TW201922626A - 在生物膜控制中表現協同作用的組合物 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種控制及移除與水工業系統接觸之表面上的生物膜的方法，其包含以下步驟：向所處理之該水系統中添加有效量的生物膜干擾劑且添加殺生物劑，以自與該水系統接觸之表面減少及移除形成生物膜之微生物。本發明亦揭示一種聚乙亞胺及氧化殺生物劑之協同組合物。

Description

在生物膜控制中表現協同作用的組合物

本發明係關於控制水性環境中之微生物。

工業、商業及城市系統及結構中之微生物生物膜對彼等系統及結構之運行及操作具有相當大的負面影響，包括降低熱傳遞、堵塞管道及管線、充當病原體之貯主、引起機械及結構故障、促進腐蝕、污染產品、飲用水及休閒用水且使其降級，及降低美感價值。

生物膜在本文檔之上下文中定義為在表面上沈澱、附著且然後生長或存在之微生物。其可由單一物種構成或其為多特異性的，並且可由細菌、病毒、真菌、藻類及微型或巨型真核生物諸如阿米巴原蟲、矽藻、線蟲及蠕蟲組成。生物可浸沒存在於液體、飛濺區、潮濕環境及甚至係乾燥環境中，諸如在雕像及建築物表面上所發現之彼等。生物膜在結構上由納入分子上相異的聚合基質中之微生物細胞構成，該聚合基質由多糖、蛋白質、DNA及眾多小分子構成。在自然環境中，該等生物膜亦可夾帶污物、土壤、植物性物質及其他環境組分。此物質常稱作黏液。生物膜之解剖結構受環境組成及由基質在膜上移動所供應之剪切力的廣泛影響。

微生物生活在固定環境中而非在主體流體中自由漂浮之結果係廣泛的，其中微生物區分在幾個基因至其基因組之近似50%範圍內之其基因組的表達。此等改變對生物膜細胞對化學殺生物劑、抗生素及其他環境應激源之易感性具有巨大影響。除了廣泛的生理變化之外，生物膜細胞存在於可干擾殺生物劑或抗生素進入細胞之聚合基質中，進一步降低其易感性。已經記錄超過一千倍之殺生物劑及抗生素易感性之改變。

控制生物膜之最常見的方法已為施用包括氧化、反應性及膜活性殺生物劑之化學殺生物劑。不考慮殺生物劑之機制類型，出於先前段落中所論述之原因，生物膜已證實對該等殺生物劑抑制作用及殺滅作用更為頑固，導致需要應用高濃度殺生物劑以達到所需效應。

在廣泛多種的工業、商業及城市領域中，氧化殺生物劑常用作生物膜控制劑，因為其便宜並且有效對抗浮游微生物。其可有效控制微生物，但高施用率、高處理成本及氧化劑對建築材料之腐蝕效應，以及在一些情況下之調控限制，常常使得難以以對長期生物膜控制有效之速率施用氧化殺生物劑。

儘管氧化殺生物劑可殺死相當大部分的生物膜群體，但其不能有效地自表面移除生物膜。這並非令人滿意的，因為生物膜之負面影響中之一些源自其物理存在於表面上。舉例而言，生物膜係優異的絕緣體並且大大妨礙冷卻塔及冷凍器中之熱傳遞，並且儘管經處理之生物膜可大致上死亡，但其將仍然使表面絕緣。另外，大量的死亡細胞為經處理之群體之存活片段提供即用的養分源，並且生物膜傾向於快速重新生長至其原始密度。

已將呈生物膜干擾物質形式之佐劑處理與殺生物劑一起投與，以提高殺死微生物及將其自表面移除兩者之功效。此等生物膜干擾劑最常為陰離子、陽離子或非離子界面活性劑，其假定機制為與生物膜結構相互作用，這允許殺生物劑更高效地穿透生物膜並藉由其表面活性性質移除生物膜兩者。儘管市場中長久存在此等生物膜干擾劑，但由於使用氧化及非氧化殺生物劑兩者之處理方案之功效，其可能往往未被充分利用。然而，市場、成本及環境問題已引起對減少殺生物劑之使用而不降低微生物控制方案之功效的需要，並且在許多市場特別係工業冷卻水中，對分散劑之關注與日俱增。正如吾人將期望的那樣，此等生物膜干擾劑之相對能力在不良至良好範圍內，並且其功效可受主體基質之組成影響。吾人亦將期望氧化殺生物劑及生物膜干擾劑之一些組合將比基於其化學相互作用及對生物膜結構的影響之其他試劑更有效。

本申請案主張2017年10月18日申請之臨時申請案第62/573,928號之權益，該臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。

以下實施方式在本質上僅為例示性的且並不意欲限制本發明或本申請案及本發明之用途。此外，不意欲受任何呈現於前述先前技術或以下實施方式中之理論的束縛。

已出人意料地發現殺生物劑較佳為氧化殺生物劑及生物膜干擾劑之一些組合表現出就殺死生物膜及將其自表面移除兩者而言的生物膜之協同控制。殺生物劑及生物膜干擾劑之組合的總計效應遠大於該等兩種化學品的純粹累加效應，使得一種化學品或其兩者之量可大大降低且仍然實現所需的生物膜控制指標。此協同相互作用尚未在所有化學品組合中發現，亦未在以所有比率之該等兩種化學品中發現。

本發明揭示一種控制及移除與水工業系統接觸之表面上的生物膜的方法，其包含以下步驟：向所處理之水系統中添加有效量的生物膜干擾劑並添加殺生物劑，以自與水系統接觸之表面減少及移除形成微生物之生物膜。

本發明亦提供一種包含生物膜干擾劑及殺生物劑之協同組合物。

可用於本發明之氧化殺生物劑包括衍生自氫氧化銨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、碳酸氫銨、溴化銨、碳酸銨、胺甲酸銨、胺磺酸銨、硝酸銨、草酸銨、過硫酸銨、磷酸銨、硫化銨、脲及脲衍生物及其他能夠供給銨離子之含氮化合物的次氯酸鈉、次氯酸鈣及其他次氯酸鹽、次氯酸、次溴酸、單鹵胺殺生物劑，該等含氮化合物與氯或溴部分諸如氯化氧化劑或溴化氧化劑反應，較佳為次氯酸或次氯酸鹽，較佳為次氯酸鹽；及銨衍生之氯胺化合物諸如單氯胺及二氯胺之摻合物該等鹵胺殺生物劑係此項技術中已知的，參見例如US 7285224、US 7052614、US 7837883、US 7820060。其他氧化殺生物劑包括二溴氮基丙醯胺、溴氯二甲基乙內醯脲及其他鹵化乙內醯脲，及三氯異三聚氰酸。對抗生物膜所使用並且預期與分散劑一起使用之非氧化殺生物劑包括異噻唑酮殺生物劑、戊二醛、甲醛及釋放甲醛之化合物、肆羥基氯化鏻，以及其他非陽離子殺生物劑。

本發明提供一種控制與包括但不限於水系統接觸之表面上的微生物生物膜之方法，其包含向該系統中添加氧化殺生物劑及由聚乙亞胺界面活性劑構成之生物膜干擾劑或分散劑之協同組合物。聚乙亞胺係具有允許其緊緊地吸附於帶負電基板上的高電荷密度之聚合胺。

電荷密度可為8至20毫當量/公克物質，較佳為10至20毫當量/公克物質且最佳為14至20毫當量/公克物質。其為通常藉由乙亞胺之聚合而製備的水溶性聚合物。其可含有一級、二級及三級胺。示例聚乙亞胺可以Lupasol™ (BASF, Florham Park, NJ)商標名獲得。

本發明中所使用之生物膜干擾劑係聚乙亞胺(「PEI」)，一種低分子量乙亞胺共聚物。聚乙亞胺之平均分子量小於750,000道爾頓，較佳小於100,000且大於500道爾頓。平均分子量通常為750至25,000，較佳為800至4000，更佳為約1000至約3000。聚乙亞胺界面活性劑之實例包括但不限於BASF Lupasols (BASF Corporation, Florham Park, N. J.)。分散劑包含約20至約98重量%之聚乙亞胺，其中分散劑之剩餘部分包含水，其可以約2至約80重量%之量存在。額外組分可以包括溶劑，諸如低分子量醇，例如，乙醇、甲醇及丁醇。

聚乙亞胺之一個實施例由約40%至約50%水及約40%至約50%具有氮丙啶之PEI聚合物構成。本發明中所提供之濃度僅為聚乙亞胺聚合物之濃度，市售PEI產品之其他組分或溶劑均不被視為劑量範圍的一部分。例如，50公克之50% PEI產品為25公克PEI劑量。

本發明亦提供一種包含生物膜干擾劑及殺生物劑之協同組合物，其中生物膜干擾劑係聚乙亞胺且殺生物劑係較佳選自單鹵胺、二鹵胺及其組合之鹵胺。鹵胺可為氨胺。較佳地，生物膜干擾劑與氧化殺生物劑之重量比為1份數殺生物劑對至少1份數生物膜干擾劑。殺生物劑與生物膜干擾劑之重量比可為1:1至1:80，或1:1至1:40，或1:1至1:20，更佳為1:1至1:8。

組合物中兩種化學品之相互作用可以三種可能方式進行。在第一方式中，兩種化學品以負面方式相互作用而減少組合物之組合效應，使得所獲得之結果小於吾人對其組合活性所期望之結果。因此，若一種試劑本身在所量測變數中達至50之值並且第二試劑本身達至50之值，則在負相互作用中該等兩種試劑之組合降低值小於100。其中其可相互作用之另一方式係加成，其中最終結果係該等兩個值之單一累加。因此，將各能夠達至50之值的兩種試劑組合，其總組合值將為100。在第三方式中，其為在微生物控制之情況下最理想的，組合各能夠達至50之值的兩種試劑之結果將為大於100的某些值。

研究人員已研發出用於量測組合物中組分之間的相互作用之性質及程度的調配物。在微生物控制領域中，最常用的等式係Kull等人(Kull等人, 1961, J. Appl. Microbiology 9:538)中所描述的等式，該文獻以引用之方式併入本文檔中。在專利中此等式之用途的最新實例係US #9555018, Synergistic combinations of organic acids useful for controlling microorganisms in industrial process，及US #8778646, method of treatment of microorganisms during propagation, conditioning, and fermentation using hops acid extracts and organic acid。最初的Kull等式使用抗菌劑之最小抑制濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)作為確定指標。MIC值係導致抑制微生物培養物之抗微生物劑之最低量測濃度。抑制可藉由檢測微生物培養物之濁度可視地確定，該濁度可藉由基於培養物或顯微方法之活細胞計數、或藉由一些代謝活性量測及其他可能的手段來確定。該等式呈現於下文中：協同指數= (指標a /指標A ) + (指標b /指標B )，其中指標A為試劑A本身之指標，指標a為試劑A與試劑B組合之指標，指標B為試劑B本身之指標，並且指標b為試劑B與試劑A組合之指標。

在此研究中，單獨的試劑及呈組合形式的試劑之功效藉由量測處理後剩餘的模型生物膜中活細胞數來確定。最小生物膜根除值(MBEC)定義為與未經處理之對照相比，活細胞數減少95%。相對無毒之分散劑不能達到利用物理上可能的濃度來殺死之位準，因此對於彼等試劑，MBEC被視為最高測試值。由於此值被用作協同指數等式中之除數，此最高測試值實際上為MBEC之低估值，並且因此協同指數值亦被低估。

本發明主要意欲用於工業製程用水，特別係冷卻塔、蒸發器、冷凍器及冷凝器，但將於生物膜在水基質中形成而損害製程之任何工業製程中具有效用。預期本發明亦可用於地熱流體處理、油及天然氣萃取及使用就地清潔系統之過程中。

待使用的生物膜干擾劑較佳為PEI之濃度在所處理的水系統中之水的1至200毫克/公升(ppm)、或較佳為1至100毫克/公升水(ppm)、或1-50 mg/L、1至15 mg/L、更佳為1至10 mg/L範圍內。

以活性物為基礎的按Cl₂ 計之殺生物劑的投劑量以每公升所處理的水的殺生物劑mg計，通常為按Cl₂ 計至少1.0 (mg/L) ppm、或按Cl₂ 計至少1.5 ppm、或較佳為按Cl₂ 計至少2 ppm或更大、或按Cl₂ 計至少2.5 ppm或更大且按Cl₂ 計至多15 ppm或更大、較佳為按Cl₂ 計至多10 ppm。較佳地，殺生物劑之劑量為每公升所處理之水1.5 mg至10 mg殺生物劑。

較佳地，生物膜干擾劑對殺生物劑較佳為氧化殺生物劑之重量比為1份數殺生物劑對至少1份數生物膜干擾劑。殺生物劑對生物膜干擾劑之重量比可為1:1至1:80或1:1至1:40，較佳為1:1至1:20，更佳為1:1至1:8。各組分按重量量測。

熟習此項技術者將能夠確定最佳投劑點，但一般而言，結垢位置之直接上游為較佳的。舉例而言，本發明可施用於冷卻塔集水池或直接施用於冷卻塔配水箱或高位調漿箱，由此處理冷卻水系統。

可依序或同時添加生物膜干擾劑及氧化殺生物劑，或可將該等組分摻合在一起並作為單一組合物添加。
實例
實例1.單氯胺及PEI之協同效應

進行劑量反應研究以確定單獨的單氯胺及PEI之最小生物膜根除濃度(Minimum Biofilm Eradication Concentration，MBEC)。MBEC定義為使活生物膜群體之如藉由平板活菌計數所量測之未經處理的對照值減少95%的試劑之濃度。然後進行實驗以確定組合該等兩種試劑(單獨的氧化殺生物劑單氯胺及分散劑PEI)對生物膜群體之結果。該等實驗檢測三種單獨的單氯胺濃度與四種單獨的PEI濃度。在實例中所使用之PEI為來自BASF之Lupasol™ G20。

M9YG培養基為補充有500 mg/L葡萄糖及0.01%酵母抽提物之簡單的極少鹽培養基。鹽組合物意欲模擬典型的冷卻塔水組合物。使用以下程序製備該培養基之組合物：在一公升水中使用64公克Na2HPO4.7H2O、15公克KH2PO4、2.5公克NaCl及5公克NH4Cl來混合5XM9鹽組合物。將其分成200 ml等分試樣並進行除菌(藉由高壓釜)。向750 ml無菌去離子水中添加無菌補充溶液同時攪拌。在添加CaCl2時將出現白色沈澱物，但其將在攪拌下溶解。

補充溶液為200 ml 5XM9組合物、2 ml 1 M MgSO4、0.1 mL 1 M CaCl2、20 mL 20%葡萄糖、1 ml 10%酵母抽提物及充足的水以製備1000 ml溶液。參見參考文獻：Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Second Edition). 1989. J. Sambrook & T. Maniatis. Cold Spring Harbor Press。

在實例中所使用之接種物為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)之隔夜培養物。假單胞菌為常見的冷卻水污染物，並且儘管冷卻水群體為多微生物，但假單胞菌常作為呈整體形式之群體之代表用於該等研究中。

簡而言之，使用M9YG極少鹽生長培養基使生物膜生長於CDC生物膜反應器中之不鏽鋼316試片上達二十四小時之時段。將單獨的PEI、單獨的單氯胺及氧化劑及分散劑之組合加入12孔細胞培養盤之孔中。用M9YG培養基進行對照。在生物膜生長之後，將來自CDC反應器中之棒的各試片旋開且滴落至該盤之孔中。然後伴隨搖晃在28℃下培育該盤兩小時。培育後，將試片自孔中移除且置放於5 mL磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline，PBS)中且進行六分鐘音波處理。然後藉由平板培養法確定釋放至流體中之活細胞。

藉由Kull等人之方法計算協同指數。該方法確定各抗微生物劑本身之抑制濃度的界定指標，並且然後確定該等兩種試劑一起之組合的抑制位準。Kull中所描述之表達為MBEC值的等式為：
協同指數(Synergy Index，SI) =MBEC a / MBEC A + MBEC b / MBEC B。
其中「MBEC a」為組合中化合物A之MBEC值，「MBEC A」為化合物A本身之MBEC值，「MBEC b」為組合中化合物「B」之MBEC值，並且「MBEC B」為化合物B本身之MBEC值。

協同指數1指示兩種試劑之間沒有相互作用，例如該等值簡單地累加。大於1之SI值指示兩種化合物以對抗性方式相互作用，而小於1之SI值指示兩種化合物協同地相互作用。

下表1顯示單獨的單氯胺需要20 mg/L之濃度以實現大於90%之活生物膜群體減少，而800 mg/L之PEI實現71.4%的減少。然而，經檢測之兩種試劑之許多比率表現出比僅添加該等兩種單獨試劑所能預期的活性更高的活性。舉例而言，5 mg/L MCA (單獨的MCA之值的1/8)及25 mg/L l PEI (單獨的PEI之值的1/32)的組合能夠實現活生物膜細胞減少95%的MBEC目標。在1:1.25至1:20之MCA與PEI之比下獲得此協同效應。
實例2.單氯胺/二氯胺摻合物及PEI之協同效應

進行劑量反應研究以確定單獨的單氯胺/二氯胺摻合物(MCA/DCA)及PEI之最小生物膜根除濃度(MBEC)。MCA/DCA摻合物由9份數MCA及一份數DCA組成。MBEC定義為使活生物膜群體之如藉由平板活菌計數所量測之未經處理的對照值減少95%的試劑之濃度。然後進行實驗以確定組合該等兩種試劑(單獨的氧化殺生物劑MCA/DCA及分散劑PEI)對生物膜群體之結果。該等實驗檢測三種單獨的MCA/DCA濃度與四種單獨的PEI濃度。

簡而言之，使用M9YG極少鹽生長培養基使生物膜生長於CDC生物膜反應器中之不鏽鋼316試片上達二十四小時之時段。將單獨的PEI、單獨的MCA/DCA及氧化劑及分散劑之組合加入12孔細胞培養盤之孔中。用M9YG培養基進行對照。在生物膜生長之後，將來自CDC反應器中之棒的各試片旋開且滴落至該盤之孔中。

然後伴隨搖晃在28℃下培育該盤兩小時。培育後，將試片自孔中移除且置放於5 mL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中且進行六分鐘音波處理。然後藉由平板培養法確定釋放至流體中之活細胞。

按Kull等人如實例1中所描述之方法計算協同指數。

下表2顯示，單獨的MCA/DCA需要10 mg/L之濃度以實現大於90%之活生物膜群體減少，而800 mg/L之PEI實現71.4%的減少。然而，經檢測之兩種試劑之許多比率表現出比僅添加該等兩種單獨試劑所能預期的活性更高的活性。舉例而言，2.5 mg/L MCA/DCA (單獨的MCA/DCA之值的1/4)及25 mg/L PEI(單獨的PEI之值的1/32)的組合能夠實現活生物膜細胞減少95%的MBEC目標。在1:1.25至1:20之MCA/DCA與PEI之比下獲得此協同效應。

儘管前述實施方式中已呈現至少一個例示性實施例，但應瞭解存在大量變體。亦應瞭解，一或多個例示性實施例僅為實例，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇、適用性或組態。相反地，前述實施方式將為熟習此項技術者提供實施例示性實施例之便利路線圖，應理解在不背離本發明之範疇(如所附申請專利範圍及其法定等效物中所闡述)的情況下，可對描述於例示性實施例中之要素的功能及配置作出各種改變。

Claims (13)

1. 一種控制及移除與水系統接觸之表面上的生物膜之方法，其包含向該水系統中添加生物膜干擾劑及殺生物劑之步驟。
2. 如請求項1之方法，其中該殺生物劑係選自由以下組成之群的氧化殺生物劑：二溴氮基丙醯胺、鹵化乙內醯脲、溴氯-二甲基乙內醯脲、次溴酸、三氯異三聚氰酸、鹵胺、二鹵胺、單氯胺、二氯胺及其組合。
3. 如請求項1之方法，其中該殺生物劑衍生自氯部分，諸如次氯酸鹽，與選自由以下組成之群的能夠供給銨離子之含氮化合物之反應：氫氧化銨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、碳酸氫銨、溴化銨、碳酸銨、胺甲酸銨、胺磺酸銨、硝酸銨、草酸銨、過硫酸銨、磷酸銨、硫化銨、脲及脲衍生物及其組合。
4. 如請求項1之方法，其中該殺生物劑係選自由以下組成之群的非氧化殺生物劑：異噻唑酮、戊二醛、甲醛、釋放甲醛之化合物、乙內醯脲、肆羥基氯化鏻及其組合。
5. 如請求項1之方法，其中該生物膜干擾劑包含聚乙亞胺(「PEI」)。
6. 如請求項5之方法，其中該PEI之重均分子量小於750,000道爾頓。
7. 如請求項5之方法，其中該PEI之電荷密度為8至20毫當量/公克物質。
8. 如請求項1之方法，其中以所處理的水之量計，生物膜干擾劑之濃度為約1 mg/L至約200 mg/L。
9. 如請求項1之方法，其中以每公升所處理的水之殺生物劑mg計，殺生物劑之濃度按Cl₂ 計在1 mg/L與15 mg/L之間。
10. 如請求項1之方法，其中殺生物劑對生物膜干擾劑之重量比為1:1至1:80。
11. 如請求項1之方法，其中該水系統選自由以下組成之群：冷卻塔、蒸發器、冷凍器、冷凝器、紙漿造紙廠、鍋爐、廢水、回收的廢水、礦漿、澱粉漿料、黏土漿料、生物精煉水、淤泥、膠體懸浮液、灌溉水、油氣水及其組合。
12. 一種組合物，其包含生物膜干擾劑及殺生物劑，其中該生物膜干擾劑係聚乙亞胺且該殺生物劑係選自由以下組成之群的氧化殺生物劑：二溴氮基丙醯胺、鹵化乙內醯脲、溴氯-二甲基乙內醯脲、次溴酸、三氯異三聚氰酸、鹵胺、二鹵胺、單氯胺、二氯胺及其組合。
13. 如請求項12之組合物，其中生物膜干擾劑對該氧化殺生物劑之重量比為1:1至1:80。