序列表
本申請案含有根據37 C.F.R. 1.821-1.825之序列表。本申請案之隨附序列表以全文引用的方式併入本文中。2013年3月21日建立之該ASCII複本係命名為10-0150-PCT-SEQ.txt且大小為34,542位元組。 本發明提供與本文中所揭示之新穎豬小病毒5A及其變異體有關之核酸及其片段、多肽及其免疫學有效片段、疫苗、免疫學有效製劑、抗體、診斷分析法及套組,以及製造及使用該等組合物及製劑之方法。 除非另外指示,否則本發明之實踐將使用在此項技術之技能內的習知分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學及免疫學之技術。該等技術已在文獻中充分說明。參見例如Sambrook, Fritsch及Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第I、II及III卷, 第二版(1989);DNA Cloning, 第I及II卷 (D. N. Glover編 1985);Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編 1984);Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及S. J. Higgins編 1984);Animal Cell Culture (R. K. Freshney編 1986);Immobilized Cells and Enzymes (IRL出版社, 1986);Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);Methods In Enzymology系列(S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.);Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris及S. Angal編, IRL Press, Oxford University Press);及Handbook of Experimental Immunology, 第I-IV卷 (D. M. Weir及C. C. Blackwell編, 1986, Blackwell Scientific Publications)。 在詳細描述本發明之前,應理解,本發明不限於特定DNA、多肽序列或製程參數,因而該等序列或參數當然可變化。亦應理解,本文中所用之術語係僅出於描述本發明之特定實施例之目的且不意欲具限制性。必須注意,除非本文明確地另外指示,否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用,單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此,舉例而言,對「一抗原」之提及包括兩種或兩種以上抗原之混合物,對「一賦形劑」之提及包括兩種或兩種以上賦形劑之混合物,及其類似情況。
A. 定義
除非另有定義,否則在提交申請時,本文中使用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬領域之技術者通常所理解相同之含義。術語之含義及範疇應清楚;然而,若存在任何潛在歧義,則本文中提供之定義優先於任何詞典或非固有定義。此外,除非本文另有要求,否則單數術語應包括複數形式且複數術語應包括單數形式。本文中,除非另有說明,否則「或」之使用意謂「及/或」。此外,術語「包括(including)」以及其他形式(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)之使用不具有限制性。本文中提及之所有專利及公開案均以引用的方式併入本文中。 「針對疾病之保護」、「保護性免疫性」、「功能性免疫性」及類似片語意謂藉由投與一或多種本發明之治療性組合物或其組合而產生之針對疾病或病狀之反應,其引起的有害作用與已暴露於疾病或感染之未經免疫之個體中所預期相比較少。亦即,經接種之個體中感染之有害作用之嚴重性降低。在經接種之個體中,可降低、減緩或可能完全預防感染。本文中,當意謂完全預防感染時,其將特定說明。若未說明完全預防,則該術語包括部分預防。 本文中,「降低臨床病徵之發病率及/或嚴重性」或「減少臨床症狀」意謂(但不限於)與野生型感染相比,降低群體中受感染個體之數目、降低或消除呈現感染之臨床病徵之個體的數目或降低一或多個個體中存在之任何臨床病徵之嚴重性。舉例而言,其應指任何病原體負荷降低、病原體脫落、病原體傳播減少或PPV5A感染之任何臨床症狀性病徵減少。較佳地,與未接受組合物且受到感染之個體相比,一或多個接受本發明之治療性組合物之個體中該等臨床病徵減少至少10%。更佳地,接受本發明之組合物之個體中臨床病徵減少至少20%,較佳至少30%,更佳至少40%且更佳至少50%。 術語「增加之保護」在本文中意謂(但不限於)與未經接種之個體對照組相比,經接種之個體組中與感染物(較佳為PPV5A)感染有關之一或多種臨床症狀顯著減少。術語「臨床症狀顯著減少」意謂(但不限於)在攻擊感染物後,與未經接種之對照組相比,經接種之個體組中至少一種臨床症狀之發病頻率降低至少10%,較佳20%,更佳30%,更佳50%且更佳70%。 「長效保護」應指「改良之功效」,其持續至少3週,但更佳至少3個月,更佳至少6個月。在家畜情況下,最佳為長效保護應持續至動物達到出售其肉品之平均年齡。 「免疫原性或免疫組合物」係指包含至少一種PPV5A蛋白質或多肽或其免疫原性部分之目標組合物,其引起細胞或抗體介導之針對該組合物之免疫反應之宿主中之免疫學反應。在本發明之較佳實施例中,免疫原性組合物誘導針對PPV5A感染之一或多種臨床病徵之免疫反應且更佳賦予保護性免疫。 如本文中所用之「免疫原性」PPV5A多肽或「抗原」係指引起本文中所描述之免疫學反應之多肽或蛋白質。「免疫原性」PPV5A蛋白質或多肽包括本文中識別之任何編碼序列之全長序列或其類似物或免疫原性片段。術語「免疫原性片段」或「免疫原性部分」係指PPV5A蛋白質之胺基酸序列之片段或經截短及/或經取代形式,其包括一或多個抗原決定基且因此引起本文中所描述之免疫學反應。通常,該等經截短及/或經取代形式或片段將包含或編碼至少六個來自全長蛋白(例如衣殼蛋白)之相鄰胺基酸。更佳地,經截短或經取代形式或片段將具有至少10個,更佳至少15個,且更佳至少19個,且更佳30個來自全長蛋白(例如衣殼蛋白)之相鄰胺基酸。 術語「抗原決定基」意謂目標組合物之區段或片段,例如蛋白質或多肽,其由免疫系統識別,特定地由抗體、B細胞或T細胞識別。在本發明中,抗原決定基通常為病毒蛋白之多肽序列之一或多個片段。 該等片段可使用此項技術中熟知的多種抗原決定基定位技術識別。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第66卷 (Glenn E. Morris編, 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。舉例而言,線性抗原決定基可藉由在固體支撐物上同時合成大量的肽(該等肽對應於蛋白質分子之某些部分)且在該等肽仍附著至支撐物時使肽與抗體反應來確定。此項技術中已知且描述該等技術,參見例如美國專利第4,708,871號;Geysen等人 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002;及Geysen等人 (1986) Molec. Immunol. 23:709-715。類似地,可藉由確定胺基酸之空間構形(諸如藉由例如x射線結晶學及二維核磁共振)而容易地識別構形抗原決定基。參見Epitope Mapping Protocols, 見上文。該定義內亦包括合成抗原,例如多抗原決定基、側接抗原決定基及其他重組或以合成方式衍生之抗原。參見例如Bergmann等人 (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781;Bergmann等人 (1996), J. Immunol. 157:3242-3249;Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408;及Gardner等人, (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 6月28日-7月3日, 1998(其教示及內容均以引用的方式併入本文中)。 「免疫反應」或「免疫學反應」意謂(但不限於)發展細胞及/或抗體介導之針對相關組合物或疫苗之免疫反應。通常,免疫或免疫學反應包括(但不限於)以下作用中之一或多者:抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞及/或細胞毒性T細胞之產生或活化,其特定地針對相關組合物或疫苗中所包括之抗原。較佳地,宿主將顯示治療性或保護性免疫學(記憶)反應,使得對新型感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴重性降低。該保護將由症狀數目、症狀嚴重性降低;或不存在與病原體感染有關之一或多種症狀;病毒血症發作延遲;病毒續存性降低;總體病毒負荷降低及/或病毒排出降低證明。 本文中,「特定免疫反應性」係指免疫反應性蛋白質或多肽,其識別PPV5A感染之抗原特徵,但不與嚴格攻擊對照物之抗原特徵反應。為確定潛在PPV5A免疫反應性蛋白質或其他多肽之特異性,將針對含有遺傳上類似病毒之動物血清使用多種免疫分析法(ELISA、IFA、西方墨點法(WesternBlot))測試蛋白質。亦將針對含有與表現方法相關之蛋白質的物質(桿狀病毒、Sf9細胞等)在多種免疫分析法中測試蛋白質。 如本文中所用,「醫藥學上或獸醫學可接受之載劑」或「賦形劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、塗層、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑、吸收延遲劑及其類似物。在一些較佳實施例中且尤其在包括凍乾免疫原性組合物之實施例中,用於本發明之穩定劑包括用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。 在一些實施例中,本發明之免疫原性組合物含有佐劑。如本文中所使用之「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、皂素(例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL))、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液可尤其基於以下物質:輕液態石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopea)類型);諸如角鯊烷或角鯊烯之類異戊二烯油;由烯烴、尤其異丁烯或癸烯之寡聚合產生之油;含有直鏈烷基之酸或醇之酯,更尤其為植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯;分支鏈脂肪酸或醇之酯,尤其為異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳為非離子性界面活性劑,尤其為視情況經乙氧基化之脫水山梨糖醇酯、二縮甘露糖醇酯(例如去水甘露糖醇油酸酯)、二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之酯,以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段,尤其為Pluronic產品,特別為L121。參見Hunter等人, The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, 第51-94頁 (1995)及Todd等人, Vaccine 15:564-570 (1997)。例示性佐劑為「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」, M. Powell及M. Newman編, Plenum Press, 1995之第147頁中描述之SPT乳液及同一本書之第183頁中描述之乳液MF59。 佐劑之另一實例為選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物之化合物。有利之佐劑化合物為尤其與糖或多元醇之聚烯基醚交聯的丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。此等化合物藉由術語卡波姆(carbomer)而為人所知(Phameuropa 第8卷, 第2期, 1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號,其描述與具有至少3個羥基、較佳不超過8個羥基之多羥基化化合物交聯之該等丙烯酸聚合物,至少三個羥基之氫原子經具有至少2個碳原子之不飽和脂族基團置換。較佳基團為含有2至4個碳原子之基團,例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。該等不飽和基團本身可含有諸如甲基之其他取代基。以名稱卡波莫(Carbopol)出售之產品(BF Goodrich, Ohio, USA)為尤其適合的。其與烯丙基蔗糖或與烯丙基異戊四醇交聯。其中,可提及卡波莫974P、934P及971P。最佳為使用卡波莫971P。在順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物中,有共聚物EMA (Monsanto),其為順丁烯二酸酐與乙烯之共聚物。此等聚合物在水中之溶解產生酸性溶液,其將經中和,較佳至生理學pH值以產生佐劑溶液,該佐劑溶液中將併入免疫原性、免疫或疫苗組合物本身。 其他適合之佐劑尤其包括(但不限於)RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M (Chiron,Emeryville CA)、單磷醯基脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(
E. coli
)之熱不穩定腸毒素(重組或其他方式)、霍亂毒素(cholera toxin)、IMS 1314或胞壁醯二肽,或天然存在或重組細胞激素或其類似物或內源性細胞激素釋放刺激劑。 預期佐劑可以每劑約100 μg至約10 mg之量,較佳每劑約500 μg至約5 mg之量,更佳每劑約750 μg至約2.5 mg之量且最佳每劑約1 mg之量添加。或者,以最終產物之體積計,佐劑可處於約0.01%至50%之濃度下,較佳處於約2%至30%之濃度下,更佳處於約5%至25%之濃度下,更佳處於約7%至22%之濃度下且最佳處於10%至20%之濃度下。 「稀釋劑」可包括水、生理食鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。 「經分離」意謂「藉由人工」自天然狀態改變,亦即若其存在於自然界中,則其已自其初始環境發生變化或移出,或兩者。舉例而言,當該術語用於本文中時,天然存在於活生物體中之聚核苷酸或多肽不「經分離」,但與其天然狀態之共存物質分離的相同聚核苷酸或多肽「經分離」。 「安全性」係指經接種之動物在接種後不出現不良後果,該等不良後果包括(但不限於):活的基於病毒之疫苗可能逆轉成毒性;顯著臨床副作用,諸如持續性、全身性疾病或疫苗投與位點處之不可接受之炎症。 如本文中所用之術語「接種(vaccination/vaccinating)」或其變體意謂(但不限於)一個過程,其包括投與本發明之免疫原性組合物,該免疫原性組合物在投與動物時引起或能夠引起(直接或間接)動物中針對PPV5A之免疫反應。 在本發明之背景下,「死亡」係指由PPV5A感染及/或由PPV5A感染增強之與其他生物體之合併感染引起之死亡,且包括因感染過於嚴重而處死動物以免受苦及對其生命提供人道終結之情形。 「減毒」意謂降低病原體之毒性。在本發明中,「減毒」與「無毒性」同義。在本發明中,減毒病毒為其中毒性已降低使得其不引起PPV5A感染之臨床病徵,但能夠誘導目標哺乳動物中之免疫反應的病毒,但亦可意謂與受到非減毒PPV5A感染且未接受減毒病毒之「對照組」動物相比,受到減毒PPV5A感染之動物中之臨床病徵之發病率或嚴重性降低。在此背景下,術語「降低(reduce/reduced)」意謂與如上文所定義之對照組相比降低至少10%,較佳25%,更佳50%,更佳60%,更佳70%,更佳80%,更佳90%且最佳100%。因此,減毒、非毒性PPV5A病毒株為適合併入包含經修飾之活PPV5A病毒之免疫原性組合物中的病毒株。 「死的」或「不活化」意謂用物理或化學試劑處理,該物理或化學試劑使PPV5A病毒死亡及/或以其他方式使其不能再現。可藉由習知方法死毒PPV5A,例如加熱、輻射或在紫外光存在下使用補骨脂素。可藉由習知方法使PPV5A不活化,例如使用一或多種化學不活化劑(包括(但不限於)二元伸乙基亞胺(BEI)、β-丙內酯、福馬林(formalin)、戊二醛及/或十二烷基硫酸鈉中之一或多者)進行化學不活化。使該等病毒之毒性病毒株減毒之方法及製造不活化病毒製劑之方法在此項技術中已知且描述於例如U.S. 4,567,042及4,567,043中。用於本發明之疫苗組合物中之來自PPV5A之抗原因此可尤其呈全病毒形式,全病毒為經修飾及/或減毒之活病毒製劑或經死毒或不活化之病毒製劑。 如本文中所用之「抗體」包括抗PPV5A抗體,例如單株及多株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、豬抗體及CDR接枝抗體,包括其中包括特定地識別本發明之PPV5A多肽之CDR序列的化合物。術語「對……具有特異性」指示本發明之抗體之可變區僅識別及結合PPV5A多肽(亦即能夠區分單一PPV5A多肽與相關多肽,而無視在多肽家族中發現之序列一致性、同源性或相似性),且允許(視情況)其經由與抗體之可變區外部(且詳言之,在抗體分子之恆定區中)之序列相互作用而與其他蛋白質(例如金黃色葡萄球菌蛋白A (
S. aureus
protein A)或ELISA技術中之其他抗體)相互作用。用於測定本發明之抗體之結合特異性之篩選分析法已為吾人所熟知且在此項技術中按常規實踐。關於該等分析法之綜合論述,參見Harlow等人(編), Antibodies A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), 第6章。亦涵蓋識別及結合本發明之PPV5A多肽之片段的抗體,其限制條件為該等抗體首先且最先對衍生出該片段之本發明之PPV5A多肽具有如上文所定義之特異性。出於清楚目的,「抗體」係指免疫球蛋白分子,其由於針對特異性抗原之免疫反應而可結合於該抗原。免疫球蛋白為由「輕」多肽鏈及「重」多肽鏈構成之血清蛋白質,其具有「恆定」區及「可變」區且基於恆定區之組成而分類(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。抗體可以多種形式(包括例如Fv、Fab'、F(ab')2以及單鏈)存在,且包括合成多肽,其含有一或多個抗體單鏈多肽序列中之所有或一部分。 本文中,「有效劑量」意謂(但不限於)引起或能夠引起免疫反應之抗原量,該免疫反應引起接受抗原投藥之動物中之臨床症狀減少。 如本文中所用,在組合物之背景下,術語「有效量」意謂能夠誘導免疫反應之免疫原性組合物的量,該免疫反應降低動物中疾病之感染或事件之發病率或減輕其嚴重性。特定言之,減毒活病毒製劑之有效量(如由每劑空斑形成單位(plaque forming unit;PFU)之數目或等效量度所量測)係利用半數組織培養感染劑量(TCID50) (亦即將引起50%經接種及敏感細胞培養物之病理變化的病原體的量)來監測。對於死毒疫苗或抗原次單位,有效量係指相對抗原含量(RAC),亦即每個有效劑量中之抗原包含量。或者,在療法之背景下,術語「有效量」係指療法之量足以降低或改善疾病或病症或其一或多種症狀之嚴重性或持續時間、阻止疾病或病症發展、引起疾病或病症消退、預防與疾病或病症有關之一或多種症狀之復發、發展、發作或進程,或增強或改良另一療法或治療劑之預防或治療。 如此項技術中已知之「序列一致性」係指兩個或兩個以上多肽序列或兩個或兩個以上聚核苷酸序列(亦即參考序列與待與參考序列比較之既定序列)之間的關係。序列一致性係藉由在將既定序列與參考序列以最佳方式比對以產生最高程度之序列相似性之後比較該等序列來測定,其中序列相似性如藉由該等序列之串之間的匹配(必要時引入間隙)來測定。在該比對後,在位置對位置之基礎上確定序列一致性,例如若在一特定位置處核苷酸或胺基酸殘基一致,則該等序列在該位置處「一致」。隨後,將該等位置一致性之總數除以參考序列中核苷酸或殘基之總數以產生序列一致性%。序列一致性可由已知方法容易地計算,包括(但不限於)以下文獻中描述之方法:Computational Molecular Biology, Lesk, A. N.編, Oxford University Press, New York (1988);Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York (1993);Computer Analysis of Sequence Data, 第I部分, Griffin, A.M.及Griffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey (1994);Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987);Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M. Stockton Press, New York (1991);及Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988);其教示以引用的方式併入本文中。測定序列一致性之較佳方法經設計以產生測試序列之間的最大匹配。在測定既定序列之間的序列一致性之公開可用之電腦程式中對用於測定序列一致性之方法編程。該等程式之實例包括(但不限於)GCG程式套件(Devereux, J.等人, Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN及BLASTX(Altschul, S. F.等人,J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990))。BLASTX程式可自NCBI及其他來源公開獲得(BLAST Manual, Altschul, S.等人, NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F.等人, J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990),其教示以引用的方式併入本文中)。此等程式最佳使用預設間隙權數(default gap weight)比對序列以產生既定序列與參考序列之間的最高程度之序列一致性。作為說明,具有與參考核苷酸序列具有至少例如85%、較佳90%、更佳95%「序列一致性」之核苷酸序列的聚核苷酸意指,除與參考核苷酸序列之每100個核苷酸相比,既定聚核苷酸序列可能包括至多15個、較佳至多10個、更佳至多5個點突變外,既定聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之,在具有相對於參考核苷酸序列具有至少85%、較佳90%、更佳95%一致性之核苷酸序列的聚核苷酸中,參考序列中之至多15%、較佳10%、更佳5%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代,或可將佔參考序列中之總核苷酸之至多15%、較佳10%、更佳5%之多個核苷酸插入參考序列中。參考序列之此等突變可能發生在參考核苷酸序列之5'端位置或3'端位置處或該等末端位置之間的任何地方,個別地散佈於參考序列中之核苷酸間或參考序列內之一或多個相鄰基團中。類似地,具有與參考胺基酸序列具有至少例如85%、較佳90%、更佳95%序列一致性之既定胺基酸序列的多肽意指,除與參考胺基酸序列中之每100個胺基酸相比,既定多肽序列可能包括至多15個、較佳至多10個、更佳至多5個胺基酸改變外,多肽之既定胺基酸序列與參考序列一致。換言之,為獲得與參考胺基酸序列具有至少85%、較佳90%、更佳95%之序列一致性之既定多肽序列,參考序列中之至多15%、較佳至多10%、更佳至多5%之胺基酸殘基可缺失或經另一胺基酸取代,或可將佔參考序列中之胺基酸殘基總數之至多15%、較佳至多10%、更佳至多5%之多個胺基酸插入參考序列中。參考序列之此等改變可發生於參考胺基酸序列之胺基末端或羧基末端位置處或該等末端位置之間的任何地方,個別地散佈於參考序列之殘基間或參考序列內之一或多個相鄰基團中。較佳地,不一致之殘基位置之不同在於保守胺基酸取代。然而,當測定序列一致性時,不包括保守取代作為匹配。 如本文中所用之「序列同源性」係指一種測定兩個序列之相關性的方法。為測定序列同源性,將兩個或兩個以上序列以最佳方式比對且必要時引入間隙。然而,與「序列一致性」相反,保守胺基酸取代在測定序列同源性時亦視為匹配。換言之,為獲得與參考序列具有95%序列同源性之多肽,參考序列中85%、較佳90%、更佳95%之胺基酸殘基必須匹配或包含使用另一胺基酸之保守取代,或可將佔參考序列中總胺基酸殘基之至多15%、較佳至多10%、更佳至多5%之多個胺基酸(不包括保守取代)插入參考序列中。同源序列較佳包含至少一個具有50個、更佳100個、更佳250個、更佳500個編碼同源胺基酸之核苷酸之延伸子。 「保守取代」係指胺基酸殘基經具有類似特徵或性質(包括尺寸、疏水性等)之另一胺基酸殘基取代,使得整體功能性不顯著改變。其亦可意謂引起保守胺基酸取代之核苷酸取代。
B . 載體分子
本發明之PPV5A蛋白質或肽可結合或共價連接之載體分子較佳為上述載體分子。供動物使用之較佳載體為牛血清白蛋白及匙孔螺血氰蛋白。載體蛋白質本身較佳為免疫原。 本發明之PPV5A蛋白質或肽可藉由此項技術中已知的任何便利方法與載體共價偶合。儘管使用對稱連接子(諸如己二酸二醯肼,如由Schneerson等人, J. Experimental Medicine, 152, 361-376 (1980)描述)或雜雙官能連接子(諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯,如由Fattom等人, Infection and Immunity, 56, 2292-2298 (1988)描述)屬於本發明之範疇內,但較佳避免使用任何連接子而改為使本發明之PPV5A肽直接與載體分子偶合。該偶合可藉助於還原性胺化實現,如由Landi等人 J. Immunology, 127, 1011-1019 (1981)描述。 免疫原性組合物之尺寸(如由平均分子量定義)可變化且視所選PPV5A蛋白質或肽及使PPV5A蛋白質或肽與載體偶合之方法而定。因此,其可小至1,000道爾頓(10
3
)或大於10
6
道爾頓。藉由還原性胺化偶合方法,PPV5A蛋白質或肽之分子量通常在5,000至500,000或500,000以上之範圍內;例如對於SEQ ID NO:4之衣殼蛋白,預測分子量為約80,000道爾頓,預測其形成包含60個單體蛋白之類病毒粒子(VLP)。 載體分子(亦即特異性結合本發明之PPV5A蛋白質或肽之肽、其衍生物及類似物及肽模擬劑)可由此項技術中已知的各種方法產生,包括(但不限於)固相合成或利用溶液(Nakanishi等人, 1993, Gene 137:51-56;Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154;Neurath, H.等人編, The Proteins, 第II卷, 第3版, 第105-237頁, Academic Press, New York, N.Y. (1976),其以全文引用的方式併入本文中)。 本發明之PPV5A蛋白質或肽或本發明之抗體或其結合部分可藉由於稀釋劑中之溶液或懸浮液形式與醫藥學或獸醫學載體一起以可注射劑量投與。 該等分子之安全性及功效在所描述之細胞培養物或實驗動物中藉由標準程序測定且由獸醫生物製劑中心(Center for Veterinary Biologics;CVB)進行調節。該等分子之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序測定,例如測定LD
50
(50%群體致死之劑量)。 本發明之疫苗可為多價或單價的。多價疫苗係由多種PPV5A蛋白質或肽與載體分子之免疫結合製成。 在一個態樣中,PPV5A蛋白質或肽組合物包含有效免疫量之免疫原性結合物,較佳與免疫刺激劑組合;及生理學上可接受之媒劑。如本發明中所使用,「免疫刺激劑」意欲涵蓋任何能夠增強免疫系統活性之化合物或組合物,無論其為與特異性抗原組合之特異性增強作用,抑或僅為對免疫反應中之一或多個要素之活性的獨立作用。免疫刺激劑化合物包括(但不限於)礦物質凝膠,例如氫氧化鋁;表面活性物質,諸如溶血卵磷脂、普洛尼克多元醇;聚陰離子;肽;油乳液;明礬及MDP。使用該等物質之方法在此項技術中已知,且確定用於既定疫苗之刺激物之最佳量完全屬於熟練技術人員之能力範圍內。既定調配物中可使用一種以上免疫刺激劑。亦可將免疫原併入脂質體中,或與疫苗調配物中使用之多醣及/或其他聚合物結合。 組合物必要時可於包裝或施配器裝置中呈遞,該包裝或施配器裝置可含有一或多個含有活性成分之單位劑型。包裝可例如包含金屬或塑膠箔,諸如泡殼封裝。包裝或施配器裝置可附有投藥說明書,較佳用於投與哺乳動物,尤其為豬。
C. 佐劑
為進一步提高由此提供之免疫原性組合物之免疫原性,該等組合物除含有一或多種PPV5A蛋白質或肽以外亦可包含一或多種佐劑。 佐劑可由先前描述或此項技術中已知的任何技術純化。較佳純化技術為矽膠層析,尤其「急驟」(快速)層析技術,如由W. Clark Still等人, J. Organic Chemistry, 43, 2923-2925 (1978)描述。然而,可使用其他層析方法(包括HPLC)進行佐劑之純化。亦可使用結晶法純化佐劑。在一些情況下,若自合成直接獲得具有分析級純度之產物,則無需進行純化。 根據用於產生佐劑組合物之已知技術,藉由將佐劑與PPV5A蛋白質或肽在適當無菌條件下物理混合來製備本發明之疫苗組合物。藉由使結合物上存在淨負電荷(其由靜電吸引至長鏈烷基化合物佐劑上之正電荷)來促進PPV5A蛋白質或肽與佐劑之複合。
D. 生理學上可接受之媒劑
本發明之疫苗組合物可使用與用於其他醫藥多肽組合物之技術類似之技術調配。因此,佐劑及較佳與載體分子結合及/或與佐劑混合之PPV5A蛋白質或肽可以凍乾形式儲存且在投藥之前於生理學上可接受之媒劑中復原以形成懸浮液。或者,佐劑及結合物可儲存於媒劑中。較佳媒劑為無菌溶液,尤其無菌緩衝溶液,諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水。任何使佐劑及結合物於媒劑中組合使得免疫原性組合物之免疫有效性得到改良之方法均為合適的。 單一劑量之本發明之疫苗之體積可變化,但通常將屬於習知疫苗之常用範圍內。在上述結合物及佐劑之濃度下,單一劑量之體積較佳介於約0.1 ml與約3 ml之間,較佳介於約0.2 ml與約1.5 ml之間,更佳為約1.0 ml。 本發明之疫苗組合物可藉由任何便利方法投與。
E. 調配物
包含與載體分子偶合之PPV5A蛋白質或肽之免疫原性結合物可用作疫苗以用於針對PPV5A之一或多種血清型免疫。包含於生理學上可接受之媒劑中之免疫原性結合物的疫苗適用於使動物(較佳為豬)免疫以治療或預防PPV5A感染之方法中。 藉由用免疫原性結合物免疫產生之針對本發明之免疫原性結合物之抗體可用於被動免疫療法及產生抗個體基因型抗體以治療或預防PPV5A感染。 接受組合物投藥之個體較佳為動物,包括(但不限於)牛、馬、綿羊、豬、家禽(例如雞)、山羊、貓、犬、倉鼠、小鼠及大鼠;最佳為豬。 本發明之調配物包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物或針對其之抗體及生理學上可接受之媒劑。疫苗包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理學上可接受之媒劑。調配物應適應投藥模式。 免疫原性組合物必要時亦可含有少量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。免疫原性組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或散劑。經口調配物可包括標準載劑,諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、鈉糖精、纖維素、碳酸鎂等。
F. 有效劑量
本文中所描述之化合物可以治療有效劑量投與個體以治療PPV5A相關疾病。劑量將視接受疫苗之宿主以及多種因素(諸如宿主體型、體重及年齡)而定。 欲用於調配物中之本發明之免疫原性結合物或抗體之精確量將視投藥途徑及個體性質(例如物種、年齡、體型、疾病之階段/程度)而定,且應根據標準臨床技術根據醫師之判斷及每一個體之情形來判定。有效免疫量為足以治療或預防個體中之PPV5A感染性疾病之量。有效劑量亦可由得自動物模型測試系統之劑量反應曲線推算且可自0.1 mg/kg至20 mg/kg,較佳1 mg/kg至10 mg/kg變化。 組合物之免疫原性可藉由使用此項技術中已知的任何免疫分析法在用組合物免疫後監測測試個體之免疫反應來確定。可將產生體液(抗體)反應及/或細胞介導之免疫性視為免疫反應之指示。測試個體可包括動物,諸如豬、小鼠、倉鼠、犬、貓、兔、牛、馬、綿羊及家禽(例如雞、鴨、鵝及火雞)。 測試個體之免疫反應可藉由各種方法分析,諸如:所得免疫血清與免疫原性結合物之反應性,如由已知技術分析,例如酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)、免疫墨點法、免疫沈澱法等;或保護經免疫之宿主免於病原體感染及/或經免疫之宿主中由病原體感染引起之症狀的減弱,如由此項技術中已知的任何用於分析感染性疾病病原體(infectious disease agent)含量之方法確定,例如定量PCR、病毒分離或此項技術中已知的其他技術。亦可藉由量測免疫球蛋白所針對之抗原之含量來確定感染性疾病病原體之含量。感染性疾病病原體之含量降低或感染性疾病之症狀改善指示組合物有效。 在動物中活體內使用之前,可活體外測試本發明之治療劑之所需治療性或預防性活性。舉例而言,可用於確定是否指示投與特異性治療劑之活體外分析法包括活體外細胞培養分析法,其中來自細胞株之合適細胞或自患有特定疾病或病症之個體培養之細胞暴露於治療劑或以其他方式接受治療劑投藥,且觀測治療劑對細胞之作用。 或者,可藉由以下方法來分析治療劑:使治療劑與細胞(自個體培養或來自經培養之細胞株)接觸,該等細胞對感染性疾病病原體之感染敏感但未受感染性疾病病原體感染;使細胞暴露於感染性疾病病原體;且接著確定與治療劑接觸之細胞之感染率是否低於未與治療劑接觸之細胞之感染率。可藉由此項技術中已知的任何方法分析細胞之感染性疾病病原體感染。 此外,可藉由在療法之前、在療法期間或在療法之後以合適時間間隔量測動物模型個體中抗體所針對之分子之含量來評估治療劑。可識別分子之量之任何改變或未發生改變且將其與治療對個體之作用相關聯。分子之含量可藉由此項技術中已知的任何方法確定。 在使用本發明之方法及組合物將動物針對PPV5A接種後,可使用此項技術中已知的任何結合分析法評估所得抗體與特定分子之間的結合。亦可進行該等分析法以選擇對特定抗原呈現較高親和力或特異性之抗體。
G. 偵測及診斷方法
由於使用本發明之原生PPV5A、減毒病毒、蛋白質或肽而產生之抗體或其結合部分適用於偵測樣品中PPV5A之存在。此偵測方法包含以下步驟:提供針對本發明之原生PPV5A、減毒病毒、蛋白質或肽所產生之經分離抗體或其結合部分,將經分離抗體或其結合部分添加至懷疑含有一定量的PPV5A病毒之樣品中,及偵測包含結合於PPV5A病毒之經分離抗體或其結合部分之複合物的存在。 本發明之抗體或其結合部分亦適用於偵測樣品中PPV5A蛋白質或肽之存在。此偵測方法包含以下步驟:提供針對原生PPV5A、減毒病毒、蛋白質或肽所產生之經分離抗體或其結合部分,將經分離抗體或其結合部分添加至懷疑含有一定量的PPV5A蛋白質或肽之樣品中,及偵測包含結合於PPV5A蛋白質或肽之經分離抗體或其結合部分之複合物的存在。 如本文中所描述,結合作為結合對之成員的特異性分子之免疫球蛋白,特定言之抗體(及其功能活性片段)可用作診斷劑及預後劑。在多個實施例中,本發明提供結合對之成員之量測及該等量測在臨床應用中之用途。本發明之免疫球蛋白可用於例如偵測生物樣品中之抗原,藉此可測試個體中免疫球蛋白所結合之分子之異常含量及/或該等分子之異常形式之存在。「異常含量」意謂相對於來自未患有疾病之身體部分或個體之類似樣品中之存在量或表示存在量之標準含量有所增加或降低。套組中亦可包括本發明之抗體作為試劑以用於診斷或預後技術。 在一個態樣中,免疫特異性結合於PPV5A原生或減毒病毒、蛋白質或肽之本發明之抗體可用於PPV5A感染之診斷、預後或篩選。 在另一態樣中,本發明提供診斷或篩選PPV5A感染或針對其之免疫性之存在的方法,其包含量測個體中抗體與來源於個體之樣品之免疫特異性結合的程度,其中抗體免疫特異性結合PPV5A蛋白質或肽,其中該免疫特異性結合之程度相對於來自不具有感染性疾病病原體之個體之類似樣品中該免疫特異性結合之程度有所增加指示PPV5A存在。 用於偵測PPV5A肽或其拮抗劑之存在的合適分析法之實例包括(但不限於)ELISA、放射免疫分析法、凝膠擴散沈澱反應分析法、免疫擴散分析法、凝集分析法、螢光免疫分析法、蛋白質A免疫分析法或免疫電泳分析法。 用於特定分子之免疫分析法將典型地包含在以可偵測方式經標記之抗體存在下培育樣品(諸如生物流體、組織提取物、新鮮收集之細胞或所培養細胞之溶解產物)及藉由此項技術中熟知的多種技術中之任一種偵測結合之抗體。 可根據熟知方法測定既定抗體之結合活性。熟習此項技術者將能夠使用常規實驗確定各測定之操作性及最佳分析條件。 本發明之另一態樣係關於用於偵測或量測PPV5A之診斷套組。提供用於診斷用途之套組,其在一或多個容器中包含抗PPV5A抗體及視情況選用之針對抗體之經標記之結合搭配物。或者,抗PPV5A抗體可經標記(使用可偵測標記,例如化學發光、酶、螢光或放射性部分)。因此,本發明提供診斷套組,其包含抗PPV5A抗體及對照免疫球蛋白。在一特定實施例中,容器中之一種上述化合物可以可偵測方式經標記。套組可視情況進一步在容器中包含預定量之由套組之抗體識別之PPV5A病毒、蛋白質或肽以用作標準物或對照物。
H. 投與個體
投藥途徑包括(但不限於)鼻內、經口(例如於飲用水中)、皮內及肌肉內。肌肉內投藥尤其較佳。熟練技術人員將認識到,本發明之組合物亦可以一次、兩次或兩次以上劑量投與以及藉由其他投藥途徑投與。舉例而言,該等其他途徑包括皮下、皮內、靜脈內、血管內、動脈內、腹膜內、鞘內、氣管內、心內、小葉內、髓內、肺內及陰道內。視治療之所需持續時間及有效性而定,本發明之組合物可投與一次或數次,亦可間歇地投與,例如在數天、數週或數月內每天及以不同劑量投與。 包括以下實例以說明本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解,以下實例中揭示之技術表示由發明者發現之在本發明實踐中起良好作用之技術,且因此可視為構成本發明實踐之較佳模式。然而,根據本發明,熟習此項技術者應瞭解,在不偏離本發明之精神及範疇下,所揭示之特定實施例中可產生多種變化且仍然獲得相似或類似結果。 本申請案係關於同一日期申請之標題為「Porcine Parvovirus 5B, Methods of Use and Vaccine」之申請案(代理人案號BIC-1153),其內容以全文引用的方式併入本文中。
實例
材料及方法
材料來源
:自罕見爆發調查接收來自三隻豬之組織勻漿。飼養場之臨床病史為200 lb豬患有全身肌肉顫動,其在靜止時存在,但在運動期間增強。在獸醫診斷實驗室中進行廣泛測試,該實驗室提出病毒劑(基於微觀病變),但僅引起識別試劑X (與瘟病毒相關之非經典豬瘟病毒),之後將樣品提供至發明者以幫助確定該等動物中CNS病徵之潛在起因。
DNA 及蛋白質分析
:使用來自454 Life Sciences (Branford CT) (「454技術」)之高通量定序進行來自受感染豬之樣品的DNA分析,由Operon (Huntsville AL)進行。經由病毒粒子保護核酸之核酸酶處理使樣品富含病毒序列,接著進行提取、隨機擴增及高通量定序;通常如Victoria等人 PLoS pathogen 2008年9月26日;4(9):e1000163中所描述進行。最初由BLASTx分析將所得序列表徵為小病毒科之分歧成員(divergent member)。使用Sequencher軟體裝配序列且該等DNA分析之結果聯合目標定序會得到SEQ ID NO:1之DNA序列,其為表示為PPV5A的病毒之推定完全編碼序列。使用Sequencher軟體進一步分析DNA序列,引起識別三個推定編碼區,其對應於在其他小病毒種中發現之編碼區,包含病毒複製酶(SEQ ID NO:2)、開放閱讀框架「ORF3」(SEQ ID NO:3)及病毒衣殼蛋白(SEQ ID NO:4)。
實例 1 :識別新穎病毒
藉由454技術(病毒多源基因體學)識別來自不同狀態之兩隻無關豬之肺勻漿之樣品中的DNA序列。BLASTn及BLASTx分析表明與豬小病毒4最密切一致,其中複製酶基因(REP)之保守區域中存在67%核苷酸一致性最大值,而衣殼蛋白(CAP)編碼區在核苷酸層面上未呈現可辨別之匹配。在蛋白質層面上,推定之複製酶蛋白呈現約60%胺基酸一致性且在衣殼蛋白中呈現約50%一致性。病毒表示為新型種,即豬小病毒5A (PPV5A)。基於衣殼蛋白編碼序列研發特異性引子,且組織中類似之勻漿基於PCR之篩選及病理學/臨床特徵表明約16%樣品中存在病原體。基於所報導之臨床病徵及與所篩選組織相關之病毒學資料,觀測到與若干其他病毒劑及臨床病理學/組織病理學之統計學顯著相關性。
實例 2 :識別 PPV5A 為新穎小病毒及系統發生分析
多種已知病毒種之推定之複製酶(REP)及衣殼(VP1/CAP)蛋白之成對胺基酸一致性展示於圖5中。PPV5A序列與最密切相關之具有REP及CAP之PPV4之一致性(分別為約60%/50%)支持將PPV5A指定為新型種。 基於CAP蛋白質之保守區域,系統發生分析(圖6)顯示該病毒為小病毒科及小病毒屬中之新穎種。使用更保守的REP蛋白序列(未圖示)實現類似結果。
實例 3 :確認 PPV5A 為病原體
使用來自ISU之三種PPV5a PCR陽性組織勻漿對剖腹分娩之未餵食初乳(CDCD)之動物進行接種以嘗試擴增病毒及確定新穎小病毒與PRRSV之合併感染是否引起臨床呼吸病徵增加。在此項研究中,用含有新穎小病毒之組織勻漿接種之組中出現意外的高死亡數(20%-22%),且使用靶向衣殼蛋白編碼區之PPV5A特異性PCR識別血清中高效價之PPV5A。接著使用來自此項研究中之一隻動物的組織攻擊CDCD豬以再現臨床病徵。在此項研究中,在大部分受感染動物中發現高效價病毒血症之全身感染。在接受含有PPV5A之接種物的組中,死亡(20%)、跛行、平均每日增重降低、發熱以及巨觀及微觀病變之發生率較高。
實例 4 : PPV5A 之培養、分離及純化
使用無菌研缽及杵棒研磨PCR陽性組織(例如脾、腦、肺、腸等)之小切片。將經研磨之組織再懸浮於5-10 ml含有HEPES緩衝液及抗生素之經改質EMEM中且使其澄清以消除較大的組織塊。收集上清液且連續通過各種過濾器以消除大部分較大粒子(包括細菌)。此外,亦藉由連續過濾來處理來自PCR陽性動物之糞便樣品懸浮液及血清以進行病毒分離。濾液之稀釋物經胰蛋白酶處理或保持未經處理且在6孔板中在特定溫度下吸附於培養細胞培養物及原生細胞培養物(列舉於下文中)上。抽出接種物且替換為2 ml新鮮維持培養基。板接著在5% CO
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氛圍中在33℃-37℃下培育且每天觀測與模擬(普通培養基)接種之對照物相比之細胞病變效應,諸如細胞變圓、細胞-細胞融合、脫落、細胞叢集等。藉由PCR篩選潛在陽性孔之病毒生長/分離。 適用於病毒分離之培養細胞株尤其包括:ST (豬睾丸)、SK6 (豬腎臟)、BHK-21 (倉鼠仔腎臟)、VIDO R1 (豬胎兒視網膜)、PK-15 NADC (豬腎臟)、PK/WRL (豬腎臟)、HRT-180 (人類結腸直腸腺癌)、Hep2 (人類上皮)、Vero (非洲綠猴(African green monkey)腎臟)及RK-13 (兔腎臟)。 適用於該過程之原生細胞培養物尤其包括:豬胚胎之肺、腎臟、睾丸、氣管及腸培養物。 在分離病毒後,藉由多輪斑塊純化或限制稀釋來純化病毒且以較大量擴增病毒,並且產生用於動物實驗之儲備培養物。
實例 5 :製備不活化病毒及疫苗
在約35℃至39℃之間且在2至15 mM BEI存在下,更佳在約10 mM BEI存在下進行不活化。不活化係進行至少24小時,多達24至72小時。接著添加等效量之中和溶液內之不活化試劑的試劑;例如等效量之硫代硫酸鈉。根據此項技術中已知之方法製備不活化病毒製劑,舉例而言,如Preuss, T.等人, Comparison of Two Different Methods for Inactivation of Viruses in Serum, CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY, (1997), 504-508或Bahnemann, H.G., Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine, VACCINE, (1990), 299-303中所揭示。一旦製備不活化病毒,則將材料與載體製劑組合以用於最終疫苗調配。
實例 6 :製備減毒病毒及疫苗
減毒病毒製劑係根據此項技術中已知之方法製備,舉例而言,如Vaccine Protocols, 第2版; Robinson, Husdon, Cranage編, Humana Press 2003中所揭示。舉例而言,「……野生型病毒在組織培養物/動物宿主中廣泛繼代直至毒性損失與免疫原性保持之間達到可接受之平衡……」。 藉由多輪斑塊純化或限制稀釋來純化減毒病毒。使用PCR分析法、深度定序或免疫螢光分析法確定培養物質之特異性。藉由組合經純化之減毒病毒製劑與載體製劑來製備減毒病毒疫苗。
實例 7 :製備包含衣殼蛋白之次單位疫苗
藉由經選殖之SEQ ID NO:4或其片段於多種蛋白質表現系統中之表現來製備SEQ ID NO:4之衣殼蛋白。
桿狀病毒表現
:SEQ ID NO:4之PPV5A衣殼蛋白於桿狀病毒表現系統中表現,通常根據Kost等人 (6), 2012中揭示之方法。在初始純化時,在不可溶部分內發現少量蛋白質。提高產率及溶解度之方法包括(但不限於)使用替代性緩衝條件(例如脲或鹽酸胍)、替代性結合及純化條件(例如鈷或鎳親和管柱、陰離子或陽離子交換管柱)或替代性表現條件(例如溫度、時間、替代性細胞株)。
細菌表現
:SEQ ID NO:4之PPV5A衣殼蛋白於細菌表現系統中表現,通常根據EMD Chemicals Inc. Novagen User Protocol TB184中揭示之方法。此方法包括添加細菌載體中所含之固有HIS標籤(EMD Chemicals Inc., 2011 (7))以促進所產生之蛋白質之純化。通常根據GE Healthcare, 2012 (8)中揭示之方法純化經細菌表現之HIS標記衣殼蛋白且使用所得產物如實例8中所描述產生PPV5A特異性抗體。 藉由組合經純化之衣殼蛋白製劑與載體製劑來製備減毒次單位疫苗。
實例 8 :製備特異性結合於 PPV5A 之抗體
藉由使用PPV5A病毒之抗原性製劑或衣殼(SEQ ID NO:4)蛋白或其片段之次單位蛋白製劑使兔免疫來製備特異性結合於PPV5A之抗體。針對結合於PPV5A抗原之多株抗體篩選來自經接種之兔之血清樣品。使來自經接種之小鼠且確定產生針對抗原之抗體之脾與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤。接著針對與PPV5A抗原之結合來篩選融合瘤。
多株抗體
:在定製抗體製備服務公司(custom antibody production service),使用根據實例7製備之HIS標記之經細菌表現之衣殼蛋白使兩隻新西蘭白兔(New Zealand White rabbit)免疫(Rockland抗體及分析法(Rockland Antibodies and Assays); Gilbertsville, PA)。在D0、D7、D14及D28,使用每隻兔約100 μg抗原使兔免疫。對於D0及D7接種,動物係皮內接種;在D14及D28進行之接種係皮下投與。在第一次接種中使用完全弗氏佐劑(Complete Freund's adjuvant);在後續接種中使用不完全弗氏佐劑(incomplete Freud's adjuvant)。在免疫之前以及在免疫後第38天及第45天收集來自兩隻兔子之血清樣品。藉由Rockland抗體及分析法篩選多株抗體製劑之抗PPV5A特異性。藉由免疫螢光分析法(IFA)、西方墨點法及酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA),產生對經純化或部分純化之PPV5A蛋白質具有結合特異性之抗體。各分析法之特異性之參數如下:藉由偵測預測的88.8 kDa尺寸蛋白質來量測西方墨點法特異性,藉由與未感染之細胞相比來量測IFA特異性且藉由用非相關蛋白塗佈板來量測ELISA特異性。
單株抗體
:在定製抗體製備服務公司(Rockland抗體及分析法; Gilbertsville, PA),使用根據實例7製備之HIS標記之經桿狀病毒表現之衣殼蛋白在Balb/c小鼠中產生單株抗體。根據由定製抗體製備設備設計之標準方案使用多種PPV5A抗原性製劑使小鼠免疫。藉由定製抗體製備設備監測接種後之免疫反應且選擇用於產生融合瘤之抗體候選物。用於產生單株抗體之標準方案已為熟習此項技術者所熟知,舉例而言,如Gabriele等人 (9), 第117-135頁中所揭示。 藉由根據標準方案組合在融合瘤培養基中培養至增殖期之B細胞腫瘤細胞與自確定產生針對PPV5A抗原之抗體之經接種小鼠收集的脾細胞來產生融合瘤,如Gabriele等人 (9), 第117-135頁中所揭示。在融合及培養融合瘤後,針對與PPV5A抗原之結合篩選融合瘤,且選擇產生抗PPV5A之融合瘤。根據標準方案使用親和層析純化由融合瘤產生之單株抗體,如Gabriele等人 (9), 第209-232頁中所揭示。 使用此項技術中熟知的免疫學技術,例如ELISA、西方墨點分析及抗原決定基定位(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第66卷 (Glenn E. Morris編, 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey)來識別對PPV5A具有特異性之高親和力抗體且進一步表徵,包括確定其結合之抗原決定基、抗體關於其他相關病毒種之特異性,且選擇對PPV5A病毒抗原具有高特異性之適合的高親和力抗體。
實例 9 : PPV5A 之診斷分析法 ELISA 分析法
:使用ELISA程序,使用根據實例8製備之抗體量測生物樣品中之PPV5A。分析法係如下進行: 將選自SEQ ID NO:4之衣殼蛋白之包被抗原於包被緩衝液(0.05 M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝劑;pH 9.6)中稀釋至實現8 ng/μl之最終濃度。每孔用50 μl包被抗原塗佈板(高蛋白結合96孔ELISA板, Phenix目錄號MPG-655061)。密封板且在37℃下培育1小時或在4℃下培育隔夜。移除塗佈溶液且板用每孔200 μl PBST (1X PBS+0.05% Tween-20)洗滌三次。板用每孔300 μl阻斷溶液(含0.5% w/v脫脂乳粉之PBS)塗佈,密封且在37℃下培育1小時。移除阻斷溶液且板用每孔200 μl PBST洗滌三次。樣品在阻斷溶液中以1:100稀釋;向板中每孔添加100 μl血清樣品。密封板且在37℃下培育1小時。移除血清樣品且板用每孔200 μl PBST洗滌三次。二級抗體(HRP結合之山羊抗豬IgG (H+L);Jackson Immuno-Research 114-035-003)於阻斷溶液中以1:10,000稀釋且用於以每孔100 μl塗佈板。密封板且在37℃下培育1小時。移除二級抗體且板用每孔200 μl PBST洗滌三次。板用每孔50 μl TMB (3,5,3',5'-四甲基聯苯胺;KPL目錄號53-00-01)塗佈。板於黑暗中在室溫下培育約十分鐘。板用每孔50 μl停止溶液(2 M H
2
SO
4
;KPL目錄號50-85-04)塗佈。在450 nm下讀取光學密度。
PCR 分析法
:用於PPV5A之基於凝膠之PCR及qPCR分析法已經最佳化。該等分析法係如下進行:對於qPCR分析法,各反應物係藉由添加以下試劑來製備:每種反應物10 μl 2X SsoFast探針supermix (BioRad, 目錄號172-5233)、每種反應物5 μl經DEPC處理之水、每種反應物1 μl正向引子(6 μM濃度)(AAT GCG TGT GCT TAC GCT TA:SEQ ID NO:6)、每種反應物1 μl逆向引子(6 μM濃度)(TGG GTT CGA ATA TGA AGA GG:SEQ ID NO:7)、每種反應物1 μl探針(4 μM濃度)(6-FAM/TC ATC AGG AAC CCT GGA GTG ATC TCA/BHQ_1:SEQ ID NO:8)及每種反應物2 μl經提取之DNA。反應在T100熱循環器(Bio-Rad)上在95℃下持續2分鐘進行一次循環,接著在以下兩種溫度下進行四十次循環:95℃下持續5秒,接著60℃下持續5秒。使用CFX96光學成像系統(Bio-Rad)讀取資料。對於基於凝膠之分析法,各反應物係藉由添加以下試劑來製備:每種反應物12.5 μl 2X AmpliTaq Gold Mastermix (Applied Biosystems, 目錄號4302758)、每種反應物8.0 μl經DEPC處理之水、每種反應物1.25 μl正向引子(GTA CTA TGA ATT TCC AAA CGA TCT TCC TTT CG:SEQ ID NO:9)(10 μM濃度)、每種反應物1.25 μl逆向引子(TTA CAC CAA ATC TGG GAC TCT AAA CAG GC:SEQ ID NO:10)(10 μM濃度)及每種反應物2 μl經提取之DNA。反應在T100熱循環器(Bio-Rad)上在95℃下持續5分鐘進行一次循環,接著在以下溫度下進行四十次循環:95℃下持續30秒,60℃下持續30秒且72℃下持續45秒,接著在72℃下最終延長持續10分鐘。
實例 10 :評估豬中 PPV5A 疫苗之功效
為評估包含至少一種PPV5A蛋白質或多肽(原型PPV5A疫苗)之目標組合物在豬中之功效,使用隨機分為三組之五週齡剖腹分娩之未餵食初乳(CDCD)動物(參見表2)進行隨機化研究。在研究第0天(D0)及D14用組合物或安慰劑(磷酸鹽緩衝生理食鹽水; PBS)對動物進行接種。在D28用已知含有PPV5A之物質攻擊動物。監測臨床觀測、直腸溫度、體重量測及血液收集。在D56,對動物進行屍檢以評估巨觀病變。藉由以統計學方式比較經接種與未經接種之動物之間的死亡百分比、病毒血症(效價及持續時間)、血清轉化(效價及持續時間)及臨床病徵來確定PPV5A疫苗之功效。 表2.
可根據本發明在無不當實驗下製備及執行本文中揭示及主張之所有組合物及方法。雖然已依照較佳實施例描述本發明之組合物及方法,但熟習此項技術者將顯而易見,在不偏離本發明之概念、精神及範疇下,可對本文所描述之組合物及方法以及在該方法之步驟或步驟次序中作出變化。更特定言之,將顯而易知可用某些化學且生理學相關試劑取代本文中所描述之試劑而獲得相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見的所有該等類似取代及修飾均視為屬於由以下申請專利範圍所界定之本發明之精神、範疇及概念內。
參考文獻
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