G12D、G12V、G13D突變;PTEN中之R130G及C71F/Y突變或缺失;BRAF中之V600E突變;及CSF-1R中之H362R突變。
- 如請求項1之方法,其中該藥物為CSF-1R抑制劑或免疫調節劑。
- 如請求項5之方法,其中該CSF-1R抑制劑或免疫調節劑為小分子藥物、生物製劑或核苷酸。
- 如請求項6之方法,其中該核苷酸為siRNA或miRNA。
- 如請求項1之方法,其中該藥物包含靶向蛋白質之藥物,該蛋白質轉譯自該組基因中之基因。
- 如請求項8之方法,其中該藥物為PIK3CA抑制劑、KRAS抑制劑、PTEN抑制劑或BRAF抑制劑。
- 如請求項1之方法,該分析係利用illumina多樣本混合定序(multiplexing illumina)、即時聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、次世代定序法(next-generation sequencing,NGS)、基因晶片、微流體(microfluidics)、流動式細胞測量術或其組合。
- 如請求項1之方法,其中針對個別基因或一組基因之該分析係以多樣本混合定序格式(multiplex format)同時進行。
- 一種用於基因診斷之方法,該方法包含使用經與探針偶合之磁珠與樣品反應以偵測目標基因之存在或不存在,其中該探針能夠與該目標基因之片段雜交。
- 如請求項12之方法,其中該目標基因為KRAS,且該探針經設計以偵測KRAS中之G12D突變。
- 如請求項12之方法,其中該探針係與生物素偶合以便與抗生蛋白鏈菌素-R-藻紅素相互作用,從而允許針對螢光強度及數量之illumina多樣本混合定序偵測。
- 如請求項12之方法,其中該樣品在偵測之前係使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增。
- 如請求項15之方法,其中該聚合酶鏈反應(PCR)係使用5'-CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGA-3' (SEQ ID NO:1)作為正向引子及5'- TATCGTCAAGGCACTCTTGC-3' (SEQ ID NO:2)作為反向引子,其中該反向引子具有與5'端偶合之生物素。
- 如請求項12之方法,其中該探針具有用於偵測KRAS G12D突變之序列5'-TTGGAGCTGATGGCGTAGGCA-3'或用於偵測野生型KRAS之序列5'- TTGGAGCTGGTGGCGTAGGCA -3',其中該探針之5'端經胺基修飾。
- 如請求項15之方法,其中該等磁珠與該樣品之雜交係在PCR反應容器中進行,且其中雜交溫度係在60-80℃之間的溫度下,且雜交時間為介於1至30分鐘之間的持續時間。
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