TW201936637A - 具有改良之免疫療效但減弱之副作用之突變抗ctla-4抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於結合至人類CTLA-4分子之抗CTLA-4抗體組合物，以及該等組合物用於癌症免疫療法中及相較於其他免疫治療劑減少自體免疫副作用之用途。

Description

具有改良之免疫療效但減弱之副作用之突變抗CTLA-4抗體
本發明係關於具有改良之抗腫瘤活性但減弱之副作用的突變抗CTLA-4抗體，以及製備及使用此類抗體之方法。
抗CTLA-4單株抗體(mAb)賦予癌症免疫療效(CITE)，但引起嚴重的免疫治療相關不良事件(irAE)。抗CTLA-4 mAb已在小鼠模型及黑色素瘤患者中展示CITE。抗PD-1 mAb尼沃單抗(Nivolumab)與抗CTLA-4 mAb伊匹單抗(Ipilimumab)之組合顯著地增加晚期黑色素瘤患者之客觀反應率。此組合療法在晚期非小細胞肺癌(NSCLC)中亦出現有希望的結果。在II期臨床試驗中，將另一種抗CTLA-4 mAb (曲美單抗(Tremelimumab))與抗PD-L1 mAb德瓦魯單抗(Durvalumab)組合時，獲得臨床益處之試驗性證據。
單獨或組合之抗CTLA-4 mAb之較寬泛臨床用途的主要障礙為嚴重不良事件(SAE)。伊匹單抗(第一臨床抗CTLA-4 mAb)試驗中所觀測的SAE引起免疫治療相關不良事件(irAE)之觀念。詳言之，在伊匹單抗與尼沃單抗(抗PD-1)之組合療法中，超過50%患者出現3級及4級SAE。在NSCLC中，伊匹單抗與尼沃單抗組合療法引起高反應率，但3級及4級SAE的發生率亦較高。同樣，德瓦魯單抗(抗PD-L1)與曲美單抗(抗CTLA-4 mAb)之組合證明NSCLC之臨床活性，但3級及4級SAE及患者退出率較高，此可能由於毒性不可接受。由於較高劑量之抗CTLA-4 mAb在單一療法與組合療法中與較佳臨床結果相關，因此irAE不僅妨礙許多患者繼續免疫療法，而且限制CITE之功效。另外，大量患者因兩種抗CTLA-4 mAb而退出，此可能歸因於不能滿足若干臨床試驗中之臨床終點。
最近，對抗PD-1 mAb尼沃單抗及抗CTLA-4 mAb伊匹單抗作為經切除之III及IV期黑色素瘤之輔助療法進行的頭對頭比較表明，伊匹單抗具有較低之CITE，但較高之irAE，此使得CTLA-4靶向免疫療法的前景進一步暗淡。然而，存活三年的經伊匹單抗治療之患者在十年期間、在存活率方面未展示進一步下降。顯著持續之反應突顯靶向此分子對於免疫療法之非凡益處，尤其是可以使irAE受到控制。
關於產生安全且有效之抗CTLA-4 mAb的基本問題係CITE與irAE是否內在地關聯。經典的檢查點阻斷假設指出，抗CTLA-4 mAb係藉由阻斷B7-CTLA-4相互作用之負信號以促進淋巴器官中之初始T細胞活化來促進癌症免疫。根據此模型，治療抗體為功能上不活化CTLA-4-B7相互作用的拮抗劑。由於基因滅活CTLA-4表現引起小鼠及人類之自體免疫疾病，因此假定irAE為CITE之必需代價。另一方面，吾等證明，抗小鼠CTLA-4 mAb之療效需要抗體介導腫瘤微環境內之Treg特異性地耗乏，而非阻斷B7-CTLA-4相互作用。其與抗體是否能夠在誘導CITE之生理條件下阻斷B7-CTLA-4相互作用不相關。此等研究引人興趣之可能性在於，若吾人可以達成局部Treg耗乏而不模擬基因滅活CTLA-4表現，則可以達成CITE而無irAE。使用對於人類對偶基因而言為同型接合或異型接合之小鼠，發現irAE需要雙對偶基因接合，而CITE僅需單對偶基因接合。此等資料表明，irAE需要拮抗CTLA-4功能；而CITE依賴於抗體之促效活性。
本發明提供消除抗CTLA-4抗體之拮抗活性同時保持及改良其Fc受體促效活性之方法。具體揭示增加抗體結合對酸性pH之敏感性的方法，藉此抗CTLA-4抗體展現減少的針對CTLA-4之結合。如本文所述的變化，諸如抗CTLA-4抗體結合活性的減小，可為特定抗體組合物之兩種不同pH水準之間的相對差異。在一個實施例中，對CTLA-4的結合在反映細胞內核內體隔室的pH下減少。在一個較佳實施例中，相對於在中性pH (pH 7.0)下的結合，對CTLA-4的結合在5.5之核內體pH下減少超過50%。相較於pH 7.0，在溶酶體pH 4.5下，此類減少可以達到超過75%。在pH 7.0下預形成的抗體-抗原複合物可以在pH 4.5-6.0之酸性環境下解離。結合的減少亦可相較於參考抗體而言，該參考抗體在使用相同標準的情況下對pH的敏感性可以大大減小。參考抗體可為此項技術中已知的抗體，諸如伊匹單抗或曲美單抗。在工程化抗體的情形下，變化亦可相較於野生型抗體而言，該野生型抗體在使用相同標準的情況下對pH的敏感性可以大大減小。
在另一態樣中，本文提供鑑別具有改良之抗腫瘤功效及/或減小之毒性之抗CTLA-4抗體的方法，包含在4.5至7.0範圍內之一種以上pH下測試或量測培養盤所塗CTLA-4與可溶性抗體之間的相互作用，及選擇對pH敏感性增強、使得在酸性pH下觀測到之結合性降低的抗體。在一個實施例中，pH為7.0及5.5。在其他實施例中，其為7.0及4.5，或7.0、5.5及4.5。
在另一態樣中，本文提供鑑別毒性減小之抗CTLA-4抗體的方法，此鑑別係依據其對細胞表面CTLA-4含量的作用。在一個較佳實施例中，抗體可與細胞內之CTLA-4解離且允許CTLA-4再循環回至細胞表面，此可基於細胞表面CTLA-4之最少或不減少來確定。
在另一態樣中，本文提供設計或修飾抗CTLA-4抗體以改良抗腫瘤作用及/或減小毒性的方法，此係藉由增強pH敏感性來達成，以使得在酸性pH值下觀測到對CTLA-4的結合性降低。亦提供展現此等特徵之抗CTLA-4抗體。在一個實施例中，可藉由用組胺酸殘基置換野生型抗CTLA-4抗體(諸如伊匹單抗或曲美單抗)之輕鏈及/或重鏈可變區之一或多個CDR區內或附近的一或多個酪胺酸殘基來設計抗體。可產生抗CTLA-4抗體曲美單抗或伊匹單抗之突變形式，使得其在酸性pH下對CTLA-4的結合相對於野生型抗體減少。
在另一態樣中，本文提供使用ADCC報導分析來鑑別具有改良之抗腫瘤功效之抗體的方法，其中增強之ADCC活性用作抗腫瘤活性之讀數。
本文亦提供具有增強之抗腫瘤活性及/或減小之毒性的特異性抗CTLA-4抗體、其抗體片段及前述者之組合物。抗體可以包含含有SEQ ID NO: 1、3、5、6或8中所述之序列的重鏈，及含有SEQ ID NO: 2或4中所述之序列的輕鏈。抗體亦可包含含有SEQ ID NO: 14-18之一中所述之序列的重鏈及含有SEQ ID NO: 10-12之一中所述之序列的輕鏈。
本文進一步提供癌症免疫治療或治療癌症之方法，其中本文所述的抗CTLA-4抗體組合物單獨或與一或多種其他抗癌療法組合使用。在一個態樣中，另一種抗癌療法為免疫療法。在另一態樣中，免疫療法為抗PD-1或抗PD-Ll療法。免疫療法可為尼沃單抗、德瓦魯單抗或派姆單抗(Pembrolizmab)。亦提供本文所述之抗體組合物用於製造供治療癌症用之藥劑的用途。治療癌症之方法可包含向需要治療癌症之個體投與本文所述之組合物。個體可為人類。
定義
如本文所用，術語「抗體」係指具有「可變區」抗原識別位點之免疫球蛋白分子。術語「可變區」係指免疫球蛋白的一種結構域，該結構域不同於抗體廣泛共享之結構域(諸如抗體Fc域)。可變區包含殘基負責抗原結合之「高變區」。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」(亦即，典型地位於輕鏈可變域中之大約殘基24至34 (L1)、50至56 (L2)及89至97 (L3)及重鏈可變域中之大約殘基27至35 (H1)、50至65 (H2)及95至102 (H3)處；參考文獻44)之胺基酸殘基且可以包含來自「高變環」(亦即，輕鏈可變域中之殘基26至32 (L1)、50至52 (L2)及91至96 (L3)及重鏈可變域中之26至32 (H1)、53至55 (H2)及96至101 (H3))之彼等殘基。「構架區」或「FR」殘基為除如本文所定義之高變區殘基之外的彼等可變域殘基。本文所揭示之抗體可為單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人類化抗體、合成抗體、嵌合抗體、駱駝化抗體、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv (sdFv)、胞內抗體，或抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如針對本發明抗體之抗Id及抗抗Id抗體)。詳言之，抗體可為免疫球蛋白分子，諸如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY，或為一類，諸如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 或IgA2 ，或為子類。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」係指抗體之一或多個部分，其含有抗體之互補決定區(「CDR」)及視情況存在的構架殘基，該等構架殘基包含抗體之「可變區」抗原識別位點且展現免疫特異性結合抗原之能力。此類片段包括Fab'、F(ab')2 、Fv、單鏈(ScFv)及其突變體、天然存在之變異體，以及包含抗體「可變區」抗原識別位點及異源蛋白(例如毒素、不同抗原之抗原識別位點、酶、受體或受體配位體等)的融合蛋白。如本文所用，術語「片段」係指一種肽或多肽，其包含至少5個鄰接胺基酸殘基、至少10個鄰接胺基酸殘基、至少15個鄰接胺基酸殘基、至少20個鄰接胺基酸殘基、至少25個鄰接胺基酸殘基、至少40個鄰接胺基酸殘基、至少50個鄰接胺基酸殘基、至少60個鄰接胺基酸殘基、至少70個鄰接胺基酸殘基、至少80個鄰接胺基酸殘基、至少90個鄰接胺基酸殘基、至少100個鄰接胺基酸殘基、至少125個鄰接胺基酸殘基、至少150個鄰接胺基酸殘基、至少175個鄰接胺基酸殘基、至少200個鄰接胺基酸殘基或至少250個鄰接胺基酸殘基的胺基酸序列。
人類、嵌合或人類化抗體對於在人類活體內使用尤其較佳，然而，鼠類抗體或其他物種之抗體可有利地用於許多用途(例如活體外或原位偵測分析、急性活體內使用等)。
「嵌合抗體」為一種分子，其中抗體之不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子，諸如具有衍生自非人類抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的抗體。包含來自非人類物種之一或多個CDR及來自人類免疫球蛋白分子之構架區的嵌合抗體可使用此項技術中已知之多種技術產生，包括例如CDR移植(EP 239,400；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)、鑲飾或表面再塑(EP 592,106；EP 519,596；46-48)，及鏈改組(美國專利第5,565,332號)，該等所有文獻的內容皆以引用之方式併入本文中。
本文所述之抗體可為人類化抗體。如本文所用，術語「人類化抗體」係指包含人類構架區及一或多個來自非人類(通常為小鼠或大鼠)免疫球蛋白之CDR的免疫球蛋白。提供CDR之非人類免疫球蛋白稱為「供者」且提供構架之人類免疫球蛋白稱為「受者」。恆定區無需存在，但若其存在，則其必須與人類免疫球蛋白恆定區實質上一致，亦即，至少約85至90%，較佳約95%或更高一致性。因此，可能除CDR之外，人類化免疫球蛋白之所有部分與天然人類免疫球蛋白序列之對應部分實質上一致。人類化抗體為包含人類化輕鏈及人類化重鏈免疫球蛋白之抗體。舉例而言，人類化抗體不涵蓋典型的嵌合抗體，原因為例如嵌合抗體之整個可變區為非人類的。供者抗體係指藉由「人類化」方法達成「人類化」，原因為預期所得人類化抗體與提供CDR之供者抗體結合至相同抗原。人類化抗體可為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中接受者的高變區殘基被來自諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種(供者抗體)的高變區殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基被相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含不會出現在接受者抗體或供者抗體中之殘基。此等修飾可進一步改進抗體效能。人類化抗體可包含至少一個且典型兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有高變區對應於非人類免疫球蛋白之高變區，且所有或實質上所有FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體亦可視情況包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，該免疫球蛋白恆定區可為免疫特異性結合至FcγRIIB多肽之人類免疫球蛋白的恆定區，已藉由引入一或多個胺基酸殘基取代、缺失或添加而改變(亦即，突變)。
1. 抗CTLA-4抗體組合物
作為單獨免疫治療劑或與另一治療劑(諸如抗PD-1抗體)組合之針對人類CTLA-4蛋白的抗體，包括伊匹單抗及曲美單抗，已展示可增加癌症患者存活率。然而，療效與顯著副作用關聯。非常需要開發出可達成較佳療效或較少自體免疫副作用的新穎抗CTLA-4抗體。本發明人已發現抗CTLA-4抗體可以驚人地用於誘導癌症排斥反應，同時亦減少與免疫療法有關之自體免疫副作用。
本文提供抗體及其抗原結合片段，及包含前述各者之組合物。該組合物可為醫藥組合物。該抗體可為抗CTLA-4抗體。該抗體可為單株抗體、人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。該抗體亦可具單特異性、雙特異性、三特異性或多特異性。該抗體可以可偵測方式標記，且可以包含所結合之毒素、藥物、受體、酶或受體配位體。
本文亦提供免疫特異性結合至CTLA-4且特定言之人類CTLA-4之抗體的抗原結合片段，其可在活細胞表面上以內源或轉染濃度表現。抗原結合片段可以結合至CTLA-4，且活細胞可為T細胞。
在一個特定實施例中，抗CTLA-4抗體可以有效地誘導Treg耗乏及Fc受體依賴性腫瘤排斥反應。在另一實施例中，根據細胞內酸性pH指示，抗CTLA-4抗體可以與CTLA-4解離，從而允許CTLA-4再循環回至細胞表面。
本發明進一步提供新穎的抗CTLA-4抗體設計及藉由併入本文所述抗體之功能特徵或屬性來改良現有抗CTLA-4抗體之功效或毒性分佈的方式。
抗體可包含已知抗CTLA-4抗體之胺基酸序列之突變形式，其可為伊匹單抗或曲美單抗。相較於野生型抗體序列，突變體序列可以在至少一個重鏈或輕鏈之一或多個CDR1、CDR2及CDR3區域的附近或內部包含一或多個酪胺酸經組胺酸取代。抗CTLA-4抗體可以包含含有SEQ ID NO: 1、3、5、6及8之一中所述之序列的重鏈，及含有SEQ ID NO: 2及4之一中所述之序列的輕鏈。特定言之，重鏈可包含SEQ ID NO: 6中所述之序列且輕鏈可包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。重鏈亦可包含SEQ ID NO: 14-18之一中所述的序列且輕鏈可以包含SEQ ID NO: 10-12之一中所述的序列。
2. 改良抗CTLA-4抗體組合物之功效及安全的方法
本文提供設計(突變或工程改造)或選擇展現改良之抗腫瘤活性及/或安全之抗體組合物的方法。具體言之，可以增強抗體結合在酸性pH下的敏感性，藉此，抗CTLA-4抗體在較低pH下展現減少的針對CTLA-4之結合。在一個實施例中，對CTLA-4的結合在反映核內體隔室的pH下減少。在一個較佳實施例中，對CTLA-4的結合在pH 5.5下相對於在中性pH (pH 7.0)下的結合性降低。在pH 5.5下發生的此類減少之結合可為在中性pH下所觀測之CTLA-4結合的50%或更多。本文所述之抗CTLA-4抗體活性(諸如結合)的變化，諸如減少或增加，可以相較於參考抗體或野生型抗體而言。參考抗體可為此項技術中已知的抗體，諸如伊匹單抗或曲美單抗。變化在本文所述之特定抗體組合物之兩種不同pH水準之間亦可為相對的。
可以藉由在4.5至7.0之pH範圍內測試培養盤所塗之CTLA-4與可溶性抗體之間之相互作用及選擇pH敏感性增強、以致在酸性pH下觀測到之結合性降低的抗體來鑑別出抗腫瘤功效改良及/或毒性減小的抗CTLA-4抗體。
可以根據對細胞表面CTLA-4含量之影響來鑑別出毒性減小的抗CTLA-4抗體。在一個較佳實施例中，抗體與細胞內之CTLA-4解離且允許CTLA-4再循環回至細胞表面，此可基於細胞表面CTLA-4之最少或不減少，或抗體所結合之表面CTLA-4之量減少來確定。
本文提供設計或修飾抗CTLA-4抗體以改良抗腫瘤作用及/或減小毒性的方法，此藉由增強pH敏感性來達成，使得在酸性pH下觀測到對CTLA-4的結合減小。在一個實施例中，藉由用組胺酸殘基置換抗體輕鏈及/或重鏈可變區之CDR區內部或附近的一或多個酪胺酸殘基來設計抗體。該方法可包含產生抗CTLA-4抗體曲美單抗或伊匹單抗之突變形式，其在酸性pH下對CTLA-4顯示的結合減小。
可以利用ADCC報導分析來設計或修飾抗體以改良抗腫瘤功效，其中增強的ADCC活性用作抗腫瘤活性的讀數。在一個較佳實施例中，為了提高抗腫瘤活性，CTLA-4靶向劑將選擇性地耗乏腫瘤微環境中之Treg。在一個特定實施例中，抗CTLA-4 mAb增強Fc介導之Treg耗乏活性。Treg耗乏可藉由Fc介導之效應功能發生，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞介導之吞噬(ADCP)。Fc介導之效應功能可藉由此項技術中已知之任何方法引入或增強。在一個實例中，抗體為IgG1同型，其效應功能相較於其他同型增加。Fc介導之效應功能可藉由Fc域之胺基酸序列之突變進一步增強。舉例而言，可將三種突變(S298A、E333A及K334A)引入Fc域之CH區中，以提高ADCC活性。ADCC介導之活性所利用的抗體通常需要某種修飾以便增強其ADCC活性。有多種技術可供此利用，典型地包括對抗體進行工程改造以使得抗體Fc區中之寡醣不具有任何岩藻糖單元，從而改良對FcγIIIa受體的結合。當抗體發生去岩藻糖基化時，效應為增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。舉例而言，Biowa的POTELLIGENT®技術係使用FUT8基因剔除CHO細胞株產生100%去岩藻糖基化抗體。FUT8為編碼a1,6-岩藻糖基轉移酶之唯一基因，該酶催化岩藻糖自GDP-岩藻糖轉移至複合型寡醣之a1,6-鍵聯中的GlcNAc。Probiogen已開發出一種CHO株系，其經工程改造以在MAb上產生較低含量的岩藻糖基化聚醣，但非經由FUT基因剔除。Probiogen的系統係引入一種細菌酶，該酶係將岩藻糖重新合成路徑再導向不能被細胞代謝的糖-核苷酸。作為一種替代方法，Seattle Genetics具有一種專屬的饋料系統，其在CHO(及可能其他)細胞株中所產生之MAb上產生較低含量的岩藻糖基化聚醣。Xencor已開發出一種XmAb Fc域技術，其為了改良免疫系統排除腫瘤及其他病理學細胞而設計。此Fc域具有兩個胺基酸變化，從而對FcγRIIIa產生大40倍的親和力。其亦增加對FcγRIIa之親和力，從而潛在地募集其他效應細胞，諸如藉由吞噬及消化外來物質而起免疫作用的巨噬細胞。
3. 治療方法
本文所述之抗體組合物或基於本文所述方法設計的抗體可以用於上調免疫反應。免疫系統之上調在癌症及慢性感染之治療中尤其合乎需要，且因此本文所述之抗體組合物在此類病症之治療中具有效用。如本文所用，術語「癌症」係指細胞之異常不可控生長而引起之贅生物或腫瘤。「癌症」明確包括白血病及淋巴瘤。術語「癌症」亦指涉及具有轉移至遠端位點之潛力之細胞的疾病。
本文所述的抗體組合物可以用於製造藥劑。組合物亦可投與需要治療之個體。個體可為人類。個體可能需要治療本文所述之疾病或病狀。
因此，本文所述的方法及組合物亦可適用於治療或預防多種癌症或其他異常增殖性疾病中之一或多者，包括(但不限於)以下：癌瘤，包括膀胱、乳房、結腸、腎臟、肝臟、肺、卵巢、胰臟、胃、子宮頸、甲狀腺及皮膚之癌瘤；包括鱗狀細胞癌；淋巴譜系之造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、伯克特淋巴瘤(Berketts lymphoma)；骨髓譜系之造血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓細胞性白血病；間葉細胞來源之腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑色素瘤、精細胞癌、畸胎上皮癌、神經母細胞瘤及神經膠質瘤；中樞及周邊神經系統之腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及許旺細胞瘤；間葉細胞來源之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精細胞癌、甲狀腺濾泡性癌症及畸胎癌。亦預期，由細胞凋亡中之畸變引起之癌症應亦藉由本發明之方法及組合物治療。此類癌症可包括(但不限於)濾泡淋巴瘤、具有p53突變之癌瘤、乳房、前列腺及卵巢之激素依賴性腫瘤，及諸如家族性腺瘤性息肉病之癌前病變，及骨髓發育不良症候群。在特定實施例中，藉由本發明之方法及組合物來治療或防治卵巢、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、胰臟或子宮中之惡性疾病或增殖異常變化(諸如化生及發育不良)或過度增殖病症。在其他特定實施例中，藉由本發明之方法及組合物來治療或防治肉瘤、黑色素瘤或白血病。
抗體組合物及其抗原結合片段可聯合另一抗腫瘤療法使用，該抗腫瘤療法可選自(但不限於)當前標準及實驗化學療法、激素療法、生物學療法、免疫療法、輻射療法及手術。在一些實施例中，本文所述的組合物可與治療或預防有效量之一或多種藥劑、治療性抗體或熟習此項技術者已知之其他藥劑組合投與以便治療或預防癌症、自體免疫疾病、感染性疾病或中毒。此類藥劑包括例如以上論述之生物學反應調節劑、細胞毒素、抗代謝物、烷基化劑、抗生素、抗有絲分裂劑或免疫治療劑中之任一者。
抗體組合物及其抗原結合片段可聯合另一抗腫瘤免疫療法使用。在此類實施例中，組合物與破壞或增強替代免疫調節路徑(諸如TIM3、TIM4、OX40、CD40、GITR、4-1-BB、B7-H1、PD-1、B7-H3、B7-H4、LIGHT、BTLA、ICOS、CD27或LAG3)或調節效應分子(諸如細胞介素(例如IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、GF-β、IFNg、Flt3、BLys)及趨化因子(例如CCL21))之活性的分子組合投與，以便增強免疫調節作用。特定實施例包括雙特異性抗體，其包含本文所述之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段與以下之組合：抗PD-1 (派姆單抗(Keytruda)或尼沃單抗(Opdivo))、抗B7-H1(阿特珠單抗(atezolizumab)(Tecentriq)或德瓦魯單抗(Imfinzi)、抗B7-H3、抗B7-H4、抗LIGHT、抗LAG3、抗TIM3、抗TIM4抗CD40、抗OX40、抗GITR、抗BTLA、抗CD27、抗ICOS或抗4-1BB。在又另一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段與活化免疫反應之不同階段或方面以便達成較廣泛免疫反應的分子(諸如IDO抑制劑)組合投與。在更佳的實施例中，在不加重自體免疫副作用之情況下，將抗體組合物及其抗原結合片段與抗PD-1或抗4-1BB抗體組合。
本文所述的組合物可以包含包含抗CTLA-4抗體的雙特異性抗體，該抗CTLA-4抗體與結合另一免疫刺激分子的抗體橋接。特定實施例包括雙特異性抗體，其包含本文所述之抗CTLA-4抗體組合物及抗PD-1、抗B7-H1、抗B7-H3、抗B7-H4、抗LIGHT、抗LAG3、抗TIM3、抗TIM4抗CD40、抗OX40、抗GITR、抗BTLA、抗CD27、抗ICOS或抗4-1BB。此類抗體可用作藥劑，且可用於治療癌症。
4. 生產
本文所述之抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段可以使用真核表現系統製備。表現系統可需要載體在哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中表現。抗體亦可由穩定細胞株產生，該穩定細胞株利用載體或已整合於細胞基因組中之載體之一部分表現抗體。
本文所述之抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段可使用例如層析法(諸如親和層析法、離子交換層析法、疏水相互作用層析法、DEAE離子交換法、凝膠過濾法及羥磷灰石層析法)純化。在一些實施例中，融合蛋白可經工程改造以含有另一結構域，該另一結構域含有允許多肽捕捉於親和基質上之胺基酸序列。舉例而言，包含免疫球蛋白域之Fc區的本文所述抗體可使用蛋白質A或蛋白質G管柱自細胞培養上清液或細胞質提取物中分離。另外，可使用標籤(諸如c-myc、血球凝集素、聚組胺酸或Flag™ (Kodak))來幫助抗體純化。此類標籤可插入多肽序列內之任何位置，包括在羧基或胺基末端插入。可適用之其他融合物包括有助於偵測多肽之酶，諸如鹼性磷酸酶。免疫親和層析亦可用於純化多肽。
5. 醫藥組合物
本發明進一步關於一種醫藥組合物，其包含治療有效量之任一種上述抗CTLA-4抗體組合物或其抗原結合片段及生理學上可接受之載劑或賦形劑。較佳地，本發明之組合物包含預防或治療有效量之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
在一個特定實施例中，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或州政府之管制機構批准或在美國藥典或其他公認之藥典中列出適用於動物且更特定言之適用於人類。術語「載劑」係指稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全及不完全))、賦形劑，或治療劑藉以投與之媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。當靜脈內投與醫藥組合物時，水為較佳載劑。亦可使用生理鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。必要時，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑，諸如泊洛沙姆(Poloxamer)或聚山梨醇酯，或pH緩衝劑。此等組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、藥丸、膠囊、散劑、持續釋放調配物及其類似物之形式。
一般而言，本發明組合物之成分可分開供應或混合在一起以單位劑型提供，例如以乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式於指示活性劑之量之氣密密封式容器(諸如安瓿或藥囊)中供應。當藉由輸注投與組合物時，可用含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸液瓶分配組合物。當藉由注射投與組合物時，可提供具有注射用無菌水或生理食鹽水之安瓿，以使得該等成分可在投與前混合。
本發明之組合物可調配為中性或鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括(但不限於)彼等使用陰離子形成者，諸如彼等衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等者；及彼等使用陽離子形成者，諸如彼等衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等等者。
本文所述之抗CTLA-4抗體組合物或其抗原結合片段亦可調配成凍乾形式以便長期儲存，尤其在室溫下長期儲存。凍乾調配物特別適用於皮下投與。
6. 投藥方法
投與本文所述組合物的方法包括(但不限於)非經腸投藥(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外及黏膜(例如鼻內及經口途徑)。在一個特定實施例中，肌內、靜脈內或皮下投與本發明之抗體。該等組合物可藉由任何便利途徑投與，例如藉由輸注或快速注射、藉由上皮或黏膜皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸黏膜及腸黏膜等)吸收且可與其他生物學活性劑一起投與。可以全身或局部投藥。
實例
實例1. 產生在低pH下失去結合活性的曲美單抗變異體.
由於CTLA-4之遺傳性失活引起嚴重的自體發炎淋巴增生疾病，因此本發明人意識到拮抗或引起CTLA-4降解的抗體將容易產生irAE。鑒於許多抗原-抗體複合物可行進至溶酶體且降解之事實，因此本發明人意識到在複合物到達溶酶體之前失去與CTLA-4結合之抗體將會解離且允許抗原及/或抗體分子再循環。由於溶酶體隔室可以具有＜5.0之pH，因此經由VL及VH CDR區之定點誘變法來產生在低pH下失去與CTLA-4分子結合的曲美單抗及伊匹單抗之變異體。由於組胺酸具有pK為5.97之側鏈，因此併入組胺酸殘基之抗體在約pH 5.5至6.0下可能具有電荷變化。為了具有最大影響，在曲美單抗與伊匹單抗二者之CDR區中進行突變。
產生包含WT或突變型曲美單抗可變區之輕鏈及重鏈的八種抗體。由於Treg耗乏活性對於腫瘤排斥反應具重要作用，因此曲美單抗中之人類IgG2恆定區用IgG1之恆定區置換，且產物藉此稱為TremeIgG1 (AB139)且突變型抗體稱為TremeIgG1M (AB154-159)。抗體之組合物及親和力列於表1中。
表1. 曲美單抗變異體：組成及親和力.
使用類似方法產生伊匹單抗親本重鏈(SEQ ID NO: 13)及輕鏈(SEQ ID NO: 9)之突變體。由此產生具有SEQ ID NO: 14-18的重鏈突變體及具有SEQ ID NO: 9-12的輕鏈突變體。SEQ ID NO. 1-18中所列的序列為實例，且可以基於相同原理，在抗體之CDR區中或抗原結合位點附近產生其他突變。
為了驗證該方法，評估曲美單抗突變抗體之活性。為了確定將組胺酸引入CDR區是否影響抗體對pH的敏感性，在pH範圍內量測抗體對其抗原(經聚組胺酸標記之CTLA-4)的結合。原始資料呈現於圖1A中，而標準化結合展示於圖1B中。作為對照，使用已知以pH依賴性方式結合CTLA-4且在低/酸性pH值下之結合性降低的HL12作為對照物。此等資料證明儘管TremeIgG1在所測試的所有pH下結合至CTLA-4，但所有突變體在酸性pH下展示不同程度之pH敏感性。其中，Ab154、Ab158及Ab159之敏感性小於HL12，而Ab156及Ab157展現較高pH敏感性。重要的是，在晚期核內體中所發現之pH (pH 5.5)下，HL12、Ab156及Ab157展示的結合為在中性pH (pH 7.0)下展示之結合的50%或更少，而Ab158及Ab159展現之結合仍為中性pH下之結合的75%或更多。此外，鑒於與Ab158比較，Ab159雖展示稍微更高的pH敏感性，但親和力更高，因此pH依賴性並非歸因於中性pH下之抗體親和力低。同樣，Ab157展現較高親和力及較高pH敏感性，Ab155不結合至CTLA-4且自此分析中排除。
由於抗CTLA-4抗體在生理條件下、在中性pH下結合至CTLA-4，且由於抗體-抗原複合物輸送通過逐漸酸性的環境，因此在不同pH下量測pH敏感性及解離。如圖2中所示，根據在酸性及中性pH下之結合及洗滌所鑑別的pH敏感性抗體在具有類似等級的酸性pH下亦與CTLA-4解離。
為了使抗體與抗原在核內體之酸性pH內解離，在TremeIgG1之CDR中，用組胺酸置換酪胺酸(Y)。組胺酸在CDR3中之五個連續Y殘基及CDR2中之兩個連續Y殘基之不同編號處引入。CDR3中具有兩個或三個連續Y至H突變之變異體(Ab157及Ab156)對pH展現的敏感性高於CDR2中的單個Y至H突變(Ab 158)或兩個Y至H突變(Ab159)。Ab156及157在早期核內體pH 6下開始釋放CTLA-4，且在晚期核內體中所發現的pH (pH 5.5)下展示50%或更小的結合。然而Ab158及Ab159在pH 5.5仍展現75%或更多的結合。
亦在重鏈可變CDR1中之Ser31、Tyr32及Trp36引入His突變(Ab 154)，或在輕鏈CDR1中之Tyr32及Asp34引入組合突變(Ab155)。儘管已報導類似突變對於其他抗體之pH依賴性抗原結合而言必不可少，但其尚未引起TremeIgG1出現所需的pH敏感性：Ab154在pH 5.5下的CTLA-4結合僅展現輕微損失，而Ab 155在中性pH下對CTLA-4展現不可量測的結合。資料表明，在富含酪胺酸之CDR區中用組胺酸置換多個酪胺酸代表一種獲得pH敏感性抗體、同時保持其在中性pH值下結合至抗原的簡單方式。
實例2. 鑑別不減少細胞表面CTLA-4含量之抗體.
為了確定抗CTLA-4抗體對總CTLA-4含量的影響，將曲美單抗抗體與經人類CTLA-4 cDNA轉染之CHO細胞一起在37℃下培育4小時。藉由對總細胞溶解物進行西方墨點法來測定細胞中之CTLA-4總量。如圖3中所示，CTLA-4之顯著減少係由WT TremeIgG1及其變異體Ab154誘導。其他突變型抗體誘導的減少則小得多。
為了確定抗體對pH的敏感性是否引起其與活細胞中之CTLA-4解離，首先將抗體與在4℃下穩定表現人類CTLA-4之293T細胞的兩種複本一起培育。30分鐘後，將等分試樣轉換至37℃維持1小時。接著洗掉未結合之抗體。用1% Triton X 100溶解之後，使用蛋白質G珠粒吸引抗CTLA-4抗體並且藉由西方墨點法偵測。如圖4A中所示，抗體Ab139、Ab154、Ab156-Ab159在4℃下所結合之CTLA-4蛋白的量類似。在37℃下培育之後，與Ab139 (TremeIgG1)或pH敏感性較小之其他變異體相比，與Ab156及Ab157結合的CTLA-4則少得多(圖4B)。相應地，細胞溶解物中之總CTLA-4量在經Mab156及157處理之細胞中較高。此等資料表明Ab156及Ab157當其在37℃下到達細胞內時與CTLA-4解離。
為了直接評估TremeIgG1或其變異體處理之後的細胞表面CTLA-4含量，將穩定表現CTLA-4的CHO細胞與TremeIgG1 (Ab139)或突變抗體Ab154及Ab156-Ab159在4℃ (不下調)或37℃下培育。使用抗人類CTLA-4試劑來量測細胞表面抗體所結合之CTLA-4的量。HL12及伊匹單抗作為對照包括在內。如圖5中所示，與TremeIgG1一起在37℃下預培育引起細胞表面CTLA-4嚴重減少。Ab154及伊匹單抗誘導的減少類似。值得注意的是，非常類似於無毒HL12，Ab156及Ab157不減少細胞表面CTLA-4。Ab158及Ab159誘導適度的減少。抗體引起的細胞表面CTLA-4減少與其對CTLA-4分子之pH依賴性結合強烈相關(圖1)。此等資料與以下假設一致：pH敏感性為抗體介導細胞表面抗CTLA-4分子減少的良好指標。
實例3. pH敏感性抗CTLA-4抗體之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及抗腫瘤活性增強.
本發明人及其他人最近已證明，抗CTLA-4抗體之ADCC活性對於活體內賦予Treg耗乏及腫瘤排斥反應為必需且足夠的(16-18，20)。因此，使用針對ADCC活性的活體外報導分析評估抗CTLA-4抗體之潛在抗腫瘤活性受到關注。如圖6中所示，儘管TremeIgG1 (Ab139)展現強ADCC活性，但具有最高pH敏感性之兩種抗體展示甚至更高的ADCC活性，尤其在較高抗體劑量下。
確認ADCC報導分析是否反映腫瘤微環境中之選擇性Treg耗乏。將TremeIgG1及Ab157注射至第14天接受MC38腫瘤細胞且平均腫瘤直徑為7 mm的小鼠中。十六小時後，收集腫瘤且藉由流式細胞術測定CD4 T細胞中之Treg %。如圖7中所示，雖然TremeIgG1在此早期時間點的效率基本上較低，但Ab157引起Treg顯著減少。
為了測試pH敏感性抗體是否有效引起腫瘤排斥反應，將MC38腫瘤細胞皮下注射至CTLA-4h / h 小鼠。七天後，當腫瘤直徑尺寸達到約5 mm時，小鼠用低劑量抗CTLA-4mA b(包括TremeIgG1及其pH敏感性變異體Ab156及Ab157)處理。觀測腫瘤生長或復發為時6.5週(圖8A)。如圖8B-E中所示，三次注射之後，TremeIgG1引起80%小鼠出現完全的腫瘤排斥反應。值得注意的是，Ab156及Ab157達成100%排斥反應。此等資料表明pH值敏感性增強可改良抗CTLA-4抗體之抗腫瘤作用，此可能藉由增強ADCC活性達成。
實例4. pH敏感性TremeIgG1變異體的毒性小於親本TremeIgG1抗體.
為了測試pH敏感性對TremeIgG1變異型抗體之毒性的影響，對出生之後第10天開始接受對照IgG1Fc、抗PD-1 + 對照IgG1Fc、抗PD-1 + TremeIgG1、抗PD-1 + Ab156，或Ab157、Ab158、Ab159 (劑量為100 µg/小鼠/注射 x4，於第10、13、17及20天)的小鼠進行比較。觀測小鼠存活率。如圖9中所示，雖然接受對照IgG1Fc或對照IgG1Fc + 抗PD-1的小鼠沒有一隻在整個觀測期死亡，但接受TremeIgG1之小鼠除了一隻之外皆死亡。相比之下，接受Ab157之小鼠除了一隻之外在整個期間皆存活。比較Ab157與TremeIgG1時(P=0.01)，觀測到存活率顯著改良。使用Ab157時，亦觀測到顯著改良(P=0.03)。雖然Ab158及Ab159展示的存活率亦稍微優於TremeIgG1，但差異未達到統計顯著水準。然而，pH敏感性與安全性之間似乎存在強相關性。將涉及15隻小鼠的兩次實驗之資料組合時，Ab157的安全性改善顯然優於TremeIgG1 (圖10)。此等資料證明pH敏感性可為抗CTLA-4抗體安全性的良好替代標記物。
綜合而言，已證明在酸性pH下保持與CTLA-4結合之抗體係藉由靶向所結合之CTLA-4以供溶酶體降解來引起細胞表面CTLA-4含量減少。因此，此等抗體為功能拮抗劑且不活化CTLA-4功能。此類抗體當與抗PD-1抗體組合使用時，在活體內展現高毒性。相比之下，在較低pH值下喪失與CTLA-4結合之彼等抗體未能藉由允許CTLA-4再循環至細胞表面來減少細胞表面CTLA-4，且因此不能充當促效劑。值得注意的是，儘管其親和力較低，但此等抗體在ADCC活性及腫瘤排斥反應方面看起來更強。此等資料證明，增強抗CTLA-4抗體之低pH敏感性為增強腫瘤療效、同時減弱其毒性的新穎方法。
圖1A-B. TremelgGl及其變異體對pH的敏感性。將His-hCTLA-4 (0.5 μg/ml)塗佈於ELISA盤中且不同抗CTLA-4 mAb於4.5至7.0之pH範圍內的緩衝液中以1 pg/ml添加。指定的pH代表結合及洗滌條件。結合至CTLA-4之抗體係使用經辣根過氧化酶標記之抗人類IgG抗體量測。
圖2. TremelgGl及其變異體對pH發生敏感性的結合解離。如同圖1，但在其中一群組中，使抗體在pH 7.0下結合至培養盤所結合之CTLA-4，且接著用指定pH之緩衝液洗滌該等培養盤。
圖3. 抗CTLA-4抗體對總CTLA-4含量的影響。經人類CTLA-4 cDNA轉染之CHO細胞與抗CTLA-4抗體一起在37℃下培育4小時且藉由對總細胞溶解物進行西方墨點法來測定細胞中之CTLA-4的總量。TremelgG1及mAbl54誘導CTLA-4下調，而其他抗體變異體誘導的下調則少得多。
圖4. 內吞之後，抗體與活細胞中之CTLA-4發生pH敏感性解離。表現hCTLA-4之293T穩定細胞株在4℃下用抗CTLA-4 mAb標記30分鐘且洗掉未結合之抗體之後，將細胞轉移至37℃維持1小時。抗體結合之表面CTLA-4藉由蛋白質G珠粒捕捉且藉由西方墨點法使用抗CTLA-4抗體(H-126)：sc-9094 (Santa Cruz biotechnology)偵測。圖4A展示抗體在4℃下之結合且圖4B展示在37℃下培育之後剩餘抗體的含量。工程化抗體，具體言之，AB156及AB157，在37℃下、在抗體誘導的內化期間與CTLA-4解離，相比之下，mAb 139 (TremelgGl)或其他變異體對pH的敏感性更小。
圖5. 抗CTLA-4抗體對細胞表面CTLA-4的影響。表現人類CTLA-4的CHO細胞在37℃或4℃下用TremelgG1及其突變體處理2小時。洗掉未結合之抗體之後，表面CTLA-4在4℃下藉由抗hIgG (H+L)-alex488偵測半小時且藉由流式細胞術分析。所呈現之資料為在37℃下培育之樣品之MLI相對於在4℃下之MLI的比率，且已相對於HL12之比率標準化，其平均值定義為1.0。所示資料來自三次獨立實驗，每次實驗包括每組兩個樣品。
圖6. TremelgG1及其pH敏感性變異體之ADCC活性。所示資料為自表現FcγRIIIA之報導細胞發射的發光單位。表現人類CTLA-4分子之293T細胞用作靶細胞。
圖7. Abl57對腫瘤微環境中之Treg耗乏展現改良的活性。腫瘤接種之後的第14天，具有MC38之Ctla4h / h 小鼠(n=9)腹膜內用TremelgGl (AB139)或其pH敏感性變異型Abl57 (30 ug/小鼠)處理。在抗體處理之後的第16小時，腫瘤微環境中Treg細胞之選擇性耗乏係利用CD4 T細胞中之Treg細胞%測定。*P＜0.05。
圖8A-E. TremelgGl及其pH敏感性變異體之免疫療效。圖8A. 實驗設計圖。圖8B-E. 接受IgG-Lc (圖8B)、TremelgGl (AB139；圖8C)、AB156 (圖8D)或AB157 (圖8E)之小鼠中的腫瘤生長。
圖9. 當與抗PD-1以組合療法使用時，pH敏感性與抗人類CTLA-4抗體之較佳安全性相關。CTLA-4h / h 小鼠在出生之後的第10、13、17及20天接受抗PD-1與以下抗CTLA-4抗體之一的組合療法：TremeIgG1 (AB139)、AB156、AB157、AB158、AB159，劑量為100 pg/小鼠/注射。安全性係以隨時間變化之存活率表示。N=6。AB157相對於TremeIgG1，P=0.01；AB156相對於TremeIgG1，P=0.03。
圖10. 得自兩次獨立實驗之存活率資料分析表明，pH敏感性變異型抗CTLA-4抗體AB157之安全性優於野生型抗體TremeIgG1。出生之後的第10、13、17及20天，以100 pg/小鼠/注射的劑量投與TremeIgG1 (AB139)及AB157。安全性以隨時間變化之存活率表示。資料為兩次獨立實驗之概述。在兩個處理組之間觀測到統計顯著差異。對於AB157或hIgGFc對照 + 抗PD-1而言，N=15；對於TremeIgG1 + 抗PD-1而言，N=16。P＜0.0001。

Claims (10)

  1. 一種產生抗CTLA-4抗體的方法，該抗CTLA-4抗體在酸性pH下對CTLA-4的結合性降低，該方法包含在該抗體之輕鏈及重鏈可變區中之至少一者之一或多個CDR1-3區內部或附近用組胺酸置換酪胺酸。
  2. 一種抗CTLA-4抗體變異體，其在酸性pH下對CTLA-4之結合性降低，其中該抗CTLA-4抗體包含曲美單抗(Tremelimumab)或伊匹單抗(Ipilimumab)之胺基酸序列，其中輕鏈及重鏈可變區中之至少一者中的一或多個酪胺酸殘基經組胺酸置換。
  3. 一種抗CTLA-4抗體，其包含含有SEQ ID NO: 1、3、5、6或8中所述之序列的重鏈及含有SEQ ID NO: 2或4中所述之序列的輕鏈。
  4. 如請求項3之抗CTLA-4抗體，其包含含有SEQ ID NO: 6中所述之序列的重鏈及含有SEQ ID NO: 2中所述之序列的輕鏈。
  5. 一種抗CTLA-4抗體，其包含含有SEQ ID NO: 14-18之一中所述之序列的重鏈，及含有SEQ ID NO: 10-12之一中所述之序列的輕鏈。
  6. 一種對有需要之個體進行癌症免疫療法的方法，其包含將如前述請求項中任一項之抗CTLA-4抗體單獨或與一或多種其他療法組合投與該個體。
  7. 如請求項6之方法，其中該其他療法為結合至PD-1或PD-L1之抗體。
  8. 如請求項7之方法，其中該抗PD-1抗體為尼沃單抗(Nivolumab)或派姆單抗(Pembrolizmab)。
  9. 如請求項2至5中任一項之抗CTLA-4抗體，其用於治療個體之癌症。
  10. 一種如請求項2至5中任一項之抗CTLA-4抗體的用途，其用於製造供治療個體之癌症用的藥劑。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
NZ775959A (en) * 2018-10-31 2022-08-26 Bioatla Inc Anti-ctla4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
EP3955960A1 (en) * 2019-04-18 2022-02-23 Bristol-Myers Squibb Company Ipilimumab variants with enhanced specificity for binding at low ph
WO2024056049A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 同润生物医药(上海)有限公司 具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL149701A0 (en) * 2001-05-23 2002-11-10 Pfizer Prod Inc Use of anti-ctla-4 antibodies
TWI667346B (zh) * 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
RS58528B1 (sr) 2012-12-03 2019-04-30 Bristol Myers Squibb Co Poboljšanje anti-kancerske aktivnosti imunomodulatornih fc fuzionih proteina
CN105636986B (zh) * 2013-10-18 2020-05-12 瑞泽恩制药公司 包含vegf拮抗剂和抗-ctla-4抗体的组合的方法和组合物
EP3288982A1 (en) * 2015-04-28 2018-03-07 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of pd-l1-negative melanoma using an anti-pd-1 antibody and an anti-ctla-4 antibody
IL296354B1 (en) * 2015-12-15 2024-03-01 Oncoc4 Inc Chimeric and humanized monoclonal antibodies against CTLA-4 and their uses
EP3400023A1 (en) * 2016-01-10 2018-11-14 ModernaTX, Inc. Therapeutic mrnas encoding anti ctla-4 antibodies

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